CN110577603A - 一种抗cd3和抗cd19双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体，包括能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，单链单元和单价单元均包括完整的轻链和完整的重链，单链单元的轻链C末端通过连接子linker与其重链N末端连接。本发明完整保留了抗CD19抗体和抗CD3抗体的生物学活性，更好的识别肿瘤细胞和效应细胞，并将效应细胞靶向到肿瘤细胞，达到特异性杀伤作用，杀伤能力更高，此外，单链单元的轻链和重链通过连接子linker连接，有效避免了双特异抗体中轻重链之间的错配，解决了纯化中的难点，为双特异抗体的放大生产提供了坚实的基础。

Description

一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
背景技术
随着生物药的不断发展，治疗性抗体已经成为癌症、自身免疫、炎症和各种其他疾病患者的主要选择药物。然而，单克隆抗体有其局限性，这些抗体所针对的都是单一的靶标，很多患者不能充分响应单一的疗法，病人可能产生耐药性或无应答。癌症和其他疾病不同，其是多因素疾病，有多种信号通路参与疾病发生，单一靶点的免疫疗法似乎并不足以推毁癌细胞，因此，近年来处于研发热度较高的双特异抗体逐渐被认可。双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够特异性识别和结合两个不同的抗原或抗原表位，并在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。区别于单克隆抗体识别单一靶点，双特异性抗体能够将特定的免疫细胞重新定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，或者同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能。
一般来讲，双特异性抗体可以分为两种，其中一种是T细胞募集型，这种类型的抗体在双抗中比率较大，T细胞募集型双抗包括肿瘤细胞靶点和T细胞募集位点，T细胞募集位点是指CD3(T细胞)，而肿瘤细胞靶点通常位于肿瘤细胞上；另外一种双抗为结合双靶点位点(如VEGF-PDGF、VEGF-Ang2)，这种双抗抑制两条信号通路，从而减少耐药产生的可能性。此外，根据不同结构也可将双特异性抗体分为两大类：含Fc片段的双特异性抗体与不含Fc片段的双特异性抗体。含Fc片段的双特异性抗体，具有Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP)。另外，因为含Fc片段的双特异性抗体的分子量相对较大，所以含有的Fc片段有助于抗体后期的纯化，并且其溶解性、稳定性均较高，同时，Fc部分与受体结合，增加了抗体血清半衰期；相反的，不含Fc片段的双特异性抗体，具有较低的免疫原性的特点，同时因相对分子量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。
T细胞表面抗原分化簇3，CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的标志物，由六条肽链组成，每条多肽链胞浆区均有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM)。CD3与T细胞表面膜受体(TCR)组成八条肽链的TCR-CD3复合体，在T细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。CD3分子的主要功能为稳定TCR结构；当TCR特异性识别并结合抗原后，作为诱导T细胞活化的第一信号，CD3参与将信号转导到T细胞胞浆内，从而通过调控引起T细胞的增殖与活化。
肿瘤表面抗原分化簇19，CD19分子又名B4或Leu-12，特异性地表达于正常和恶性B淋巴细胞膜表面，以及滤泡树突状细胞膜表面，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，编码556个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。CD19在整个B细胞的发育和成熟过程中均高表达，直至B细胞分化为浆细胞时，表达量下调，其在成熟B细胞中的表达是未成熟细胞的3倍，被视为B淋巴细胞发育过程中涵盖阶段较长的最为可靠的表面特异性的标志性分子。CD19对B细胞的增殖和分化具有重要的调控作用。CD19在几乎所有的B细胞恶性肿瘤中广泛表达，包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤等，因此，CD19成为B细胞恶性肿瘤治疗的特异性分子靶点。近年来靶向CD19的免疫治疗策略在临床前以及临床研究中广泛发展，例如单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)等，均取得了显著优于常规小分子化疗方案的临床效果，推动了免疫治疗的进展。
目前Blincyto是针对CD3和CD19抗原唯一上市的双特异抗体，Blincyto是用linker直接连接抗CD19轻链可变区、抗CD19重链可变区、抗CD3重链可变区、抗CD3轻链可变区，不含有Fc片段，所以其药物中药效分子的半衰期较短，此外，现有的其它双抗药物分子中，即使为了延长药物半衰期而保留了Fc片段，但Fc区的修饰使得双抗在体内没有天然的单克隆抗体的稳定，而且很容易产生轻重链之间的错配，因此，急需研发一种既能够保留Fc片段，延长药效分子半衰期，又能够结构稳定，避免轻重链分子之间错配的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种含有完整Fc片段，不仅能够延长药效分子半衰期，保证药物分子稳定性，而且能够最大限度保留双特异性抗体的生物学活性的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体，包括能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，所述单链单元和所述单价单元均包括轻链和重链，所述单链单元的所述轻链C末端通过连接子linker与其所述重链N末端连接；所述重链包括重链可变区和重链恒定区，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。
首先，本发明抗CD19抗体采用完整的抗体轻重链结合形式，保持了抗CD19抗体的生物学活性，抗CD3的抗体轻链C末端通过连接子linker与重链N末端连接，保持了抗体与CD3抗原的结合能力，同时避免了抗CD19抗体和抗CD3抗体的轻链与重链之间的错配；通过本发明的双特异性抗体更好的识别两种不同的靶抗原，从而发挥激活免疫细胞，并将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，提高局部免疫细胞浓度，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，最后，本发明中的单链单元和单价单元均包括完整的轻链和重链，保留了Fc片段，能够有效延长药效分子的半衰期。
进一步的，所述连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，所述X为Gly或Ser，所述n为1-6的自然数；
优选的，所述X为Ser；
优选的，所述n为6。
本发明为了避免抗CD3抗体轻重链和抗CD19抗体轻重链的错配，通过连接子linker的特殊结构设计将抗CD3抗体轻重链进行连接，保证了分子结构的稳定性。
进一步的，本发明提供了单链单元的重链可变区和轻链可变区的完整的氨基酸序列，所述单链单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述单链单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
进一步的，本发明提供了单价单元的重链可变区和轻链可变区的完整的氨基酸序列，所述单价单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述单价单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
进一步的，所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种；优选的，所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG4。
本发明进一步限定了单价单元和单链单元的重链恒定区，保留了Fc片段，有效延长了药物中药效分子的半衰期。
进一步的，所述单链单元和所述单价单元均含有修饰的CH3结构域，所述CH3结构域的修饰为非对称的杵臼结构。
本发明通过含有修饰的CH3结构域连接形成的异源二聚体结构非常稳定，并且很难形成同源二聚体。
本发明还提供了一种多肽或蛋白，所述多肽和所述蛋白均包含所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明还提供了一种核苷酸序列或其组合，所述核苷酸序列或其组合编码包含所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的核苷酸序列或其组合。
本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核、酵母或哺乳动物细胞。
本发明进一步的提供了一种药物或药物组合物，其特征在于，所述药物或药物组合物包含所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明进一步的提供了一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体在制备治疗B淋巴细胞系统恶性肿瘤疾病药物中的应用。
本发明的有益效果如下：本发明提供的双特异性抗体能够特异性结合T细胞表面抗原分化簇3即CD3分子和肿瘤表面抗原分化簇19即CD19分子，完整的保留了抗CD19抗体和抗CD3抗体的生物学活性，从而使该双特异性抗体更好的识别肿瘤抗原和效应细胞，并将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，达到特异性杀伤作用，杀伤能力更强，此外，本发明还完整的保留了Fc片段，能够有效延长药物分子的半衰期，提高了抗体的溶解性和稳定性，同时，抗CD3抗体的轻链和重链通过连接子linker进行连接，有效避免了抗CD3抗体和抗CD19抗体的轻重链之间的错配，解决了纯化过程中的难点，为双特异抗体后期的放大生产提供了坚实的基础。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体的分子结构示意图；
图2为本发明实施例4中PTSE–antiCD19H的质粒载体图谱；
图3为本发明实施例4中PTSE–antiCD19L的质粒载体图谱；
图4为本发明实施例4中PTSE-antiCD3的质粒载体图谱；
图5为本发明实施例5中纯化后的双特异抗体SDS-PAGE电泳图；
图6为本发明实施例6中双特异抗体与Raji细胞的结合能力图；
图7为本发明实施例6中双特异抗体与Jukart细胞的结合能力图；
图8为本发明实施例7中双特异抗体介导的PBMC对Raji细胞的杀伤能力图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明构建了一种抗CD3和抗CD19的双特异性抗体分子(抗体命名为JY039)，包含能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，单链单元和单价单元均包括完整的轻链和完整的重链，单价单元包含抗CD19的抗体轻链和重链，单链单元中抗CD3抗体的轻链C末端通过连接子linker与其重链N末端连接；重链包括重链可变区和重链恒定区，轻链包括轻链可变区和轻链恒定区，具体构型示意图如图1所示。
实施例2
本发明在实施例1的基础上，进一步的限定了连接子linker，连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n为1-6的自然数；
优选的，X为Ser；
优选的，n为6。
进一步的，单链单元的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；单链单元的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
其中，SEQ ID NO:1(单链单元的重链可变区的氨基酸序列)；
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID NO:2(单链单元的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。
进一步的，单价单元的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；单价单元的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
其中，SEQ ID NO:3(单价单元的重链可变区的氨基酸序列)；
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID NO:4(单价单元的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK。
进一步的，单链单元的重链恒定区和单价单元的重链恒定区均为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种；优选的，单链单元的重链恒定区和单价单元的重链恒定区均为IgG4。
进一步的，单链单元和单价单元均含有修饰的CH3结构域，CH3结构域的修饰为非对称的杵臼结构，Fc片段的CH3/CH3界面引入非对称异二聚体突变设计(单链单元)T350V/L351Y/F405A/Y407V和(单价单元)T350V/T366L/K392L/T394W。
实施例3
本发明还提供了一种多肽或蛋白，多肽和蛋白均包含抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明还提供了一种核苷酸序列或其组合，核苷酸序列或其组合编码包含的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含核苷酸序列或其组合。
本发明还提供了一种转染的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，宿主细胞包括原核、酵母或哺乳动物细胞。
本发明进一步的提供了一种药物或药物组合物，其特征在于，药物或药物组合物包含抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
本发明进一步的提供了一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体在制备治疗B淋巴细胞系统恶性肿瘤疾病药物中的应用。
实施例4双特异抗体分子表达载体的构建
按照实施例1并参考图1中双特异抗体的结构形式设计相应的基因序列，例如实施例2，选择pTSE作为表达载体，抗体基因由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，基因合成时在抗CD19的抗体轻链、抗CD19的抗体重链和抗CD3单链基因的两侧引入Sall、BamHI酶切位点，然后对pTSE表达载体和合成的抗体基因均进行Sall、BamHI双酶切，并将载体和基因的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的片段回收，最后将回收的目的片段分别连接到pTSE表达载体中，转化到TOP感受态(汇天东方，货号HT702-03)，测序正确后得到含有轻链、重链及单链基因的表达载体(如图2-4所示)，质粒分别命名为：pTSE–antiCD19L、pTSE–antiCD19H、pTSE-antiCD3。利用无内毒素大提试剂盒(购买于康为世纪生物科技有限公司，CW2104)进行质粒大提，具体操作步骤按照试剂盒提供的说明书进行操作，最终测定质粒浓度后，于-20℃保存质粒。
实施例5、双特异抗体分子的表达与纯化
1)双特异抗体的表达
人胚肾细胞(HEK293ES悬浮细胞)在FreeStyle 293Expression Medium(Gibco)中培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在0.2-0.6×106/ml，细胞培养体积为摇瓶容积的15-35％，细胞培养瓶放在摇床(摇床转速:135rpm，温度:37℃，CO2:5％)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的HEK293ES细胞，传代到细胞密度为0.5×106/ml，放置摇床(135rpm，37℃，5％CO2)培养过夜，待第二天进行转染。
转染前将准备好的1×106/ml细胞悬液在摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养2h，转染时，依次加入pTSE–antiCD19L(终浓度0.3ug/ml)、pTSE–antiCD19H(终浓度0.3ug/ml)、pTSE-antiCD3(终浓度0.3ug/ml)、聚乙烯亚胺PEI(终浓度2ug/ml)，混匀，一起共转染到HEK293ES悬浮细胞中，之后，置于摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养40min。转染后的细胞继续在135rpm，37℃，5％CO2摇床中培养，表达抗CD3和CD19的双特异抗体。转染96小时后离心收获上清液体。
2)双特异抗体的纯化
上清液体用0.22uM滤膜过滤，利用亲和层析柱从表达上清中获得带有Fc结构域的抗体。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mM Tris-Hcl0.15M Nacl PH7.0和0.1M柠檬酸-柠檬酸钠PH3.0。通过阳离子交换柱HiTrap-SPFF获得目标双特异抗体(JY039)，最后用PBS缓冲液进行换液浓缩。纯化后的双特异分子还原SDS-PAGE图如图5所示，右边为双特异抗体，从上至下依次为抗CD3、抗CD19的抗体重链、抗CD19的轻链，左侧是蛋白质分子量Marker；结果显示所纯化的双特异抗体含有抗CD3的单链单元、抗CD19抗体的重链和抗CD19的轻链，且每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6、双特异抗体分子与过表达CD19或CD3细胞结合情况
本发明采用过表达的淋巴瘤细胞系Raji(购自ATCC，CCL-86)作为CD19阳性的细胞；采用过表达的T细胞系Jurkat(Jurkat，TIB-152)作为CD3阳性的细胞，用人的IgG(hIgG)作为同型对照。
1、利用流式分析法检测双特异性抗体与Raji细胞的结合活性。
采用过表达CD19的淋巴瘤细胞系(Raji)来检测双特异抗体与细胞表面CD19的结合情况，将JY039的抗CD19序列构建单克隆抗体，用此抗CD19的单克隆抗体以及专利CN105531374 A中的v5851双特异抗体、CN 106062206 A中的v1661双特异抗体与本发明实施例5纯化得到的双特异抗体JY039进行比较，采用步骤如下：
培养足够的Raji细胞，离心收集细胞。同时稀释各种抗体，浓度从1μM开始，5倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+1％FBS洗三遍，再加PBS+1％FBS重悬细胞至4×106个细胞/ml，然后铺细胞于96孔板中，每孔50ul(2×105个细胞)，加入50ul稀释好的双特异抗体，4℃孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的Alexa488标记的抗人IgG-Fc抗体(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30分钟，PBS洗三遍，100ulPBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism5.0进行计算各抗体与Raji细胞的结合亲和力，计算对应的EC50值，具体数据如下：
项目 JY039 v5851 v1661 AntiCD19McAb hIgG
EC50(nM) 1.023 2.486 7.923 0.1910 —
通过上述数据及如图6所示，以非相关抗体同型人IgG(hIgG)做阴性对照，本发明实施例5纯化得到的抗CD3和抗CD19双特异性抗体JY039与CD19阳性的Raji细胞结合活性比抗CD19单克隆抗体与CD19阳性的Raji细胞结合活性稍弱，本发明JY039双特异抗体与Raji细胞的结合活性与专利CN 105531374 A中的v5851双特异抗体与Raji细胞的结合活性相当，但是本发明JY039比CN 106062206 A中的v1661双特异抗体的活性强。证明本发明提供的双特异性抗体JY039较好的保持了其母本抗体特异性结合细胞表面CD19活性。
2、流式分析法检测双特异性抗体与Jurkat细胞的结合活性
采用过表达CD3的T细胞系(Jurkat)来检测双特异抗体与细胞表面CD3的结合情况，将JY039的抗CD3序列构建单克隆抗体，用此抗CD3的单克隆抗体以及专利CN 105531374A中的v5851双特异抗体和CN 106062206 A中的v1661双特异抗体与本发明实施例5纯化得到的双特异抗体JY039进行比较，采用步骤如下：
培养足够的Jurkat悬浮细胞，离心收集细胞。同时稀释各种抗体，浓度从5μM开始，5倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。接下来的实验过程与上述实施例相同，将100ulPBS重悬的细胞，上机检测，以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism5.0进行分析计算双抗体与Jurkat细胞的结合亲和力，计算对应的EC50值，具体数据如下：
项目 JY039 v5851 v1661 AntiCD3McAb hIgG
EC50(nM) 21.57 59.84 117.9 8.560 —
通过上述数据及如图7所示，以非相关抗体同型人IgG(hIgG)做阴性对照，本发明实施例5得到的JY039双特异性抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性比抗CD3的单克隆抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性稍弱，但是JY039双特异性抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性比专利CN 105531374 A中的v5851双特异抗体和CN 106062206 A中的v1661双特异抗体与CD3阳性的Jurkat细胞的结合活性强，而同型对照(hIgG)则没有结合，所以本发明提供的双特异性抗体JY039较好的保持了其母本抗体特异性结合细胞表面CD3活性。
实施例7、双特异抗体分子介导的PBMC对Raji细胞的杀伤作用
A)PBMC分离
取四只SepMate分离管，使用移液管加入约15mL人单个核细胞分离液，避免气泡产生，液面应刚好没过管中托架；将全血小心转移至两个50mL离心管中，每管25mL，各加入25mLPBS混匀；沿管壁将1:1稀释后的全血缓缓加入到SepMate分离管中，不得破坏液体分层；1200g离心10分钟；使用移液管吸取托架上方的PBMC层，转移至新的50mL离心管中，使用PBS补齐体积至50mL，1200g离心10分钟；弃上清，加入25mLPBS重悬，1200g离心10分钟；弃上清，加入2mL红细胞裂解液，室温孵育5分钟，加入约20mLPBS，1200g离心10分钟；重悬，使用40μm细胞筛去除大块细胞团。细胞台盼蓝计数并记录PBMC总量。
B)LDH检测
以在1640培养基(Gibico，A10491-01)+10％FBS(VisTech，SE200-ES)，37℃，5％CO2培养箱培养的Raji作为靶细胞，接种密度均为1×104/孔，将相应细胞稀释至1×105/mL，每孔加入100μL细胞悬液；分离得到的PBMC作为效应细胞时，效靶比采用25:1，将PBMC稀释至5×106/mL，每孔加入50μL细胞悬液；在实验孔内加入梯度浓度的抗体药物，初始浓度0.1μM，5倍梯度稀释，12个梯度，每孔加入50μL抗体稀释样品；另外设置背景组(靶细胞+效应细胞)，混合最大组(靶细胞+效应细胞)，37℃，5％CO2培养箱培养培养18h后，向混合最大孔内加入20μL Lysis裂解液，37℃孵育90分钟；以3000rpm离心5分钟后，取50μL上清液，加50μLLDH底物；室温避光孵育20分钟，490nm处检测吸光度，同时计算对应的EC50值，数据如下：
细胞杀伤率(％)＝(实验孔-背景孔)/(混合最大孔-背景孔)×100；
项目 JY039 v1661 v5851 AntiCD19McAb AntiCD3McAb hIgG
EC50(uM) 1.26E-6 9.24E-5 3.00E-5 2.22E-4 — —
通过上述数据及结果如图8所示，本发明实施例5纯化得到的JY039双特异性抗体对靶细胞的杀伤能力明显优于专利CN 105531374 A和CN 106062206 A的双特异抗体(v5851、v1661)，更明显地优于CD19单克隆抗体和CD3单克隆抗体，证明本发明提供的JY039双特异性抗体在保持了其与过表达CD19的淋巴瘤细胞系(Raji)及其与表达CD3的T细胞系(Jurkat)的结合能力的基础上，杀伤效果明显。
经上述实施例证明，本发明的双特异性抗体在保持原有抗CD19抗体和抗CD3抗体体内生物学活性的同时，通过靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。本发明的双特异性抗体为单链单元-单价单元形式，相较于ScFv，CH1和CL的存在能够帮助VH和VL形成稳定的结构，因此，单链单元-单价单元比ScFv形式在结构上更加稳定。本发明的单价单元与单链单元之间通过IgG4的CH3/CH3界面引入非对称异二聚体突变设计，进行连接，该结构与常用的KiH结构不同，形成的异源二聚体非常稳定，并且很难形成同源二聚体。本发明的双特异性抗体可用于制备非正常表达的B淋巴细胞相关疾病和肿瘤相关疾病的治疗药物，肿瘤相关疾病为CD19抗原阳性的B细胞恶性肿瘤。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (12)

1.一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体，其特征在于，包括能够与CD3抗原特异性结合的单链单元和能够与CD19抗原特异性结合的单价单元，所述单链单元和所述单价单元均包括轻链和重链，所述单链单元的所述轻链C末端通过连接子linker与其所述重链N末端连接；所述重链包括重链可变区和重链恒定区，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。
2.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，其特征在于，所述连接子linker的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，所述X为Gly或Ser，所述n为1-6的自然数；
优选的，所述X为Ser；
优选的，所述n为6。
3.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，其特征在于，所述单链单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述单链单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，其特征在于，所述单价单元的所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；所述单价单元的所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
5.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，其特征在于，所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种；优选的，所述单链单元的所述重链恒定区和所述单价单元的所述重链恒定区均为IgG4。
6.如权利要求1所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体，其特征在于，所述单链单元和所述单价单元均含有修饰的CH3结构域，所述CH3结构域的修饰为非对称的杵臼结构。
7.一种多肽或蛋白，其特征在于，所述多肽和所述蛋白均包含权利要求1-6任一项所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
8.一种核苷酸序列或其组合，其特征在于，所述核苷酸序列或其组合编码包含权利要求1-6任一项所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
9.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求8所述的核苷酸序列或其组合。
10.一种转染如权利要求9所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核、酵母或哺乳动物细胞。
11.一种药物或药物组合物，其特征在于，所述药物或药物组合物包含如权利要求1-6任一项所述的抗CD3和抗CD19双特异性抗体。
12.一种抗CD3和抗CD19双特异性抗体在制备治疗B淋巴细胞系统恶性肿瘤疾病药物中的应用。
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