JP7264383B2 - 血中半減期の向上のための抗体Fc変異体 - Google Patents
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Description
a)前記ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階;及び
b)前記宿主細胞により発現したポリペプチドを回収する段階。
a)前記ポリペプチドを含む抗体を発現する宿主細胞を培養する段階;及び
b)前記宿主細胞から発現した抗体を精製する段階。
a)カバットのEUナンバリングシステムに従うM428L突然変異を含むFc変異体ライブラリーを構築する段階;及び
b)前記M428L突然変異を含むFc変異体から、pH5.6~6.4でFcRnに対する親和度が野生型に比べて高いFc変異体を選別する段階。
ed.,1995)に詳細に記載されている。
(i)本発明は、ヒト抗体Fcドメインのアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸配列に置換されたFc変異体を含むポリペプチド又はこれを含む抗体を提供する。
[実施例1.Fc変異体ライブラリーを探索するためのFcRn(neonatal Fc receptor)の発現及び精製]
FcRnにpH-依存的結合力が向上したFc変異体を探索するためにtetrameric FcRnとdimeric FcRnの発現及び精製を行うための発現用ベクターを準備した(図1)。tetrameric FcRnを得るためにpMAZ-β2microglobulin-GSlinker-FcRnα-chain-streptavidin-HisのDNAプラスミドを確保した。このDNAをHEK293F細胞にコトランスフェクション(co-transfection)し、300ml規模で臨時発現させた。培養を終えた培養液は、7000rpm、10分間遠心分離によって除去し、上澄み液を取って25xPBSを用いて平衡化した。ボトルトップフィルターを用いて0.2μmフィルター(Merck Millipore)で濾過した。PBSで平衡化した後、Ni-NTAレジン(Qiagen)を入れ、16時間4℃でFcRnとレジンを結合させた。FcRnと結合したレジンをカラムに流してから、50ml wash-1バッファー(PBS)、25ml wash-2バッファー(PBS+10mMイミダゾール)、25ml wash-3バッファー(PBS+20mMイミダゾール)、200μl wash-4バッファー(PBS+250mMイミダゾール)を流してtFcRn以外のタンパク質を除去した。そして、2.5ml溶出バッファー(PBS+250mMイミダゾール)を流し、tFcRnを得た。そして、バッファーを変えるためにCentrifugal Filter Units(Merck Millipore)を使用した。Dimeric FcRnを得るためにOslo大学から受けたpcDNA-FcRnα-chain-GST-β2 microglobulinプラスミドを確保した。このDNAをHEK293F細胞にコトランスフェクションし、300ml規模で臨時発現させた。培養済み培養液は7000rpm、10分間遠心分離して除去し、上澄み液を取って25xPBSを用いて平衡化した。ボトルトップフィルターを用いて0.2μmフィルター(Merck Millipore)で濾過した。PBSで平衡化した後、Glutathione agarose 4B(incospharm)レジンを入れて16時間4℃でFcRnとレジンを結合させた。FcRnと結合したレジンをカラムに流してから10ml洗浄バッファー(PBS)を流し、dFcRn以外のタンパク質を除去した。そして、2.5ml溶出バッファー(50mM Tris-HCl+10mM
GSH pH8.0)を流し、バッファーを変えるためにCentrifugal Filter Units 3K(Merck Millipore)を使用した。精製後、SDS-PAGEゲルを用いて大きさを確認した(図1)。精製されたtetrameric FcRnとdimeric FcRnに蛍光信号が生成されるようにAlexa
488を用いて蛍光標識をした。
トラスツズマブ(Trastzumab)にあるFc部分の遺伝子(配列目録第29配列)を、SfiI制限酵素を用いてpMopac12-NlpA-Fc-FLAGを作製した。作製されたベクターに基づいて、Fc内に2つのMet部分をcysとMet以外の残り18個の他のアミノ酸に置換され得るように、pMopac12-seq-Fw、Fc-M252-1-Rv、Fc-M252-2-Rv、Fc-M252-3-Rv、Fc-M428-Fw、Fc-M428-1-Rv、Fc-M428-2-Rv、Fc-M428-3-Rv、Fc-M428-frg3-Fw、pMopac12-seq-Rvプライマーを用いてライブラリーインサートを作製した(表1、図2)。作製されたインサートをSfiI制限酵素処理して同じSfiIで処理されたベクターとライゲーションした。その後、大腸菌Jude1((F’[Tn10(Tetr)proAB+lacIqΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74deoR recA1araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG)に形質転換し、巨大Fc変異体2Mライブラリー(ライブラリーサイズ:1×109)を構築した。
構築された2M Fc変異体ライブラリー探索のために、大腸菌Jude1細胞に形質転換されているFc変異体ライブラリー細胞1mlを37℃250rpm振盪(shaking)条件で2%(w/v)グルコースに、抗生剤はクロラムフェニコール(40μg/mL)の含まれたTB(Terrific Broth)培地に入れて4時間培養した。振盪培養されたライブラリー細胞をTB培地に1:100で接種した後、37℃250rpm振盪によりOD600が0.5に到達するまで培養した。その後、冷却(cooling)のために20分間25℃で培養した後、1mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)を入れて発現誘導をした。培養が終わった後、細胞を回収してOD600ノーマライズによって均一の量ずつ14000rpm、1分間遠心分離して細胞を収穫した。1mlの10mM Tris-HCl(pH8.0)を添加して細胞を再懸濁(resuspension)し、1分間遠心分離する洗浄過程を2回反復した。1mlのSTE[0.5Mスクロース、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)]で再懸濁して37℃、30分間回転させ、細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を捨てた後、1mlの溶液A[0.5Mスクロース、20mM MgCl2,10mM MOPS pH6.8]を添加して再懸濁及び遠心分離をした。1mlの溶液Aと50mg/mlリゾチーム溶液20μlを混合した溶液を1ml添加して再懸濁した後、37℃、15分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄み液を除去し、1mlのPBSで再懸濁した後に300μlを取り、700μlのPBSと蛍光標識されたtetrameric FcγRIIIa-Alexa 488 flourプローブを共に入れて常温で回転させ、スフェロプラスト(spheroplast)に蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、1mlのPBSで1回洗浄した後にフローサイトメトリー(Flow cytometry:S3 sortor(Bio-rad))を用いて、高い蛍光を示す上位3%細胞を回収するために選別(sorting)作業を行い、蛍光が高い細胞の純度を高めるために、選別された細胞をさらに再選別(resorting)した。再選別したサンプルを、pMopac12-seq-FwとpMopac12-seq-Rvプライマーを用いてTaqポリマーレイズ(Biosesang)によりPCRで遺伝子増幅し、SfiI制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を経てソートされた細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリーを作製した。この過程を総2ラウンドにわたって反復した後、約40個の個別クローンをそれぞれ分析し、野生型Fcに比べてpH5.8でFcRnと高い親和度を示すM428L変異体を選別した(図3)。
見出されたM428Lを鋳型とし、さらに2種のライブラリーを作製した。一番目のライブラリーは、error prone PCR手法を用いてFcに変異を導入し、エラーライブラリーを作製した。エラー率は、Fc(680bp)に0.3%エラー(2.04bp)が入るようにep-Fc-Fw、ep-Fc-Rvプライマーを用いてライブラリー(ライブラリーサイズ:2×108)を作製した。二番目のライブラリーは、M428Lを鋳型とし、FcとFcRn結合部位を選定し、該当の部位に無作為に突然変異が導入されるように、pMopac12-seq-Fw、pMopac12-seq-Rv、Fc-Sub#0-Rv、Fc-Sub#1-1-Fw、Fc-Sub#1-2-Fw、Fc-Sub#1-3-Fw、Fc-Sub#1-4-Fw、Fc-Sub#1-5-Fw、Fc-Sub#1-Rv、Fc-Sub#2-1-Fw、Fc-Sub#2-2-Fw、Fc-Sub#2-3-Fw、Fc-Sub#2-Rv、Fc-Sub#3-1-Fw、Fc-Sub#3-2-Fw、Fc-Sub#3-3-Fw、Fc-Sub#3-4-Fwプライマーを用いてポイントライブラリーを作製した(図4)。その後、上記のような方法でJude1に形質転換してFc変異体ライブラリーを構築した。
先に見出されたM428Lを基本としてさらに作製されたエラーライブラリーとポイントライブラリーに対して、上記のような方法で選別及び再選別作業を行った。エラーライブラリーは5ラウンドにわって反復し、ポイントライブラリーは1回選別を行った後、両ライブラリーから得られたグループでそれぞれ約100個の個別クローンを分析し、pH5.8でFcRnに高い親和度を示し、pH7.4では低い親和度を示すFc変異体を選別した。FACSを用いてそれぞれを分析した結果、エラーライブラリーから見出されたEFc6、EFc29、EFc41、EFc46、EFc70、EFc90EFc82、EFc88の方が野生型Fcに比べてpH5.8において高い蛍光強度を示したが、先行研究で見出されたメディミューン(Medimmune)のYTE(Gabriel J.Robbie et al.,Antimicrob Agents Chemother.2013Dec;57(12):6147-6153)やゼンコア(Xencor)のLS(米国特許登録番号第8,324,351号)に比べてはpH5.8で高い蛍光強度を示し、pH7.4でLSに比べて低い蛍光を示す変異体はEFc6、EFc29、EFc41、EFc82、EFc88であることを確認した。また、ポイントライブラリーから見出された変異体PFc3、PFc29、PFc41はYTEやLSに比べてpH5.8で高い蛍光強度を示したが、PFc30は低い蛍光強度を示した。そして、PFc29、PFc41は、pH7.4でLSに比べて低い蛍光を示すことを確認した。最終的に、血中半減期を向上させるものと予想されるEFc6、EFc29、EFc41、EFc82、EFc88、PFc3、PFc29、PFc41を選定した(表2、図5)。
本発明では、IgG1治療用抗体の代表であるトラスツズマブ(trastuzumab,Herceptin(登録商標))を選定して、見出されたFc変異体を導入し、後に対照群としようとした。
CHO懸濁培養で生産された商業用(commercial)トラスツズマブと違い、研究室で作製(in-house)されたin-houseトラスツズマブはHEK293で生産したので、選別されたFc-変異体を導入してその機能を分析する前に、2種の基本特性分析を行った。CE(Capillary Electrophoresis:PA800 Plus,Beckman coulter)による分析は、pH3~10の勾配を形成するPharmalyte 3-10両性担体(GE Healthcare,17-0456-01)を使って試料のpI値及びCharge variantsを分析した。分析の結果、SEC(Size Exclusion Chromatography:Tskgel G3000swxl,Tosoh)によるimpurityはなく、CE(Capillary Electrophoresis:PA800 Plus,Beckman coulter)によるcharge variantによるpI値は、商業用では8.27~8.74であり、メインピークのPIが8.62であり、自体生産したトラスツズマブのPIは8.29~8.78、メインピークは8.65であって、両者が類似していた(図8)。しかし、cIEF分析の結果、研究室で作製したトラスツズマブではメインピーク以外のピークにおける若干の含量差が観察され、これは、商業用はCHOで生産されるが、研究室で作製したトラスツズマブの生産細胞株がHEK293であって、グリカンパターンが異なるため、シアル酸などによる酸化(oxdation)である可能性もあり、グリカン分析も行った(図9)。
商業用と研究室で作製した野生型に加えて、LS(XenCor)、YTE(MedImmune)、428Lなどの対照群変異体5種と、PFc29、PFc41、EFc29、EFc41及びEFc82などの5種の選別された変異体をHEK293F動物細胞に形質注入した。形質注入一日前にHEK293F細胞を1×106cells/mlの密度で300ml継代培養し、翌日、ポリエチレンイミン(PEI,Polyscience,23966)を用いて形質注入した。Freestyle293発現培養液(Gibco,12338-018)30mlに変異体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を2:1の割合でまず混ぜ、次にPEI:変異体遺伝子=1:2割合で混ぜて常温で20分間置いてから、前日に継代培養しておいた細胞に混ぜて振盪CO2インキュベーターで37℃、125rpm、8%CO2条件で6日間培養した後、遠心分離して上澄み液だけを取った。
Tris(pH9.0)500ulを混ぜて中和させた後、各切片を、Bradford(BioRad,5000001)溶液でタンパク質を確認して新しいチューブに取った。30K Amicon ultra centrifugal filter(UFC903096)を用いて精製された変異体を濃縮した後、物成分析した(図10及び図11)。
先に準備した変異体のFcRn pH-依存的結合力と効果機能を示させ得るFcγRs、C1qとの結合力を測定するためにELISA測定を行った。まず、FcRnにpH-依存的結合力を測定するために、0.05M Na2CO3、pH9.6に4μg/mlで希釈したIgG Fc変異体をそれぞれ50μlずつ底平ポリスチレン高結合96ウェルマイクロプレート(Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate)(costar)に4℃、16時間固定化した後、100μlの4%スキームミルク(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH5.8/pH7.4)で常温で2時間ブロッキングした。0.05% PBST(pH5.8/pH7.4)180μlで4回ずつ洗浄過程を行った後、1% スキームミルク(in 0.05% PBST pH5.8/pH7.4)で連続して希釈されたFcRnを50μl各ウェルに分注し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-GST-HRP conjugate(GE Healthcare)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。1-Step
Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific)を50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4を50μlずつ入れて反応を終了した後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)を用いて分析した。見出した変異体は、FcRnに対してpH5.8ではLS変異体と類似な結合力を有し、pH7.4ではLSに比べて解離しやすいことが観察された(図12)。
このように、物成分析から確認された商業用及び研究室作製トラスツズマブ以外の選別されたFc変異体のpHによるヒトFcRnとの結合力差を比較するために、Biacore T200(GE Healthcare)装備を用いてKD値を測定比較した。pH6.0条件では文献(Yeung YA.et al.,J.Immunol,2009)によってantigen-mediated antibody capture方式でヒトFcRnを検体(analyte)とした。HER2 ECDドメインが~3,000RU(response units)レベルで固定されたCM5チップ表面にFc変異体をリガンドとして展開液(running buffer)(50mM Phosphate、pH6.0、150mM NaCl、0.005% surfactant P20、pH6.0)に希釈して~300RUレベルで注入しキャプチャーした。検体であるmonomeric FcRn(Sinobiological inc.,CT009-H08H)は、125nMから始めてFcRn展開液に順次に希釈して30ul/min流速で2分間注入し、2分間解離(dissociation)して結合力を測定した。各サイクルごとに10mMグリシン(pH1.5)の30ml/minの流速で30秒間regenerationを行った。センソグラムはBIAevaluation software(Biacore)で1:1結合モデル(binding model)を適用して分析した。その結果、Fc変異体は、対照群として用いられた商業用トラスツズマブ(15nM)及び研究室作製トラスツズマブ(16.9nM)とbackboneとして用いられた428L(9nM)に比べては結合力が良くなったが(PFc3:5.6nM、PFc29:6.8nM、PFc41:5.9nMなど)、世界最高として知られたYTE(5.7nM)及びLS(4.1nM)に比べては結合力が多少劣った。しかし、その値の差はほとんど誤差範囲内であり、類似していることを確認した。pH7.0条件では、リガンドと検体(analytes)がよく結合しないので、monomeric hFcRnを直接固定化(direct immobilization)した後、Fc変異体を濃度別に注入するavid format(Zalevsky J et al.Nat.Biotechnol,2010)で測定した。ヒトFcRn
ECDドメイン(Sino Biological)をCM5チップ表面に~1,500RUレベルで固定化した。FcRnが固定されたチップの表面にFc変異体を3000nMから始めてHBS-EP(pH7.4)に順次に希釈して5ml/minの流速で2分間注入した。結合したFc変異体は2分間解離させ、各cycleが終わると、チップ表面を100mM Tris(pH9.0)でregenerationした(conatat time 30秒;流速30ul/min)。このうち、Fc変異体の2種(PFc29、PFc41)がpH6.0条件で高い結合力を維持しながらpH7.4条件ではYTEとLSよりも速く解離すること(ELISA結果と一致)から、半減期増加効果を期待できることを予想し(図13)、実際にヒトFcRn Tgマウスで体内薬動学実験を進行した。
ヒトFcRn Tgマウスと遺伝的バックグラウンドが同じB6一般マウス(中央実験動物センター、C57BL/6J(B6))におけるPK分析の結果、論文で報告された通り、一般マウスFcRnとヒト抗体のFcとの親和力が、ヒトFcRnとヒト抗体Fcに比べて高いことを確認した。しかし、一般マウスにおけるPK値は、研究室作製及び商業用抗体間の差異(variation)があり、研究室作製抗体が不安定(unstable)に見えたが、Tgマウス(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Prkdcscid Tg(Jackson lab,CAGFCGRT)276Dcr/DcrJ)では、一般マウスよりはAUCが多少低いが、研究室作製及び商業用抗体間の薬動学傾向は類似に測定されることが確認された。したがって、Tgマウスにおける実際の体内薬動学分析において、HEK293で生産した研究室作製由来Fc変異体の実験測定に問題がないことを確認した(図14)。
ELISAとBiaCore装備でpH6.0及びpH7.4で測定した結合力結果に一貫性があり、これに基づいて、pH6.0酸性条件でLSと同等に結合力が良く、pH7.4で解離力がLSよりも高かった、PFc29とPFc41の2種類を選別した。これと同時に、現在世界最高とされているXenCorのLS mutantとMedImmuneのYTEを対照群とし、総4種のトラスツズマブFc変異体をヒトFcRn Tgマウス20匹(各群当たり5匹ずつ5mg/kgをI.V(微静脈)で注射後、顔面静脈から採血(総12回→0秒、30秒、1時間、6時間、24時間、3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、50日))から得られた血液を用いてELISAで濃度分析した後、WinNonlinでNCA(non-compartmental analysis)した。ELISAとBiaCore分析の結果において、予想の通り、Fc変異体の2種(PFc29及びPFc41)とも体内半減期増加効果を示し、特にPFc29の場合、先行研究で見出されたLSに比べても高い半減期効果を示した(図15、表3)。
time concentration;Cmax,maximal concentration;AUClast,area under the curve from
administration to the last measured concentration;AUCinf, area under the curve from administration to infinity;AUC%Extrap,percentage of the extrapolated area under the curve at the total area under the curve;Vz,volume of distribution;CL,clearance。
FcγRsとの結合力を測定するために0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlで希釈したIgG Fc変異体をそれぞれ50μlずつ底平ポリスチレン高結合96ウェルマイクロプレート(costar)に4℃、16時間固定化した後、100μlの4%スキームミルク(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH7.4)で常温で2時間ブロッキングした。0.05% PBST(pH7.4)180μlで4回ずつ洗浄過程を行った後、1%スキームミルク(in 0.05% PBST pH7.4)で連続希釈されたFcγRsを50μl各ウェルに分注し、常温で1時間反応させた。洗浄過程後、FcRsはanti-GST-HRP conjugate(GE Healthcare)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific)を50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4を50μlずつ入れて反応を終了した後、Epoch Microplate
Spectrophotometer(BioTek)を用いて分析した。各実験はいずれも2連(duplicate)で行い、ELISAの結果、それぞれのFcγRs[FcγRI、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、FcγRIIIa(F))に対する結合力が確認できた(図16)。
トラスツズマブFc変異体の抗体依存性細胞-媒介の細胞毒性ADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity)活性は、ADCCリポーターバイオアッセイキット(reporter bioassay kit,Promega,G7010)を用いて評価した。具体的に、標的細胞(Target
cells)として用いられるSKBR-3を96-ウェル組織培養プレートの各ウェルに5X103cells/100μlずつ分注した後、37℃ CO2培養器で20時間培養した。20時間経過後、マルチピペットを用いてプレートの各ウェルにSU95μlの培養培地を除去し、ADCCリポーターバイオアッセイキットから提供されたADCCアッセイバッファー25μlを各ウェルに分注した。Normal IgG、トラスツズマブとトラスツズマブFc変異体は、ADCCアッセイバッファーに濃度別に希釈して準備した後、細胞が存在する96-ウェル組織培養プレートの各ウェル当たり25μlずつ分注し、効果器細胞(effector cells)を添加するまで常温に置いた。キットから提供する効果器細胞は、37℃恒温水槽で2~3分間溶かした後に630μlを取り、ADCCアッセイバッファー3.6mLと混合した。標的細胞と抗体希釈物を含むプレートに、準備した効果器細胞をウェル当たり25μlずつ分注した後、37℃ CO2培養器で6時間反応させた。時間が経過するとプレートを取り出して15分間常温に置いた後、Bio-GloTMルシフェラーゼアッセイ試薬をウェル当たり75μlずつ添加し、5分間常温で反応させた。反応後、ルミノメーター(luminometer,Enspire multimode plate reader)を用いて各ウェルのルミネセンス(luminescence)を測定した。各試験抗体のADCC活性度は、実験した結果の平均値を誘導倍率(Fold induction)で表示し、次の式によって決定した:
Fold induction=
RLU(induced1-background2)/RLU(noantibodycontrol3-background)
1.induced:標的細胞、試験抗体そして効果器細胞が混合された試料から得られたRLU値
2.background:ADCCアッセイバッファーから得たRLU値
3.no antibody control:標的細胞と効果器細胞だけが混合された試料から得たRLU値。
C1qとの結合力を測定するために0.05M Na2CO3 pH9.6に4μg/mlで希釈したIgG Fc変異体をそれぞれ50μlずつ底平ポリスチレン高結合96ウェルマイクロプレート(costar)に4℃、16時間固定化した後、100μlの4%スキームミルク(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH7.4)で常温で2時間ブロッキングした。0.05% PBST(pH7.4)180μlで4回ずつ洗浄過程を行った後、1%スキームミルク(in 0.05% PBST pH7.4)で連続希釈されたComplement C1q Human(Millipore)を50μl各ウェルに分注して常温で1時間反応させた。洗浄過程後、anti-C1q-HRP conjugate(Invitrogen)50μlずつを用いて常温で1時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。1-Step Ultra TMB-ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific)を50μlずつ添加して発色した後、2M H2SO4を50μlずつ入れて反応を終了させた後、Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)を用いて分析した。分析の結果、C1q結合力が、先行研究で見出されたLSとYTEに比べて、本研究で見出したPFc29の方が高かった(図19)。
Claims (9)
- ヒトIgG1またはIgG4抗体Fc変異体を含むポリペプチドであって、
前記Fc変異体はアミノ酸置換によって野生型に比べて半減期(Half-life)が増加したものであり、
前記Fc変異体は、野生型(wild type)ヒト抗体FcドメインでカバットのEUナンバリングシステム(Kabat EU numbering system)に従うM428L及びL309Gのアミノ酸置換のみを半減期の増加のための変異として含む、ポリペプチド。 - 請求項1のポリペプチドを含む抗体。
- 前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ミニボディー(minibody)、ドメイン抗体、二重特異的抗体、抗体模倣体、キメラ抗体、抗体接合体(conjugate)、ヒト抗体又はヒト化抗体であるか、又はその断片であることを特徴とする、請求項2に記載の抗体。
- 請求項1のポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項4の核酸分子を含むベクター。
- 請求項5のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1のポリペプチド、請求項2の抗体、請求項4の核酸分子又は請求項5のベクターを含む組成物。
- 下記の段階を含む、野生型に比べて半減期が増加したヒトIgG1またはIgG4抗体Fc変異体を含むポリペプチドの製造方法:
a)請求項1のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階;及び
b)前記宿主細胞により発現したポリペプチドを回収する段階。 - 下記の段階を含む、野生型に比べて半減期が増加したIgG1またはIgG4抗体の製造方法:
a)請求項1のポリペプチドを含む抗体を発現させる宿主細胞を培養する段階;及び
b)前記宿主細胞から発現した抗体を精製する段階。
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