CN110691796B - 用于增加血液半衰期的抗体fc变体 - Google Patents

用于增加血液半衰期的抗体fc变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含Fc变体的多肽或包含该多肽的抗体，其中用不同的氨基酸序列置换人抗体Fc结构域的氨基酸序列的一部分。本发明的Fc变体可以用于多种抗体和Fc融合构建体中。在一个方面，本发明的抗体或Fc融合构建体是用于治疗、诊断或研究的试剂，优选为治疗性试剂。本发明的Fc变体可以通过优化氨基酸序列的一部分而使体内半衰期最大化，并且可用于癌症的治疗。本发明的抗体和Fc融合构建体用于杀伤靶抗原，例如含有癌细胞的靶细胞。替代地，本发明的抗体和Fc融合构建体用于阻断、拮抗或干扰靶抗原，以便拮抗例如细胞因子或细胞因子受体。

Description

用于增加血液半衰期的抗体FC变体
技术领域
本发明涉及具有增加的血液半衰期的新型抗体Fc变体和用于制备抗体Fc变体的方法。
背景技术
随着生物技术如基因重组和细胞培养的最新进展，在世界范围内对蛋白质的结构和功能进行了大量研究。生物技术促进人们更好地理解重要现象，并在阐明各种疾病的发病机理以为疾病的有效诊断和治疗铺平道路，从而极大地改善生活质量方面起着决定性作用。特别地，由于1975年开发了通过将B细胞与骨髓瘤细胞融合来产生单克隆抗体的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature，256：495-497，1975)，所以在包括癌症、自身免疫性疾病、炎症、心血管疾病和感染的临床应用中已经对使用治疗性抗体的免疫疗法进行了广泛研究和开发。
与现有的小分子药物相比，治疗性抗体对靶标的特异性更高、生物毒性更小且副作用更少。治疗性抗体的另一个优势是它们的长的血液半衰期(约3周)。由于这些优点，治疗性抗体被认为是最有效的癌症治疗方法。实际上，大型制药公司和研究机构已将其研发能力集中在特异性结合并有效去除包括致癌因子的癌细胞的治疗性抗体上。罗氏、安进、强生、雅培和BMS是目前正在开发治疗性抗体药物的主要制药公司。特别地，罗氏公司开发了用于抗癌治疗的三种新颖的治疗性抗体，即赫赛汀、阿瓦斯汀和美罗华，在2012年，其治疗性抗体销售额达到195亿美元，在全球市场上获得了可观的利润，目前引领抗体药物的全球市场。由于类克(Remicade)销量的增长，开发类克的强生公司在全球抗体市场中正在迅速扩张。众所周知，其他制药公司例如雅培和BMS拥有许多处于开发最后阶段的治疗性抗体。结果，包括对目标疾病特异且几乎没有副作用的治疗性抗体在内的生物医学正在迅速取代主导全球制药市场的小分子药物。
抗体的Fc区域募集免疫白细胞或血清补体分子，然后触发缺陷细胞如肿瘤细胞或受感染细胞的清除。Cγ2和Cγ3结构域之间的Fc界面介导与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用，其结合使内吞的抗体从内体循环回血流(Raghavan等人，1996，Annu Rev Cell DevBiol 12：181-220；Ghetie等人，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766)。该过程，加上由于全长IgG抗体分子的大尺寸而导致的肾过滤阻碍，使得抗体血清的半衰期延长为1周至3周。此外，Fc与FcRn的结合在抗体转运中起关键作用。因此，Fc区域对于通过细胞内运输和循环机制延长循环抗体的血清持久性至关重要。
考虑到治疗剂的半衰期，作为治疗剂的抗体或Fc-融合蛋白的施用需要预定的注射频率。较长的体内半衰期可减少注射频率或降低剂量。因此，在目前正在进行的许多临床研究中，许多努力集中在通过将突变引入Fc结构域以增加抗体的半衰期或将变体引入Fc结构域以实现最大的ADCC效应，来开发下一代抗癌治疗性抗体和抗癌治疗性蛋白(Modifiedfrom Cancer Immunol Res.2015/Thomson Reuters)。
然而，尽管研究小组致力于开发针对FcRn的结合亲和力增强的一些蛋白和抗体，并且通过将一些突变引入Fc结构域来延长体内半衰期，但仍未实现体内半衰期的显著增加。在这些情况下，迫切需要开发最佳突变的抗体。
提供背景技术的描述仅仅是为了更好地理解本发明的背景，而不应被认为对应于本领域技术人员已知的现有技术。
发明详述
发明要解决的问题
本发明人认真地进行了研究，以有效地增加现有治疗性蛋白或抗体的体内半衰期，结果发现通过用不同的氨基酸序列置换野生型Fc结构域的氨基酸序列的一部分来优化治疗性蛋白或抗体，使得可以在保持其卓越活性的同时最大化地延长血液半衰期。
本发明的一个目的是提供一种包含Fc变体的多肽，该Fc变体通过用不同的氨基酸序列置换人抗体Fc结构域的氨基酸序列的一部分而产生。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述多肽的抗体。
本发明的另一个目的是提供一种编码所述多肽的核酸分子。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述核酸分子的载体。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种包含多肽、抗体、核酸分子或载体的组合物。
本发明的另一个目的是提供制备多肽或抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供筛选多肽的方法。
根据本文的详细描述、权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将变得更加显而易见。
解决问题的手段
本发明的一个方面提供了一种包含Fc变体的多肽，该Fc变体通过用不同的氨基酸序列置换人抗体Fc结构域的氨基酸序列的一部分而产生。
本发明的另一个方面提供了一种用于增加治疗性抗体或蛋白的血液半衰期的组合物，该组合物包含通过用不同的氨基酸序列置换人抗体Fc结构域的氨基酸序列的一部分而产生的Fc变体。
本发明人试图找到一种有效地增加现有治疗性蛋白或抗体的体内半衰期的方法，结果发现一种包含Fc变体的治疗性蛋白或抗体可以实现最大的体内半衰期，该Fc变体通过用不同的氨基酸序列置换和优化野生型Fc结构域的氨基酸序列的一部分而产生。
抗体是与特定抗原特异性结合的蛋白质。天然抗体是分子量为约150000道尔顿的异二聚糖蛋白，通常由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。
本发明中使用的人抗体属于以下五种主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。人抗体优选是IgG抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个Fab片段和一个Fc片段，而人IgG分子的Fc区域通过木瓜蛋白酶消化N端的Cys226而产生(Deisenhofer，Biochemistry 20：2361-2370，1981)。
抗体Fc结构域可以是IgA、IgM、IgE、IgD或IgG抗体或其修饰的Fc结构域。在一个实施方案中，结构域是IgG抗体的Fc结构域，例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体的Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域可以是IgG1 Fc结构域，例如抗HER2抗体的Fc结构域，优选曲妥珠单抗的Fc结构域，更优选具有SEQ ID NO：28所示序列的Fc结构域。本发明的多肽可以任选地被部分或完全糖基化。除了Fc结构域之外，本发明的多肽还可包括一个或多于一个源自抗体的区域。另外，本发明的多肽可以包括源自抗体的抗原结合结构域，并且可以与另一多肽形成抗体或抗体样蛋白。
在此，根据本领域通常使用的Kabat EU编号系统来命名抗体Fc结构域的氨基酸残基，如Kabat等人，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，1991中所述。
根据本发明的一个优选实施方案，经置换的Fc变体包括根据Kabat EU编号系统的M428L作为氨基酸置换。
根据本发明的一个优选实施方案，经置换的Fc变体包括据Kabat EU编号系统的a)M428L和b)Q311R或L309G作为氨基酸置换。
根据本发明的一个优选实施方案，经置换的Fc变体包括根据Kabat EU编号系统的P228L和M428L作为氨基酸置换。
根据本发明的一个优选实施方案，根据Kabat EU编号系统，包括氨基酸置换P228L和M428L的Fc变体包括在选自234位、264位、269位、292位、309位、342位、359位、364位、368位、388位、394位、422位、434位和445位的一个或多于一个位置处的另外的氨基酸置换。
另外的氨基酸置换可以是L309R和N434S。
另外的氨基酸置换可以是V264M、L368Q、E388D、V422D和P445S。
另外的氨基酸置换可以是R292L、T359A和S364G。
另外的氨基酸置换可以是L234F、E269D、Q342L、E388D和T394A。
根据本发明的一个优选实施方案，经置换的Fc变体包括根据Kabat EU编号系统的a)M428L和b)P230Q或P230S作为氨基酸置换。
根据本发明的一个优选实施方案，根据Kabat EU编号系统，包括氨基酸置换a)M428L和b)P230Q或P230S的经置换的Fc变体包括在选自243位、246位、295位、320位、356位、361位、384位和405位的一个或多于一个位置处的另外的氨基酸置换。
另外的氨基酸置换可以是F243Y、K246E、N361S和N384I。
另外的氨基酸置换可以是Q295L、K320M、D356E和F405I。
本发明涉及包括一个或多于一个氨基酸置换的Fc变体，该氨基酸置换调节Fc变体与新生儿Fc受体(FcRn)的结合和解离。特别地，本发明的Fc变体或其功能变体显示出在酸性条件(pH低于7)下对FcRn的结合亲和力增加，在中性pH条件下与FcRn的结合力非常低。
对其半衰期待增加的治疗性抗体没有特别限制，其实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、微抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、抗体缀合物、人抗体、人源化抗体及其片段。
作为单克隆抗体，可提及例如人抗体，例如帕尼单抗(维克替比)、奥法木单抗(Arzerra)、戈利木单抗(欣普尼)和伊匹单抗(Yervoy)等；人源化抗体，例如托珠单抗(雅美罗)、曲妥珠单抗(赫赛汀)、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、奥马珠单抗(索雷尔)、美泊利单抗(Bosatria)、吉妥珠单抗(麦罗塔)、帕利珠单抗(Synagis)、雷珠单抗(诺适得)、赛妥珠单抗(Cimzia)、奥瑞珠单抗、mogamulizumab(Poteligeo)和依库珠单抗(舒立瑞)；以及嵌合抗体，例如利妥昔单抗(美罗华)、西妥昔单抗(爱必妥)、英夫利昔单抗(类克)和巴利昔单抗(舒莱)。
对其半衰期待增加的治疗性蛋白没有特别限制，其实例包括：激素，例如胰岛素；细胞因子，例如生长因子、干扰素、白细胞介素、红细胞生成素、中性粒细胞生长因子和转化生长因子；Fc融合蛋白，例如依那西普(恩利)、阿柏西普(艾力雅、Zaltrap)、阿巴西普(奥瑞希纳)、阿法西普(Amevive)、贝拉西普(Nulojix)和列洛西普(Arcalyst)；治疗性肽，例如特立帕肽(复泰奥)、艾塞那肽(百泌达)、利拉鲁肽(诺和力)、兰瑞肽(索马杜林)、普兰林肽(Symlin)和恩夫韦肽(Fuzeon)；以及多肽包括部分或全部的VEGF受体、Her2受体、G蛋白偶联受体和离子通道的细胞表面受体。
治疗性抗体或蛋白的半衰期可通过与本发明的多肽或编码该多肽的核酸结合或引入到表达该核酸的载体中而延长。
根据本发明的一个优选实施方案，在5.6至6.4(优选5.8至6.2)的pH下，Fc变体比野生型Fc结构域对FcRn的结合亲和力提高了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％，或者是野生型Fc结构域对FcRn的结合亲和力的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
根据本发明的一个优选实施方案，在7.0至7.8(优选7.2至7.6)的pH下，Fc变体与新生儿Fc受体(FcRn)的解离程度可以与野生型Fc结构域与新生儿Fc受体(FcRn)的解离程度相同或没有实质上的改变。
根据本发明的一个实施方案，经置换的Fc变体表现出在弱酸性条件下(例如，在5.8至6.2的pH下)比野生型Fc或其他开发的Fc变体更高的结合亲和力，并且其在中性条件下(例如，在7.4的pH下)的解离程度与野生型Fc或其他开发的Fc变体的解离程度相同或基本相等或更高(参见实施例4和实施例8)。
根据本发明的一个优选实施方案，与野生型相比，经置换的Fc变体具有长的半衰期。
根据本发明的经置换的Fc变体的半衰期可以比野生型Fc结构域长至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％，或是野生型Fc结构域的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
根据本发明的一个实施方案，与野生型相比，经置换的Fc变体具有显著改善的体内半衰期(参见实施例11和表3)。
如本文所用，“Fcγ受体”或“FcγR”是指与IgG抗体的Fc区域结合并由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。这些Fcγ受体或FcγR的实例包括但不限于：FcγRI(CD64)，包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc；FcγRIII(CD16)，包括FcγRIIIa和FcγRIIIb；和未发现的FcγR。FcγR可源自哺乳动物生物体，包括人、小鼠、大鼠、兔和猴子以及其他生物体。
如本文所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”是指与IgG抗体的Fc区域结合并且至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可源自哺乳动物生物体，包括人、小鼠、大鼠、兔和猴子以及其他生物体。功能性FcRn蛋白包括称为重链和轻链的两个多肽。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。
本发明的另一方面提供了一种包含多肽的抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、微抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、抗体缀合物、人抗体、人源化抗体或其片段(例如，抗原结合抗体片段)。
根据本发明的一个优选实施方案，可以通过优化相应的抗体Fc区域(例如，M428L和Q311R；或M428L和L309G)来最大化Fc结构域或包含Fc结构域的多肽的半衰期。
本发明的另一方面提供了编码所述多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体或包含所述载体的宿主细胞。
本发明的核酸分子可以是分离的或重组的核酸分子。这样的核酸的实例包括单链和双链DNA和RNA及其相应的互补序列。分离的核酸可以是从天然来源分离的。在这种情况下，将分离的核酸与存在于要从中分离核酸的对象的基因组中的周边基因序列分离。分离的核酸可以理解为由模板酶促或化学合成的核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸。在这种情况下，由该程序产生的核酸可以理解为分离的核酸分子。分离的核酸分子代表分离片段形式或作为较大核酸构建体的一部分的核酸分子。当核酸与另一核酸序列以功能关系排列时，核酸被“可操作地连接”。例如，当表达为前蛋白时，前序列或分泌型前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，该前蛋白是分泌前的多肽。将影响多肽序列转录的启动子或增强子可操作地连接至编码序列，或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，当这样排列时会促进翻译。通常，术语“可操作地连接”是指待连接的DNA序列彼此相邻。对于分泌型前导序列，术语“可操作地链接”是指分泌型前导序列在同一前导框中彼此相邻存在。但是，所需的增强子不一定是连续的。通过在方便的限制性内切酶位点的连接来进行连接。在不存在这样的位点的情况下，根据本领域已知的合适方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头。
如本文所用，术语“载体”用于指可以将核酸序列插入其中以引入细胞中从而可以进行复制的载体。核酸序列可以是“外源的”或“异源的”。载体包括质粒、黏粒和病毒(例如噬菌体)。本领域技术人员可以通过标准的重组技术构建载体，该技术在Maniatis等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1988；和Ausubel等人，In：Current Protocols in Molecular Biology，John，Wiley & Sons，Inc，NY，1994)中描述。
如本文所用，术语“表达载体”是指含有编码至少一部分能够被转录的基因产物的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可以包含各种“控制序列”。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可以包含具有其他功能的核酸序列。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指能够复制载体或表达由载体编码的基因的任何转基因生物体。合适的生物体包括真核生物和原核生物。宿主细胞可以被载体转染或转化。转染或转化是指用于将外源核酸分子转移或引入宿主细胞的过程。
本发明的宿主细胞优选是细菌细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞或NIH3T3细胞，但不限于此。
本发明的另一方面提供了一种用于产生包含人抗体Fc变体的多肽的方法，其包括：a)培养包含载体的宿主细胞，该载体包含编码该多肽的核酸分子；和b)收集由宿主细胞表达的多肽。
本发明的另一方面提供了一种用于制备抗体的方法，其包括：a)培养表达包含所述多肽的抗体的宿主细胞；b)纯化由宿主细胞表达的抗体。
在本发明的方法中，可以通过过滤、HPLC、阴离子交换或阳离子交换、高效液相色谱法(HPLC)、亲和色谱法或其组合，优选使用蛋白A的亲和色谱法来纯化抗体。
本发明的另一方面提供了一种用于筛选包含Fc变体的多肽的方法，其包括：构建包括根据Kabat EU编号系统的M428L作为突变的Fc变体的文库；和b)从包括M428L突变的Fc变体中分选出在pH为5.6至6.4下对FcRn具有比野生型更高亲和力的Fc变体。
包括M428L突变的Fc变体可以包括至少一个另外的氨基酸置换。
根据本发明的优选实施方案，另外的氨基酸置换包括作为突变的Q311R或L309G。
根据本发明的一个优选实施方案，另外的氨基酸置换包括作为突变的P228L。
包括P228L突变的Fc变体可以包括至少一个另外的氨基酸置换。
另外的氨基酸置换没有特别限制，但优选为在选自根据Kabat EU编号系统的234位、264位、269位、292位、309位、342位、359位、364位、368位、388位、394位、422位、434位和445位的至少一个位置处的氨基酸突变。
根据本发明的一个优选实施方案，另外的氨基酸置换包括作为突变的P230Q或P230S。
包括P230突变的Fc变体可以包括至少一个另外的氨基酸置换。
另外的氨基酸置换没有特别限制，但优选为在选自根据Kabat EU编号系统的243位、246位、295位、320位、356位、361位、384位和405位的至少一个位置处的氨基酸突变。
本发明的筛选方法可以使用荧光激活细胞分选(FACS)或自动流式细胞术。流式细胞术的仪器是本领域技术人员众所周知的。这些仪器的实例包括FACSAria、FACS StarPlus、FACScan和FACSort(加利福尼亚州福斯特城的Becton Dickinson)，Epics C(佛罗里达州海厄利亚的Coulter Epics分部)，MOFLO(科罗拉多州科罗拉多斯普林斯的Cytomation)和MOFLO-XDP(印第安纳州印第安纳波利斯的Beckman Coulter)。流式细胞术通常涉及液体样品中细胞或其他颗粒的分离。通常，流式细胞术的目的是分析经分离的颗粒的一种或多于一种特征，例如标记的配体或其他分子的存在。颗粒一个接一个地通过传感器，并根据大小、折射度、光散射度、不透明度、粗糙度、形状、荧光等被分选。
本发明的另一方面提供了包含多肽、抗体、核酸分子或载体的组合物，所述多肽包含具有一个或多于一个氨基酸置换的Fc变体。
根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物是用于预防或治疗癌症的药物组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，药物组合物(或多肽、抗体、核酸分子或载体)识别癌症抗原。
根据本发明的一个实施方案，Fc变体具有与对照组(例如曲妥珠单抗)相当或更高的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性，从而实现了显著增加的半衰期和高抗癌活性(参见实施例13和图18)。
本发明的药物组合物可以包括(a)多肽、抗体、编码该多肽的核酸分子或包含该核酸分子的载体和(b)药学上可接受的载剂。
本发明的又一方面提供了用于预防或治疗癌症的方法，其包括将药物组合物施用于对象。
通过本发明的方法预防或治疗的癌症的类型不受限制。可施用本发明的药物组合物以治疗许多癌症，包括白血病和淋巴瘤例如急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，儿童时期的实体瘤例如脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、骨肿瘤和软组织肉瘤，成年人的常见实体瘤例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿癌、子宫癌、口腔癌、胰腺癌、黑色素瘤和其他皮肤癌、胃癌、卵巢癌、脑瘤、肝癌、喉癌、甲状腺癌、食道癌和睾丸癌。
根据本发明的药物组合物的药学上可接受的载剂可以是本领域已知的任何载剂。适用于本发明药物组合物的载剂的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。本发明的药物组合物还可以包含至少一种选自润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂的添加剂。合适的药学上可接受的载剂和制剂的详细信息可以在Remington’sPharmaceutical Sciences(第19版，1995年)中找到。
本发明的药物组合物可以经口或肠胃外给药，优选肠胃外给药。例如，本发明的药物组合物可以通过静脉内、局部或腹膜内注射给药。
对象没有特别限制，但优选地解释为包括脊椎动物，更优选为包括人类和黑猩猩的灵长类动物，包括狗和猫的家庭宠物，包括牛、马、绵羊和山羊的家畜，以及包括小鼠和大鼠的啮齿动物。
根据本发明的药物组合物的合适剂量取决于多种因素，例如剂型、给药方式、患者的年龄、体重、性别和病理状况、饮食、给药时间和途径、排泄速率和响应性。本领域普通技术人员可以容易地确定并开出用于所需治疗或预防的根据本发明药物组合物的有效剂量。根据本发明的一个优选实施方案，根据本发明的药物组合物的日剂量为0.0001mg/kg至100mg/kg。
本发明的药物组合物可以通过本领域普通技术人员容易进行的合适方法制备成单位剂量形式或与药学上可接受的载剂和/或赋形剂一起分配在多剂量容器中。本发明的药物组合物可以是在油或水性介质中的溶液、混悬剂或乳剂形式。本发明的药物组合物可以是提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式。本发明的药物组合物还可以包含分散剂或稳定剂。
本发明的药物组合物可以用于单一疗法。或者，本发明的药物组合物可以与通常的化学疗法或放射疗法组合使用。这种组合疗法对癌症治疗更为有效。可以与本发明的组合物一起使用的化学治疗剂包括顺铂、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤等。可以与本发明的组合物一起使用的放射疗法包括X射线辐照和γ射线辐照。
发明效果
本发明的特征和优点总结如下。
(i)本发明提供了一种包含Fc变体的多肽，该Fc变体通过用不同的氨基酸序列置换人抗体Fc结构域的氨基酸序列的一部分而产生。
(ii)本发明还提供了产生多肽或包含该多肽的抗体的方法。
(iii)本发明的Fc变体适用于癌症的治疗，因为其体内半衰期可以通过优化氨基酸序列的一部分而最大化。
附图说明
图1示出了用于表达和纯化四聚体FcRn和二聚体FcRn的表达载体，以及纯化后的SDS-PAGE凝胶。
图2是经构建使得在位置M252和M428处包括18种氨基酸的文库的示意图。
图3示出了2M文库检索过程和分选的M428L变体。
图4示意性地示出了基于M428L构建的错误文库和点文库。
图5示出了从(5a)错误文库和(5b)点文库分选的变体的FACS荧光强度。
图6示出了用于在动物细胞中表达曲妥珠单抗重链和轻链的质粒。
图7示出了野生型曲妥珠单抗的表达和纯化结果。
图8比较了商业曲妥珠单抗和内部曲妥珠单抗的物理性质(a：CE-cIEF，b：SEC)。
图9通过N-聚糖谱分析比较了商业曲妥珠单抗和内部曲妥珠单抗的物理性质。
图10示出了10种曲妥珠单抗Fc变体的表达和纯化结果(a：亲和色谱，b：SDS-PAGE分析，c：最终产量列表)。
图11示出了曲妥珠单抗Fc变体的SEC表征结果。
图12示出了曲妥珠单抗Fc变体与FcRn的结合力，其通过ELISA测量。
图13示出了曲妥珠单抗Fc变体在6.0和7.4的pH值下与hFcRn的结合力，其使用BiaCore仪器测量(a：pH6.0(捕获方法)b：pH7.4(avid形式))。
图14比较了商业曲妥珠单抗和内部曲妥珠单抗在常规小鼠(C57BL/6J(B6))和人FcRn Tg小鼠中的药代动力学。
图15示出了人FcRn Tg小鼠中Fc变体的药代动力学分析的结果(静脉内注射变体后(每个5mg/kg)，n＝5)。
图16示出了曲妥珠单抗Fc变体与FcγR的结合力，其通过ELISA测量。
图17比较了曲妥珠单抗Fc变体的效应功能与正常IgG的效应功能，曲妥珠单抗作为对照组(ADCC测定)。
图18比较了曲妥珠单抗Fc变体的效应功能(ADCC)。
图19示出了曲妥珠单抗Fc变体与C1q的结合力，其通过ELISA测量。
本发明最佳实施方式
将参照以下实施例更详细地阐述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不受根据本发明主旨的这些实施例的限制。
实施例
实施例1：用于检索Fc变体文库的新生儿Fc受体(FcRn)的表达和纯化
对用于检索对FcRn具有改进的pH依赖性结合力的Fc变体的四聚体FcRn和二聚体FcRn进行表达和纯化。为此，制备了表达载体(图1)。构建了pMAZ-β2微球蛋白-GS接头-FcRnα链-链霉抗生物素蛋白-His作为DNA质粒以获得四聚体FcRn。将DNA共转染到HEK 293F细胞中，并以300ml的水平暂时表达。将得到的培养基以7000rpm离心10分钟。用25×PBS平衡所收集的上清液，并用0.2μm瓶顶过滤器(Merck Millipore)过滤。用PBS平衡后，使FcRn在4℃下与Ni-NTA树脂(Qiagen)结合16h。将结合FcRn的树脂上样到柱上，并用50ml的1号洗涤缓冲液(PBS)、25ml的2号洗涤缓冲液(PBS+10mM咪唑)、25ml的3号洗涤缓冲液(PBS+20mM咪唑)和200μl的4号洗涤缓冲液(PBS+250mM咪唑)洗脱以去除tFcRn以外的蛋白。然后，使2.5ml洗脱缓冲液(PBS+250mM咪唑)流经柱，以获得tFcRn。使用离心过滤器装置(Merck Millipore)将缓冲液替换为新的缓冲液。由从奥斯陆大学获得的pcDNA-FcRnα链-GST-β2微球蛋白质粒获得二聚体FcRn。将DNA共转染到HEK 293F细胞中，并以300ml的水平暂时表达。将得到的培养基以7000rpm离心10分钟。用25×PBS平衡所收集的上清液，并用0.2μm瓶顶过滤器(MerckMillipore)过滤。用PBS平衡后，在4℃下使FcRn与谷胱甘肽琼脂糖4B(incospharm)结合16h。将结合FcRn的树脂上样到柱上，并用10ml洗涤缓冲液(PBS)洗脱柱，以去除dFcRn以外的蛋白。然后，使2.5ml洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl+10mM GSH，pH8.0)流经柱。使用离心过滤器装置3K(Merck Millipore)将缓冲液替换为新的缓冲液。使用SDS-PAGE凝胶测定纯化后的四聚体FcRn和二聚体FcRn的大小(图1)。使用Alexa 488对纯化的四聚体FcRn和二聚体FcRn进行荧光标记以用于荧光检测。
实施例2：Fc变体2M文库的构建
使用SfiI限制性内切酶根据曲妥珠单抗Fc结构域的基因(SEQ ID NO：29)构建pMopac12-NlpA-Fc-FLAG。基于载体，使用pMopac12-seq-Fw、Fc-M252-1-Rv、Fc-M252-2-Rv、Fc-M252-3-Rv、Fc-M428-Fw、Fc-M428-1-Rv、Fc-M428-2-Rv、Fc-M428-3-Rv、Fc-M428-frg3-Fw、和pMopac12-seq-Rv引物构建文库插入物，使得Fc中的两个Met残基被除了Cys和Met的18种不同的氨基酸置换(表1和图2)。用SfiI限制酶处理插入物，并与经相同SfiI处理的载体进行连接。之后，将连接的插入物转化到大肠杆菌Jude1((F’[Tn10(Tetr)proAB+lacIqΔ(lacZ)M15]mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dla cZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG)中以构建Fc变体的大型2M文库(文库大小：1×109)。
[表1]
pMopac12-seq-Fw 5`-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3`
Fc-M252-1-Rv 5`-CCTCAGGGGTCCGGGAGATGWAGAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGG-3`
Fc-M252-2-Rv 5`-CCTCAGGGGTCCGGGAGATKNBGAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGG-3`
Fc-M252-3-Rv 5`-CCTCAGGGGTCCGGGAGATCCAGAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGG-3`
Fc-M428-Fw 5`-ATCTCCCGGACCCCTGAGG-3`
Fc-M428-1-Rv 5`-GTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGGWACACGGAGCATGAGAAGACGTTCC-3`
Fc-M428-2-Rv 5`-GTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGKNBCACGGAGCATGAGAAGACGTTCC-3`
Fc-M428-3-Rv 5`-GTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCCACACGGAGCATGAGAAGACGTTCC-3`
Fc-M428-frg3-Fw 5`-CATGAGGCTCTGCACAACCACTAC-3`
pMopac12-seq-Rv 5`-CTGCCCATGTTGACGATTG-3`
Fc-Sub#0-Rv 5`-GTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAG-3`
Fc-Sub#1-1-Fw 5`-CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACNNKCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG-3`
Fc-Sub#1-2-Fw 5`-CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCNNKATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG-3`
Fc-Sub#1-3-Fw 5`-CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGNNKTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG-3`
Fc-Sub#1-4-Fw 5`-CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCNNKCGGACCCCTGAGGTCACATGCG-3`
Fc-Sub#1-5-Fw 5`-CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCNNKACCCCTGAGGTCACATGCG-3`
Fc-Sub#1-Rv 5`-GACGGTGAGGACGCTGACC-3`
Fc-Sub#2-1-Fw 5`-GGTCAGCGTCCTCACCGTCNNKCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG-3`
Fc-Sub#2-2-Fw 5`-GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACNNKGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG-3`
Fc-Sub#2-3-Fw 5`-GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGNNKAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG-3`
Fc-Sub#2-Rv 5`-CACGGAGCATGAGAAGACGTTCC-3`
Fc-Sub#3-1-Fw 5`-GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATNNKGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG-3`
Fc-Sub#3-2-Fw 5`-GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTNNKCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG-3`
Fc-Sub#3-3-Fw 5`-GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACNNKCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG-3`
Fc-Sub#3-4-Fw 5`-GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACNNKACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG-3`
ep-Fc-Fw 5`-CCAGCCGGCCATGGCG-3`
ep-Fc-Rv 5`-GAATTCGGCCCCCGAGGCCCC-3`
用于克隆的引物(SEQ ID NO：1-27)
实施例3：基于细菌培养和流式细胞术检索Fc变体的2M文库
在该实施例中，针对已建立的Fc变体的2M文库进行检索。具体而言，将1ml转化进大肠杆菌Jude1细胞的Fc变体文库细胞在补充有2重量/体积％葡萄糖和作为抗生素的氯霉素(40μg/mL)的超级肉汤(TB)培养基中于37℃和250rpm下振荡培养4h。振荡培养后，将文库细胞以1∶100的比例接种到TB培养基中，并在250rpm和37℃下振荡培养，直到OD600达到0.5。之后，在25℃下进一步培养20分钟以冷却，并加入1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)以诱导表达。培养完成后，基于OD600归一化将收集的细胞分成等量，然后以14000rpm离心1分钟。将收获的细胞重悬于1ml的10mM Tris-HCl(pH8.0)中，并通过离心1分钟洗涤两次。将细胞重悬于1ml的STE(0.5M蔗糖、10mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0))中，并在37℃下离心30分钟以除去外膜。离心除去上清液，加入1ml溶液A(0.5M蔗糖、20mM MgCl2、10mM MOPS(pH6.8))，然后重悬并离心。将细胞重悬于1ml的1ml溶液A和20μl的50mg/ml溶菌酶溶液的混合物中，然后在37℃下离心15分钟以去除肽聚糖层。除去上清液，并将细胞重悬于1ml的PBS中。向300μl的悬浮液中加入700μl的PBS和荧光标记的四聚体FcγRIIIa-Alexa488荧光探针，并在室温下离心以用荧光探针标记原生质球。标记后，将细胞用1ml的PBS洗涤一次，并通过流式细胞仪(S3sortor(Bio-rad))进行分选，以收集前3％高荧光的细胞。将所分选的细胞重新分选，以得到更高的纯度。对于重新分选的样品，使用Taq聚合酶(Biosesang)以及pMopac12-seq-Fw和pMopac12-seq-Rv引物通过PCR扩增基因，然后进行一系列处理，包括用SfiI限制性内切酶处理、连接和转化以构建子文库，其中所分选细胞的基因得以扩增。该程序总共进行了2轮。此后，单独分析得到的40个克隆，并分选出在pH5.8下对FcRn的亲和力比野生型Fc更高的M428L变体(图3)。
实施例3：Fc变体的错误文库和点文库的构建
使用分选的M428L作为模板，构建另外两个文库。首先，通过易错PCR将突变引入Fc，以构建错误文库。以Fc(680bp)中含有0.3％错误(2.04bp)的错误率，使用ep-Fc-Fw和ep-Fc-Rv引物构建文库(大小：2×108)。其次，将M428L用作构建点文库的模板。使用pMopac12-seq-Fw、pMopac12-seq-Rv、Fc-Sub#0-Rv、Fc-Sub#1-1-Fw、Fc-Sub#1-2-Fw、Fc-Sub#1-3-Fw、Fc-Sub#1-4-Fw、Fc-Sub#1-5-Fw、Fc-Sub#1-Rv、Fc-Sub#2-1-Fw、Fc-Sub#2-2-Fw、Fc-Sub#2-3-Fw、Fc-Sub#2-Rv、Fc-Sub#3-1-Fw、Fc-Sub#3-2-Fw、Fc-Sub#3-3-Fw和Fc-Sub#3-4-Fw引物构建文库，以便将突变随机引入到Fc与FcRn结合的所选区域中(图4)。之后，以与上述相同的方式通过转化到Jude1来建立Fc变体的文库。
实施例4：基于细菌培养和流式细胞术以及包括PFc3、PFc29、PFc41、EFc29、EFc41、EFc82和EFc88在内的变体的分选，检索Fc变体的错误文库和点文库
对基于分选的M428L构建的其他错误文库和点文库进行上述分选和重新分选程序。对错误文库重复进行5轮分选和重新分选，对点文库仅进行一轮分选。单独分析来自两个文库的每一个的约100个克隆的组，并且分选在pH5.8下对FcRn具有高亲和力和在pH7.4下对FcRn具有低亲和力的Fc变体。FACS分析显示，从错误文库中分选的EFc6、EFc29、EFc41、EFc46、EFc70、EFc90、EFc82和EFc88在pH5.8下显示出的荧光强度要高于野生型Fc和包括来自Medimmune的YTE(Gabriel J.Robbie等人，Antimicrob Agents Chemother.2013年12月；57(12)：6147-6153)和来自Xencor的LS(U.S.专利第8324351号)的常规变体。发现在pH 7.4处EFc6、EFc29、EFc41、EFc82和EFc88显示出比LS更低的荧光强度。此外，从点文库中分选出的PFc3、PFc29和PFc41变体在pH 5.8处显示出比YTE和LS更高的荧光强度。PFc30在pH5.8下显示出比YTE和LS更低的荧光强度。PFc29和PFc41在pH7.4下显示出比LS更低的荧光强度。最后，选择EFc6、EFc29、EFc41、EFc82、EFc88、PFc3、PFc29和PFc41，因为它们有望增加血液半衰期(表2和图5)。
[表2]
分选变体的点突变
根据Kabat EU编号系统来编号突变的位置，如Kabat等人，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242，1991中所述。
实施例5：用于引入Fc变体的对照曲妥珠单抗的产生和纯化
选择代表性的IgG1治疗性抗体曲妥珠单抗作为对照组。在随后的实施例中，将分选的Fc变体引入曲妥珠单抗。
通过哺乳动物密码子优化和同步的反向翻译，从来自Drug Bank(http：//www.drugbank.ca/)的相应氨基酸序列合成(Genscript)野生型曲妥珠单抗的重链和轻链可变区域。将合成的曲妥珠单抗重链和轻链基因分别亚克隆到pOptiVEC-Fc和pDNA3.3载体中(图6)。制备编码曲妥珠单抗重链和轻链的动物细胞表达质粒，在HEK293细胞中表达并纯化。
在HEK 293F中培养后，野生型曲妥珠单抗通过蛋白A亲和色谱法(AKTA primeplus，目录号11001313)和凝胶渗透色谱法(HiTrap MabselectSure，GE，目录号11-0034-95)进行纯化。从300ml培养基中以高纯度获得7.7mg野生型曲妥珠单抗(图7)。
实施例6：内部曲妥珠单抗与商业曲妥珠单抗的物理性质的分析和比较
与通过在CHO细胞中悬浮培养产生的商业曲妥珠单抗不同，内部曲妥珠单抗在HEK293中产生。在引入分选的Fc变体和对分选的Fc变体进行功能分析之前，分析了商业曲妥珠单抗和内部曲妥珠单抗的两个基本特征。使用Pharmalyte 3-10载体两性电解质(GEHealthcare，17-0456-01)建立3至10的pH梯度，通过毛细管电泳(CE：PA800Plus，Beckmancoulter)分析样品的pI值和电荷变化。分析结果表明，通过尺寸排阻色谱法(SEC，TskgelG3000swxl，Tosoh)未检测到杂质。对于商业曲妥珠单抗，电荷变化的pI值为8.27至8.74，主峰的pI为8.62。对于内部曲妥珠单抗，电荷变化的pI值为8.29至8.78，主峰的pI为8.65，几乎与商业曲妥珠单抗相同(图8)。通过毛细管电泳(CE，PA800Plus，Beckman coulter)测量pI值。但是，cIEF分析显示，内部曲妥珠单抗的主峰和其他峰的含量略有不同。这些差异是由于HEK293细胞系产生的内部曲妥珠单抗和CHO细胞系产生的商业曲妥珠单抗的聚糖模式不同，使得内部曲妥珠单抗具有可能被唾液酸氧化的可能性。因此，还进行了聚糖分析(图9)。
用PNG酶F(NEB，186007990-1)从蛋白质上切割N-聚糖并用RapiFluor-MS试剂(Waters，186007989-1)标记后，使用UPLC系统(Acquity UPLC I类，Waters，FLR检测器)进行聚糖分析。聚糖分析的结果显示，聚糖模式相似，但观察到组成的聚糖含量不同，这似乎不是由唾液酸诱导的氧化引起的，而是由不同的生产细胞系引起的。此外，发现聚糖对结合力分析和药代动力学分析没有显著影响(数据未显示)。因此，将分选的Fc变体引入商业曲妥珠单抗和内部曲妥珠单抗中。
实施例7：Fc变体的制备和纯化以及Fc变体的物理性质分析
将五个对照变体，包括商业野生型变体、内部野生型变体、LS(XenCor)、YTE(MedImmune)和428L，以及分选的变体PFc29、PFc41、EFc29、EFc41和EFc82转染至HEK 293F动物细胞中。转染前一天，以1×106个细胞/ml的密度传代培养300ml HEK293F细胞。第二天，用聚乙烯亚胺(PEI，Polyscience，23966)转染细胞。首先，将每种变体的重链基因和轻链基因以2∶1的比例混合在30ml的Freestyle 293表达培养基(Gibco，12338-018)中。然后，将PEI和变体基因以1∶2的比例混合，在室温下静置20分钟，与前一天传代培养的细胞混合，在CO2振荡培养箱中以125rpm、37℃和8％的CO2培养6天，然后离心。仅收集上清液。
使用AKTA prim plus和HiTrap MabselectSure柱通过亲和色谱法从上清液中纯化蛋白。使300ml的上清液以3ml/分钟的速度流经柱，并用100ml的1×PBS洗涤。然后，使IgG洗脱缓冲液(Thermo science，21009)以5ml/分钟的速度流经柱。收集六个级分(各5ml)。每个级分均用500μl的1M Tris(pH9.0)中和。使用Bradford(BioRad，5000001)测定级分中的蛋白，并放入新试管中。纯化的变体使用30K Amicon超离心过滤器(UFC903096)进行浓缩，并对其物理性质进行分析(图10和图11)。
用蛋白A纯化除内部野生型曲妥珠单抗外的每种Fc变体，并通过SDS-PAGE测定其纯度(≥90％)和分子量。使用SEC-HPLC(图11a)获得高纯度蛋白样品，以进行功效评估和纯度分析(纯度≥97％)。在等度条件下(流动相1×PBS，pH7.0，1ml/分钟流速)进行的分析显示，所有Fc变体具有相同的主峰保留时间，并且估计了分子量(图11b)。
实施例8：通过ELISA测量Fc变体与FcRn的结合力
进行ELISA以测量制备的变体与FcRn的pH依赖性结合力以及变体与FcγR和C1q的结合力，这些结合使变体表现出效应功能。首先，研究了变体与FcRn的pH依赖性结合力。为此，用0.05M Na2CO3(pH9.6)将每组50μl的IgG Fc变体稀释至4μg/ml，将其在4℃下于平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(costar)上固定16h，在室温下用100μl的4％脱脂牛奶(GenomicBase)(在pH5.8/pH7.4的0.05％PBST中)封闭2h，然后用180μl的0.05％PBST(pH5.8/pH7.4)洗涤四次。之后，用1％脱脂牛奶(在pH5.8/pH7.4的0.05％PBST中)将50μl的FcRn连续稀释，将其加入到每个孔中，并在室温下反应1h。洗涤后，使抗体与50μl抗GST-HRP缀合物(GE Healthcare)在室温下反应1h。洗涤板并用50μl的1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显影。用2M的H2SO4(各50μl)终止反应。然后，使用epoch微孔板分光光度计(BioTek)分析反应产物。分选的变体在pH5.8下具有类似于变体LS的与FcRn的结合力，并且在pH7.4下比LS更容易解离(图12)。
实施例9：在pH6.0和pH7.4下曲妥珠单抗Fc变体与单体hFcRn结合力的测量和比较
在该实施例中，比较了商业曲妥珠单抗、内部曲妥珠单抗和已分析并研究了物理性质的经分选的Fc变体与人FcRn的pH依赖性结合力。具体地，使用Biacore T200仪器(GEHealthcare)测量KD值。如文献中所公开的(Yeung YA.等人，J.Immunol，2009)，在pH6.0下，在抗原介导的抗体捕获形式中使用人FcRn用作分析物。将每种作为配体的Fc变体在运行缓冲液(50mM磷酸盐，pH6.0，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20，pH6.0)中稀释，以约300响应单位(RU)的水平注入至CM5芯片的表面，在该表面上将HER2 ECD结构域固定至约3000RU的水平并捕获。为了测定结合力，由125nM的FcRn运行缓冲液连续稀释作为分析物的单体FcRn(Sinobiological inc.，CT009-H08H)，以30μl/分钟的流速注入2分钟，然后解离2分钟。在每个循环中，用10mM甘氨酸(pH1.5)以30ml/分钟的流速再生30秒。使用BIAevaluation软件(Biacore)将传感图拟合为1∶1结合模型。结果，与作为对照组的商业曲妥珠单抗(15nM)和内部曲妥珠单抗(16.9nM)以及作为主链的428L(9nM)相比，Fc变体具有更高的结合力(PFc3：5.6nM，PFc29：6.8nM，PFc41：5.9nM等)。但是，Fc变体的结合力比YTE(5.7nM)和LS(4.1nM)低，YTE和LS的结合力是已知世界上最高的值，但在误差范围内它们的差异几乎相同。由于配体在pH 7.0下与分析物的结合较少，因此使用avid形式评估解离，在这种形式下，直接固定单体hFcRn并注入不同浓度的Fc变体(Zalevsky J等人Nat.Biotechnol，2010)。将人FcRn ECD结构域(Sino Biological)以约1500RU的水平固定至CM5芯片表面。在HBS-EP(pH7.4)中由3000nM连续稀释Fc变体，并以5ml/分钟的流速注入固定有FcRn的芯片表面2分钟。将结合的Fc变体解离2分钟。每个循环完成后，用100mM Tris(pH9.0)再生(接触时间30秒；流速30μl/分钟)芯片表面。特别地，与YTE和LS相比，Fc变体PFc29和PFc41在pH6.0下保持其高结合力，且在pH7.4下更快速解离。这些结果与通过ELISA获得的结果一致，并表明了Fc变体的预期的长半衰期(图13)。在实践中，在人FcRn Tg小鼠中进行了体内药代动力学实验。
实施例10：常规B6小鼠和hFcRn Tg小鼠中商业曲妥珠单抗和内部曲妥珠单抗的体内PK实验的分析和比较
在常规B6小鼠(Jungang实验动物资源中心，C57BL/6J(B6))中进行了PK分析，该小鼠的遗传背景与人FcRn Tg小鼠的遗传背景相同。结果，如文献报道，发现人抗体的Fc对常规小鼠FcRn的亲和力高于对人FcRn的亲和力。在常规小鼠中，内部抗体和商业抗体之间的PK值存在差异，且内部抗体似乎不稳定。此外，Tg小鼠(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Prkdcscid Tg(Jackson实验室，CAGFCGRT)276Dcr/DcrJ)的AUC略低于常规小鼠，但内部抗体和商业抗体的药代动力学趋势相似。这表明在使用HEK293中产生的内部Fc变体以分析Tg小鼠中Fc变体的实际体内药代动力学的实验中没有遇到任何问题(图14)。
实施例11：hFcRn Tg小鼠中包括LS、YTE以及变体PFc29和PFc41在内的四种类型的药代动力学
发现使用ELISA系统和BiaCore仪器在pH6.0和pH7.4下测量的结合力是恒定的。根据这些结果，由于在酸性条件(pH6.0)下PFc29和PFc41的结合力与LS的结合力相当，且在pH7.4下PFc29和PFc41的解离力比LS的解离力高，因而对PFc29和PFc41进行分选。同时，将目前已知在世界上是最有效的Xencor的LS突变体和MedImmune的YTE作为对照组，并将两种曲妥珠单抗Fc变体注射入20只人FcRn Tg小鼠中(每组5只动物，每只5mg/kg I.V(尾静脉))。注射后，从面静脉共采集血样12次(0分钟、30分钟、1小时、6小时、24小时、3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天和50天)。通过ELISA分析血液样品中Fc变体的浓度，然后使用WinNonlin进行非房室分析(NCA)。根据ELISA和BiaCore分析的结果可以预期，Fc变体PFc29和PFc41表现出体内半衰期增加。特别是，PFc29的半衰期比常规LS的半衰期长(图15和表3)。
[表3]
曲妥珠单抗Fc变体向小鼠静脉内给药(5mg/kg)后的药代动力学参数的非房室分析(数据表示为平均值±SD(n＝5))。
t1/2，终末半衰期；T最大，最大浓度的时间；C0，推断的零时刻的浓度；C最大，最大浓度；AUC最终，从给药点到最终测得浓度的曲线下面积；AUC无穷，从给药点到无穷的曲线下面积；AUC％推断，推断的曲线下面积占总曲线下面积的百分比；Vz，分配体积；CL，清除。
实施例12：通过ELISA测量Fc变体与FcγR的结合力
在该实施例中，测量了Fc变体与FcγR的结合力。具体而言，用0.05M Na2CO3(pH9.6)将各个50μl的IgG Fc变体稀释至4μg/ml，将其在4℃下于平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(costar)上固定16h，在室温下用100μl的4％脱脂牛奶(GenomicBase)(在pH7.4的0.05％PBST中)封闭2h，然后用180μl的0.05％PBST(pH7.4)洗涤四次。之后，用1％脱脂牛奶(在pH7.4的0.05％PBST中)将50μl FcγR连续稀释，将其加入到每个孔中，并在室温下反应1h。洗涤后，使抗体与50μl抗GST-HRP缀合物(GE Healthcare)在室温下反应1h。洗涤板并用50μl的1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显影。用2M的H2SO4(各50μl)终止反应。然后，使用epoch微孔板分光光度计(BioTek)分析反应产物。每个实验重复进行两次。图16示出了通过ELISA测量的Fc变体与FcγR(FcγRI、FcγRIIa(H)、FcγRIIa(R)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、和FcγRIIIa(F))的结合力。
实施例13：测量Fc变体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的效应功能
使用ADCC报告分子生物测定试剂盒(Promega，G7010)评估了曲妥珠单抗Fc变体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。具体地，将作为靶细胞的SKBR-3细胞以5×103个细胞/100μl的密度接种在96孔组织培养板的每个孔中，并在37℃的CO2培养箱中培养20h。之后，使用多筒移液器从板的每个孔中去除95μl培养基，并在每个孔中加入25μl由ADCC报告分子生物测定试剂盒提供的ADCC测定缓冲液。用ADCC测定缓冲液将正常IgG、曲妥珠单抗和曲妥珠单抗Fc变体稀释至各种浓度。将25μl的每种稀释液加入到含有细胞的96孔组织培养板的每个孔中，并在室温下静置直至加入效应细胞。将试剂盒提供的效应细胞在37℃的恒温水浴中溶解2分钟至3分钟，然后将630μl溶液与3.6mL ADCC测定缓冲液混合。将25μl效应细胞加入到含有靶细胞和抗体稀释液的板的每个孔中。反应在37℃的CO2培养箱中进行6h。经过预定时间后，将板从培养箱中取出并在室温下静置15分钟。将75μl的Bio-GloTM萤光素酶测定试剂添加到每个孔中，并在室温下反应5分钟。反应完成后，使用光度计(Enspire多模式读板器)测量每个孔的发光。通过将实验结果的平均值表示为诱导倍数来确定每种测试抗体的ADCC活性，诱导倍数由下式计算：
诱导倍数＝RLU(诱导1-背景2)/RLU(无抗体对照3-背景)
诱导1：从包含靶细胞、测试抗体和效应细胞的样品中获得的RLU值
背景2：从ADCC测定缓冲液获得的RLU值
无抗体对照3：从仅包含靶细胞和效应细胞的样品中获得的RLU值
将曲妥珠单抗Fc变体(LS、YTE、PFC29和PFC41)对SKBR-3的ADCC活性与曲妥珠单抗对SKBR-3的ADCC活性进行比较(图17)。结果，最高浓度下的LS、PFc29和PFc41的最大ADCC活性分别为作为阳性对照组的曲妥珠单抗的约1.5倍、约1.18倍和约1.27倍。相反，最高浓度下的YTE的最大ADCC活性是曲妥珠单抗的约4.2分之一。总之，曲妥珠单抗Fc变体PFc29和PFc41以及对照变体LS的ADCC活性为对照曲妥珠单抗的ADCC活性的1.18倍至1.5倍。测量变体的EC50值。如图18所示，与对照LS(0.05575μg/mL)相比，Fc变体PFc29(0.04543μg/mL)和PFc41(0.05405μg/mL)的EC50值较低，这表明Fc变体PFc29和PFc41的功效更稳定。
实施例14：通过ELISA测量Fc变体与C1q的结合力
在该实施例中，测量了Fc变体与C1q的结合力。具体而言，用0.05MNa2CO3(pH9.6)将各组50μl的IgG Fc变体稀释至4μg/ml，将其在4℃下于平底聚苯乙烯高结合96孔微孔板(costar)上固定16h，在室温下用100μl的4％脱脂牛奶(GenomicBase)(在pH7.4的0.05％PBST中)封闭2h，然后用180μl的0.05％PBST(pH7.4)洗涤四次。之后，用1％脱脂牛奶(在pH7.4的0.05％PBST中)将50μl互补人C1q(Millipore)连续稀释，将其加入到每个孔中，并在室温下反应1h。洗涤后，使抗体与50μl抗C1q-HRP缀合物(Invitrogen)的反应在室温下进行1h。洗涤板并用50μl的1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific)显影。用2M的H2SO4(各50μl)终止反应。然后，使用epoch微孔板分光光度计(BioTek)分析反应产物。分析的结果显示，分选的PFc29与C1q的结合力高于常规LS和YTE与C1q的结合力(图19)。
尽管已经详细描述了本发明的具体实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些具体实施方式仅是优选的实施方案，并不旨在限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应该由所附的权利要求和它们的等同物所限定。

Claims (12)

1.一种包含人IgG1抗体Fc变体的多肽，其中所述Fc变体与野生型相比具有增加的半衰期，
其中是通过在野生型人抗体的Fc结构域中进行氨基酸置换增加半衰期，
其中增加半衰期的氨基酸置换是根据Kabat EU编号系统的M428L和Q311R或M428L和L309G。
2.一种抗体，其包含根据权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、微抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、抗体缀合物、人抗体、人源化抗体或其片段。
4.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的多肽。
5.一种载体，其包含根据权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其包含根据权利要求5所述的载体。
7.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的抗体、根据权利要求4所述的核酸分子或根据权利要求5所述的载体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物增加治疗性抗体或蛋白的血液半衰期。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物是用于预防或治疗癌症的药物组合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物识别癌症抗原。
11.一种用于产生包含人抗体Fc变体的多肽的方法，所述人抗体Fc变体与野生型相比具有增加的半衰期，所述方法包括：a)培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码根据权利要求1所述的多肽的核酸分子；和b)收集宿主细胞表达的多肽。
12.一种用于产生与野生型相比具有增加的半衰期的抗体的方法，其包括：a)培养宿主细胞，所述宿主细胞表达包含根据权利要求1所述的多肽的抗体；和b)纯化宿主细胞表达的抗体。
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