CN117677637A - 抗犬cd20抗体 - Google Patents

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CN117677637A
CN117677637A CN202280050529.7A CN202280050529A CN117677637A CN 117677637 A CN117677637 A CN 117677637A CN 202280050529 A CN202280050529 A CN 202280050529A CN 117677637 A CN117677637 A CN 117677637A
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D·鲍兰德
J·王
R·V·苏塔瓦尼
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Pete Maidi Co ltd
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Abstract

本公开涉及与犬CD20结合的抗体和其抗原结合部分。本公开还涉及用于治疗犬受试者的由B细胞介导的病状的组合物和方法。

Description

抗犬CD20抗体
背景技术
犬淋巴瘤是狗中最常见的癌症，占所有癌症的约7-14％。与人类一样，有许多不同类型的犬淋巴瘤并且从快速进展的癌症到慢性疾病不等。
CD20是被认为参与B细胞增殖和分化的调节的细胞表面蛋白。抗原包括四个跨膜跨越区并且存在于几乎所有正常和恶性B细胞的表面上。
如利妥昔单抗(rituximab)等识别人CD20的人抗体用于治疗以B细胞数量过多或B细胞过度活跃或功能障碍为特征的人类疾病。这些抗体破坏B细胞。利妥昔单抗被视为B细胞淋巴瘤治疗的革命性进展。
自从二十多年前开发如利妥昔单抗等用于人类的抗体以来，文献中已经报告了许多识别犬CD20的抗体。然而，在这个时间点上，还没有抗体在普遍临床中使用。因此，仍然需要不同的疗法。本发明旨在解决这一需求。
发明内容
第一方面，本发明涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)HC CDR1序列，所述HC CDR1序列包括SEQ ID NO:27或相较于SEQ ID NO:27具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
b)HC CDR2序列，所述HC CDR2序列包括SEQ ID NO:28或相较于SEQ ID NO:28具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
c)HC CDR3序列，所述HC CDR3序列包括SEQ ID NO:29或相较于SEQ ID NO:29具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
d)LC CDR1序列，所述LC CDR1序列包括SEQ ID NO:30或相较于SEQ ID NO:30具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
e)LC CDR2序列，所述LC CDR2序列包括SEQ ID NO:31或相较于SEQ ID NO:31具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；以及
f)LC CDR3序列，所述LC CDR3序列包括SEQ ID NO:32或相较于SEQ ID NO:32具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:7或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:8或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:9或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:10或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:11或由其组成的LC CDR1序列和包括SEQ ID NO:12或由其组成的LCCDR1序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:17或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:18或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ IDNO:19或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:20的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:21或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:22或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:37的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:38的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:39的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:40的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:41的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:42的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:47或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:48或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ IDNO:49或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:50或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQID NO:51或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:52或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:82或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:83或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ IDNO:84或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:85或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQID NO:86或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:87或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:92或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:93或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ IDNO:94或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:95或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQID NO:96或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:97或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:102或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:103或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:104或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:105或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:106或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:107或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:112或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:113或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:114或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:115或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:116或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:117或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:122或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:123或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:124或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:125或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:126或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:127或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:132或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:133或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:134或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:135或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:136或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:137或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:142或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:143或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:144或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:145或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:146或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:147或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:152或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:153或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:154或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:155或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:156或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:157或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:162或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:163或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:164或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:165或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:166或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:167或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:172或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:173或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:174或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:175或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:176或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:177或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:182或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:183或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:184或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:185或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:186或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:187或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:192或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:193或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:194或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:195或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:196或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:197或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:202或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:203或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:204或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:205或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:206或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:207或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述其中所述抗体具有包括SEQ ID NO:212或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:213或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:214或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:215或由其组成的LCCDR1序列、包括SEQ ID NO:216或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:217或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:222或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:223或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:224或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:225或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:226或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:227或由其组成的LC CDR3序列。
在本发明的另一方面或在第一方面的一实施例中，所述抗体具有包括SEQ ID NO:232或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:233或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQID NO:234或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:235或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:236或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:237或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分包括：HC可变区序列，所述HC可变区序列包括SEQ ID NO:24或与其具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性的序列；以及LC可变区序列，所述LC可变区序列包括SEQ ID NO:26或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
例如，所述抗体或其抗原结合部分具有
a)包括SEQ ID NO:4的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:6的LC可变区序列；
b)包括SEQ ID NO:14的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:16的LC可变区序列；
c)包括SEQ ID NO:34的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:36的LC可变区序列；
d)包括SEQ ID NO:44的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:46的LC可变区序列；
e)包括SEQ ID NO:79的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:81的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:238的LC可变区序列；
f)包括SEQ ID NO:89的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:91的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:239的LC可变区序列；
g)包括SEQ ID NO:99的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:101的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:240的LC可变区序列；
h)包括SEQ ID NO:109的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:111的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:241的LC可变区序列；
i)包括SEQ ID NO:119的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:121的LC可变区序列；
j)包括SEQ ID NO:129的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:131的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:242的LC可变区序列；
k)包括SEQ ID NO:139的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:141的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:243的LC可变区序列；
l)包括SEQ ID NO:149的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:151的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:244的LC可变区序列；
m)包括SEQ ID NO:159的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:161的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:245的LC可变区序列；
n)包括SEQ ID NO:169的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:171的LC可变区序列；
o)包括SEQ ID NO:179的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:181的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:246的LC可变区序列；
p)包括SEQ ID NO:189的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:191的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:247的LC可变区序列；
q)包括SEQ ID NO:199的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:201的LC可变区序列、包括SEQ ID NO:248的LC可变区序列；
r)包括SEQ ID NO:209的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:211的LC可变区序列、包括SEQ ID NO:249的LC可变区序列；
s)包括SEQ ID NO:219的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:221的LC可变区序列；或者
t)包括SEQ ID NO:229的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:231的LC可变区序列、包括SEQ ID NO:250的LC可变区序列。
例如，所述其抗原结合部分是scFv、Fv、重链或单结构域抗体。
本发明还涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与如上文所描述的抗体或其抗原结合部分竞争与犬CD20结合。
例如，所述抗体或其抗原结合部分与治疗部分缀合。
例如，所述治疗部分是第二抗体或其抗原结合部分。
例如，所述第二抗体或其抗原结合部分与不同的靶标结合。
例如，所述抗体或其抗原结合部分与另外的部分缀合，所述另外的部分选自半衰期延长部分、标记、细胞毒素、脂质体、纳米颗粒或放射性同位素。
例如，所述所述抗体或其抗原结合部分是a-岩藻糖基化的。
本发明还涉及一种药物组合物，其包括如上文所描述的抗体或其抗原结合部分。
本发明还涉及一种治疗有需要的犬受试者的由B细胞介导的病状的方法，所述方法包括施用有效量的如上文所描述的抗体或其抗原结合部分或如上文所描述的药物组合物。
例如，所述由B细胞介导的病状是B细胞淋巴瘤或白血病。
例如，所述由B细胞介导的病状是免疫介导的疾病。
例如，所述免疫介导的疾病是自体免疫性疾病。
例如，另一种治疗剂可以单独施用于所述受试者。
例如，所述治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。
例如，所述治疗剂是免疫抑制剂。
例如，所述治疗剂是免疫调节剂，如细胞因子或趋化因子。
本发明还涉及用于治疗疾病的如上文所描述的抗体或抗原结合部分或如上文所描述的药物组合物。
例如，所述疾病是由B细胞介导的疾病。
例如，所述由B细胞介导的疾病是B细胞淋巴瘤或白血病。
例如，所述由B细胞介导的疾病是免疫介导的疾病。
例如，所述免疫介导的疾病是自体免疫性疾病。
本发明还涉及一种抑制肿瘤生长或转移的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的如上文所描述的抗体或其抗原结合部分或如上文所描述的药物组合物接触。
本发明还涉及一种杀伤表达CD20的肿瘤细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如上文所描述的抗体或如上文所描述的药物组合物接触，使得产生对所述表达CD20的细胞的杀伤。
例如，所述肿瘤细胞是犬肿瘤细胞。
本发明还涉及一种核酸序列，其编码如上文所描述的抗体或其抗体抗原结合部分。
例如，所述核酸序列包括选自SEQ ID NO:3、5、13、15、23、25、33、35、43、45、78、80、88、90、98、100、108、110、118、120、128、130、138、140、148、150、158、160、168、170、178、180、188、190、198、200、208、210、218、220、228、230、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300或301的序列。
本发明还涉及一种载体，其包括如上文所描述的核酸序列。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包括如上文所描述的核酸序列或如上文所描述的载体。
本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上文所描述的抗体或其抗原结合部分或如上文所描述的药物组合物。
例如，其进一步包括用于检测所述抗体或其抗原结合部分的试剂。
本发明还涉及一种用于制备与CD20结合的犬抗体的方法，所述方法包括培养如上文所描述的分离的宿主细胞并且回收所述抗体。
本发明还涉及一种用于制备与CD20结合的犬抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用CD20抗原免疫表达包括犬重链V基因和犬轻链V基因的核酸构建体的转基因小鼠；
b)由所述小鼠产生抗体文库；以及
c)从所述文库分离抗体。
本发明还涉及一种用于检测来自犬受试者的生物样品中的CD20蛋白或CD20蛋白的胞外结构域的方法，所述方法包括使生物样品与如上文所描述的抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分与可检测标记连接。
例如，所述生物样品是活检、组织、血液、血清、血浆或淋巴液样品。
本发明还涉及一种抗体或其抗原结合部分，其在表位处与犬结合，所述表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号150-159)。
附图说明
本发明在以下非限制性附图中进一步描述。
图1.犬CD20免疫的Ky9小鼠的抗体滴度。将免疫后血清连续稀释(如图所示)并添加到表达犬CD20的细胞中。随后，将细胞与荧光团缀合的抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b次级抗体一起温育并在流式细胞仪上评估样品。免疫前血清与表达犬CD20的细胞的结合在图中呈现为背景线。
图2.(A)PMX001、PMX002、PMX003、PMX004和PMX005 mAb的可变区的氨基酸序列比对。阴影指示mAb的重链(HC)和轻链(LC)序列两者中的CDR1、CDR2和CDR3区。(B)mAb的HC和LC可变区的氨基酸序列比对。方框指示mAb的重链(HC)和轻链(LC)序列两者中的CDR1、CDR2和CDR3区。
图3.使用流式细胞术对抗犬CD20 mAb的结合评估。PMX001、PMX002、PMX003、PMX004、PMX005、1E4-cIGGB、4E1-7-cIGGB(参见A)和PMX006、PMX007、PMX008、PMX009、PMX010、PMX011(参见B)和PMX003、PMX066、PMX067、PMX069、PMX070、PMX071、PMX072、PMX073、PMX074、PMX075、PMX076、PMX077、PMX078、PMX079、PMX080、PMX081、1E4-cIGGB、4E1-7-cIGGB(参见C)以10μg/ml应用于表达cCD20的MDCK II细胞。利妥昔单抗-cIGGB(灰色阴影)用作同种型对照并在每个图中呈现。(D)PMX003、PMX115和PMX070 mAb的亲和力确定。在结合测定中评估1:2连续稀释的抗体与表达cCD20的MDCK II细胞的结合并确定荧光团信号的平均值。使用非线性回归，平均荧光强度(MFI)与浓度的图用于确定结合的EC50，这是抗体与细胞表面表达的犬CD20结合的表观Kd。
图4.抗犬CD20抗体的CDC活性。在CDC测定中，在一定浓度范围内(如图所示)分析了天然和a-岩藻糖基化的形式的抗体两者。利妥昔单抗-cIGGB嵌合抗体用作“同种型对照”。“F”是指抗体的a-岩藻糖基化的形式。
图5.抗犬CD20抗体的ADCC活性。在ADCC测定中，在一定浓度范围内(如图所示)分析了天然和a-岩藻糖基化的形式的抗体两者。利妥昔单抗-cIGGB嵌合抗体用作“同种型对照”。“F”是指抗体的a-岩藻糖基化的形式。还呈现了每种抗体的EC50值。
图6.抗犬CD20 mAb在全犬血中的B细胞耗竭效率。将新鲜抽取的狗全血用培养基稀释并与10μg/ml的PMX001、PMX003、1E4-cIGGB、4E1-7-cIGGB(参见A)、天然或a-岩藻糖基化的形式的PMX003和4E1-7-cIGGB抗体(参见B)、PMX003、PMX006、PMX007、PMX008、PMX009、PMX010、PMX011(参见C)或无抗体一起温育24小时。利妥昔单抗-cIGGB用作“同种型对照”(Iso Ctrl)。“F”是指抗体的a-岩藻糖基化的形式。
图7.抗犬CD20 mAb在健康比格犬中的B细胞耗竭效率。(A-B)通过静脉内施用给予每个测试组的三只健康比格犬以下抗体：同种型对照(利妥昔单抗-cIgGB，2.5mg/kg)、低剂量的PMX003(0.5mg/kg)、高剂量的PMX003(2.5mg/kg)和低剂量的a-岩藻糖基化的PMX003(0.5mg/kg)。“F”是指抗体的a-岩藻糖基化的形式。在第0、1、2、5、7、15、27和43天，使用流式细胞术分析淋巴细胞中的CD21+B细胞(A)和CD8+T细胞(B)的百分比。这里示出的数据代表四个技术重复。(C)通过静脉内施用给予每个测试组的三只健康比格犬以下抗体：同种型对照(利妥昔单抗-cIgGB，2mg/kg)、低剂量的PMX115(0.5mg/kg)、高剂量的PMX115(2mg/kg)、低剂量的PMX070(0.5mg/kg)和高剂量的PMX070(2mg/kg)。在第0、1、4、7、14、21和28天，使用流式细胞术分析淋巴细胞中的CD21+B细胞的百分比。这里示出的数据代表四个技术重复。
图8.抗CD20抗体的表位作图策略。(A)犬CD20胞外结构域序列在载体DH01-DH09的等效位置处突变为人CD20序列。(B)犬CD20胞外结构域序列在载体DM01-DM09的等效位置处突变为鼠CD20序列。(C)犬CD20细胞外结构域的小环中的每个残基和大环中的每个其它残基被突变为丙氨酸，产生载体S01-S09和L01-L25。突变的残基以粗体突出显示。
图9.通过流式细胞术评估PMX003、PMX115和PMX070 mAb与表达狗-人嵌合CD20或狗-小鼠嵌合CD20的MDCK细胞的结合。图中的01-09的黑色条形表示与图8A所示DH01-DH09序列的结合并且图中的01-09的灰色条形表示与图8B所示DM01-DM09序列的结合。表达野生型犬CD20的MDCK细胞用作阳性对照并且野生型MDCK细胞用作阴性对照。
表1：氨基酸残基和保守氨基酸取代的实例
表2：序列
表3：VH和VL基因使用
表4：抗体功能数据汇总
表5：抗体可显影性特征
具体实施方式
现在将进一步描述本发明的实施例。在以下段落中，描述了不同的实施例。除非明确指出相反，否则如此定义的每个方面都可以与任何其它一个或多个方面组合。
通常，与本文所描述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学和蛋白质以及核酸化学以及杂交结合使用的命名法和其技术是本领域众所周知和常用的命名法和技术。除非另外说明，否则通常根据本领域众所周知的常规方法以及如在本说明书通篇引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的方法进行本公开的方法和技术。参见例如，Green和Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratory Manual)》,第4版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(2012)；《治疗性单克隆抗体：从实验室到临床(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic)》,ZhiqiangAn(编辑),Wiley,(2009)；以及《抗体工程(Antibody Engineering)》,第2版,第1和第2卷,Ontermann和Dubel,编辑,海德尔堡的施普林格出版社(Springer-Verlag,Heidelberg)(2010)。
根据制造商的说明，如本领域通常实现的或如本文所描述来进行酶促反应和纯化技术。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学相关使用的命名法以及实验室程序和技术都是本领域中众所周知且常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及对患者的治疗。
本发明人已经开发了与犬CD20特异性结合的全犬抗体。这些抗体是在表达犬V、D、J基因的转基因啮齿动物中产生的。因此，与犬科化抗体或嵌合抗体相比，所述抗体对犬受试者的施用的免疫原性更低。此外，由于这些抗体可以直接使用，无需对其可变区进行进一步修饰，因此不存在降低亲和力或以其它方式损害抗体的风险。其它技术通过犬来源的抗体序列与通常为啮齿动物的另一物种的抗体序列的离体组合而存在引入开发或功效责任的风险。因此，本发明涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合。
本发明的抗体和其抗原结合部分的性质可以用于治疗方法和用途以及本文所描述的药物调配物。
术语CD20是指B淋巴细胞抗原CD20。抗体和其抗原结合部分与野生型犬CD20特异性结合，如SEQ ID NO:1(核苷酸序列)和SEQ ID NO:2(氨基酸序列)所定义的。除非另有说明，否则如本文所使用的术语CD20是指犬CD20。B淋巴细胞抗原CD20或CD20在所有B细胞的表面上表达，开始于前B期(CD45R+、CD117+)并且浓度逐渐增加直到成熟为止。在人类和犬中，CD20由MS4A1基因编码。
术语“CD20结合分子/蛋白质/多肽/药剂/部分”、“CD20抗原结合分子/蛋白质/多肽/药剂/部分”、“抗CD20抗体”、“抗CD20抗体或其抗原结合部分”均指能够与犬CD20抗原特异性结合的分子。结合反应可以通过标准方法示出，例如参考使用不相关特异性的抗体的阴性对照测试。
包含本文所描述的与所关注的抗原，即犬CD20“结合”或“能够与其结合”的多特异性，例如双特异性或三特异性结合剂的本发明的抗体或其抗原结合部分是以足够的亲和力与抗原结合的抗体或其抗原结合部分，使得所述抗体或其抗原结合部分可用作靶向表达本文如所描述的抗原CD20的细胞或组织的治疗剂。
根据本发明的抗体或其抗原结合部分与犬CD20特异性结合。换句话说，与CD20抗原的结合明显不同于非特异性相互作用。具体地，本文所描述的抗体不与小鼠CD20交叉反应。
如本文所使用的术语与特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binds to)”或对其具有“特异性”可以例如通过对靶标具有至少约10-6M、可替代地至少约10-7M、可替代地至少约10-8M、可替代地至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、可替代地至少约10-11M、可替代地至少约10-12M或更低的KD的分子表现。在一个实施例中，例如，KD为至少约10-8M至约10-9M。在一个实施例中，KD在纳摩尔范围内。在一个实施例中，术语“特异性结合”是指分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的结合。术语KD和KD在本文中可互换使用。
如本文所使用的术语“抗体”广义上是包含四条多肽链、两条重链(H)和两条轻链(L)的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，或其保留了Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生物。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区或结构域(在本文中缩写为HCVR)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区或结构域(在本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。
重链和轻链可变区可以进一步细分为散布有被称为框架区(FR)的更保守区的被称为互补决定区(CDR)的高变区。每个重链和轻链可变区由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
免疫球蛋白分子通常可以是任何同种型、类别或亚类。根据本发明的各个方面的CH3结构域是犬IgG亚型的CH3结构域，例如IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。
在犬中，有被称为A、B、C和D的四条IgG重链。这些重链表示四种不同的狗IgG亚类，其分别被称为IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。这四条重链的DNA和氨基酸序列首先由Tang等人(《兽医免疫学和免疫病理学(Vet.Immunol.Immunopathol.)》80:259-270(2001))鉴定。这些重链的氨基酸和DNA序列也可从GenBank数据库(IgGA：登录号AAL35301.1、IgGB：登录号AAL35302.1、IgGC：登录号AAL35303.1、IgGD：登录号AAL35304.1)获得。犬抗体还含有两种类型的轻链，κ和λ(GenBank登录号κ轻链氨基酸序列ABY 57289.1、GenBank登录号ABY55569.1)。本文的抗体可以具有λ或κ轻链。在一个实施例中，轻链是λ轻链。
术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区中的每个可变区中存在三个CDR，对于可变区中的每个可变区分别指定为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”是指存在于能够与抗原结合的单个可变区中的一组三个CDR。根据本领域已知的不同系统，可以不同地定义这些CDR的确切边界。
Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等人,(1971)《美国纽约科学院年报(Ann.NY Acad.Sci.)》190:382-391和Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第五版,美国卫生和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版号91-3242)。Chothia反而是指结构环的位置(Chothia和Lesk《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901 -917(1987))。当涉及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统。另一个系统是免疫遗传学(IMGT)编号方案。IMGT编号方案在Lefranc等人,《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》,29,185-203(2005)中描述。除非另有说明，否则本文中使用IMGT编号方案。
嵌合抗体是含有可变结构域的重组蛋白，所述可变结构域包含源自一个物种的抗体的互补决定区(CDR)，优选地啮齿动物或人抗体，而抗体分子的恒定结构域源自犬抗体的恒定结构域。
如本文所使用的，术语“犬科化抗体”是指含有来自犬和非犬(例如，鼠)抗体两者的序列的重组抗体的形式。通常，犬科化抗体将包括至少一个或多个，通常为两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有高变环与非犬免疫球蛋白的那些高变环相对应，并且所有或基本上所有框架(FR)区(并且通常所有或基本上所有剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些框架区。犬科化抗体可以包括来自鼠或人抗体的三条重链CDR和三条轻链CDR以及犬框架或经修饰的犬框架。经修饰的犬框架包括可以进一步优化犬科化抗体的效力，例如，增加其与其靶标的结合的一个或多个氨基酸变化。非犬序列，例如高变环的序列可以进一步与犬序列进行比较，并且残基尽可能多地变化以与真实的犬序列尽可能类似。
相反，本发明的完全犬抗体具有犬可变区并且不包含来自另一物种的完全或部分CDR或FR。有利地，如本文所描述的完全犬抗体已经从包括犬免疫球蛋白序列的转基因小鼠中获得。在这些免疫小鼠中产生的抗体是通过体内B细胞信号传导和发育而产生的，以允许天然亲和力成熟，包含体内V(D)J重组、体内连接多样化、体内重链和轻链配对以及体内超突变。以这种方式产生的完全犬抗体产生了具有用于可显影性的最佳性质的抗体，最大限度地减少了大规模产生之前的冗长前导优化。有利地，当引入到患者动物体内时，此类完全犬抗体呈现出尽可能低的免疫原性风险，这反过来有利于重复给药方案。鉴于离体mAb工程存在引入发育责任、免疫原性和亲和力降低的风险(如上所述)，因此，本发明的完全犬抗体在临床环境中最有可能是有效的疗法。因此，在一实施例中，术语犬抗体是指完全犬抗体。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化、碳水化合物加成)之外，包括所述群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的有利之处还在于，其是由杂交瘤培养物合成的，而不受其它免疫球蛋白污染。
术语“抗原结合位点”是指包括与抗原特异性结合的区域的抗体或抗体片段的一部分。抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合位点通常包括在抗体或抗体片段的相关VH和VL内。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原的表面上免疫球蛋白、抗体或抗体片段特异性结合的位点。通常，抗原具有几个或许多不同的表位并与许多不同的抗体反应。术语具体包含线性表位和构象表位。蛋白质抗原内的表位可以由连续氨基酸(通常为线性表位)或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(通常为构象表位)两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。用于确定给定抗体或抗体片段所结合的表位的方法(即，通过丙氨酸扫描诱变或肽扫描(Pepscan)表位作图)是本领域众所周知的并且包含例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试了重叠或连续肽与给定抗体或抗体片段的反应性。当这两个抗体识别相同或空间重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间重叠的表位结合的最广泛使用且快速的方法是竞争测定，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以不同的形式配置。
在一个实施例中，如本文所描述的抗体或其抗原结合部分与表位结合，所述表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至19个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个，或由以下氨基残基组成：ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ IDNO:302、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号141-159)。在一个实施例中，所述表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号150-159)。
在一个实施例中，通过如实例中所示的定点诱变来确定表位，例如使用丙氨酸扫描。在一个实施例中，表位是线性表位。在一个实施例中，表位是构象表位。在一个实施例中，表位包含大环中的线性表位。在一个实施例中，表位进一步包含小环中的构象表位。在一个实施例中，抗体是PMX003或其抗原结合部分或与如本文所描述的具有至少80％序列同一性的抗体。
在本发明的另一方面，本发明还涉及一种抗体或其抗原结合部分，其与表位结合，所述表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至19个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个，或由以下氨基残基组成：ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号141-159)。在一个实施例中，所述表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号150-159)。例如，所述抗体或其抗原结合部分可以具有如本文所描述的序列。
本发明还涉及一种抗体或其抗原结合部分，其与如本文所描述的抗体或其抗原结合部分竞争。
抗体的蛋白水解消化释放被称为Fv(片段可变)、Fab(片段抗原结合)和Fc(片段结晶)的不同片段。Fc片段包括通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。Fc片段的恒定结构域负责介导抗体的效应子功能。
本发明延伸至抗体的抗原结合部分或抗原结合片段。术语“结合部分”和“片段”在本文中可互换使用。抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab′)2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重(VH)、可变轻(VL)链结构域等。全长抗体的功能片段保留了完整抗体的靶特异性。因此，重组功能性抗体片段，如Fab(片段、抗体)、scFv(单链可变链片段)和单结构域抗体(dAb)已经用于开发治疗剂，作为基于mAb的治疗剂的替代物。
本发明还延伸至包括如本文所描述的序列的抗体模拟物。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这一片段由紧密地非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中衍生出六个高变环(H链和L链各3个环)，所述高变环为抗原结合提供氨基酸残基，并且赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“单链Fv”也缩写为是由连接成单个多肽链的两个可变结构域VH和VL组成的抗体片段scFv片段(约25kDa)的“sFv”或“scFv”。自然地，VH和VL结构域通过疏水相互作用非共价缔合并且倾向于解离。然而，稳定的片段可以通过用亲水柔性连接子连接结构域来产生单链Fv(scFv)而被工程化。
最小的抗原结合片段是单可变片段，即可变重链(VH)或可变轻链(VL)结构域。VH和VL结构域分别能够与抗原结合。靶结合不需要分别与轻链/重链配偶体结合，或者实际上不需要存在完整抗体的其它部分。抗体的抗原结合实体，大小缩减为一个单结构域(与VH或VL结构域相对应)，通常被称为“单结构域抗体”或“免疫球蛋白单可变结构域”。因此，单结构域抗体(约12至15kDa)具有VH或VL结构域，即其不具有完整抗体的其它部分。术语“结构域抗体”的“dAb”通常是指与抗原特异性结合的单免疫球蛋白可变结构域(VH、VHH或VL)多肽。
术语“分离的”是指与其天然环境分离的部分。例如，术语“分离的”是指基本上不含其它抗体、抗体或抗体片段的抗体或其片段。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。
如本文所使用的，术语“同源性”或“同一性”通常是指如果必要，在比对序列之后并且在一些实施例中在引入缺口以达到最大同源性百分比之后，序列中与所比较的参考多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。因此，两个氨基酸序列之间的同源性百分比相当于两个序列之间的同一性百分比。N或C末端延伸、标签或插入不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。可以使用众所周知的数学算法来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本文中的“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸之一或可能存在于特定的确定位置处的任何非天然类似物。氨基酸涵盖天然存在的氨基酸和合成氨基酸两者。尽管在大多数情况下，当重组产生蛋白质时，仅使用天然存在的氨基酸。
如本文所使用的，在如本文所描述的异二聚体蛋白质或多肽(例如抗体)的氨基酸序列中，用另一个氨基酸残基“取代一个氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替代一个氨基酸残基”并表示原始(例如野生型/种系)氨基酸序列中的特定位置处的特定氨基酸残基已经被不同的氨基酸残基替代(或取代)。这可以使用技术人员可用的标准技术来完成，例如使用重组DNA技术。氨基酸相对于天然(野生型/种系)序列发生变化，如在自然界中在野生型(wt)中发现的那样，但是可以在含有相对于天然序列的其它变化的IgG分子中发生变化。在本文中“野生型”或“WT”或“天然”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质、多肽、抗体或免疫球蛋白具有尚未有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
根据本发明的抗体或其抗原结合部分具有以下性质中的一个或多个性质：
a)与犬CD20特异性结合；
b)用如实例中所测量的并且例如如图所示的KD与犬CD20结合；
c)示出了在表达CD20的犬淋巴瘤细胞系中的如CDC和/或ADCC等细胞杀伤，如实例中所测量的；
d)促进抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；
e)能够有效清除犬组织中的CD20阳性B细胞；
f)能够与表达犬CD20的细胞结合；
g)能够合适地通过凋亡通过直接细胞杀伤来清除表达犬CD20的细胞；
h)提供良好的稳定性，如实例中所示；
i)与包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成的表位结合：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ IDNO:2中的氨基酸编号150-159)，例如ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号141-159)；
j)对犬CD20具有比基准测试抗体1E4和4E1-7更强的结合能力(高5-10倍)，例如如实例中所示；
k)具有比基准测试抗体1E4和4E1-7更强的ADCC和/或CDC活性，例如如实例和表4中所示；和/或
l)与基准测试抗体1E4和4E1-7 mAb相比，更有效地杀伤全犬血中的B细胞，例如如所示例如如所示。
在一个实施例中，根据本发明的抗体或其抗原结合部分具有上述性质中的一个或多个性质并且任选地具有以下性质中的一个或多个性质：
a)具有EC50值小于20nM的CDC活性；
b)具有EC50值小于0.3nM的ADCC活性；
c)具有超过100ug/ml的瞬时表达产量；
d)由Uncle确定的Tm1高于58℃；
e)以约0.5mg/kg至2.5mg/kg的剂量在狗体内提供细胞杀伤；
f)将狗体内的B细胞耗竭维持在低水平至少15天；和/或
g)与包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成的表位结合：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ IDNO:2中的氨基酸编号150-159)，例如ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号141-159)。
这些性质可以通过本领域已知的方法测量，如实例中公开的方法，包含在小鼠模型或狗中的体内研究。
具体地，本发明人已经发现抗体和其抗原结合部分示出CDC和ADCC活性两者，例如，如通过在表达CD20的犬淋巴瘤细胞系中的细胞杀伤来证明，如实例中所测量的。
一方面，本发明涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)重链(HC)CDR1序列，所述HC CDR1序列包括SEQ ID NO:27或与其具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
b)HC CDR2序列，所述HC CDR2序列包括SEQ ID NO:28或与其具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
c)HC CDR3序列，所述HC CDR3序列包括SEQ ID NO:29或与其具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
d)轻链(LC)CDR1序列，所述LC CDR1序列包括与其具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的SEQ ID NO:30或由其组成；
e)LC CDR2序列，所述LC CDR2序列包括SEQ ID NO:31或与其具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；以及
f)LC CDR3序列，所述LC CDR3序列包括SEQ ID NO:32或与其具有至少60％、70％、80％或90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
本发明涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)包括SEQ ID NO:27或由其组成的HC CDR1序列；
b)包括SEQ ID NO:28或由其组成的HC CDR2序列；
c)包括SEQ ID NO:29或由其组成的HC CDR3序列；
d)包括SEQ ID NO:30或由其组成的LC CDR1序列；
e)包括SEQ ID NO:31或由其组成的LC CDR2序列；以及
f)包括SEQ ID NO:32或由其组成的LC CDR3序列；
或者涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其具有如上文所描述的CDR但具有一个或多个相较于上文所提及的CDR序列具有1、2、3或4个氨基酸取代的CDR。
因此，本发明涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)重链(HC)CDR1序列，所述HC CDR1序列包括SEQ ID NO:27或相较于SEQ ID NO:27具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
b)HC CDR2序列，所述HC CDR2序列包括SEQ ID NO:28或相较于SEQ ID NO:28具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
c)HC CDR3序列，所述HC CDR3序列包括SEQ ID NO:29或相较于SEQ ID NO:29具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
d)轻链(LC)CDR1序列，所述LC CDR1序列包括SEQ ID NO:30或相较于SEQ ID NO:30具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
e)LC CDR2序列，所述LC CDR2序列包括SEQ ID NO:31或相较于SEQ ID NO:31具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；以及
f)LC CDR3序列，所述LC CDR3序列包括SEQ ID NO:32或相较于SEQ ID NO:32具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:7或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:8或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:9或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:10或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:11或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:12或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:17或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:18或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:19或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:20的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:21或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:22或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:37的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:38的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:39的HC CDR3序列、包括SEQ IDNO:40的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:41的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:42的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:47或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:48或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:49或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:50或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:51或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:52或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:82或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:83或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:84或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:85或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:86或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:87或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:92或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:93或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:94或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:95或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:96或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:97或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:102或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:103或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:104或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:105或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:106或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:107或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:112或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:113或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:114或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:115或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:116或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:117或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:122或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:123或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:124或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:125或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:126或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:127或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:132或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:133或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:134或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:135或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:136或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:137或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:142或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:143或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:144或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:145或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:146或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:147或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:152或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:153或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:154或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:155或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:156或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:157或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:162或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:163或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:164或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:165或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:166或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:167或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:172或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:173或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:174或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:175或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:176或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:177或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:182或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:183或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:184或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:185或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:186或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:187或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:192或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:193或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:194或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:195或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:196或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:197或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:202或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:203或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:204或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:205或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:206或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:207或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:212或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:213或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:214或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:215或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:216或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:217或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:222或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:223或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:224或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:225或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:226或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:227或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:232或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:233或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:234或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:235或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:236或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:237或由其组成的LC CDR3序列。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分包括：重链(HC)可变区序列，所述HC可变区序列包括SEQ ID NO:24或与其具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性的序列；以及轻链(LC)可变区序列，所述LC可变区序列包括SEQ ID NO:26或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO:24的重链(HC)可变区序列，以及包含SEQ ID NO:26的轻链(LC)可变区序列或包含SEQ ID NO:26的LC可变区序列，其中LC可变区的FR1中的NVT序列已经被修饰，例如在FR1中具有1、2或3个氨基酸修饰的LC可变区，例如包括具有如下文所描述的SEQID NO:60、61、62、63、64或65的FR1的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:53、54、55、56、57或58的LC可变区序列。
例如，所述抗体或其抗原结合部分具有
a)包括SEQ ID NO:4或由其组成的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:6或由其组成的LC可变区序列；
b)包括SEQ ID NO:14或由其组成的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:16或由其组成的LC可变区序列；
c)包括SEQ ID NO:34的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:36或由其组成的LC可变区序列；
d)包括SEQ ID NO:44或由其组成的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:46或由其组成的LC可变区序列；
e)包括SEQ ID NO:79的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:81的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:238的LC可变区序列；
f)包括SEQ ID NO:89的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:91的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:239的LC可变区序列；
g)包括SEQ ID NO:99的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:101的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:240的LC可变区序列；
h)包括SEQ ID NO:109的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:111的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:241的LC可变区序列；
i)包括SEQ ID NO:119的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:121的LC可变区序列；
j)包括SEQ ID NO:129的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:131的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:242的LC可变区序列；
k)包括SEQ ID NO:139的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:141的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:243的LC可变区序列；
l)包括SEQ ID NO:149的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:151的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:244的LC可变区序列；
m)包括SEQ ID NO:159的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:161的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:245的LC可变区序列；
n)包括SEQ ID NO:169的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:171的LC可变区序列；
o)包括SEQ ID NO:179的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:181的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:246的LC可变区序列；
p)包括SEQ ID NO:189的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:191的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:247的LC可变区序列；
q)包括SEQ ID NO:199的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:201的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:248的LC可变区序列；
r)包括SEQ ID NO:209的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:211的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:249的LC可变区序列；
s)包括SEQ ID NO:219的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:221的LC可变区序列；或者
t)包括SEQ ID NO:229的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:231的LC可变区序列或如下文所描述的NVT序列已经被修饰的LC可变区序列，例如包括SEQ ID NO:250的LC可变区序列。
在一个实施例中，其抗原结合部分是F(ab′)2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重(VH)结构域或可变轻(VL)。
在另一个实施例中，所述抗体或抗原结合部分包括包含SEQ ID NO:27或由其组成的HC CDR1序列、包含SEQ ID NO:28或由其组成的HC CDR2序列、包含SEQ ID NO:29或由其组成的HC CDR3序列、包含SEQ ID NO:30或由其组成的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:31或由其组成的LC CDR2序列和包含SEQ ID NO:32或由其组成的LC CDR3序列。所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有5个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中具有1个氨基酸变化的框架区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:7或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:8或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:9或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:10或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:11或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:12或由其组成的LC CDR3序列。所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有2个氨基酸变化并且相较于种系序列(SEQ ID NO:76)在轻链可变序列中具有3个氨基酸变化的框架区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:17或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:18或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:19或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:20的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:21或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:22或由其组成的LC CDR3序列。所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有10个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化的框架区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:37的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:38的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:39的HC CDR3序列、包括SEQ IDNO:40的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:41的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:42的LC CDR3序列。所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有12个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化的框架区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分具有包括SEQ ID NO:47或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:48或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:49或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:50或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:51或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:52或由其组成的LC CDR3序列。所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有4个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化的框架区。
在一实施例中，所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有1至10个氨基酸变化的框架区。例如，所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的框架区。在一实施例中，所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ IDNO:76)在轻链可变序列中具有1至10个氨基酸变化的框架区。例如，所述抗体或抗原结合部分具有相较于种系序列(SEQ ID NO:76)在轻链可变序列中可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的框架区。
本发明还涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)HC CDR1序列，所述HC CDR1序列包括SEQ ID NO:112或相较于SEQ ID NO:112具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
b)HC CDR2序列，所述HC CDR2序列包括SEQ ID NO:113或相较于SEQ ID NO:113具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
c)HC CDR3序列，所述HC CDR3序列包括SEQ ID NO:114或相较于SEQ ID NO:114具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
d)LC CDR1序列，所述LC CDR1序列包括SEQ ID NO:115或相较于SEQ ID NO:124具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
e)LC CDR2序列，所述LC CDR2序列包括SEQ ID NO:116或相较于SEQ ID NO:116具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；以及
f)LC CDR3序列，所述LC CDR3序列包括SEQ ID NO:117或相较于SEQ ID NO:117具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。
本发明还涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)HC CDR1序列，所述HC CDR1序列包括SEQ ID NO:122或相较于SEQ ID NO:122具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
b)HC CDR2序列，所述HC CDR2序列包括SEQ ID NO:123或相较于SEQ ID NO:123具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
c)HC CDR3序列，所述HC CDR3序列包括SEQ ID NO:124或相较于SEQ ID NO:124具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
d)LC CDR1序列，所述LC CDR1序列包括SEQ ID NO:125或相较于SEQ ID NO:125具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
e)LC CDR2序列，所述LC CDR2序列包括SEQ ID NO:126或相较于SEQ ID NO:126具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；以及
f)LC CDR3序列，所述LC CDR3序列包括SEQ ID NO:127或相较于SEQ ID NO:127具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。
如本文所使用的氨基酸变化选自氨基酸取代、添加或缺失。在一个实施例中，氨基酸变化是氨基酸取代。
在一个实施例中，所述抗体是PMX001、PMX002、PMX003、PMX004、PMX005、PMX 006、PMX 007、PMX 008、PMX 009、PMX 010、PMX 011、PMX066、PMX067、PMX068、PMX069、PMX070、PMX071、PMX072、PMX073、PMX074、PMX075、PMX076、PMX077、PMX078、PMX079、PMX080、PMX081、PMX112、PMX113、PMX114、PMX115、PMX116、PMX117、PMX118、PMX119、PMX120、PMX121、PMX122、PMX123或PMX 124，如示例和序列信息中所示。在一些实施例中，所述抗体选自PMX001、PMX002、PMX003、PMX004、PMX005、PMX066、PMX067、PMX068、PMX069、PMX070、PMX071、PMX072、PMX073、PMX074、PMX075、PMX076、PMX077、PMX078、PMX079、PMX080或PMX081。在一个实施例中，所述抗体选自PMX003、PMX066、PMX069、PMX070、PMX078或PMX081。在一个实施例中，所述抗体选自PMX010、PMX112、PMX115、PMX122或PMX124。在一个实施例中，所述抗体选自PMX069、PMX070或PMX115。
因此，在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有2个氨基酸变化并且相较于种系序列(SEQ ID NO:76)在轻链可变序列中具有3个氨基酸变化。CDR序列如下：重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:7)、CDR2(SEQ ID NO:8)和CDR3(SEQ ID NO:9)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:10)、CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:14)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:13)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:16)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有10个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化。CDR是：重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:17)、CDR2(SEQ ID NO:18)和CDR3(SEQ ID NO:19)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:20)、CDR2(SEQ ID NO:21)和CDR3(SEQ ID NO:22)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:24)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:23)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:26)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:25)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有5个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中具有1个氨基酸变化。CDR是：重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:27)、CDR2(SEQ ID NO:28)和CDR3(SEQ ID NO:29)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:30)、CDR2(SEQ ID NO:31)和CDR3(SEQ ID NO:32)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:34)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:33)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:36)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:35)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有12个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:37)、CDR2(SEQ ID NO:38)和CDR3(SEQ ID NO:39)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:40)、CDR2(SEQ ID NO:41)和CDR3(SEQ ID NO:42)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:44)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:43)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:46)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:45)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有4个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:47)、CDR2(SEQ ID NO:48)和CDR3(SEQ ID NO:49)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:50)、CDR2(SEQ ID NO:51)和CDR3(SEQ ID NO:52)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:79)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:78)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:81)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:80)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:82)、CDR2(SEQ ID NO:83)和CDR3(SEQ ID NO:84)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:85)、CDR2(SEQ ID NO:86)和CDR3(SEQ ID NO:87)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:89)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:88)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:91)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:90)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:92)、CDR2(SEQ ID NO:93)和CDR3(SEQ ID NO:94)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:95)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:97)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:99)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:98)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:101)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:100)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:102)、CDR2(SEQ ID NO:103)和CDR3(SEQ ID NO:104)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:105)、CDR2(SEQ ID NO:106)和CDR3(SEQ ID NO:107)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:109)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:108)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:111)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:110)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:112)、CDR2(SEQ IDNO:113)和CDR3(SEQ ID NO:114)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:115)、CDR2(SEQ IDNO:116)和CDR3(SEQ ID NO:117)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:119)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:118)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:121)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:120)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:122)、CDR2(SEQ IDNO:123)和CDR3(SEQ ID NO:124)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:125)、CDR2(SEQ IDNO:126)和CDR3(SEQ ID NO:127)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:129)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:128)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:131)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:130)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:132)、CDR2(SEQ IDNO:133)和CDR3(SEQ ID NO:134)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:135)、CDR2(SEQ IDNO:136)和CDR3(SEQ ID NO:137)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:139)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:138)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:141)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:140)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:142)、CDR2(SEQ IDNO:143)和CDR3(SEQ ID NO:144)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:145)、CDR2(SEQ IDNO:146)和CDR3(SEQ ID NO:147)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:149)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:148)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:151)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:150)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:152)、CDR2(SEQ IDNO:153)和CDR3(SEQ ID NO:154)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:155)、CDR2(SEQ IDNO:156)和CDR3(SEQ ID NO:157)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:159)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:158)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:161)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:160)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:162)、CDR2(SEQ IDNO:163)和CDR3(SEQ ID NO:164)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:165)、CDR2(SEQ IDNO:166)和CDR3(SEQ ID NO:167)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:169)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:168)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:171)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:170)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:172)、CDR2(SEQ IDNO:173)和CDR3(SEQ ID NO:174)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:175)、CDR2(SEQ IDNO:176)和CDR3(SEQ ID NO:177)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:179)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:178)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:181)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:180)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:182)、CDR2(SEQ IDNO:183)和CDR3(SEQ ID NO:184)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:185)、CDR2(SEQ IDNO:186)和CDR3(SEQ ID NO:187)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:189)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:188)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:191)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:190)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:192)、CDR2(SEQ IDNO:193)和CDR3(SEQ ID NO:194)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:195)、CDR2(SEQ IDNO:196)和CDR3(SEQ ID NO:197)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:199)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:198)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:201)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:200)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:202)、CDR2(SEQ IDNO:203)和CDR3(SEQ ID NO:204)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:205)、CDR2(SEQ IDNO:206)和CDR3(SEQ ID NO:207)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:209)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:208)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:211)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:210)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:212)、CDR2(SEQ IDNO:213)和CDR3(SEQ ID NO:214)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:215)、CDR2(SEQ IDNO:216)和CDR3(SEQ ID NO:217)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:219)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:218)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:221)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:220)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:222)、CDR2(SEQ IDNO:223)和CDR3(SEQ ID NO:224)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:225)、CDR2(SEQ IDNO:226)和CDR3(SEQ ID NO:227)。
在一个实施例中，所述抗体具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:229)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:228)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:231)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:230)。CDR是重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:232)、CDR2(SEQ IDNO:233)和CDR3(SEQ ID NO:234)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:235)、CDR2(SEQ IDNO:236)和CDR3(SEQ ID NO:237)。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分包括Fc区，例如犬Fc区，例如犬IgGB Fc区。
包含但不限于表2中所示的氨基酸和核苷酸序列(和/或其片段)的本文所描述的可变区序列可以与编码抗体分子的一个或多个恒定链(和/或其片段)的一个或多个氨基酸序列和/或核苷酸序列组合使用。例如，表2中所示的可变区氨基酸序列可以与衍生可变区氨基酸序列的相同或不同物种(例如，人、山羊、大鼠、绵羊、鸡)的任何抗体分子的恒定区连接。优选地，表2中所示的可变区氨基酸序列与犬抗体的恒定区连接并且可以是来自犬IgGA、B、C或D中任一种的恒定区。在一个实施例中，恒定区是犬IgG B恒定区。可以使用狗IGGB(SEQ ID NO:66)、狗IGK(SEQ ID NO:73)或狗IGLC5(SEQ ID NO:67)恒定区。
如上文所描述的抗体和抗原结合部分的变体也在本发明的范围内。
如本文所描述的抗体或其抗原结合部分的变体与非变体分子具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一个实施例中，序列同一性为至少95％。在一个实施例中，修饰是保守序列修饰。
如本文所使用的，术语“保守序列修饰”旨在是指不显著地影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包含氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，将修饰引入到本发明的抗体或其抗原结合部分中，如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且可以使用本文所描述的功能测定测试改变的抗体的保留功能(即，CD20结合)。
因此，这些氨基酸变化通常可以在不改变多肽的生物活性、功能或其它期望的性质的情况下进行，如对抗原的其亲和力或其特异性。通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代不会显著改变生物活性。此外，结构或功能类似的氨基酸的取代不太可能破坏多肽的生物活性。包括本文所描述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写，以及这些氨基酸残基的保守取代在下表1中示出。
表1：氨基酸残基和保守氨基酸取代的实例
在一些实施例中，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其是与本文所描述的序列相比的抗体或其抗原结合部分的变体，例如选自SEQ ID NO:3至65或SEQ ID NO:78至237，其包括一个或多个序列修饰并且与未经修饰的抗体或其片段相比，在一个或多个性质如结合亲和力、特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性方面具有改善。
可以表明抗体可以成功大规模开发的测量性质的合适方法包含首先使用色谱法纯化，如亲和色谱法色谱法(蛋白A：MabSelect Sure LX)、阴离子交换色谱法(Capto Q)、阳离子交换色谱法(Capto S)和缓冲液交换(G-25Fine)，然后评估抗体是否保持完整(例如，使用SDS PAGE分析确定分子量，使用HPLC-SEC计算单体的％，评估聚集和热稳定性(Tm)研究)。
例如，可以去除天冬酰胺连接的蛋白质糖基化的共有序列。PMX003(SEQ ID NO:26)的轻链的框架区1(FR1)含有NVT序列子，所述序列子是天冬酰胺连接的蛋白质糖基化的共有序列。为了去除与该位点结合的聚糖，PMX003 mAb的FR1中的NVT序列子突变为PMX006mAb的QVT、PMX007 mAb的AVT、PMX008 mAb的EVT、PMX009mAb的NVA、PMX010 mAb的SVT和PMX011 mAb的TVT。此类修改在本发明的范围内。
PMX006 mAb(SEQ ID NO:53)、PMX007 mAb(SEQ ID NO:54)、PMX008 mAb(SEQ IDNO:55)、PMX009 mAb(SEQ ID NO:56)、PMX010 mAb(SEQ ID NO:57)、PMX011 mAb(SEQ IDNO:58)的所得轻链可变区氨基酸序列以及PMX003(SEQ ID NO:59)、PMX006 mAb(SEQ IDNO:60)、PMX007 mAb(SEQ ID NO:61)、PMX008 mAb(SEQ ID NO:62)、PMX009 mAb(SEQ IDNO:63)、PMX010 mAb(SEQ ID NO:64)、PMX011 mAb(SEQ ID NO:65)的FR1序列在本发明的范围内并且在序列表2中列出。这些可以与PMX003重链而非SEQ ID NO:26一起使用。PMX003的LC FR1序列在SEQ ID NO:59中示出，经修饰的LC FR1序列在SEQ ID NO:60、61、62、63、64和65中示出。
NVT序列子在PMX001至PMX005(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQID NO:36、SEQ ID NO:46)和PMX066至PMX0081(SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:151、SEQID NO:161、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:231)的轻链的FR1的残基位置11至13处发现。在PMX001至PMX005或PMX066至PMX081的轻链的FR1的残基位置11至13处发现的NVT序列子可以突变为选自以下的序列：QVT、AVT、EVT、NVA、SVT、TVT。在一实施例中，在PMX001至PMX005或PMX066至PMX081的轻链的FR1的残基位置11至13处发现的NVT序列子可以突变为SVT。
PMX066(SEQ ID NO:81)、PMX067(SEQ ID NO:91)、PMX068(SEQ ID NO:101)、PMX069(SEQ ID NO:111)、PMX071(SEQ ID NO:131)、PMX072(SEQ ID NO:141)、PMX073(SEQID NO:151)、PMX074(SEQ ID NO:161)、PMX076(SEQ ID NO:181)、PMX077(SEQ ID NO:191)、PMX078(SEQ ID NO:201)、PMX079(SEQ ID NO:211)、PMX081(SEQ ID NO:231)的轻链的框架区1(FR1)含有NVT序列子，所述序列子是天冬酰胺连接的蛋白质糖基化的共有序列。为了去除与该位点结合的聚糖，PMX066、PMX067、PMX068、PMX069、PMX071、PMX072、PMX073、PMX074、PMX076、PMX077、PMX078、PMX079和PMX081 mAb的FR1中的NVT序列子突变为SVT，以分别产生PMX112(SEQ ID NO:238)、PMX113(SEQ ID NO:239)、PMX114(SEQ ID NO:240)、PMX115(SEQID NO:241)、PMX116(SEQ ID NO:242)、PMX117(SEQ ID NO:243)、PMX118(SEQ ID NO:244)、PMX119(SEQ ID NO:245)、PMX120(SEQ ID NO:246)、PMX121(SEQ ID NO:247)、PMX122(SEQID NO:248)、PMX123(SEQ ID NO:249)和PMX124(SEQ ID NO:250)。此类修饰在本发明的范围内，这些的轻链可以与其相应重链对应物一起使用，例如PMX066(SEQ ID NO:79)的HC可以与经修饰的LC(SEQ ID NO:238)一起使用等。
PMX112 mAb(SEQ ID NO:238)、PMX113 mAb(SEQ ID NO:239)、PMX114 mAb(SEQ IDNO:240)、PMX115 mAb(SEQ ID NO:241)、PMX116 mAb(SEQ ID NO:242)、PMX117 mAb(SEQ IDNO:243)、PMX118 mAb(SEQ ID NO:244)、PMX119 mAb(SEQ ID NO:245)、PMX120 mAb(SEQ IDNO:246)、PMX121 mAb(SEQ ID NO:247)、PMX122 mAb(SEQ ID NO:248)、PMX123 mAb(SEQ IDNO:249)和PMX124 mAb(SEQ ID NO:250)的所得轻链可变区氨基酸序列在本发明的范围内并且在序列表中列出。
技术人员将知道有不同的方法来鉴定、获得和优化如本文所描述的抗原结合分子，包含体外和体内表达文库。这在实例中进一步描述。可以使用如展示(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如，易错诱变)等本领域已知的优化技术。因此，本发明还包括本文所描述的抗体的序列优化的变体。
在一个实施例中，可以作出修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基恢复到对应犬种系序列。更具体地，已经经历体细胞突变的抗体可以含有与抗体源自于的种系序列不同的框架残基。此类残基可以通过将抗体框架序列与抗体源自于的种系序列进行比较来鉴别。在一个实施例中，所有框架序列是种系序列。
为了使框架区序列中的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基回到其种系构型，体细胞突变可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变“回复突变”到种系序列。
另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位以由此减少抗体的潜在免疫原性。
在一些实施例中，本公开的抗原结合蛋白、其片段和衍生物以及融合蛋白经历翻译后修饰，例如但不限于，谷氨酰胺可以环化或转化为焦谷氨酸；另外地或可替代地，氨基酸可以经历脱酰胺化、异构化、糖基化和/或氧化。本公开的多肽可以在本领域众所周知的位点处经历另外的翻译后修饰，包含糖基化，例如N-连接或O-连接的糖基化。可以对多肽的氨基酸序列进行变化，以排除或最小化此类改变，或者在此类加工有益的情况下促进这种改变。本公开的多肽包含已经被修饰的多肽，例如以：(1)降低对蛋白水解的易感性；(2)降低对氧化的易感性；(3)改变结合亲和力，以形成蛋白质复合物；(4)改变结合亲和力；以及(4)赋予或修饰其它生理化学或功能性质。
因此，在仍另一个实施例中，糖基化被修饰。例如，可以制备去糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。在一个实施例中，去糖基化抗体的轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ IDNO:249、SEQ ID NO:250。FR1提供为SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65。
还可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，以由此在所述位点处消除糖基化作用。此类去糖基化作用可以增加抗体对抗原的亲和力。
在一些应用中，结合剂可以与犬CD20结合，但与标准结合剂相比，与Fc受体结合的能力改变。在一个实例中，结合剂是具有经修饰的糖基化模式的抗体。例如，IgG分子通常含有N-连接的寡糖，例如岩藻糖。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分是a-岩藻糖基化的。在癌症免疫疗法中，抗体可能依赖于Fc介导的免疫效应子功能，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，作为消耗肿瘤细胞的主要作用模式。众所周知，这种效应子功能是由抗体Fc区的N连接的糖基化调节的。具体地，Fc N-聚糖上的核心岩藻糖的缺失已经示出增加IgG1 Fc与如自然杀伤细胞等免疫效应子细胞上存在的FcγRIIIa的结合亲和力并使得ADCC活性增强。因此，a-岩藻糖基化的抗体可能有利于提高治疗功效，并且岩藻糖的缺失/去除增强了抗体与Fc受体相互作用的能力。这种类型的抗体可以被称为“a-岩藻糖基化的”。此类抗体可以使用本文所描述的技术和/或本领域已知的技术来产生。在一些实施例中，编码抗体的核酸序列可以在具有经修饰的糖基化能力(例如，缺失的、经修饰的或较少量的岩藻糖基转移酶)并且不能添加典型岩藻糖部分的细胞系中表达。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分具有EC50值在0.9-4.5ug/ml(6-30nM)范围内，例如小于20nM的CDC活性。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分具有EC50值小于0.3nM，例如0.013ug/ml(0.09nM)的ADCC活性。
在一个实施例中，根据本发明的抗体或其抗原结合部分具有以下性质中的一个或多个性质：
a)具有EC50值小于20nM的CDC活性；
b)具有EC50值小于0.3nM的ADCC活性；
c)具有超过100ug/ml的瞬时表达产量；
d)由Uncle确定的Tm1高于58℃；和/或
e)以约0.5mg/kg至2.5mg/kg的剂量在狗体内提供细胞杀伤；
f)将狗体内的B细胞耗竭维持在低水平至少15天；和/或
g)与包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成的表位结合：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ IDNO:2中的氨基酸编号150-159)，例如ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号141-159)。
ADCC和CDC活性可以如实例中所描述的进行测量。
在一个实施例中，抗体和其抗原结合部分示出CDC和ADCC活性两者，例如，如通过在表达CD20的犬淋巴瘤细胞系中的细胞杀伤来证明，如实例中所测量的。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分具有上述性质中的一个或多个性质并且具有PMX069、PMX115或PMX070的HC CDR和LC CDR和/或HC和LC CDR。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合部分选自PMX069、PMX115或PMX070。
在一个实施例中，抗体是表4中描述的抗体或其抗原结合部分，并且具有如该表中所示的ADCC或CDC的EC50值。EC50值可以如实例中所描述的进行测量。
在一个实施例中，抗体的Fc部分可以被修饰。
在一个实施例中，变体中的一个或多个取代在CDR1、2和/或3区中。例如，在CDR1、2和/或3区中可以有1、2、3、4、5个或更多个氨基酸取代。在另一个实例中，可能有1或2个氨基酸缺失。
在一个实施例中，一个或多个取代在框架区中。例如，在HC可变区和/或LC可变区框架区中可以有1至20个，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。
本发明的抗体优选地具有KD、IC50和/或EC50值，例如本文实例中进一步描述的KD。合适地，KD值足以使抗体具有期望的生物效应。例如，KD可以是至少约10pM至100uM、约100pM至10nM或更高。EC50值可以如表4所示，例如0.12至0.89nM。KD、IC50和/或EC50值可以如实例中所描述的进行测量。
术语“KD”是指“平衡解离常数”并且是指在平衡时滴定测量中获得的值，或者是通过将解离速率常数(Koff)除以缔合速率常数(Kon)获得的值。“KA”是指亲和力常数。缔合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体对抗原的结合亲和力。用于确定缔合和解离速率常数的方法是本领域众所周知的。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度和在平衡状态下检查生理缓冲液中的样品的能力。可以使用其它实验方法和仪器，如SPR测定。本发明还涉及一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与如上文所描述的抗体或其抗原结合部分竞争与犬CD20结合。与本发明的任何CD20抗体在犬CD20上的相同表位或重叠表位处或附近结合的抗体、抗体片段或抗体模拟物具有用于与本发明的任何抗体交叉竞争与CD20结合的能力。因此，本发明的抗体可以用作参考抗体来评估此类交叉反应性。此类交叉竞争抗体可以基于其在标准CD20结合测定中与本文所描述的抗体交叉竞争的能力来鉴定。例如，/>分析、ELISA测定或流式细胞术可以用于证明与抗体的交叉竞争。
核酸序列、载体和宿主细胞
本发明还涉及编码如本文所描述的抗体或其抗原结合部分的氨基酸序列的核酸序列，例如HC可变区或LC可变区。表2中描述了示例性序列。在一个实施例中，所述核酸选自SEQ ID NO:3、5、13、15、23、25、33、35、43、45、78、80、88、90、98、100、108、110、118、120、128、130、138、140、148、150、158、160、168、170、178、180、188、190、198、200、208、210、218、220、228、230、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300或301或者与其具有至少75％、80％或90％序列同源性的核酸。在一个实施例中，所述核酸序列通过连接子与第二核酸序列连接。在一个实施例中，所述第二核酸编码另外的治疗部分。在一个实施例中，所述连接子是核酸连接子。示例性核酸如下所示。然而，本领域技术人员将理解，由于基因密码的简并性，可以设想其它序列。
密码子优化的核苷酸序列也在本发明的范围内，包含SEQ ID NO:68和69。
根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA并且可以是全部或部分合成的或重组产生的。除非上下文另外要求，否则提及本文所示的核苷酸序列涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有其中U取代了T的指定序列的RNA分子。
此外，本发明涉及包含至少一种如上文所定义的核酸的核酸构建体。构建体可以呈质粒、载体、转录或表达盒的形式。
本发明还涉及一种载体，其包括编码如本文所描述的CD20结合分子的核酸。术语“载体”是指核酸分子，优选地源自例如质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，核酸序列可以插入或克隆到其中。载体优选地含有一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在包含靶细胞或组织或其祖细胞或组织的限定宿主细胞中自主复制，或者整合到限定宿主的基因组中，使得克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可以含有任何确保自我复制的方式。可替代地，载体可以是这样一种载体，当引入到宿主细胞中时，所述载体被整合到基因组中，并与整合到其中的染色体一起复制。载体系统可以包括单个载体或质粒或一起含有要引入到宿主细胞的基因组或转座子中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。载体的选择通常将取决于载体与要引入载体的宿主细胞的相容性。载体还可以包含选择标志物，如可以用于选择合适转化体的抗生素抗性基因。此类抗性基因的实例是本领域技术人员众所周知的。在一个实施例中，载体是腺相关病毒(AAV)载体，如WO 2021176362中描述的那些。
在一些实施例中，核酸还可以包括前导序列。在另一个实施例中，其不包括前导序列。可以使用任何合适的前导序列，包含天然免疫球蛋白种系前导序列，如PMX001至PMX005和PMX066至PMX081 mAb的重链的SEQ ID NO:71、轻链的SEQ ID NO:72，或者可以选择其它序列，如Campath前导序列(SEQ ID NO:70)(参见US 8,362,208 B2)来增强蛋白质表达。
在一些实施例中，核酸还可以包括信号肽，即分泌蛋白(如免疫球蛋白)的N末端的短氨基酸序列(13-36个氨基酸)，所述分泌蛋白介导旨在通过分泌通路的第一膜分泌的蛋白的转运。该序列不存在于成熟蛋白质中，在共翻译事件中被切割，但介导蛋白质的分泌和正确表达。合适的信号序列可以用于优化重组蛋白的表达。
本发明还涉及包括一个或多个如上文所描述的核酸构建体的分离的重组宿主细胞。用于本发明的宿主细胞是原核、酵母或高等真核细胞并且包含但不限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
在本发明中用作宿主细胞的原核生物包含革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠杆菌(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和志贺氏菌(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。一种克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但是如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)等其它菌株是合适的。在一个实施例中，提供了制备如本文所描述的抗CD20抗体的方法，其中所述方法包括在适于编码抗体的多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞并分离抗体。
编码抗体的核酸可以用于向个体施用抗体，以便在体内产生其编码的蛋白质并介导治疗效果。多核苷酸向受试者的递送可以是直接的，使得多核苷酸或表达载体施用于个体，例如通过将mRNA或DNA直接引入到细胞，例如肌肉细胞中。还设想了间接引入，其中多核苷酸在施用之前在体外转化到细胞中。也可以使用如缺陷或减毒病毒等病毒载体。
在一个实施例中，提供了制备如本文所描述的抗CD20抗体的方法，其中所述方法包括在适于编码抗体的多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞并分离抗体。
本发明还涉及异源测定或表达系统，其包括犬CD20和源自不同物种的细胞系，例如人细胞系，如HEK。
测定包括使犬CD20与源自不同物种的细胞系接触，例如来自不同哺乳动物的细胞系，例如啮齿动物细胞系或人细胞系，如HEK。例如，用犬CD20转染细胞系，使得其以稳定或瞬时的方式表达犬CD20。
免疫缀合物和其它结合剂
本发明涉及包括根据本发明的抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物和其它结合剂。例如，根据本发明的抗体或其抗原结合部分可以与治疗部分或非治疗部分缀合。
在一个实施例中，治疗部分是与所关注的靶抗原结合的结合分子，例如选自抗体或抗体片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段(scFv)或单结构域抗体，例如VH或VHH结构域)或抗体模拟蛋白。
在一个实施例中，包括如本文所描述的与CD20结合的抗体或其抗原结合部分和第二部分的蛋白质或多肽是融合蛋白。在一个实施例中，包括如本文所描述的与CD20结合的抗体或其抗原结合部分和第二部分的蛋白质或多肽是药物缀合物。
如本文所使用的，“缀合物”是指包括如本文所描述的与CD20结合的抗体的组合物，所述组合物与药物结合/缀合。
此类缀合物包含“药物缀合物”和“非共价药物缀合物”，所述药物缀合物包括与和药物共价键合的CD20结合的抗体，所述非共价药物缀合物包括与和药物非共价键合的CD20min结合的抗体。
如本文所使用的，“药物缀合物”是指包括与药物共价结合的抗体的组合物。药物可以通过合适的连接子部分与抗体片段直接或间接共价结合。药物可以在任何合适的位置处与抗体结合，如氨基末端、羧基末端或通过合适的氨基酸侧链。
在一个实施例中，抗体用肽连接子或其它合适的连接子与第二部分连接以与这两个部分连接。
术语“肽连接子”是指包括一个或多个氨基酸的肽。肽连接子包括1至50个，例如1至20个氨基酸。肽连接子是本领域已知的并且本文描述了非限制性实例。合适的非免疫原性连接子肽是例如包含G和/或S残基的连接子、(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽连接子，其中“n”通常是1至10之间的数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
结合剂可以是多特异性的，例如双特异性的。
在一个实施例中，结合分子是双特异性的。因此，一个方面，本发明涉及双特异性分子，所述双特异性分子包括与第二部分连接的本文所描述的抗体，所述第二部分具有与所述抗体不同的结合特异性。因此，第二抗体与不同的靶抗原，例如所关注的靶标结合。
在一个实施例中，结合分子，例如蛋白质或构建体是多特异性的并且包括另外的，即第三、第四、第五等部分。
治疗部分也可以选自半衰期延长部分、细胞毒素或放射性同位素。
非治疗部分可以选自标记、脂质体或纳米颗粒。标记是可检测的或有功能的。标记可以是产生或可以被诱导产生信号的任何分子，包含但不限于荧光团、荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂、核磁共振活性标记或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合。
根据本发明，与一个部分连接的抗体和抗原结合部分可以进一步与另一个部分连接。例如，a可以与治疗部分连接，并且可以通过抗体或所述部分提供与非治疗部分的另外的连接。
在一个实施例中，根据本发明的结合剂或抗体或其抗原结合部分可以包括半衰期延长部分。这可以选自与犬血清白蛋白结合的抗体或其抗原结合部分。可替代地，通过聚乙二醇化可以延长半衰期。
如所使用的术语“半衰期”通常可以是指体内氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度降低50％所需的时间，例如由于序列或化合物的降解和/或序列或化合物通过天然机制的清除或螯合。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以任何本身已知的方式确定，如通过药物代谢动力学分析。合适的技术是本领域技术人员显而易见的。半衰期可以使用如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)等参数来表示。半衰期(tα和tβ)和AUC可以由缀合物或融合物的血清浓度对时间的曲线确定。因此，如本文所使用的术语“半衰期”具体地是指t1/2-β或终末半衰期(其中t1/2-α和/或AUC或两者可以不考虑)。
例如，在第一阶段(α阶段)，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合物)主要在患者体内分布，具有一些消除。第二阶段(β阶段)是当药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合物)已经分布并且血清浓度随着药物组合物从患者体内清除而降低的终末期。tα半衰期是第一阶段的半衰期并且tβ半衰期是第二阶段的半衰期。
药物组合物
另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所描述的抗体或片段以及任选地药学上可接受的载剂。如本文所使用的术语“药物组合物”是指用于治疗伴侣动物的组合物，即用于兽医用途的组合物，即兽医组合物。在优选实施例中，被治疗的动物是狗。
药物组合物可以任选地包括药学上可接受的载剂。抗体、蛋白质或构建体或药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包含但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、透皮、经粘膜、通过吸入或局部给药，特别是耳朵、鼻子、眼镜或皮肤或通过吸入。
肠胃外施用包含例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地，组合物是肠胃外施用的。
药学上可接受的载剂或媒剂可以是颗粒，因此组合物是例如片剂或粉末形式。术语“载剂”是指与本发明的药物抗体缀合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。此类药物载剂可以是液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载剂可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施例中，当施用于动物时，本发明的抗体或组合物和药学上可接受的载剂是无菌的。当本发明的药物抗体缀合物静脉内施用时，水是优选的载剂。还可以采用盐水溶液以及水性葡聚糖和甘油水溶液作为液体载剂，尤其是用于可注射溶液的液体载剂。合适的药物载剂还包含赋形剂，如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。
本发明的药物组合物可以呈液体的形式，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可以用于通过注射、输注(例如，IV输注)或皮下递送。当旨在用于口服施用时，组合物优选地呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包含在本文视为固体或液体的形式内。
作为用于口服施用的固体组合物，组合物可以调配成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口嚼锭、粉片等形式。此类固体组合物典型地含有一种或多种惰性稀释剂。另外，可能存在以下中的一种或多种：如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶等粘合剂；如淀粉、乳糖或糊精等赋形剂；如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等崩解剂；如硬脂酸镁等润滑剂；如胶体二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂；如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品等调味剂；以及着色剂。当组合物呈胶囊(例如，明胶胶囊)形式时，除以上类型的材料以外，其可以含有如聚乙二醇、环糊精或脂肪油等液体载剂。
组合物可以呈液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。液体可以用于口服施用或通过注射递送。当旨在用于口服施用时，组合物可以包括甜味剂、防腐剂、染料/色素和增味剂中的一种或多种。在通过注射施用的组合物中，还可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
组合物可以采取一种或多种剂量单位的形式。在具体实施例中，可能需要将组合物局部施用于需要治疗的区域，或者通过静脉内注射或输注施用。
治疗疾病的方法
本发明进一步延伸至用于治疗疾病的方法、施用本文所描述的药物组合物或调配物或本发明的抗体或抗原结合部分。还设想了用于治疗疾病的本文所描述的药物组合物或调配物或包括如本文所描述的抗体或其抗原结合部分的结合分子或融合蛋白。
具体地，本发明涉及一种治疗有需要的犬受试者的由B细胞介导的病状的方法，所述方法包括施用有效量的如本文所描述的抗体或其抗原结合部分。
本发明的方面也是用于治疗犬受试者中由B细胞介导的疾病的如本文所描述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
例如，抗体或其抗原结合部分可以用于消耗犬血和/或B细胞淋巴瘤细胞的组织。由B细胞介导的病状选自B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤、霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin′s and non-Hodgkin′s lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤(mantel cell lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、纵隔大B细胞淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、结外边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病)、白血病或免疫介导的疾病。免疫介导的疾病可以是自身免疫性疾病。实例可以包含但不限于自身免疫性溶血性贫血、免疫介导的血小板减少症、自身免疫性发疱性疾病、免疫介导的关节炎和特应性皮炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)、血管炎、多发性硬化症、格雷夫斯氏病(Graves′disease)、特发性血小板减少症、皮肌炎、免疫介导的血小板减少症、多肌细胞增多症、天疱疮、免疫介导的溶血性贫血和大疱性类天疱疮。
在特定病症或病状的治疗中有效/有活性的治疗剂的量将取决于病症或病状的性质，并且可以通过标准临床技术确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。组合物中要采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重度，并且应根据实践者的判断和每个患者的情况来决定。应考虑像年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度等因素。
通常，按组合物的重量计，量是本发明的抗体或其片段的至少约0.01％。当旨在用于口服施用时，按组合物的重量计，该量可以在约0.1％至约80％的范围内变化。按组合物的重量计，优选的口服组合物可以包括本发明的抗体或其片段的约4％至约50％。
制备本发明的优选的组合物，使得按本发明的抗体或其片段的重量计，肠胃外剂量单位含有约0.01％至约2％。
对于通过如静脉内或皮下注射等注射的施用，组合物通常可以包括受试者的体重的约0.01mg/kg至约250mg/kg，例如0.1mg/kg至约250mg/kg，例如动物的体重的约0.1mg/kg至约20mg/kg，并且更优选地动物的体重的约1mg/kg至约10mg/kg，尽管也设想小于0.1mg/kg。在一个实施例中，组合物以约0.5至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约0.5至5mg/kg、约0.5至2.5mg/kg、约0.5至2.0mg/kg或约2或3mg/kg的剂量施用。在一个实施例中，组合物以2至50mg/ml的剂量施用。在一个实施例中，组合物以0.5mg/ml至2.5mg/ml或0.5mg/ml至5mg/ml的剂量施用。给药方案可以从例如每周一次到每2、3、4周一次，或者在两次给药之间至多8周不等。在一个实施例中，组合物以每三至四周0.5mg/ml至2.5mg/ml，例如每三至四周0.5mg/ml或2.5mg/ml的剂量施用。合适地选择剂量以延长CD20阳性细胞的耗竭，从而允许剂量之间的三至四周间隔。可以施用多剂量，合适地至多约6次或更多次重复剂量。
在一个实施例中，治疗后，受试者具有至少7天、或至少14天、或至少21天、或至少28天、或至少40天、或至少50天、或至少60天无疾病进展。在一个实施例中，治疗后，受试者具有至少7天、或至少14天、或至少21天、或至少28天、或至少40天、或至少50天、或至少60天无疾病进展。
在一个实施例中，存活天数、无疾病天数或无疾病进展天数为至少2个月、或至少3个月、或至少4个月，例如至少5个月，如至少6个月。
在一个实施例中，存活天数、无疾病天数或无疾病进展天数为至少9个月、200天、300天或3年或更长时间。在一个实施例中，其是至少一年、两年、三年或更多年。本发明提供了治疗或预防伴侣动物，例如狗的CD20介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向给有需要的动物施用有效量的本发明的抗体或片段。
如本文所使用的，“治疗(treat/treating/treatment)”意指抑制或缓解疾病或病症。例如，治疗可以包含延缓与疾病或病症相关的症状的发展，和/或降低将会或预期与所述疾病一起发展的此类症状的严重程度。所述术语包含改善现有的症状、预防另外的症状以及改善或预防此类症状的潜在原因。因此，术语表示至少一些接受治疗的哺乳动物，例如犬患者获得了有益的结果。许多药物治疗对一些但不是全部接受治疗的患者有效。例如，在B细胞淋巴瘤的治疗中，症状的改善可以通过在治疗之后测量淋巴结并观察淋巴结大小的减少作为成功治疗的指标来评估。
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验的对象的狗。为了避免疑义，不包括对人类的治疗。
本发明的分子或药物组合物可以作为唯一的活性成分施用或者与一种或多种其它治疗剂，例如癌症疗法组合施用。治疗剂是用于疾病治疗的化合物或分子。治疗剂的实例包含抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料、放射性同位素、免疫抑制剂或免疫调节剂，如细胞因子或趋化因子。在一个实例中，本发明的分子或药物组合物可以与多药剂、基于CHOP的化学疗法方案组合施用，所述方案结合了几种可注射和口服药物(L天冬酰胺酶(Lasparaginase)、长春新碱(vincristine)、环磷酰胺(Cytoxan)、泼尼松(prednisone)和多柔比星(doxorubicin))，在大致每周基础上给予，持续几个月的时间段。施用可以在施用本发明的化合物的同时、之前或之后进行。
本发明还涉及一种抑制肿瘤生长或转移的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的如本文所描述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物接触。所述方法可以是体外、体内或离体的。
本发明还涉及一种杀伤表达CD20的肿瘤细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如本文所描述的抗体或药物组合物接触，使得产生对所述表达CD20的细胞的杀伤。所述肿瘤细胞是犬肿瘤细胞。所述方法可以是体外、体内或离体的。
还提供了用于使用如本文所描述的抗体或药物组合物消除表达犬CD20的细胞的方法。所述方法可以是体外、体内或离体的。
试剂盒
另一方面，本发明提供了用于治疗或预防例如本文所列疾病或免疫应答和/或用于检测CD20以诊断、预后或监测疾病的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体以及任选地使用说明书。此类试剂盒可以含有其它组分、包装、说明书或材料，以帮助检测CD20蛋白。试剂盒可以包含与CD20结合的标记的抗体或包括与CD20结合的抗体和一种或多种用于检测标记的化合物的结合分子。
制备抗体的方法
本文所描述的抗体可以从转基因哺乳动物，例如啮齿动物获得，所述转基因哺乳动物在用CD20抗原刺激时表达犬抗体。WO20018/189520和WO2020/074874中描述了此类啮齿动物。
因此，本文所描述的抗体或片段可以从哺乳动物，例如啮齿动物，例如转基因动物获得，所述哺乳动物在用犬CD20抗原刺激时表达抗体。转基因啮齿动物，例如小鼠表达内源性抗体基因的能力可能降低。因此，在一个实施例中，啮齿动物表达内源轻和/或重链抗体基因的能力降低。因此，啮齿动物，例如小鼠可以包括破坏内源性κ和λ轻和/或重链抗体基因表达的修饰，从而不产生功能性小鼠轻链和/或重链，例如如下文进一步解释的。此类转基因啮齿动物在本领域中有所描述并且这将在下文实例中进一步解释。
也在本发明的范围内的是用于产生能够与CD20结合的犬抗体的方法，所述方法包括
a)用CD20抗原免疫转基因啮齿动物，例如小鼠，其中所述啮齿动物表达包括未重排的犬V、D和J基因的核酸构建体；
b)分离犬抗体。
也在本发明的范围内的是用于产生能够与犬CD20结合的抗体的方法，所述方法包括
a)用CD20抗原免疫转基因啮齿动物，例如小鼠，其中所述啮齿动物表达包括未重排的犬V、D和J基因的核酸构建体；
b)由所述啮齿动物，例如小鼠产生包括重链和轻链序列的序列的文库；以及
c)从所述文库分离包括重链和轻链序列的抗体。
另外的步骤可以包含鉴定与CD20结合的抗体，例如通过使用如实例中所示的功能测定。
用于使用体外表达文库制备或产生本文所描述的多肽、核酸、宿主细胞、产物和组合物的方法可以包括以下步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；以及
b)从所述组、集合或文库中筛选能够与CD20结合/对CD20具有亲和力的氨基酸序列；以及
c)分离能够与CD20结合/对CD20具有亲和力的氨基酸序列。
在上述方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可以在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(如酵母)上展示，以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的合适方法、技术和宿主生物对本领域技术人员来说是清楚的(参见例如《肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册(Phage Display of Peptides and Proteins:ALaboratoryManual)》,学术出版社(Academic Press)；第1版(1996年10月28日)Brian K.Kay,JillWinter,John McCafferty)。通过分离表达抗原特异性抗体或其片段的细胞或组织，克隆编码源自分离的细胞或组织的抗体或其片段mRNA的序列，并使用文库展示编码的蛋白质，从而产生文库，例如噬菌体文库。序列可以在细菌、酵母或其它表达系统中表达。
另一方面还涉及通过上文所描述的方法获得或可获得的分离的抗体。
其它方法和用途
另一方面，如本文所描述的抗体或其抗原结合部分用于非治疗目的，如诊断测试和测定。因此，本发明还涉及一种用于在来自犬受试者的生物样品中检测表达犬CD20的犬细胞或检测犬CD20蛋白的方法，所述方法包括使生物样品与如本文所描述的抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分与可检测标记连接。所述生物样品可以是活检、组织、血液、血清、血浆或淋巴液样品。
在某些实施例中，所述方法可以包含将测试生物样品中的结合量与对照生物样品中的结合量进行比较，其中相对于对照生物样品，测试生物样品中结合增加可以表明测试生物样品中存在一种或多种淋巴瘤细胞。在一些实施例中，所述生物样品是犬血或针抽吸物。这些方法还以体内和/或体外形式提供。
用于诊断目的的抗体修饰是本领域众所周知的。例如，抗体可以用如生物素等配体基团，或如荧光基团等可检测的标志物基团、放射性同位素或酶进行修饰。本发明的化合物可以用于诊断目的并且例如使用常规技术进行标记。合适的可检测标记包含但不限于荧光团、发色团、放射性原子、电子密集试剂、酶和具有特定结合配偶体的配体。
另一方面，如本文所描述的抗体或其抗原结合部分用于分离和/或鉴定表达犬CD20的细胞或含有与这些结合剂反应的细胞表面蛋白的细胞(例如，B细胞、B淋巴瘤细胞、犬CD20)。
如本文所描述的抗体或其抗原结合部分也可以用于确定CD20表达水平的测定中。然后可以将表达水平与基础(例如，对照)水平相关联，以确定患者体内是否存在特定疾病、患者的预后或特定治疗方案是否有效。
除非在本文另外定义，否则与本公开结合使用的科学术语和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然前述公开提供了涵盖在本公开的范围内的主题的一般描述，包含制备和使用本公开的方法以及其最佳模式，但是提供以下实例以进一步使本领域技术人员能够实践本公开。然而，本领域技术人员将会理解，这些实例的细节不应该被理解为对本发明的限制，本发明的范围应该从本公开所附的权利要求和其等同物中理解。鉴于本公开，本公开的各个另外的方面和实施例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
本说明书中所引用的所有文档以全文引用的方式并入本文中，包含基因登录号的参考文献、科学出版物和专利出版物的参考文献。
本文使用的“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下明确公开了两个指定特征或组分中的每一个。例如，“A和/或B”将被视为明确地公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种，就像本文单独列出的每一种情况一样。除非上下文另外指出，否则以上列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例并且同等地适用于所描述的所有方面和实施例。
本发明在以下非限制性实例中进一步说明。
实例
实例1：克隆犬CD20
使用UCSC基因组浏览器对CAMFAM_3.1boxer参考基因组进行搜索。CD20的基因组序列(MS4A1)与mRNA序列AB210085.1一起下载。使用该序列数据，设计引物以能够从添加了序列的cDNA中扩增CD20，从而允许无缝克隆。这允许确认狗血中的CD20序列并无缝克隆到piggyBac克隆载体中。
犬CD20 mRNA的分离和cDNA的产生
比格犬全血由Envigo公司(Envigo)RMS(英国亨廷顿奥尔肯伯里(Alconbury,Huntingdon,UK))提供并且PBMC使用Ficoll梯度分离。简而言之，用25ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释10ml全血，并分层到15ml Ficoll Paque Plus(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich))上，然后在室温下以800rcf离心10分钟，缓慢加速且无制动。将间期盘收集到PBS中。用QIAGEN RNeasy微型试剂盒(德国希尔登凯杰公司(Qiagen,Hilden,DE))和标准程序将总RNA从PBMC中分离，用柱上DNA酶消化。使用SuperScriptTMIV第一链合成系统按照标准程序和锚定的oligo dT引物(美国马萨诸塞州的赛默飞世尔公司(ThermoFisher,Massachusetts,US))进行cDNA产生。
用于细胞表达的全长犬CD20的核苷酸和氨基酸序列如下所示：
核苷酸：
ATGACAACACCCAGAAATTCAATGAGTGGAACTCTCCCGGTAGATCCTATGAAAAGCCCTACTGCCATGTATCCTGTTCAAAAAATAATTCCCAAAAGGATGCCTTCAGTGGTGGGCCCTACACAAAACTTCTTCATGAGGGAATCTAAGACACTGGGGGCTGTCCAGATTATGAATGGGCTCTTCCACATTGCCCTAGGCAGCCTCCTGATGATTCACACGGATGTCTATGCGCCCATCTGTATAACTATGTGGTACCCTCTCTGGGGAGGCATTATGTTCATCATTTCTGGATCACTCCTGGCAGCAGCGGACAAAAACCCCAGGAAGAGTTTGGTCAAAGGAAAAATGATAATGAACTCATTGAGCCTCTTTGCTGCTATTTCTGGAATAATTTTTTTGATCATGGACATATTTAATATTACCATTTCCCATTTTTTTAAAATGGAGAATTTGAATCTTATTAAAGCTCCCATGCCATATGTTGACATACACAACTGTGACCCAGCTAACCCCTCTGAGAAAAACTCTTTATCTATACAATATTGTGGCAGCATACGATCTGTTTTCTTGGGCGTTTTTGCTGTGATGGTGATCTTTACCTTTTTCCAGAAACTTGTGACAGCTGGCATTGTTGAGAATGAATGGAAAAAACTGTGCTCTAAACCTAAATCTGATGTAGTTGTTCTGTTAGCTGCTGAAGAAAAAAAAGAACAGCCGATTGAAACAACAGAAGAAATGGTTGAGCTGACTGAAATAGCTTCCCAACCAAAGAAAGAAGAAGACATTGAAATTATTCCAGTCCAAGAAGAAGAAGAGGAACTGGAAATAAACTTTGCAGAACCTCCCCAGGAGCAGGAATCTTCACCAATAGAAAACGACAGCATCCCTTAA(SEQ ID NO:1)
蛋白质：
MTTPRNSMSGTLPVDPMKSPTAMYPVQKIIPKRMPSVVGPTQNFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGSLLMIHTDVYAPICITMWYPLWGGIMFIISGSLLAAADKNPRKSLVKGKMIMNSLSLFAAISGIIFLIMDIFNITISHFFKMENLNLIKAPMPYVDIHNCDPANPSEKNSLSIQYCGSIRSVFLGVFAVMVIFTFFQKLVTAGIVENEWKKLCSKPKSDVVVLLAAEEKKEQPIETTEEMVELTEIASQPKKEEDIEIIPVQEEEEELEINFAEPPQEQESSPIENDSIP(SEQ IDNO:2)
实例2：表达犬CD20
使人胚胎肾(HEK)293细胞作为单层在补充有10％胎牛血清(FBS；西格玛奥德里奇公司)的DMEM/F12(生命技术公司(Life Technologies))中在37℃下和5％CO2下在90mm圆形组织培养板上生长。将HEK293细胞使用聚乙烯亚胺(PEI MAX：40kDa，德国埃佩尔海姆的波利塞斯公司(Polysciences Inc.,Eppelheim,Germany))用CD20cDNA和PiggyBac转座酶共转染。将30μl的PEI MAX(1mg ml-1)、5μg cDNA和1ml DMEM/F12在室温下温育10分钟，滴加到70-80％汇集HEK293细胞的90mm板中，并在使用之前温育2天。48小时后使用合适的抗生素选择稳定转染的细胞。
使小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为单层在补充有10％FBS、1mM丙酮酸钠(西格玛奥德里奇公司)、0.5mMβ-巯基乙醇(吉博科公司(Gibco))和1％MEM非必需氨基酸(西格玛奥德里奇公司)的DMEM-高葡萄糖(生命技术公司)中在37℃下和5％CO2下在90mm圆形组织培养板上生长。根据制造商的推荐说明，使用Lipofectamine LTX和PLUSTM试剂(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))用CD20 cDNA和PiggyBac转座酶转染细胞。48小时后使用合适的抗生素选择稳定转染的细胞。
使MDCK II(Madin-Darby犬肾)作为单层在补充有10％FBS和1％MEM非必需氨基酸(西格玛奥德里奇公司)的DMEM-高葡萄糖(生命技术公司)中在37℃下和5％CO2下在表面处理的组织培养烧瓶(T25/T75/T175)上生长。按照推荐的方案，使用LipofectamineTMLTX试剂和PLUSTM试剂(赛默飞世尔科技公司)用野生型或突变体犬CD20 cDNA和piggyBac转座酶共转染MDCK II细胞。
实例3：使用DNA和MEF免疫小鼠模型
例如，基本上如WO2018/189520和WO2020/074874中所描述的对Ky9TM小鼠进行免疫。转基因小鼠已经通过将狗免疫球蛋白可变基因储库插入到小鼠基因组的对应基因座中进行修饰。这允许产生包括源自犬DNA在小鼠中的表达的可变抗体区的抗体，所述可变抗体区与小鼠恒定区(对于重链和κ链)或狗恒定区(对于λ链)组合。关于此类嵌合抗体链的可变区的信息或包括所述可变区的核酸可以用于产生完全犬抗体。
对于DNA免疫，使用流体动力尾静脉注射(HTVI)进行基本和加强方案并收获组织。对于基于细胞的免疫，使用稳定表达CD20的MEF细胞进行基本和加强方案并收获组织。使用HTVIDNA免疫与表达CD20的MEF细胞加强剂组合的引物进行另外的免疫方案。
血清滴度的确定：
小鼠在免疫之前和每次后续加强之后10天放血。通过在microvette 200Z-凝胶管(德国的Starstedt AG&Co.KG公司(Starstedt AG&Co.KG,Germany))中离心将血清从凝结的血液中分离，并通过流式细胞术评估针对犬CD20的抗体滴度。将血清在FACS缓冲液(PBS+3％FBS)中以1:10连续稀释，并添加到稳定表达犬CD20的细胞或犬CD20阴性对照细胞中。用BB700缀合的(BD Horizon BrilliantTMBlue 700，BD生物科学公司(BD Biosciences))或FITC缀合的针对同种型IgG1、IgG2a、IgG2b的次级单克隆抗体(BD OptiBuildTM，碧迪公司(Becton Dickinson))检测针对犬CD20的小鼠抗体。使用BD Accuri C6流式细胞仪(美国新泽西州的碧迪公司(Becton Dickinson,NJ,USA))或贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)CytoFLEX获取数据。免疫前血清用于确定背景。抗体滴度被确定为示出高于背景的阳性信号的最高稀释度。图1示出了5只免疫的Ky9小鼠的抗体滴度。
实例4：产生抗体的细胞的分离、抗体测序、选择和序列修饰
组织分离：从小鼠收获脾脏、淋巴结和骨髓。脾细胞通过将脾脏切成小块并通过40μm细胞过滤器(福尔肯公司公司(Falcon))捣碎，同时在冰上用RPMI-1640(瑞士巴塞尔的龙沙公司(Lonza,Basel,CH))+10％FBS冲洗来制备。类似的过程用于来自淋巴结的淋巴细胞，通常将脾脏和淋巴结细胞合并。通过使用25号针，用RPMI-1640冲洗骨髓，通过用RPMI-1640预湿的40μm细胞过滤器，从股骨和胫骨收集骨髓。所有细胞类型以300g沉淀5分钟并且直接用于流式分选或者在-150℃下冷冻之前重悬于FBS+10％二甲亚砜(DMSO)中。
细胞分选：通常，抗原特异性脾B细胞可以被标记的抗原蛋白探针(例如细胞外结构域)或抗原-VLP捕获，因为其在细胞表面主要表达跨膜抗体。另一方面，抗原特异性浆母细胞或浆细胞被认为不太容易被蛋白探针或VLP标记，因为其主要表达分泌的抗体。因此，从脾脏淋巴结样品或骨髓中分离的浆母细胞和浆细胞进行下一步抗体序列回收，而不使用抗原探针来分离这些群体的抗原特异性亚群。CD138和CD267(TACI)的细胞表面共表达用于鉴定浆母细胞和浆细胞的群体。为了大量分选浆母细胞和浆细胞以进行10X基因组学公司(10X Genomics)铬单细胞免疫分析，使用CD138浆细胞富集试剂盒(英国美天旎生物科技公司(Miltenyi biotech UK))来富集这些稀有细胞。在从脾脏和淋巴结细胞中分选抗原特异性细胞之前，根据制造商的说明使用小鼠pan-B细胞分离试剂盒(英国干细胞技术公司(StemCell Technologies UK))或根据制造商的说明使用内部生物素化抗体混合物和链霉亲和素rapidspheres(英国干细胞技术公司)进行B细胞富集。
然后使用包含CD19、IgM、IgA、IgD、CD138和CD267(TACI)的标志物来鉴定在对免疫应答的细胞中富集的同种型转换的B细胞。在该群体中，抗原特异性细胞可以通过用标记的蛋白探针或VLP染色来捕获，所述标记的蛋白探针或VLP在其表面和流动分选上表达靶抗原。从用CD20稳定转染的HEK细胞产生VLP，并且将逆转录病毒gag蛋白与EGFP融合；gag的表达使得VLP能够从细胞中出芽，并且EGFP标记VLP进行荧光检测。VLP上的表面抗原直接由重组细胞表达，没有任何纯化或修饰步骤，并以天然形式存在。如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)等其它哺乳动物细胞系也可以用于VLP产生。鉴定不需要的细胞群体和死亡细胞的标志物(F4/80；Ly-6C/G；CD8a；CD4；CD11c；7AAD或zombie-NIR/FVDEF780)包含在所有染色板中，以将这些细胞排除在分选程序之外。
下一代测序和候选者选择：
根据制造商的说明，使用10X基因组学公司铬单细胞免疫分析系统和V(D)J试剂盒(10X基因组学公司)为抗体分析准备分选的细胞。对于10X，根据来自10X基因组学公司的说明使用各种Illumina平台仪器。使用基于pRESTO/Change-O(耶鲁大学(YaleUniversity))/IgBlast(美国国立生物技术信息中心(NCBI,USA))/Enclone(10X基因组学公司)软件的定制工具分析序列，以预测种系序列和超突变。
可变免疫球蛋白区包括重基因的免疫球蛋白核苷酸序列的VDJ区和Igκ和Igλ的免疫球蛋白核苷酸序列的VJ区。在克隆家族中，亚家族在免疫球蛋白基因重组和体细胞高突变期间出现的其V(D)J区段内有共享突变。显示独特V(D)J区段用途的不同克隆家族通常表现出不同的结合特性。在重组和超突变期间，选择其抗体对抗原具有更高亲和力的细胞。亲和力通常随着另外的突变而增加；例如，在WO2015/040401的图6中示出了聚类家族。
克隆家族通常由两个或多个克隆细胞的相关免疫球蛋白重链和轻链V(D)J序列来定义。相关免疫球蛋白V(D)J序列可以通过其共享使用V和J基因区段来鉴定。WO2015/040401的图5中示出了分选的Ag特异性单B细胞的抗体序列的分析实例，并且示出了通过重链V基因家族使用排列的抗体序列，并且聚类以产生展示的系统发生树。从此类系统树中选择候选克隆。
例如，抗犬CD20 mAb PMX001、PMX002、PMX003、PMX004和PMX005都由相同的重链V基因(cIGHV3-5)、重链J基因(cIGHJ4，具有SEQ ID NO:75示出的种系序列)、轻链V基因(cIGLV3-3)和轻链J基因(cIGLJ3，具有SEQ ID NO:77示出的种系序列)编码。PMX001可变区序列首先从犬CD20免疫的Ky9小鼠中鉴定。其具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有2个氨基酸变化并且相较于种系序列(SEQ ID NO:76)在轻链可变序列中具有3个氨基酸变化。使用IMGT V-QUEST(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input)预测重链可变区的CDR1(SEQID NO:7)、CDR2(SEQ ID NO:8)和CDR3(SEQ ID NO:9)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:10)、CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。PMX mAb的重链和轻链的CDR3区的长度分别为5aa和9aa。
PMX001 mAb的命中扩增随后在所有犬CD20免疫的小鼠中进行，并且选择重链和轻链两者共享相同VJ基因使用和CDR3长度的候选者用于另外的筛选。与PMX001 mAb相比，序列中可能出现另外的突变。例如，PMX002、PMX003、PMX004和PMX005 mAb选自其它免疫队列，并且因此来自不同小鼠的PMX001 mAb被鉴定。其示出了成功的基因重排的会聚选择。
PMX002 mAb具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:14)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:13)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:16)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO:15)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有10个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化。使用IMGT V-QUEST预测重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:17)、CDR2(SEQ ID NO:18)和CDR3(SEQ ID NO:19)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:20)、CDR2(SEQ ID NO:21)和CDR3(SEQ ID NO:22)。
PMX003mAb具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:24)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:23)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:26)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO:25)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有5个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中具有1个氨基酸变化。使用IMGT V-QUEST预测重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:27)、CDR2(SEQ ID NO:28)和CDR3(SEQ ID NO:29)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:30)、CDR2(SEQ ID NO:31)和CDR3(SEQ ID NO:32)。
PMX004 mAb具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:34)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:33)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:36)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO:35)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有12个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化。使用IMGT V-QUEST预测重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:37)、CDR2(SEQ ID NO:38)和CDR3(SEQ ID NO:39)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:40)、CDR2(SEQ ID NO:41)和CDR3(SEQ ID NO:42)。
PMX005 mAb具有编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:44)的重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:43)和编码对应氨基酸序列(SEQ ID NO:46)的轻链可变区核苷酸序列(SEQ IDNO:45)。相较于种系序列(SEQ ID NO:74)在重链可变序列中具有4个氨基酸变化并且在轻链可变序列(SEQ ID NO:76)中不具有氨基酸变化。使用IMGT V-QUEST预测重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:47)、CDR2(SEQ ID NO:48)和CDR3(SEQ ID NO:49)以及轻链可变区的CDR1(SEQ ID NO:50)、CDR2(SEQ ID NO:51)和CDR3(SEQ ID NO:52)。
图2示出了PMX抗体序列的比对。
序列修饰
PMX003(SEQ ID NO:26)的轻链的框架区1(FR1)含有NVT序列子，所述序列子是天冬酰胺连接的蛋白质糖基化的共有序列。为了去除与该位点结合的聚糖，PMX003mAb的FR1中的NVT序列子突变为PMX006 mAb的QVT、PMX007 mAb的AVT、PMX008 mAb的EVT、PMX009 mAb的NVA、PMX010 mAb的SVT和PMX011 mAb的TVT。
PMX006 mAb(SEQ ID NO:53)、PMX007 mAb(SEQ ID NO:54)、PMX008 mAb(SEQ IDNO:55)、PMX009 mAb(SEQ ID NO:56)、PMX010 mAb(SEQ ID NO:57)、PMX011 mAb(SEQ IDNO:58)的所得轻链可变区氨基酸序列以及PMX003(SEQ ID NO:59)、PMX006 mAb(SEQ IDNO:60)、PMX007 mAb(SEQ ID NO:61)、PMX008 mAb(SEQ ID NO:62)、PMX009 mAb(SEQ IDNO:63)、PMX010 mAb(SEQ ID NO:64)、PMX011 mAb(SEQ ID NO:65)的FR1序列在序列表中列出。
PMX066(SEQ ID NO:81)、PMX0067(SEQ ID NO:91)、PMX068(SEQ ID NO:101)、PMX0069(SEQ ID NO:111)、PMX071(SEQ ID NO:131)、PMX072(SEQ ID NO:141)、PMX073(SEQID NO:151)、PMX074(SEQ ID NO:161)、PMX076(SEQ ID NO:181)、PMX077(SEQ ID NO:191)、PMX078(SEQ ID NO:201)、PMX079(SEQ ID NO:211)、PMX081(SEQ ID NO:231)的轻链的框架区1(FR1)含有NVT序列子。为了去除与该位点结合的聚糖，PMX066、PMX0067、PMX068、PMX0069、PMX071、PMX072、PMX073、PMX074、PMX076、PMX077、PMX078、PMX079、PMX081 mAb的FR1中的NVT序列子突变为SVT，以分别产生所得轻链可变区氨基酸序列PMX112(SEQ IDNO:238)、PMX113(SEQ ID NO:239)、PMX114(SEQ ID NO:240)、PMX115(SEQ ID NO:241)、PMX116(SEQ ID NO:242)、PMX117(SEQ ID NO:243)、PMX118(SEQ ID NO:244)、PMX119(SEQ ID NO:245)、PMX120(SEQ ID NO:246)、PMX121(SEQ ID NO:247)、PMX122(SEQ ID NO:248)、PMX123(SEQ ID NO:249)和PMX124(SEQ ID NO:250)。序列在表2中列出。许多抗体包括不导致聚糖与抗体结合的天然存在的序列基序。例如，PMX070和PMX075包括轻链的FR1中的序列基序SVT，PMX080包括轻链的FR1中的序列基序TVT。
实例5：从单细胞产生单克隆抗体
合成所选候选克隆的重链和轻链V(D)J序列并将其分别克隆到含有狗IgG恒定区和狗IGK或IGL恒定区的基因组序列的表达载体中。例如，将PMX001至PMX005可变序列克隆到编码狗IGGB(SEQ ID NO:66)和狗IGLC5恒定区(SEQ ID NO:67)的载体中。将编码重链和轻链的表达载体共转染到如CHO细胞等合适的哺乳动物细胞系中，以获得稳定表达。因此产生了全犬序列抗体。
为了促进在CHO细胞中的表达，可以对例如PMX003 mAb的重链可变区(SEQ ID NO:68)和轻链可变区(SEQ ID NO:69)的核苷酸序列进行密码子优化。Campath前导序列(SEQID NO:70)(参见US 8,362.208B2)可以被引入以替代PMX001至PMX005mAb的天然前导序列(重链的SEQ ID NO:71、轻链的SEQ ID NO:72)。
还表达了单克隆抗体1E4和4E1-7。1E4核苷酸序列从WO 2013063186获得。4E1-7氨基酸序列从Mizuno等人《科学报告(Scientific Reports)》,10,第11476条(2020)(https://doi.org/10.1038/s41598-020-68470-9)获得。将两种抗体的可变区克隆到编码狗IGGB(SEQ ID NO:66)和狗IGK(SEQ ID NO:73)恒定区的载体中。通过合成可变区序列(参见US 5,736,137)产生利妥昔单抗-cIGGB对照mAb并将其克隆到编码狗IGGB(SEQ ID NO:66)和狗IGLC5(SEQ ID NO:67)恒定区的载体中。
与抗体Fc部分结合的N连接的聚糖上的核心岩藻糖可能会影响Fc受体与抗体的Fc区的结合，并且因此降低ADCC活性。为了增强ADCC杀伤活性，通过删除Fut8编码基因的外显子2，以合并的形式产生Fut8敲除(KO)CHO细胞，如Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng.)》2004年9月5日；87(5):614-22中所描述的。(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15352059/)。使用LCA染色对KO细胞进行表型选择。
为了产生抗体，将6×106个所选CHO细胞或Fut8敲除CHO细胞接种在3ml培养基中并在32℃、8％CO2下以200rpm摇动温育。在第1、4、7和10天，将4％HyClone细胞增强7a补充物+0.4％HyClone细胞增强7b补充物+1％葡萄糖添加到培养基中。在第12天收集培养上清液并且使用表面等离子共振(Biacore 8K，思拓凡生命科学公司(Cytiva Life Sciences))确定IgG浓度。
实例6：结合测定
基于流式细胞术的测定：
用编码犬CD20 cDNA的全长的载体稳定转染HEK293细胞或MDCK II细胞。使用流式细胞术评估抗体与这些细胞的结合。简而言之，将1-2×105个表达犬CD20的细胞与候选mAb在+4℃下一起温育1小时，固定浓度为1μg/ml或10μg/ml用于结合测定，并在一定浓度范围内(从30μg/ml，即200nM开始的12点1:2连续稀释液抗体)用于亲和力确定，随后与5μg/ml的FITC缀合的抗犬IgG次级抗体(Bethyl实验室(Bethyl Laboratories))在+4℃下一起温育1小时。与抗犬IgG FITC次级抗体一起温育且不与初级抗犬CD20抗体一起温育或与同种型对照初级抗体一起温育的细胞用作阴性对照。数据在贝克曼库尔特公司CytoFLEX或BDAccuri C6 Plus流式细胞仪上获取并使用FlowJo软件进行分析。对于亲和力确定，将染色的细胞在与候选抗体一起温育之后用1％多聚甲醛/3％FBS/PBS洗涤并固定15分钟，在与次级抗体一起温育之后再次固定24小时，然后在流式细胞仪上采集数据。在GraphPad Prism中绘制了使用FITC通道的平均荧光强度(MFI)值与抗体浓度的图(图3D)。候选抗体与细胞表面犬CD20的结合的表观亲和力(Kd)被确定为当50％表达CD20的细胞被染色时的浓度，即结合的EC50，使用log(激动剂)与应答-可变斜率(四个参数)的方程。
结合测定的结果如图3A-C所示。这些结果表明，在单个浓度点(10ug/ml)下，除了等同于4E1-7抗体的PMX002之外，PMX抗体对犬CD20的结合能力比测试抗体1E4和4E1-7对犬CD20的结合能力更强。
基于ELISA的测定：
如下文所描述的，犬CD20蛋白的胞外结构域(ECD)的大环在CHO细胞中表达，并在CAG启动子的控制下分泌到胞外介质中，然后使用蛋白A柱纯化。
CD20 ECD蛋白包被到测定板上。添加一定浓度范围的抗体，并使用ELISA确定结合能力。
基于SPR的测定：
抗犬CD20 mAb的亲和力(Kd)可以通过SPR，使用重组小鼠Fc标记的CD20胞外结构域来测量。
CD20的重组胞外结构域(ECD)(大环)命名为dCD20LL-Fc(参见WO2013/063186，第37页，SEQ ID NO:62)，以分泌形式表达，具有来自稳定CHO细胞的鼠IgG2a Fc标签，并使用蛋白A色谱法从澄清的上清液中纯化。通过将dCD20LL-Fc的100-150RU胺偶联到CM5芯片的流动细胞2上，并对流动细胞1应用NHS/EDC激活/失活，得到与相互作用的二价亲合力相对应的表观Kd。在HBS-EP+缓冲液中制备200nM至0.1nM浓度的候选IgG的三倍稀释液，并以30微升/分钟注射到芯片表面上180秒。在用10mM甘氨酸-HCl pH 2.0的60秒脉冲再生表面之前，以30微升/分钟监测解离600秒。通过使用全长IgG的木瓜蛋白酶(或SpeB)消化产生的候选抗体Fab片段重复上述方案，获得与单价亲和力相对应的单价Kd。实验在25℃下的HBS-EP+运行缓冲液中进行。所有SPR实验均在Biacore 8K仪器上进行，并通过使用Biacore洞察评估软件将数据拟合到1:1结合模型来分析数据。
实例7：功能测定
补体依赖性细胞毒性(CDC)活性
天然地表达犬CD20的CLBL-1犬淋巴瘤肿瘤细胞系(维也纳兽医大学(Universityof Veterinary Medicine Vienna))用作CDC测定的靶细胞系。将96孔板(白色，透明底部)的每孔10,000个CLBL-1细胞与抗犬CD20抗体和犬补体保存的血清(百进生物科技公司(BioIVT))滴定(从10μg/ml开始的11点1:3稀释液)在1:4的最终稀释度下在37℃、5％CO2下温育2小时。使用由热灭活血清制备的培养基(RPMI+1％L-谷氨酰胺+20％胎牛血清)建立所述测定，使得犬补体保存的血清将是补体的唯一来源。利妥昔单抗-cIGGB嵌合抗体用作阴性同种型对照。
然后按照测定方案使用CellTitre-发光细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega))对活细胞进行定量。这种测定使用活细胞的ATP含量作为细胞活力的指标。在CLARIOstar(BMG Labtech公司(BMG Labtech))上测量发光。使用MARS软件(BMG Labtech公司)分析数据，并使用Microsoft Excel，使用没有抗体的孔作为基线，使用剩余活细胞数来计算在存在抗体的情况下的杀伤百分比。在GraphPad Prism中绘制图。
图4示出了用天然和a-岩藻糖基化的形式两者的PMX003观察到的CDC活性。在使用犬补体保存的血清的相同实验设置下，未观察到天然和a-岩藻糖基化的形式两者的1E4和4E1-7测试抗体的CDC活性。表4总结了抗体PMX066至PMX081的CDC活性。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性
用编码犬CD20蛋白的构建体和表达荧光蛋白(例如GFP)的构建体稳定转染如MDCKII细胞系(ATCC)等犬细胞系。表达荧光蛋白但不表达抗原的MDCK II细胞系或同种型对照抗体用作实验的阴性对照。
犬外周血单核细胞(PBMC，Envigo公司(Envigo))用作效应子细胞的来源。按照推荐的方案，使用Ficoll-Paque plus(思拓凡公司(Cytiva)，GE17-1440-02)密度梯度离心，用肝素钠抗凝剂将PBMC从新鲜抽取的全血中分离。将PBMC重悬于补充有50ng/ml的重组犬IL-2(R&D系统公司(R&D systems))的培养基(PBMC培养基＝RPMI+10％热灭活胎牛血清+1％青霉素-链霉素+1％非必需氨基酸+1％L-谷氨酰胺+1％丙酮酸钠+2％HEPES)中，并在用于ADCC测定之前在37℃下温育24小时。
为了评估ADCC活性，在MDCK II培养基(DMEM+1％L-谷氨酰胺+10％胎牛血清)和PBMC培养基的1:1混合物中，将10,000个MDCK II细胞与PBMC以35:1的效应子:靶标比率和抗体滴定(从10μg/ml抗体开始的11点1:3稀释液)在37℃下共培养24小时。利妥昔单抗-cIGGB用作阴性(同种型)对照抗体。
与每孔的活细胞数量成比例的GFP信号用作在24小时温育结束时孔中的剩余活细胞数量的量度。在CLARIOstar(BMG Labtech公司)上测量GFP信号。使用MARS软件(BMGLabtech公司)分析数据，并使用Microsoft Excel，使用没有抗体的孔作为基线来计算在存在抗体的情况下的杀伤百分比。用GraphPad Prism绘制图。
图5示出了在存在PMX抗体的情况下观察到的ADCC活性。PMX003抗体示出比天然和去岩藻糖基化的形式两者的测试抗体1E4和4E1-7更强的ADCC活性。表4总结了抗体PMX066至PMX081的观察到的ADCC活性。
抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性
用于测量ADCP活性的合适的方法在Ito等人《白血病和淋巴瘤(Leuk Lymphoma.)》2015年1月；56(1):219-225中描述。
直接杀伤活性/凋亡测定
直接杀伤可以如Mizuno等人《科学报告》,10,第11476条(2020)中所描述的进行测量。
实例8：离体-全血测定
为了评估离体狗模型中的B细胞耗竭效率，用肝素收集100μl的新鲜抽取的狗全血，并用200μL的RPMI1640+10％热灭活胎牛血清+1％青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+2％HEPES缓冲液稀释。稀释的血液在37℃下与或不与10μg/ml的抗犬CD20抗体一起温育2小时、24小时和96小时。在温育之后，将样品与Versalyse溶液(贝克曼库尔特公司)在室温下一起温育15分钟，以溶解红细胞(RBC)。在洗涤之后，将样品用抗犬CD21抗体和抗犬CD8抗体(均来自伯乐公司(BioRad))染色，并在CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)上分析CD21+B细胞和CD8+T细胞的数量。与无抗体对照相比，基于CD21+B细胞与CD8+T细胞的比率的降低来计算B细胞耗竭的百分比。图6A-B中的结果显示，与1E4和4E1-7 mAb相比，PMX003mAb导致更有效地杀伤全犬血中的B细胞。表4总结了抗体PMX066至PMX081的观察到的离体特异性B细胞耗竭活性。
实例9：体内测定
肿瘤小鼠模型
产生同系肿瘤小鼠模型以评估抗犬CD20抗体的体内肿瘤杀伤效率。通过同源重组工程修饰小鼠129Sv ES细胞的基因组序列以用狗CD20编码区替代小鼠CD20编码区。靶向载体含有在两侧上侧接4-4.5kb的小鼠基因组序列的狗CD20编码区的基因组DNA序列。在显微注射和种系传递之后，将如此产生的小鼠与Balb/c小鼠繁殖，以产生混合遗传背景的mCD20/dCD20杂合子代。
Balb/c遗传背景的小鼠淋巴瘤细胞系A20也被修饰以表达狗CD20。通过用线性化的ES细胞靶向载体转染A20细胞系，用狗CD20编码序列替代小鼠CD20编码区。
为了评估小鼠肿瘤杀伤效率，将1百万只狗CD20敲入A20细胞(于100μl的PBS中)皮下移植到mCD20/dCD20杂合小鼠(6-8周龄)中。在第0天腹膜内注射一次抗犬CD20-mIGG2a嵌合抗体(150μg于500μl的PBS中)或仅PBS。每天测量肿瘤的大小并且当达到人道终点时，对小鼠实施安乐死。
体内狗研究
在狗研究1中，在法国Avogadro LS(Avogadro LS,France)饲养十二只2-3岁并且体重8-11kg的健康雄性比格犬(每个测试组三只狗)。在研究之前，其都被证实没有疾病或其它临床异常。PMX003抗体的天然形式在CHO细胞中产生，并施用于两个测试组，一组接受0.5mg/kg抗体并且另一组接受2.5mg/kg抗体。PMX003抗体的a-岩藻糖基化的版本通过在Fut8 KO CHO细胞中表达而产生，并以0.5mg/kg施用于一个测试组。对照组接受同种型对照，利妥昔单抗-cIGGB，2.5mg/kg。所有抗体在第0天以单剂量静脉内输注在30分钟内施用。在施用抗体后的以下几天监测和分析CD21+B细胞的百分比：第0天(给药前)、第1、2、5、7、15、27和43天。将0.5ml含有K3EDTA抗凝剂的新鲜抽取的血液用1ml 1x RBC裂解/固定溶液(百进生物公司(BioLegend))在室温下在黑暗中固定30分钟，并且然后用18ml的1x PBS稀释。固定和稀释的血液样品在储存和运输到英国的整个过程中保持在+4℃。在抽血后48小时内进行样品分析。对于每个样品，将细胞以400g沉淀5分钟，将细胞沉淀重悬于0.5ml缓冲液中，并将50μl细胞用于每次技术复制的染色。对于每次复制，用AF647缀合的抗犬CD21抗体(伯乐公司，1:10)和PE缀合的抗犬CD8抗体(伯乐公司，1:50)对细胞进行染色。使用贝克曼库尔特公司CytoFLEX通过在DAPI上设置阈值以排除碎片和无核细胞来获取数据。使用FlowJo软件分析淋巴细胞群体中的CD21+B细胞和CD8+T细胞的百分比。通过比较每只狗在施用抗体后的评估日的CD21+B细胞的百分比与第0天(基线)的百分比来确定B细胞耗竭。还评估了CD8+T细胞的百分比并用作内部对照。图7A-B示出了施用PMX和对照抗体的健康比格犬的B细胞耗竭的结果。当以天然和a-岩藻糖基化的形式施用PMX003时，观察到耗竭。a-岩藻糖基化的形式比天然形式更有效。PMX003以比在使用1E4的狗研究中观察到的剂量低得多的剂量显示B细胞杀伤(Rue等人,《兽医免疫学和免疫病理学(Veterinary Immunologyand Immunopathology)》164(2015),148-159)。另外，B细胞耗竭维持在低水平至少15天，这比在4E1-7的狗研究中观察到的时间更长(Mizuno等人)。
在狗研究2中，在法国Avogadro LS饲养十五只2-3岁并且体重8-11kg的健康雄性比格犬(每个测试组三只狗)。在研究之前，其都被证实没有疾病或其它临床异常。PMX070和PMX115抗体的天然形式在CHO细胞中产生，并施用于每种抗体的两个测试组，一组接受0.5mg/kg抗体并且另一组接受2mg/kg抗体。对照组接受同种型对照，利妥昔单抗-cIGGB，2mg/kg。所有抗体在第0天以单剂量静脉内输注在30分钟内施用。在施用抗体后的以下几天监测和分析CD21+B细胞的百分比：第0天(给药前)第1、4、7、14、21和28天。将1ml含有K3EDTA抗凝剂的新鲜抽取的血液用2ml 1x RBC裂解/固定溶液(百进生物公司)在室温下在黑暗中固定30分钟，并且然后用12ml的1x PBS稀释。固定和稀释的血液样品在储存和运输到英国的整个过程中保持在+4℃。在抽血后48-72小时内进行样品分析。对于每个样品，将细胞以400g沉淀5分钟，将细胞沉淀重悬于1ml缓冲液中，并将50μl细胞用于每次技术复制的染色。对于每次复制，用AF647缀合的抗犬CD21抗体(伯乐公司，1:10)和PE缀合的抗犬CD8抗体(伯乐公司，1:50)对细胞进行染色。使用贝克曼库尔特公司CytoFLEX通过在DAPI上设置阈值以排除碎片和无核细胞来获取数据。使用FlowJo软件分析淋巴细胞群体中的CD21+B细胞和CD8+T细胞的百分比。通过比较每只狗在施用抗体后的评估日的CD21+B细胞的百分比与第0天(基线)的百分比来确定B细胞耗竭。还评估了CD8+T细胞的百分比并用作内部对照。图7C示出了施用PMX和对照抗体的健康比格犬的B细胞耗竭的结果。在0.5mg/kg和2mg/kg剂量下观察到PMX070和PMX115的耗竭，并且与用a-岩藻糖基化的形式的PMX003观察到的耗竭相当。
对于药物代谢动力学分析，在施用抗体后的以下时间监测和分析mAb药物的血浆浓度：狗研究1中的给药前T2小时、T6小时、T24小时、T48小时、T72小时、T120小时、T168小时、T360小时、第27天和第43天，以及狗研究2中的给药前T2小时、T6小时、T24小时、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天。在抽血之后，立即将含有肝素锂抗凝剂的新鲜血液置于冰上。将血液管在+5℃下以2500g离心10分钟。将血浆收集到聚丙烯管中并保存在冰上，直到储存在-20℃下为止。将血浆保持冷冻直到通过ELISA分析。使用针对PMX mAb的抗独特型多克隆抗体作为捕获抗体，并且使用抗犬Fc-HRP(西格玛公司(Sigma))或抗犬Fc-生物素(西格玛公司)加链霉亲和素-HRP(百进生物公司)作为检测抗体，通过ELISA评估mAb的浓度。通过用PMX Fab片段免疫兔、杂交瘤细胞系产生和与PMX mAb结合的抗独特型抗体的选择，然后去除与同种型对照抗体结合的任何交叉反应性抗体，在GenScript中产生针对PMX mAb的抗独特型多克隆或单克隆抗体。
对于免疫原性评估，在候选PMX抗体与抗药物抗体之间的任何预先形成的复合物酸解离之后，通过ELISA评估冷冻血浆中的抗药物抗体(ADA)的浓度。产生候选抗体的嵌合版本，例如PMX-小鼠Fc或PMX-人Fc并用生物素标记一部分。抗药物抗体的存在和浓度使用夹心ELISA测定形式来确定，其中未标记的嵌合抗体用作捕获试剂并且生物素标记的嵌合抗体与链霉亲和素-HRP一起用于检测。为上述药物代谢动力学测定产生的抗独特型多克隆抗体用作阳性对照并产生标准曲线。
实例10：表位作图
进行表位作图以鉴定与抗体特异性结合的犬CD20抗原上的位点。使用定点诱变，通过将犬CD20的胞外结构域分成9个区，并用人序列中的等效位置替代狗序列中的每个区，产生表达狗-人嵌合CD20的载体(图8A)。相同的策略用于产生狗-小鼠嵌合CD20(图8B)。突变的全长cDNA在MDCK细胞中表达，如实例2中所描述的。通过比较PMX003、PMX115和PMX070与这些嵌合突变体的结合以及与野生型CD20的结合，序列ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ IDNO:303)被鉴定为PMX003、PMX115和PMX070的表位，因为该位置处的突变导致流式细胞术分析中的结合减少(图9)。“ENLNLIKAPM”(SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号150-159)被鉴定为该序列内的核心表位。该表位不同于被描述为基准1E4抗体的表位的“DIHNCD”。研究表位的另一种策略是通过丙氨酸扫描，其中在小环中的每个残基处和大环中的每隔一个残基处产生单个丙氨酸突变(图8C)。
实例11：可显影性标准
存在几个方面的抗体表征，包含：1)小规模抗体产生过程期间的瞬时表达水平，其与影响COGS(商品销售成本)的最终稳定表达水平相关。2)与许多性质相关的热稳定性，包含聚集倾向和与更高浓度调配物的相容性。热稳定性可以用作为50％的蛋白质展开时的温度的Tm1值和作为聚集温度的Tagg来反映。使用UNcle蛋白质稳定性筛选平台(非链实验室(Unchained Labs))测量铅抗体的Tm1和Tagg值。3)大小和纯度。断裂和聚集可能导致体内功效或免疫原性的问题。在非还原的和还原的SDS-PAGE凝胶上确定抗体的大小。HPLC-SEC表明每个候选产物由超过95％的单体组成。使用UNcle机器检测颗粒的直径，这允许检测聚集的潜在问题。表5中展示了PMX003、PMX066、PMX067、PMX069、PMX070、PMX071、PMX072、PMX073、PMX074、PMX075、PMX076、PMX077、PMX078、PMX079、PMX080、PMX081、PMX112、PMX115、PMX122和PMX124抗体的可显影性参数。
实例12：去糖基化抗体的分析
除上述之外，使用计算机序列分析进行了序列责任的预测。在PMX003 mAb的轻链的框架区1(FR1)并且也在来自前导组的另外12个mAb(除了PMX070、PMX075和PMX080)中鉴定N-连接的糖基化基序(NVT)。为了通过预防该位置处的糖基化来减少责任，PMX003的轻链FR1中的NVT序列子突变为QVT(PMX006)、AVT(PMX007)、EVT(PMX008)、NVA(PMX009)、SVT(PMX010)和TVT(PMX011)。通过在还原的SDS-PAGE凝胶上将突变体抗体的轻链大小与原始PMX003 mAb进行比较来观察脱糖基化。随后，进行结合和功能评估，以评估这些突变的影响。流式细胞仪分析揭示，除了QVT和AVT突变体略有下降之外，与表达犬CD20的细胞的结合能力保持不变(图3B)。类似地，体外ADCC测定(图5D和5E)和离体全血测定(图6C)中的杀伤效力不显著受这些突变影响。因此，有可能修饰NVT基序用于去糖基化，而不损害结合和功能活性。
表2：序列
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表3：VH和VL基因使用
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表4：抗体功能数据汇总
表5：可显影性特征
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*3个生产批次的平均值。
序列表
<110> 佩特迈迪有限公司
<120> 抗犬CD20抗体
<130> P38561WO1
<150> GB 2108677.2
<151> 2021-06-17
<150> GB 2202635.5
<151> 2022-02-25
<160> 365
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 894
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 1
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ctggcagcag cggacaaaaa ccccaggaag agtttggtca aaggaaaaat gataatgaac 360
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<213> 家犬
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Arg Met Pro Ser Val Val Gly Pro Thr Gln Asn Phe Phe Met Arg Glu
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Cys Ile Thr Met Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Phe Ile Ile
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Ser Gly Ile Ile Phe Leu Ile Met Asp Ile Phe Asn Ile Thr Ile Ser
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Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
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<212> DNA
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<213> 家犬
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Tyr Asp Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Lys Ala
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<213> 家犬
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Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
1 5 10
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<213> 家犬
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<212> PRT
<213> 家犬
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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1 5
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1
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1 5
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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1
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<400> 97
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 98
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<213> 家犬
<400> 99
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<213> 家犬
<400> 101
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<211> 8
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<213> 家犬
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr
1 5
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<212> PRT
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<400> 103
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 104
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1 5
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1 5
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1
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<400> 107
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1 5
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<211> 394
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 108
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 109
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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Thr Thr Leu Asp Tyr
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1
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<213> 家犬
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<211> 394
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 118
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 119
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<211> 376
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 120
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<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 121
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<213> 家犬
<400> 122
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr His
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 123
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 124
Thr Thr Tyr Asp Gln
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<210> 125
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 125
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1 5
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 126
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1
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<213> 家犬
<400> 127
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1 5
<210> 128
<211> 394
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 128
atggagtctg cgctcagctg ggtgttcctt gtcactattt taaaaggtgt ccagggtgag 60
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<211> 112
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 129
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1 5 10 15
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<211> 376
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 130
atggcctgga cccacctcct cctgagcctc ctggctctct gcacaggttc tgtggcctcc 60
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<213> 家犬
<400> 131
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 245
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 245
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Leu Pro Ser Lys Ser Val Thr Leu Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Arg Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ala Asn Val
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Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 246
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65 70 75 80
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Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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<212> DNA
<213> 家犬
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<213> 家犬
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gagatgcaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 256
gaggtgcacc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
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<212> DNA
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<400> 257
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<212> DNA
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<212> DNA
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gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc cgggggggtc cctgagactt 60
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<212> DNA
<213> 家犬
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 262
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
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<212> DNA
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<400> 263
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 265
gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
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<211> 337
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 266
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactt 60
tcctgtgtgg cctctggata caccttcact aggtatcaca tgagttgggt ccgccaggct 120
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<213> 家犬
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 268
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<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 269
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<212> DNA
<213> 家犬
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 271
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 272
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
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<210> 273
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 273
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 274
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<210> 275
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 275
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
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acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 276
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 276
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa agtgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
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acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 277
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 277
tcctatgtcc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
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acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 278
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<212> DNA
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<400> 278
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gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 279
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 279
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tactgattat ctattatgat agtaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg ataatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 280
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 280
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg cactgattat ctattatgat agcagcaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagtagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 281
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 281
tcctatgtgg tgacacagct gccatccaat actgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggcccctg tgctgattat ctattatgat agcaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagtagtg ctaatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 282
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 282
tcctatgtgc tgacacagct gccatccaaa aatgtgaccc tgaagcagcc ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa agtgttcact ggtaccagca gaagctgggc 120
caggccccta tactgattat ctattatgat agcaggaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggcg ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcggggc cctggccgag 240
gacgaggctg actattactg ccaggtgtgg gacagcagtg gtaatgtgtt cggcggaggc 300
acccatctga ccgtcctcg 319
<210> 283
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 283
agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag caagtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60
acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240
gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300
acccacctga ccgtgctgg 319
<210> 284
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 284
agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag gccgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60
acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240
gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300
acccacctga ccgtgctgg 319
<210> 285
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 285
agctacgtgc tgacacagct gcctagcaaa gaggtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60
acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240
gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300
acccacctga ccgtgctgg 319
<210> 286
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 286
agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag aacgtggccc tgaagcagcc tgcccacatc 60
acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240
gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300
acccacctga ccgtgctgg 319
<210> 287
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 287
agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag tccgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60
acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240
gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300
acccacctga ccgtgctgg 319
<210> 288
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 288
agctacgtgc tgacacagct gcctagcaag accgtgaccc tgaagcagcc tgcccacatc 60
acctgcggcg gcgacaacat cggcagcaag agcgtgcact ggtatcagca gaagctgggc 120
caagcccctg tgctgatcat ctactacgac agcagaagac ctaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcgc cctggccgag 240
gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gacagcagcg ccaacgtgtt cggcggaggc 300
acccacctga ccgtgctgg 319
<210> 289
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 289
tcttacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccaggcggc ccaccggaat ccctgagagg 180
ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tcaacggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcagatgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 290
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 290
tcctacgtgc tgacacagct gccattcaag agcgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggctctaag tccgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tctaggcggc ccaccggcat ccctgagagg 180
ttcagcggcg ccaactctgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg tgaacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 291
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 291
agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 292
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 292
tcctacgtgc tgacacaggt gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggaggcaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccc tgctgatcat ctactatgat acaaggcggc ccaccggcat ccctgagaga 180
ttcagcggcg ccaactctgg caataccgct acactgacca tctctcgcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg gaaacgtgtt cggaggagga 300
acacacctga ccgtgatcg 319
<210> 293
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 293
tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctccca tcctgatcat ctactatgat acatctaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctccggag ctaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 294
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 294
agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 295
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 295
agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctggga 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgct tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gattcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 296
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 296
tcttacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccaggcggc ccaccggaat ccctgagagg 180
ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tcaacggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 297
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 297
agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attacttctg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 298
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 298
tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctccca tcctgatcat ctactatgat acatctaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctccggag ctaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcctccg ccaacgtgtt cggaggagga 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 299
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 299
tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctcccg tgctgatcat ctactatgat tctaggcggc ccaccggcat ccctgagagg 180
ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg ataacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 300
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 300
agctacgtgc tgacacagct gccaagcaag tctgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggctccaag agcgtgcatt ggtatcagca gaagctggga 120
caggctcccg ctctgatcat ctactatgat tccagcaggc caaccggaat ccctgagcgg 180
ttctctggcg ccaactccgg caataccgct acactgacca tctctggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactcttccg ctaacgtgtt cggcggcggc 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 301
<211> 319
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 301
tcctacgtgc tgacacagct gccatctaag tccgtgaccc tgaagcagcc agctcacatc 60
acatgcggag gcgacaacat cggcagcaag tctgtgcatt ggtatcagca gaagctgggc 120
caggctccca tcctgatcat ctactatgat tctaggcggc ccaccggcat ccctgagagg 180
ttctccggcg ccaacagcgg caataccgct acactgacca tctccggcgc cctggctgag 240
gacgaggctg attactattg tcaagtgtgg gactccagcg gaaacgtgtt cggaggagga 300
acacacctga ccgtgctgg 319
<210> 302
<211> 19
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 302
Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ala Pro Met
<210> 303
<211> 10
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 303
Glu Asn Leu Asn Leu Ile Lys Ala Pro Met
1 5 10
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 304
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 305
<211> 50
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 305
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 306
Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 307
<211> 50
<212> PRT
<213> 智人
<400> 307
Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile
1 5 10 15
Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln
35 40 45
Ser Leu
50
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 308
Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 309
<211> 9
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 309
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 310
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH03
<400> 310
Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 311
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH04
<400> 311
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 312
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH05
<400> 312
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Arg Ala His Thr Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 313
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH06
<400> 313
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 314
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH07
<400> 314
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Glu Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 315
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH08
<400> 315
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 316
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DH09
<400> 316
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln
35 40 45
Ser Leu
50
<210> 317
<211> 9
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 317
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 318
<211> 50
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 318
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 319
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 319
Pro Thr Gly Val Phe Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 320
<211> 50
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 320
Asn Met Thr Leu Ser His Phe Leu Lys Met Arg Arg Leu Glu Leu Ile
1 5 10 15
Gln Thr Ser Lys Pro Tyr Val Asp Ile Tyr Asp Cys Glu Pro Ser Asn
20 25 30
Ser Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Asn Ser Ile Gln
35 40 45
Ser Val
50
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM01
<400> 321
Pro Thr Gly Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 322
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM02
<400> 322
His Thr Asp Val Phe Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 323
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM03
<400> 323
Asn Met Thr Leu Ser His Phe Leu Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 324
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM04
<400> 324
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Arg Arg Leu Glu Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 325
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM05
<400> 325
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Gln Thr Ser Lys Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 326
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM06
<400> 326
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile Tyr Asp Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 327
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM07
<400> 327
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Glu Pro Ser Asn
20 25 30
Ser Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 328
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM08
<400> 328
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 329
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM09
<400> 329
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Asn Ser Ile Gln
35 40 45
Ser Val
50
<210> 330
<211> 9
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 330
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 331
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S01
<400> 331
Ala Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 332
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S02
<400> 332
His Ala Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 333
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S03
<400> 333
His Thr Ala Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 334
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S04
<400> 334
His Thr Asp Ala Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 335
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S05
<400> 335
His Thr Asp Val Ala Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S06
<400> 336
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Cys
1 5
<210> 337
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S07
<400> 337
His Thr Asp Val Tyr Ala Ala Ile Cys
1 5
<210> 338
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S08
<400> 338
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ala Cys
1 5
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S09
<400> 339
His Thr Asp Val Tyr Ala Pro Ile Ala
1 5
<210> 340
<211> 50
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 340
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 341
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L01
<400> 341
Ala Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 342
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L02
<400> 342
Asn Ile Ala Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 343
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L03
<400> 343
Asn Ile Thr Ile Ala His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 344
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L04
<400> 344
Asn Ile Thr Ile Ser His Ala Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 345
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L05
<400> 345
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Ala Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 346
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L06
<400> 346
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Ala Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 347
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L07
<400> 347
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Ala Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 348
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L08
<400> 348
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Ala Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 349
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L09
<400> 349
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Ala Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 350
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L10
<400> 350
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Ala Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 351
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L11
<400> 351
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Ala Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 352
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L12
<400> 352
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Ala Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 353
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L13
<400> 353
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ala His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 354
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L14
<400> 354
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Ala Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 355
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L15
<400> 355
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Ala Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 356
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L16
<400> 356
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 357
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L17
<400> 357
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Ala Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 358
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L18
<400> 358
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Ala Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 359
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19
<400> 359
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Ala Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 360
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L20
<400> 360
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Ala Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 361
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L21
<400> 361
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ala Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 362
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L22
<400> 362
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Ala Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 363
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L23
<400> 363
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Ala Ser Ile Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 364
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L24
<400> 364
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ala Arg
35 40 45
Ser Val
50
<210> 365
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L25
<400> 365
Asn Ile Thr Ile Ser His Phe Phe Lys Met Glu Asn Leu Asn Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ala Pro Met Pro Tyr Val Asp Ile His Asn Cys Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Ser Glu Lys Asn Ser Leu Ser Ile Gln Tyr Cys Gly Ser Ile Arg
35 40 45
Ala Val
50

Claims (32)

1.一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与犬CD20结合，其中所述抗体包括
a)HC CDR1序列，所述HC CDR1序列包括SEQ ID NO:27或相较于SEQ ID NO:
27具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
b)HC CDR2序列，所述HC CDR2序列包括SEQ ID NO:28或相较于SEQ ID NO:
28具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
c)HC CDR3序列，所述HC CDR3序列包括SEQ ID NO:29或相较于SEQ ID NO:
29具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
d)LC CDR1序列，所述LC CDR1序列包括SEQ ID NO:30或相较于SEQ ID NO:
30具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；
e)LC CDR2序列，所述LC CDR2序列包括SEQ ID NO:31或相较于SEQ ID NO:
31具有1个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成；以及
f)LC CDR3序列，所述LC CDR3序列包括SEQ ID NO:32或相较于SEQ ID NO:
32具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分具有
i)包括SEQ ID NO:7或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:8或由其组成的HCCDR2序列、包括SEQ ID NO:9或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:10或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:11或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:12或由其组成的LC CDR3序列；
ii)包括SEQ ID NO:17或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:18或由其组成的HCCDR2序列、包括SEQ ID NO:19或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:20的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:21或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:22或由其组成的LCCDR3序列；
iii)包括SEQ ID NO:37的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:38的HC CDR2序列、包括SEQID NO:39的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:40的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:41的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:42的LC CDR3序列；
iv)包括SEQ ID NO:47或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:48或由其组成的HCCDR2序列、包括SEQ ID NO:49或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:50或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:51或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:52或由其组成的LC CDR3序列；
v)包括SEQ ID NO:82或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:83或由其组成的HCCDR2序列、包括SEQ ID NO:84或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:85或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:86或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:87或由其组成的LC CDR3序列；
vi)包括SEQ ID NO:92或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:93或由其组成的HCCDR2序列、包括SEQ ID NO:94或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:95或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:96或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:97或由其组成的LC CDR3序列；
vii)包括SEQ ID NO:102或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:103或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:104或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:105或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:106或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:107或由其组成的LC CDR3序列；
viii)包括SEQ ID NO:112或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:113或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:114或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:115或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:116或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:117或由其组成的LC CDR3序列；
ix)包括SEQ ID NO:122或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:123或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:124或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:125或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:126或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:127或由其组成的LC CDR3序列；
x)包括SEQ ID NO:132或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:133或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:134或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:135或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:136或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:137或由其组成的LC CDR3序列；
xi)包括SEQ ID NO:142或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:143或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:144或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:145或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:146或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:147或由其组成的LC CDR3序列；
xii)包括SEQ ID NO:152或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:153或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:154或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:155或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:156或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:157或由其组成的LC CDR3序列；
xii)包括SEQ ID NO:162或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:163或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:164或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:165或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:166或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:167或由其组成的LC CDR3序列；
xiii)包括SEQ ID NO:172或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:173或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:174或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:175或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:176或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:177或由其组成的LC CDR3序列；
xiv)包括SEQ ID NO:182或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:183或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:184或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:185或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:186或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:187或由其组成的LC CDR3序列；
xv)包括SEQ ID NO:192或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:193或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:194或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:195或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:196或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:197或由其组成的LC CDR3序列；
xvi)包括SEQ ID NO:202或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:203或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:204或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:205或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:206或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:207或由其组成的LC CDR3序列；
xvii)包括SEQ ID NO:212或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:213或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:214或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:215或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:216或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:217或由其组成的LC CDR3序列；
xviii)包括SEQ ID NO:222或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:223或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:224或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:225或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:226或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ IDNO:227或由其组成的LC CDR3序列；
xix)包括SEQ ID NO:232或由其组成的HC CDR1序列、包括SEQ ID NO:233或由其组成的HC CDR2序列、包括SEQ ID NO:234或由其组成的HC CDR3序列、包括SEQ ID NO:235或由其组成的LC CDR1序列、包括SEQ ID NO:236或由其组成的LC CDR2序列和包括SEQ ID NO:237或由其组成的LC CDR3序列。
3.根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包括：HC可变区序列，所述HC可变区序列包括SEQ ID NO:24或与其具有至少75％、80％、85％或90％序列同一性的序列；以及LC可变区序列，所述LC可变区序列包括SEQ ID NO:26或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的序列，例如包括SEQ IDNO:53、54、55、56、57或58的LC可变区序列。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分具有
a)包括SEQ ID NO:4的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:6的LC可变区序列；
b)包括SEQ ID NO:14的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:16的LC可变区序列；
c)包括SEQ ID NO:34的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:36的LC可变区序列；
d)包括SEQ ID NO:44的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:46的LC可变区序列；
e)包括SEQ ID NO:79的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:81的LC可变区序列或包括SEQID NO:238的LC可变区序列；
f)包括SEQ ID NO:89的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:91的LC可变区序列或包括SEQID NO:239的LC可变区序列；
g)包括SEQ ID NO:99的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:101的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:240的LC可变区序列；
h)包括SEQ ID NO:109的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:111的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:241的LC可变区序列；
i)包括SEQ ID NO:119的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:121的LC可变区序列；
j)包括SEQ ID NO:129的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:131的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:242的LC可变区序列；
k)包括SEQ ID NO:139的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:141的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:243的LC可变区序列；
l)包括SEQ ID NO:149的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:151的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:244的LC可变区序列；
m)包括SEQ ID NO:159的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:161的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:245的LC可变区序列；
n)包括SEQ ID NO:169的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:171的LC可变区序列；
o)包括SEQ ID NO:179的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:181的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:246的LC可变区序列；
p)包括SEQ ID NO:189的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:191的LC可变区序列或包括SEQ ID NO:247的LC可变区序列；
q)包括SEQ ID NO:199的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:201的LC可变区序列、包括SEQ ID NO:248的LC可变区序列；
r)包括SEQ ID NO:209的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:211的LC可变区序列、包括SEQ ID NO:249的LC可变区序列；
s)包括SEQ ID NO:219的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:221的LC可变区序列；或者
t)包括SEQ ID NO:229的HC可变区序列和包括SEQ ID NO:231的LC可变区序列、包括SEQ ID NO:250的LC可变区序列。
5.根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述其抗原结合部分是scFv、Fv、重链或单结构域抗体。
6.一种分离的犬抗体或其抗原结合部分，其与根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分竞争与犬CD20结合。
7.根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与治疗部分缀合。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗部分是第二抗体或其抗原结合部分。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述第二抗体或其抗原结合部分与不同的靶标结合。
10.根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与另外的部分缀合，所述另外的部分选自半衰期延长部分、标记、细胞毒素、脂质体、纳米颗粒或放射性同位素。
11.根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是a-岩藻糖基化的。
12.一种药物组合物，其包括根据前述权利要求所述的抗体或其抗原结合部分。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据权利要求12所述的药物组合物，其用于治疗疾病。
14.一种治疗有需要的犬受试者的由B细胞介导的病状的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据权利要求12所述的药物组合物。
15.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物或根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是由B细胞介导的疾病，例如B细胞淋巴瘤、白血病或免疫介导的疾病。
16.根据权利要求13或15所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物或根据权利要求14或15所述的方法，其进一步包括向所述受试者单独施用另一种治疗剂。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物或根据权利要求16所述的方法，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或放射性毒剂、免疫抑制剂或免疫调节剂，如细胞因子或趋化因子。
18.一种核酸序列，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗体抗原结合部分。
19.根据权利要求18所述的核酸序列，其包括选自SEQ ID NO:3、5、13、15、23、25、33、35、43、45、78、80、88、90、98、100、108、110、118、120、128、130、138、140、148、150、158、160、168、170、178、180、188、190、198、200、208、210、218、220、228、230、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300或301的序列。
20.一种载体，其包括根据权利要求18至19中任一项所述的核酸序列。
21.一种宿主细胞，其包括根据权利要求18至19中任一项所述的核酸序列或根据权利要求20所述的载体。
22.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据权利要求12所述的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其进一步包括用于检测所述抗体或其抗原结合部分的试剂。
24.一种用于制备与CD20结合的犬抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求21所述的分离的宿主细胞并且回收所述抗体。
25.一种用于制备与CD20结合的犬抗体的方法，所述方法包括以下步骤
a)用CD20抗原免疫表达包括犬重链V基因和犬轻链V基因的核酸构建体的转基因小鼠；
b)由所述小鼠产生抗体文库；以及
c)从所述文库分离抗体。
26.一种用于检测来自犬受试者的生物样品中的CD20蛋白或CD20蛋白的胞外结构域的方法，所述方法包括使生物样品与根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分与可检测标记连接。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物样品是活检、组织、血液、血清、血浆或淋巴液样品。
28.一种抑制肿瘤生长或转移的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据权利要求12所述的药物组合物接触。
29.一种杀伤表达CD20的肿瘤细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或根据权利要求12所述的药物组合物接触，使得产生对所述表达CD20的细胞的杀伤。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述肿瘤细胞是犬肿瘤细胞。
31.一种抗体或其抗原结合部分，其中表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或由以下氨基残基组成：ENLNLIKAPM(SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号150-159)。
32.根据权利要求31所述的抗体或其抗原结合部分，其与表位结合，所述表位包括以下氨基残基中的一个或多个氨基残基，例如1至19个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个，或由以下氨基残基组成：ITISHFFKMENLNLIKAPM(SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:2中的氨基酸编号141-159)。
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