CN101189028A - 具有变异Fc区的抗体的鉴定和工程化以及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含变异Fc区的分子，特别是多肽，更特别的是免疫球蛋白(例如，抗体)，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述变异Fc区以更大的亲和性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。本发明的分子在预防、治疗或改善与疾病、失调或感染有关的一种或多种症状方面是特别有用的。本发明的分子在疾病或失调的治疗或预防中特别有用，其中由FcγR介导的效应细胞功能(例如，ADCC)的增强的效力是期望的，例如，癌症、传染性疾病，以及在提高效力由ADCC介导的治疗性抗体的治疗效力方面特别有用。
Description
[0001]本申请要求美国申请No.10/902,588的优先权，其是2004年1月9日提交的美国申请系列号No.10/754,922的部分延续，美国申请系列号No.10/754,922要求了分别于2003年1月9日、2003年3月19日和2003年10月23日提交的美国临时申请Nos.60/439,498、60/456,041和60/514,549的优先权；通过完全引用将它们每一个合并在此。本申请还根据美国法案§119(e)Title 35要求2004年7月12日提交的美国临时申请No.60/587,257的权利，通过完全引用将它合并在此。
1.发明领域
[0002]本发明涉及分子，具体是多肽，更具体地是免疫球蛋白(例如，抗体)，其包括变异Fc区，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，该变异Fc区以更大的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。本发明的分子在预防、治疗或改善与疾病、失调或感染有关的一种或多种症状方面是特别有用的。本发明的分子对于疾病或失调的治疗或预防是特别有用的，在所述疾病或失调中，由FcγR介导的效应细胞功能的增强的效力(例如，ADCC)是期望的，例如，癌症、传染性疾病，并且，在增强其效果由ADCC介导的治疗性抗体的治疗效力方面是特别有用的。
2.发明背景
2.1Fc受体和它们在免疫系统中的作用
[0003]抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用引起广泛的系列反应，从效应物功能，例如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和吞噬作用到免疫调节信号，例如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用都是通过抗体或免疫复合物的Fc结构域与造血细胞上特化的细胞表面受体的结合来启动的。由抗体和免疫复合物触发的细胞反应的多样性是由Fc受体的结构异质性引起的。Fc受体共有结构上相关的配体结合结构域，其可能介导了细胞内信号转导。
[0004]蛋白质的免疫球蛋白基因超家族的成员，Fc受体，是可以结合免疫球蛋白的Fc部分的表面糖蛋白。家族的每个成员通过Fc受体的α链上的识别结构域来识别一种或多种同种型的免疫球蛋白。Fc受体是由它们对免疫球蛋白亚型的特异性定义的。IgG的Fc受体被称为FcγR，IgE的称为FεR，IgA的称为FcαR。不同的辅助细胞带有不同同种型抗体的Fc受体，抗体的同种型确定了哪个辅助细胞将参与给定的反应(由Ravetch J.V.et al.1991，Annu.Rev.Immunol.9：457-92；Gerber J.S.et al.2001 Microbes and Infection，3：131-139；Billadeau D.D.et al.2002，The Journal of Clinical Investigation，2(109)：161-1681；Ravetch J.V.et al.2000，Science，290：84-89；RavetchJ.V.et al.，2001 Annu.Rev.Immunol.19：275-90；Ravetch J.V.1994，Cell，78(4)：553-60综述)。在表1中概述了不同的Fc受体、表达它们的细胞和它们的同种型特异性(改编自Immunobiology：The Immune System in Health and Disease，4th ed.1999，Elsevier ScienceLtd/Garland Publishing，New York)。
Fcγ受体
[0005]这个家族的每个成员都是整合的膜糖蛋白，具有与免疫球蛋白相关结构域的C2组有关的细胞外结构域、单个跨膜结构域和可变长度的胞质内结构域。存在三种已知的FcγR，称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。这三种受体由不同的基因编码；然而，在三个家族成员之间的广泛同源性表明它们可能由于基因多重化而起源于共同的祖先。
FcγRII(CD32)
[0006]FcγRII蛋白是40KDa整合的膜糖蛋白，由于与单体Ig的低亲合性(106M-1)，其仅结合复合的IgG。这个受体是最广泛表达的FcγR，存在于所有造血细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性白细胞、肥大细胞和血小板。FcγRII在其免疫球蛋白结合链中仅具有两个免疫球蛋白样区域，因而相比Fcγ/RI与IgG的亲合性低得多。存在三种人类FcγRII基因(FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C)，所有的都结合聚集物或免疫复合物中的IgG。
[0007]FcγRII-A和FcγRII-B的细胞质结构域间的明显不同产生了对受体连接的两种功能上异型的反应。基本的差异是A同种型启动引起细胞活化的细胞内信号转导，例如吞噬作用和呼吸性喷发(respiratoryburst)，而B同种型启动抑制性信号，例如抑制B细胞活化。
通过FcγR的信号转导
[0008]活化和抑制信号都在连接之后通过FcγR转导。这些径直相反的功能是由不同的受体同种型之间的结构差异引起的。在受体的细胞质信号转导结构域内、称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)两个不同的结构域，是所述不同的反应的原因。不同的细胞质酶对这些结构的补充决定了FcγR介导细胞反应的结局。含有ITAM的FcγR复合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而含有ITIM的复合物仅包括FcγRIIB。
[0009]人类嗜中性白细胞表达FcγRIIA基因。FcγRIIA经由免疫复合物或特异性抗体交联的群集用来聚集ITAM和受体相关的激酶，所述激酶促进ITAM的磷酸化。ITAM的磷酸化充当了Syk激酶的对接位点，所述Syk激酶的活化引起下游底物(例如，PI3K)的活化。细胞活化引起前炎症性介体(proinflammatory mediator)的释放。
[0010]FcγRIIB基因在B淋巴细胞上表达；它的细胞外结构域与FcγRIIA 96％相同，并以不可区别的方式结合IgG复合物。在FcγRIIB的细胞质结构域中ITIM的存在决定了FcγR的这种抑制性子类。近来，确定了这种抑制作用的分子基础。当与活化FcγR捆绑时，FcγRIIB中的ITIM变为磷酸化的，并吸引肌醇多磷酸5′-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，所述肌醇多磷酸5′-磷酸酶(SHIP)水解磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca++的流入，所述磷酸肌醇信使是作为含ITAM的FcγR介导的酪氨酸激酶活化的结果而释放的。因而，FcγRIIB的交联阻抑了对FcγR连接的活化反应，并抑制细胞应答。因而中止了B细胞活化、B细胞增殖和抗体分泌。
2.2相关的疾病
2.2.1癌症
[0011]赘生物或肿瘤是由可能为良性或恶性的异常不受控细胞生长引起的赘生的胞块。良性肿瘤一般保持局部化。恶性肿瘤被集体称为癌症。术语“恶性”一般指肿瘤可以侵入和破坏邻近的身体结构并扩散到远离的位点而导致死亡(关于综述，参见，Robbins and Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PP.68-122)。癌症可能在身体的许多位置出现，取决于它的发源表现不同。癌细胞破坏它们发源部分的身体，然后扩散到身体的其他部分，在那里它们开始新的生长并导致更大的破坏。
[0012]每年有超过120万美国人患上癌症。在美国癌症是死亡第二大主要原因，如果当前的趋势继续下去，预计到2010年癌症将成为死亡的主要原因。在美国肺癌和前列腺癌是男性的最大癌症杀手。在美国肺癌和乳腺癌是女性的最大癌症杀手。在美国两名男性中的一人在他一生中的某个时期将被诊断为癌症。在美国三名女性中的一人在她一生中的某个时期将被诊断为癌症。
[0013]还未发现癌症的治愈法。当前的治疗选择，例如手术、化疗和放射治疗通常不是无效就是存在严重的副作用。
癌症治疗
[0014]当前，癌症治疗可能包括手术、化疗、激素治疗和/或放射治疗以消灭患者体内的赘生性细胞(参见，例如，Stockdale，1998，“Principles of Cancer Patient Management”，in Scientific American： Medicine，vol.3，Rubenstein and Federman，eds.，Chapter 12，SectionIV)。近来，癌症治疗也可能包括生物学疗法或免疫疗法。所有这些方法对于患者都有显著的缺陷。例如，手术可能由于患者的健康状况是禁忌的，或可能是患者不接受的。另外，手术可能不能完全地除去赘生的组织。当赘生组织展现出比正常组织更高的放射敏感性时放射疗法才是有效的，放射疗法也常常可能引发严重的副作用。虽然可能是有效的，激素治疗很少作为单独的药剂来给予，常被用于在其他治疗已经除去大多数癌细胞之后防止或延迟癌症的复发。生物学疗法/免疫疗法在数量方面有限制，并且可能产生副作用，例如皮疹或肿胀、流感样症状，包括发烧、寒战和疲劳，消化道问题或过敏性反应。
[0015]对于化疗，存在各种可用于癌症治疗的化学治疗剂。绝大多数的癌症化学治疗通过抑制脱氧核糖核苷酸三磷酸盐前体的生物合成、直接地或间接地抑制DNA合成，来防止DNA复制和伴随的细胞分裂(参见，例如，Gilman et al.，Goodman and Gilman’s：The Pharmacological Basis of Therapeutics，Eighth Ed.(PergamomPress，New York，1990))。这些试剂包括烷化剂，例如亚硝基脲，抗代谢产物，例如氨甲蝶呤和羟基脲，和其他试剂，例如etoposides、campathecins、博来霉素、阿霉素、红比霉素等等，尽管不一定是细胞周期特异性的，由于它们对DNA复制的作用在S期期间杀死细胞。其他试剂，特别是秋水仙碱和长春花生物碱，例如长春花碱和长春新碱，干扰微管组装引起有丝分裂的延滞。化疗方案一般包括使用化学治疗剂的组合以增加治疗的效力。
[0016]尽管有各种化学治疗剂的可用性，化学疗法有许多缺陷(参见，例如Stockdale，1998，“Principles Of Cancer Patient Management”in Scientific American Medicine，vol.3，Rubenstein and Federman，eds.，ch.12，sect.10)。几乎所有的化学治疗剂都是有毒的，化学疗法引起显著的、常常是危险的副作用，包括严重的恶心、骨髓降低、免疫抑制，等等。另外，即使使用化学治疗剂的组合，许多肿瘤细胞是有抗性的，或发展出对化学治疗剂的抗性。实际上，对治疗方案中使用的特定化学治疗剂有抗性的那些细胞常常证明是对其他药物有抗性的，甚至是那些通过与特定治疗中使用的药物的作用机制不同的机制起作用的那些药剂；这种现象被称为多效性药物抗性或多药物抗性。因而，由于药物抗性，许多癌症被证明是标准的化学治疗方案难以治疗的。
[0017]存在着对可选择的癌症治疗的显著需求，特别是对于已经被证明标准的癌症治疗，例如，手术、放射疗法、化学疗法和激素治疗难以治疗的癌症的治疗。有前景的选择是免疫疗法，其中癌细胞被癌症抗原特异性抗体特异性地靶定。主要的努力已经针对免疫反应特异性的无害性，例如，杂交瘤技术已经允许开发肿瘤选择性单克隆抗体(参见，Green M.C.et al.，2000 Cancer Treat Rev.，26：269-286；WeinerLM，1999Semin Oncol.26(suppl.14)：43-51)，在过去几年中，食品和药品管理局已经批准了用于非Hodgkin’s淋巴瘤的Rituxin(抗CD20)和用于转移性乳腺癌(Suzanne A.Eccles，2001，Breast CancerRes.，3：86-90)的Herceptin[抗(c-erb-2/HER-2)]的第一批用于癌症治疗的MAb。然而，抗体效应物功能的效力，例如，介导抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)，是这种治疗的障碍。因而需要改善这种免疫疗法的效力的方法。
2.2.2炎症疾病和自体免疫疾病
[0018]炎症是一种过程，通过这种过程身体的白血球和化学物质保护我们的身体免于外来物质，例如细菌和病毒的感染。这通常以受影响区域的疼痛、肿胀、热度和红色为特征。称为细胞因子和前列腺素的化学物质控制这种过程，以有序和自我限制的级联释放到血液或受影响组织中。化学物质的这种释放增加了流向损伤或感染区域的血液，并可能引起红色和热度。某些化学物质使得液体渗漏入组织中，导致肿胀。这种保护性的过程可能刺激神经并导致疼痛。这些变化当在相关区域在有限的时期中发生时，对身体是有利的。
[0019]在自体免疫和/或炎症性失调中，在没有需要对抗的外来物质时免疫系统触发炎症性反应，身体正常保护性的免疫系统通过错误地攻击自身引起对他自己的组织的损害。存在着以不同方式影响身体的许多不同的自体免疫失调。例如，在患有多发性硬化的个体中大脑受到影响，在患有Crohn’s病的个体中肠受到影响，在患有类风湿性关节炎的个体中各种关节的滑膜、骨骼和软骨受到影响。随着自体免疫失调不断破坏一种或多种类型的身体组织，可能产生器官的异常生长、或器官功能方面的变化。自体免疫失调可能仅影响一个器官或组织类型，或者可能影响多个器官和组织。通常受自体免疫失调影响的器官和组织包括红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺(例如，甲状腺或胰腺)、肌肉、关节和皮肤。自体免疫失调的实例包括但不限于，Hashimoto’s甲状腺炎、恶性贫血、Addison’s病、1型糖尿病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、皮肌炎、Sjogren’s综合症、皮肌炎、红斑狼疮、多发性硬化、自体免疫内耳疾病重症肌无力、Reiter’s综合症、Graves病、自体免疫肝炎、家族性腺瘤息肉和溃疡性结肠炎。
[0020]类风湿性关节炎(RA)和青年类风湿性关节炎是炎症性关节炎的类型。关节炎是描述关节中的炎症的通称。某些、但不是所有种类的关节炎是指向错误的炎症的结果。除了类风湿性关节炎之外，与炎症相关的其他类型的关节炎包括以下的：牛皮癣关节炎、Reiter’s综合症、关节强硬性脊椎炎关节炎和痛风性关节炎。类风湿性关节炎是在身体的双侧关节(例如，双手、双腕或双膝)中发生的一种慢性关节炎。这种对称性有助于从其他种类的关节炎中辨别出类风湿性关节炎。除了影响关节之外，类风湿性关节炎可能偶尔地影响皮肤、眼、肺、心脏、血液或神经。
[0021]类风湿性关节炎影响了约1％的世界人口并潜在地使人残废。在美国存在约290万例类风湿性关节炎的发病。与男性相比，两到三倍的女性受到影响。发生类风湿性关节炎的一般年龄在25到50岁之间。青年类风湿性关节炎影响了71,000名青年美国人(年龄十八以下)，影响男孩数量六倍的女孩。
[0022]类风湿性关节炎是一种自体免疫失调，其中身体的免疫系统不正确地将关节中分泌润滑液的滑膜识别为外源的。产生了炎症，在关节中和周围的软骨和组织被损坏或破坏。在严重的病例中，这种炎症延伸到其他关节组织和环绕的软骨，在此处它可能侵蚀或破坏骨骼和软骨并引起关节畸形。身体用瘢痕组织替换损伤的组织，导致关节内的正常空间变得狭窄并导致骨骼融合在一起。类风湿性关节炎产生僵硬、肿胀、疲劳、贫血、失重、发烧，以及通常地，伤残疼痛。类风湿性关节炎的某些共同症状包括在醒来时持续一小时或更久的关节僵硬；特定手指或腕关节中的肿胀；关节周围软组织中的肿胀；和双侧关节的肿胀。肿胀可以伴有或不伴有疼痛而发生，可能逐渐地恶化，或在发展之前保持相同数年。
[0023]类风湿性关节炎的诊断基于因素的组合，包括：疼痛关节的特定位置和对称性，早晨关节僵硬的存在，皮肤下肿块和结节的存在(类风湿结节)，暗示类风湿性关节炎的X射线测试的结果，和/或称为类风湿因子的血液测试的阳性结果。许多但不是所有患有类风湿性关节炎的人在他们的血液中具有类风湿因子抗体。类风湿因子可能在没有患上类风湿性关节炎的人群中存在。其他疾病也可能引起类风湿因子在血液中产生。这就是为什么类风湿性关节炎的诊断基于几种因素的组合，而不是仅基于血液中类风湿因子的存在。
[0024]该疾病的典型病程是持久性但起伏的关节症状之一，约10年后，90％的患者将显示骨骼和软骨的结构损伤。小部分人将患有完全消除的短期病症，另一小部分人将患有非常严重的疾病，伴有许多关节畸形和偶尔地疾病的其他表现。炎症性过程引起关节中的溃疡或骨骼和软骨的破坏。在类风湿性关节炎，存在着持久性的抗原呈现、T细胞刺激、细胞因子分泌、滑膜细胞活化和关节破坏的自体免疫循环。该疾病对于个体和社会都有重要影响，引起显著的疼痛、损害的功能和无能力，以及在保健花费和损失工资方面数百万美元的耗费。(参见，例如：NIH网站和NIAID网站)。
[0025]对于关节炎当前可获得的治疗集中于用抗炎或免疫抑制药物降低关节的炎症。任何关节炎的第一线治疗通常是抗炎药，例如阿斯匹林、布洛芬和Cox-2抑制物，例如celecoxib和rofecoxib。“第二线药物”包括金、氨甲蝶呤和类固醇。虽然这些是很好地建立的关节炎治疗，非常少数的患者单独地豁免于(remit)这些治疗线。在类风湿性关节炎病理方面的了解的新发展已经引致与针对细胞因子的抗体或重组可溶性受体共同使用氨甲蝶呤。例如，肿瘤坏死因子(TNF)-α的重组可溶性受体已经用于在关节炎的治疗中与氨甲蝶呤组合。然而，用氨甲蝶呤和抗TNF-α试剂例如TNF-α的重组可溶性受体的组合治疗的仅约50％的患者显示了临床上显著的改善。许多患者保持了不论治疗法的难治疗性。对于类风湿性关节炎患者仍然存在困难的治疗问题。许多当前的治疗具有高几率的副作用，或者不能完全防止疾病发展。迄今为止，没有治疗是理想的，不存在治愈。需要更有效地治疗类风湿性关节炎和其他自体免疫失调的新的治疗剂。
2.1.3传染性疾病
[0026]引起疾病的传染原分成五个组：病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫(蠕虫)。这些病原体的可观的多样性引起了适应性免疫的两个决定性特征的自然选择。首先，能够识别大范围的不同病原体的益处驱使了在相当的或更大多样性的B和T细胞上受体的发展。第二，病原体的不同孳生地和生命周期必须由一系列不同的效应物机制补偿。每种病原体的特征是它的传播方式、它的复制机制、它的病理或它引起疾病的方式、和它引发的反应。
[0027]人类患上、或由于天花、霍乱、斑疹伤寒、痢疾、疟疾等等死亡的记录确立了传染性疾病的重要性。不论在由改善的环境卫生、免疫和抗菌治疗提供的控制方面的显著成功，传染性疾病仍然是近代医学的常见和重要的问题。最常见的人类疾病，感冒，是传染性疾病，令人恐惧的现代疾病AIDS也是。以前被认为是退行性疾病的某些慢性神经疾病已经被证明是传染性的。毫无疑问，将来会继续显现出传染性疾病是主要的医学问题。
[0028]巨大数目的人类和动物疾病是由上述传染原的任何一种的毒性和随机的感染引起的(参见，Belshe(Ed.)1984 Textbook of Human Virology，PSG Publishing，Littleton，MA)。
[0029]例如，传染性疾病的一个种类是病毒感染。广泛的组织，包括呼吸道、CNS、皮肤、泌尿生殖道、眼、耳、免疫系统、胃肠道和肌骨胳系统的病毒疾病影响了各个年龄的许多人(参见Table 328-2In：Wyngaarden and Smith，1988，Cecil Textbook of Medicine，18th Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PP.1750-1753)。尽管在有效的抗病毒治疗的设计中已经投入了可观的努力，病毒感染持续威胁着世界范围内数百万人的生命。一般地，开发抗病毒药物的努力集中于病毒生命周期的几个阶段(参见，例如Mitsuya et al.，1991，FASEB J.5：2369-2381，讨论HIV)。然而，与使用许多当前的抗病毒药物有关的常见障碍是它们的有害副作用，例如，对宿主的毒性，或某些病毒株的抗性。
3.发明概述
[0030]本发明部分地基于使用酵母展示系统鉴定具有对FcγR受体(例如，活化性FcγR、抑制性FcγR)的改变的亲合性的、突变的人类IgG1重链Fc区。体内动物建模和临床实验表明，Fc区在确定单克隆抗体治疗的结局方面起到了重要作用。优化治疗性单克隆抗体和与Fc区融合的可溶多肽的Fc区功能(例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC))方面的当前方法集中于根据结构分析和/或计算机辅助设计的有限数量的单氨基酸改变。工程化Fc区的可选择方法集中于Fc区的糖基化来优化Fc区功能。本发明部分地基于从Fc变体的无偏库(unbiased library)中选择在一种或多种Fc功能活性中改变的可能的突变体，所述Fc功能活性例如但不限于ADCC和CDC。本发明提供了在由结构研究鉴定的预期区域之外工程化Fc区并鉴定和筛选新的Fc变体的方法。在此使用的预期区域是指根据结构和/或生物化学研究与Fc配体接触的那些区域。
[0031]本发明提供了通过组合基于细胞的功能分析和用现阶段自动装置构建的组合库、鉴定具有一种或多种Fc效应物功能方面的改善的Fc变体的开发平台。本发明通过用覆盖所有可能的氨基酸变化的修饰使Fc内目标区域饱和来组合完全的组合库。将使用一组结合和功能分析根据改善的生物学功能选择突变体来测试组合库。
[0032]因此，本发明涉及分子、优选的多肽、更优选的免疫球蛋白(例如，抗体)，其包含在一个或多个区域中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换，但也包括插入或删除)的变异Fc区，所述修饰改变，例如，提高或降低所述变异Fc区对FcγR的亲合性。优选的，所述一个或多个氨基酸修饰增加所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在优选的实施方式中，本发明的分子进一步以比包含野生型Fc区的可比较分子(即，与本发明的分子相比除了Fc区中的一个或多个氨基酸修饰之外具有相同的氨基酸序列)结合FcγRIIB的更低的亲合性特异性地结合FcγRIIB(经由Fc区)。在某些实施方式中，本发明涵盖具有变异Fc区的分子，具有一个或多个氨基酸修饰，相对于具有野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性并增强所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。在其他实施方式中，本发明涵盖具有变异Fc区的分子，具有一个或多个氨基酸修饰，相对于具有野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性但不改变所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。优选的实施方式是一种变异Fc区，其相对于具有野生型Fc区的可比较分子具有对FcγRIIIA和FcγRIIA增强的亲合性但对FcγRIIB降低的亲合性。
[0033]本发明的Fc变体可以与其他Fc修饰组合，包括但不限于改变效应物功能的修饰。本发明包括组合本发明的Fc变体与其他Fc修饰来提供抗体或Fc融合物中相加的、协同的或新的性质。优选的，本发明的Fc变体增强与它们相组合的修饰的表型。例如，如果本发明的Fc变体与突变体组合，已知所述突变体以比包含野生型Fc区的可比较分子更高的亲合性结合FcγRIIIA；与本发明的突变体的组合导致FcγRIIIA亲合性方面更高倍数的增强。
[0034]在一个实施方式中，本发明的Fc变体可以与其他已知的Fc变体组合，例如在Duncan et al，1988，Nature 332：563-564；Lund et al.，1991，J.Immunol 147：2657-2662；Lund et al，1992，Mol Immunol29：53-59；Alegre et al，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchinset al.，1995，Proc Natl.Acad Sci U S A 92：11980-11984；Jefferis et al，1995，Immunol Lett.44：111-117；Lund et al.，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis et al，1996，Immunol Lett 54：101-104；Lund et al，1996，JImmunol 157：49634969；Armour et aL，1999，Eur J Immunol29：2613-2624；Idusogie et al，2000，J Immunol 164：41784184；Reddyet al，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol200：16-26；Idusogie et al，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields etal.，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Jefferis et al，2002，ImmunolLett 82：57-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490)；US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572中公开的那些，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[0035]本发明包括作为Fc区的同二聚体或异二聚体的分子。包含Fc区的异二聚体是指其中两条Fc链具有相同或不同序列的分子。在某些实施方式中，在包含变异Fc区的异二聚分子中，每条链具有与另一条链不同的一个或多个修饰。在其他实施方式中，在包含变异Fc区的异二聚分子中，一条链含有野生型Fc区，另一条链包含一个或多个修饰。工程化含异二聚Fc的分子的方法是本领域已知的，并涵盖在本发明内。
[0036]在某些实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，如本领域技术人员已知的标准分析(例如，体外分析)测定的，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述变异Fc区不结合任何FcγR或以降低的亲合性结合。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变异Fc区仅仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγIIIA。在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变异Fc区仅仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在又一个实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变异Fc区仅仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。
[0037]本发明的分子对FcγR的亲合性和结合性质最初使用本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即，Fc区与FcγR的特异性结合的体外分析(基于生物化学或免疫学的分析)来测定，包括但不限于ELISA分析、表面胞质团共振分析、免测沉淀分析(参见5.2.1节)。优选的，本发明的分子的结合性质也通过用于测定一种或多种FcγR介体效应细胞功能的体外功能性分析来表征(参见5.2.6节)。在最优选的实施方式中，本发明的分子在体内模型(例如，在此描述和公开的那些)中具有与基于体外的分析的那些所类似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的分析中不展现期望的表型、但在体内展现期望的表型的本发明的分子。
[0038]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性地结合FcγRIIIA，条件是所述变异Fc区不单独地具有在位置329、331或332的任何一处的替换，并且不包括或不单独地用：位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任何一处的丙氨酸；位置330的赖氨酸；位置339的苏氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的丝氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的组氨酸；位置334的缬氨酸；位置334的亮氨酸；位置335的赖氨酸的任何一个替换。
[0039]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIA更大的亲合性特异性地结合FcγRIIA，条件是所述一个或多个氨基酸修饰不包括或不单独地用：位置256、290、326、255、258、267、272、276、280、283、285、286、331、337、268、272或430的任何一处的丙氨酸；位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；位置290的丝氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸、位置326的丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的赖氨酸、位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸的任何一个替换。
[0040]在优选的特定实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述分子具有对FcγR的改变的亲合性，条件是所述变异Fc区不具有一些位置处的替换，根据例如Sondermann等(2000Nature，406：267-273，通过完全引用将其合并在此)所公开的那些的Fc-FcγR相互作用的结晶和结构分析，所述位置与FcγR进行直接接触。与FcγR进行直接接触的Fc区内的位置的实例是氨基酸234-239(绞链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C’/E环)和氨基酸327-332(F/G)环。在某些实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子包含至少一个残基的修饰，根据结构或结晶分析所述修饰不与FcγR进行直接接触，例如，不在Fc-FcγR结合位点内。
[0041]在另一个优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以改变的亲合性结合FcγR，条件是所述至少一个氨基酸修饰不包括或不单独地在位置255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439的任何一处替换。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以改变的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区不包括或不单独地在位置255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439的任何一处替换，并且不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任一处的丙氨酸；位置330的赖氨酸；位置339的苏氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的丝氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的组氨酸；位置334的缬氨酸；或位置334的亮氨酸；位置335的赖氨酸；位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；位置290的丝氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的赖氨酸；位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。
[0042]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区不包括或不单独地在位置268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439的任何一处替换，并且不具有位置280的组氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；位置290的丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸或酪氨酸，位置300的亮氨酸或异亮氨酸；位置294的天冬酰胺，位置296的脯氨酸；位置298的脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或缬氨酸；位置295的赖氨酸。在又一个优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以降低的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区做不具有或不单独具有在位置252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439的任何一处的替换。在又一个优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以增强的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区不具有或不单独地具有位置280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430的任何一处的替换。
[0043]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区不包括替换或不单独地具有位置330、243、247、298、241、240、244、263、262、235、269或328任何一处的替换，并且不具有位置243的亮氨酸、位置298的天冬酰胺，位置241的亮氨酸，和位置240的异亮氨酸或丙氨酸，位置244的组氨酸，位置330的缬氨酸，或位置328的异亮氨酸。
[0044]在特定的实施方式中，本发明的分子包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性到至少2倍。在某些实施方式中，本发明的分子包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性至大于2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍。在本发明的其他实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子以相对于包含野生型Fc区的分子更大至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％的亲合性特异性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。这种测量优选的是体外分析。
[0045]本发明涵盖对活化性和/或抑制性Fcγ受体有改变的亲合性的分子。特别是，本发明预期具有变异Fc区的分子，其具有一个或多个氨基酸修饰，相对于具有野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性，但是降低所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在其他实施方式中，本发明涵盖具有变异Fc区的分子，其具有一个或多氨基酸修饰，相对于具有野生型Fc区的可比较分子，所述修饰降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性，并且也降低所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在又一个实施方式中，本发明涵盖具有变异Fc区的分子，相对于具有野生型Fc区的可比较分子，所述修饰降低所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性，但是不改变所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个实施方式中，本发明涵盖具有变异Fc区的分子，相对于具有野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性，但是降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。
[0046]在特定的实施方式中，本发明的分子包含变异Fc区，其具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)，相对于包含以野生型亲合性结合FcγRIIIA和FcγRIIB的野生型Fc区的可比较分子，所述一个或多个修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性并且降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不是在位置256、298、333或334的任一处用丙氨酸替换。
[0047]在另一个特定的实施方式中，本发明的分子包含变异Fc区，其具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)，相对于包含以野生型亲合性结合FcγRIIA和FcγRIIB的野生型Fc区的可比较分子，所述一个或多个修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIA的亲合性并且降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不是在位置320处用精氨酸替换。
[0048]在最优选的实施方式中，具有对活化性和/或抑制性受体的改变的亲合性、具有变异Fc区的本发明的分子，具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰是在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc10)(参见表5)；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换(MgFc27)；或在位置392用苏氨酸、在位置396用亮氨酸替换(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用组氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用天冬氨酸替换(MgFc42)；或在位置240用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc52)；或在位置410用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc54)；或在位置255用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc59)。
[0049]用于筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子的优选的方法是酵母表面展示技术(关于综述参见，Boder and Wittrup，2000，Methods inEnzymology，328：430-444，通过完全引用将其合并在此)。具体地，酵母表面展示是一种遗传学方法，通过这种方法包含Fc突变的多肽以对于与FcγR相互作用可接近的形式在酵母细胞壁上表达。可以根据本领域技术人员已知的任何技术或在此描述的特定方法来进行含有突变Fc的本发明的多肽的酵母表面展示。酵母展示提供了好处，利用与期望的受体的实际结合来鉴定具有对该受体增强的结合的变异Fc区。
[0050]本发明的一个方面提供了选择具有期望的结合性质的突变Fc融合蛋白的方法，所述结合性质例如，所述突变Fc融合蛋白以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA的能力。可以筛选和通过本领域技术人员已知用于评估结合相互作用的任何基于生物化学或免疫学的分析来表征展示突变Fc融合蛋白的酵母细胞。在特定的实施方式中，筛选突变Fc融合蛋白使用一种或多种基于生物化学的分析，例如ELISA分析来进行。
[0051]在优选的实施方式中，筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子，使用在此描述的酵母展示技术结合一种或多种基于生物化学的分析，优选的以高通量方式来进行。所述一种或多种生物化学的分析可以是本领域已知用于鉴定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的任何分析，包括但不限于，ELISA分析、表面胞质团共振分析、免测沉淀法分析、亲和层析和平衡透析。在某些实施方式中，筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子，使用在此描述的酵母展示技术结合一种或多种基于功能分析，优选的以高通量方式来进行。基于功能的分析可以是本领域已知用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何分析，例如在此的5.2.6节中描述的那些。根据本发明的方法可以使用的效应细胞功能的非限制性实例包括但不限于，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用(opsonophagocytosis)、细胞结合、丛簇、C1q结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性。在某些实施方式中，筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子，使用在此描述的酵母展示技术结合一种或多种基于生物化学的分析、组合或并用一种或多种基于功能的分析，优选的以高通量方式来进行。
[0052]根据本发明用于测量FcγR-Fc相互作用的优选的方法是由发明人开发的分析，其容许检测和定量相互作用，不论受体对其配体的固有地弱的亲合性，例如，对于FcγRIIB和FcγRIIIA以微摩尔的范围。所述方法包括形成FcγR复合物(例如，FcγRIIIA、FcγRIIB)，所述FcγR复合物相对于未复合的FcγR具有对Fc区的改善的亲合力。在特定的实施方式中，本发明涵盖产生四聚FcγR复合物的方法，其中相对于单体FcγR对Fc区的亲合性，所述四聚复合物具有对Fc区增强的亲合性，所述方法包括：(i)产生融合蛋白，从而15个氨基酸的AVITAG序列与FcγR的可溶区操作性地连接；(ii)使用E.coli BirA酶生物素化所产生的蛋白；(iii)以合适的摩尔比将产生的生物素化的蛋白与streptaividn-藻红素混合，从而形成四聚的FcγR复合物。
[0053]在本发明优选的实施方式中，包含Fc区的多肽以比它们结合单体未复合FcγR至少高7倍的亲合性结合根据本发明的方法形成的四聚FcγR复合物。包含Fc区的多肽与所述四聚FcγR复合物的结合可以使用本领域技术人员已知的标准技术，实例例如，荧光活化的细胞分选(FACS)、放射性免疫分析、ELISA分析等等来测定。
[0054]本发明涵盖使用根据如上所述的方法形成的免疫复合物来在基于细胞的或无细胞的分析中测定包含Fc区的分子的功能。
[0055]在特定的实施方式中，本发明提供了具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性、包含变异Fc区的修饰的免疫球蛋白。这种免疫球蛋白包括天然地含有FcγR结合区(例如，FcγRIIIA和/或FcγRIIB结合区)的IgG分子，或已经工程化来含有FcγR结合区(例如，FcγRIIIA和/或FcγRIIB结合区)的免疫球蛋白衍生物。本发明的修饰的免疫球蛋白包括任何免疫球蛋白分子并含有FcγR结合区(例如，FcγRIIIA和/或FcγRIIB结合区)，所述免疫球蛋白分子结合，优选的免疫特异性地，即，通过本领域公知用于分析特异性抗原-抗体结合的免疫分析测定的、竞争排除非特异性结合，抗原。这种抗体包括但不限于，多克隆的、单克隆的、双特异性的、多特异性的、人类的、人源化的、嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物连接的Fvs、以及含有VL或VH结构域乃至特异性结合抗原的互补决定区(CDR)、在某些情况下被工程化以含有或融合到FcγR结合区的片段。
[0056]在某些实施方式中，本发明涵盖包含具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的变异Fc区的免疫球蛋白，从而所述免疫球蛋白具有增强的效应物功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。本发明的分子的效应物功能可以使用在此描述的或本领域技术人员已知的任何分析来进行。在某些实施方式中，包含具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的变异Fc区的免疫球蛋白具有增强的ADCC活性，是相对于野生型的至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。
[0057]本发明涵盖在Fc区中通过修饰(例如，替换、插入、删除)一个或多个氨基酸残基来工程化人类的或人源化的治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，所述修饰调节所述治疗性抗体对FcγR活化性受体和/或FcγR抑制性受体的亲合性。在一个实施方式中，本发明涉及在Fc区中通过修饰一个或多个氨基酸残基来工程化人类的或人源化的治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在另一个实施方式中，本发明涉及在Fc中通过修饰一个或多个氨基酸残基来工程化人类的或人源化的治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性，并进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。工程化的治疗性抗体可以进一步具有增强的效应物功能，例如，增强的ADCC活性、吞噬作用活性等等，如本领域技术人员已知的标准分析所测定的。
[0058]在特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化特异于Her2/neu原癌基因的人源化单克隆抗体(例如，在Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-9中公开的Ab4D5人源化抗体)，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在另一个特定实施方式中，修饰人源化Her2/neu单克隆抗体也可以进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，特异于Her2/neu的工程化的人源化单克隆抗体可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。
[0059]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化小鼠人类嵌合抗CD20单克隆抗体2H7，所述修饰增加Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在另一个特定的实施方式中，抗CD20单克隆抗体2H7的修饰也可以进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，工程化的抗CD20单克隆抗体2H7可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。
[0060]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化抗FcγRIIB抗体，所述抗体包括但不限于在2002年8月12日提交的美国临时申请No.60/403,266和具有代理编号No.011183-010-999的2003年8月14提交的美国申请No.10/643,857中公开的任何抗体，所述修饰提高Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。可以根据本发明的方法被工程化的抗FcγRIIB抗体的实例是具有ATCC登记号PTA-4591的2B6单克隆抗体、和具有ATCC登记号PTA-4592的3H7(保藏在ATCC，10801 University Boulevard，Manassas，VA 02209-2011，通过完全引用将其合并在此。在另一个特定的实施方式中，抗FcγRIIB抗体的修饰也可以进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，工程化的抗FcγRIIB抗体可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。在特定的实施方式中，2B6单克隆抗体包含在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、以及在位置366用丝氨酸替换(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换(MgFc27)；或在位置243用异亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换(MgFc29)；或在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用组氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用aspartic(MgFc42)；或在位置410用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc54)；或在位置255用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc59)。
[0061]本发明还包括编码本发明的分子的多核苷酸，所述分子包括通过本发明的方法鉴定的多肽和抗体。通过本领域已知的任何方法可以获得编码本发明的分子的多核苷酸，测定所述多核苷酸的核苷酸序列。本发明设计编码本发明的分子的分离的核酸。本发明还提供了包含所述核酸的载体。本发明进一步提供了含有本发明的载体或多核苷酸的宿主细胞。
[0062]本发明进一步提供了产生本发明的分子的方法。本发明的分子，包括多肽和抗体可以通过本领域技术人员已知的任何方法，特别是通过重组表达来产生。在特定的实施方式中。本发明涉及重组产生本发明的分子的方法，所述方法包括：(i)在适合于表达所述分子的条件下，在培养基中培养包含编码所述分子的核酸的宿主细胞；和(ii)从所述培养基中回收所述分子。
[0063]根据本发明的方法鉴定的分子在预防、治疗或改善与疾病、失调或感染有关的一种或多种症状方面是有用的。本发明的分子对于疾病或失调的治疗或预防是特别有用的，在所述疾病或失调中，由FcγR介导的效应细胞功能的增强的效力(例如，ADCC)是期望的，例如，癌症、传染性疾病，并且，在增强其效果由ADCC介导的治疗性抗体的治疗效力方面是特别有用的。
[0064]在一个实施方式中，本发明涵盖在患有以癌症抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括施用结合所述癌症抗原的、治疗有效量的治疗性抗体，所述抗体已经根据本发明的方法被工程化。在特定的实施方式中，本发明涵盖在患有以癌症抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括施用特异性结合所述癌症抗原的、治疗有效量的治疗性抗体，所述治疗性抗体包含变异Fc区，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述治疗性抗体以比包含野生型Fc区的治疗性抗体结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，条件是所述变异Fc区不具有位置329、331或332的替换，并且不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360或430的任何一处的丙氨酸；在位置330的赖氨酸；在位置339的苏氨酸；在位置320的甲硫氨酸；在位置326的丝氨酸；在位置326的天冬酰胺；在位置326的天冬氨酸；在位置326的谷氨酸；在位置334的谷氨酰胺；在位置334的谷氨酸；在位置334的甲硫氨酸；在位置334的组氨酸；在位置334的缬氨酸；或在位置334的亮氨酸。在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖在患有以癌症抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包含施用特异性结合癌症抗原的、治疗有效量的治疗性抗体；所述治疗性抗体包含变异Fc区，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述治疗性抗体以比包含野生型Fc区的治疗性抗体结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，所述治疗性抗体进一步以比包含野生型Fc区的治疗性抗体结合FcγRIIB更低亲合性特异性结合FcγRIIB，条件是所述变异Fc区不具有在位置256、298、333或334的任何一处的丙氨酸。本发明涵盖在以癌症抗原为特征的患者中治疗癌症对方法，所述方法包括施用特异性结合所述癌症抗原的、治疗有效量对治疗性抗体，所述治疗性抗体包含变异Fc区，从而所述抗体具有增强的ADCC活性。
[0065]本发明涵盖在有需要的患者中治疗自体免疫失调和/或炎症性失调的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述分子以比包含野生型Fc区的可比较分子更大亲合性特异性结合FcγRIIB，并且所述分子进一步以比包含野生型Fc区的可比较分子更低亲合性特异性结合FcγRIIIA，并且所述分子结合免疫复合物(例如，抗原/抗体复合物)。本发明涵盖治疗自体免疫失调和/或炎症性失调的方法，进一步包括施用用于治疗和/或预防这些疾病的一个或多个附加的预防性或治疗性药剂，例如，免疫调节药剂，抗炎症药剂。
[0066]本发明还涵盖在受试者中治疗或预防传染性疾病的方法，包括施用结合传染原或其细胞受体的、治疗或预防有效量的一种或多种本发明的分子。可以通过本发明的分子治疗或预防的传染性疾病是由传染原，包括但不限于病毒、细菌、真菌、protozae和病毒引起的。
[0067]根据本发明的一个方面，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，包含变异Fc区的本发明的分子具有针对传染原，例如，病原性蛋白的增强的抗体效应物功能。在特定的实施方式中，本发明的分子通过增强对引起传染性疾病的传染原的吞噬作用和/或调理作用来增强传染性疾病治疗的效力。在另一个特定的实施方式中，本发明的分子通过增强对引起传染性疾病的受感染细胞的ADCC来增强传染性疾病治疗的效力。
[0068]在某些实施方式中，本发明的分子可以与本领域技术人员已知用于治疗或预防传染性疾病的、治疗或预防有效量的一种或额外的治疗药剂组合施用。本发明预期使用本发明的分子与本领域技术人员已知用于治疗和/或预防传染性疾病的抗生素组合。
[0069]本发明提供了药物组合物，其包含本发明的分子，例如包含变异Fc区的多肽、包含变异Fc区的免疫球蛋白、根据本发明工程化的治疗性抗体，和药学上可接受的载体。本发明额外提供了药物组合物，其进一步包含一种或多种额外的治疗剂，包括但不限于，抗癌症药剂、抗炎症药剂、免疫调节药剂。
3.1定义
[0070]如在此使用的，使用术语“Fc区”来定义IgG重链的C-末端区域。尽管边界可以稍微地不同，人类IgG重链Fc区被定义为从Cys226延伸到羧基末端。IgG的Fc区包含两个恒定区，CH2和CH3。人类IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸到氨基酸341。人类IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸到447。人类IgGFc区的CH2结构域(也称为“Cγ2”结构域)通常从氨基酸231延伸到340。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。更确切地，两个N-连接的分支碳水化物链被插入到完整的天然IgG的两个CH2结构域之间。
[0071]在整个说明书中，IgG重链中残基的编号是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，NH1，MD(1991)中EU索引的编号，通过引用明确地合并在此。“Kabat的EU索引”是指人类IgG1EU抗体的编号。
[0072]“铰链区”一般被定义为从人类IgG1的Glu216延伸到Pro230。通过将形成重链内S-S结合的第一个和最后一个半胱氨酸残基放在相同位置，其他IgG同种型的绞链区可以与IgG1序列比对。
[0073]如在此使用的，术语“抗体”和“多个抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)、内抗体(intrabodies)和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明的抗体的抗Id和抗抗Id抗体)和任何上述抗体的表位结合片段。特别是，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
[0074]如在此使用的，在多肽或蛋白质的上下文中术语“衍生物”是指包含已经通过引入氨基酸残基替换、删除或添加而改变的氨基酸序列的多肽或蛋白质。如在此使用的术语“衍生物”还指一种多肽或蛋白质，其已经被修饰，即，通过将任何类型的分子共价附着到多肽或蛋白质上。例如，而不是限制，抗体可以被修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞配体或其他蛋白，等等。可以通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等，来产生衍生多肽或蛋白。进一步的，衍生的多肽或蛋白衍生物具有与衍生它们的多肽或蛋白类似的或相同的功能。
[0075]如在此使用的，在非蛋白类衍生物的上下文中术语“衍生物”是指基于第一有机或无机分子的结构形成的第二有机或无机分子。有机分子的衍生物包括但不限于，例如通过添加或删除羟基、甲基、乙基、羧基或胺基修饰的分子。有机分子也可以被酯化、烃化和/或磷酸化。
[0076]如在此使用的，术语“失调”和“疾病”可互换地使用来指受试者中是状况。特别地，术语“自体免疫疾病”与术语“自体免疫失调”可互换地使用，来指在受试者中以由受试者对他自己的细胞、组织和/或器官的免疫反应引起的细胞、组织和/或器官损伤为特征的状况。术语“炎症疾病”与术语“炎症失调”可互换地使用，来指在受试者中以炎症、优选的慢性炎症为特征的状况。自体免疫失调可能或可能不与炎症相关。此外，炎症可能或可能不由自体免疫失调引起。因而，某些失调可能以自体免疫和炎症性失调为特征。
[0077]如在此使用的，术语“癌症”是指由异常的不受控制的细胞生长引起的赘生物或肿瘤。如在此使用的，癌症明确地包括白血病和淋巴瘤。在某些实施方式中，癌症是指良性肿瘤，其是保持局部化的。在其他实施方式中，癌症是指恶性肿瘤，其侵入和破坏了邻近的身体结构并扩散到远离的位点。在某些实施方式中，癌症与特异性癌症抗原有关。
[0078]如在此使用的，术语“免疫调节试剂”和其变体是指调节宿主的免疫系统的试剂。在某些实施方式中，免疫调节试剂是免疫抑制剂试剂。在某些其他实施方式中，免疫调节试剂是免疫刺激试剂。免疫调节试剂包括但不限于小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗体、无机分子、模拟试剂和有机分子。
[0079]如在此使用的，术语“表位”是指在动物中、优选的在哺乳动物中、和最优选的在人类中具有抗原性或免疫原性的活性的多肽或蛋白或非蛋白分子的片段。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体反应的多肽或蛋白的片段。具有抗原性活性的表位是根据本领域技术人员公知的任何方法，例如通过免疫分析来测定的、抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白质的片段。抗原性表位不必一定是免疫原性的。
[0080]如在此使用的，术语“片段”是指肽或多肽，其包含另一个多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少连续80个氨基酸残基、至少连续90个氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少连续125个氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少连续175个氨基酸残基、至少连续200个氨基酸残基或至少连续250个氨基酸残基的氨基酸序列。在特定的实施方式中，多肽的片段保持了所述多肽的至少一种功能。
[0081]如在此使用的，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的组合或杂交DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的类似物。可以使用例如核苷酸类似物来产生这种类似物，所述核苷酸类似物包括但不限于次黄苷或三甲基化碱基。这种类似物也可以包含DNA或RNA分子，其包含给分子带来有益特质的修饰的主干，所述特质例如核酸酶抗性或提高的跨细胞膜能力。所述核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可以含有单链和双链的部分，可以含有三链的部分，但优选的是双链DNA。
[0082]如在此使用的，“治疗有效量”是指足够治疗或应付疾病或失调的治疗试剂的数量。治疗有效量可以指足够延迟或最小化疾病的发作，例如延迟或最小化癌症的扩散的治疗试剂的数量。治疗有效量也可以指在疾病的治疗或控制中提供治疗益处的治疗试剂的数量。进一步的，对于本发明的治疗试剂治疗有效量意思是在疾病的治疗或控制中提供治疗益处的、单独的或与其他治疗剂组合的治疗试剂的数量。
[0083]如在此使用的，术语“预防试剂”或“多个预防试剂”是指可用于预防失调或预防失调的复发或扩散的任何试剂。预防有效量可以指足以在患者，包括但不限于易感染高增殖性疾病的那些患者，例如遗传地易感染癌症或早先暴露于致癌物质的那些患者中，防止高增殖性疾病、特别是癌症的复发或扩散、或这种疾病的发生的预防试剂的数量。预防有效量也可以指在疾病的预防中提供预防性益处的预防试剂的数量。进一步的，对于本发明的预防试剂预防有效量意思是在疾病的预防中提供预防益处的、单独的或与其他试剂组合的预防试剂的数量。
[0084]如在此使用的，术语“预防(“prevent”，“preventing”和“prevention”)”是指作为施用预防或治疗试剂的结果在受试者中防止失调的一种或多种症状的复发或发作。
[0085]如在此使用的，术语“组合”是指使用超过一种预防和/或治疗试剂。使用术语“组合”不限制向患有失调的受试者施用预防性和/或治疗试剂的顺序。第一预防或治疗试剂可以在向患有失调的受试者施用第二预防或治疗试剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)、伴随地、或随后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后)施用。
[0086]如在此使用的“效应物功能”是指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应物功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，和补体依赖性细胞毒性(CDC)。效应物功能包括在抗原的结合之后起作用的那些以及独立于抗原结合操作的那些。
[0087]如在此使用的“效应细胞”是指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应物功能的免疫系统的细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、树突状细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、Langerhans′细胞、天然杀伤(NK)细胞，可以来自任何有机体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。
[0088]如在此使用的“Fc配体”是指来自任何有机体的一种分子、优选的一种多肽，其结合抗体的Fc区以形成Fc-配体复合物。Fc配体包括但不限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体可以包括结合Fc的未被发现的分子。
4.附图的简要说明
附图1重组可溶性FcγR的SDS-PAGE分析
[0089]通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳评估重组可溶性FcγR蛋白的纯度。凝胶用考马斯蓝染色。泳道1：纯化的重组可溶性FcγRIIIA；泳道2：分子量标记物；泳道3：分子量标记物；泳道4：纯化的重组可溶性FcγRIIB。长划线是指标记物的分子量，从上到下它们分别相应于98、50、36和22KDa的分子量。
附图2重组可溶性FcγR的ELISA分析
[0090]使用ELISA分析测定纯化的重组可溶性FcγRIIIA与聚集的和单体的IgG的直接结合。与3G8聚集的IgG(▲)；生物素化的IgG(◆)；聚集的IgG(■)；与小鼠IgG1聚集的IgG(X)的结合。
附图.3A和B使用ELISA分析表征FcγRIIIA四聚复合物
A.可溶的四聚FcγRIIIA复合物特异性地结合可溶的单体人类IgG。可溶的四聚FcγRIIIA与人类IgG的结合被小鼠抗FcγIIIA单克隆抗体3G8阻断(◆)；携带D265A突变的4-4-20单克隆抗体不能阻断可溶的四聚FcγRIIIA与聚集的人类IgG的结合(Δ)。
B.比较可溶的四聚FcγRIIIA复合物与可溶的单体人类IgG的结合(■)和单体的可溶FcγRIIIA与可溶的单体人类IgG的结合(◆)。
附图4和B使用磁性珠子分析表征FcγRIIIA四聚复合物
A.FcγRIIIA复合物：两个FcγRIIIA(实心形状)由单克隆抗体DJ130c(1stAb)连接；抗小鼠F(ab)2与PE轭合(圆圈)。
B.与Fc包被的珠子结合的FcγRIIIA的FACS分析：(a)单独的珠子；(b)无FcγRIIIA的复合物；(c)与FcγRIIIA的复合物；(d)与FcγRIIIA和LNK16的复合物。
附图5含Fc的构建体的示意性呈示
[0091]呈现了克隆到pYD1中的IgG1Fc结构域的示意图。空心盒代表铰链-CH2-CH3结构域；平行垂线代表CH1结构域。对于GIF206和227构建体，显示了N-末端氨基酸。下划线的残基相应于绞链区；＊代表Xpress表位tag；画阴影线的盒子代表Gly4-Ser接头，点画的盒子代表Aga2p基因。
附图6A-H在酵母细胞壁上Fc融合蛋白的FACS分析
[0092]用结合PE的山羊抗人类Fc抗体(附图6A-D)或用小鼠抗人类IgG1Fc(CH3)特异性单克隆抗体HP6017(Sigma)(附图6E-H)孵育细胞。A和E表示单独的载体；画面B和F表示CH1-CH3构建体；画面C和G表示GIF227；画面D和H表示GIF 206构建体。
附图7A-C可溶的四聚FcγRIIIA与表面展示的Fc融合蛋白的结合
[0093]含有pYD1-CH1(A)；pYD-CH1-D265A(B)；和pYD载体(C)的细胞在一定条件下生长以在细胞表面表达Aga2p融合蛋白。分别在0.15mM、7.5mM和7.5mM用FcγRIIIA孵育细胞，通过FACS分析。
附图8表征可溶的四聚FcγRIIIA与表面展示的Fc融合蛋白的结合
[0094]分析在酵母细胞表面上FcγRIIIA四聚复合物与Fc融合蛋白的结合。结合PE的FcγRIIIA四聚复合物与不同浓度的3G8(◆)、LNK(▲)或不相关的同种型对照(■)预先孵育，随后与酵母细胞孵育。通过FACS分析细胞的PE荧光。结合FcγRIIIA四聚复合物的细胞百分比在y轴上标绘。
附图9用于选择具有对FcγRIIIA提高的结合的Fc突变体的分选门的实施例
[0095]用结合PE的FcγRIIIA四聚复合物(y轴)和结合抗Fc-FITC的抗体(x轴)染色细胞。方框的区域表示设置以选择～1.0％的细胞群体的分选门。
附图10A-N被鉴定具有对FcγRIIIA四聚复合物的提高的亲合性的一些Fc突变体的FACS分析
[0096]携带含有含有的Fc突变的pYD-CH1质粒的单个克隆在含有葡萄糖的选择培养基上扩增，在含半乳糖的选择培养基中诱导Fc表达，并随后通过FACs分析。附图10A和B表示携带野生型Fc的细胞；附图10C和D表示突变体#5；附图10E和F表示突变体#20；附图10G和H表示突变体#21；附图10I和J表示突变体#24；附图10K和L表示突变体#25；附图10M和N表示突变体#27。用FcγRIIIA四聚复合物(附图10A、C、E、G、I、K和M)或FcγRIIB四聚复合物(附图10B、D、F、H、J、L和N)染色细胞。
附图11A-B通过ELISA表征4-4-20单克隆抗体中的Fc突变体
[0097]将来自pYD-CH1质粒的Fc结构域克隆到嵌合4-4-20单克隆抗体的重链中。在293细胞中表达4-4-20单克隆抗体，收集上清液。用结合荧光素的BSA包被ELISA平板来捕获嵌合的4-4-20突变抗体。然后将FcγRIIIA(A)和FcγRIIB(B)受体包被在已经吸收了4-4-20单克隆抗体的ELISA平板上，以测定变异受体对Fc结构域的相对亲合性。突变体#15和#29是作为对照包括的非结合分离物。
附图12在4-4-20单克隆抗体中突变体的ADCC活性
[0098]评估含有突变Fc区的4-4-20抗体的ADCC活性，并与野生型4-4-20抗体的ADCC活性比较。分析的突变体如下：MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-26(D265A)、MGFc-27(G316D、A378V、D399E)、MGFc28(N315I、A379M、D399E)、MGFc29(F243I、V379L、G420V)、MGFc30(F275V)、MGFc-31(P247L、N421K)、MGFc-32(D280E、S354F、A431D、L441I)、MGFc-33(K317N、F423deleted)、MGFc-34(F241L、E258G)、MGFc-35(R255Q、K326E)、MGFc-36(K218R、G281D、G385R)
附图13A和B在HER2/NEU人源化单克隆抗体中突变体的ADCC活性
A.评估含有突变Fc区的人源化HER2/neu单克隆抗体的ADCC活性，并与野生型Her2/neu抗体的ADCC活性比较。分析的突变体如下：MGFc-5(V379M)、MGFc-9(F243I、V379L)、MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-13(K334E、T359N、T366S)、MGFc-27(G316D、A378V、D399E)。
B.在人源化Her2/neu单克隆抗体的环境中额外的突变的ADCC活性MGFc-37(K248M)、MGFc-39(E293V Q295E、A327T)、MGFc-38(K392T、P396L)、MGFc-41(H268N、P396L)、MGFc-23(K334E、R292L)、MGFc-44、MGFc-45。每个突变测试了两个独立的克隆。
附图14在BSA-FITC表面上捕获CH 4-4-20抗体
[0099]将浓度大约20μg/ml的6μL抗体以5μL/min注射到BSA-荧光异硫氰酸盐(FITC)表面上。显示了在BSA-FITC固定化的传感器船的表面上ch抗体与突变Fc区的结合的BIAcore sensogram。在野生型捕获的抗体反应上设置标记。
附图15FcγRIIIA与携带变异Fc区的CH 4-4-20抗体的实时结合的SENSOGRAM
[00100]在200nM浓度分析FcγRIIIA与携带变异Fc区的ch-4-4-20抗体的结合。在为野生型获得的ch-4-4-20抗体的水平处将反应标准化。
[00101]使用的突变如下：Mut 6(S219V)、Mut 10(P396L、A330S、K288N)；Mut 18(K326E)；Mut 14(K334E、K288N)；Mut 11(R255L、F243L)；Mut 16(F372Y)；Mut 19(K334N、K246I)。
附图16A-H FcγRIIIA结合携带变异Fc区的抗体的动力参数的分析
[00102]通过对200nM和800nM产生独立的最佳似合曲线来获得FcγRIIIA结合携带变异Fc区的抗体的动力参数。实线表明了相关似合，其是根据对32-34秒间隔的解离曲线计算的koff值获得的。Kd和koff值代表两个浓度的平均数。
附图17FcγRIIB-Fc融合蛋白与携带变异Fc区的抗体的实时结合的SENSOGRAM
[00103]在200nM浓度分析了FcγRIIB-Fc融合蛋白与携带变异Fc区的ch-4-4-20抗体的结合。在为野生型获得的ch-4-4-20抗体的水平处将反应标准化。
附图18A-CFcγRIIB-Fc融合蛋白对携带变异Fc区的抗体的动力参数的分析
[00104]通过对200nM和800nM产生独立的最佳似合曲线来获得FcγRIIB-Fc结合携带变异Fc区的抗体的动力参数。实线表明了相关似合，其是根据对32-34秒间隔的解离曲线计算的koff值获得的。Kd和koff值代表两个浓度的平均数。
[00105]使用的突变如下：Mut 6(S219V)、Mut 10(P396L、A330S、K288N)；Mut 18(K326E)；Mut 14(K334E、K288N)；Mut 11(R255L、F243L)；Mut 16(F372Y)；Mut 19(K334N，K246I)。
附图19相对于ADCC数据标绘的FcγRIIIA-Fc的Koff(WT)/Koff(MUT)比例
[00106]比一个数字更高的数字显示了相对于野生型、FcγRIIIA结合的降低的离解速率和FcγRIIB-Fc结合的提高的离解速率。方框中突变对于FcγRIIIA结合具有更低的off速率，对于FcγRIIB-Fc结合有更高的off速率。
附图20与未标记FcγRIIIA竞争
[00107]进行动力学筛选来鉴定具有结合FcγRIIIA的改善的Koff速率的Fc区突变。含有P396L突变的Fc区变体的库用0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接头-Avitag孵育一小时然后洗涤。随后0.8μM未标记FcγRIIIA与标记的酵母孵育不同的时点。旋转沉淀酵母，除去未标记FcγRIIIA，结合受体的酵母用SA(链霉抗生物素蛋白):PE(藻红素)染色用于FACS分析。
附图21A-C基于动力学筛选的FACS分析
[00108]根据来自附图20中呈现的数据计算的Koff，选择一分钟时点选择。用0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接头-Avitag单体孵育10倍过量的库；洗涤细胞并用未标记的配体孵育一分钟，然后洗涤并用SA:PE标记。然后通过FACS分选细胞，选择上面0.3％binders。将未选择的P396L库与通过FACS选择了改善的结合的酵母细胞比较。直方图显示了用FcγRIIIA/PE和山羊抗人类Fc/FITC共染色的细胞的百分比。
附图22A-B根据FcγRIIB Fc BINDERS的固相耗尽的选择
[00109]A.使用磁性珠子根据FcγRIIB耗尽和FcγRIIIA选择来筛选P396L库。通过磁性珠子的FcγRIIB耗尽重复5次。分析产生的酵母群体，发现显示了超过50％的山羊人抗Fc染色的细胞，和非常小百分比的FcγRIIIA染色的细胞。随后，使用0.1μM生物素化的FcγRIIIA接头-avitag通过FACS选择细胞两次。在每次分选后分析酵母细胞的FcγRIIIA和FcγRIIB结合并与野生型结合比较。
B.使用生物素化的FcγRIIIA 158F接头avitag单体作为配体从耗尽FcγRIIB的酵母群体中选择Fc突变体。设置分选门来选择顶部0.25％FcγRIIIA 158F binders。通过FACS分析产生的富集群体与不同的FcγRIIIA(158F和158V)、FcγRIIIB和FcγRIIA(131R)的结合。
附图23由携带Fc突变体的嵌合4D5介导的SKBR3目标细胞裂解的相对比例
[00110]为每个测试的Fc突变体计算了裂解的相对比例。带有Fc突变体的4D5抗体的裂解率除以由野生型4D5抗体介导的裂解的比率。将来自至少2个独立的分析的数据平均，标绘在直方图上。对每个Fc突变体，显示了来自两种不同抗体浓度的数据。选择抗体浓度，来侧翼于曲线上裂解为～50％处的点。
附图24由携带Fc突变体的嵌合2H7介导的DAUDI细胞裂解的相对比例
[00111]为每个测试的Fc突变体计算了裂解的相对比例。带有Fc突变体的2H7抗体的裂解率除以由野生型2H7抗体介导的裂解的比率。将来自至少1-2个独立的分析的数据平均，标绘在直方图上。对每个Fc突变体，显示了来自两种不同抗体浓度的数据。根据曲线上裂解为～50％处的点来选择抗体浓度。
附图25库产生的方案
[00112]显示了DNA链。正向箭头代表含有突变密码子的引物。反向箭头代表反向的基因特异性低聚物。
附图26通过构建基因方案产生库的策略
[00113]矩形方框分别代表铰链、CH2和CH3结构域。短的黑线代表具有5’突出的双链低聚物。
附图27新的Fc突变体在SKBR3细胞中改善PBMC介导的ADCC
[00114]图表显示了标准ADCC分析的线性回归分析。使用75∶1的效应物对目标比，在3logs上滴定抗体。裂解％＝(实验的释放-SR)/(MR-SR)＊100。
附图28新的Fc突变体在DAUDI细胞中改善PBMC介导的ADCC
[00115]图表显示了标准ADCC分析的线性回归分析。使用75∶1的效应物对目标比，在3logs上滴定抗体。裂解％＝(实验的释放-SR)/(MR-SR)＊100。
附图29在单核细胞的细胞因子处理时通过FACS的Fc受体分布型
[00116]单核细胞的细胞因子处理提高了Fc受体表达的低亲合性。使用特异性细胞因子在无血清培养基中培养淘选的单核细胞。使用FACS分析Fc受体分布型。
附图30在基于ADCC的巨噬细胞衍生的单核细胞中使用Fc突变体改善的肿瘤细胞杀伤
[00117]使用35∶1的效应物：目标比例测试2logs上的Ch4D5MAb浓度计算裂解百分比，在附图28中。
附图31补体依赖性细胞毒性分析流程图
[00118]该流程图概括了所使用的CDC分析。
附图32补体依赖性细胞毒性活性
[00119]显示了对FcγRIIIA增强的结合的Fc突变体也显示了改善的补体活性。滴定了3个数量级上的抗CD20ChMAb。计算裂解百分比，在附图28中。
附图33选择Fc突变体的判定树
[00120]选择Fc突变体的示例性方案。
附图34C1q结合2B6抗体
[00121]A.图表描绘了分析2B6结合补体级联的第一个成分的BIAcore形式。
[00122]B.携带变异Fc区的2B6抗体与C1q的实时结合的Sensogram。
附图35A-D C1q结合2B6突变抗体
[00123]2B6突变体与C1q的实时结合的Sensogram(3.25nM)。描绘的突变体MgFc51(Q419H、P396L)；画面A中MgFc51/60；MgFc55和MgFc55/60(画面B)，MgFc59和MgFc59/60(画面C)；和MgFc31/60(画面D)。
附图36A-D具有与FcγRIIB降低的结合的Fc变体
[00124]FcR与ch4D5抗体结合来比较D270E(60)对R255L、P396L双突变体(MgFc55)的影响。在不同的FcR浓度；400nM CD16A 158V；800nM CD16A 158F；200nM CD32B；200nM CD32A 131H分析KD。使用Biacore 3000软件使用独立的KD进行分析。
附图37A-D从FcγRIIB耗尽/FcγRIIAH131选择中选出的4D5突变体的动力学特征
[00125]FcR与ch4D5抗体的结合，所述抗体携带通过CD32B耗尽和CD32A H131筛选策略选择的不同Fc突变在不同的FcR浓度；400nM CD16A 158V；800nM CD16A 158F；200nM CD32B；200nMCD32A 131H分析KD。使用Biacore 3000软件使用独立的KD进行分析。
附图38MDM ADCC数据相对KOFF的图表，KOFF是如BIACORE所测定的针对CD32A 131H结合确定的。
[00126]突变如下：MgFc 25(E333A、K334A、S298A)；MgFc68(D270E)；MgFc38(K392T、P396L)；MgFc55(R255L、P396L)；MgFc31(P247L、N421K)；MgFc59(K370E、P396L)。
5.优选实施方式的说明
[00127]本发明涉及分子、优选的多肽、更优选的免疫球蛋白(例如，抗体)，其包含在一个或多个区域中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换，但也包括插入或删除)的变异Fc区，所述修饰改变，例如，提高或降低所述变异Fc区对FcγR的亲合性。在某些实施方式中，本发明提供包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，如本领域技术人员已知用于测定Fc-FcγR相互作用的方法和在此公开的方法，例如ELISA分析或表面胞质团共振分析所测定的，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，即与具有变异Fc区的所述分子相同但不具有所述一个或多个氨基酸修饰的分子，所述变异Fc区以更大的亲合性结合FcγRIIIA。在又一个实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的可比较分子所述变异Fc区以降低的亲合性结合FcγRIIIA。在优选的实施方式中，本发明的分子进一步以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIB更低的亲合性特异性结合FcγRIIB(经由Fc区)。在某些实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的可比较分子所述变异Fc区以更高的亲合性结合FcγRIIIA和FcγRIIB。在某些实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的可比较分子所述变异Fc区以更高的亲合性结合FcγRIIB。在其他实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的可比较分子所述变异Fc区以降低的亲合性结合FcγRIIB。
[00128]在某些实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的可比较分子所述变异Fc区不显示与任何FcγR的可检测的结合(例如，通过例ELISA分析所测定的，不结合FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA)。
[00129]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变异Fc区仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγIIIA。在另一个特定实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变异Fc区仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在又一个实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变异Fc区仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。本发明特别涉及通过增强，例如，治疗性抗体的效应物功能，例如增强ADCC来修饰人类或人源化治疗性抗体(例如，肿瘤特异性抗血管生成或抗炎性单克隆抗体)用于增强治疗性抗体的效力。
[00130]本发明的分子对FcγR的亲合性和结合性质最初使用本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即，Fc区与FcγR的特异性结合的体外分析(基于生物化学或免疫学的分析)来测定，包括但不限于ELISA分析、表面胞质团共振分析、免测沉淀分析(参见5.2.1节)。优选的，本发明的分子的结合性质也通过用于测定一种或多种FcγR介体效应细胞功能的体外功能分析来表征(参见5.2.6节)。在最优选的实施方式中，本发明的分子在体内模型(例如，在此描述和公开的那些)中具有与基于体外的分析的那些所类似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的分析中不展现期望的表型、但在体内展现期望的表型的本发明的分子。
[00131]在某些实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子包含在Fc区的CH3结构域中的至少一个氨基酸修饰，所述CH3结构域被定义为从氨基酸342延伸到447。在其他实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子包含在Fc区的CH2结构域中的至少一个氨基酸修饰，所述CH2结构域被定义为从氨基酸231延伸到341。在某些实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子包含至少两个氨基酸修饰，其中一个修饰在CH3区中，一个修饰在CH2区中。本发明进一步涵盖在绞链区中的氨基酸修饰。如使用在此描述的或本领域技术人员已知的方法测定的，在CH2和/或CH3结构域中具有一个或多个氨基酸修饰的本发明的分子具有对FcγR的改变的亲合性。
[00132]在特定的实施方式中，本发明涵盖在Fc区的CH1结构域中的氨基酸修饰。
[00133]在特别优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异具有提高的对FcγRIIA(CD32A)的结合和/或提高的ADCC活性，如使用本领域技术人员已知的和在此例示的方法所测定的。根据本发明的方法使用的ADCC分析可以是NK依赖性或巨噬细胞依赖性的。
[00134]本发明的Fc变体可以与其他已知的Fc修饰组合，包括但不限于改变效应物功能的修饰和改变FcγR结合亲合性的修饰。在特定的实施方式中，包含CH3结构域、CH2结构域或绞链区中的第一氨基酸修饰的本发明的Fc变体，可以与第二Fc修饰组合，使得所述第二Fc修饰不处在与第一修饰相同的结构域，从而第一氨基酸修饰对所述第二氨基酸修饰赋予相加的、协同的或新的性质。在某些实施方式中，本发明的Fc变体不具有CH2结构域中的任何氨基酸修饰。
[00135]本发明的Fc变体可以与本领域已知的Fc修饰的任一种组合，例如在以下的表2中公开的那些。
表2.
| 替换V264AV264LV264IF241WF241LF243WF243LF241L/F243L/V262I/V264IF241W/F243WF241W/F243W/V262A/V264AF241L/V262IF243L/V2641 |
| F243L/V262I/V264WF241Y/F243Y/V262T/V264TF241E/F243R/V262E/V264RF241E/F243Q/V262T/V264EF241R/F243Q/V262T/V264RF241E/F243Y/V262T/V264RL328ML328EL328FI332EL328M/I332EP244HP245AP247VW313FP244H/P245A/P247VP247GV264I/I332EF241E/F243R/V262E/V264R/I332EF241E/F243Q/V262T/V264E/I332EF241R/F243Q/V262T/V264R/I332EF241E/F243Y/V262T/V264R/I332ES298AS298A/I332ES298A/E333A/K334AS239E/I332ES239Q/I332ES239ED265GD265NS239E/D265G |
| S239E/D265NS239E/D265QY296EY296QS298TS298NT299IA327SA327NS267Q/A327SS267L/A327SA327LP329FA330LA330YI332DN297SN297DN297S/I332EN297D/I332EN297E/I332ED265Y/N297D/I332ED265Y/N297D/T299L/I332ED265F/N297E/I332EL328I/I332EL328Q/I332EI332NI332QV264TV264FV240I |
| V263IV266IT299AT299ST299VN325QN325LN325IS239DS239NS239FS239D/I332DS239D/I332ES239D/I332NS239D/I332QS239E/I332DS239E/I332NS239E/I332QS239N/I332DS239N/I332ES239N/I332NS239N/I332QS239Q/I332DS239Q/I332NS239Q/I332QK326EY296DY296NF241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332EA330Y/I332EV264I/A330Y/I332E |
| A330L/I332EV264I/A330L/I332EL234DL234EL234NL234QL234TL234HL234YL234IL234VL234FL235DL235SL235NL235QL235TL235HL235YL235IL235VL235FS239TS239HS239YV240AV240TV240MV263AV263TV263M |
| V264MV264YV266AV266TV266ME269HE269YE269FE269RY296SY296TY296LY296IA298HT299HA330VA330IA330FA330RA330HN325DN325EN325AN325TN325VN325HL328D/I332EL328E/I332EL328N/I332EL328Q/I332EL328V/I332E |
| L328T/I332EL328H/I332EL328I/I332EL328AI332TI332HI332YI332AS239E/V264I/I332ES239Q/V264I/I332ES239E/V264I/A330Y/I332ES239E/V264I/S298A/A330Y/I332ES239D/N297D/I332ES239E/N297D/I332ES239D/D265V/N297D/I332ES239D/D265I/N297D/I332ES239D/D265L/N297D/I332ES239D/D265F/N297D/I332ES239D/D265Y/N297D/I332ES239D/D265H/N297D/I332ES239D/D265T/N297D/I332EV264I/N297D/I332EY296D/N297D/I332EY296E/N297D/I332EY296N/N297D/I332EY296Q/N297D/I332EY296H/N297D/I332EY296T/N297D/I332EN297D/T299V/I332EN297D/T299I/I332EN297D/T299L/I332E |
| N297D/T299F/I332EN297D/T299H/I332EN297D/T299E/I332EN297D/A330Y/I332EN297D/S298A/A330Y/I332ES239D/A330Y/I332ES239N/A330Y/I332ES239D/A330L/I332ES239N/A330L/I332EV264I/S298A/I332ES239D/S298A/I332ES239N/S298A/I332ES239D/V264I/I332ES239D/V264I/S298A/I332ES239D/V264I/A330L/I332ET256AK290AD312A＊K326AS298AE333AK334AE430AT359AK360AE430AK320MK326SK326NK326DK326E |
| K334QK334EK334MK334HK334VK334LA330KT335KA339TE333A，K334AT256A，S298AT256A，D280A，S298A，T307AS298A，E333A，K334A S298A，K334AS298A，E333AT256AK290AK326AR255AE258AS267AE272AN276AD280AE283AH285AN286AP331AS337AH268AE272AE430A |
| A330KR301MH268NH268SE272QN286QN286SN286DK290SK320MK320QK320EK320RK322EK326SK326DK326EA330KT335ES267A，E258AS267A，R255AS267A，D280AS267A，E272AS267A，E293AS267A，E258A，D280A，R255AP238AD265AE269AD270AN297AP329A |
| A327QS239AE294AQ295AV303AK246AI253AT260AK274AV282AK288AQ311AK317AE318AK338AK340AQ342AR344AE345AQ347AR355AE356AM358AK360AN361AQ362AY373AS375AD376AE380AE382A |
| S383AN384AQ386AE388AN389AN390AY391AK392AL398AS400AD401AD413AK414AS415AR416AQ418AQ419AN421AV422AS424AE430AH433AN434AH435AY436AT437AQ438AK439AS440AS442AS444A |
| K447AK246MK248MY300FA330QK338MK340MA378QY391F |
[00136]在其他实施方式中，本发明的Fc变体可以与本领域已知的任何Fc修饰组合，例如在以下表3A和B中公开的那些。
表3A
表3B
＊＊注意，该表格使用Kabat中的EU编号。
[00137]在优选的特定实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述分子具有对FcγR的改变的亲合性，条件是所述变异Fc区不具有一些位置处的替换，根据例如Sondermann等(2000Nature，406：267-273，通过完全引用将其合并在此)所公开的那些的Fc-FcγR相互作用的结晶和结构分析，所述位置与FcγR进行直接接触。与FcγR进行直接接触的Fc区内的位置的实例是氨基酸234-239(绞链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C′/E环)和氨基酸327-332(F/G)环。在某些实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子包含至少一个残基的修饰，根据结构或结晶分析所述修饰不与FcγR进行直接接触。
[00138]FcγR相互作用结构域定位于IgG重链的较低绞链区和CH2和CH3结构域内的选择位点。如根据诱变研究和使用小肽抑制物的研究分别表明的(Sondermann et al.，2000Nature，406：267-273；Diesenhofer et al.，1981，Biochemistry，20：2361-2370；Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.276：6591-6604；通过完全引用将它们每一个合并在此)，侧翼于实际接触位置的氨基酸残基和CH3结构域中的氨基酸残基在IgG/FcγR相互作用中起了作用。如在此使用的直接接触是指相互处在至少1A、至少2或至少3埃之内、或处在1
、1.2
、1.5
、1.7
或2
范德华半径内的那些氨基酸。影响Fc相互作用蛋白的结合、在Fc上早先鉴定的位点的示范性列表在以下的表4中列出。在某些实施方式中，本发明涵盖在下列的位点处不具有任何修饰的Fc变体。在其他实施方式中，本发明涵盖Fc变体，其包含在下列一个或多个位点处的氨基酸修饰以及在此公开的其他修饰，从而这样的修饰对突变体的性质具有协同的或相加的效果。
表4.影响Fc相互作用蛋白的结合、在Fc上的早先鉴定的位点
| FcR-Fc | 结构域 | 残基 | FcRI | FcRII | FcRIII | C1q | FcRn |
| - | CH2 | 233 | C | C | C | - | C |
| A，B | CH2 | 234 | C | C | C | G | C |
| A，B | CH2 | 235 | C | C | C | G | C |
| A，B | CH2 | 236 | C | C | C | - | C |
| A，B | CH2 | 237 | - | - | - | - | - |
| A，B | CH2 | 238 | D | - | - | - | - |
| A，B | CH2 | 239 | - | - | C | - | - |
| - | CH2 | 241 | D | - | - | - | - |
| - | CH2 | 243 | D | - | - | - | - |
| - | CH2 | 246 | D | - | - | - | - |
| - | CH2 | 250 | - | - | - | - | E |
| - | CH2 | 254 | - | - | - | - | C |
| - | CH2 | 255 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 256 | - | C | C | - | - |
| - | CH2 | 258 | - | C | - | - | - |
| B | CH2 | 265 | C | C | C | F | C |
| B | CH2 | 267 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 268 | - | C | C | - | - |
| B | CH2 | 269 | - | - | C | - | - |
| - | CH2 | 270 | - | C | C | F | - |
| - | CH2 | 272 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 276 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 285 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 286 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 288 | - | - | - | - | C |
| - | CH2 | 290 | - | C | C | - | - |
| - | CH2 | 292 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 293 | - | - | C | - | - |
| - | CH2 | 295 | - | C | C | - | - |
| - | CH2 | 296 | - | - | C | - | - |
| B | CH2 | 297 | X | X | X | X | - |
| B | CH2 | 298 | - | - | - | - | - |
| B | CH2 | 299 | - | - | - | - | - |
| - | CH2 | 301 | D | C | C | - | - |
| - | CH2 | 311 | - | - | - | - | C |
| - | CH2 | 312 | - | - | - | - | C |
| - | CH2 | 315 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 317 | - | - | - | - | C |
| - | CH2 | 322 | - | C | C | F | - |
| - | CH2 | 326 | - | C | - | F | - |
| A，B | CH2 | 327 | D，C | C | C | - | - |
| A | CH2 | 328 | - | - | - | - | - |
| A | CH2 | 329 | D，C | C | C | F | - |
| A | CH2 | 330 | - | - | - | - | - |
| - | CH2 | 331 | - | C | - | F | - |
| A | CH2 | 332 | - | - | - | - | - |
| - | CH2 | 333 | - | - | C | F | - |
| - | CH2 | 334 | - | - | C | - | - |
| - | CH2 | 337 | - | C | - | - | - |
| - | CH2 | 338 | - | - | C | - | - |
| - | CH3 | 339 | - | - | C | - | - |
| - | CH3 | 360 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 362 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 376 | - | - | C | - | - |
| - | CH3 | 378 | - | C | - | - | - |
| - | CH3 | 380 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 382 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 414 | - | C | - | - | - |
| - | CH3 | 415 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 424 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 428 | - | - | - | - | E |
| - | CH3 | 430 | - | C | - | - | - |
| - | CH3 | 433 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 434 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 435 | - | - | - | - | C |
| - | CH3 | 436 | - | - | - | - | C |
[00139]表4列出了Fc区内的位点，它们早先被鉴定对于Fc-FcR相互作用是重要的。标为FcR-Fc的列指明了FcR接触的Fc链。字母指明引用了数据的参考文献。C是Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.276：6591-6604；D是Jefferis et al.，1995，Immunol.Lett.44：111-7；E是Hinton et al；2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6；F是Idusogieet al.，2000，J.Immunol.164：4178-4184；通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00140]在另一个优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以改变的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区不具有或不单独地在位置255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439的任何一处替换。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以改变的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区不具有或不单独地在位置255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439的任何一处替换，并且不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任何一处的丙氨酸；位置330的赖氨酸；位置339的苏氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的丝氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的组氨酸；位置334的缬氨酸；或位置334的亮氨酸；位置335的赖氨酸位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；位置290的丝氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的赖氨酸；位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。
[00141]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区不具有或不单独地在位置268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439任何一处替换，并且不具有位置280的组氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；位置290的丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸或酪氨酸，位置300的亮氨酸或异亮氨酸；位置294的天冬酰胺，位置296的脯氨酸；位置298的脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或缬氨酸；位置295的赖氨酸。在又一个优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以降低的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区不具有或不单独具有在位置252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439的任何一处的替换。在又一个优选的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而相对于包含野生型Fc区的分子所述分子以增强的亲合性结合FcγR，条件是所述变异Fc区不具有或不单独地具有位置280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430的任何一处的替换。
[00142]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区不包括或不单独地在位置330、243、247、298、241、240、244、263、262、235、269或328任何一处替换，并且不具有位置243的亮氨酸、位置298的天冬酰胺，位置241的亮氨酸，和位置240的异亮氨酸或丙氨酸，位置244的组氨酸，位置330的缬氨酸，或位置328的异亮氨酸。
[00143]在最优选的实施方式中，具有对活化性和/或抑制性受体的改变的亲合性、具有变异Fc区的本发明的分子，具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰是在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc10)(参见表5)；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换(MgFc27)；或在位置392用苏氨酸、在位置396用亮氨酸替换(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用组氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用天冬氨酸替换(MgFc42)；或在位置240用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc52)；或在位置410用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc54)；或在位置255用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc59)。
[00144]在一个特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置396用亮氨酸、在位置270用谷氨酸以及在位置243用亮氨酸替换。在另一个特定的实施方式中，所述分子进一步包含一个或多个氨基酸修饰，所述修饰例如在此公开的那些。
[00145]在某些实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，所述变异Fc区在一个或多个以下位置具有氨基酸修饰：185、142、192、141、132、149、133、125、162、147、119、166、251、292、290、291、252、288、268、256、262、218、214、205，215、247、275、202、289、258、219、279、222、246、233、246、268、244、217、253、246、224、298、280、255、218、281、284、216、223、235、221、252、241、258、227、231、215、274、287、244、229、287、291、240、281、232、269、225、246、246、293、295、248、276、268、210、288、227、221、217、261、210、242、255、240、250、247、258、246、282、219、225、270、263、272、292、233、247、254、243、347、339、392、399、301、315、383、396、385、348、333、334、310、337、371、359、366、359、379、330、318、395、319、380、305、309、335、370、378、394、386、377、358、384、397，372、326、320、375、327、381、354、385、335、387、353、375、383、397、345、375、389、335、394、316、399、315、394、382、390、369、377、304、323、313、388、339、317、365、367、340、311、312、398、343、352、362、303、308、327、307、344、328、393、355、360、306、361、355、415、408、409、407、424、401、402、435、421、431、441、440、435、431、442、400、422、406、411、422、433、406、423、420、412、447、443、414、433、428、446、402、419、410、404、427、417、433、436、438、416。优选的这些突变产生分子，所述分子具有对FcγR的改变的亲合性和/或具有改变的效应细胞介导的功能，如使用在此公开和例示以及本领域技术人员已知的方法测定的。
[00146]本发明涵盖包含变异Fc区的分子，所述变异Fc区包含或由以下在表5中列出的任何突变组成。
表5.示范性的突变
[00147]在又一个实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，所述变异Fc区具有超过两个氨基酸修饰。这种变体的非限制性实例在以下的表格(表6)中列出。本发明涵盖表6中列出的突变，其进一步包含一个或多个氨基酸修饰，所述修饰例如在此公开的那些。
表6.示范性的组合变体
| D399E，R292L，V185M |
| R301C，M252L，S192T |
| P291S，K288E，H268L，A141V |
| S383N，N384K，T256N，V262L，K218E，R214I，K205E，F149Y，K133M |
| S408I，V215I，V125L |
| G385E，P247H |
| V348M，K334N，F275I，Y202M，K147T |
| H310Y，T289A，Y407V，E258D |
| R292L，P396L，T359N |
| F275I，K334N，V348M |
| F243L.R255L，E318K |
| K334E，T359N，T366S |
| T256S，V305I，K334E，N390S |
| T335N，K370E，A378V，T394M，S424L |
| K334E，T359N，T366S，Q386R |
| K288N，A330S，P396L |
| P244H，L358M，V379M，N384K，V397M |
| P217S，A378V，S408R |
| P247L，I253N，K334N |
| D312E，K327N，I378S |
| D280E，S354F，A431D，L441I |
| K218R，G281D，G385R |
| P247L，A330T，S440G |
| T355N，P387S，H435Q |
| P247L，A431V，S442F |
| P343S，P353L，S375I，S383N |
| E216D，E345K，S375I |
| K288N，A330S，P396L |
| K222N，T335N，K370E，A378V，T394M |
| G316D，A378V，D399E |
| N315I，V379M，T394M |
| K326Q，K334E，T359N，T366S |
| A378V，N390I，V422I |
| V282E，V369I，L406F |
| V397M，T411A，S415N |
| T223I，T256S，L406F |
| L235P，V382M，S304G，V305I，V323I |
| P247L，W313R，E388G |
| D221Y，M252I，A330G，A339T，T359N，V422I，H433L |
| F243I，V379L，G420V |
| A231V，Q386H，V412M |
| T215P，K274N，A287G，K334N，L365V，P396L |
| P244A，K326I，C367R，S375I，K447T |
| R301H，K340E，D399E |
| C229Y，A287T，V379M，P396L，L443V |
| E269K，K290N，Q311R，H433Y |
| E216D，K334R，S375I |
| T335N，P387S，H435Q |
| K246I，Q362H，K370E |
| K334E，E380D，G446V |
| V303I，V369F，M428L |
| K246E，V284M，V308A |
| E293V，Q295E，A327T |
| Y319F，P352L，P396L |
| D221E，D270E，V308A，Q311H，P396L，G402D |
| K290T，N390I，P396L |
| K288R，T307A，K344E，P396L |
| V273I，K326E，L328I，P396L |
| K326I，S408N，P396L |
| K261N，K210M，P396L |
| F243L，V305I，A378D，F404S，P396L |
| K290E，V369A，T393A，P396L |
| K210N，K222I，K320M，P396L |
| P217S，V305I，I309L，N390H，P396L |
| K246N，Q419R，P396L |
| P217A，T359A，P396L |
| V215I，K290V，P396L |
| F275L，Q362H，N384K，P396L |
| A330V，H433Q，V427M |
| V263Q，E272D，Q419H |
| N276Y，T393N，W417R |
| V282L，A330V，H433Y，T436R |
| V284M，S298N，K334E，R355W |
| A330V，G427M，K438R |
| S219T，T225K，D270E，K360R |
| K222E，V263Q，S298N |
| E233G，P247S，L306P |
| S219T，T225K，D270E |
| S254T，A330V，N361D，P243L |
| V284M，S298N，K334E，R355W R416T |
| D270E，G316D，R416G |
| K392T，P396L，D270E |
| R255L，P396L，D270E |
| V240A，P396L，D270E |
| Q419H，P396L，D270E |
| K370E，P396L，D270E |
| P247L，N421K，D270E |
| R292P，V305I |
| R292P，V305I，F243L |
| V284M，R292L，K370N |
[00148]在某些实施方式中，本发明的所述分子、优选的免疫球蛋白，进一步包含一个或多个糖基化位点，从而一个或多个碳水化物部分共价地附着到所述分子上。优选的，具有在Fc区中一个或多个糖基化位点和/或一个或多个修饰的本发明的抗体具有增强的抗体介导的效应物功能，例如，增强的ADCC活性。在某些实施方式中，本发明进一步包含抗体，其包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸已知直接或间接地于抗体的碳水化物部分相互作用，包括但不限于位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301的氨基酸。直接或间接地于抗体的碳水化物部分相互作用的氨基酸是本领域已知的，参见，例如Jefferis et al.，1995ImmunologyLetters，44：111-7，通过完全引用将它合并在此。
[00149]本发明涵盖抗体，所述抗体已经通过导入一个或多个糖基化位点到抗体的一个或多个位点来修饰，优选的不改变所述抗体的功能，例如对FcγR的结合活性。糖基化位点可以导入到本发明的抗体的可变区或恒定区。如在此使用的，“糖基化位点”包括抗体中的任何特定氨基酸序列，低聚糖(即，含有连接在一起的两个或多个单糖的碳水化物)将特异性地和共价地连接到所述序列。低聚糖侧链一般经由N-或O-键与抗体的主干连接。N-连接的糖基化是指低聚糖部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。O-连接的糖基化是指低聚糖部分附着到羟氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸上。本发明的抗体可以包含一个或多个糖基化位点，包括N-连接的和O-连接的糖基化位点。根据本发明可以使用本领域已知的用于N-连接或O-连接的糖基化的任何糖基化位点。根据本发明的方法有用的示范性的N-连接的糖基化位点是氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何氨基酸，Thr/Ser代表苏氨酸或丝氨酸。可以使用本发明相关领域中公知的方法将这样的位点导入本发明的抗体中。参见，例如，″In Vitro Mutagenesis，″ Recombinant DNA：A Short Course，J.D.Watson，et al.W.H.Freemanand Company，New York，1983，chapter 8，PP.106-116，通过完全引用将它合并在此。将糖基化位点导入本发明的抗体的示范性的方法可以包括：修饰或突变抗体的氨基酸序列，从而获得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。
[00150]在某些实施方式中，本发明涵盖通过添加或删除糖基化位点来修饰本发明的抗体的碳水化合物含量的方法。修饰抗体的碳水化合物含量的方法是本领域公知的并涵盖在本发明中，美国专利No.6,218,149；EP 0 359 096 B1；美国公开No.US 2002/0028486；WO03/035835；美国公开No.2003/0115614；美国专利No.6,218,149；美国专利No.6,472,511；通过完全引用将它们所有的合并在此。在其他实施方式中，本发明涵盖通过删除抗体的一个或多个内源性碳水化物部分来修饰本发明的抗体的碳水化合物含量的方法。在特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰邻近于297的位置来移动抗体的Fc区的糖基化位点。在特定的实施方式中，本发明涵盖修饰位置296，从而位置296而不是位置297被糖基化。
5.1具有变异Fc区的多肽和抗体
[00151]本发明部分地基于使用酵母展示系统鉴定具有对不同的FcγR受体的改变的亲合性的、突变的人类IgG1重链Fc区。因而，本发明涉及分子、优选的多肽、更优选的免疫球蛋白(例如，抗体)，其包含在一个或多个区域具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换，但也包括插入或删除)的变异Fc区，所述修饰改变所述变异Fc区对FcγR的亲合性。
[00152]本领域的技术人员将理解的是，除了氨基酸替换之外，本发明预期Fc区氨基酸序列的其他修饰，来产生具有一种或多种改变的性质，例如，改变的效应物功能的Fc区变体。本发明预期删除Fc区的一个或多个氨基酸残基来降低与FcγR的结合。优选的，根据本发明的这个实施方式，不超过5个、不超过10个、不超过20个、不超过30个、不超过50个Fc区残基将被删除。此处包含一个或多个氨基酸删除的Fc区优选的保持了野生型Fc区的至少约80％、和优选的至少约90％、和更优选的至少约95％。在某些实施方式中，维持了所述分子的一种或多种性质，例如，非免疫原性、FcγRIIIA结合、FcγRIIA结合，或这些性质的组合。
[00153]在可选择的实施方式中，本发明涵盖氨基酸插入以产生Fc区变体，所述变体具有改变的性质，包括改变的效应物功能。在一个特定的实施方式中，本发明涵盖将至少一个氨基酸残基，例如一到两个氨基酸残基和优选的不超过10个氨基酸残基导入邻近于在此鉴定的一个或多个Fc区位置。在可选择的实施方式中，本发明进一步涵盖将至少一个氨基酸残基，例如一到两个氨基酸残基和优选的不超过10个氨基酸残基导入邻近于本领域已知影响FcγR相互作用和/或结合的一个或多个Fc区位置。
[00154]本发明进一步涵盖掺入非天然氨基酸来产生本发明的Fc变体。这些方法是本领域技术人员已知的，例如使用天然的生物合成机制来容许将非天然氨基酸掺入到蛋白质中，参见，例如，Wang et al.，2002Chem.Comm.1：1-11；Wang et al.，2001，Science，292：498-500；van Hest et al.，2001.Chem.Comm.19：1897-1904，通过完全引用将它们的每一个合并在此。可选择的策略集中于有关氨基酰基tRNA的生物合成的酶，参见，例如，Tang et al.，2001，J.Am.Chem.123(44)：11089-11090；Kiick et al.，2001，FEBS Lett.505(3)：465，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00155]本发明的分子对FcγR的亲合性和结合性质最初使用本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即，Fc区与FcγR的特异性结合的体外分析(基于生物化学或免疫学的分析)来测定，包括但不限于ELISA分析、表面胞质团共振分析、免测沉淀分析(参见5.2.1节)。优选的，本发明的分子的结合性质也通过用于测定一种或多种FcγR介体效应细胞功能的体外功能性分析来表征(参见5.2.6节)。在最优选的实施方式中，本发明的分子在体内模型(例如，在此描述和公开的那些)中具有与基于体外的分析的那些所类似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的分析中不展现期望的表型、但在体内展现期望的表型的本发明的分子。在附图33中描述了筛选和表征本发明的分子的代表性的流程图。
[00156]本发明涵盖包含以更大的亲合性结合一种或多种FcγR的变异Fc区的分子。如下文讨论的，这种分子优选的更有效地介导效应物功能。在其他实施方式中，本发明涵盖包含以更弱的亲合性结合一种或多种FcγR的变异Fc区的分子。在某些情况下效应物功能的降低或消除是可取的，例如，对于抗体来说，所述抗体的作用机制涉及阻断或拮抗而不是杀死携带目标抗原的细胞。在自体免疫疾病的情况下，其中人体将阻断效应细胞中FcγR活化受体(这种类型的功能将在宿主细胞中呈现)，效应物功能降低或消除将是可取的。一般地，提高的效应物功能将针对肿瘤和外源细胞。
[00157]本发明的Fc变体可以与其他Fc修饰组合，包括但不限于改变效应物功能的那些。本发明涵盖组合本发明的Fc变体与其他Fc修饰来提供抗体或Fc融合物中相加的、协同的、或新的性质。优选的本发明的Fc变体增强它们与之组合的修饰的表型。例如，如果本发明的Fc变体与一种突变体组合，所述突变体已知以比包含野生型Fc区的可比较分子更高亲合性结合FcγRIIIA；与本发明的突变的组合引起在FcγRIIIA亲合性上更大倍数的增强。
[00158]在一个实施方式中，本发明的Fc变体可以与其他已知的Fc变体组合，例如在Duncan et al，1988，Nature 332：563-564；Lund etal.，1991，J.Immunol 147：2657-2662；Lund et al，1992，Mol Immunol29：53-59；Alegre et al，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchinset al.，1995，Proc Natl.Acad Sci U S A 92：11980-11984；Jefferis et al，1995，Immunol Lett.44：111-117；Lund et al.，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis et al，1996，Immunol Lett 54：101-104；Lund et al，1996，JImmunol 157：49634969；Armour et aL，1999，Eur J Immunol29：2613-2624；Idusogie et al，2000，J Immunol 164：41784184；Reddyet al，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol200：16-26；Idusogie et al，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields etal.，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Jefferis et al，2002，ImmunolLett 82：57-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490)；US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572中公开的那些；通过完全引用将它们的每一个合并在此。
[00159]在某些实施方式中，本发明的Fc变体被掺入到包含一种或多种工程化的glycoforms的抗体或Fc融合物中，所述glycoforms即，共价附着于包含Fc区的分子的碳水化物成分，其中所述碳水化物成分化学上不同于包含Fc区的亲本分子的。工程化的glycoforms可以用于各种目的，包括但不限于增强或降低效应物功能。工程化的glycoforms可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用工程化的或变异的表达菌株，通过与一种或多种酶共表达，例如，DI N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶III(GnTI11)，通过在各种有机体或来自各种有机体的细胞系中表达包含Fc区的分子，或通过在已经表达包含Fc区的分子之后修饰碳水化物。产生工程化的glycoforms的方法是本领域已知的，包括但不限于在Umana et al，1999，Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies et al.，20017Biotechnol Bioeng74：288-294；Shields et al，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa et aL，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM technology(Biowa，Inc.Princeton，NJ)；GlycoMAbTMglycosylation engineering technology(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)中描述的那些，通过完全引用将它们的每一个合并在此。参见，例如，WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki et al.，2004，JMB，336：1239-49，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00160]本发明的Fc变体可以为各种性质优化。可以优化的性质包括但不限于增强或降低的对FcγR的亲合性、增强或降低的效应物功能。在优选的实施方式中，本发明的Fc变体被优化以具有对人类活化性FcγR，优选的FcγR、FcγRIIA、FcγRIIc、FcγRIIIA和FcγRIIIB，最优选的FcγRIIIA的增强的亲合性。在可选择的优选的实施方式中，所述Fc变体被优化以具有对人类抑制性受体FcγRIIB的降低的亲合性。这些优选的实施方式是预期的，来提供在人类中具有增强的治疗性质的抗体和Fc融合物，所述治疗性质例如在此描述和例示的增强的效应物功能和更大的抗癌效力。这些优选的实施方式是预期的，来提供在小鼠异种移植肿瘤模型中具有增强的肿瘤消除的抗体和Fc融合物。
[00161]在可选择的实施方式中，本发明的Fc变体被优化以具有对人类FcγR的降低的亲合性，包括但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA和FcγRIIIB。这些实施方式是预期的，来提供在人类中具有增强的治疗性质的抗体和Fc融合物，所述治疗性质例如降低的效应物功能和降低的毒性。
[00162]在可选择的实施方式中，本发明的Fc变体具有增强或降低的对来自非人有机体的FcγR的亲合性，所述非人有机体包括但不限于小鼠、大鼠、兔和猴。优化了与非人类FcγR的结合的Fc变体可以在实验中获得应用。例如，各种疾病的小鼠模型是可获得的，其容许测试一些性质，例如给定药物候选物的效力、毒性和药物动力学。如本领域中已知的，癌细胞可以移植或注射到小鼠中来模拟人类癌症，一种称为异种移植的过程。测试包含为一种或多种小鼠FcγR优化的Fc变体的抗体或Fc融合物，可以提供关于该抗体或Fc融合物的效力、它的作用机制等等的有价值的信息。
[00163]虽然优选的是改变与FcγR的结合，本发明进一步预期具有对新生受体(FcRn)的改变的结合亲合性的Fc变体。虽然不希望局限于特定的作用机制，具有对FcRn的改善的亲合性的Fc区变体预期具有更长的血清半衰期，这种分子将在期望施用的多肽的长半衰期的哺乳动物治疗方法中具有有用的应用，例如，来治疗慢性疾病或失调。虽然不希望局限于特定的作用机制，具有降低的FcRn结合亲合性的Fc区变体，相反地，预期具有较短的半衰期，这样的分子可以，例如，施用给哺乳动物，其中缩短的循环时间可能是有益的，例如，用于体内诊断成像，或用于某些多肽，当留在血流中循环延长的时间时这些多肽具有毒性副作用。具有降低的FcRn结合亲合性的Fc区变体预期不太可能跨越胎盘，因而可以用于孕妇中疾病或失调的治疗。
[00164]在其他实施方式中，这些变体可以与具有改变的FcRn亲合性的其他已知的Fc修饰组合，例如在国际公开No.WO 98/23289和WO 97/34631；和美国专利No.6,277,375中公开的那些，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00165]本发明涵盖用于产生具有提高的体内半衰期的抗体的本领域已知的任何其他方法，例如，通过引入一个或多个氨基酸修饰(即，替换、插入或删除)到IgG恒定区区、或其FcRn结合片段(优选的Fc或铰链-Fc结构域片段)中。参见，例如，国际公开No.WO 98/23289和WO 97/34631；和美国No.6,277,375，通过引用将它们每一个合并在此来与本发明的Fc变体一同使用。进一步的，本发明的抗体可以与白蛋白结合来产生体内更稳定的或具有更长体内半衰期的抗体或抗体片段。这些技术是本领域已知的，参见，例如，国际公开No.WO93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137，和欧洲专利No.EP 413,622，通过完全引用将它们所有的合并在此。
[00166]在此描述的变体可以经受进一步的修饰，常常取决于所述变体的预定用途。这些修饰可以包括进一步改变氨基酸序列(替换、插入和/或删除氨基酸残基)、融合到异源多肽和/或共价修饰。可以在此处公开的产生改变的性质例如改变的Fc受体结合和/或ADCC活性的氨基酸修饰之前、同时地、或随后来进行这种进一步的修饰。
[00167]做为选择或另外地，本发明涵盖组合在此公开的氨基酸修饰和一个或多个进一步的氨基酸修饰，所述进一步的氨基酸修饰如体外或体内测定的改变所述Fc区的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性功能。优选的，在此特别的感兴趣的起始分子通常是结合C1q并显示补体依赖性细胞毒性(CDC)的分子。在此描述的进一步的氨基酸替换一般将用来改变所述起始分子结合C1q的能力或修饰它的补体依赖性细胞毒性功能，例如，来降低和优选的消除这些效应物功能。在其他实施方式中，具有改善的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能、包含在一个或多个描述的位置的替换的分子是此处预期的。例如，起始分子可能不结合C1q和/或介导CDC，可以根据此处的教导被修饰从而获得这些进一步的效应物功能。此外，具有先存的C1q结合活性、任选的进一步具有介导CDC的能力的分子可以被修饰，从而一种或两种这些活性被改变，例如，增强。在某些实施方式中，本发明涵盖具有改变的CDC活性、在C1q结合上没有任何改变的变异Fc区。在另一个实施方式中，本发明涵盖具有改变的CDC活性和改变的C1q结合的变异Fc区。
[00168]为了产生具有改变的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能的Fc区，要修饰的氨基酸位置一般选自位置270、322、326、327、329、331、333和334，其中IgG重链中残基的编号是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(199)中的EU索引。这些氨基酸修饰可以与在此公开的一个或多个Fc修饰组合，来提供在C1q结合和/或CDC活性上的协同或相加的效果。在其他实施方式中，本发明涵盖具有改变的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能的Fc变体，其包含在位置396用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸的氨基酸替换；或在位置396用亮氨酸以及在位置419用组氨酸的氨基酸替换；在位置396用亮氨酸以及在位置370用谷氨酸的氨基酸替换；在位置396用亮氨酸以及在位置240用丙氨酸的氨基酸替换；在位置396用亮氨酸和在位置92用苏氨酸的氨基酸替换；在位置247用亮氨酸和在位置421用赖氨酸的氨基酸替换。本发明涵盖改变C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能的任何已知的Fc区修饰，例如在Idusogie et al.，2001，J.Immunol.166(4)2571-5；Idusogie et al.，J.Immunol.2000164(8)：4178-4184中公开的那些，通过完全引用将它们的每一个合并在此。
[00169]如以上公开的，本发明涵盖具有改变的效应物功能的Fc区，例如，修饰的C1q结合和/或FcR结合以及因而改变的CDC活性和/或ADCC活性。在特定的实施方式中，本发明涵盖具有改善的C1q结合和改善的FcγRIII结合的变异Fc区；例如，具有改善ADCC活性以及改善的CDC活性。在可选择的实施方式中，本发明涵盖具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的变异Fc区。在其他实施方式中，可以仅提高这些活性的一种，任选的也降低另一种活性，例如，来产生具有改善的ADCC活性、但降低的CDC活性的Fc区，反之亦然。
A.具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增强的改变亲合性的突 变
[00170]本发明涵盖包含在一个或多个区域具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区的分子，其中这些修饰改变所述变异Fc区对活化性FcγR的亲合性。在某些实施方式中，本发明的分子包含在一个或多个区域具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性至至少2倍。在另一个特定的实施方式中，本发明的分子包含在一个或多个区域具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性至大于2倍。在本发明的其他实施方式中，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述一个或多个氨基酸修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性至至少3倍、4倍、5倍、6倍、8倍或10倍。在本发明的又一个实施方式中，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述一个或多个氨基酸修饰降低所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性至少至1/3、1/4、1/5、1/6、1/8或1/10。这种倍数增加优选的是通过ELISA或表面胞质团共振分析测定的。在特定的实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不包括或不单独地在位置329、331或322的任一处用任何氨基酸替换。在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不包括或不单独地是在位置256、290、298、312、333、334、359、360或430任何一处的丙氨酸；在位置339用苏氨酸；在位置320用甲硫氨酸；在位置326用丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，在位置334用谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、缬氨酸或亮氨酸的替换。在另一个特定的实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不包括或不单独地是位置280、290、300、294或295的任一处的替换。在另一个更特定的实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不包括或不单独地是在位置300用亮氨酸或异亮氨酸；在位置295用赖氨酸；在位置294用天冬酰胺；在位置298用缬氨酸；天冬氨酸脯氨酸，天冬酰胺或缬氨酸；在位置280用组氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；在位置290用丝氨酸、甘氨酸、theonine或酪氨酸的替换。
[00171]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIA，条件是所述变异Fc区不具有在位置256、290、326、255、258、267、272、276、280、283、285、286、331、337、268、272或430的任一处的丙氨酸；位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；位置290的丝氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的赖氨酸；位置335的谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。在特定的实施方式中，本发明的分子包含在一个或多个区域具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰将所述变异Fc区对FcγRIIA的亲合性提高到至少2倍。在另一个特定的实施方式中，本发明的分子包含在一个或多个区域中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰将所述变异Fc区对FcγRIIA的亲合性提高到大于2倍。在本发明的其他实施方式中，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述一个或多个氨基酸修饰将所述变异Fc区对FcγRIIA的亲合性提高到至少3倍、4倍、5倍、6倍、8倍或10倍。
[00172]在特定的实施方式中，本发明涵盖分子、优选的多肽、更优选的免疫球蛋白(例如，抗体)，包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换，但也包括插入或删除)的变异Fc区，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少150％和至少200％。
[00173]在特定的实施方式中，提高所述变异Fc区的亲合性的所述一个或多个氨基酸修饰包含在位置347用组氨酸以及在位置339用缬氨酸替换；或在位置425用异亮氨酸以及在位置215用苯丙氨酸替换；或在位置408用异亮氨酸、在位置215用异亮氨酸以及在125用亮氨酸替换；或在位置385用谷氨酸以及在位置247用组氨酸替换；或在位置348用甲硫氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置275用异亮氨酸、在位置202用甲硫氨酸以及在位置147用苏氨酸替换；或在位置275用异亮氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置348用甲硫氨酸替换；或在位置279用亮氨酸以及在位置395用丝氨酸替换；或在位置246用苏氨酸以及在位置319用苯丙氨酸；或在位置243用异亮氨酸以及在位置379用亮氨酸；或在位置243用亮氨酸、在位置255用亮氨酸以及在位置318用赖氨酸替换；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换；或在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；或在位置334用谷氨酸以及在位置380用天冬氨酸替换；或在位置256用丝氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置334用谷氨酸以及在位置390用丝氨酸替换；或在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用缬氨酸、在位置394用甲硫氨酸以及在位置424用亮氨酸替换；或在位置233用天冬氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置366用丝氨酸以及在位置386用精氨酸替换；或在位置246用苏氨酸以及在位置396用组氨酸替换；或在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替换；或在位置288用天冬酰胺、在330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置244用组氨酸、在位置358用甲硫氨酸、在位置379用甲硫氨酸、在位置384用赖氨酸以及在397用甲硫氨酸替换；或在位置217用丝氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置408用精氨酸替换；或在位置247用亮氨酸、在位置253用天冬酰胺以及在位置334用天冬酰胺替换；或在位置246用异亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替换；或在位置320用谷氨酸以及在位置326用谷氨酸替换；或在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。引起体外对FcγRIIIA的增强的亲合性的其他氨基酸替换的实例在以下公开，并在表5中概述。
[00174]本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置243用异亮氨酸和在位置379用亮氨酸替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约1.5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置243用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约1倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约1.5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约3倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约1.5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置315用异亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约1倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置243用异亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约2.5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置247用亮氨酸以及在位置421用赖氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约3倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约4.5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置293用缬氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用苏氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约1.5倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约2倍的亲合性结合FcγRIIIA。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含在位置319用苯丙氨酸、在352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸的替换，从而如ELISA分析所测定的，所述分子以包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA约2倍的亲合性结合FcγRIIIA。
[00175]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置396用组氨酸替换。在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置248用甲硫氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以同包含野生型Fc区的可比较多肽类似的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置392用精氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以同包含野生型Fc区的可比较多肽类似的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置315用异亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以同包含野生型Fc区的可比较多肽类似的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置132用异亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以同包含野生型Fc区的可比较多肽类似的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置162用缬氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置396用亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置379用甲硫氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置219用酪氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置282用甲硫氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置401用缬氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置222用天冬酰胺替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置334用谷氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置377用苯丙氨酸(phenylalaine)替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置334用异亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置247用亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置326用谷氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置372用酪氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置224用亮氨酸替换。
[00176]本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置275用酪氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置398用缬氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置334用天冬酰胺替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置400用脯氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置407用异亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置372用酪氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以同包含野生型Fc区的可比较多肽类似的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置366用天冬酰胺替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽降低的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置414用天冬酰胺替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽降低的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置225用丝氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽降低的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置377用天冬酰胺替换。
[00177]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更高1倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置379用甲硫氨酸替换。在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1.5倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置248用甲硫氨酸替换。
[00178]在某些实施方式中，本发明的分子具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的改变的亲合性，如使用本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即，Fc区与FcγR的特异性结合的体外分析(基于生物化学或免疫学的分析)所测定的，包括但不限于ELISA分析、表面胞质团共振分析、免测沉淀法分析(参见5.2.1节)。优选的，具有对活化性FcγR受体的改变的亲合性的这些分子的结合性质也与它们的活性相关，如用于测定一种或多种FcγR介体效应细胞功能(参见5.2.6节)的体外功能性分析所测定的，例如，具有对FcγRIIIA增强的亲合性的变异Fc区的分子具有增强的ADCC活性。在最优选的实施方式中，在体外分析中具有对活化性Fc受体，例如FcγRIIIA的改变的结合性质的本发明的分子也在体内模型(例如在此描述和公开的那些)中具有改变的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的分析中不展现改变的FcγR结合、但在体内展现期望的表型的本发明的分子。
B.具有对FcγRIIIA的增强的亲合性以及对FcγRIIB降低的或 无亲合性的突变体
[00179]在特定的实施方式中，本发明的分子包含在一个或多个区域中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，替换)的变异Fc区，相对于以野生型亲合性结合FcγRIIIA和FcγRIIB的包含野生型Fc区的可比较分子，所述一种或多种修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性并降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性，在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰不包括或不单独地是在位置256、298、333、334、280、290、294、298或296的任何一处的丙氨酸替换；或在位置298用天冬酰胺、缬氨酸、天冬氨酸或脯氨酸替换；或用丝氨酸替换290。在某些氨基实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％，并降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％。
[00180]在特定的实施方式中，如使用携带变异Fc区的ch-4-4-20抗体根据ELISA分析和/或基于ADCC的分析所测定的，所述变异Fc区具有对FcγRIIIA的增强的亲合性以及对FcγRIIB的降低的亲合性或无亲合性，包含所述变异Fc区的本发明的分子包含以下任何的替换，位置275用异亮氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置348用甲硫氨酸；或在位置279用亮氨酸以及在位置395用丝氨酸替换；或在位置246用苏氨酸以及在位置319用苯丙氨酸替换；或在位置243用亮氨酸、在位置255用亮氨酸以及在位置318用赖氨酸替换；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换；或在位置334用谷氨酸以及在位置380用天冬氨酸替换；或在位置256用丝氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置334用谷氨酸以及在位置390用丝氨酸替换；或在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用缬氨酸、在位置394用甲硫氨酸以及在位置424用亮氨酸替换；或在位置233用天冬氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置366用丝氨酸以及在位置386用精氨酸替换；或在位置312用谷氨酸、在位置327用天冬酰胺以及在位置378用丝氨酸替换；或在位置288用天冬酰胺以及在位置326用天冬酰胺替换；或在位置247用亮氨酸以及在位置421用赖氨酸替换；或在位置298用天冬酰胺以及在位置381用精氨酸替换；或在位置280用谷氨酸、在位置354用苯丙氨酸、在位置431用天冬氨酸以及在位置441用异亮氨酸替换；或在位置255用谷氨酰胺以及在位置326用谷氨酸替换；或在位置218用精氨酸、在位置281用天冬氨酸以及在位置385用精氨酸替换；或在位置247用亮氨酸、在位置330用苏氨酸以及在位置440用甘氨酸替换；或在位置284用丙氨酸以及在位置372用亮氨酸替换，或在位置335用天冬酰胺、在位置387用丝氨酸以及在位置435用谷氨酰胺替换；或在位置247用亮氨酸、在位置431用缬氨酸以及在位置442用苯丙氨酸替换。
[00181]在特定的实施方式中，如使用携带变异Fc区的ch-4-4-20抗体根据ELISA分析和/或基于ADCC的分析所测定的，所述变异Fc区具有对FcγRIIIA的增强的亲合性以及对FcγRIIB的降低的亲合性或无亲合性，包含所述变异Fc区的本发明的分子包含在位置379用甲硫氨酸；在位置219用酪氨酸；在位置282用甲硫氨酸；在位置401用缬氨酸；在位置222用天冬酰胺；在位置334用异亮氨酸；位置334用谷氨酸；在位置275用酪氨酸；在位置398用缬氨酸替换。
[00182]本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/3的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置288用天冬酰胺，在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/10-15的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置316用天冬酰胺，在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/10倍的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置315用异亮氨酸，在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/7的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置243用异亮氨酸，在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/3的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。本发明涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/5的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替换。本发明还涵盖包含变异Fc区的分离的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而如ELISA分析所测定的，所述多肽以包含野生型Fc区的可比较多肽约1/2的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。
C.具有对FcγRIIIA和FcγRIIB增强的亲合性的突变体
[00183]本发明涵盖具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIIA和FcγRIIB的亲合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％，并且降低所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％。在特定的实施方式中，包含具有对FcγRIIIA增强的亲合性和对FcγRIIB增强的亲合性的变异Fc区的本发明的分子(如使用携带在此描述的变异Fc区的ch-4-4-20根据ELISA分析和/或基于ADCC的分析所测定的)包含在位置415用异亮氨酸以及在位置251用苯丙氨酸替换；或在位置399用谷氨酸、在位置292用亮氨酸以及在位置185用甲硫氨酸替换；或在位置408用异亮氨酸、在位置215用异亮氨酸以及在位置125用亮氨酸替换；或在位置385用谷氨酸以及在位置247用组氨酸替换；或在位置348用甲硫氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置275用异亮氨酸、在位置202用甲硫氨酸以及在位置147用苏氨酸替换；或在位置246用苏氨酸以及在位置396用组氨酸替换；或在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替换；或在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置224用组氨酸、在位置358用甲硫氨酸、在位置379用甲硫氨酸、在位置384用赖氨酸以及在位置397用甲硫氨酸替换；或在位置217用丝氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置408用精氨酸替换；或在位置247用亮氨酸、在位置253用天冬酰胺以及在位置334用天冬酰胺替换；或在位置246用异亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替换；或在位置320用谷氨酸以及在位置326用谷氨酸替换；或在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置343用丝氨酸、在位置353用亮氨酸、在位置375用异亮氨酸、在位置383用天冬酰胺替换；或在位置394用甲硫氨酸以及在位置397用甲硫氨酸替换；或在位置216用天冬氨酸、在位置345用赖氨酸以及在位置375用异亮氨酸替换；或在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置247用亮氨酸亮氨酸以及在位置389用甘氨酸替换；或在位置222用天冬酰胺、在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置394用甲硫氨酸替换；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换；或在位置315用异亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置394用甲硫氨酸替换；或在位置290用苏氨酸以及在位置371用天冬氨酸替换；或在位置247用亮氨酸以及在位置398用谷氨酰胺替换；或在位置326用谷氨酰胺；在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换；或在位置247用亮氨酸以及在位置377用苯丙氨酸替换；或在位置378用缬氨酸、在位置390用异亮氨酸以及在位置422用异亮氨酸替换；或在位置326用谷氨酸以及在位置385用谷氨酸替换；或在位置282用谷氨酸、在位置369用异亮氨酸以及在位置406用苯丙氨酸替换；或在位置397用甲硫氨酸；在位置411用丙氨酸以及在位置415用天冬酰胺替换；或在位置223用异亮氨酸、在位置256用丝氨酸以及在位置406用苯丙氨酸替换；或在位置298用天冬酰胺以及在位置407用精氨酸替换；或在位置246用精氨酸、在位置298用天冬酰胺以及在位置377用苯丙氨酸替换；或在位置235用脯氨酸、在位置382用甲硫氨酸、在位置304用甘氨酸、在位置305用异亮氨酸以及在位置323用异亮氨酸替换；或在位置247用亮氨酸、在位置313用精氨酸以及在位置388用甘氨酸替换；或在位置221用酪氨酸、在位置252用异亮氨酸、在位置330用甘氨酸、在位置339用苏氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置422用异亮氨酸以及在位置433用亮氨酸替换；或在位置258用天冬氨酸以及在位置384用赖氨酸替换；或在位置241用亮氨酸以及在位置258用甘氨酸替换；或在位置370用天冬酰胺以及在位置440用天冬酰胺替换；或在位置317用天冬酰胺替换以及在位置423删除；或在位置243用异亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换；或在位置227用丝氨酸以及在位置290用谷氨酸替换；或在位置231用缬氨酸、在位置386用组氨酸以及在位置412用甲硫氨酸替换；或在位置215用脯氨酸、在位置274用天冬酰胺、在位置287用甘氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置365用缬氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置293用缬氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用苏氨酸替换；或在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置290用苏氨酸、在位置390用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置326用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置268用天冬氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置210用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置358用脯氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置288用精氨酸、在位置307用丙氨酸、在位置344用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置273用异亮氨酸、在位置326用谷氨酸、在位置328用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置326用异亮氨酸、在位置408用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置334用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置379用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置227用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置217用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置261用天冬酰胺、在位置210用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置419用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置242用苯丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置255用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置240用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置250用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置247用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置410用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置419用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置427用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置258用天冬氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置384用赖氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置323用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置244用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置305用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置400用苯丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置303用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置243用亮氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置290用谷氨酸、在位置369用丙氨酸、在位置393用丙氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置210用天冬酰胺、在位置222用异亮氨酸、在位置320用甲硫氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置217用丝氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置309用亮氨酸、在位置390用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置246用天冬酰胺；在位置419用精氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置217用丙氨酸、在位置359用丙氨酸以及位置396用亮氨酸替换；或在位置215用异亮氨酸、在位置290用缬氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置275用亮氨酸、在位置362用组氨酸、在位置384用赖氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置334用天冬酰胺替换；或在位置400用脯氨酸替换；或在位置407用异亮氨酸替换；或在位置372用酪氨酸替换；或在位置366用天冬酰胺替换；或在位置414用天冬酰胺替换；或在位置352用亮氨酸替换；或在位置225用丝氨酸替换；或在位置377用天冬酰胺替换；或在位置248用甲硫氨酸替换。
D.不结合任何FcγR的突变
[00184]在某些实施方式中，本发明涵盖包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，如本领域已知和在此公开的标准分析所测定的，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述变异Fc区不结合任何FcγR。在特定的实施方式中，所述消除与所有FcγR的结合的一个或多个氨基酸修饰包含在位置232用丝氨酸以及在位置304用甘氨酸替换；或在位置269用赖氨酸、在位置290用天冬酰胺、在位置311用精氨酸以及在位置433用酪氨酸替换；或在位置252用亮氨酸替换；或在位置216用天冬氨酸、在位置334用精氨酸以及在位置375用异亮氨酸替换；或在位置247用亮氨酸以及在位置406用苯丙氨酸替换，或在位置335用天冬酰胺、在位置387用丝氨酸以及在位置435用谷氨酰胺替换；或在位置334用谷氨酸、在位置380用天冬氨酸以及在位置446用缬氨酸替换；或在位置303用异亮氨酸、在位置369用苯丙氨酸以及在位置428用亮氨酸替换；或在位置251用苯丙氨酸以及在位置372用亮氨酸替换；或在位置246用谷氨酸、在位置284用甲硫氨酸以及在位置308用丙氨酸替换；或在位置399用谷氨酸以及在位置402用天冬氨酸替换；或在位置399用谷氨酸以及在位置428用亮氨酸替换。
D.具有改变的FcγR介导的效应物功能的突变
[00185]本发明涵盖包含具有改变的效应物功能的Fc变体的免疫球蛋白。在某些实施方式中，包含Fc变体的免疫球蛋白在存在效应细胞时更有效地介导效应物功能，如使用本领域已知和在此例示的分析所测定的。在其他实施方式中，包含Fc变体的免疫球蛋白在存在效应细胞时更低效地介导效应物功能，如使用本领域已知和在此例示的分析所测定的。在特定的实施方式中，本发明的Fc变体可以与改变效应物功能的其他已知的Fc修饰组合，从而这种组合具有相加的、协同的效果。本发明的Fc变体具有体外和/或体内的改变的效应物功能。
[00186]在特定的实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有增强的FcγR介导的效应物功能，如使用在此公开的ADCC活性分析所测定的。可以由本发明的分子介导的效应物功能的实例包括但不限于，C1q结合、补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用，等等。本发明的分子的效应物功能可以使用本领域已知的标准方法来分析，所述方法的实例在5.2.6节中公开。在特定的实施方式中，包含具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增强的亲合性的变异Fc区的本发明的免疫球蛋白比包含野生型Fc区的免疫球蛋白更有效1倍地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在其他实施方式中，包含具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的变异Fc区的本发明的免疫球蛋白以包含野生型Fc区的免疫球蛋白的至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少104倍、至少105倍的有效性介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另一个特定的实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有改变的C1q结合活性。在某些实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有包含野生型Fc区的免疫球蛋白的至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少104倍、至少105倍的C1q结合活性。在又一个特定的实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有改变的补体依赖性细胞毒性。在又一个特定的实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有比包含野生型Fc区的免疫球蛋白增强的补体依赖性细胞毒性。在某些实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有包含野生型Fc区的免疫球蛋白的至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少104倍、至少105倍的补体依赖性细胞毒性。
[00187]在其他实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有相对于包含野生型Fc区的免疫球蛋白增强的吞噬作用活性，如本领域技术人员已知的或在此公开的标准分析所测定的。在某些实施方式中，具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA增强的亲合性的本发明的免疫球蛋白具有相对于包含野生型Fc区的免疫球蛋白至少2倍、至少4倍、至少8倍、至少10倍的吞噬作用活性。
[00188]在特定的实施方式中，本发明涵盖包含具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区的、具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增强的亲合性的免疫球蛋白，从而所述免疫球蛋白具有增强的效应物功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或吞噬作用。在特定的实施方式中，所述提高变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性并且提高免疫球蛋白的ADCC活性的一个或多个氨基酸修饰包含在位置379用甲硫氨酸替换；或在位置243用异亮氨酸以及在位置379用亮氨酸替换；或在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置243用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸替换；或在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换；或在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；或在位置334用谷氨酸以及在位置292用亮氨酸替换；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换；或在位置315用异亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸替换；或在位置243用异亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换；或在位置247用亮氨酸以及在位置421用赖氨酸替换；或在位置248用甲硫氨酸替换；或在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置293用缬氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用苏氨酸替换；或在位置268用asapragine以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。
[00189]在另一个特定的实施方式中，提高免疫球蛋白的ADCC活性的所述一个或多个氨基酸修饰是以下表7中列出的突变的任何一个。
表7.提高ADCC的氨基酸修饰
| E333A，K334A |
| R292L，K334E |
| V379M |
| S219Y |
| V282M |
| K222N |
| F243I，V379L |
| F243L，R255L，E318K |
| K334I |
| K334E，T359N，T366S |
| K288M，K334E |
| K288N，A330S，P396L |
| K326E |
| G316D，A378V，D399E |
| N315I，V379M，T394M |
| F243I，V379L，G420V |
| E293V，Q295E，A327T |
| Y319F，P352L，P396L |
| K392T，P396L |
| K248M |
| H268N，P396L |
| K290T，N390I，P396L |
| K326I，P396L |
| H268D，P396L |
| K210M，P396L |
| L358P，P396L |
| K288R，T307A，K344E，P396L |
| V273I，K326E，L328I，P396L |
| K326I，S408N，P396L |
| K334N，P396L |
| V379M，P396L |
| P227S，P396L |
| P217S，P396L |
| K261N，K210M，P396L |
| Q419H，P396L |
| K370E，P396L |
| L242F，P396L |
| F243L，V305I，A378D，F404S，P396L |
| R255L，P396L |
| V240A，P396L |
| T250S，P396L |
| P247S，P396L |
| K290E，V369A，T393A，P396L |
| K210N，K222I，K320M，P396L |
| L410H，P396L |
| Q419L，P396L |
| V427A，P396L |
| P217S，V305I，I309L，N390H，P396L |
| E258D，P396L |
| N384K，P396L |
| V323I，P396L |
| K246N，Q419R，P396L |
| P217A，T359A，P396L |
| P244H，P396L |
| V215I，K290V，P396L |
| F275L，Q362H，N384K，P396L |
| V305L，P396L |
| S400F，P396L |
| V303I，P396L |
| D270E，G316D，R416G |
| P247L，N421K |
| P247L，N421K，D270E |
| Q419H，P396L，D270E |
| K370E，P396L，D270E |
| R255L，P396L，D270E |
| V240A，P396L，D270E |
| K392T，P396L，D270E |
[00190]做为选择或另外地，将上述氨基酸修饰或任何在此公开的氨基酸修饰与改变Fc区的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性功能的一个或多个进一步的氨基酸修饰组合可能是有用的。在此特别的感兴趣的起始分子通常是结合C1q并显示补体依赖性细胞毒性(CDC)的分子。在此描述的进一步的氨基酸替换一般将用来改变所述起始分子结合C1q的能力或修饰它的补体依赖性细胞毒性功能，例如，来降低和优选的消除这些效应物功能。然而，具有改善的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能、包含在一个或多个描述的位置的替换的分子是此处预期的。例如，起始分子可能不结合C1q和/或介导CDC，可以根据此处的教导被修饰从而获得这些进一步的效应物功能。此外，具有先存的C1q结合活性、任选的进一步具有介导CDC的能力的分子可以被修饰，从而一种或两种这些活性被增强。
[00191]如以上公开的，可以设计具有改变的效应物功能的Fc区，例如，通过修饰C1q结合和/或FcR结合以及因而改变CDC活性和/或ADCC活性。例如，可以产生具有改善的C1q结合和改善的FcγRIII结合的变异Fc区；例如，具有改善ADCC活性以及改善的CDC活性。做为选择，当期望降低或消除效应物功能时，可以工程化具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的变异Fc区。在其他实施方式中，可以仅提高这些活性的一种，任选的也降低另一种活性，例如，来产生具有改善的ADCC活性、但降低的CDC活性的Fc区，反之亦然。
[00192]本发明涵盖Fc区的特定变体，其是使用本发明的方法在第2-第4轮分选之后从突变体的酵母库中鉴定的，在表8中列出。表8概述了使用本发明的方法鉴定各种突变体。使用ELISA分析来分析突变体用于测定与FcγRIIIA和FcγRIIB的结合。通过使用在此公开和例示的方法将Fc变体克隆到4-4-20抗体中，还在ADCC分析中测试了这些突变体。粗体的项目是指一些实验，在其中在ADCC分析之前纯化了ch4-4-20。使用的抗体浓度在0.5μg/mL-1.0μg/mL的范围。
[00193]在优选的实施方式中，本发明提供具有变异Fc区的修饰的免疫球蛋白分子(例如，抗体)，所述变异Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰提高所述分子对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。这种免疫球蛋白包括天然地含有FcγR结合区(例如，FcγRIIIA和/或FcγRIIB结合区)的IgG分子，或已经被工程化以含有FcγR结合区(例如，FcγRIIIA和/或FcγRIIB结合区)的免疫球蛋白衍生物。本发明的修饰的免疫球蛋白包括任何免疫球蛋白分子，如通过本领域公知用于分析特异性抗原-抗体结合的免疫分析所测定的，所述免疫球蛋白分子结合，优选的免疫特异性地结合，即，竞争排除非特异性结合，抗原，并且含有FcγR结合区(例如，FcγRIIIA和/或FcγRIIB结合区)。这种抗体包括但不限于，多克隆的、单克隆的、双特异性的、多特异性的、人类的、人源化的、嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫化物连接的Fvs、以及含有VL或VH结构域乃至特异性结合抗原的互补决定区(CDR)、在某些情况下被工程化以含有或融合到FcγR结合区的片段。
[00194]在某些实施方式中，本发明的分子包含Fc区的部分。如在此使用的，术语“Fc区的部分”是指Fc区的片段，优选的具有效应物活性和/或FcγR结合活性的部分(或缺乏这种活性的突变体的可比较区域)。Fc区的片段大小可以从5个氨基酸到完整Fc区减去一个氨基酸。Fc区的部分可以从N-末端或C-末端缺少多达10、多达20、多达30个氨基酸。
[00195]本发明的IgG分子优选的是IgG的IgG1子类，但也可以是给定动物的任何其他IgG子类。例如，在人类中，IgG种类包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；小鼠IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。
[00196]免疫球蛋白(和在此使用的其他多肽)可以来自任何动物来源，包括鸟类以及哺乳动物。优选的，所述抗体是人类、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的。如在此使用的，“人类抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并包括从人免疫球蛋白库或从为了一个或多个人免疫球蛋白转基因并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如在下文以及例如Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598中描述的。
[00197]本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性的，或更大的多特异性的。多特异性抗体可以特异于多肽的不同表位，或可以特异于异源表位，例如，异源多肽或固相支持材料。参见，例如PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，et al.，J.Immunol.，147：60-69，1991；U.S.Patent Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.，148：1547-1553，1992。
[00198]多特异性抗体具有对至少两个不同抗原的结合特异性。虽然这些分子通常将仅结合两种抗原(即，双特异性抗体，BsAbs)，具有额外的特异性的抗体，例如三特异性抗体被本发明涵盖。BsAbs的实例无限制地包括具有针对肿瘤细胞抗原的一个臂和针对细胞毒分子的另一个臂的那些。
[00199]制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产是根据共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature，305：537-539(1983)；通过完全引用将它合并在此。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10个不同抗体分子的潜在混合物，在其中仅有一个具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化，是相当繁琐的，产物产率很低。在WO 93/08829和在Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)中公开了类似的步骤。
[00200]根据不同的方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选的是与免疫球蛋白重链恒定区融合，至少包含铰链、CH2和CH3区域的部分。具有包含为轻链结合所必需的位点的第一个重链恒定区(CH1)是优选的，存在于至少一个所述融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA、和如果期望的编码免疫球蛋白轻链的DNA，插入到独立的表达载体中，共转染到适合的宿主生物中。当用于构建时三个多肽链的不等比例提供了最适的产量时，在实施方式中这为调整所述三个多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等的比例表达导致高产量时，或当所述比例没有特别的意义时，有可能将两个或全部三个多肽链编码序列插入到一个表达载体中。
[00201]在这个方法的优选实施方式中，所述双特异性抗体由在一条臂上具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链、和在另一条臂上的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。据发现，这个不对称的结构便于从不需要的免疫球蛋白链结合物中离期望的双特异性化合物，在仅半个所述双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离路线。在WO 94/04690中公开了这个方法。产生双特异性抗体的进一步细节，参见，例如，Suresh等，Methods in Enzymology121：210(1986)。根据在WO 96/27011中描述的另一种方法，可以工程化抗体分子的配对来最大化从重组细胞培养物中回收异二聚物的百分比。优选的接触面至少包含抗体恒定区的CH3区的一部分。在这个方法中，来自第一抗体分子的接触面的一个或多个小的氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的接触面上产生与大的侧链相同或类似大小的补偿“腔”。这提供了一种相对其他不需要的终产物，例如同型二聚体、用于增加异二聚体的产量的机制。
[00202]双特异性抗体包括交联的或“异共轭的”抗体。例如，在异共轭物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白联结，另一个与生物素联结。这种抗体已经，例如，用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO92/200373和EP 03089)。可以利用任何方便的交联方法来制造异共轭物抗体。适合的交联剂是本领域公知的，在美国专利No.4,676,980中随同许多交联技术一起被公开。
[00203]具有超过两个化合价的抗体是期待的。例如，可以利用化学连接来制备三特异性抗体。参见，例如，Tutt et al.J.Immunol.147：60(1991)，通过引用将它合并在此。
[00204]本发明的抗体包括另外修饰的衍生物，即，通过共价附着任何类型的分子到抗体上，从而共价附着不阻碍抗体结合抗原和/或产生抗同种型反应。例如，而不是限制，抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞配体或其他蛋白，等等。可以通过已知的技术进行各种化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等。此外，衍生物可以含有一种或多种非典型的氨基酸。
[00205]对于某些应用，包括在人类中抗体的体内使用和体外检测分析，使用嵌合的、人源化的或人类抗体是优选的。嵌合抗体是一种分子，其中抗体不同的部分来自不同的动物物种，例如，具有来自鼠单克隆抗体的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如Morrison，Science，229：1202，1985；Oi et al.，BioTechniques，4：2141986；Gillies et al.，J.Immunol.Methods，125：191-202，1989；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，通过完全引用将它们合并在此。人源化抗体是来自非人类物种、结合期望的抗原的抗体分子，具有来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的骨架区和恒定区。通常，人类骨架区中的骨架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基替换，来改变，优选的改善抗原结合。这些骨架替换通过本领域公知的方法来鉴别，例如，通过对CDR和骨架残基的相互作用建模来鉴定对于抗原结合重要的骨架残基，和通过序列比较来鉴定特定位置不寻常的骨架残基。参见，例如Queen et al.，美国专利No.5,585,089；Riechmannet al.，Nature，332：323，1988，通过完全引用将它们合并在此。可以使用本领域已知的各种技术将抗体人源化，包括，例如，CDR移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101和5,585,089)，veneering或resurfacing(EP 592,106；EP519,596；Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498，1991；Studnicka et al.，Protein Engineering，7(6)：805-814，1994；Roguskaet al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91：969-973，1994)，和链shuffling(美国专利No.5,565,332)，通过完全引用将它们所有的合并在此。可以使用在美国专利No.5,693,762(Protein Design Labs)、5,693,761、(Protein Design Labs)5,585,089(Protein Design Labs)、6,180,370(Protein Design Labs)和美国公开No.20040049014、200300229208中公开的任何方法来产生人源化抗体，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00206]完全的人类抗体是用于人类患者的治疗特别优选的。人类抗体可以通过本领域已知的各种方法产生，包括如上所述使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体显示方法。参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00207]也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人类抗体。对于生产人类抗体的这种技术的综述，参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，13：65-93，1995。对于生产人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术和生产这种抗体的方案的详细论述，参见，例如PCT公开WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735、欧洲专利No.0598877、美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598，通过完全引用将它们合并在此。此外，可以请例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)、Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)的公司使用类似上述的技术来提供针对选定抗原的人类抗体。
[00208]可以使用称为“指导选择(guided selection)”的技术来产生识别选定表位的完全的人类抗体。在这种方法中，选定的非人类单克隆抗体，例如，小鼠抗体，被用于指导识别相同表位的完全人类抗体的选择(Jespers et al.，Bio/technology，12：899-903，1988)。
[00209]本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基在Fc区中工程化人类或人源化的治疗抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在另一个实施方式中，本发明涵盖通过修饰至少一个氨基酸残基在Fc区中工程化人类或人源化的治疗抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性并且进一步降低所述Fc区对FcγRIIB的亲合性。工程化的治疗性抗体可以进一步具有增强的效应物功能，例如，增强的ADCC活性、吞噬作用活性等等，如本领域技术人员已知的标准分析所测定的。
[00210]在特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化特异于Her2/neu原癌基因的人源化单克隆抗体(例如，如Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-9中公开的Ab4D5人源化抗体)，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在另一个特定的实施方式中，修饰人源化Her2/neu单克隆抗体也可以进一步降低所述Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，特异于Her2/neu的工程化的人源化单克隆抗体可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。
[00211]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化小鼠人类嵌合抗CD20单克隆抗体2H7，所述修饰提高所述Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。在另一个特定的实施方式中，修饰抗CD20单克隆抗体2H7也可以进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，工程化的抗CD20单克隆抗体2H7可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。
[00212]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化抗FcγRIIB抗体，所述抗FcγRIIB抗体包括但不限于在2002年8月12日提交的美国临时申请No.60/403,266和2003年8月14日提交的、具有AttorneyDocket No.011183-010-999美国申请No.10/643,857，2004年4月16日提交的美国临时申请No.60/562,804(具有Attorney Docket No.011183-014-888)；2004年5月10日提交的美国临时申请No.60/569,882(具有Attorney Docket No.011183-013-888)和在2004年6月21日提交的具有Attorney Docket Nos.011183-016-888、011183-017-888和011183-018-888的美国临时申请Nos.____中公开的任何抗体，所述修饰提高Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。通过完全引用将上述申请的每一个合并在此。可以根据本发明的方法工程化的抗FcγRIIB抗体的实例是具有ATCC登记号PTA-4591的2B6单克隆抗体和具有ATCC登记号PTA-4592的3H7、具有ATCC登记号PTA-5958的1D5单克隆抗体、具有ATCC登记号PTA-5959的1F2单克隆抗体、具有ATCC登记号PTA-5960的2D11单克隆抗体、具有ATCC登记号PTA-5961的2E1单克隆抗体和具有ATCC登记号PTA-5962的2H9单克隆抗体(所有的都保藏在10801University Boulevard，Manassas，VA 02209-2011)，通过引用将它们合并在此。在另一个特定的实施方式中，修饰抗FcγRIIB抗体也可以进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，工程化的抗FcγRIIB抗体可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。在特定的实施方式中，2B6单克隆抗体包含在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、以及在位置366用丝氨酸替换(MgFc13)；或在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换(MgFc27)；或在位置243用异亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换(MgFc29)；或在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc38)；或在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用组氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用aspartic(MgFc42)；或在位置410用组氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc53)；或在位置243用亮氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc54)；或在位置255用异亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc55)；或在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换(MgFc59)(参见表5)。
1.1.1多肽和抗体结合
[00213]包含变异Fc区的本发明的分子(即，多肽，抗体)可以重组地融合或化学地结合(包括共价和非共价结合)到异源多肽(即，无关的多肽；或其部分，优选的所述多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸)来产生融合蛋白。融合不一定需要是直接的，可以通过接头序列来发生。
[00214]进一步的，包含变异Fc区的本发明的分子(即，多肽，抗体)可以结合到修饰给定的生物反应的治疗试剂或药物部分。治疗试剂或药物部分不应被认为限于标准的化学治疗试剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性蛋白质或多肽。这些蛋白质可以包括，例如，毒素，例如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)或白喉毒素、篦麻毒素、gelonin和商陆抗病毒蛋白，蛋白质，例如肿瘤坏死因子、干扰素，包括但不限于α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、细胞凋亡试剂(例如TNF-α、TNF-β、AIM I，如PCT公开No.WO97/33899中公开的)、AIM II(参见，PCT公开No.WO97/34911)、Fas配体(Takahashi et al.，J.Immunol.，6：1567-1574，1994)和VEGI(PCT公开No.WO99/23105)、血栓试剂或抗血管生成试剂(例如，angiostatin或endostatin)，或生体应答修饰物，例如，淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生长因子(例如，生长激素(“GH”)；蛋白酶或核酸酶。
[00215]本发明的分子(即，多肽，抗体)可以融合到标记物序列，例如肽来便于纯化。在优选的实施方式中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在特别是pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的tag，它们的许多是商业上可获得的。例如，如Gentz et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824中描述的，六组氨酸提供了纯化融合蛋白的便利。对纯化有用的其他肽tag包括但不限于，血球凝集素“HA”tag，其相应于来自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson et al.，Cell，37：7671984)，和“flag”tag(Knappik et al.，Biotechniques，17(4)：754-761，1994)。
[00216]通过基因shuffling、基序shuffling、外显子shuffling和/或密码子shuffling(共同称为“DNA shuffling”)的技术，可以产生其他的融合蛋白。可以采用DNA shuffling来改变本发明的分子的活性(例如，具有更高亲合性和更低离解速率的抗体)。参见，一般地，美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458，和Patten et al.，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16：76；Hansson，et al.，1999，J.Mol.Biol.287：265；以及Lorenzo and Blasco，1998，BioTechniques 24：308(通过完全引用将专利和出版物的每一个合并在此)。包含变异Fc区的本发明的分子，或编码本发明的分子的核酸，可以通过error-pronePCR、随机核苷酸插入或其他先于重组的方法经历随机诱变来进一步改变。编码本发明的分子的多核苷酸的一个或多个部分可以与一种或多种异源分子的一个或多个成分、基序、段、部分、结构域、片段等等重组。
[00217]本发明还涵盖与诊断或治疗试剂或期望提高血清半衰期和/或靶向特定细胞子集的任何其他分子结合的、包含变异Fc区的本发明的分子(即，抗体，多肽)。本发明的分子可以诊断性地使用，例如，作为临床试验过程的部分来监视疾病、失调或感染的发展或进展，例如，来确定给定治疗方式的效力。通过将本发明的分子与可检测物质联结可以使检测便利化。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性物质、正电子发射金属和非放射性的顺磁性金属离子。可检测物质可以使用本领域已知的技术直接地或通过中间物(例如，本领域已知的接头)间接地联结或结合到本发明的分子。参见，例如，美国专利No.4,741,900关于可以结合到抗体用作根据本发明的诊断的金属离子。这种诊断和检测可以通过将本发明的分子联结到可检测物质来实现，所述可检测物质包括但不限于各种酶，酶包括但不限于，辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物，例如但不限于，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、二氯三嗪基胺、荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料，例如但不限于，鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于，荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，例如但不限于，铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；利用各种正电子发射成像的正电子发射金属，非放射性的顺磁性金属离子。
[00218]包含变异Fc区的本发明的分子可以结合到治疗部分，例如细胞毒素(例如，抑制细胞的或杀细胞的试剂)、治疗试剂或放射性元素(例如，α发射体、γ发射体，等等)。细胞毒素或细胞毒试剂包括对细胞有害的的任何试剂。实例包括paclitaxol、细胞分裂抑素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、etoposide、tenoposide、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、红比霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-2-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、萘异丙促胺和嘌呤霉素，和它们的类似物或同系物。治疗试剂但不限于，抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥bsnu BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯氨铂(II)(DDP)顺式铂氨)、anthracyclines(例如，红比霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素(以前的纳霉素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC)、和抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
[00219]此外，本发明的分子可以结合到治疗部分，例如放射性物质或对结合放射金属离子(实例参见上述的放射性物质)有用的大环的螯合剂。在某些实施方式中，大环的螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子附着到抗体上。这种接头分子是本领域一般已知的，在Denardo et al.，1998，ClinCancer Res.4：2483-90；Peterson et al.，1999，Bioconjug.Chem.10：553；和Zimmerman et al.，1999，Nucl.Med.Biol.26：943-50中描述了，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00220]将这种治疗部分结合到抗体的技术是公知的；参见，例如，Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，1985，pp.243-56，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstromet al.，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，1987，pp.623-53，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies‘84：Biological AndClinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，1985，pp.475-506)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，1985，pp.303-16，Academic Press；和Thorpe et al.，Immunol.Rev.，62：119-58，1982。
[00221]在一个实施方式中，其中本发明的分子是包含变异Fc区的抗体，它可以在有或没有结合到其上的治疗部分的情况下施用、单独地施用、或与用于治疗的细胞毒因子和/或细胞因子共同施用。做为选择，本发明的抗体可以结合到第二抗体来形成如Segal在美国专利No.4,676,980中描述的抗体异共轭物，通过完全引用将它合并在此。本发明的抗体也可以附着于固相支持物，其对于免疫分析或目标抗原的纯化是特别有用的。这种固相支持物包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
1.2筛选具有变异Fc区的分子的增强的FcγRIII结合并表征它们
[00222]在优选的实施方式中，筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子，使用在此描述的酵母展示技术结合一种或多种基于生物化学的分析，优选的以高通量方式来进行。所述一种或多种生物化学的分析可以是本领域已知用于鉴定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的任何分析，包括但不限于，ELISA分析、表面胞质团共振分析、免测沉淀法分析、亲和层析和平衡透析。在某些实施方式中，筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子，使用在此描述的酵母展示技术结合一种或多种基于功能性的分析，优选的以高通量方式来进行。基于功能的分析可以是本领域已知用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何分析，例如在此的5.2.7节中描述的那些。根据本发明的方法可以使用的效应细胞功能的非限制性实例包括但不限于，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用(opsonophagocytosis)、细胞结合、丛簇、C1q结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性。在某些实施方式中，筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性)的变异Fc区的分子，使用在此描述的酵母展示技术结合一种或多种基于生物化学的分析、组合或并用一种或多种基于功能的分析，优选的以高通量方式来进行。
[00223]术语Fc区与FcγR的“特异性结合”是指Fc区和特定的FcγR的相互作用，其对于单体FcγRIIIA来说具有至少约150nM的亲合常数，对于二聚FcγRIIB来说至少约60nM的亲和常数，如使用例如ELISA或表面胞质团共振分析(例如，BIAcoreTM)所测定的。Fc区对单体FcγRIIIA的亲合常数可以是150nM、200nM或300nM。Fc区对二聚FcγRIIB的亲合常数可以是60nM、80nM、90nM或100nM。用于本发明的方法的二聚FcγRIIB可以使用本领域技术人员已知的方法产生。一般地，FcγRIIB的细胞外区域与能够二聚化的异源多肽共价连接，从而产生的融合蛋白是二聚体，例如，参见，2003年1月13日提交的美国申请No.60/439,709(Attorney Docket No.11183-005-888)，通过完全引用将它合并在此。特异性相互作用一般在生理条件是稳定的，所述生理条件包括，例如，在活的个体例如人类或其他脊椎动物或无脊椎动物中出现的条件，以及在细胞培养中出现的条件，这样的条件被用于维持和培养哺乳动物细胞或来自另一种脊椎动物有机体或无脊椎动物有机体的细胞。
[00224]在特定的实施方式中，筛选和鉴定包含变异Fc区的分子和改变的FcγR亲合性包括：在酵母表面展示包含变异Fc区的分子；以及使用用于测定Fc-FcγR相互作用的生物化学分析，优选的基于ELISA的分析来表征包含变异Fc区的分子与FcγR(一种或多种)的结合。通过至少一种基于生物化学的分析，例如，ELISA分析，一旦包含变异Fc区的分子被表征了它与一种或多种FcγR的相互作用并测定了具有对一种或多种FcγR的改变的亲合性，使用本领域已知的标准DNA重组技术方法，该分子可以被工程化为完全的免疫球蛋白，包含变异Fc区的免疫球蛋白在哺乳动物细胞中表达用于进一步的生物化学表征。其中导入了本发明的变异Fc区的免疫球蛋白(例如，替换该免疫球蛋白的Fc区)可以是任何免疫球蛋白，包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体和嵌合抗体。在优选的实施方式中，变异Fc区被导入特异于细胞表面受体、肿瘤抗原或癌症抗原的免疫球蛋白。其中导入了本发明的变异Fc区的免疫球蛋白可以特异性结合癌症或肿瘤抗原，例如，包括但不限于，KS 1/4泛癌抗原(Perez and Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)，、卵巢癌抗原(CA125)(Yu et al.，1991，Cancer Res.51(2)：468-475)、前列腺酸磷酸盐(Tailor et al.，1990，Nucl.Acids Res.18(16)：4928)、前列腺特异性抗原(Henttu and Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli et al.，1993，Cancer Res.53：227-230)、黑素瘤相关抗原p97(Estin et al.，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)：445-446)、黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl et al.，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali et al.，1987，Cancer 59：55-63；Mittelman et al.，1990，J.Clin.Invest.86：2136-2144)、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foonet al.，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13：294)、多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原例如：CEA、TAG-72(Yokata et al.，1992，Cancer Res.52：3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar et al.，1993，Int.J.Cancer 53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn et al.，1982，J.Clin.Immunol.2：135)、CTA-1和LEA、Burkitt′s淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie et al.，1994，Blood 83：1329-1336)、人类B淋巴瘤抗原-CD20(Reff et al.，1994，Blood83：435-445)、CD33(Sgouros et al.，1993，J.Nucl.Med.34：422-430)、黑素瘤特异性抗原例如神经节苷脂GD2(Saleh et al.，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara et al.，1993，Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston et al.，1994，J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon et al.，1993，Cancer Res.53：5244-5250)、细胞表面抗原的肿瘤特异性移植类型(TSTA)例如virally诱导的肿瘤抗原，包括T抗原DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白例如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(Hellstrom et al.，1985，Cancer.Res.45：2210-2188)，differentiation antigen such as humanlung carcinoma antigen L6，L20(Hellstrom et al.，1986，Cancer Res.46：3917-3923)、纤维肉瘤的抗原、人类白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al.，1988，J.of Immun.141：1398-1403)、neoglycoprotein、鞘脂类、乳癌抗原例如EGFR(E pidermal growthfactor receptor)、HER2抗原(p185HER2)、多态上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens et al.，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17：359)、恶性人类淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard et al.，1989，Science 245：301-304)、分化抗原(Feizi，1985，Nature 314：53-57)例如胎儿红血球中发现的I抗原、成年人红血球中发现的原内胚层I抗原、胃腺癌中发现的植入前(preimplantation)胚，I(Ma)、乳腺上皮细胞中发现的M18、M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85(血群H)、结肠腺癌中发现的C14、肺腺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、Y半抗原、胚胎癌细胞中发现的Ley、TL5(血群A)、A431细胞中发现的EGF受体、胰腺癌中发现的E1系列(血群B)、胚胎癌细胞中发现的FC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中发现的CO-514(血群Lea)、腺癌中发现的NS-10、CO-43(血群Leb)、A431细胞的EGF受体中发现的G49、结肠腺癌中发现的MH2(血群ALeb/Ley)、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现的T5A7、黑素瘤中发现的R24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和胚胎癌细胞中发现的M1:22:25:8，和4到8细胞期胚中发现的SSEA-3和SSEA-4。在一个实施方式中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生的肽(参见，Edelson，1998，The Cancer Journal 4：62)。
[00225]在某些实施方式中，本发明的变异Fc区被导入抗荧光素单克隆抗体4-4-20(Kranz et al.，1982 J.Biol.Chem.257(12)：6987-6995；通过完全引用将它合并在此)。在其他实施方式中，本发明的变异Fc区被导入小鼠人类嵌合抗CD20单克隆抗体2H7，其识别B细胞上的CD20细胞表面磷蛋白(Liu et al.，1987，Journal ofImmunology，139：3521-6；通过完全引用将它合并在此)。在又一个实施方式中，本发明的变异Fc区被导入如Carter等描述的针对人类表皮生长因子受体2(p185HER2)的人源化抗体(Ab4D5)(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-9；通过完全引用将它合并在此)。在又一个实施方式中，本发明的变异Fc区被导入人源化抗TAG72抗体(CC49)(Sha et al.，1994Cancer Biother.9(4)：341-9)。在其他实施方式中，本发明的变异Fc区被导入用于治疗淋巴瘤的Rituxan。
[00226]在另一个特定的实施方式中，本发明涵盖通过修饰(例如，替换、插入、删除)至少一个氨基酸残基来工程化抗FcγRIIB抗体，所述抗FcγRIIB抗体包括但不限于在2002年8月12日提交的美国临时申请No.60/403,266和2003年8月14日提交的美国申请No.10/643,857(具有Attorney Docket No.011183-010-999)，2004年4月16日提交的美国临时申请No.60/562,804(具有Attorney Docket No.011183-014-888)；2004年5月10日提交的美国临时申请No.60/569,882(具有Attorney Docket No.011183-013-888)和在2004年6月21日提交的具有Attorney Docket Nos.011183-016-888、011183-017-888和011183-018-888的美国临时申请Nos.____中公开的任何抗体，所述修饰提高Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。可以根据本发明的方法工程化的抗FcγRIIB抗体的实例是具有ATCC登记号PTA-4591的2B6单克隆抗体和具有ATCC登记号PTA-4592的3H7、具有ATCC登记号PTA-5958的1D5单克隆抗体、具有ATCC登记号PTA-5959的1F2单克隆抗体、具有ATCC登记号PTA-5960的2D11单克隆抗体、具有ATCC登记号PTA-5961的2E1单克隆抗体和具有ATCC登记号PTA-5962的2H9单克隆抗体(所有的都保藏在10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 02209-2011)，通过引用将它们合并在此。在另一个特定的实施方式中，修饰抗FcγRIIB抗体也可以进一步降低Fc区对FcγRIIB的亲合性。在又一个特定实施方式中，工程化的抗FcγRIIB抗体可以进一步具有增强的效应物功能，如本领域已知的以及在此公开和例示的标准分析所测定的。在某些实施方式中，本发明的变异Fc区被导入特异于癌症抗原或细胞表面受体的治疗性单克隆抗体，包括但不限于，ErbituxTM(也称为IMC-C225)(ImCloneSystems Inc.)、针对EGFR的嵌合单克隆抗体；HERCEPTIN
(Trastuzumab)(Genentech，CA)，其是用于治疗患有转移性乳腺癌的患者的人源化抗HER2单克隆抗体；REOPRO
(abciximab)(Centocor)，其是用于防止凝块形成的抗血小板上的糖蛋白IIb/IIIa受体；ZENAPAX(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其是用于防止急性的肾脏异体移植排斥的免疫抑制性、人源化抗CD25单克隆抗体。其他实例是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Genentech)；CDP860，其是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Celltech，UK)；PRO542，其是与CD4融合的抗-HIV gp120抗体(Progenics/Genzyme Transgenics)；C14其是抗-CD14抗体(ICOSPharm)；人源化的抗-VEGF IgG1抗体(Genentech)；OVAREXTM其是鼠抗-CA 125抗体(Altarex)；PANOREXTM，其是鼠抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(Glaxo Wellcome/Centocor)；IMC-C225其是嵌合的抗-EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXINTM，其是人源化的抗-αVβ3整联蛋白抗体(Applied MolecularEvolution/MedImmune)；Campath 1H/LDP-03，其是人源化的抗CD52IgG1抗体(Leukosite)；Smart M195，其是人源化的抗-CD33IgG抗体(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXANTM，其是嵌合的抗-CD20IgG1抗体(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，其是人源化的抗-CD22IgG抗体(Immunomedics)；Smart ID10，其是人源化的抗-HLA抗体(ProteinDesign Lab)；ONCOLYMTM(Lym-1)是放射标记的鼠抗-HLA DR抗体(Techniclone)；抗-CD11a是人源化的抗IgG1抗体(Genetech/Xoma)；ICM3是人源化的抗-ICAM3抗体(ICOSPharm)；IDEC-114是灵长化的抗-CD80抗体(IDECPharm/Mitsubishi)；ZEVALINTM是放射标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化的抗-CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151是灵长化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152是灵长化的抗-CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化的抗-补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；IDEC-151是灵长化的抗-CD4IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人类抗-CD4IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗体(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVATM是人源化的抗-CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化的抗-VLA-4IgG抗体(Elan)；MDX-33是人类抗-CD64(FcγR)抗体(Medarex/Centeon)；；rhuMab-E25是人源化的抗-IgE IgG1抗体(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)；IDEC-152其是灵长化的抗-CD23抗体(IDEC Pharm)；ABX-CBL是鼠抗CD-147IgM抗体(Abgenix)；BTI-322是大鼠抗-CD2IgG抗体(Medimmune/BioTransplant)；Orthoclone/OKT3是鼠抗-CD3IgG2a抗体(orthoBiotech)；SIMULECTTM是嵌合的抗-CD25IgG1抗体(NovartisPharm)；LDP-01是人源化的抗-β2-整联蛋白IgG抗体(LeukoSite)；Anti-LFA-1是鼠抗CD18F(ab′)2(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152是人类抗-TGF-β2抗体(Cambridge Ab Tech)；以及CorsevinM是嵌合的抗-Factor VII抗体(Centocor)。
[00227]本发明的变异Fc区，优选的的在免疫球蛋白的背景中，可以进一步使用一种或多种生物化学的分析和/或一种或多种功能性分析，优选的以高通量方式来表征。在某些可选择的实施方式中，本发明的变异Fc区不被导入免疫球蛋白，进一步使用一种或多种基于生物化学的分析和/或一种或多种功能性分析，优选的以高通量方式来表征。所述一种或多种生物化学的分析可以是本领域已知用于鉴定Fc-FcγR相互作用任何分析，包括但不限于，ELISA分析、用于测定Fc-FcγR相互作用的动力参数的基于表面胞质团共振的分析，例如，BIAcore分析。一种或多种功能性分析可以是本领域已知用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何分析，如本领域技术人员已知或在此描述的。在特定的实施方式中，在ELISA分析中分析包含变异Fc区的免疫球蛋白与一种或多种FcγR，例如，FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIA的结合；继之以一种或多种ADCC分析。在某些实施方式中，进一步使用基于表面胞质团共振的分析，例BIAcore来分析包含变异Fc区的免疫球蛋白。基于表面胞质团共振的分析是本领域公知的，在5.2.7节中进一步讨论了，在此在实施例6.8中例示了。
[00228]用于表征包含变异Fc区的免疫球蛋白的示范性的高通量分析可以包括：通过例如标准的DNA重组技术方法将本发明的变异Fc区导4-4-20抗体中；在ELISA分析中表征包含变异Fc区的4-4-20抗体与FcγR(例如，FcγRIIIA、FcγRIIB)的特异性结合；在ADCC分析中表征包含变异Fc区的4-4-20抗体(使用在此公开的方法)，其中用包含变异Fc区的4-4-20抗体调理靶细胞；然后可以将变异Fc区克隆到第二免疫球蛋白中，例4D5、2H7，在ADCC分析中表征第二免疫球蛋白，其中用包含变异Fc区的第二抗体调理目标细胞。然后使用基于ELISA的分析来进一步分析包含变异Fc区的第二抗体来证实与FcγR的特异性结合。
[00229]优选的，如在ELISA分析中测定的，本发明的变异Fc区以比野生型Fc区更高的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA。最优选的，如在ELISA分析中测定的，本发明的变异Fc区以比野生型Fc区更高的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，更低的亲合性结合FcγRIIB。在某些实施方式中，如在ELISA分析中测定的，所述变异Fc区以野生型Fc区结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA至少2倍高、至少4倍高、更优选的至少6倍高、最优选的至少8到10倍高的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，并以野生型Fc区结合FcγRIIB至少1/2、至少1/4、更优选的至少1/6、最优选的至少1/8到1/10的亲合性结合FcγRIIB。
[00230]使用在此公开合本领域技术人员已知的方法，可以在任何点使用用于定义Fc-FcγR相互作用的动力参数的、基于表面胞质团共振的分析，来分析包含变异Fc区的免疫球蛋白。优选的，如通过BIAcore分析所测定的，本发明的变异Fc区结合单体FcγRIIIA和/或FcγRIIA的Kd是月100nM、优选的约70nM、最优选的约40nM；本发明的变异Fc区结合二聚FcγRIIB的Kd是约80nM、约100nM、更优选的约200nM。
[00231]在最优选的实施方式中，进一步在动物模型中表征包含变异Fc区的免疫球蛋白与FcγR的相互作用。用于本发明的方法的优选的动物模型是，例如，表达人类FcγR的转基因小鼠，例如，在美国专利No.5,877,397和6,676,927中描述的任何小鼠模型，通过完全引用将它们合并在此。在本发明的方法中使用的转基因小鼠包括但不限于，携带人类FcγRIIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIA的天生敲除FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIIA和FcγRIIA的天生敲除FcγRIIIA和FcγRIIA的小鼠以及携带人类FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的天生敲除FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的小鼠。
5.2.1设计策略
[00232]本发明涵盖工程方法来产生Fc变体，包括但不限于计算设计策略、库产生方法以及实验生产和筛选方法。这些策略可以独立地或各种组合应用来工程化本发明的Fc变体。
[00233]在最优选的实施方式中，本发明的工程方法包含一些方法，在其中Fc区和Fc配体间接口处的氨基酸不被修饰。Fc配体包括但不限于，FcγR、C1q、FcRn、C3、甘露糖受体、蛋白A、蛋白G、甘露糖受体以及尚未发现的结合Fc的分子。Fc区和Fc配体之间接口处的氨基酸被定义为那些氨基酸，它们在Fc区和配体间产生直接和/或间接接触，在确定接口的构象中起到结构性作用，或如通过结构分析例如X-射线晶体衍射和分子建模所测定的，相互在至少3埃、优选的至少2埃之内。Fc区和Fc配体之间接口处的氨基酸包括根据Fc-FcγR相互作用的结晶和结构分析，例如Sondermann等公开的(2000，Nature，406：267-273；通过完全引用将它合并在此)，与FcγR进行直接接触的那些氨基酸。与FcγR进行直接接触的Fc区内的位置的实例是氨基酸234-239(绞链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C′/E环)和氨基酸327-332(F/G)环。在某些实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子包含至少一个残基的修饰，根据结构或结晶分析所述修饰不与FcγR进行直接接触，例如，不在Fc-FcγR结合位点内。
[00234]优选的，本发明的工程方法不修饰如Shields等所鉴定的任何氨基酸，它们位于靠近绞链区的Fc区的CH2结构域中，例如Leu234-Pro238；Ala327、Pro329，并影响Fc区与所有人类FcγR的结合。
[00235]在其他实施方式中，本发明涵盖具有改变的FcγR亲合性和/或改变的效应物功能的Fc变体，从而所述Fc变体不具有在Fc区和Fc配体之间接口处位置的氨基酸修饰。优选的，这样的Fc变体结合在Fc区和Fc配体之间接口处的一个或多个其他氨基酸修饰对特别改变的性质，例如改变的FcγR亲合性具有进一步的影响。修饰Fc和Fc配体之间接口处的氨基酸可以使用本领域已知的方法来进行，例如，根据Fc-配体复合物的结构分析。例如而不是限制，通过探索在Fc位置影响结合接口的能量有利性替换，可以工程化产生新的接口构象的变体，它们中的一些可能改善与Fc配体的结合，它们的一些可能降低Fc配体结合，它们中的一些可能具有其他有利的性质。这些新的接口构象可能是，例如，与形成接口的Fc配体残基的直接相互作用的结果，或由氨基酸修饰引起的间接效果，例如侧链或主干构象的扰动的结果。
[00236]本发明涵盖工程化Fc变体，所述Fc变体包含在此公开的任何氨基酸修饰结合其他修饰，其中在位置297处Fc碳水化物的构象被改变。本发明涵盖在N297碳水化物中构象和成分的变化，其产生期望的性质，例如对FcγR提高的或降低的亲合性。这种修饰可以进一步增强本发明的Fc变体的原始氨基酸修饰的表型。尽管不希望受特定作用机制的限制，这种策略得到了观察结果的支持，所述观察结果是碳水化物结构和构象显著地影响Fc-FcγR和Fc/Clq结合(Umahaet aL，1999，Nat Biotechnol 17：176-180；Davies et aL，2001，BiotechnolBioeng 74：288-294；Mimura et aL，2001，J Biol Chem 276：45539；Radaev et aL，2001，J Biol Chem 276：16478-16483；Shields et aL2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa et aL，2003，J BiolChem 278：3466-3473)。
[00237]提供了用于产生根据本发明的Fc变体的另一种设计策略，其中Fc变体被重新工程化来消除糖基化方面的结构和功能依赖。这种设计策略包括在不存在N297碳水化物的情况下优化Fc结构、稳定性、溶解性和/或Fc功能(例如，Fc对一种或多种Fc配体的亲合性)。在一种方法中，未糖基化时暴露于溶剂的位置被工程化，从而它们是稳定的、与Fc结构在结构上一致的、并且没有聚集的倾向。优化糖基化的Fc的方法可以包括但不限于，通过掺入朝向Cg2-Cg2二聚体轴的极性或带电残基，和通过设计直接增强糖基化Fc-FcγR接口或糖基化Fc与其他Fc配体的接口的氨基酸修饰，来设计增强糖基化Fc稳定性和/或溶解性的氨基酸修饰。
[00238]本发明的Fc变体可以与其他Fc修饰组合，包括但不限于改变效应物功能的那些。本发明涵盖组合本发明的Fc变体与其他Fc修饰来提供抗体或Fc融合物中附加的、协同的、或新的性质。这种修饰可以位于CH1、CH2或CH3结构域或它们的组合中。优选的本发明的Fc变体增强它们与之组合的修饰的性质。例如，如果本发明的Fc变体与一种突变体组合，所述突变体已知以比包含野生型Fc区的可比较分子更高亲合性结合FcγRIIIA；与本发明的突变的组合引起在FcγRIIIA亲合性上更大倍数的增强。
[00239]在一个实施方式中，本发明的Fc变体可以与其他已知的Fc变体组合，例如在Duncan et al，1988，Nature 332：563-564；Lund etal.，1991，J.Immunol 147：2657-2662；Lund et al，1992，Mol Immunol29：53-59；Alegre et al，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchinset al.，1995，Proc Natl.Acad Sci U S A 92：11980-11984；Jefferis et al，1995，Immunol Lett.44：111-117；Lund et al.，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis et al，1996，Immunol Lett 54：101-104；Lund et al，1996，JImmunol 157：49634969；Armour et aL，1999，Eur J Immunol29：2613-2624；Idusogie et al，2000，J Immunol 164：41784184；Reddyet al，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu et al.，2000，Cell Immunol200：16-26；Idusogie et al，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields etal.，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Jefferis et al，2002，ImmunolLett 82：57-65；Presta et al.，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490)；US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572中公开的那些，通过完全引用将它们每一个合并在此。
5.2.2FcγR-Fc结合分析
[00240]开发了FcγR-Fc结合分析用于测定包含变异Fc区的本发明的分子与FcγR的结合，其容许相互作用的检测和定量，不论受体对它的配体的固有地弱的亲合性，例如，对于FcγRIIB和FcγRIIIA在微摩尔的范围内。所述方法包括形成FcγR复合物，相对于未复合的FcγR，其具有对Fc区的改善的亲合力。根据本发明，优选的分子复合物是四聚的免疫复合物，包括：(a)FcγR的可溶区域(例如，FcγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶区)；(b)与FcγR的可溶区域(例如，FcγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶区域)的C-末端可操作连接的生物素化的15氨基酸AVITAG序列(AVITAG)；和(c)链霉抗生物素蛋白-藻红素(SA-PE)；以一定摩尔比来形成四聚FcγR复合物(优选的以5∶1的摩尔比)。根据本发明的优选的实施方式，所述融合蛋白以酶学手段生物素化，使用例如，E.coli Bir A酶，一种特异地将AVITAG序列中15氨基酸上的赖氨酸残基生物素化的生物素连接酶。在本发明的特定实施方式中，85％的融合蛋白被生物素化的，如本领域技术人员已知的标准方法所测定的，包括但不限于链霉抗生物素蛋白移动分析。根据本发明优选的实施方式，以1X SA-PE:5X生物素化可溶FcγR的摩尔比将生物素化的可溶FcγR蛋白与SA-PE混合，来形成四聚FcγR复合物。
[00241]在本发明的优选的实施方式中，包含Fc区的多肽以比单体未复合的FcγR高至少7倍的亲合性结合根据本发明的方法形成的四聚FcγR复合物。包含Fc区的多肽与四聚FcγR复合物的结合可以使用本领域技术人员已知的标准技术来测定，实例例如，荧光活化的细胞分选(FACS)、放射性免疫分析、ELISA分析，等等。
[00242]本发明涵盖使用根据如上所述的方法形成的免疫复合物来在基于细胞的或无细胞的分析中测定包含Fc区的分子的功能。
[00243]为了方便，可以以分析试剂盒来提供试剂，即，用于分析包含变异Fc区的分子结合FcγR四聚复合物的能力的试剂的封装组合。用于测定Fc-FcγR相互作用的其他形式的分子复合物也预期用于本发明的方法中，例如，如2003年1月13日提交的美国临时申请60/439,709(Attorney Docket No.11183-005-888)中描述所形成的融合蛋白；通过完全引用将它合并在此。
5.2.3酵母展示库的诱变和构建
[00244]IgG Fc和Fc受体之间的分子相互作用早先已经通过结构和遗传技术研究了。这些研究鉴定了对于Fc与不同的FcγR的功能性结合是关键性的氨基酸残基。这些变化在动物模型中都没有显示改善人类FcγR介导的治疗抗体的效力。还没有报道在这些残基或其他潜在重要的残基处的所有潜在氨基酸变化的完整分析。在此描述的平台具有构建带有所有可能的氨基酸变化的突变体库、使用多种功能性分析来筛选库、最后在人源化的动物模型中分析库的能力。
[00245]本发明涵盖根据本领域已知的或正在发展的遗传和结构的数据构建多个库。此处描述和例示的方法包括构建单独的库，其含有在Fc区的3-6个残基之间测试所有20种氨基酸变化的突变体。突变的完整集合汇集到所有可能的突变组合中。产生的独立突变的数目基于在库组装期间被饱和的位点的数目(以下的表9)。库大小将决定初步筛选的选择和用于最初克隆步骤的载体的选择。
表9：根据目标位点数目的独立突变的数目
| 库 | 残基的数目 | 独立突变的数目 | 初步筛选 |
| 小 | 3或更少 | 最多8000 | ELISA |
| 大 | 4-6 | 1.6×105-6.4×107 | 表面展示 |
[00246]本发明涵盖构建组合库，其集中于有限数量的关键性残基(例如，3-6个)。使用随机诱变的IgG1 Fc的库和在此描述和例示的筛选分析，鉴定Fc变体。在最初几轮中，根据FcR结合分布型和功能活性选择最好的5个突变。采用205个单独突变来覆盖5个位置处的所有可能的氨基酸变化和它们的组合。产生对每个突变具有至少10倍覆盖度的库。此外，根据可获得的信息，例如晶体结构数据、小鼠/人类同种型FcγR结合差异、遗传学数据和通过诱变鉴定的其他位点，来选择区域。
[00247]当前的针对位点的诱变方案最大的缺点是产生偏离的群体，在某些区域过度出现的变异以及在其他区域过低出现的或完全缺乏突变。本发明通过使用很好地开发的基因建筑技术产生期望的Fc突变的无偏排列克服了这个难题，来消除由基于PCR的方法，例如重叠PCR和反向PCR引入的偏差。本发明的方法的主要区别是：1)采用对每个目标密码子的20个单独的oligo的等摩尔混合物，取代简并引物。这样每个氨基酸由单个的、最常用的密码子来呈现，而简并引物过度呈现由更多密码子编码的那些氨基酸，超过了由更少的密码子编码的那些氨基酸。2)通过链替换方法构建突变体。这确保了无偏差地将所有期望的变化引入最终产物中。
[00248]方案示范性的方案包含以下步骤：1)磷酸化的oligos，呈现在一个或几个位置所有期望的变化，全部与相同的链互补，添加到模板以及热稳定的、5’＞3’核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶和连接酶(附图25a)。2)组合的混合物经历多个聚合/连接循环，足以产生期望数量的产物。当热稳定的连接酶将单独的引物-延伸的片段组装到连续的单链的链上时，使用5′＞3′核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶确保了引物序列和它的磷酸盐残基的完整性。反应循环可以继续直到完全耗尽oligos库，而不向最终产物中引入偏差(附图25b)。3)通过向反应添加反向的基因特异性引物将产生的单链突变体的库转化为双链DNA(附图251c)。4)双链的产物在末端设计的限制性位点得以消化，并克隆到合适的表达载体中(附图251d)。
[00249]为了确保库的质量，通过电泳分析PCR扩增的片段来确定最终PCR产物的长度。如果99％的PCR产物具有预期的长度，将反应表征为成功的。最终的库被克隆到表达载体中。突变库的部分将被测序来确定突变密码子掺入的比率。测序的片段的数目基于突变的目标位点的数目，通过观察的目标位点的突变比率来确定库的有效性(表10)。没有插入物的载体的比率应当低于2％。在非目标位点的突变的比率应低于8％。含有具有＞90％正确插入的克隆的库将允许我们维持筛选时间线。
表10库的预期的突变比率
[00250]在其他实施方式中，本发明涵盖用于构建库的重叠或反向PCR。为了保持无偏差，使用每个密码子的单独的引物而不是简并的引物。采用与以上公开的类似的有效性方案。
[00251]采用最优选的自动化方案用于高通量库产生。自动装置容许为需要冗长的重复操作的任务改善通过量、离人的操作、以及实验误差的总体下降。Oligo合成能力基于2Mermade DNA合成仪(Bioautomation，Inc.)为575个60mer Oligos/12小时的总输出能力。专用软件处理了设计、合成和最终寡核苷酸存储的所有方面。采用机器人化的液体处理机来布置用于全长Fc突变体的合成的oligos，并建立用于将突变Fc掺入抗体重链表达载体的连接反应。在连接之后，估计将花费1FTE～10天来排列库克隆并产生～8000个minipreps，相当于3个位点饱和的组合库。在细菌转化之后，使用Qpix-2克隆挑取者机器人来挑取菌落到96深孔平板中。使用磁悬浮搅拌器进行培养物生长，能够孵育12个平板并在37℃在12-16hr内产生稠密的生长。使用Qiagen miniprep机器人以2.5小时内4个96孔平板的速率来进行DNA制备。通过重叠任务，可以在9个月内以1FTE构建5个这样的库。
[00252]亲合性成熟(affinity maturation)需要从预选的突变库或基因家族的成员中组装一套新的突变组合，其可以通过选择方案来富集。重复该过程几次直到实现具有期望表型的突变体的分离。当前的酶学方法、DNA shuffling实现这个过程的缺点是偏差、最终装配的库中特定突变的优势性、以及损失最终的库中某些原始的突变，所述偏差可能由于基因内对于核酸酶是热点的特异性位点而引入。为了克服这个缺点，使用build-a-gene(BAG)技术来产生Fc突变的高度复合的库，所述Fc突变含有在对于受体结合可能重要的所有潜在位置处的随机的氨基酸变化。使用覆盖IgG Fc的特定区域的简并oligo的集合(参见，附图26)。
[00253]Oligo为～30nt，构建改变一个或两个AA(8oligos)的合成的简并oligos。设计oligos来无缺口地重叠。每个寡核苷酸采取～200个oligos来适应所有单个AA变化，～2000个来改变两个AA。使用以上列出的方案(A.20)，单独地或组合地使用所有2000+个oligos来产生Fc突变的系列。我们使用内部编写的随机发生器程序和机器人液体处理机用于集中突变和野生型oligos的选择的组合。将大的库克隆到载体中，所述载体容许使用酵母表面展示进行筛选。这种方法利用了磁性珠子选择，继之以流式细胞计数，已经成功地应用于具有＞109的复杂度的库(Feldhaus et al.，2003，Nat.Biotech.21(2)：163-170；通过完全引用将它合并在此)。这限制了在任一个库中测试的位点数目为7，产生～1.3×109种可能的突变/库。
[00254]为了确保库的质量，通过电泳分析PCR扩增的片段来确定最终PCR产物的长度。如果99％的PCR产物具有预期的长度，将反应表征为成功的。突变库的部分将被测序来确定突变密码子掺入的比率。测序的片段的数目基于突变的目标位点的数目，通过观察的目标位点的突变比率来确定库的有效性(表10)。没有插入物的载体的比率应当低于2％。在非目标位点的突变的比率应低于8％。
[00255]通过测序克隆的子集，确定通过这种方法产生期望的诱变有效水平的能力。对BAG可选择的是使用“DNA shuffle”方案。这需要集中所有的突变体，单个、两个、三个，等等。在DNA制备之后，使用选择性扩增Fc的突变区～700bp的侧翼引物通过PCR扩增Fc区。经由DNAseI处理扩增的DNA和分离150-200bp片段，通过reshuffling突变来构建新的突变体(参见，例如Stemmer et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：10747-51。重新连接片段，用嵌套引物PCR扩增，并克隆到酵母表面展示载体pYD1中。如在此描述和例示的，在酵母Fc展示筛选中重新选择重组的库。
[00256]BAG库利用大多数相同的设备作为组合库。然而，克隆处在适合于酵母表面展示的载体中，并且不需要排列单独的克隆，因为最初采用酵母表面展示用于大库的富集。在合适水平的富集之后，排列单独的克隆。
[00257]使用本领域已知的任何基于随机的诱变技术来产生包含变异Fc区的分子的初始库。本领域技术人员理解的是，可以通过本领域技术人员已知的任何诱变技术获得Fc区的氨基酸序列变体。在此简要地描述这些技术中的一些，然而，要认识到可选择的过程可以产生等同的结果。在优选的实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子通过如下文实施例6中例举的error-prone PCR来制备(参见Leung etal.，1989，Technique，1：11)。特别优选的是，具有2-3bp/Kb的差错率用于本发明的方法。在一个实施方式中，使用error prone PCR获得2-3突变/kb的突变频率。
[00258]诱变可以根据本领域已知的任何技术来进行，包括但不限于，合成寡核苷酸，所述寡核苷酸具有待修饰的抗体的Fc区或包含Fc区(例如，CH2或CH3结构域)的多肽的序列内的一个或多个修饰。位点特异性诱变容许通过使用编码期望的突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的邻近核苷酸来产生突变体，来提供足够大小和序列复杂性的引物序列，以在被横越的删除接头的两侧形成稳定的双链体。一般地，长度约30到约45个核苷酸或更长的引物是优选的，在序列接头的两侧约10个到约25个或更多残基被改变。可以使用在一个或多个位置引入各种不同突变的多种这样的引物来产生突变体的库。
[00259]位点特异性诱变技术是本领域公知的，如各种出版物所例示的(参见，例如Kunkel et al.，Methods Enzymol.，154：367-82，1987，通过完全引用将它合并在此)。一般地，通过首先获得单链载体、或熔化开双链载体的两条链，来进行针对位点的诱变，所述载体在它的序列中包括编码期望的肽的DNA序列。制备携带期望的突变序列的寡核苷酸引物，一般是合成地制备。然后将这种引物与单链的载体退火，经受DNA聚合酶例如T7 DNA聚合酶，来完成携带突变的链的合成。因而，形成异双链体，其中一条链编码原始的未突变序列，第二条链携带期望的突变。然后将这种异双链体用于转化或转染适合的细胞，例如E.coli细胞，选择包括带有突变序列配置的重组载体的克隆。要理解的是，该技术一般采用噬菌体载体，其以单链和双链形式存在。在针对位点的诱变中有用的典型载体包括例如M13噬菌体的载体。这些噬菌体是商业上可容易地获得的，它们的使用一般是本领域技术人员公知的。双链的质粒通常也在针对位点的诱变中采用，其消除了将目标基因从质粒转移到噬菌体的步骤。
[00260]做为选择，使用具有商业上可获得的耐热酶例如Taq DNA聚合酶的PCRTM可以用来将诱变寡核苷酸引物掺入扩增的DNA片段，所述DNA片段因而可被克隆到合适的克隆或表达载体中。对于PCR介导的诱变过程，参见，例如Tomic et al.，Nucleic Acids Res.，18(6)：1656，1987和Upender et al.，Biotechniques，18(1)：29-30，32，1995，通过完全引用将它们合并在此。采用除热稳定聚合酶之外的热稳定连接酶的PCRTM也可以用来将磷酸化的诱变寡核苷酸掺入到扩增的DNA片段中，所述DNA片段因而可被克隆到合适的克隆或表达载体中(参见，例如Michael，Biotechniques，16(3)：410-2，1994，通过完全引用将它合并在此)。
[00261]制备用于本发明的变体的另一个方法是基于Wells等(1985，Gene，34：315)描述的技术的盒诱变。起始材料是包含期望的DNA的质粒，所述DNA编码要突变的蛋白(例如，编码包含Fc区的多肽的DNA)。鉴定了DNA序列中要突变的密码子；在鉴定的突变位点的每一侧必须有独特的限制性内切酶位点。如果不存在这样的限制性位点，可以通过寡核苷酸指导的诱变来产生在将限制性位点导入质粒之后，在这些位点切割质粒并线性化。使用本领域技术人员已知的标准程序合成双链寡核苷酸，所述寡核苷酸编码限制性位点之间的DNA序列但含有突变。所述双链寡核苷酸被称为盒。这种盒被设计为具有与线性化的质粒的末端兼容的3′和5′末端，从而它可以直接连接到质粒。
[00262]可以使用本领域技术人员已知的其他方法，用于产生包含Fc区的抗体或多肽的Fc区的序列变体。例如，可以用诱变剂，例如羟胺处理编码抗体或其片段的恒定区氨基酸序列的重组载体，来获得序列变体。
[00263]一旦根据所描述的方法产生了突变库，使用本领域技术人员已知的标准乙酸锂转化方案(ref)，将诱变的库转化到酵母菌株中，优选的，EBY100(Invitrogen)，MATa ura3-52trpl leu2Δl his3Δ200pep4::HIS3prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1。
[00264]本领域技术人员将理解的是，一旦根据本发明的方法鉴定了(参见5.1节和表2)具有期望的结合性质(例如，具有有至少一个氨基酸修饰的变异Fc区的分子，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰增强所述变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性)的分子，可以使用标准的重组DNA技术和任何已知的技术，如本节中所描述的，工程化其他分子(例如，治疗抗体)来产生携带所鉴定的突变位点的工程化的分子。
5.2.4酵母表面展示
[00265]筛选和鉴定包含具有改变的FcγR亲合性(例如，增强的FcγRIIIA亲合性和/或FcγRIIA)的变异Fc区的分子的优选的方法是酵母表面展示技术(综述参见，Boder and Wittrup，2000，Methods inEnzymology，328：430-444，通过完全引用将它合并在此)，其解决了先有技术中为筛选细胞外翻译后修饰的蛋白的结合相互作用的缺陷。具体地，酵母表面展示是一种遗传学方法，通过这种方法包含Fc突变的多肽以对于与FcγR相互作用可接近的形式在酵母细胞壁上表达。可以根据本领域技术人员已知的任何技术来进行含有突变Fc的本发明的多肽的酵母表面展示。参见美国专利No.6,423,538、6,114,147和6,300,065，通过完全引用将它们所有的合并在此。参见Boder et al.，1997Nat.Biotechnol.，15：553-7；Boder et al.，1998Biotechnol.Prog.，14：55-62；Boder et al.，2000Methods Enzymol.，328：430-44；Boder etal.，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97：10701-5；Shusta et al.，1998 Nat.Biotechnol.，1998，16：773-7；Shusta et al.，1999J.Mol.Biol.，292：949-56；Shusta et al.，1999 Curr.Opin.Biotechnol.，10：117-22；Shusta et al.，2000 Nat.Biotechnol.，18：754-9；Wittrup et al.，1994 Ann.N.Y.Acad.Sci.，745：321-30；Wittrup et al.，1994 Cytometry，16：206-13；Wittrup，1995 Curr.Opin.Biotechnol.，6：203-8；Wittrup，1999Trends Biotechnol.，17：423-4；Wittrup，2000 Nat.Biotechnol.，18：1039-40；Wittrup，2001 Curr.Opin.Biotechnol.，12：395-9。
[00266]酵母表面展示用于富集含有＞107个独立克隆的库。这种方法将提供在单次分选中将大库富集＞20倍的能力。将具有＞10,000个独立突变的Fc突变库(4个或更多个位点)克隆到用于酵母表面展示的合适的载体中，并通过FACS分选富集直到＜8000个突变体能够通过如下所述的其他生物化学的和功能性的分析来测试。
[00267]本发明提供了在酵母中构建Fc突变库的方法，用于展示包含Fc区的分子，所述Fc区已经如5.2.2节中描述的突变了。优选的，用于本发明的方法的Fc突变库含有至少107个细胞，至多109个细胞。构建用于本发明的方法的Fc库的一种示范性的方法包含以下的：将编码包含Fc区的分子的核酸克隆到来自酵母复制载体例如，pCT302的载体的多克隆位点；从而编码Fc的核酸在GAL1半乳糖诱导启动子的控制下、并且与编码接合凝集素细胞壁蛋白Aga2p的核苷酸序列按读码框表达。在优选的实施方式中，将编码包含Fc区的分子的核酸克隆到Aga2p编码区的C-末端，从而编码Fc区Aga2p融合蛋白。使用本发明的优选的构建体，包含Aga2p蛋白以及含Fc区的多肽的融合蛋白被细胞外地分泌，并经由与整合细胞壁蛋白Aga1p蛋白的二硫键展示到细胞壁上。在可选择的实施方式中，构建体可以进一步包含编码表位tag的核苷酸序列。可以根据本发明使用本领域技术人员已知的任何表位tag核苷酸编码序列，包括但不限于编码血球凝集素(HA)、c-myc Xpress TAG、His-TAG或V5TAG的核苷酸序列。可以使用FACS分析、共焦荧光显微术或标准的免疫染色方法来检测酵母细胞表面上融合蛋白的存在，所有这些都是本领域技术人员已知的。在一个实施方式中，使用Fc特异性单克隆抗体(CH3特异性)来检测酵母细胞表面本发明的Fc融合蛋白的存在，所述抗体包括但不限于IgG1 Fc特异性单克隆抗体HP6017(Sigma)、JL512(Immunotech)和在Partridge et al.，1986，Molecular Immunology，23(12)：1365-72中公开的任何抗体，通过引用将它合并在此。在另一个实施方式中，使用本领域技术人员已知的技术通过表位tag的免疫荧光标记来检测本发明的Fc融合蛋白的存在。在本发明的方法中特别有用的是，使用编码表位tag的核苷酸序列侧翼于编码Fc融合蛋白的核酸，作为内部对照，来检测融合蛋白是否以部分proteolyzed形式展示在细胞壁上。
5.2.5筛选酵母显示库
[00268]本发明涵盖使用基于免疫学的分析、包括但不限于基于细胞的分析、基于溶液的分析和基于固相的分析来筛选酵母显示库。
[00269]在某些实施方式中，本发明涵盖使用本领域技术人员已知并涵盖在此的亲合性成熟方法鉴定具有改变的FcγR亲合性的Fc突变体。简要地，亲合性成熟通过随机重组在突变库中出现的单个突变产生新的等位基因，参见，例如Hawkins et al.，1992，J.Mol.Biol.226：889-896；Stemmer et al.，1994Nature，370：389-91，通过完全引用将它们合并在此。它已经被成功地使用来提高抗体、T细胞受体和其他蛋白质的亲合性。本发明涵盖使用显示了提高的FcγR结合的突变作为基准线，来构建具有增强的表型的新的突变库。使用本发明的方法，可以挑选通过酵母表面展示富集的IgG1 Fc突变体群体的提高的对FcγR，例如FcγRIIIA的结合。在DNA制备之后，使用本领域技术人员已知的以及在此公开或例示的方法，使用～700bp的、选择性扩增Fc的突变区的侧翼引物通过PCR扩增Fc区。使用例如Stemmeret al.，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-51公开的那些方法，通过完全引用将它合并在此，经由DNAseI处理扩增的DNA并分离片段，通过Fc区中突变的reshuffling来构建新的突变体。然后可以使用本领域技术人员已知的方法重新连接片段，用嵌套引物PCR扩增，并克隆到酵母表面展示载体例如pYD1中。然后在酵母Fc展示筛选中重新选择重组的库。使用本领域已知的方法，例如中公开的那些，通过完全引用将它合并在此，由于KD降低低于10nM，根据FcγRIIIA配体从Fc受体的解离速率的降低，可以确定条件以容许亲合性的进一步提高。本发明涵盖酵母库的动力学筛选。通过用标记的配体，例如荧光配体将展示Fc的细胞标记到饱和，继之以与过量的未标记配体孵育预定的时间，可以建立动力学筛选。通过添加过量缓冲液(例如，1X PBS、0.5mg/ml BSA)终止反应之后，通过FACS和设置用于选择的分选门来分析细胞。在每轮富集之后，可以检测单个突变在亲合性上的提高倍数，并为多样性进行测序。可以重复体外重组过程。在某些实施方式中，所述体外过程重复至少3次。
[00270]可以使用任何FcγR，包括但不限于FcγR的多态性变体来进行本发明的Fc变体的选择。在某些实施方式中，使用在位置158含有苯丙氨酸的FcγRIIIA的多态性变体来进行Fc变体的选择。在其他实施方式中，使用在位置158含有缬氨酸的FcγRIIIA的多态性变体来进行Fc变体的选择。FcγRIIIA 158V显示了比158F更高的IgG1亲合性和提高的ADCC活性(参见，例如Koene et al.，1997，Blood，90：1109-14；Wu et al.，1997，J.Clin.Invest.100：1059-70，通过完全引用将它们两个合并在此)；根据近来由IgG1-FcγRIIIA共结晶研究显示的，这个残基实际上与IgG1的较低的绞链区直接相互作用，参见，例如Sonderman et al.，2000，Nature，100：1059-70，通过完全引用将它合并在此。研究显示，在某些情况下治疗性抗体在FcγRIIIA-158V纯合的患者中具有改善的效力。例如，与FcγRIIIA 158F纯合的患者相比，在FcγRIIIA158V纯合的患者中人源化抗CD20单克隆抗体Rituximab治疗上更有效(参见，例如，Cartron et al.，2002Blood，99(3)：754-8)。尽管不希望受特定作用机制的限制，用FcγRIIIA158F同种型来选择本发明的Fc变体能够提供这样的变体，所述变体一旦被工程化为治疗性抗体，将在临床上对FcγRIIIA 158F纯合的患者更有效。
[00271]本发明涵盖根据FcγRIIB耗尽和FcγRIIIA选择来筛选酵母库，从而选择不仅具有对FcγRIIIIA的增强的亲合性而且具有对FcγRIIB的降低的亲合性的Fc突变体。通过连续的耗尽方法，例如，通过孵育酵母库与包被FcγRIIB的磁性珠子，可以富集酵母库中具有降低的FcγRIIB亲合性的克隆。优选的连续地进行FcγRIIB耗尽，从而富集所述库中具有降低的FcγRIIB亲合性的克隆。在某些实施方式中，FcγRIIB耗尽产生了细胞的群体，从而仅30％、优选的仅10％、更优选的仅5％、最优选的低于1％结合FcγRIIB。在某些实施方式中，FcγRIIB耗尽进行在3个循环、至少4个循环、至少6个循环。FcγRIIB耗尽步骤优选的与FcγRIIIIA选择步骤组合，例如使用FACS分选，从而选择具有增强的FcγRIIIIA亲合性的Fc变体。
5.2.5.1FACS分析；固相分析和基于免疫学的分析
[00272]本发明涵盖根据5.2.3节中描述的方法表征酵母表面细胞壁上展示的突变Fc融合蛋白。本发明的一个方面提供了选择具有期望的结合性质的突变Fc融合蛋白的方法，所述结合性质具体是，所述突变Fc融合蛋白以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA的能力。在另一个实施方式中，本发明提供了选择具有期望的结合性质的突变Fc融合蛋白的方法，所述结合性质具体是，所述突变体Fc融合蛋白以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA的能力，以及进一步的所述突变ü融合蛋白以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIB更低的亲合性结合FcγRIIB的能力。本领域技术人员将理解的是，可以使用本发明的方法用于鉴定和筛选具有任何期望的结合特征的、分子的Fc区中的任何突变。
[00273]可以筛选和通过本领域技术人员已知用于评估结合相互作用的任何基于生物化学或免疫学的分析来表征展示突变Fc融合蛋白的酵母细胞。
[00274]优选的，运用本领域技术人员已知的任何技术的荧光活化的细胞分选(FACS)被用于筛选酵母细胞表面上展示的突变Fc融合蛋白与FcγRIIIA、优选的FcγRIIIA四聚复合物、或可选的FcγRIIB的结合。流式分选机能够快速地检查大量的含有库插入物的单独的细胞(例如，每小时1000-10000万个细胞)(Shapiro et al.，Practical FlowCytometry，1995)。此外，用于优化的特定参数包括但不限于，配体浓度(即，FcγRIIIA四聚复合物)、动力学竞争时间或FACS严格度可以变化，以选择展示了具有特定结合性质的Fc融合蛋白的细胞，所述特定结合性质例如与包含野生型Fc区的可比较多肽相比更高的FcγRIIIA亲合性。用于分选和检查生物细胞的流式细胞计是本领域公知的。例如，在美国专利No.4,347,935、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796和6,211,477中描述了已知的流式细胞计；通过引用将它们的完整内容合并在此。其他已知的流式细胞计是BectonDickinson and Company制造的FACS VantageTM系统，和UnionBiometrica制造的COPASTM系统。
[00275]根据本发明优选的实施方式，通过荧光活化的细胞分选(FACS)来分析酵母细胞。在最优选的实施方式中，以反复的方式进行酵母细胞的FACS分析，至少两次、至少三次、或至少5次。在每一轮选择之间，使细胞生长并诱导，从而Fc区在最大数量的酵母细胞表面上展示。尽管不希望受特定作用方式的限制，这种重复过程有助于富集具有特定表型，例如对FcγRIIIA的高结合性的细胞群体。
[00276]在优选的实施方式中，筛选本发明的Fc变体包含具有多轮筛选，例如至少两轮筛选的选择过程。在一个实施方式中，筛选具有对FcγRIIIA增强的亲合性的Fc变体可以包含以下步骤：在第一轮筛选中，使用例如标记的四聚FcγRIIIA来选择具有增强的FcγRIIIA亲合性的Fc变体，通过FACS，优选的以重复的方式，来富集酵母细胞的库，例如107个细胞的天然库；被选择具有期望的表型，例如，对FcγRIIIA增强的结合的变异Fc区然后被导入抗体，例如4-4-20抗体中，使用第二筛选，例如ELISA来分析工程化的抗体与FcγR的结合。在第二轮筛选中，可以根据第一次筛选产生单突变库，从而Fc区携带显示了增强的FcγRIIIA亲合性的变体；在存在和不存在未标记的受体的情况下，使用例如标记的单体FcγRIIIA通过FACS来富集；然后将变异Fc区导入抗体，例如4-4-20抗体中，使用第二筛选，例如ELISA来分析工程化的抗体与FcγR的结合。在某些实施方式中，第二筛选可以进一步包括使用在此公开的方法在基于ADCC或BIAcore的分析中表征包含Fc变体的抗体。
[00277]本发明涵盖在平衡或动力条件下突变酵母库的FACS筛选。当筛选在平衡条件下进行时，携带Fc突变体的过量的酵母库以Kd的1/5-10的浓度与FcγRIIIA、优选的标记的FcγRIIIA孵育至少一小时以容许在平衡条件下Fc突变体与FcγRIIIA的结合。当筛选在动力条件下进行时，突变酵母库与标记的FcγRIIIA孵育；然后细胞与等摩尔未标记的FcγRIIIA孵育预定时间，然后监视结合的FcγRIIIA。
[00278]用FACS分析酵母细胞表达突变Fc融合蛋白的一个示范性的方法是共染色带有FcγRIIIA四聚复合物的细胞和抗Fc抗体，所述FcγRIIIA四聚复合物已经用荧光标记例如PE标记了，所述抗Fc抗体例如已经荧光标记了的F(ab)2抗-Fc。根据本发明的方法产生的酵母库的荧光测量优选的包括与对照比较；例如，缺乏插入物的酵母细胞，所述插入物编码包含Fc区的分子(阴性对照)。流式分选机合不仅具有快速地测量细胞中的荧光信号的能力，而且具有收集具有特定荧光性质的细胞的能力。这种特征可以应用于本发明的优选的实施方式来富集初始库群体中表达具有特定结合特征的Fc融合蛋白的细胞，所述结合特征例如与包含野生型Fc区的可比较多肽相比对FcγRIIIA更高的亲合性。在本发明优选的实施方式中，通过FACS和分选门来分析酵母细胞，所述分选门被建立以选择相对于酵母细胞上的Fc表达数量显示了对FcγRIIIA的最高亲合性的细胞。根据优选的实施方式，建立了四个连续的分选，其中对每个连续分选的门是5.5％、1％、0.2％和0.1％。优选的是，根据本发明的方法形成的酵母展示库被过量取样至少10倍，以提高分离稀有克隆的概率(例如，分析107个克隆的库的～108个细胞)。做为选择，建立25次分选来选择期望表型的细胞。可以由本领域技术人员经验性地建立分选门。
[00279]在其他优选的实施方式中，使用基于固相的分析，例如，使用磁性珠子的分析，例如，由Dynal所提供的，优选的以高通量的方式筛选酵母细胞表面上展示的突变Fc融合蛋白与FcγR，例如FcγRIIIA的结合。在一个实施方式中，磁性珠子分析可以用于鉴定具有对FcγRIIIA增强的亲合性和/或对FcγRIIB降低的亲合性的突变体。鉴定具有对FcγRIIIA增强的亲合性和对FcγRIIB降低的亲合性的突变体的示范性的分析可以包括，通过使用包被FcγRIIB的磁性珠子的连续固相耗尽、继之以用包被FcγRIIIA的磁性珠子进行选择，来选择突变体。例如，一种分析可以包括以下步骤：与包被FcγRIIB的磁性珠子孵育根据本发明的方法产生的酵母细胞的库；通过将混合物置于磁场中来从未结合的部分中分离与珠子结合的酵母细胞，移除未结合的酵母细胞并将它们置于新鲜培养基中；使酵母细胞与包被FcγRIIIA的珠子结合，通过将混合物置于磁场中来从未结合的部分中分离与珠子结合的酵母细胞，移除未结合的酵母细胞；通过剧烈的旋涡移除结合的细胞；在含葡萄糖的培养基中使回收的细胞生长；在含有半乳糖的选择培养基中重新诱导。重复选择过程至少一次。然后使用本领域已知的常规方法，例如，PCR来扩增含有Fc结构域的插入物，通过已经描述了进一步的特征的方法导入抗体。
[00280]在可选择的实施方式中，非基于酵母的系统被用于表征本发明的分子的结合性质。用于表征本发明的分子的示范性的系统包括含有抗荧光素单克隆抗体4-4-20的重链的哺乳动物表达载体，编码具有变异Fc区的本发明的分子的核酸被克隆到所述载体中。产生的重组克隆在哺乳动物宿主细胞系(即，人类肾脏细胞系293H)中表示，使用本领域技术人员已知的任何标准分析，包括但不限于ELISA和FACS，来分析产生的重组免疫球蛋白与FcγR的结合。
[00281]可以以各种方法表征本发明的分子(例如，抗体、融合蛋白、结合的分子)。特别地，包含修饰的Fc区的本发明的分子可以被分析与配体，例如FcγRIIIA四聚复合物免疫特异性结合的能力。这种分析可以在溶液中(例如，Houghten，Bio/Techniques，13：412-421，1992)、在珠子上(Lam，Nature，354：82-84，1991，on chips(Fodor，Nature，364：555-556，1993)、在细菌上(美国专利No.5,223,409)、在孢子上(美国专利No.5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、在质粒上(Cullet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1865-1869，1992)、或在噬菌体上(Scott and Smith，Science，249：386-390，1990；Devlin，Science，249：404-406，1990；Cwirla et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378-6382，1990；和Felici，J.Mol.Biol.，222：301-310，1991)进行(通过完全引用将这些参考文献的每一个合并在此)。已经被鉴定与配体，例如FcγRIIIA免疫特异性结合的分子，然后可以分析它们对该配体的特异性和亲合性。
[00282]已经被工程化以包含修饰的Fc区(例如，治疗性抗体)或已经在酵母展示系统中鉴定具有期望的表型(参见5.1节)的本发明的分子，可以通过本领域已知的任何方法分析与抗原(例如，癌症抗原)的免疫特异性结合以及与其他抗原(例如，FcγR)的交叉反应性。可用于分析免疫特异性结合和交叉反应性的免疫分析包括但不限于，使用例如Western印迹的技术的竞争性和非竞争性分析系统、放射性免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“三夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、互补-定影分析、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白质A免疫分析、to name but a few。这些分析是常规的和本领域公知的(参见，例如，Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York；通过完全引用将它合并在此)。
[00283]可以通过竞争性结合分析来测定包含修饰的Fc区的本发明的分子与配体，例如，FcγR四聚复合物的结合亲合性和相互作用的解离速率。竞争性结合分析的一个实例是放射免疫分析，包括在存在提高着数量的未标记配体例如四聚FcγR的情况下，孵育标记的配体例如四聚FcγR(例如，3H或125I)与目标分子(例如，包含修饰的Fc区的本发明的分子)，并检测与标记的配体结合的分子。通过scatchard分析根据饱和度数据，可以测定本发明的分子与配体的亲合性和结合解离速率。
[00284]在优选的实施方式中，使用BIAcore动力学分析来测定本发明的分子与配体例如FcγR的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析配体从芯片的结合和分离，所述芯片在它们的表面上具有固定化的分子(例如，包含修饰的Fc区的分子)。
5.2.6突变体的测序
[00285]任何本领域已知的各种测序反应可以被用于直接测序包含变异Fc区的本发明的分子。序列反应的实例包括基于由Maxim和Gilbert(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：560，1977)或Sanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463，1977)所开发的技术的那些。同样预期的是，可以使用各种自动化测序过程的任一种(Bio/Techniques，19：448，1995)，包括通过质谱法的测序(参见，例如，PCT公开No.WO 94/16101，Cohen et al.，Adv.Chromatogr.，36：127-162，1996和Griffin et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.，38：147-159，1993)。
5.2.7具有变异Fc区的分子的功能分析
[00286]本发明涵盖使用本领域已知用于鉴定分子的效应细胞功能的分析来表征本发明的分子(例如，包含通过上述酵母展示技术鉴定的变异Fc区的分子；或根据本发明的方法工程化的治疗性单克隆抗体)的方法。特别地，本发明涵盖表征本发明的分子的FcγR介导的效应细胞功能。根据本发明可以分析的效应细胞功能的实例包括但不限于，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用(opsonophagocytosis)、C1q结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性。可以使用本领域技术人员已知用于测定效应细胞功能活性的任何基于细胞的或无细胞的分析(对于效应细胞分析，参见，Perussiaet al.，2000，Methods Mol.Biol.121：179-92；Baggiolini et al.，1998Experientia，44(10)：841-8；Lehmann et al.，2000 J.Immunol.Methods，243(1-2)：229-42；Brown EJ.1994，Methods Cell Biol.，45：147-64；Munn et al.，1990 J.Exp.Med.，172：231-237，Abdul-Majidet al.，2002Scand.J.Immunol.55：70-81；Ding et al.，1998，Immunity8：403-411，通过完全引用将它们每一个合并在此)。
[00287]在一个实施方式中，可以在人类单核细胞中分析本发明的分子的FcγR介导的吞噬作用。做为选择，本发明的分子的FcγR介导的吞噬作用可以在其他吞噬细胞中分析，例如嗜中性白细胞(多形核白细胞；PMN)；人类外周血单核细胞，单核细胞衍生的，其可以通过本领域技术人员已知的标准过程来获得(例如，参见Brown EJ.1994，Methods Cell Biol.，45：147-164)。在一个实施方式中，通过早先描述的方法(Tridandapani et al.，2000，J.Biol.Chem.275：20480-7)，通过测量THP-1细胞吞噬荧光化的IgG调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力，来表征本发明的分子的功能。例如，测量包含具有增强的FcγRIIIA亲合性的变异Fc区的本发明的分子的吞噬作用的示范性的分析包括：用本发明的分子或不结合FcγRIIIA的对照抗体处理THP-1细胞，比较所述细胞的活性水平，其中细胞的活性(例如，丛簇活性(结合包被IgG的SRBC的THP-1细胞的数目)、附着活性(结合到THP-1细胞的SRBC的总数)、和吞噬速率)方面的差异将指明本发明的分子的功能。本领域技术人员可以理解的是，这种示范性的分析可以用于分析通过本发明的方法鉴定的任何分子。
[00288]用于测定本发明的分子的吞噬作用的另一个示范性的分析是抗体依赖性调理吞噬作用分析(ADCP)，其可以包括以下：用(i)针对荧光素的抗体(参见Bedzyk et al.，1989，J.Biol.Chem，264(3)：1565-1569，通过完全引用将它合并在此)野生型4-4-20抗体，作为FcγR依赖性ADCP的对照抗体；或(iii)携带破坏了对FcγRIII的结合的D265A突变的4-4-20抗体，作为FcγR依赖性ADCP的背景对照，(iii)带有通过本发明的方法鉴定、如实施例6.6中的例示产生的变异Fc区的4-4-20抗体包被目标生物粒子，例如Escherichia coli标记的FITC(Molecular Probes)或Staphylococcus aureus-FITC；并形成调理的粒子；以60∶1的比例将任何所描述的调理的粒子(i-iii)添加到THP-1效应细胞(可从ATCC获得的单核细胞系)以容许FcγR介导的吞噬作用发生；优选的在37℃孵育细胞和E.coli-FITC/抗体1.5小时；孵育(优选的在室温下2-3分钟)之后向细胞添加锥石蓝，来淬灭附着于细胞表面之外没有被内在化的细菌的荧光；将细胞转移到FACS缓冲液(例如，PBS中的0.1％BSA，0.1％叠氮化钠)中，使用FACS(例如，BDFACS Calibur)分析THP1细胞的荧光。优选的，通过FACS来分析在分析中使用的THP-1细胞的细胞表面FcγR的表达。THP-1细胞表达CD32A和CD64。CD64是高亲合性FcγR，其在根据本发明的方法进行ADCP分析时被封闭。优选的用100mg/mL可溶性IgG1或10％人类血清封闭THP-1细胞。为了分析ADCP的程度，优选的将门设置在THP-1细胞上，测量中值荧光强度。计算单个突变体的ADCP活性，作为对获得的野生型chMab 4-4-20的标准值来报道。将调理的粒子添加到THP-1细胞，从而调理的粒子与THP-1细胞的比例是30∶1或60∶1。在最优选的实施方式中，连同对照，例如培养基中的E.coli-FITC、E.coli-FITC和THP-1细胞(作为FcγR非依赖性ADCP活性)，E.coli-FITC、THP-1细胞和野生型4-4-20抗体(作为FcγR依赖性ADCP活性)，Ecoli-FITC、THP-1细胞、4-4-20D265A(作为FcγR依赖性ADCP活性的背景对照)，进行ADCP分析。
[00289]在另一个实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的任何标准方法，在效应细胞例如天然杀伤细胞中分析本发明的分子的FcγR介导的ADCC活性(参见，例如，Perussia et al.，2000，Methods Mol.Biol.121：179-92)。测定本发明的分子的ADCC活性的示范性的分析是基于51Cr释放分析，包括：用[51Cr]Na2CrO4(这种细胞膜可透过的分子一般被用于标记，因为它结合胞浆蛋白，虽然缓慢动力学的从细胞天然地释放，在目标细胞坏死之后大量地释放)标记目标细胞；用包含变异Fc区的本发明的分子调理目标细胞；在微量滴定板上以合适的目标细胞对效应细胞比例来组合调理的放射性标记的目标细胞和效应细胞；在37℃孵育细胞的混合物16-18小时；并分析放射性。因而可以测定本发明的分子的细胞毒性，例如，使用以下公式：裂解％＝(实验的cpm-目标渗漏cpm)/(洗涤剂裂解cpm-目标渗漏cpm)x 100％。做为选择，裂解％＝(ADCC-AICC)/(最大释放-自然的释放)。特异性裂解可以使用以下公式计算：特异性裂解＝本发明的分子的裂解％-不存在本发明分子时的裂解％。通过改变目标：效应细胞比例或抗体浓度，可以产生图表。
[00290]在又一个实施方式中，表征了本发明的分子的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，参见，例如，Ding et al.，Immunity，1998，8：403-11；通过完全引用将它合并在此。
[00291]优选的，在本发明的ADCC分析中使用的效应细胞是外周血单核细胞(PBMC)，其优选的是使用本领域技术人员已知的标准方法，例如使用Ficoll-Paque密度梯度离心从正常人血液纯化的。在本发明的方法中使用的优选的效应细胞表达不同的FcγR活化性受体。本发明涵盖效应细胞，表达FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIB的THP-1，以及来自全人血、表达FcγRIIIA和FcγRIIB的单核细胞衍生的原始巨噬细胞，来测定Fc抗体突变体是否显示相对于野生型IgG1抗体的提高的ADCC活性和吞噬作用。
[00292]人类单核细胞系THP-1通过高亲合性受体FcγRI和低亲合性受体FcγRIIA的表达来活化吞噬作用(Fleit et al.，1991，J.Leuk.Biol.49：556)。THP-1细胞不组成性地表达FcγRIIA或FcγRIIB。用细胞因子刺激这些细胞影响FcR表达模式(Pricop et al.，2000J.Immunol.166：531-7)。在存在细胞因子IL4的情况下THP-1细胞的生长诱导FcγRIIB表达并引起FcγRIIA和FcγRI表达的减少。FcγRIIB表达也可以通过提高细胞密度来增强(Tridandapani et al.，2002，J.Biol Chem.277：5082-9)。相比之下，已经报道了IFNg可以引起FcγRIIIA的表达(Pearse et al.，1993PNAS USA 90：4314-8)。细胞表面上受体的存在或缺乏可以使用本领域技术人员已知的常规方法通过FACS来测定。在细胞表面上细胞因子诱导的FcγR表达提供了在存在FcγRIIB的情况下测试活化作用和抑制作用的系统。如果THP-1细胞不能表达FcγRIIB，本发明还涵盖另一种人类单核细胞系，U937。这些细胞已经显示了在存在IFNg和TNF的情况下末期分化成巨噬细胞(Koren etal.，1979，Nature 279：328-331)。
[00293]在小鼠肿瘤模型中FcγR依赖性肿瘤细胞杀伤是由巨噬细胞和NK细胞介导的(Clynes et al.，1998，PNAS USA 95：652-656)。本发明涵盖使用来自供体的淘选的单核细胞作为效应细胞来分析Fc突变体在吞噬作用和ADCC分析中触发靶细胞的细胞毒性的效力。FcγRI、FcγRIIIA和FcγRIIB的表达模式受不同生长条件的影响。单核细胞、新鲜淘选的单核细胞、维持在10％FBS中的单核细胞、培养在FBS+GM-CSF和/或在人类血清中的单核细胞的FcγR表达可以使用本领域技术人员已知的常规方法来测定。例如，细胞可以用FcγR特异性抗体染色并通过FACS来分析以确定FcR分布型。然后将最好地模拟巨噬细胞体内FcγR表达的条件用于本发明的方法。
[00294]在某些实施方式中，本发明涵盖使用小鼠细胞，特别是在不能获得具有正确FcγR分布型的人类细胞时。在某些实施方式中，本发明涵盖小鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC)，其可以使用本领域已知的方法用人类FcγRIIIA转染并分离稳定的转染子，参见，例如，Ralph et al.，J.Immunol.119：950-4)。使用常规实验通过FACS分析可以测定转染子的FcγRIIIA表达，高表达体可以用于本发明的ADCC分析。在其他实施方式中，本发明涵盖从敲除的转基因小鼠，例如在此公开的那些小鼠分离表达人类FcγR的脾腹巨噬细胞。
[00295]使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)从供体的外周血(PBM)收获淋巴细胞。在分离的单核的细胞群体中，大多数ADCC活性经由在其表面含有FcγRIIIA而没有FcγRIIB的天然杀伤细胞(NK)发生。这些细胞的结果表明了突变体触发NK细胞ADCC的效力，并确定了用淘选的单核细胞进行测试的试剂。
[00296]用于本发明的ADCC的目标细胞包括但不限于，乳腺癌细胞系，例如，具有ATCC登记号HTB-30的SK-BR-3(参见，例如Trempet al.，1976，Cancer Res.33-41)；B-淋巴细胞；来自Burkitts淋巴瘤的细胞，例如具有ATCC登记号CCL-86的Raji细胞(参见，例如Epstein et al.，1965，J.Natl.Cancer Inst.34：231-240)，和具有ATCC登记号CCL-213的Daudi细胞(参见，例如，Klein et al.，1968，CancerRes.28：1300-10)。目标细胞必须被要分析的免疫球蛋白的抗原结合位点识别。
[00297]ADCC分析是基于NK细胞经由细胞凋亡途径介导细胞死亡的能力。NK细胞部分地通过FcγRIIIA识别细胞表面上结合到抗原的IgG来介导细胞死亡。根据本发明的方法使用的ADCC分析可以是基于放射性的分析或基于荧光的分析。用于表征包含变异Fc区的本发明的分子的ADCC分析包括，标记目标细胞，例如SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi细胞，用抗体调理目标细胞，所述抗体仅有它的抗原结合位点识别目标细胞上的细胞表面受体；以合适的比例组合标记的调理的目标细胞和效应细胞，所述比例可以通过常规实验来确定；收获细胞；根据所使用的标记使用适当的检测方案，检测裂解的目标细胞的上清液中的标记。可以使用本领域已知的标准方法用放射性标记或荧光标记来标记目标细胞。例如，标记包括但不限于，[51Cr]Na2CrO4；和荧光增强配体的乙酰基甲基酯，2，2’：6’，2”-terpyridine-6-6”-二羧酸(TDA)。
[00298]在特别优选的实施方式中，时间分辨的荧光分析被用于测量针对目标细胞的ADCC活性，所述目标细胞已经用荧光增强配体的乙酸基甲基酯，2，2’：6’，2”-terpyridine-6-6”-二羧酸(TDA)标记。这种荧光分析是本领域已知的，例如，参见Blomberg et al.，1996，Journalof Immunological Methods，193：199-206；通过完全引用将它合并在此。简要地，用TDA的膜可透性乙酸基甲基二酯(二(乙酸基甲基)2，2’：6’，2”-terpyridine-6-6”-二羧酸，(BATDA)来标记目标细胞，其快速地扩散跨越活细胞的细胞膜。细胞内的酯酶裂解酯基，重新产生的膜不透性TDA分子被捕获在细胞内部。在37℃、5％CO2下孵育效应物和目标细胞，例如，至少两个小时、多至3.5小时之后，用Eu3+螯合从裂解的目标细胞释放的TDA，在时间分辨的荧光计(例如，Victor 1420，Perkin Elmer/Wallac)中测定所形成的铕-TDA螯合物的荧光。
[00299]在另一个特定实施方式中，用于表征包含变异Fc区的本发明的分子的ADCC分析包括以下步骤：用二(乙酸基甲基)2，2’：6’，2”-terpyridine-t-6”二羧酸(DELFIA BATDA 试剂，PerkinElmer/Wallac)标记优选的4-5×106个目标细胞(例如，SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji细胞)。对于最佳的标记效力，用于ADCC分析的目标细胞是数目应优选的不超过5×106个。将BATDA试剂添加到细胞，在37℃、优选的在5％CO2下孵育混合物至少30分钟。然后用生理学的缓冲液，例如，有0.125mM sulfinpyrazole的PBS，和含有0.125mM sulfinpyrazole的培养基洗涤细胞。然后用包含变异Fc区的本发明的分子，即，包含本发明的变异Fc区的免疫球蛋白，包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体或嵌合抗体，来调理(包被)标记的目标细胞。在优选的实施方式中，在ADCC分析中使用的包含变异Fc区的免疫球蛋白特异于细胞表面受体、肿瘤抗原或癌症抗原。其中导入了本发明的变异Fc区的免疫球蛋白可以特异性结合任何癌症或肿瘤抗原，例如，5.4节列出的那些。另外，其中导入了本发明的变异Fc区的免疫球蛋白可以是特异于癌症抗原的任何治疗性抗体，例如5.4节中列出的那些。在某些实施方式中，在ADCC分析中使用的包含变异Fc区的免疫球蛋白是抗荧光素单克隆抗体4-4-20(Kranz et al.，1982 J.Biol.Chem.257(12)：6987-6995)、小鼠-人类嵌合抗CD20单克隆抗体2H7(Liu et al.，1987，Journal of Immunology，139：3521-6)；或针对人类表皮生长因子受体2(p185HER2)的人源化抗体(Ab4D5)(Carteret al.(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-9)。根据其中导入了本发明的变异Fc区的免疫球蛋白选择ADCC分析中的目标细胞，从而所述免疫球蛋白特异性地结合目标细胞的细胞表面受体。优选的，使用携带本发明的Fc变体的超过一种工程化的抗体，例如，抗Her2/neu、4-4-20、2B6、Rituxan和2H7，进行本发明的ADCC分析。在最优选的实施方式中，本发明的Fc变体被导入至少3种抗体，测试它们的ADCC活性。虽然不希望受特定作用机制的限制，在这些功能分析中检查至少3中抗体将减少错误地除去可行的Fc突变的机会。
[00300]将调理的目标细胞添加到效应细胞，例如，PBMC，来产生约50∶1、75∶1或100∶1的效应：目标比例。在特定的实施方式中，当包含变异Fc区的免疫球蛋白具有4-4-20的可变区时，效应：目标是75∶1。在37℃、在5％CO2下，孵育效应细胞和目标细胞至少两小时、多至3.5小时。收获细胞上清液并添加到酸性铕溶液(例如，DELFIA铕溶液，Perkin Elmer/Wallac)。在时间分辨的荧光计(例如，Victor1420，Perkin Elmer/Wallac)中测定形成的铕-TDA螯合物的荧光。通过与1％TX-100和单独的培养基分别孵育目标细胞，测定最大释放(MR)和自然的释放(SR)。通过在不存在抗体的情况下孵育目标和效应细胞，测量抗体依赖性细胞毒性(AICC)。每个分析优选的进行三份。将特异性裂解平均百分比计算为：实验释放(ADCC)-AICC)/(MR-SR)×100
[00301]本发明涵盖在NK依赖性和巨噬细胞依赖性ADCC分析中表征Fc变体。本发明的Fc变体具有改变的表型，例如改变的效应物功能，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性分析中所分析的。
[00302]本发明涵盖本领域已知和在此例示的分析，来结合C1q和介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。为了测定C1q结合，可以进行C1q结合ELISA。示范性的分析可以包含以下的：用多肽变体或起始多肽(对照)在包被缓冲液中包被分析平板在4℃过夜。然和可以洗涤和封闭平板。在洗涤之后，将等分量的人类C1q添加到每个孔，在室温下孵育2小时。进一步的洗涤之后，可以将100uL绵羊抗补体C1q过氧化物酶结合的抗体添加到每个孔，在室温下孵育1小时。可以再次用洗涤缓冲液洗涤平板，将含有OPD(O-间苯二胺二氢氯化物(Sigma))的100ul底物缓冲液添加到每个孔中。通过黄色的外观观察到的氧化反应可以容许进行30分钟，通过添加100ul 4.5NH2 SO4来停止。然后可以在(492-405)nm读取吸光度。
[00303]根据本发明的优选的变体是显示了C1q结合的明显减少的变体，如在这种分析或类似的分析中所检测和测量的。优选的，与具有未突变的IgG1 Fc区的对照抗体相比，包含Fc变体的分析显示了C1q结合中约50倍的降低、约60倍、约80倍、或约90倍降低。在最优选的实施方式中，包含Fc变体的分子不结合C1q，即，与对照抗体相比，所述变体显示了C1q结合中约100倍或更多的降低。
[00304]另一种示范性的变体是与包含野生型Fc区的分子相比具有对人类C1q更好的结合亲合性的变体。与包含野生型Fc区的亲本分子相比，这种分子可以显示在人类C1q结合中，例如，约两倍或更多，优选的约五倍或更多的改善。例如，与包含野生型Fc区的分子相比，人类C1q结合可以被改善约两倍到约500倍，优选的从约两倍或从约5倍到约1000倍。
[00305]为了评估补体激活，可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)分析，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的，通过完全引用将其合并在此。简要地，可以用缓冲液稀释这种浓度的包含变异Fc区的分子和人类补体。表达被包含变异Fc区的分子所结合的抗原的细胞可以被稀释到约1×106细胞/ml的密度。包含变异Fc区的分子、稀释的人类补体和表达抗原的细胞的混合物可以添加到平底组织培养96孔平板上，容许在37℃、5％CO2下孵育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后可以向每个孔添加50uL的alamar蓝(Accumed International)，并在37℃孵育过夜。用530nm的激发和590nm的发射，使用96孔荧光计测量吸光度。结果以相对荧光单位(RFU)表示。可以根据标准曲线计算样品浓度，为每个感兴趣的变体报告与非变异分子，即，包含野生型Fc区的分子相比的百分比活性。
[00306]在某些实施方式中，本发明的Fc变体不活化补体。优选的，所述变体在上述CDC分析中不显现具有任何CDC活性。本发明还涉及与亲本分子(包含野生型Fc区的分子)相比具有增强的CDC的变体，例如，在体外或体内显示了CDC活性方面约两倍到约100倍的改善(例如，以每个被比较分子的IC50)。可以用豚鼠、兔或人类血清进行补体分析。通过监视细胞内酶，例如乳酸脱氢酶(LDH)的释放，如Korzeniewski et al.，1983Immunol.Methods 64(3)：313-20；和Decker et al.，1988 J.ImmunolMethods 115(1)：61-9所描述的，通过完全引用将每一个合并在此；或细胞内标记，例如Europium、铬51或铟111的释放，其中目标细胞如在此描述的进行标记，可以检测目标细胞的补体裂解。
5.2.8其他分析
[00307]包含变异Fc区的本发明的分子也可以使用本领域已知用于表征Fc-FcγR相互作用结合的动力参数的任何基于表面胞质团共振的分析来分析。包括但不限于可从Biacore AB(Uppsala，Sweden)获得的BIAcore仪器；可从Affinity Sensors(Franklin，MA.)获得的IAsys仪器；可从Windsor Scientific Limited(Berks，UK)获得的IBIS系统，可从Nippon Laser and Electronics Lab(Hokkaido，Japan)获得的SPR-CELLIA系统以及可从Texas Instruments(Dallas，TX)获得的SPR Detector Spreeta的任何SPR仪器可以用于本发明。基于SPR的技术的综述参见Mullet et al.，2000，Methods 22：77-91；Donget al.，2002，Review in Mol.Biotech.，82：303-23；Fivash et al.，1998，Current Opinion in Biotechnology 9：97-101；Rich et al.，2000，CurrentOpinion in Biotechnology 11：54-61，通过完全引用将它们所有的合并在此。此外，在美国专利No.6,373,577；6,289,286；5,322,798；5,341，215；6,268,125中描述用于测量蛋白-蛋白相互作用的任何SPR仪器和基于SPR的方法是本发明的方法所预期的，通过完全引用将它们所有的合并在此。
[00308]简要地，基于SPR的分析包括将结合配对的成员固定在表面上，在溶液中实时地监视它与结合配对的另一个成员的相互作用。SPR基于测量在发生复合物形成或分离的表面附近溶剂折射率的变化。在其上发生固定作用的表面是传感器芯片，它是SPR技术的核心；它由包被有金的薄层的玻璃表面组成，形成了一批专门化的表面的基础，所述表面被设计以优化分子与表面的结合。各种传感器芯片是商业上可获得的，特别是来自以上列出的公司，所有这些都可以用于本发明的方法中。传感器芯片的实例包括可从BIAcore AB，Inc.获得的那些，例如，传感器芯片CM5、SA、NTA和HPA。可以使用本领域已知的任何固定方法和化学作用将本发明的分子固定在传感器芯片的表面上，包括但不限于，经由胺基的直接共价联结、经由硫氢基的直接共价联结、生物素附着到抗生物素蛋白包被的表面、醛联结到碳水化物基团、以及通过组氨酸tag与NTA芯片附着。
[00309]在某些实施方式中，可以使用BIAcore仪器(例如，BIAcore仪器1000，BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)来测定包含变异Fc区的本发明的分子，例如包含变异Fc区的免疫球蛋白，与FcγR的结合的动力参数。任何FcγR可以用于评估与包含变异Fc区的本发明的分子的相互作用。在特定的实施方式中，FcγR是FcγRIIIA，优选的是可溶的单体FcγRIIIA。例如，在一个实施方式中，可溶的单体FcγRIIIA是连接到接头-AVITAG序列的FcγRIIIA的细胞外区域(参见，2003年1月9日提交的美国临时申请No.60/439,498(Attorney Docket No.11183-004-888)和2003年3月19日提交的美国临时申请No.60/456,041，通过完全引用将它们合并在此)。在另一个特定的实施方式中，所述FcγR是FcγRIIB，优选的是可溶的二聚FcγRIIB。例如，在一个实施方式中，根据在2003年1月13日提交的美国临时申请No.60/439,709中描述的方法制备可溶的二聚FcγRIIB蛋白，通过完全引用将它合并在此。
[00310]使用BIAcore仪器测定包含变异Fc区的分子与FcγR的动力参数的示范性的分析包括以下，其中所述分子是4-4-20抗体：将BSA-FITC固定在传感器芯片表面的四组流动细胞之一上，优选的通过胺联结化学作用，从而BSA-FITC的约5000个应答单位(RU)被固定在表面上。一旦制备了表面，使携带Fc突变的4-4-20抗体通过所述表面，优选的通过以5μL/mL的流速、20μg/mL溶液的一分钟注射。结合到表面的4-4-20抗体的水平在400和700RU之间。然后，将HBS-P缓冲液(20mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA，pH 7.5)中受体(FcγRIIA和FcγRIIB-Fc融合蛋白)的稀释系列以100μL/min注射到表面上。不同的受体稀释度之间的抗体再生优选的通过100mMNaHCO3pH 9.4；3M NaCl的单次5秒注射液来进行。本领域已知的任何再生技术是本发明的方法预期的。
[00311]一旦收集到完整的数据集，使用由SPR仪器厂家，例如BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的计算机算法将产生的结合曲线全局性地拟合。这些算法计算Kon和Koff，从中作为两个速率常数的比例(即，Koff/Kon)推断出表观平衡结合常数Kd。如何产生单独的速率常数的更详细的处理可以在BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中找到。使用本领域已知的任何方法可以进行对产生的数据的分析。解释所产生的动力学数据的各种方法的综述，参见Myszka，1997，Current Opinion in Biotechnology8：50-7；Fisher et al.，1994，Current Opinion in Biotechnology 5：389-95；O’Shannessy，1994，Current Opinion in Biotechnology，5：65-71；Chaiken et al.，1992，Analytical Biochemistry，201：197-210；Mortonet al.，1995，Analytical Biochemistry 227：176-85；O’Shannessy et al.，1996，Analytical Biochemistry 236：275-83，通过完全引用将它们所有的合并在此。
[00312]在优选的实施方式中，使用SPR分析例如BIAcore确定的动力参数可以用作本发明的分子在功能分析例如ADCC中如何起作用的预示性度量。根据从SPR分析获得的动力参数预测本发明的分子的效力的示范性的方法可以包括以下的：测定本发明的分子结合FcγRIIIA和FcγRIIB的Koff值；相对ADCC数据标绘(1)FcγRIIIA的Koff(wt)/Koff(mut)；(2)FcγRIIB的Koff(mut)/Koff(wt)。比一高的数字显示了相对于野生型、对FcγRIIIA降低的离解速率和对FcγRIIB升高的离解速率；并具有增强的ADCC功能。
5.3重组产生本发明的分子的方法
5.3.1编码本发明的分子的多核苷酸
[00313]本分子还包括编码分子的多核苷酸，所述分子包括通过本发明的方法鉴定的多肽和抗体。通过本领域已知的任何方法可以获得编码本发明的分子的多核苷酸，测定所述多核苷酸的核苷酸序列。
[00314]一旦确定了通过本发明的方法鉴定的分子(例如，抗体)的核苷酸序列，可以使用本领域公知的方法操作该核苷酸序列，例如，重组DNA技术、定点诱变、PCR，等等(参见，例如，在Sambrook etal.，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；和Ausubel etal.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY中描述的技术，通过完全引用将它们合并在此)，通过例如产生氨基酸替换、删除和/或插入来产生，例如，具有不同氨基酸序列的抗体。
[00315]在特定的实施方式中，当核酸编码抗体时，使用常规的重组DNA技术将一个或多个CDR插入到骨架区内。骨架区可以是天然发生的或共有的骨架区，优选的是人类骨架区(参见，例如，Chothia etal.，1998，J.Mol.Biol.278：457-479关于人类骨架区的列表)。
[00316]在另一个实施方式中，本领域中可用的人类库或任何其他库可以通过本领域已知的标准技术来筛选，以克隆编码本发明的分子的核酸。
5.3.2本发明的分子的重组表达
[00317]一旦获得了编码本发明的分子(例如，抗体)的核酸序列，可以使用本领域公知的技术通过DNA重组技术产生用于生产该分子的载体。本领域技术人员公知的方法可用于构建表达载体，所述表达载体含有本发明的分子的编码序列和合适的转录和翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成的技术和体内遗传重组。(参见，例如在Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY和Ausubel et al.eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY中描述的技术)。
[00318]包含通过本发明的方法鉴定的分子(例如，抗体)的核苷酸序列的表达载体，可以通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞来产生本发明的分子。在特定的实施方式中，本发明的分子的表达受到组成型、可诱导的、或组织特异性启动子的调节。
[00319]用于表达通过本发明的方法鉴定的分子的宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌，或优选的，是真核细胞，特别是对于完全重组免疫球蛋白分子的表达。特别地，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，以及载体，例如来自人类巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking et al.，1998，Gene 45：101；Cockett et al.，1990，Bio/Technology 8：2)。
[00320]可以利用各种宿主-表达载体系统来表达通过本发明的方法鉴定的分子。这种宿主-表达系统代表载体，通过所述载体可以产生和随后纯化本发明的分子的编码序列，还代表细胞，当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，所述细胞可以原位表达本发明的分子。这些包括但不限于，用含有通过本发明的方法鉴定的分子的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如，E.coli和B.subtilis)；用含有编码本发明的方法鉴定的分子的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，SaccharomycesPichia)；用含有编码本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有编码本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV)感染的，或重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见U.S.5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的人类视网膜细胞)，所述构建体含有来自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
[00321]在细菌系统中，取决于要表达的分子的预定用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量的这种蛋白，用于抗体的药物组合物的生产时，指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体是期望的。这种载体包括但不限于，E.coli表达载体pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.2：1791)，其中抗体编码序列可以与lac Z编码区按读码框地单独连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13：3101-3109；VanHeeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等等。pGEX载体也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，这种融合蛋白是可溶的，通过吸附和结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠子继之以在存在游离谷胱甘肽的情况下的洗脱，可以容易地从裂解的细胞制备。pGEX载体被设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，从而克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
[00322]在昆虫系统中，Autographa californica核多角体病病毒(AcNPV)被用作载体来表达外源基因。病毒在Spodoptera frugeperda细胞中生长。抗体编码序列可以单独地克隆到病毒的非关键区(例如，polyhedrin基因)并置于AcNPV启动子(例如，polyhedrin启动子)的控制之下。
[00323]在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，感兴趣的抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联的前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。在病毒基因组的非关键区(例如，区域E1或E3)中的插入将产生存活的和能在感染的宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒(例如，参见，Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359)。特定的起始信号也可能是插入的抗体编码序列的有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框相符以确保完整插入物的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子，等等，可以增强表达的效力(参见，Bittner et al.，1987，Methods in Enzymol.153：51-544)。
[00324]此外，可以选择宿主细胞菌株，其调节插入的序列的表达，或以期望的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞对于翻译后加工和蛋白与基因产物的修饰具有特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用真核的宿主细胞，其具有用于原始转录产物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
[00325]对于长期的、高产量的重组蛋白质生产，稳定的表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达本发明的抗体的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由适合的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点，等等)控制的DNA和选择标记来转化宿主细胞。在导入外源DNA之后，可以容许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予了对选择的抗性，容许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，并生长形成foci，其随后可被克隆和扩大成细胞系。这种方法可以有利地用于工程化表达本发明的抗体的细胞系。这种工程化的细胞系在筛选和评估与本发明的抗体直接或间接作用的化合物中是特别有用的。
[00326]可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶((Wigler et al.，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖茎酶(Szybalska&Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，1980，Cell 22：817)基因，可以分别应用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。并且，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性((Wigler et al.，1980，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77：357；O’Hareet al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，其孵育对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu and Wu，1991，3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；and Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)：155-215)。可以使用的DNA重组技术领域通常已知的方法是Ausubel et al.(eds.)，1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；and in Chapters 12and 13，Dracopoli et al.(eds)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.150：1中描述的；和hygro，其赋予对匀霉素的抗性(Santerre et al.，1984，Gene 30：147)。
[00327]通过载体扩增(对于综述，参见Bebbington and Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3(AcademicPress，New York，1987)，可以提高本发明的抗体的表达水平。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞的培养物中存在的抑制物水平的提高将提高标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相连，抗体的生产也将提高(Crouse et al.，1983，Mol.Cell.Biol.3：257)。
[00328]可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以含有相同的选择标记，其允许重链和轻链多肽的等量表达。做为选择，可以使用编码重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况中，轻链应当置于重链之前以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot，1986，Nature322：52；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
[00329]一旦重组表达了本发明的分子(即，抗体)，它可以通过本领域已知用于多肽或抗体的纯化的任何方法来纯化，例如，通过层析(例如，离子交换、亲合性、特别是通过蛋白A对特定抗原的亲合性，和大小柱层析)、离心、差异溶解，或通过用于多肽或抗体的纯化的任何其他标准技术。
5.4预防和治疗方法
[00330]本发明涵盖向动物、优选的哺乳动物、最优选的人类施用一种或多种本发明的分子(例如，抗体)来预防、治疗或改善与疾病、失调或感染有关的一种或多种症状。本发明的分子对于疾病或失调的治疗或预防是特别有用的，在所述治疗或预防中由FcγR介导的效应细胞功能(例如，ADCC)的增强的效力是期望的。本发明的方法和组合物对于原发或转移性肿瘤疾病(即，癌症)和传染性疾病的治疗和预防是特别有用的。本发明的分子可以如本领域已知的或如在此描述的以药学上可接受的组合物来提供。如以下详述的，本发明的分子可以用于治疗或预防癌症(特别在被动免疫治疗中)、自体免疫疾病、炎症性失调或传染性疾病的方法中。
[00331]本发明的分子也可以有利地与本领域已知用于癌症、自体免疫疾病、炎症性失调或传染性疾病的治疗或预防的其他治疗试剂一同使用。在特定的实施方式中，本发明的分子可以与单克隆或嵌合抗体、淋巴因子、造血的生长因子(例如，IL-2、IL-3和IL-7)组合使用，它们被用来提高与所述分子作用的效应细胞的数目或活性，和提高免疫反应。本发明的分子也可以有利地与用于治疗疾病、失调或感染药物组合使用，例如抗癌药剂、抗炎症药剂或抗病毒剂，例如以下的5.4.1.2和5.4.2.1节中详述的。
5.4.1癌症
[00332]本发明涵盖用于在受试者中治疗或预防癌症或转移的方法和组合物，包括向受试者施用治疗有效量的包含变异Fc区的一种或多种分子。
[00333]包含变异Fc区的本发明的分子(即，多肽、抗体)可以用于防止、抑制或降低原发肿瘤或癌细胞的转移的生长。在一个实施方式中，本发明的分子包含变异Fc，所述变异Fc以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，和/或所述变异Fc区具有增强的效应物功能，例如，ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用，等等。这种分子可以单独使用来治疗或预防癌症。在另一个实施方式中，本发明的分子包含变异Fc区，所述变异Fc区以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，并进一步以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIB更低的亲合性结合FcγRIIB，和/或所述变异Fc区具有增强的效应物功能，例如ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用，等等。这种分子也可以单独使用来治疗或预防癌症。
[00334]在某些实施方式中，本发明涵盖在具有FcγR多态性的受试者，例如对FgRIIIA-158V或FcγRIIIA-158F等位基因纯合的那些受试者中治疗或预防癌症的方法和组合物。在某些实施方式中，本发明涵盖根据本发明的方法工程化治疗性抗体，例如，肿瘤特异性单克隆抗体，从而工程化的抗体在FcγRIIIA(158F)的低亲合性等位基因纯合的患者中具有增强的效力。在其他实施方式中，本发明涵盖根据本发明的方法工程化治疗性抗体，例如，肿瘤特异性单克隆抗体，从而工程化的抗体在FcγRIIIA(158V)的高亲合性等位基因纯合的患者中具有增强的效力。
[00335]在某些实施方式中，本发明的工程化的抗体在治疗和/或预防非Hodgkin’s淋巴瘤(NHL)中是特别有效的。本发明的工程的抗体比NHL的当前治疗方式，包括但不限于化学疗法和使用抗CD20mAb，Rituximab的免疫治疗是治疗上更有效的。然而抗CD20单克隆抗体的效力取决于受试者的FcγR多态性(Carton et al.，2002Blood，99：754-8；Weng et al.，2003 J Clin Oncol.21(21)：3940-7，通过完全引用将它们两个合并在此。这些受体在效应细胞表面表达并介导ADCC。低亲合性活化受体的高亲合性等位基因改善效应细胞介导ADCC的能力。本发明的方法容许携带Fc突变的工程化的抗-CD20抗体经由它们改变的Fc结构域来增强它们对效应细胞上FcγR的亲合性。本发明的工程化的抗体为患者提供了不考虑患者的FcγR多态性的更好的免疫治疗试剂。
[00336]在受试者中测定工程化的抗-CD20抗体的效力的示范性的方法可以包括以下的：携带具有Fc突变的嵌合抗-HER2/neu重链基因的质粒，可以用作主干来转移来自Rituximab重链基因的可变区，所述Fc突变显示了ADCC中实质上提高的杀伤。用来自Rituximab的可变区替换抗-HER2/neu Fc变体的可变区。含有野生型Fc结构域或取消FcR结合的D265A突变、或抗-CD20Fc变体的质粒，与Rituximab轻链基因短暂地共转染到293H细胞中，在蛋白G柱上使用常规方法纯化条件培养基和抗体。
[00337]使用培养的B细胞系通过ADCC测试携带Fc变体的抗-CD20mAbs，来测定Fc突变增强ADCC的能力。使用在此公开的方法进行标准的ADCC。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)从供体的外周血收获淋巴细胞。用Europium(PerkinElmer)加载目标Daudi细胞、表达CD20的B细胞系，在37℃与效应物孵育4小时。使用荧光板读数器(Wallac)检测释放的Europium。产生的ADCC数据表明Fc变体触发NK细胞介导的细胞毒性的效力，并确定了哪些抗-CD20Fc变体可以用患者样品和淘选的单核细胞来测试。然后使用来自患者的PBMC在ADCC分析中测试显示了增强抗-CD20抗体的效力的最大可能性的Fc变体。来自健康供体的PBMC用作效应细胞。在来自患有滤泡性淋巴瘤的患者的原始淋巴瘤细胞中进行使用抗-CD20变体和Rituximab的体外ADCC分析。使用本领域已知的方法测定供体的特定FcγR多态性并编目。通过来自具有不同的FcγRIIIA和FcγRIIA基因型的患者的效应细胞进行ADCC分析。
[00338]根据本发明的一个方面，包含变异Fc区的本发明的分子(例如，抗体)，相对于含有野生型Fc区的分子，通过提高的抗体效应物功能的效力，例如，ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用等等，来增强癌症免疫治疗的效力。在特定的实施方式中，使用具有变异Fc区的本发明的分子增强了抗体依赖性细胞毒性和/或肿瘤细胞的吞噬作用。本发明的分子可以通过增强至少一种抗体介导的效应物功能来增强免疫疗法癌症治疗的效力。在一个特定的实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子通过增强补体依赖性级联来增强免疫疗法治疗的效力。在本发明的另一个实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子通过增强目标肿瘤细胞的吞噬作用和/或调理作用来增强免疫疗法治疗的效力。在本发明的另一个实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子通过在目标肿瘤细胞的破坏中促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)来增强治疗的效力。
[00339]本发明进一步期待工程化的治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)用于增强治疗性抗体的治疗效力，例如，通过增强所述治疗性抗体的效应物功能(例如，ADCC)。优选的，所述治疗性抗体是细胞毒的和/或调理抗体。本领域技术人员将理解的是，一旦根据本发明的方法鉴定了(参见5.2节和表8)具有期望的结合性质(例如，具有有至少一个氨基酸修饰的变异Fc区的分子，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述修饰增强所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性)的分子，可以使用标准的重组DNA技术和任何已知的技术，如5.2.2节中所描述的，工程化治疗抗体来产生携带具有期望的结合性质的所鉴定突变位点的工程化的治疗剂。已经在癌症治疗中证明了治疗实用性的表9中所列的任何治疗性抗体，可以根据本发明的方法工程化，例如，通过修饰Fc区以具有与具野生型Fc区的治疗性抗体相比的、对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的增强的亲合性，并用于以癌症抗原为特征的癌症的治疗和/或预防。其他治疗性抗体包括针对病原体的那些，例如针对Streptococcus pneumoniae血清型6B的那些，参见，例如Sun et al.，1999，Infection and Immunity，67(3)：1172-9。
[00340]本发明的Fc变体可以掺入治疗性抗体，例如在此公开的那些，或其他Fc融合物临床候选物，即，已经批准用于临床试验的包含Fc区的分子，或其他任何可得益于本发明的Fc变体的分子，它们的人源化的、亲合性成熟的、修饰的或工程化的型式。
[00341]本发明还涵盖根据本发明的方法来工程化具有治疗实用性包含Fc区的任何其他多肽，包括但不限于ENBREL，来增强这些多肽的治疗效力，例如，通过增强包含Fc区的多肽的效应物功能。
表9.可以根据本发明的方法被工程化的治疗性抗体
[00342]因此，本发明提供了使用治疗性抗体预防或治疗以癌症抗原为特征的癌症的方法，所述治疗性抗体结合癌症抗原，并且是细胞毒性的，已经根据本发明在Fc区中一个或多个位点修饰，以比亲本治疗性抗体更高的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，和/或更有效地介导效应物功能(例如，ADCC、吞噬作用)。在另一个实施方式中，本发明提供了使用治疗性抗体预防或治疗以癌症抗原为特征的癌症的方法，所述治疗性抗体结合癌症抗原，并且是细胞毒性的，已经根据本发明的方法工程化，来以比亲本治疗性抗体更高的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA并以更低的亲合性结合FcγRIIB，和/或更有效地介导效应物功能(例如，ADCC、吞噬作用)。根据本发明工程化的治疗性抗体对于癌症的预防或治疗是有用的，因为它们具有增强的细胞毒活性(例如，增强的肿瘤细胞杀伤和/或增强的，例如ADCC活性或CDC活性)。
[00343]与癌症抗原相关的癌症可以通过施用治疗性抗体来治疗或预防，所述治疗性抗体结合癌症抗原并且是细胞毒的，并且已经根据本发明的方法工程化以具有例如增强的效应物功能。在一个特定的实施方式中，根据本发明的方法工程化的治疗性抗体增强了针对特定癌症抗原的抗体的抗体介导的细胞毒效果。例如而不是为了限制，与以下癌症抗原相关的癌症可以通过本发明的方法和组合物来治疗或预防：KS 1/4泛癌抗原(Perez and Walker，1990，J.Immunol.142：32-37；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)、卵巢癌抗原(CA125)(Yuet al.，1991，Cancer Res.51(2)：48-475)、前列腺酸磷酸盐(Tailor etal.，1990，Nucl.Acids Res.18(1)：4928)、前列腺特异性抗原(Henttuand Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.10(2)：903-910；Israeliet al.，1993，Cancer Res.53：227-230)、黑素瘤相关抗原p97(Estin etal.，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)：445-44)、黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl et al.，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali et al.，1987，Cancer59：55-3；Mittelman et al.，1990，J.Clin.Invest.86：2136-2144))、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon et al.，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13：294)、多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原例如：CEA、TAG-72(Yokata et al.，1992，CancerRes.52：3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar et al.，1993，Int.J.Cancer53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn et al.，1982，J.Clin.Immunol.2：135)、CTA-1和LEA，Burkitt’s淋巴瘤抗原-38.13，CD19(Ghetie etal.，1994，Blood 83：1329-1336)、人类B淋巴瘤抗原-CD20(Reff et al.，1994，Blood 83：435-445)、CD33(Sgouros et al.，1993，J.Nucl.Med.34：422-430)、黑素瘤特异性抗原例如神经节苷脂GD2(Saleh et al.，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara et al.，1993，Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston et al.，1994，J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon et al.，1993，Cancer Res.53：5244-5250)、细胞表面抗原的肿瘤特异性移植类型(TSTA)例如virally诱导的肿瘤抗原，包括T抗原DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白例如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(Hellstrom et al.，1985，Cancer.Res.45：2210-2188)、分化抗原，例如人类肺癌抗原L6，L20(Hellstrom et al.，1986，Cancer Res.46：3917-3923)、纤维肉瘤的抗原、人类白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al.，1988，J.of Immun.141：1398-1403)、新糖蛋白(neoglycoprotein)、鞘脂类、乳癌抗原例如EGFR(Epidermal growth factor receptor)、HER2抗原(p185HER2)、多态上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens et al.，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17：359)、恶性人类淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard et al.，1989，Science 245：301-304)、分化抗原(Feizi，1985，Nature 314：53-57)例如胎儿红细胞和原内胚层中发现的I抗原、胃腺癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮细胞中发现的M18和M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、结肠直肠癌症中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5和D156-22、结肠腺癌中发现的TRA-1-85(血群H)、C14、肺腺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、Y半抗原、胚胎癌细胞中发现的Ley、TL5(血群A)、A431细胞中发现的EGF受体、胰腺癌中发现的E1系列(血群B)、胚胎癌细胞、胃腺癌中发现的FC10.2、腺癌中发现的CO-514(血群Lea)、腺癌中发现的NS-10、CO-43(血群Leb)、G49、EGF受体、结肠腺癌中发现的(血群ALeb/Ley)、胃癌粘蛋白、结肠癌中发现的19.9、骨髓细胞中发现的T5A7、黑素瘤中发现的R24、胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8和4-8细胞分裂期胚中发现的SSEA-3、SSEA-4。在另一个实施方式中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生的肽(参见Edelson，1998，The Cancer Journal 4：62)。
[00344]可以通过本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症和相关的失调包括但不限于以下的：白血病，包括但不限于，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病，例如，myeloblastic、promyelocytic、骨髓单核的、单核细胞的、红白血病白血病和脊髓发育不良综合征，慢性白血病，例如但不限于，慢性的髓细胞的(granulocytic)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；脾大性红细胞增多；淋巴瘤，例如但不限于Hodgkin’s病、非Hodgkin’s病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积多发性骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、骨硬化的骨髓瘤、浆细胞性白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；
巨球蛋白血症；未确定显著性的单克隆的免疫球蛋白病；良性的单克隆免疫球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤，例如但不限于，骨骼肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、Ewing’s肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、Kaposi’s肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、neurilemmoma、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于，胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、nonglial肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、pineocytoma、成松果体细胞瘤、原发脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于，腺癌、小叶(小细胞)癌、管内癌、髓质乳腺癌、粘质乳腺癌、管性乳腺癌、乳头乳腺癌、Paget’s病和炎症性的乳腺癌；肾上腺癌症，包括但不限于，pheochromocytom和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于，乳头状的或卵泡的甲状腺癌、髓质甲状腺癌和退行的甲状腺癌；胰腺癌，包括但不限于，胰岛瘤、胃泌素瘤、胰升血糖素瘤、舒血管肠肽瘤(vipoma)、促生长素释放抑制因子分泌肿瘤、和类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌症，包括但不限于，Cushing’s病、分泌促黄体分泌素的肿瘤、肢端肥大症和糖尿病insipius；眼癌症，包括但不限于，眼黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和cilliary体黑素瘤，和成视网膜细胞瘤；阴道的癌症，包括但不限于，鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；阴部癌症，包括但不限于，鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和Paget’s病；子宫颈癌症，包括但不限于，鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于，子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌症，包括但不限于，卵巢上皮癌、界线肿瘤、生殖细胞肿瘤和基质肿瘤；食管癌症，包括但不限于，鳞状癌症、腺癌、adenoidcyctic癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和oat细胞(小细胞)癌；胃癌，包括但不限于，腺癌、真菌样生长(息肉样)、溃烂、浅表散布、广泛地散布、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝胚细胞瘤，胆囊癌症，包括但不限于腺癌；胆管细胞癌，包括但不限于，pappillary、结节的和弥漫的；肺癌，包括但不限于，非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌症，包括但不限于，生殖肿瘤、精原细胞瘤、退性发育的、经典的(典型的)、精细胞的、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、恶性合胞体瘤(卵黄囊肿瘤)、前列腺癌症，包括但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；penal癌症；口腔癌，包括但不限于，鳞状细胞癌；基底癌症；唾液腺癌症，包括但不限于，腺癌、粘液表皮样癌和腺胞囊癌；咽癌，包括但不限于，扁平细胞癌症和疣；皮肤癌，包括但不限于，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表散布黑素瘤、结节的黑素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢端的斑点的黑素瘤；肾癌，包括但不限于，肾脏细胞癌症、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌症(肾盂和/或uterer)；Wilms’肿瘤；膀胱癌，包括但不限于，转移细胞癌、扁平细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨肉瘤、内皮肉瘤、lymphangioendotheliosarcoma、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(这些疾病的综述，参见Fishman etal.，1985，Medicine，2d Ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia andMurphy et al.，1997，Informed Decisions：The Complete Book of CancerDiagnosis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin BooksU.S.A.，Inc.，United States of America)。
[00345]因此，本发明的方法和组合物在各种癌症或其他异常增殖性疾病的治疗或预防中也是有用的，包括(但不限于)以下的：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、宫颈、甲状腺和皮肤的癌；包括鳞状细胞癌；淋巴系统的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、Burketts淋巴瘤；骨髓系统的造血肿瘤，包括急性和慢性粒性白血病和早幼粒细胞性白血病；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和rhabdomyoscarcoma；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和胶质瘤；中央和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和许旺氏细胞瘤；间质来源的肿瘤，包括fibrosafcoma、rhabdomyoscarama和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、xenoderma pegmentosum、keratoactanthoma、精原细胞瘤、甲状腺卵泡的癌症和畸胎癌。还预期的是由细胞凋亡中的畸变引起的癌症也将通过本发明的方法和组合物来治疗。这些癌症可以包括但不限于，滤泡性淋巴瘤、p53突变的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，和癌前期病变，例如家族性腺瘤息肉病，和脊髓发育不良综合征。在特定的实施方式中，恶性肿瘤或不正常的增殖变化(例如组织化生和发育异常)，或超增殖性失调，在卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰腺或子宫中，通过本发明的方法和组合物来治疗或预防。在其他特定实施方式中，肉瘤、黑素瘤或白血病通过本发明的方法和组合物来治疗或预防。
[00346]在特定的实施方式中，相对于不存在本发明的所述分子的情况下原发肿瘤或转移的生长，本发明的分子(例如，包含变异Fc区的抗体，或根据本发明的方法工程化的治疗性单克隆抗体)抑制或降低原发肿瘤或癌细胞转移的生长至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。
5.4.1.1组合治疗
[00347]本发明进一步涵盖施用本发明的分子连同本领域技术人员已知用于癌症的治疗或预防的其他治疗，包括但不限于，当前标准的和实验的化学疗法、激素治疗、生物学治疗、免疫治疗、放射治疗或手术。在某些实施方式中，本发明的分子可以连同治疗或预防有效量的一种或多种抗癌症试剂、治疗性抗体(例如，表9中所列的抗体)，或本领域技术人员已知用于癌症的治疗和/或预防的其他试剂(参见5.4.1.2节)来施用。
[00348]在某些实施方式中，同时地随同一种或多种对癌症的治疗有用的其他治疗试剂向哺乳动物、优选的人类使用一种或多种本发明的分子。术语“同时地”不限于在完全相同的时间施用预防或治疗试剂，而是它意味着，按顺序和在一定时间间隔内向哺乳动物施用本发明的分子和另一种那些，从而本发明的分子可以与另一种试剂一同起作用，来提供与另外地施用它们相比提高的效益。例如，每种预防或治疗试剂(例如，化学疗法、放射疗法、激素治疗或生物学疗法)可以同时地施用或者以任何顺序在不同的时点次序地施用；然而，如果不是同时施用的，它们应当在时间上足够接近地施用以便提供期望的治疗或预防效果。每种治疗试剂可以单独地、以任何合适的形式和通过任何适合的途径来施用。在各种实施方式中，以低于1小时的间隔、约1小时的间隔、约1小时到约2小时的间隔、约2小时到约3小时的间隔、约3小时到约4小时的间隔、约4小时到约5小时的间隔、约5小时到约6小时的间隔、约6小时到约7小时的间隔、约7小时到约8小时的间隔、约8小时到约9小时的间隔、约9小时到约10小时的间隔、约10小时到约11小时的间隔、约11小时到约12小时的间隔、不超过24小时的间隔或不超过48小时的间隔，来施用预防或治疗试剂。在优选的实施方式中，在就诊的相同患者内施用两种或多种成分。
[00349]在其他实施方式中，预防或治疗试剂以约2到4天的间隔、约4到6天的间隔、约1周的间隔、约1到2周的间隔、或超过2周的间隔施用。在优选的实施方式中，在两种试剂都仍然有效的时间框内施用预防或治疗试剂。通过测定施用的试剂的半衰期，本领域技术人员将能确定这种时间框。
[00350]在某些实施方式中，本发明的预防或治疗试剂循环地施用给受试者。循环治疗包括施用第一试剂一段时间，随后施用第二试剂和/或第三试剂一段时间，并重复这种连续的施用。循环治疗可以降低对一种或多种治疗的抗性的发展，避免或降低治疗之一的副作用，和/或改善治疗的效力。
[00351]在某些实施方式中，以不超过3周的循环、每两周约1次、每10天约1次或每周约1次施用预防或治疗试剂。一个循环可以包括，通过每个循环约90分钟、每个循环约1小时、每个循环约45分钟的输注来施用治疗或预防试剂。每个循环可以包括至少1周的静止、至少2周的静止、至少3周的静止。所施用的循环的数目从约1到约12个循环、更一般地从约2到约10个循环、更一般地从约2到约8个循环。
[00352]在再其他的实施方式中，本发明的治疗和预防试剂以节奏给药方式施用，通过没有延伸的静止期的连续的输注或常见的施用。这种节奏施用可以包括以没有静止期的稳定间隔给药。一般地，治疗试剂、特别是细胞毒的试剂以较低的剂量使用。这种给药方式涵盖相对低剂量的长期每天施用持续的时间周期。在优选的实施方式中，较低剂量的使用可以最小化毒性副作用并消除静止期。在某些实施方式中，通过从约24小时到约2天、到约1周、到约2周、到约3周、到约1个月、到约2个月、到约3个月、到约4个月、到约5个月、到约6个月的长期低剂量或连续输注，来递送治疗和预防试剂。这种给药方式的进度表可以由熟练的肿瘤学家来优化。
[00353]在其他实施方式中，同时地向哺乳动物施用治疗的进程，即，施用单独的治疗剂的剂量但又在一定时间间隔之内，从而本发明的分子可以与其他试剂一同工作。例如，与另一种成分一同地，一种成分可以每周施用一次，所述另一种成分每两周施用一次或每三周施用一次。换句话说，即使治疗剂不被同时地施用或在相同的就诊患者内，也同时地进行治疗剂的给药方式。
[00354]当与其他预防试剂和/或治疗试剂组合使用时，本发明的分子和所述预防试剂和/或治疗试剂可以附加地、或更优选的协同地起作用。在一个实施方式中，本发明的分子与一种或多种治疗试剂在相同的药物组合物中同时施用。在另一个实施方式中，本发明的分子与一种或多种其他治疗试剂在独立的药物组合物中同时施用。在又一个实施方式中，本发明的分子在另一种预防或治疗试剂的施用之前或之后施用。本发明预期通过相同或不同的给药途径，例如口服和胃肠外途径，与其他预防或治疗试剂组合施用本发明的分子。在某些实施方式中，当与可能产生不良副作用，包括但不限于毒性的另一种预防或治疗试剂同时地施用本发明的分子时，可以有利地以低于引发不良副作用的阈值的剂量施用所述预防或治疗试剂。
[00355]在此提供的给药数量和施用频率被术语治疗有效的和预防有效的涵盖。根据特异于每个患者的因素、取决于所施用的特定治疗或预防试剂、癌症的严重度和类型、给药途径、以及年龄、体重、反应和患者的以往病史，剂量和频率进一步地一般将不同。通过考虑这些因素，并通过遵循，例如，在文献中报道的以及在Physician’s DeskReference(56th ed.，2002)中推荐的剂量，本领域技术人员可以选择适合的服法。
5.4.1.2其他治疗/预防试剂
[00356]在特定的实施方式中，本发明的方法涵盖施用一种或多种本发明的分子和用于癌症的治疗和/或预防的一种或多种治疗试剂。在一个实施方式中，血管生成抑制物可以与本发明的分子组合施用。可用于本发明的方法和组合物的血管生成抑制物包括但不限于：Angiostatin(血纤维蛋白溶解酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay 12-9566；Benefin；Bevacizumab；BMS-275291；软骨衍生的抑制物(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col 3；Combretastatin A-4；Endostatin(胶原蛋白XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-beta；Halofuginone；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干扰素alpha/beta/gamma；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白细胞介素-12；Kringle5(血纤维蛋白溶酶原片段)；Marimastat；金属蛋白酶抑制物(TIMPs)；2-甲氧雌甾二醇；MMI 270(CGS 27023A)；MoAbIMC-1C11；Neovastat；NM-3；Panzem；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制物；纤溶酶原激活物抑制物；血小板因子-4(PF4)；Prinomastat；促黄体分泌素16kD片段；Proliferin相关蛋白(PRP)；PTK 787/ZK222594；类视黄醇；Solimastat；Squalamine；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氢皮质醇-S；四硫钼酸盐；酞胺哌啶酮；Thrombospondin-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-beta(TGF-b)；Vasculostatin；Vasostatin(calreticulin片段)；ZD6126；ZD 6474；法呢基转移酶抑制物(FTI)；和双膦酸盐类。
[00357]可以在本发明的各种实施方式中与本发明的分子，包括本发明的药物组合物和剂型和试剂盒组合使用的抗癌试剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿柔比星；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨基苯乙哌啶酮；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；bisnafidedimesylate；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；二甲睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；亚硝脲氮芥；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺式铂氨；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯唑胺；放线菌素；盐酸红比霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸dezaguanine；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；重氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法洛唑啉；法扎拉滨；芬维A胺；5-氟脱氧尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸依达比星；异环磷酰胺；依莫福新；白细胞介素II(包括重组白细胞介素II或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸依立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；环己亚硝脲；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；甲地孕酮；十六次甲基甲地孕酮；苯丙氨酸氮芥；美诺立尔；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；氨甲蝶呤钠；氯苯氨啶；米得派；米丁度胺；mitocarcin；丝裂红素；丝裂吉霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达啉；诺加霉素；奥马铂；亚磺酰吡啶；紫杉醇；天门冬酰胺酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；双溴丙基哌嗪；保释芬；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；松龙苯芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；甲基环己亚硝脲；二甲二苯四氮烯；磷乙酰天冬氨酸钠；稀疏霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替克加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾丸内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；硫替派；噻唑呋林；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸醛基长春碱；去乙酰长春酰胺；硫酸去乙酰长春酰胺；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；呋氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药物包括，但不限于：20-epi-1，25二羟维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；氨吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管发生抑制物；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素物质；抗肿瘤物质；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；细胞凋亡基因调节物；细胞凋亡调节物；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨基酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯佐利定；benzoylstaurosporine；β内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycinB；白桦脂酸；bFGF抑制物；比卡鲁胺；比生群；bisaziridinylspermine；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；buthionine sulfoximine；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物；雀痘IL-2；卡培他滨；羧酸胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制物；carzelesin；酪蛋白激酶抑制物(ICOS)；castanospermine；天蚕素B；西曲瑞克；chlorlns；磺胺氯喹喔啉；西卡前列素；顺式-卟啉；克拉曲滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；collismycin 8；cryptophycinA衍生物；curacin A；环五蒽醌；cycloplatam；cypemycin；cytarabineocfosfate；溶细胞因子；cytostatin；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidemnin B；地洛瑞林；地塞米松；dexifosfamide；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；didox；diethylnorspermine；二氢-5-阿扎胞苷；二氢紫杉醇，9-；dioxamycin；联苯螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin hydrochloride；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；gadolinium texaphyrin；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制物；吉西他滨；谷胱甘肽抑制物；hepsulfam；heregulin；环己二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；依达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；imidazoacridones；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制物；干扰素激动剂；干扰素类；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrinB；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；lamellarin-N triacetate；兰瑞肽；新生霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白血病α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋四咪唑；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；溶胞肽；美坦新；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制物；基质金属蛋白酶抑制物；美诺立尔；汞溴红；美替瑞林；乙硫磷酶；灭吐灵；MIF抑制物；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素；成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人类绒毛促性腺激素；单磷酰基脂质A+myobacterium细胞壁sk；莫哌达醇；多药物抗性基因抑制物；基于多肿瘤抑制物1的治疗；芥子抗癌试剂；mycaperoxideB；mycobacterial细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；nisamycin；氮氧化物调节物；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苯甲基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；天门冬酰胺酶；培得星；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；perillylalcohol；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸脂酶抑制物；picibanil；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；血纤维蛋白溶酶原激活物抑制物；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟菲尔钠；甲基丝裂霉素；强的松；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制物；基于蛋白A的免疫调节物；蛋白激酶C抑制物；蛋白激酶C抑制物，microalgal；蛋白酪氨酸磷酸酯酶抑制物；嘌呤核苷磷酸化酶抑制物；羟基茜草素；吡唑啉吖啶；磷酸吡哆醛血红蛋白聚氧乙烯基结合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制物；ras抑制物；ras-GAP抑制物；脱甲基的瑞替普汀；rhenium Re 186etidronate；根霉素；核酶；RII维胺酯；罗谷亚胺；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制物1；有义寡核苷酸；信号转导抑制物；信号转导调节物；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；sodiumborocaptate；乙酸苯酯钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；sparfosic acid；spicamycin D；螺莫司汀；splenopentin；spongistatin 1；角鲨胺；干细胞抑制物；干细胞分化抑制物；stipiamide；基质降解酶抑制物；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明，；swainsonine；合成糖胺聚糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；tecogalan sodium；替加氟；tellurapyrylium；端粒末端转移酶抑制物；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；甲状腺刺激激素；tinethyl etiopurpurin；替拉扎明；二氯钛省；topsentin；托瑞米芬；全能性干细胞因子；翻译抑制物；维甲酸；三乙酰基尿嘧啶；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制物；tyrphostins；UBC抑制物；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统，红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦明；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；zilascorb；和净司他丁激动剂。优选的其他抗癌药物是5-氟尿嘧啶和亚叶酸。
[00358]可以用于本发明的方法的治疗性抗体的实例包括但不限于ZENAPAX
(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其是用于防止急性的肾脏异体移植排斥的免疫抑制性、人源化抗CD25单克隆抗体；PANOREXTM，其是鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠抗独特型(GD3epitope)IgG抗体(ImClone System)；IMC-C225，其是嵌合的抗EGFRIgG抗体(ImClone System)；VITAXINTM，其是人源化的抗-αVβ3整联蛋白抗体(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；SmartM195，其是人源化的抗-CD33IgG抗体(Protein DesignLab/Kanebo)；LYMPHOCIDETM，其是人源化的抗-CD22IgG抗体(Immunomedics)；ICM3是人源化抗-ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114是灵长化的抗-CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；IDEC-131是人源化抗-CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151，其是灵长化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152，其是灵长化的抗-CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3 IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化的抗-互补因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；D2E7是人源化的抗-TNF-α抗体(CAT/BASF)；CDP870是人源化的抗-TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151其是灵长化的抗-CD4IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人类抗-CD4IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗体(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVATM是人源化的抗-CD40LIgG抗体(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化的抗-VLA-4IgG抗体(Elan)；和CAT-152是人类抗-TGF-β2抗体(Cambridge Ab Tech)。可根据本发明使用的治疗性抗体的其他实例在表9中列出。
5.4.2自体免疫疾病和炎症性疾病
[00359]在某些实施方式中，本发明的分子包含在一个或多个区域具有一个或多个氨基酸修饰的变异Fc区，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性但降低所述变异Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲合性。具有这种结合特征的本发明的分子在调节免疫反应，例如，抑制与自体免疫疾病或炎症性疾病有关的免疫反应方面是有用的。虽然不希望受任何作用机制的限制，具有对FcγRIIB增强的亲合性和对FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的亲合性的本发明的分子能够引起对FcγR的活化反应的抑制和细胞应答的抑制。
[00360]在某些实施方式中，包含变异Fc区的本发明的分子不是免疫球蛋白，并包含至少一个氨基酸修饰，相对于包含野生型Fc区的分子，所述修饰提高所述变异Fc区对FcγRIIB的亲合性。在其他实施方式中，所述分子进一步包含一个或多个氨基酸修饰，所述修饰降低分子对活化性FcγR的亲合性。在某些实施方式中，所述分子是可溶的(即，非膜结合的)Fc区。本发明预期在可溶Fc区内的其他氨基酸修饰，其调节它对各种Fc受体的亲合性，包括如在此描述的本领域的技术人员已知的那些。在其他实施方式中，使用本领域技术人员已知的和在此描述的技术修饰所述分子(例如，包含至少一个或多个氨基酸修饰的Fc区)来提高Fc区的体内半衰期。这种分子在治疗和/或预防自体免疫失调中具有治疗实用性。虽然不希望受任何作用机制的限制，具有增强的FcγRIIB亲合性的这种分子将引起对活化性受体的阻抑，因而引起免疫反应的阻抑，并具有治疗和/或预防自体免疫失调的治疗效力。
[00361]在某些实施方式中，提高变异Fc区对FcγRIIB的亲合性但降低变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性的一个或多个氨基酸修饰包含在位置246用苏氨酸以及在位置396用组氨酸替换；或在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替换；或在位置217用丝氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置408用精氨酸替换；或在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；或在位置246用异亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替换。在一个实施方式中，提高变异Fc区对FcγRIIB的亲合性但降低变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性的一个或多个氨基酸修饰包括在位置247用亮氨酸替换。在另一个实施方式中，提高变异Fc区对FcγRIIB的亲合性但降低变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性的一个或多个氨基酸修饰包括在位置372用酪氨酸替换。在又一个实施方式中，提高变异Fc区对FcγRIIB的亲合性但降低变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性的一个或多个氨基酸修饰包括在位置326用谷氨酸替换。在一个实施方式中，提高变异Fc区对FcγRIIB的亲合性但降低变异Fc区对FcγRIIIA的亲合性的一个或多个氨基酸修饰包括在位置224用亮氨酸替换。
[00362]相对于包含野生型Fc区的可比较分子具有对FcγRIIB增强的亲合性以及对FcγRIII和/或FcγRIIA降低的亲合性的变异Fc区可用于治疗或预防自体免疫疾病或炎症性疾病。本发明提供了在受试者中预防、治疗或控制与自体免疫或炎症性失调相关的一种或多种症状的方法，包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的具有变异Fc区的本发明的分子，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述变异Fc区具有对FcγRIIB增强的亲合性以及对FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的亲合性。
[00363]本发明还提供了在受试者中预防、治疗或控制与炎症性失调相关的一种或多种症状的方法，进一步包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的一种或多种抗炎症试剂。本发明还提供了预防、治疗或控制与自体免疫疾病相关的一种或多种症状的方法，进一步包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的一种或多种免疫调节试剂。5.4.2.1节提供了抗炎症试剂和免疫调节试剂的非限制性实例。
[00364]可以通过施用本发明的分子治疗的自体免疫失调的实例包括但不限于，斑形脱发、关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合症、自体免疫Addison’s病、肾上腺的自体免疫疾病、自身免疫性溶血性贫血、自体免疫肝炎、自体免疫卵巢炎和睾丸炎、自体免疫血小板减少、Behcet’s病、大疱天疱疮、心肌炎、腹口炎性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合症(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多神经病、Churg-Strauss综合症、瘢痕性天疱疮、CREST综合症、冷凝集素病、Crohn’s病、盘状狼疮、基本混合的冷球蛋白血症、fibromyalgia-纤维肌炎、血管球性肾炎、Graves’病、Guillain-Barre、Hashimoto’s甲状腺炎、特发性肺纤维化、突发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、少年关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、Ménière’s病、混合结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多发性结节性动脉炎、polychrondritis、多腺综合症、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发丙种球蛋白缺乏症、夏科氏肝硬变、牛皮癣、牛皮癣关节炎、Raynauld’s现象、Reiter’s综合症、类风湿性关节炎、结节病、硬皮症、综合症、全身肌强直综合症、全身性红斑狼疮、红斑狼疮、takayasu动脉炎、temporal arteristis/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、vasculitides例如疱疹样皮炎、脉管炎、白斑病和Wegener’s肉芽肿病。炎症性失调的实例包括但不限于，哮喘、encephilitis、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性紊乱、脓毒性休克、肺纤维化、未分化的spondyloarthropathy、未分化的关节病、关节炎、炎症性骨质溶解和由长期的病毒或细菌感染引起的慢性炎症。如在此的2.2.2节中描述的，某些自体免疫失调与炎症性状况相关。因而，存在着被认为是自体免疫失调和炎症性失调的重叠。因此，某些自体免疫失调也可能被表征为炎症性失调。可以根据本发明的方法预防、治疗或控制的炎症性失调的实例包括但不限于，哮喘、encephilitis、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性紊乱、脓毒性休克、肺纤维化、未分化的spondyloarthropathy、未分化的关节病、关节炎、炎症性骨质溶解和由长期的病毒或细菌感染引起的慢性炎症。
[00365]具有变异Fc区的本发明的分子也可以用于降低患有炎症性失调的动物、特别是哺乳动物所经历的炎症，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述变异Fc区具有对FcγRIIB增强的亲合性和对FcγRIIIA降低的亲合性。在特定的实施方式中，相对于没有施用本发明的分子的动物中的炎症，本发明的分子降低动物中的炎症至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。
[00366]具有变异Fc区的本发明的分子也可以用于预防移植排斥，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，所述变异Fc区具有对FcγRIIB增强的亲合性和对FcγRIIIA降低的亲合性。
[00367]本发明进一步预期工程化本领域已知用于治疗和/或预防自体免疫疾病或炎症性疾病的任何抗体，从而所述抗体包含变异Fc区，所述变异Fc区包括一个或多个氨基酸修饰，其通过本发明的方法鉴定来具有相对于包含野生型Fc区的可比较分子对FcγRIIB增强的亲合性和对FcγRIIIA降低的亲合性。可以根据本发明工程化的、用于炎症性失调的治疗或预防的抗体的非限制性实例在表10A中呈现，用于自体免疫失调的治疗或预防的抗体的非限制性实例在表10B中呈现。
表10A：可以根据本发明工程化的用于炎症性疾病和自体免疫疾病的抗体
| 抗体名称 | 目标抗原 | 产品类型 | 同种型 | 保证人 | 适应症 |
| 5G1.1 | 补体(C5) | 人源化的 | IgG | Alexion Pharm Inc | 类风湿性关节炎 |
| 5G1.1 | 补体(C5) | 人源化的 | IgG | Alexion Pharm Inc | SLE |
| 5G1.1 | 补体(C5) | 人源化的 | IgG | Alexion Pharm Inc | 肾炎 |
| 5G1.1-SC | 补体(C5) | 人源化的 | ScFv | Alexion Pharm Inc | 心肺转流术 |
| 5G1.1-SC | 补体(C5) | 人源化的 | ScFv | Alexion Pharm Inc | 心肌梗死 |
| 5G1.1-SC | 补体(C5) | 人源化的 | ScFv | Alexion Pharm Inc | 血管成形术 |
| ABX-CBL | CBL | 人类 | Abgenix Inc | GvHD |
| 抗体名称 | 目标抗原 | 产品类型 | 同种型 | 保证人 | 适应症 |
| ABX-CBL | CD147 | 鼠 | IgG | Abgenix Inc | 移植排斥 |
| ABX-IL8 | IL-8 | 人类 | IgG2 | Abgenix Inc | 银屑病 |
| Antegren | VLA-4 | 人源化的 | IgG | Athena/Elan | 多发性硬化 |
| 抗-CD11a | CD11a | 人源化的 | IgG1 | GenentechInc/Xoma | 银屑病 |
| 抗-CD18 | CD18 | 人源化的 | Fab’2 | Genentech Inc | 心肌梗死 |
| 抗-LFA1 | CD18 | Murine | Fab’2 | Pasteur-Merieux/Immunotech | 移植排斥 |
| Antova | CD40L | 人源化的 | IgG | Biogen | 移植排斥 |
| Antova | CD40L | 人源化的 | IgG | Biogen | SLE |
| BTI-322 | CD2 | Rat | IgG | Medimmune Inc | GvHD，银屑病 |
| CDP571 | TNF-alpha | 人源化的 | IgG4 | Celltech | Crohn’s |
| CDP571 | TNF-alpha | 人源化的 | IgG4 | Celltech | 类风湿性关节炎 |
| CDP850 | E-selectin | 人源化的 | Celltech | 银屑病 | |
| Corsevin M | Fact VII | 嵌合的 | Centocor | 抗凝剂 | |
| D2E7 | TNF-alpha | 人类 | CAT/BASF | 类风湿性关节炎 | |
| Hu23F2G | CD11/18 | 人源化的 | ICOS Pharm Inc | 多发性硬化 | |
| Hu23F2G | CD11/18 | 人源化的 | IgG | ICOS Pharm Inc | 中风 |
| IC14 | CD14 | ICOS Pharm Inc | 中毒性休克 | ||
| ICM3 | ICAM-3 | 人源化的 | ICOS Pharm Inc | 银屑病 | |
| IDEC-114 | CD80 | Primatised | IDECPharm/Mitsubishi | 银屑病 | |
| IDEC-131 | CD40L | 人源化的 | IDEC Pharm/Eisai | SLE | |
| IDEC-131 | CD40L | 人源化的 | IDEC Pharm/Eisai | 多发性硬化 | |
| IDEC-151 | CD4 | 灵长化的 | IgG1 | IDECPharm/GlaxoSmithKline | 类风湿性关节炎 |
| IDEC-152 | CD23 | 灵长化的 | IDEC Pharm | 哮喘/过敏症 | |
| Infliximab | TNF-alpha | 嵌合的 | IgG1 | Centocor | 类风湿性关节炎 |
| Infliximab | TNF-alpha | 嵌合的 | IgG1 | Centocor | Crohn’s |
| 抗体名称 | 目标抗原 | 产品类型 | 同种型 | 保证人 | 适应症 |
| LDP-01 | beta2-整联蛋白 | 人源化的 | IgG | Millennium Inc(LeukoSite Inc.) | 中风 |
| LDP-01 | beta2-整联蛋白 | 人源化的 | IgG | Millennium Inc(LeukoSite Inc.) | 移植排斥 |
| LDP-02 | alpha4beta7 | 人源化的 | Millennium Inc(LeukoSite Inc.) | 溃疡性结肠炎 | |
| MAK-195F | TNF alpha | 鼠 | Fab’2 | Knoll Pharm，BASF | 中毒性休克 |
| MDX-33 | CD64(FcR) | 人类 | Medarex/Centeon | 自体免疫haematogical失调 | |
| MDX-CD4 | CD4 | 人类 | IgG | Medarex/Eisai/Genmab | 类风湿性关节炎 |
| MEDI-507 | CD2 | 人源化的 | Medimmune Inc | 银屑病 | |
| MEDI-507 | CD2 | 人源化的 | Medimmune Inc | GvHD | |
| OKT4A | CD4 | 人源化的 | IgG | Ortho Biotech | 移植排斥 |
| OrthoCloneOKT4A | CD4 | 人源化的 | IgG | Ortho Biotech | 自体免疫疾病 |
| Orthoclone/抗-CD3OKT3 | CD3 | 鼠 | mIgG2a | Ortho Biotech | 移植排斥 |
| RepPro/Abciximab | gpIIbIIIa | 嵌合的 | Fab | Centocor/Lilly | 冠状动脉血管成形术的并发症 |
| rhuMab-E25 | IgE | 人源化的 | IgG1 | Gehentech/Novartis/Tanox Biosystems | 哮喘/过敏症 |
| SB-240563 | IL5 | 人源化的 | GlaxoSmithKline | 哮喘/过敏症 | |
| SB-240683 | IL-4 | 人源化的 | GlaxoSmithKline | 哮喘/过敏症 | |
| SCH55700 | IL-5 | 人源化的 | Celltech/Schering | 哮喘/过敏症 | |
| Simulect | CD25 | 嵌合的 | IgG1 | Novartis Pharm | 移植排斥 |
| SMARTa-CD3 | CD3 | 人源化的 | Protein Design Lab | 自体免疫疾病 | |
| SMART | CD3 | 人源化的 | Protein Design Lab | 移植排斥 |
| 抗体名称 | 目标抗原 | 产品类型 | 同种型 | 保证人 | 适应症 |
| a-CD3 | |||||
| SMARTa-CD3 | CD3 | 人源化的 | IgG | Protein Design Lab | 银屑病 |
| Zenapax | CD25 | 人源化的 | IgG1 | Protein DesignLab/Hoffman-La Roche | 移植排斥 |
附图10B：可以根据本发明工程化的用于自体免疫失调的抗体
| 抗体 | 适应症 | 目标抗原 |
| ABX-RB2 | 针对T细胞、B细胞和NK细胞上的CBL抗原的抗体来自Xenomouse的完全人类抗体 | |
| 5c8(抗CD-40配体抗体) | 在10月停止了II期试验99例检查“不利事件” | CD-40 |
| IDEC 131 | 系统性红斑狼疮(SLE) | 抗CD40人源化的 |
| IDEC 151 | 类风湿性关节炎 | 灵长化的；抗-CD4 |
| IDEC 152 | 哮喘 | 灵长化的；抗-CD23 |
| IDEC 114 | 银屑病 | 灵长化的抗-CD80 |
| MEDI-507 | 类风湿性关节炎；多发性硬化Crohn’s病银屑病 | 抗-CD2 |
| LDP-02(抗-b7mAb) | 炎症性肠病Chron’s病溃疡性结肠炎 | 白血球(白细胞)上的a4b7整联蛋白受体 |
| SMART抗-Gamma干扰素抗体 | 自体免疫失调 | 抗-Gamma干扰素 |
| 抗体 | 适应症 | 目标抗原 |
| Verteportin | 类风湿性关节炎 | |
| MDX-33 | 起因于自体免疫反应的血液失调突发性的血小板减少Purpurea(ITP)自身免疫性溶血性贫血 | 针对FcRI受体的单克隆抗体 |
| MDX-CD4 | 治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫 | 针对CD4受体分子的单克隆抗体 |
| VX-497 | 自体免疫失调多发性硬化类风湿性关节炎炎症性肠病狼疮银屑病 | 肌苷酸脱氢酶的抑制物(淋巴细胞增殖所需的核苷酸生产中使用的新RNA和DNA的生产所需的酶) |
| VX-740 | 类风湿性关节炎 | ICE白细胞介素-1beta的抑制物(控制引起侵略性免疫反应的途径的转化酶) |
| VX-745 | 特异于免疫反应发作和炎症发展的化学信号转导中涉及的炎症 | P38MAP激酶的抑制物促分裂素活化的蛋白激酶 |
| Enbrel(etanercept) | 靶向TNF(肿瘤坏死因子) | |
| IL-8 | 针对IL-8(白细胞介素8)的完全人类单克隆抗体 | |
| Apogen MP4 | 重组抗原有选择地破坏与T细胞相关的疾病诱导细胞凋亡由程序的细胞死亡消除的T细胞不再攻击身体自己的细胞特异性apogens目标特异性T细胞 |
| 抗体 | 适应症 | 目标抗原 |
5.4.2.1免疫调节试剂和抗炎症试剂
[00368]本发明提供了治疗自体免疫疾病和炎症性疾病的方法，包括连同其他治疗试剂一起施用具有变异Fc区的分子，所述变异Fc区具有对FcγRIIB增强的亲合性和对FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的亲合性。免疫调节试剂的实例包括但不限于，methothrexate、ENBREL、REMICADETM、leflunomide、环磷酰胺、环孢霉素A和大环内酯抗生素(例如，FK506(tacrolimus))、甲基强的松龙(MP)、皮质类固醇、steriods、mycophenolate mofetil、雷帕霉素(sirolimus)、mizoribine、deoxyspergualin、brequinar、malononitriloamindes(例如，leflunamide)、T细胞调节物和细胞因子受体调节物。
[00369]抗炎症试剂已经在炎症性和自体免疫失调的治疗中展现了成功，现在是这些失调的常规和标准的疗法。本领域技术人员公知的任何抗炎症试剂都可以用于本发明的方法。抗炎症试剂的非限制性实例包括非甾族抗炎药物(NSAID)、甾族的抗炎药物、beta-激动剂、anticholingeric试剂和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于阿斯匹林、布洛芬、celecoxib(CELEBREXTM)、diclofenac(VOLTARENTM)、etodolac(LODINETM)、fenoprofen(NALFONTM)、indomethacin(INDOCINTM)、ketoralac(TORADOLTM)、oxaprozin(DAYPROTM)、nabumentone(RELAFENTM)、sulindac(CLINORILTM)、tolmentin(TOLECTINTM)、rofecoxib(VIOXXTM)、naproxen(ALEVETM、NAPROSYNTM)、ketoprofen(ACTRONTM)和nabumetone(RELAFENTM)。这些NSAID通过已知的环氧合酶(例如，COX-1和/或COX-2)来起作用。甾族抗炎药物的实例包括但不限于，糖皮质激素、地塞米松(DECADRONTM)、可的松、氢化可的松、脱氢可的松(DELTASONETM)、氢化泼尼松、氟羟脱氢皮质醇、柳氮磺胺吡啶和类花生酸类物质(eicosanoids)例如前列腺素、凝血烷和白细胞三烯。
5.4.3传染性疾病
[00370]本发明还涵盖在受试者中治疗或预防传染性疾病的方法，包括施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的分子。可以通过本发明的分子治疗或预防的传染性疾病是由传染原，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和病毒引起的。
[00371]可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的病毒疾病包括但不限于，由A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感、水痘、腺病毒、单纯性疱疹I型(HSV-I)、单纯性疱疹II型(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、乳头状瘤病毒、乳多泡病毒、巨细胞病毒、echinovirus、虫媒病毒、huntavirus、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、骨髓灰白质炎病毒、小痘、Epstein Barr病毒、人类免疫缺陷性病毒I型(HIV-I)、人类免疫缺陷性病毒II型(HIV-II)，和病毒疾病例如viral miningitis、脑炎、登革热或小痘的病原体引起的那些。
[00372]可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的、起因于细菌的细菌疾病包括但不限于，分支杆菌立克次氏体、支原体、奈瑟氏菌属、S.pneumonia、Borrelia burgdorferi(Lyme病)、Bacillusantracis(炭疽)、破伤风、链球菌属、葡萄球菌属、分枝杆菌属、破伤风、pertissus、霍乱、瘟疫、diptheria、衣原体、S.aureus和legionella。
[00373]可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的、起因于原生动物的原生动物疾病包括但不限于，利什曼虫、kokzidioa、锥虫属或疟疾。
[00374]可以使用本发明的分子连同本发明的方法治疗或预防的、起因于寄生虫的寄生虫疾病包括但不限于，衣原体和立克次氏体。。
[00375]根据本发明的一个方面，相对于包含野生型Fc区的可比较分子，包含变异Fc区的本发明的分子具有针对传染原，例如，病原性蛋白的增强的抗体效应物功能。传染原的实例包括但不限于细菌(例如Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecials，Candida albicans，Proteus vulgaris，Staphylococcus viridans，and Pseudomonas aeruginosa)，病原体(例如B-亲淋巴性的乳多空病毒(LPV)；Bordatella pertussis；Borna病病毒(BDV)；牛冠状病毒；脉络丛脑膜炎病毒；登革热病毒；病毒，E.coli；Ebola；艾柯病毒1；艾柯病毒-11(EV)；内毒素(LPS)；肠细菌；肠孤儿病毒；肠道病毒；猫白血病毒；口蹄疫病毒；长臂猿猿白血病毒(GALV)；革兰氏阴性细菌；Heliobacter pylori；乙型肝炎病毒(HBV)；单纯性疱疹病毒；HIV-1；人类巨细胞病毒；人类冠状病毒；流感A、B&C；Legionella；Leishmania mexicana；Listeriamonocytogenes；麻疹病毒；脑膜炎球菌；麻疹病毒；小鼠肝炎病毒；鼠白血病毒；鼠γ疱疹病毒；鼠逆转录病毒；鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒；鸟分枝杆菌-M；淋病奈瑟氏菌；新城疫病毒；细小病毒B19；恶性疟原虫；痘病毒；假单胞菌；轮状病毒；Samonella typhiurium；志贺氏菌；链球菌；T细胞亲淋巴性的病毒1；牛痘病毒)。
[00376]在特定的实施方式中，本发明的分子通过增强对引起传染性疾病的传染原的吞噬作用和/或调理作用来增强传染性疾病治疗的效力。在另一个特定的实施方式中，本发明的分子通过增强对引起传染性疾病的受感染细胞的ADCC来增强传染性疾病治疗的效力。
[00377]在某些实施方式中，本发明的分子可以与本领域技术人员已知用于治疗或预防传染性疾病的、治疗或预防有效量的一种或额外的治疗药剂组合施用。本发明预期使用本发明的分子与本领域技术人员已知用于治疗和/或预防传染性疾病的抗生素组合。可用于与本发明的分子组合的抗生素包括但不限于，大环内酯(例如，托普霉素(Tobi
))，头孢菌素(例如，头孢氨苄(Keflex
)，头孢霉定(Velosef
)，头孢呋辛(Ceftin
)，头孢罗齐(Cefzil
)，头孢可克洛(Ceclor)，头孢克肟(Suprax
)或头孢羟氨苄(Duricef
))，克拉霉素(例如，克拉霉素(Biaxin
))，红霉素(例如，红霉素(EMycin
))，青霉素(例如，青霉素V(V-Cillin K
或Pen Vee K
))或喹诺酮(例如，氧氟沙星(Floxin
)，环丙沙星(Cipro
)或诺氟沙星(Noroxin
))，氨基糖苷类抗生素(例如，安普霉素、阿贝卡星、班贝霉素、丁胺菌素、地贝卡星、新霉素、新霉素、十一碳烯酸酯、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、紫苏霉素和奇霉素)，酰胺醇抗生素(例如，叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素)、利福抗生素(例如，利福酰胺和利福平)、碳头孢烯类(例如，氯碳头孢)、碳青霉素烯类(例如，比阿培南和亚胺培南)、头孢菌素(例如，头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢羟唑、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺和头孢匹罗)、头霉素类(例如，头孢拉宗、头孢美他唑、和头孢米诺)，单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、卡芦莫南和替吉莫南)、氧头孢烯类(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)、青霉素类(例如氮卓西林、匹伏基氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、苄青霉素酸、苄青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林、培那西林、penethamate hydriodide、盘尼西林o-苯乙苄胺、青霉素0、青霉素V、苄星青霉素V、青霉素Vhydrabamine、青哌四环素和phencihicillin potassium)、lincosamides(例如，氯林肯霉素、和林肯霉素)、安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、粘菌素、持久杀霉素、恩维霉素、四环素类(例如，阿哌环素、氯四环素、氯莫环素、和地美环素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃类(例如，呋喃它酮和呋噻咪唑氯)、喹诺酮类和其类似物(例如西诺沙星、克林沙星、氟甲喹和grepagloxacin)、磺胺类(例如，乙酰基磺胺基吡嗪、苯甲基磺胺、诺丙磺胺、邻苯二酰基磺胺醋酰、磺胺柯定和sulfacytine)、砜(例如，地百里砜、葡糖砜钠和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星和抗结核菌素。
[00378]在某些实施方式中，本发明的分子可以与治疗或预防有效量一种或多种抗真菌剂一同施用。可用于与本发明的分子组合的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、依曲康唑、酮康唑、氟康唑、膜内的、氟胞嘧啶、咪康唑、布康唑、克霉唑、制霉菌素、特康唑、噻康唑、环吡酮、益康唑、卤丙烷、萘替芬、特比萘芬、十一烯酸酯和灰黄霉素。
[00379]在某些实施方式中，本发明的分子可以与治疗或预防有效量一种或多种抗病毒剂一同施用。可用于与本发明的分子组合的有用的抗病毒剂包括但不限于，蛋白酶抑制物、核苷逆转录酶抑制物、非核苷逆转录酶抑制物和核苷类似物。抗病毒剂的实例包括但不限于，叠氮胸苷、无环鸟苷、gangcyclovir、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷和病毒唑，以及膦甲酸、金刚烷胺、金刚烷乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、安泼那韦、洛匹那韦、利托那韦、alpha干扰素；阿德福韦、clevadine、恩替卡韦、普来可那立。
5.5疫苗治疗
[00380]本发明进一步涵盖使用本发明的组合物来诱导针对抗原或免疫原的免疫反应，包括但不限于，癌症抗原和传染性疾病抗原(其实例在下文公开)。本发明的疫苗组合物包含一种或多种抗原或免疫原，针对它们的免疫反应是期望的，其中所述一种或多种抗原或免疫原被包被具有增强的FcγRIIIA亲合性的、本发明的变异抗体。虽然不希望受特定作用机制的限制，用具有增强的FcγRIIIA亲合性的本发明的变异抗体包被抗原或免疫原，通过诱导体液和细胞介导的反应增强了对期望的抗原或免疫原的免疫反应。本发明的疫苗组合物在引发免疫反应、特别是针对抗原或免疫原的保护性免疫反应方面是特别有效的。
[00381]在某些实施方式中，本发明的疫苗组合物中的抗原或免疫原包括病毒，针对所述病毒的免疫反应是期望的。病毒可以是重组或嵌合的，优选的是减毒的。重组、嵌合和减毒的病毒的生产可以使用本领域技术人员已知的标准方法来进行。本发明涵盖根据本发明配制的活重组病毒疫苗或灭活重组病毒疫苗。活疫苗是优选的，因为在宿主中的增殖产生与自然感染中发生的相类似的种类和数量的延长的刺激，因而赋予了相当的、持久的免疫性。这种活重组病毒疫苗制剂的生产可以使用常规方法实现，包括在细胞培养物或鸡胚的尿囊中增殖病毒随后纯化。
[00382]在特定的实施方式中，重组病毒对于施用它的受试者是非致病的。在这点上，使用为疫苗目的遗传工程化的病毒需要这些毒株中减毒特征的存在。向用于转染的模板中导入合适的突变(例如，删除)可以提供具有减毒特征的新的病毒。例如，可以进行与温度敏感性或冷适应相关的特定错义突变变成删除突变。这些突变应当比与冷或温度敏感突变体相关的点突变更稳定，并且回复频率应当极其低。用于工程化重组病毒的重组DNA技术是本领域已知的，并涵盖在本发明中。例如，修饰负链RNA病毒的技术是本领域已知的，参见，例如，美国专利No.5,166,057，通过完全引用将它合并在此。
[00383]做为选择，可以构建具有“自杀”特征的嵌合病毒用于本发明的皮内疫苗制剂。这种病毒在宿主内将仅经历一轮或几轮复制。当用作疫苗时，重组病毒将经历有限的复制循环，并诱导足够水平的免疫反应，但它不会在人类宿主中走得更远和引起疾病。做为选择，根据本发明可以配制灭活的(杀死的)病毒。使用常规技术来“杀死”嵌合病毒可以制备灭活疫苗制剂。在它们的传染性被破坏的意义上，灭活疫苗是“死的”。理想地，病毒的传染性被破坏而不影响它的免疫原性。为了制备灭活疫苗，可以在细胞培养物或鸡胚的尿囊中生长嵌合病毒，通过区域超速离心法纯化、通过甲醛或β-丙内酯来灭活，并集中。
[00384]在某些实施方式中，完全外源的表位，包括来自其他病毒或非病毒病原体的抗原，可以被工程化到病毒中用于本发明的皮内疫苗制剂。例如，非相关病毒的抗原，例如HIV(gp160、gp120、gp41)、寄生虫抗原(例如，疟疾)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原可以被工程化到减毒的毒株中。
[00385]实际上任何异源基因序列都可以被构建入本发明的嵌合病毒用于皮内疫苗制剂。优选的，异源基因序列是作用生物应答调节物的部分和肽。优选的，诱导针对任何各种病原体的保护性免疫反应的表位、或结合中和抗体的抗原，可以被嵌合病毒或作为嵌合病毒的部分表达。例如，可以被构建入本发明的嵌合病毒的异源基因序列包括但不限于，流感和副流感血球凝集素神经氨糖酸苷酶和融合糖蛋白例如人类PIV3的HN和F基因。在又一个实施方式中，可以被工程化入嵌合病毒的异源基因序列包括编码具有免疫调节活性的蛋白质的那些。免疫调节蛋白的实例包括但不限于，细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子、白细胞介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、12，和这些试剂的拮抗剂。
[00386]在再其他的实施方式中，本发明涵盖病原性的细胞或病毒，优选的减毒病毒，其在它们的表面表达变异抗体。
[00387]在可选择的实施方式中，本发明的疫苗组合物包含融合多肽，其中抗原或免疫原可操作地连接到具有增强的FcγRIIIA亲合性的本发明的变异抗体。使用常规DNA重组技术方法进行用于本发明的疫苗组合物的融合多肽的工程化，处于普通技术人员的能力范围内。
[00388]本发明进一步涵盖通过施用本发明的组合物在受试者中诱导耐受性的方法。优选的，适合于在受试者中诱导耐受性的组合物包含包被了本发明的变异抗体的抗原或免疫原，其中所述变异抗体具有对FcγRIIB更高的亲合性。虽然不希望受特定作用机制的限制，通过活化FcγRIIB介导的抑制途径，这种组合物在诱导耐受性方面是有效的。
5.6组合物和施用方法
[00389]本发明提供了包含本发明的分子(即，抗体、多肽)的方法和药物组合物，所述分子包含变异Fc区。本发明还提供了通过向受试者施用有效量的本发明的融合蛋白或轭合的分子、或包含本发明的融合蛋白或轭合的分子的药物组合物来治疗、预防和改善与疾病、失调或感染相关的一种或多种症状的方法。在优选的方面，抗体、融合蛋白或轭合的分子是基本上纯的(即，基本上不含限制它的效果或产生不期望的副作用的物质)。在特定的实施方式中，受试者是动物，优选的是哺乳动物，例如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠，等等)和灵长类(例如，猴，如cynomolgous猴和人类)。在优选的实施方式中，受试者是人。在又一个优选的实施方式中，本发明的抗体来自与受试者相同的物种。
[00390]各种递送系统是已知的，可以用于施用包含本发明的分子(即，抗体、多肽)的组合物，本发明的分子包含变异Fc区，例如，封装在脂质体、微粒、微囊、能表达抗体或融合蛋白的重组细胞中，受体介导的内吞作用(参见，例如Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)，构建核酸作为逆病毒或其他载体的部分，等等。施用本发明的分子的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的和皮下的)、硬膜外的和粘膜的(例如，鼻内和口腔途径)。在特定实施方式中，肌肉内地、静脉内地或皮下地施用本发明的分子。可以通过任何便利的途径施用组合物，例如，通过输注或弹丸注射，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等等)的吸收，并且可以与其他生物活性试剂一同施用。施用可以是全身性或局部的。此外，也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化试剂的制剂。参见，例如，美国专利No.6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开No.WO92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO99/66903，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00391]本发明还提供了，包含变异Fc区的本发明的分子(例如，抗体、多肽)被封装在标明了抗体数量的密闭容器例如安瓿瓶或小袋中。在一个实施方式中，本发明的分子作为密闭容器中的干燥灭菌冻干粉剂或无水浓缩物来提供，并可以用例如水或盐水重构成合适的浓度用于向受试者施用。优选的，本发明的分子以至少5mg、更优选的至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、或至少75mg的单位剂量在密闭容器中作为干燥的无菌冻干粉剂来提供。冻干的本发明的分子应在它们的原始的容器中存储在2到8℃之间，分子应当在重构后12小时、优选的6小时、5小时、3小时、或1小时之内施用。在可选择的实施方式中，本发明的分子在标明所述分子、融合蛋白或轭合分子的数量和浓度的密闭容器中以液体形式提供。优选的，本发明的分子的液体形式以至少1mg/ml、更优选的至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml所述分子在密闭容器中提供。
[00392]在治疗、预防或改善与失调相关的一种或多种症状中有效的本发明的组合物的数量可以通过标准的临床技术来测定。在制剂中采用的准确剂量也将取决于给药途径、状况的严重度，并且应当根据医师的判断和每个患者的环境来决定。有效的剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。
[00393]对于本发明涵盖的抗体，向患者施用的剂量一般是0.0001mg/kg到100mg/kg患者体重。优选的，向患者施用的剂量在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg到0.25mg/kg、0.0001到0.15mg/kg、0.0001到0.10mg/kg、0.001到0.5mg/kg、0.01到0.25mg/kg或0.01到0.10mg/kg患者体重之间。一般地，由于对外源多肽的免疫反应，人类抗体在人体内比来自其他物种的抗体具有更长的半衰期。因而，降低剂量的人类抗体和较低频率的施用常常是可能的。进一步的，通过修饰例如脂质化来增强抗体的摄取和组织穿透性，可以降低本发明的抗体或其片段的施用剂量和频率。
[00394]在一个实施方式中，当用作单试剂治疗时，向患者施用的本发明的分子的剂量是0.01mg到1000mg/天。在另一个实施方式中，本发明的分子用于与其他治疗组合物组合，向患者施用的剂量比所述分子用作单试剂治疗时的更低。
[00395]在特定的实施方式中，期望的是局部地向需要治疗的区域施用本发明的药物组合物；这可以通过，例如但不是限制，局部输注、通过注射、或通过植入物的方法来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。优选的，当施用本发明的分子时，必须小心使用不吸附所述分子的材料。
[00396]在另一个实施方式中，组合物可以在囊、特别是脂质体中递送(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat et al.，inLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；一般地参见同上)。
[00397]在又一个实施方式中，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术可以用于生产包含一种或多种本发明的分子的持续释放制剂。参见，例如，美国专利No.4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning et al.，1996，“Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon CancerXenograft Using a Sustained-Release Gel，”Radiotherapy&Oncology39：179-189，Song et al.，1995，“Antibody Mediated Lung Targeting ofLong-Circulating Emulsions，”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397；Cleek et al.，1997，“Biodegradable PolymericCarriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application，”Pro.Iht’l.SFmp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam et al.，1997，“Microencapsulation of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody for Local Delivery，”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，通过完全引用将它们每一个合并在此。在一个实施方式中，泵可以用于控释系统(参见Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald et al.，1980，Surgery88：507；和Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方式中，聚合材料可以用于实现抗体的控释。(参见，例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen andBall(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy et al.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利No.5,679,377；美国专利No.5,916,597；美国专利No.5,912,015；美国专利No.5,989,463；美国专利No.5,128,326；PCT公开No.WO 99/15154；和PCT公开No.WO 99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，但不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-co-乙烯基醋酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙二醇类(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)，和polyorthoesters。在又一个实施方式中，控释系统可以置于治疗目标(例如，肺)附近，因而仅需要全身性剂量的一部分(参见，例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。在另一个实施方式中，根据Dunnet al.(参见U.S.5,945,155)使用作为控释植入物有用的聚合的组合物。这种特殊方法是基于来自聚合物系统的生物活性材料的原位受控释放的治疗效果。植入一般可以在需要治疗的患者体内任何位置进行。在另一个实施方式中，使用非聚合的持续释放系统，其中受试者体内的非聚合的植入物被用作药物递送系统。在植入体内之时，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围的组织液，非聚合材料将逐渐地凝结或沉淀来形成固体的、多微孔的基质(参见U.S.5,888,533)。
[00398]在Langer的综述(1990，Science 249：1527-1533)中讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可以用于生产包含一种或多种本发明的治疗试剂的持续释放制剂。参见，例如美国专利No.4,526,938；国际公开No.WO 91/05548和WO 96/20698；Ning et al.，1996，Radiotherapy&Oncology 39：179-189；Song et al.，1995，PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397；Cleek etal.，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam et al.，1997，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，通过完全引用将它们每一个合并在此。
[00399]在特定的实施方式中，其中本发明的组合物是编码抗体的核酸，所述核酸可以体内施用来促进它编码的抗体的表达，通过将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的部分并施用，使它成为细胞内的，例如，通过施用逆病毒载体(参见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射，同通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过连接到已知进入核内的间源盒样肽来施用它(参见，例如，Joliot et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等等。做为选择，可以通过同源重组将核酸细胞内地导入并掺入宿主细胞DNA中用于表达。
[00400]对于抗体，向受试者施用的治疗或预防有效剂量一般是0.1mg/kg到200mg/kg受试者体重。优选的，向受试者施用的剂量在0.1mg/kg和20mg/kg受试者体重之间，更优选的向受试者施用的剂量在1mg/kg到10mg/kg受试者体重之间。进一步的，通过修饰例如脂质化来增强抗体或融合蛋白的摄取和组织穿透性(例如，进入肺)，也可以降低本发明的抗体的施用剂量和频率。
[00401]用治疗或预防有效量的本发明的分子治疗受试者可以包括单次治疗，或优选的包括系列的治疗。在优选的实施例中，在约0.1到30mg/kg体重的范围内，每周一次地持续约1到10周之间、优选的2到8周之间、更优选的约3到7周之间、再更优选的约4、5或6周，用本发明的分子治疗受试者。在其他实施方式中，每天一次、每天两次、或每天三次地施用本发明的药物组合物。在其他实施方式中，每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两月一次、每年两次或每年一次地施用药物组合物。还要理解的是，用于治疗的分子的有效剂量可以在特定治疗的过程中提高或降低。
5.6.1药物组合物
[00402]本发明的组合物包括在药物组合物的制造中有用的散装药物组合物(例如，不纯的或非无菌的组合物)和可用于单位剂型的制备的药物组合物(即，适合于向受试者或患者施用的组合物)。这种组合物包含预防或治疗有效量的在此公开的预防或治疗试剂，或这些试剂和药学上可接受的载体的组合。优选的，本发明的组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种本发明的分子和药学上可接受的载体。
[00403]在一个特定的实施方式中，所述药物组合物包含治疗有效量一种或多种包含变异Fc区的本发明的分子，其中所述变异Fc区以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，和/或所述变异Fc区比包含野生型Fc区的可比较分子更有效至少1倍地介导效应物功能，和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种包含变异Fc区的本发明的分子，其中所述变异Fc区以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIIA更大的亲合性结合FcγRIIIA，并且所述变异Fc区以比包含野生型Fc区的可比较分子结合FcγRIIB更低的亲合性结合FcγRIIB，和/或所述变异Fc区比包含野生型Fc区的可比较分子更有效至少1倍地介导效应物功能，和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或多种抗癌试剂。
[00404]本发明还涵盖包含特异于特定癌症抗原的治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)和药学上可接受的载体的药物组合物，所述治疗性抗体包含根据本发明确定的Fc区中的一种或多种氨基酸修饰。
[00405]在特定的实施方式中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的，用于动物、更特别地用于人类。术语“载体”是指稀释剂、佐剂(例如，Freund’s佐剂(完全的和不完全的)、赋形剂或载体(vehicle)，伴随它们施用治疗剂。这种药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内地施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可以被用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，合物也可包含少量的湿润或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、药丸、胶囊剂、粉剂、持续释放的制剂等形式。
[00406]一般地，在单位剂型中分别地或混合地提供本发明的组合物的成分，例如，在密闭容器例如标明了活性试剂数量的安瓿瓶或者小袋中，作为干燥的冻干粉末或无水的浓缩物。当通过输注来施用组合物时，可以用含有无菌的药物级水或盐水的输液瓶进行配药。当通过注射施用组合物时，可以提供灭菌注射水或盐水的安瓿瓶以便在施用前将配料混合。
[00407]本发明的组合物可以被配制为中性的或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于，与例如来自盐酸、磷、乙酸、草酸、酒石酸等等的阴离子形成的那些，和与例如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的阳离子形成的那些。
5.6.2基因治疗
[00408]在特定的实施方式中，施用包含编码本发明的分子的序列的核酸，通过基因治疗的方法来治疗、预防或改善与疾病、失调或感染相关的一种或多种症状。基因治疗是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的治疗。在本发明的这个实施方式中，核酸产生它们编码的抗体或融合蛋白，所述抗体或融合蛋白介导治疗或预防效果。
[00409]本领域中可用的基因治疗的任何方法都可以根据本发明使用。示范性的方法描述如下。
[00410]对于基因治疗的方法的一般性综述，参见Goldspiel et al.，1993，Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu and Wu，1991，Biotherapy3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；和Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215。在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；and Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中描述了DNA重组技术领域一般已知的、可以使用的方法。
[00411]在优选的方面，本发明的组合物包含编码抗体的核酸，所述核酸是表达载体的部分，所述表达载体在适合的宿主中表达所述抗体。特别地，这种核酸具有可操作地与抗体编码区连接的启动子、优选的异源启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，任选的，是组织特异性的。在另一个特定的实施方式中，使用核酸分子，在所述核酸分子中，抗体编码序列和任何其他期望的序列侧翼是促进基因组中期望位点处的同源重组的区域，因而提供了所述抗体编码核酸的染色体内的表达(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；and Zijlstra et al.，1989，Nature 342：435-438)。
[00412]在另一个优选的方面，本发明的组合物包含编码融合蛋白的核酸，所述核酸是表达载体的一部分，所述表达载体在适合的宿主中表达所述融合蛋白。特别地，这种核酸具有可操作地与融合蛋白的编码区连接的启动子、优选的异源启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，任选的，是组织特异性的。在另一个特定实施方式中，使用核酸分子，在所述核酸分子中，融合蛋白编码序列和任何其他期望的序列侧翼是促进基因组中期望位点处的同源重组的区域，因而提供了所述融合蛋白的染色体内的表达。
[00413]递送核酸到受试者中可以是直接的，在这种情况下，受试者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体，或者是间接的，在这种情况下，首先用所述核酸体外转化细胞，然后将细胞移植到受试者中。作为体内或体外基因治疗，这两种方法分别是已知的。
[00414]在特定的实施方式中，所述核酸序列直接地体内施用，其中它被表达以产生编码的产物。这可以伴随有本领域已知的许多方法的任一种，例如通过作为合适的核酸表达载体的部分来构建它们并施用所述载体以使它们成为细胞内的，例如通过使用缺陷的或减毒的逆病毒或其他病毒载体进行感染(例如，美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射裸露的DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；BiolisticDupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，封装在脂质体、微粒或微囊中，或通过连接到已知进入核内的肽来施用它们，或通过连接到遭受受体介导的内吞作用的配体来施用它(参见，例如，Wu andWu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可用于靶向特异性表达受体的细胞类型)，等等。在另一个实施方式中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包括fusogenic病毒肽以破坏内涵体，容许核酸避免溶酶体降解。在又一个实施方式中，通过靶向特异性受体，核酸可以在体内被靶向用于细胞特异性摄取和表达(参见，例如，PCT公开WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188；WO93/20221)。做为选择，可以细胞内地导入核酸并通过同源重组掺入用于表达的宿主细胞DNA内(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；and Zijlstra et al.，1989，Nature 342：435-438)。
[00415]在特定实施方式中，使用含有编码本发明的分子(例如，抗体或融合蛋白)的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆病毒载体(参见，Miller et al.，1993，Meth.Enzymol.217：581-599)。这些逆病毒载体含有病毒基因组的正确封装和整合如宿主细胞DNA所必需的成分。用于基因治疗、编码抗体或融合蛋白的核酸序列可被克隆到一种或多种载体中，其促进所述核苷酸序列向受试者中的递送。关于逆病毒载体的更多细节可以在Boesen et al.(1994，Biotherapy 6：291-302)中找到，其描述了使用逆病毒载体来递送mdr 1基因到造血干细胞中以使所述干细胞对化学疗法更有抗性。说明在基因治疗中使用逆病毒载体的其他参考文献是：Clowes et al.，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Klein et al.，1994，Blood 83：1467-1473；Salmons andGunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；和Grossman andWilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114。
[00416]腺病毒是可用于基因治疗的其他病毒载体。腺病毒用于将基因递送到呼吸上皮的特别有吸引力的载体。腺病毒天然地感染呼吸上皮，其中它们引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其他目标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson(Current Opinion in Genetics andDevelopment 3：499-503，1993，陈述了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.，(Human Gene Therapy，5：3-10，1994)表明了腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸上皮的用途。在基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在Rosenfeld et al.，1991，Science 252：431-434；Rosenfeld et al.，1992，Cell 68：143-155；Mastrangeli et al.，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公开W094/12649；和Wang et al.，1995，GeneTherapy 2：775-783中找到。在优选的实施方式中，使用腺病毒载体。
[00417]腺病毒相关病毒(AAV)也被建议用于基因治疗。(参见，例如Walsh et al.，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300和美国专利No.5,436,146)。
[00418]基因治疗的另一种方法包括通过如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染这些方法将基因转移到组织培养中的细胞。通常，转移的方法包括将选择标记转移到细胞。然后将这些细胞置于选择之下以分离已经取得了并在表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送给受试者。
[00419]在这个实施方式中，在体内施用产生的重组细胞之前将核酸导入细胞。这种导入可以通过本领域已知的任何方法来进行，包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、用病毒或噬菌体载体感染、包涵核酸序列、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质融合，等等。许多技术是本领域已知的，用于将外源基因导入细胞中(参见，例如Loeffler and Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618，Cohen et al.，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；and Clin.Pharma.Ther.29：69-92，1985)，并可以根据本发明来使用，只要不破坏受体细胞的必需的发育和生理功能。所述技术应当提供核酸对细胞的稳定转移，从而所述核酸是可由所述细胞表达的，优选的可遗传的和可由它的细胞子代表达。
[00420]产生的重组细胞可以通过本领域已知的各种方法递送给受试者。优选的静脉内地施用重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。预定使用的细胞数量取决于期望的效果、患者状态等等，可以由本领域技术人员确定。
[00421]其中可以导入核酸用于基因治疗目的的细胞涵盖任何期望的、可获得的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如，从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏获得的，等等。
[00422]在优选的实施方式中，用于基因治疗的细胞对于受试者是自体的。
[00423]在重组细胞被用于基因治疗的实施方式中，将编码抗体或融合蛋白的核酸序列导入细胞内，从而它们可被细胞或它们的子代表达，然后为了治疗效果体内施用重组细胞。在特定的实施方式中，使用干细胞或祖细胞。可以分离和在体外维持的任何干细胞和/或祖细胞潜在地可以根据本发明的这个实施方式使用。(参见例如，PCT公开WO 94/08598；Stemple and Anderson，1992，Cell 71：973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A：229；和Pittelkow and Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61：771)。
[00424]在特定实施方式中，为了基因治疗的目的导入的核酸包括与编码区可操作连接的可诱导启动子，从而通过控制合适的转录诱导物的存在或缺乏，所述核酸是可控制的。
5.6.3试剂盒
[00425]本发明提供了药物包装或试剂盒，其包含装有本发明的分子(即，包含变异Fc区的抗体、多肽)的一个或多个容器。此外，对疾病的治疗有用的一种或多种其他预防或治疗试剂也可以被包括入药物包装或试剂盒。本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含装有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。任选的，与这种容器相关的可以是管理厂家的政府机构所规定的形式、药物或生物制品的使用或销售的提示，所述提示反应厂家机构的批准，用于人类施用的使用或销售。
[00426]本发明还提供了可在上述方法中使用的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含一种或多种本发明的分子。在另一个实施方式中，试剂盒进一步在一个或多个容器中包含对癌症治疗有用的一种或多种其他预防或治疗试剂。在另一个实施方式中，，试剂盒进一步包含结合与癌症相关的一种或多种癌症抗原的一种或多种细胞毒抗体。在某些实施方式中，所述其他预防或治疗试剂是化学治疗剂。在其他实施方式中，本发明的预防或治疗试剂是生物学的或激素的治疗剂。
5.7治疗剂应用的表征和展示
[00427]药物组合物的几个方面，本发明的预防试剂或治疗试剂优选的在人类使用之前在体外、在细胞培养系统中、在动物模型有机体，例如啮齿动物模型系统中测试期望的治疗活性。例如，可用于确定特定药物组合物的施用是否是期望的的分析，包括细胞培养分析，其中在培养中生长患者组织样品，并暴露于或与本发明的药物组合物接触，并观察这种组合物对组织样品的影响。可以通过患者的活组织检查获得组织样品。这种测试容许鉴定对单个患者治疗上最有效的预防或治疗分子。在各种特定的实施方式中，可以用涉及自体免疫或炎症性失调的细胞类型的代表性的细胞(例如，T细胞)进行体外分析，来确定本发明的药物组合物是否对这些细胞类型具有期望的效果。
[00428]可以在人类使用之前在适合的动物模型系统中测试预防试剂和/或治疗试剂的组合。这种动物模型系统包括但不限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔，等等。可以使用本领域公知的任何动物系统。在本发明的特定实施方式中，在小鼠模型系统中测试预防试剂和/或治疗试剂的组合。这种模型系统是广泛使用的，并且是技术人员公知的。可以重复地施用预防试剂和/或治疗试剂。该过程的几个方面可以不同。所述方面包括施用预防试剂和/或治疗试剂的时间方式，以及这些试剂是单独地还是作为混合物施用。
[00429]用于本发明的方法的优选的动物模型是，例如，在小鼠效应细胞上表达人类FcγR的转基因小鼠，例如，在美国专利No.5,877,396中(通过完全引用将它合并在此)描述的任何小鼠模型，可以用于本发明。用于本发明的方法的转基因小鼠包括但不限于，携带人类FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIA的小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIIA的小鼠；携带人类FcγRIIB和人类FcγRIIA的小鼠。
[00430]优选的，在如上所述的功能分析中显示了最高的活性水平的突变在人类使用之前测试在动物模型研究中的使用。携带使用本发明的方法鉴定的和在ADCC中分析中测试的Fc突变体的抗体包括两种抗-Erb-B2抗体ch4D5和ch520C9，和一种抗-TAG72抗体，优选的用于动物模型中，因为早先已经在异种移植小鼠模型中使用了它们(Hudsiak et al.，1989，Mol.Cell Biol.9：1165-72；Lewis et al.，1993，Cancer Immunol.Immunother.37：255-63；Bergman et al.，2001 Clin.Cancer Res.7：2050-6；Johnson et al.，1995，Anticancer Res.1387-93)。可以使用以上描述的方法，例如，使用在此公开和例示的哺乳动物表达系统和IgG纯化方法，制备足够数量的抗体用于动物模型中。一般的实验需要至少约5.4mg突变抗体。这种计算是基于遵循4μg/g的加载剂量和每周的维持剂量2μg/g十周，保护8-10只30g小鼠所需的野生型抗体的平均数量。本发明涵盖作为异种移植肿瘤的来源的肿瘤细胞系，例如来自患有乳腺癌的患者的SK-BR-3、BT474和HT29细胞。这些细胞在它们的表面具有Erb-B2和促黄体分泌素受体。已经在ADCC和异种移植肿瘤模型中成功地使用了SK-BR-3细胞。在其他分析中可以使用来自人类卵巢腺癌的OVCAR3细胞。这些细胞在细胞表面表达抗原TAG72，可以与chCC49抗体共同使用。使用不同的抗体和多种肿瘤模型将避免由于抗体特异性Fc突变不相容性的任何特定突变的损失。
[00431]小鼠异种移植模型可以用于检查小鼠抗体的效力，所述小鼠抗体是根据抗体分子的CDR区的亲合性和特异性针对肿瘤特异性目标产生的，以及抗体的Fc区引发免疫反应的能力(Wu et al.，2001，Trends Cell Biol.11：S2-9)。在小鼠效应细胞上表达人类FcγR的转基因小鼠是独特的，是定制的动物模型，来测试人类Fc-FcγR相互作用的效力。可以使用在Dr.Jeffrey Ravetch的实验室中产生的FcγRIIIA、FcγRIIIB和FcγRIIA转基因小鼠的配对(经过Rockefeller U.和SloanKettering Cancer center的许可)，如以下表11列出的那些。
表11：小鼠品系
| 品系背景 | 人类FcR |
| Nude/CD16A KO | 无 |
| Nude/CD16A KO | FcγRIIIA |
| Nude/CD16A KO | FcγR IIA |
| Nude/CD16A KO | FcγR IIA和IIIA |
| Nude/CD32B KO | 无 |
| Nude/CD32B KO | FcγR IIB |
[00432]优选的，在动物模型实验中测试Fc突变体，所述Fc突变体显示了对FcγRIIIA增强的结合和对FcγRIIB降低的结合、ADCC和吞噬作用分析中的提高的活性。动物模型实验检查在FcγRIIIA转基因的、nude mCD16A敲除小鼠中与已经施用天然抗体的对照相比携带Fc突变的抗体效力的增加。优选的，使用标准方案检查8-10只小鼠的组。示范性的动物模型实验可以包含以下步骤：在乳腺癌模型中，在第1天用与Matrigel(Becton Dickinson)混合的0.1mL PBS皮下地注射～2×106个SK-BR-3细胞。首先，施用野生型嵌合抗体和同种型对照来确定预定治疗剂量的曲线，在第1天以4μg/g的初始剂量，继之以每周2μg/g的注射静脉内注射4D5。监视肿瘤体积6-8周来测量疾病的进展。在注射了同种型对照的动物中，肿瘤体积应随时间线性地提高。相比之下，在注射4D5的组中应出现极少的肿瘤生长。标准剂量研究的结果被用于设置测试Fc突变体的实验的上限。使用含Fc突变的抗体的亚治疗剂量进行这些研究。在用FcγRIIB敲除小鼠进行的实验中对异种移植模型使用十分之一的剂量，参见Clynes etal.，2000，Nat.Med.6：443-6，具有产生的肿瘤细胞生长的阻断。由于本发明的突变优选地显示了FcγRIIIA活化的提高和FcγRIIB结合的降低，以十分之一的治疗剂量检查突变体。以不同的间隔检查肿瘤大小表面了所述抗体在较低剂量的效力。使用t检验对数据的统计分析提供了确定数据是否显著的方法。以逐渐降低的剂量测试显示了提高的效力的Fc突变体，来确定最小可能的剂量作用它们的效力的度量。
[00433]通过使用本领域已知的和在Crofford L.J.and Wilder R.L.，“Arthritis and Autoimmunity in Animals”，in Arthritis and AlliedConditions：A Textbook of Rheumatology，McCarty et al.(eds.)，Chapter 30(Lee and Febiger，1993)中描述的炎症性关节炎的各种实验动物模型，可以确定本发明的组合治疗的抗炎活性。炎症性关节炎和自体免疫风湿疾病的实验的和天然的动物模型也可以用于评定本发明的组合治疗的抗炎活性。以下是作为实例而不是为了限制而提供的一些分析。
[00434]本领域已知和广泛使用的关节炎或炎症性疾病的原则动物模型包括：佐剂诱导的关节炎大鼠模型、胶原蛋白诱导的关节炎大鼠和小鼠模型，和抗原诱导的关节炎大鼠、兔和仓鼠模型，所有的都在Crofford L.J.and Wilder R.L.，“Arthritis and Autoimmunity inAnimals”，in Arthritis and Allied Conditions：A Textbook ofRheumatology，McCarty et al.(eds.)，Chapter 30(Lee and Febiger，1993)中描述，通过完全引用将它合并在此。
[00435]本发明的组合治疗的抗炎活性可以使用角叉菜胶诱导的关节炎大鼠模型来评定。角叉菜胶诱导的关节炎也已经在慢性关节炎或炎症的研究中用于兔、狗和猪。定量的histomorphometric评定被用于测定治疗效力。在Hansra P.et al.，“Carrageenan-Induced Arthritis inthe Rat，”Inflammation，24(2)：141-155，(2000)中描述了使用这种角叉菜胶诱导的关节炎模型的方法。通常还使用的是本领域已知和已描述的酵母多糖诱导的炎症动物模型。
[00436]本发明的组合治疗的抗炎活性也可以通过使用Winter C.A.et al.，“Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as anAssay for Anti-inflammatory Drugs”Proc.Soc.Exp.Biol Med.111，544-547，(1962)中描述的方法的修改体、测量大鼠中对角叉菜胶诱导的爪水肿的抑制来评定。这种分析已经用于大多数NSAID的抗炎活性的初步体内筛选，并认为是人类效力的预示。测试的预防或治疗试剂的抗炎活性被表示为测试组相对于载体给药的对照组在后爪重量增加方面的抑制百分比。
[00437]另外，炎症性肠病的动物模型也可以用于评定本发明的组合治疗的效力(Kim et al.，1992，Scand.J.Gastroentrol.27：529-537；Strober，1985，Dig.Dis.Sci.30(12Suppl)：3S-10S)。溃疡性的cholitis和Crohn’s病是可以在动物中诱导的人类炎症性肠病。可以向动物口头地施用硫酸化的多聚糖，包括但不限于，支链淀粉、角叉菜、硫酸支链淀粉和硫酸葡聚糖或化学刺激物包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸来诱导炎症性肠病。
[00438]自体免疫失调的动物模型也可以用于评定本发明的组合治疗的效力。已经开发了自体免疫失调的动物模型例如1型糖尿病、甲状腺自体免疫、系统性红斑狼疮和血管球性肾炎(Flanders et al.，1999，Autoimmunity 29：235-246；Krogh et al.，1999，Biochimie 81：511-515；Foster，1999，Semin.Nephrol.19：12-24)。
[00439]进一步的，本领域技术人员已知的任何分析可以用于评估在此公开的组合治疗对于自体免疫和/或炎症性疾病的预防和/或治疗实用性。
[00440]本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效力可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学过程来测定，例如，测定LD50(对50％群体的致死剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。在有毒/治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，它可以被表示为LD50/ED50之间的比例。显示了大的治疗指数的预防和/或治疗试剂是优选的。当使用展现了毒性副作用的预防和/或治疗试剂时，应当小心地设计递送系统，所述递送系统将这些试剂靶向受感染组织以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而降低副作用。
[00441]从细胞培养分析和动物研究获得的数据可以用于配制用于人类的预防和/或治疗试剂的剂量范围。这些试剂的剂量优选地处在包括很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变动。对于用于本发明的方法任何试剂，可以最初地从细胞培养分析来估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量来达到包括在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地测定人类中有用的剂量。可以通过例如高效液相层析法测定血浆中的水平。
[00442]根据本发明使用的治疗的抗癌活性也可以通过使用本领域已知和在Relevance of Tumor Models for A nticancer Drug Development(1999，eds.Fiebig and Burger)；Contributions to Oncology(1999，Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research(1991，eds.Boven andWinograd)；and Anticancer Drug Development Guide(1997 ed.Teicher)中描述的各种用于癌症研究的实验动物模型，例如SCID小鼠模型或转基因小鼠或具有人类异种移植的nude小鼠，动物模型，例如仓鼠、兔等等，来测定，通过完全引用将它们合并在此。
[00443]用于测定本发明的分子的治疗效力的优选的动物模型时小鼠异种移植模型。可以用作异种移植肿瘤的来源的肿瘤细胞系包括但不限于SKBR3和MCF7细胞，其可以来自患有乳腺癌的患者。这些细胞具有erbB2和促黄体分泌素受体。已经在本领域中常规地使用SKBR3细胞作为ADCC和异种移植肿瘤模型。做为选择，来自人类卵巢癌的OVCAR3细胞可被用作异种移植肿瘤的来源。
[00444]在人类使用前，优选的在体外、然后在体内测试本发明的方案和组合物的期望的治疗或预防活性。可以使用肿瘤或恶性细胞系的细胞筛选治疗试剂和方法。本领域的许多标准分析可以用于评定这种存活率和/或生长，例如，通过测量3H-胸腺嘧啶核苷掺入、通过直接细胞计数、通过检测已知基因例如原癌基因(例如，fos、myc)或细胞周期标记物的转录活性的变化可以分析细胞增殖；通过锥石蓝染色可以评定细胞生存力，根据形态学、降低的生长和/或在软琼脂中的集落形成或在三维的基底膜或细胞外基质制备物中的管性网络形成，可以视觉上地评定分化。
[00445]可以在人类中测试之前在适合的动物模型系统中测试治疗中使用的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、仓鼠等等，例如，如上所述的动物模型。然后可以在合适的临床试验中使用化合物。
[00446]进一步的，本领域技术人员已知的任何分析可以用于评估在此公开的组合治疗对于癌症、炎症性失调或自体免疫疾病的治疗或预防的预防和/或治疗实用性。
6.实施例
[00447]使用酵母展示系统，筛选突变的人类IgG1重链Fc区的对不同Fc受体的修改的亲合性。特别地，通过error-prone PCR(Genemorph，Stratagene)产生突变Fc库，然后将突变的Fc蛋白融合到Aga2p细胞壁蛋白，其容许融合蛋白细胞外地分泌并展示在酵母细胞壁上。
[00448]克隆人类受体(FcγRIIIA和FcγRIIB)的可溶形式。然而，由于FcγR对它的配体的低亲合性，在酵母细胞表面检测IgG1 Fc结构域被防碍。为了规避这种局限，使用AVITAG序列形成可溶的FcγR四聚复合物，所述AVITAG序列可以以酶学手段生物素化，随后与结合到藻红素的链霉抗生物素蛋白(SA-PE；Molecular Probes)反应来形成可溶的四聚FcγR复合物。ELISA分析证实了相对于单体的FcγR，可溶的FcγR四聚复合物对人类IgG1具有更高的亲合力。如通过FACS分析评定的，酵母细胞表面的Fc融合蛋白也结合可溶的FcγR四聚复合物。
[00449]酵母细胞表面表达的Fc融合蛋白与可溶的四聚FcγR复合物的差异结合通过FACS分析来监视。因而鉴定了对一种或多种可溶的四聚FcγR复合物具有改变的亲合性的Fc融合蛋白，然后掺入完整的免疫球蛋白并在哺乳动物细胞中表达。将哺乳动物表达的产物用于ELISA分析来证实酵母表面展示系统中获得的结果。最后，对突变Fc区测序来确认改变的残基。
6.1FcγRIIIA的克隆、表达和纯化
材料和方法
[00450]可溶的FcγRIIB和FcγRIIIA如下克隆：获得人类FcγR基因(FcγRIIB和FcγRIIIA)的cDNA克隆(Ravetch实验室的惠赠)。通过PCR(表12)扩增FcγRIIIA基因的可溶区(氨基酸7-203)，用BamHI/HindIII消化并连接到pET25载体(Novagen)中。用Sall/Notl消化这个载体，凝胶分离370by片段。用BamHI/Sall消化载体hu3A(J.Ravetch的惠赠)，分离含有FcγRIIIA的N-末端的270by片段。两个片段共同连接到用BamH/NotI切割的pcDNA3.1中来产生pcDNA3-FcγRIIIA。通过PCR(表12)控制FcγRIIB的可溶区(氨基酸33-180)，用BglII/HindIII消化并连接到pET25b(+)(Novagen)中。用BamHI/Notl消化这个载体，凝胶分离140bp片段。用BamHI/EcoRI消化载体huRIIb1(J.Ravetch的惠赠)，分离440bp N-末端FcγRIIB片段。两个片段共同连接到用BamHI/Notl切割的pcDNA3.1来产生pcDNA3-FcγRIIB(氨基酸1-180)。将重组克隆转染到293H细胞中，从细胞培养物收集上清液，在IgG琼脂糖柱上纯化可溶的重组FcγR(rFcγR)蛋白。
结果
重组可溶FcγRIIIA(rFcγRIIIA)和重组可溶FcγRIIB(rFcγRIIB)被纯化到同质。
[00451]在表达和在IgG琼脂糖柱上纯化重组可溶FcγR蛋白之后，通过SDS-PAGE测定重组纯化的可溶受体蛋白的纯度和表观分子量。如附图1所示，可溶rFcγRIIIA(附图1，泳道1)具有35KDa的预期表观分子量，可溶rFcγRIIB(附图1，泳道4)具有～20KDa的预期表观分子量。如附图1所示，可溶rFcγRIIIA作为弥散的“模糊”条带迁移，其归因于FcγRIIIA上正常地存在的高度的糖基化(Jefferis，et al.，1995Immunol Lett.44，111-117)。
6.1.1纯化的重组可溶FcγRIIIA的表征
材料和方法
[00452]使用ELISA分析，来分析如上所述获得的纯化的可溶rFcγRIIIA与人类单体或聚集的IgG的直接结合。用10ng可溶rFcγRIIIA在1X PBS中包被平板过夜。在包被之后，在1X PBS/0.1％吐温20中洗涤平板三次。将人类IgG，生物素化的单体IgG或生物素化的聚集的IgG，以0.03mg/mL到2mg/mL的浓度范围添加到孔中，容许与可溶rFcγRIIIA结合。在37℃进行反应一小时。再次用1XPBS/0.1％吐温20洗涤平板三次。通过监视650nm处的吸光度，用链霉抗生物素蛋白辣根过氧化酶轭合来检测人类IgG与可溶rFcγRIIIA的结合。650nm处的吸光度与结合的聚集IgG成比例。
[00453]在阻断ELISA实验中，监视FcγRIIIA单克隆抗体、小鼠抗FcγRIIIA抗体3G8(Pharmingen)阻断受体与聚集的IgG结合的能力。洗涤和孵育条件与上述的相同，只是在添加IgG之前，添加5倍摩尔过量的3G8，并容许在37℃孵育30分钟。
结果
[00454]纯化的、重组可溶性FcγRIIIA特异性地结合聚集的IgG。
[00455]使用ELISA分析测试纯化的重组可溶FcγRIIIA与聚集的和单体的IgG的直接结合(附图2)。在2μg/ml的IgG浓度处，观察到与聚集的IgG的强劲结合。然而，在类似的浓度，没有检测到与单体IgG的结合。与聚集的IgG的结合被3G8阻断，3G8是封闭配体结合位点的小鼠抗FcγRIIIA单克隆抗体，表明聚集的IgG结合是经由正常的FcγRIIIA配体结合位点的(附图2)。还表征了可溶rFcγRIIB，并显示具有与可溶rFcγRIIIA类似特征的对IgG的结合(数据未显示)。
6.2可溶FcγR四聚复合物的形成
材料和方法
构建用于表达融合到AVITAG肽的可溶FcRγIIIA和FcRγIIB的质粒
[00456]为了产生可溶的FcγR四聚复合物，通过PCR(表12)扩增人类FcRgIIIA基因的可溶区(氨基酸7-203)，用BamHI/HindIII消化并连接到pET25b(+)(Novagen)中。用SalI/Not1消化这个载体，通过琼脂糖凝胶电泳分离370bp片段。用BamHI/SalI消化载体hu3A(J.Ravetch的惠赠)，分离含有FcRγIIIA的N-末端的270bp片段。两个片段共同连接到用BamH/NotI消化的pcDNA3.1(Invitrogen)中，来产生pcDNA3-FcRgIIIA(氨基酸1-203)。
[00457]通过PCR(表I)扩增FcRγIIB的可溶区(氨基酸33-180)，用BglII/HindIII消化并连接到pET25b(+)(Novagen)中。用BamHI/NotI消化这个载体，通过琼脂糖凝胶电泳分离140bp片段。用BamHI/EcoRI消化载体huRIIb1(J.Ravetch的惠赠)，分离440byFcRγIIB N-末端片段。两个片段共同连接到已经用BamHI/Notl消化的pcDNA3.1中，来产生pcDNA3-FcRγIIB(氨基酸1-180)。随后，将接头AVITAG序列融合到FcγRIIIA和FcγRIIB的C-末端。为了产生FcγRIIIA-接头-avitag和FcγRIIB-接头-avitag构建体，用Not I和XbaI消化pcDNA3.1FcγRIIIA和FcγRIIB构建体(都插入载体序列中)，将包括5’末端的NotI位点和3’末端的XbaI的86碱基对双链寡核苷酸连接到载体中。通过将具有已经预先设计的NotI和XbaI限制性位点的两个5’磷酸化反向互补寡核苷酸(表12中示出，为5’和3’接头avitag引物)退火，来产生这个86bp片段。将100ng每ul的等体积每种引物混合，将DNA加热到90℃15分钟，在室温下冷却一小时来退火。这产生了预备与用各自的酶消化的pcDNA3.1-FcγRIIIA和FcγRIIB构建体连接的双链DNA片段。因而，构建了pcDNA3.1-FcRγIIIA-接头-AVITAG和pcDNA3.1-FcRγIIB-接头-AVITAG。
表12：用于FcγR和IgG载体的构建的引物
| 寡聚物 | 序列 |
| 5’接头avitag(SEQ.ID NO.1) | GGCCGCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAA TCGAATGGCACGAATGAT |
| 3’接头avitag(SEQ.ID NO.2) | CTAGATCATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGC |
| FcRIIIA左侧(SEQ.ID NO.3) | G TTG GAT CCT CCA ACT GCT CTG CTA CTT CTA GTT T |
| FcRIIIA右侧(SEQ.ID NO.4) | GAA AAG CTT AAA GAA TGA TGA GAT GGT TGA CAC T |
| FcRIIB右侧(SEQ.ID NO.5) | GAA GTC GAC AAT GAT CCC CAT TGG TGA AGA G |
| FcRIIB左侧(SEQ.ID NO.6) | G TTA GAT CTT GCT GTG CTA TTC CTG GCT CC |
| IgG1右侧(SEQ.ID NO.7) | ATA GTC GAC CAC TGA TTT ACC CGG AGA |
| IgG1左侧(SEQ.ID NO.8) | GGAA TTC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT |
| mcr025；chl(f’)(SEQ.ID NO.9) | AAA GGATCC GCG AGC TCA GCC TCC ACC AAG G |
| H021(SEQ.ID NO.10) | GTCTGCTCGAAGCATTAACC |
通过BirA生物素化
[00458]通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，CA)短暂地转染293H细胞，产生克隆到pcDNA3.1中、在蛋白质的C-末端融合到15氨基酸AVITAG序列(Avidity，CO)(Schatz P.J.，1993，Biotechology，11：1138-1143)的可溶Fc受体(FcγR)。从培养物收集上清液，通过使上清液通过IgG琼脂糖柱来纯化可溶FcR蛋白。通过280nm处的吸光度测定可溶FcR-AVITAG融合蛋白的浓度。根据厂家的方案(Avidity，CO)用一种生物素连接酶E.coli BirA酶将可溶FcR蛋白上呈现的AVITAG生物素化。将1：100最终稀释度的蛋白酶抑制物的混合物(cocktail)(Sigma catalog#_P8849)和1mg/ml终浓度的亮抑蛋白酶肽(Sigma L-8511)添加到混合物以防止蛋白的降解。在室温下孵育BirA反应过夜，随后使用Biomax 10K-ultrafiltration装置(Millipore)通过在4℃3500rpm离心来浓缩溶液。在Tris-HCl(20mM，pH 8.0)、50mM NaCl中将蛋白加载到FPLCSuperdex 200HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)上，来从游离生物素分离标记的可溶FcγR。
通过链霉抗生物素蛋白移动分析来测定生物素化的程度
[00459]约80-85％的蛋白质被BirA酶(Avidity，CO)生物素化。链霉抗生物素蛋白移动分析被用于测定蛋白质的生物素化的程度。以不同的比例将生物素化的蛋白与链霉抗生物素蛋白(MW 60,000Daltons)孵育。单独的未生物素化的蛋白质和单独的链霉抗生物素蛋白被包括作为对照，来测定生物素化的程度。孵育在冰上进行2小时或在4℃进行过夜。用还原剂并且不煮沸样品在4-12％Bis-Tris(Invitrogen，CA)上分析样品。结合链霉抗生物素蛋白的生物素化的蛋白质作为高分子量条带迁移。通过样品中留下的单体蛋白质的数量估计生物素化的程度。单体的低分子量种类的缺乏和具有大于单独的链霉抗生物素蛋白的分子量的复合物的存在，表面高度的生物素化。
FcγR四聚复合物的形成
[00460]根据针对MHC I类四聚物早先建立的方法(参见，Busch，D.H.et al.，1998Immunity8：353-362；Altman，J.D.et al.，1996，Science 274：94-96)进行FcγR四聚复合物的形成。根据280nm的吸光度计算生物素化的单体FcγR的浓度。一个分子的链霉抗生物素蛋白-藻红蛋百(SA-PE)(Molecular Probes，OR)具有结合4分子生物素的能力。使用5∶1摩尔比的单体生物素化的FcγR和SA-PE(5X单体生物素化的FcγR：1X SA-PE)来确保过量的生物素化的蛋白。SA-PE的计算的分子量是300,000道尔顿，因此303mL a 1 mg/mL链霉抗生物素蛋白-PE的溶液具有1nmole SA-PE，将它添加到5nmole蛋白中。四聚蛋白的有效形成需要以逐步式增加的方式来添加SA-PE。首先添加一半数量的SA-PE，其余的SA-PE在黑暗中在4℃每20-30分钟添加小的等分量。添加其余SA-PE的间隔是灵活的。在添加SA-PE完成之后，将溶液浓缩，如上述在磷酸盐缓冲盐水、pH 7.4中加载到FPLC大小排阻柱上。收集在空隙容积中洗脱的具有大于单独的SA-PE的分子量的馏分。再添加蛋白酶抑制物来防止蛋白降解。浓缩溶液，添加其他蛋白酶抑制物到最终的复合物中用于保存。根据生物素化的单体蛋白的起始浓度计算可溶的FcγR四聚复合物的终浓度。例如，如果500μg生物素化的蛋白被用于制造四聚复合物，最终浓缩的四聚物在500μL的体积中，浓度估计是约1mg/mL(不考虑浓缩期间的损失，因为难以精确地测定在四聚物形成的每个步骤中损失了多少。由于PE的干扰，也不可能的是采用280nm的吸光度来测量浓度)。在-80℃以小的等分量分配可溶FcγR四聚复合物用于伴有蛋白酶抑制物的长期保存。不向这些制备物中添加叠氮化钠，因为四聚物被用于筛选酵母显示库。在解冻等分量时，将四聚物保存在4℃直至1周。
用于表征四聚FcγR复合物的ELISA分析
[00461]ELISA被用于表征四聚FcγR复合物。用PBS缓冲液中25ng的人类IgG包被Maxisorb F96孔平板(Nunc)，在4℃孵育过夜。用PBS/0.5％BSA/0.1％Tween 20(洗涤和稀释缓冲液)洗涤平板，之后添加FcγRIIIA四聚物和测试抗体的组合来测定用小鼠抗人类FcγRIIIA抗体的阻断，如下所述：阻断步骤如下进行：固定的0.5mg/ml终浓度的可溶FcγRIIIA四聚物与抗体在缓冲液PBS/0.5％BSA/0.1％Tween 20中在室温下预孵育1h。抗体的终浓度从60mg/mL到0.25mg/mL。3G8是小鼠抗人类FcγRIIIA抗体，对于这个实验来说，使用嵌合的版本，即抗体的可变区是小鼠抗人类FcγRIIIA，重链和轻链的恒定区来自IgG1人类区域。嵌合的4.4.20.D265A也用于这个实验中，其是抗荧光素抗体，从而Fc区含有位置265处的突变，其中天冬氨酸被人类IgG1中的丙氨酸替换，其导致与FcγR的降低的结合。这个抗体先前已经被表征(参见Clynes et al.，2000，Nat.Med.6：443-446；Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.，276：6591-6604)。这个抗体被用作阴性同种型对照。
[00462]通过在室温下预孵育1小时，容许抗体与FcγRIIIA四聚物结合。然后将混合物添加到洗涤的平板上的IgG，在室温下另外孵育1小时。用缓冲液洗涤平板，以1∶5000稀释度添加DJ130c(从DAKO，Denmark获得的小鼠抗人类FcγRIIIA抗体；它的表位不同于3G8抗体的表位)，容许在室温下孵育1小时以检测结合的FcRIIIA四聚物。用缓冲液洗去未结合的抗体，用山羊抗小鼠过氧化物酶(Jackson实验室)检测结合的DJ130c。这个试剂将不检测人类Fc。在洗去未结合的结合过氧化物酶的抗体之后，添加底物TMB试剂(BioFx)来检测相比同种型对照的3G8阻断程度，在650nm读取产生的颜色。
[00463]通过ELISA，对于可溶四聚FcγRIIIA与IgG的直接结合，如上所述用25ng IgG包被maxisorb平板。从20mg/mL到0.1mg/mL添加可溶四聚FcγRIIIA，以20mg/mL到0.16mg/mL的浓度范围添加生物素化的单体可溶四聚FcγRIIIA。检测与上述用DJ130c的相同，继之以山羊抗小鼠过氧化物酶抗体。用TMB试剂生产颜色，在650纳米读取平板。
结果
可溶的FcγRIIIA四聚复合物经由它的正常配体结合位点结合单体人类IgG
[00464]使用ELISA分析，如在材料和方法一节中描述的，产生、分离和分析可溶的FcγRIIIA-AVITAG融合蛋白，显示了具有与非AVITAG可溶FcγRIIIA蛋白类似的性质(数据未显示)。将融合蛋白生物素化，如上所述产生四聚复合物。
[00465]然后使用ELISA分析来评定可溶的FcγR四聚复合物与其配体、单体人类IgG的结合。ELISA的分析显示，可溶的四聚FcγR复合物。特异性地结合单体人类IgG。如附图3A所示，如650nm处的吸光度所监测的，可溶四聚FcγRIIIA与单体人类IgG的结合被小鼠抗人类FcγIIIA单克隆抗体3G8阻断。另一方面，携带D265A突变的4-4-20单克隆抗体不能阻断可溶四聚FcγRIIIA与单体人类IgG的结合(附图3A)。因而这个实验证实了可溶四聚FcγRIIIA复合物的结合通过天然的配体结合位点来发生。
可溶FcγRIIIA四聚复合物以比单体可溶FcγRIIIA更大的亲合力结合单体人类IgG
[00466]使用ELISA分析来评定可溶四聚FcγRIIIA与聚集的人类IgG的直接结合，并与可溶单体FcγRIIIA与单体人类IgG的直接结合相比较。如附图3B所示，可溶四聚FcγRIIIA以比可溶单体受体更高的亲合力(8-10倍)结合人类IgG，如450nm处的吸光度所监测的。
[00467]也使用包被了从IgG1纯化的Fc片段的磁性珠子来分析可溶FcγRIIIA四聚复合物的结合(附图4)。在未检测到单体结合的条件下，可溶FcγRIIIA四聚复合物与IgG1 Fc包被的珠子结合。通过预先孵育受体复合物和阻断Fc结合的抗FcγRIIIA单克隆抗体LNK16，显示了结合的特异性。这个分析进一步证实了，可溶FcγRIIIA四聚复合物通过它的正常配体结合位点结合单体IgG，由于复合物内的多个结合位点，提高了受体的亲合力。
6.3用于展示突变IgG1 Fc结构域的酵母菌株的构建
材料和方法
[00468]pYD1载体(Invitrogen)是直接从酵母复制载体pCT302衍生的(Shusta，et al.，2000Nat.Biotechnol.18：754-759，其已经被成功地用于展示T细胞受体和许多scFV。这种质粒是着丝粒的并携带TRP1基因，容许在trpl酵母菌株中每个细胞1-2个质粒的相对恒定的拷贝数。方向性克隆到多聚接头中将目标基因置于GAL1启动子的控制下并与AGA2处在读码框内。IgG Fc结构域与酵母Aga2p的融合引起了Aga2-Fc融合蛋白的细胞外分泌和随后的经由到酵母Aga lp蛋白的二硫键在细胞壁上展示Fc蛋白，Aga lp蛋白是整合的细胞壁蛋白。
[00469]为了优化展示水平，通过PCR扩增来自IgG1重链的不同片段并克隆到pYD1中。具体地，通过PCR从IMAGE克隆182740扩增IgG1重链的Fc区(同种型IG1m(a)；氨基酸206-447)，用EcoRI/SaII消化并连接到pYD1载体(Invitrogen)中。来自IMAGE的最初的克隆含有在位置319的单个核苷酸删除，其通过体外定点诱变来纠正，以构建pYD-GIF206(Quickchange，Stratagene)。
[00470]使用5’oligo(mcr025；chl(f))和3’oligo(H021)(参见表8)从pCINEO载体中的MAb B6.2的重链克隆扩增CH1-CH3片段(氨基酸118-447)。用BamHI/NotI消化这个片段，并连接到pYD1载体中来构建pYD-CH1。
[00471]附图5显示了构建体的示意图。CH1-CH3构建体除了重链的铰链-CH2-CH3结构域之外含有CH1结构域，GIF206含有铰链上游的6个氨基酸残基，GIF227在内源蛋白水解裂解位点的绞链区内开始(Jendeberg et al.，1997J.Immunol.Meth.201：25-34)。
6.4酵母细胞壁上Fc结构域的免疫定位和表征
材料和方法
[00472]使用标准的乙酸锂酵母转化方案(Gietz et al.，1992NucleicAcids Res.20：1425)，将含有Aga2p-Fc融合蛋白的构建体和没有任何插入物的对照载体pYDI转化到酵母菌株EBY100(Invitrogen)MATaura3-52trpl leu2Δl his3Δ200pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1中。随后，在合成培养基上选择色氨酸原养型微生物。独立细胞群体的扩增以及Agalp和Aga2p-Fc融合蛋白的诱导伴随着在葡萄糖中的生长，随后在含有半乳糖作为原始碳源的培养基中在20℃生长24-48小时。半乳糖中生长经由GAL1启动子诱导Aga2-Fc融合蛋白的表达，其随后引起Fc融合蛋白在酵母细胞表面的展示。
结果
Fc融合蛋白的FACS分析
[00473]使用PE-轭合的多克隆F(ab)2山羊抗人FcγR和HP6017(Sigma)抗体(Jackson Immununoresearch Laboratories，Inc.)通过免疫染色来分析酵母细胞表面Fc融合蛋白的表达。荧光显微术显示了对三种Fc融合蛋白的周围染色。携带单独的载体的对照菌株显示了极少的或没有染色(数据未显示)。FACS分析被用于定量染色(附图6)。含有CH1-CH3融合物的酵母菌株显示了最高百分比的用两种抗体染色的细胞(附图6B和F)。GIF227构建体显示了最大的平均荧光强度(附图6，画面C和G)。
表征酵母细胞表面表达的Fc融合蛋白的结合
[00474]Fc和FcγR蛋白的天然环境将受体置于细胞表面并使Fc作为可溶配体；然而酵母Fc表面展示反转了这种天然相互作用的几何结构。酵母细胞壁的表面上IgGl Fc蛋白的检测，由于FcγR对其配体的低亲合性和展示系统固有的反转几何结构而被复杂化。虽然后一点不能被改变，如以上解释的通过形成可溶的FcγR四聚复合物改善了配体的亲合力，其容许检测结合到酵母细胞壁表面表达的Fc融合蛋白的FcγR。
[00475]为了表征可溶的四聚FcγR复合物与表面展示的Fc融合蛋白的结合，将表达不同Fc构建体的酵母细胞与可溶的rFcγRIIIA四聚复合物孵育并通过FACS分析。如FACS分析所示，携带pYD-CH1、展示野生型CH1-CH3构建体的酵母细胞被可溶的rFcγRIIIA四聚复合物结合。然而，如FACS分析所示，GIF206和GIF227株显示了很少的或没有与可溶的rFcγRIIIA四聚复合物的结合(数据未显示)。
[00476]已经鉴定了Fc区中阻断与FcγR的结合的突变(Shields etal.，2001；J Biol.Chem.276：6591-6604)。这些突变之一，D265A，被掺入pYD-CH1中，这个突变体在酵母细胞表面上表达。使用高浓度的配体(0.15mM Fc；7.5mM D265A)与可溶FcγRIIIA四聚复合物孵育这些细胞，FACS分析表明，可溶FcγRIIIA四聚复合物与野生型Fc结合(附图7A)，但可溶FcγRIIIA四聚复合物不与D265A-Fc突变体结合，表明FcγR与较低的铰链-CH2区中的正常FcR结合位点相互作用(附图7B)。
[00477]如FACS分析的，针对FcγRIIIA配体结合位点的抗体阻断可溶FcγRIIIA四聚复合物与酵母细胞壁表面展示的野生型Fc蛋白的结合(附图8)。可溶FcγRIIIA四聚复合物的结合被3G8抗体以及另一种抗FcγRIIIA单克隆抗体LNK16抗体(Advanced Immunological)(Tam et al.，1996J.Immunol.157：，1576-1581)阻断，但不被不相关的同种型对照阻断。因此，可溶FcγRIIIA四聚复合物与酵母细胞表面展示的Fc蛋白的结合通过正常的配体结合位点发生。FcγRIIIA四聚复合物的有限结合表明，细胞的亚群具有FcγR可接近的正确折叠的Fc。为何仅细胞的亚群能够结合配体存在多种原因，例如，它们可能处在细胞周期的不同阶段或融合蛋白可能未被输出。
[00478]为了确定与酵母细胞表面的Fc融合蛋白结合的FcγRIIIA四聚物的离解常数，使用FACS分析了一系列FcγRIIIA四聚复合物的结合。在1.4μM到0.0006μM的浓度滴定FcγRIIIA四聚复合物。使用平均荧光强度作为结合亲合性和非线性回归分析的度量，测定KD为0.006μM(+/-0.001)(数据未显示)。
6.5Fc突变库的构建
[00479]使用侧翼于Fc-CH1构建体中Fc片段的引物和error-pronePCR(Genemorph，Stratagene)构建突变Fc库。使诱变PCR(Genemorph，Stratagene)扩增载体pYD-CHI中插入的CH1-CH3。使用pYD-上游和pYD-下游引物(Invitrogen)进行五个反应。用XHOI/BamHI消化产生的扩增的片段并连接到pYD1中。然后将连接反应物转化到XL10超感受态细胞(Stratagene)中，这产生～1×106个转化体，80％的转化体含有插入物。
[00480]来自库的28个随机质粒的序列分析表明～2-3个突变/kb的突变频率，40％保守核苷酸变化和60％引起氨基酸变化的突变的破坏。
[00481]将库转化到酵母菌株EBY100，MATα ura3-52trp l leu2Δ1his3Δ200pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can l GAL GAL-A GA 1::URA3中达到高效率，～3.3×105个转化体/ug，在20个独立的转化反应中，产生总共～107个酵母转化体(Gietz，et al.，1992，Nucleic Acids Res.20：1425)。集中库，通过在葡萄糖中生长来扩增。
6.6Fc突变体的选择和分析
材料和方法
筛选Fc突变体的ELISA分析
[00482]ELISA平板(Nunc F96MaxiSorp Immunoplate)在4℃在碳酸盐缓冲液中用50ml/孔的0.5mg/ml BSA-FITC包被，容许孵育过夜。平板用1X PBS/0.1％Tween 20(PBST)洗涤3次。添加200ml/孔的PBST/0.5％BSA，在室温下将平板孵育30分钟。用PBST另外洗涤平板三次。野生型或含有Fc突变体的50ml/孔1∶4稀释的4-4-20抗体(大约3mg/mL，其将产生0.7-0.8mg/孔的终浓度)在PBST/0.5％BSA中从条件培养基添加，在室温下孵育2小时。用PBST洗涤平板三次。添3mg/ml(PBST/0.5％BSA中)的纯化的生物素化的单体FcγRIIIA(50μl/孔)到平板中，容许在室温下孵育1.5小时。用PBST洗涤平板三次。添PBST/0.5％BSA中50ml/孔1∶5000稀释度的链霉抗生物素蛋白-HRP(Pharmacia，RPN 123v)，在室温下孵育平板30分钟。用PBST洗涤平板三次。然后将80ml/孔TMB试剂(BioFX)添加到平板上，容许在室温下在暗处孵育10-15分钟。通过添加40ml/孔停止溶液(0.18M硫磺酸)最终停止反应。然后监视平板酯450nm处的吸光度。在第一次筛选之后，在基于免疫复合物的结合ELISA中通过4-4-20-Fc突变体的连续滴定来进一步确认感兴趣的候选物。在这种ELISA中进行了几种修改。为了包被平板，使用2mg/mlBSA-FITC。根据IgG定量结果，来自条件培养基的稀释的4-4-20Fc(野生型或突变体)在PBST-/0.5％BSA中添加到1、0.5、0.25、0.125、0.063和0mg/ml的终浓度。
细胞表面展示的Fc蛋白的FACS筛选
[00483]在具有葡萄糖的至少10mls的HSM-Trp-Ura pH 5.5中生长细胞16-24小时，或直到OD600大于2.0。在～2000rpm旋转沉淀细胞5分钟。将细胞重悬浮在具有半乳糖的等体积的HSM-Trp-Ura pH7.0中。在125ml烧瓶中，添36mls半乳糖培养基，用9mls的培养基接种，在20℃摇动孵育20-48小时。通过8-16小时间隔测量OD600来监视生长。2K rpm 5分钟收获细胞，重悬浮在等体积的1XPBS，pH 7.4中。
[00484]平衡筛选：在维持过量的配体时孵育合适数量的细胞。例如，优选的是以确保库的10倍覆盖度所需的细胞数量开始。对于含有107个转化体的库的第一次分选，使用108个细胞。实际上，最好是以109个细胞开始，来补偿染色方案中的损失。
[00485]一般在1.5mL试管中以20-100mls体积在旋转器上在暗处在4℃进行孵育1小时(孵育缓冲液：1XPBS pH7.4；1mg/ml BSA)。在500ml孵育缓冲液中洗涤细胞一次，在4K rpm旋转沉淀细胞2.5分钟。将细胞重悬浮在100ml孵育缓冲液中，并与第二染色试剂孵育。对于Fc-CH1，F(ab)2山羊抗hFc F(ab)-FITC抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories，Inc.)可用于CH1表达的染色。用1mL进行30分钟染色。在500mL孵育缓冲液中另外洗涤细胞，在4K rpm旋转沉淀细胞2.5分钟，重悬浮在1mL IX PBS 1mg/mL BSA中，并通过FACS进行分析。
[00486]典型的平衡筛选分选门和收集的细胞的数目在表13中示出。
表13.分选门和分选的细胞的数目
| 分选 | 门 | 筛选的总细胞 | 收集的细胞 |
| 1st | 5％ | 108 | 5×106 |
| 2nd | 1％ | 107 | 1×105 |
| 3rd | 0.2％ | 107 | 2×104 |
| 4th | 0.2％ | 107 | 2×104 |
[00487]在第3和第4次分选之后，将细胞直接涂覆到-trp-ura平板上来鉴定单独的突变。这一般回收每个平板～200-400个菌落。在收集之后，将细胞置于50mL锥形管中10mLs葡萄糖培养基中，在30℃生长。重复全部过程。
结果
Fc突变体的FACS分析
[00488]在半乳糖培养基中诱导之后，收获细胞，用PE标记的可溶FcγRIIIA四聚复合物和FITC标记的小鼠抗人Fc(JacksonImmunoresearch Laboratories，Inc.)共染色。通过FACS分析细胞，使用分选门来选择显示了相对于细胞表面Fc表达的数量对可溶FcγRIIIA四聚复合物的最高亲合性的细胞(附图9)。例如，含有更好地结合可溶FcγRIIIA四聚复合物的突变Fc的细胞可能在酵母细胞表面表达较少的Fc融合蛋白，这种细胞将处在分选门的较低的左手边角。
[00489]进行四次连续分选来富集显示了对可溶FcγRIIIA四聚复合物最高亲合性的那些突变体。每次连续分选的门是5.5％、1％、0.2％和0.1％。在最后一次分选之后，将细胞涂覆在选择培养基上，分离单独的菌落。每个单独的菌落代表携带Aga2-Fc融合蛋白内的单个Fc突变体的细胞的克隆群体。首先挑选32个独立的群体，通过FACS测试与可溶FcγRIIIA四聚复合物的结合(附图10)。如被可溶FcγRIIIA四聚复合物结合的细胞百分比和结合的细胞的平均荧光强度所测量的，十八个突变体显示了结合强度的增加。
[00490]还测试了显示与FcγRIIIA的结合提高的突变与可溶FcγRIIB四聚复合物的结合(附图10)。引起与可溶FcγRIIIA四聚复合物的结合提高的大多数突变也产生了FcγRIIB四聚复合物染色的检测(附图10)。根据早先的物理的和遗传学的数据，提高与FcγRIIIA的结合的某些突变，预期也提高与FcγRIIB的结合(Shields et al.，2001，JBiol.Chem.276：6591-6604；Sondermann et al.，2000，Nature 406：267-273)。
分析人类细胞系中产生的4-4-20MAb中的突变体
[00491]在酵母系统中分离和分析突变容许快速鉴定新的突变等位基因。使用异源系统来分离突变可以产生突变的鉴定，所述突变通过引起错误折叠的改变或特异于酵母的糖基化的改变增强的结合。为了分析在人类细胞中产生的免疫球蛋白分子中的Fc突变，将突变体亚克隆到哺乳动物表达载体中，所述表达载体含有抗荧光素单克隆抗体4-4-20的重链(Kranz et al.，1982 J.Biol.Chem，257(12)：6987-6995)。突变的4-4-20重链与轻链克隆在人类肾脏细胞系(293H)中短暂地共表达。收集上清液并通过ELISA分析(附图11)。
[00492]根据ELISA分析，当出现在人类细胞系中产生的4-4-20单克隆抗体的Fc区中时，大多数突变体被鉴定为具有对可溶单体FcγRIIIA复合物的增强的亲合性，在随后的FACS分析中，也显示了与可溶FcγRIIIA四聚复合物的结合的提高(附图11A)。然而，两个突变体，编号16和编号19显示了与可溶FcγRIIIA单体复合物的结合的降低。
[00493]表14概括了已经鉴定的突变和它们与FcγRIIIA和FcγRIIB的相应的结合特征，如基于酵母展示的分析和ELISA所测定的。在表14中，符号代表如下：与包含野生型Fc区的可比较分子相比，·相应于亲合性中的1倍提高；+相应于亲合性中的50％提高；-相应于亲合性中的1倍降低；→相应于亲合性的无变化。
表14：鉴定的突变和结合特征
| 克隆# | 突变位点 | 结构域 | IIIA结合 | IIB结合 |
| 4 | A339V，Q347H | CH2，CH3 | + | + |
| 5 | L251P，S415I | CH2，CH3 | + | + |
| 7 | Aga2p-T43I | 注意：这是增强展示的Aga2P中的突变。 | Aga2p-T43I | |
| 8 | V185M，K218N，R292L，D399E | CH1，铰链，CH2，CH3 | 无变化 | - |
| 12 | K290E，L142P | CH1，CH2 | + | 未测试 |
| 16 | A141V，H268L，K288E，P291S | CH1，CH2 | - | 未测试 |
| 19 | L133M，P150Y，K205E，S383N，N384K | CH1，CH2，CH3 | - | 未测试 |
| 21 | P396L | CH3 | · | ·+ |
| 25 | P396H | CH3 | ··· | ·· |
| 6 | K392R | CH3 | 无变化 | 无变化 |
| 15 | R301C，M252L，S192T | CH1，CH2 | - | 未测试 |
| 17 | N315I | CH2 | 无变化 | 未测试 |
| 18 | S132I | CH1 | 无变化 | 未测试 |
| 26 | A162V | CH1 | 无变化 | 未测试 |
| 27 | V348M，K334N，F275I，Y202M，K147T | CH1，Ch2 | + | + |
| 29 | H310Y，T289A，G337E | CH2 | - | 未测试 |
| 克隆# | 突变位点 | 结构域 | IIIA结合 | IIB结合 |
| 30 | S119F，G371S，Y407N，E258D | CH1，CH2，CH3 | + | 无变化 |
| 31 | K409R，S166N | CH1，CH3 | 无变化 | 未测试 |
| 20 | S408I，V215I，V125I | CH1，铰链，CH3 | + | 无变化 |
| 24 | G385E，P247H | CH2，CH3 | ··· | + |
| 16 | V379M | CH3 | ·· | 无变化 |
| 17 | S219Y | 铰链 | · | - |
| 18 | V282M | CH2 | · | - |
| 31 | F275I，K334N，V348M | CH2 | + | 无变化 |
| 35 | D401V | CH3 | + | 无变化 |
| 37 | V280L，P395S | CH2 | + | - |
| 40 | K222N | 铰链 | · | 无变化 |
| 41 | K246T，Y319F | CH2 | · | 无变化 |
| 42 | F243I，V379L | CH2，CH3 | ·+ | - |
| 43 | K334E | CH2 | ·+ | - |
| 44 | K246T，P396H | CH2，CH3 | · | ··+ |
| 45 | H268D，E318D | CH2 | ·+ | ····· |
| 49 | K288N，A330S，P396L | CH2，CH3 | ····· | ··· |
| 50 | F243L，R255L，E318K | CH2 | · | - |
| 53 | K334E，T359N，T366S | CH2，CH3 | · | 无变化 |
| 54 | I377F | CH3 | ·+ | + |
| 57 | K334I | CH2 | · | 无变化 |
| 58 | P244H，L358M，V379M，N384K，V397M | CH2，CH3 | ·+ | ·+ |
| 59 | K334E，T359N，T366S(独立分离) | CH2，CH3 | ·+ | 无变化 |
| 61 | I377F(独立分离) | CH3 | ··· | ··+ |
| 62 | P247L | CH2 | ·· | ··+ |
| 64 | P217S，A378V，S408R | 铰链，CH3 | ·· | ····+ |
| 克隆# | 突变位点 | 结构域 | IIIA结合 | IIB结合 |
| 65 | P247L，I253N，K334N | CH2 | ··· | ··+ |
| 66 | K288M，K334E | CH2 | ··· | - |
| 67 | K334E，E380D | CH2，CH3 | ·+ | - |
| 68 | P247L(独立分离) | CH2 | + | ···· |
| 69 | T256S，V305I，K334E，N390S | CH2，CH3 | ·+ | 无变化 |
| 70 | K326E | CH2 | ·+ | ··+ |
| 71 | F372Y | CH3 | + | ·····+ |
| 72 | K326E(独立分离) | CH2 | + | ·· |
| 74 | K334E，T359N，T366S(独立分离) | CH2，CH3 | ·· | 无变化 |
| 75 | K334E(独立分离) | CH2 | ··+ | 无变化 |
| 76 | P396L(独立分离) | CH3 | ·+ | 无变化 |
| 78 | K326E(独立分离) | CH2 | · | ···+ |
| 79 | K246I，K334N | CH2 | · | ···· |
| 80 | K334E(独立分离) | CH2 | · | 无变化 |
| 81 | T335N，K370E，A378，T394M，S424L | CH2，CH3 | · | 无变化 |
| 82 | K320E，K326E | CH2 | · | · |
| 84 | H224L | 铰链 | · | ····· |
| 87 | S375C，P396L | CH3 | ·+ | ····+ |
| 89 | E233D，K334E | CH2 | ·+ | 无变化 |
| 91 | K334E(独立分离) | CH2 | · | 无变化 |
| 92 | K334E(独立分离) | CH2 | · | 无变化 |
| 94 | K334E，T359N，T366S，Q386R | CH2 | · | 无变化 |
[00494]可溶FcγRIIB四聚复合物结合的分析显示，显示了与可溶FcγRIIIA四聚复合物的结合提高的8个突变体中的7个也具有与可溶FcγRIIB四聚复合物的提高的结合(附图11B)。一个突变体，编号8，显示了可溶FcγRIIB四聚复合物结合的下降。突变体中的三个在与可溶FcγRIIIA四聚复合物或可溶FcγRIIB四聚复合物的结合中没有显示差异，可能是由于引起酵母特异性改变的突变。
6.7Fc突变体的ADCC分析
[00495]效应细胞制备：通过Ficoll-Paque(Pharmacia，17-1440-02)Ficoll-Paque密度梯度离心从正常的外周人类血液纯化外周血单核细胞(PBMC)(Biowhittaker/Poietics，1W-406)。血液在环境温度在同一天装运，在PBS和葡萄糖(1g/1L)中1∶1稀释，在15mL锥形管(3mL Ficoll；4mL PBS/血液)或50mL锥形管(15mL：Ficoll；20mL PBS/血液)中在Ficoll上分层。在室温下在1500rpm(400rcf)进行离心40分钟。除去PBMC层(从50mL锥形管中大约4-6mL)并在50mL锥形管中在PBS(其不含Ca2+或Mg2+)1∶10稀释，在室温下在1200rpm(250rcf)另外旋转十分钟。除去上清液，将团粒重悬浮在10-12mL PBS(其不含Ca2+或Mg2+)中，转移到15mL锥形管，在室温下在1200rpm再旋转10分钟。除去上清液，将团粒重悬浮再最小体积(1-2mL)的培养基(Isocove’s培养基(IMDM)+10％胎儿牛血清(FBS)，4mM Gln，青霉素/链霉素(P/S))中。将重悬浮的PBMC稀释到合适的体积用于ADCC分析；在ELISA96孔板(Nunc F96MaxiSorp Immunoplate)中进行两倍的稀释。PBMC的产量是每40-50mL全血大约3-5×107个细胞。
[00496]目标细胞制备：在分析中使用的目标细胞是SK-BR-3(ATCC登记号HTB-30；Trempe et al.，1976，Cancer Res.33-41)，Raji(ATCC登记号CCL-86；Epstein et al.，1965，J.Natl.Cancer Inst.34：231-40)或Daudi细胞(ATCC登记号CCL-213；Klein et al.，1968，Cancer Res.28：1300-10)(重悬浮在0.5mL IMDM培养基中)，它们用铕螯合双(乙酰氧基甲基)2，2”：6’，2”terpyridine 6，6’dicarboxylate(BATDA试剂；Perkin Elmer DELFIA试剂；C136-100)标记。使用K562细胞(ATCC登记号CCL-243)作为NK活性的对照细胞。旋转沉淀Daudi和Raji细胞；在37℃，5％CO2将SK-BR-3细胞胰蛋白酶化2-5分钟，在200-350G旋转沉淀之前中和培养基。用于分析的目标细胞的数量约4-5×106个细胞，它不超过5×106个，因为少至2×106个细胞时标记效力是最好的。一旦将细胞旋转沉淀，将培养基吸出至0.5mL，置于15mL Falcon试管中。添加2.5μl BATDA试剂，在37℃、5％CO2孵育混合物30分钟。在10mL PBS和0.125mM sulfinpyrazole(“SP”；SIGMA S-9509)中洗涤细胞两次，在10mL分析培养基(细胞培养基+0.125mM sulfinpyrazole)中洗涤两次。将细胞重悬浮在1mL分析培养基中，计数并稀释。
[00497]当在第一次PBS/SP洗涤后SK-BR-3细胞被用作目标细胞时，吸出PBS/SP，添加500μg/mL FITC(PIERCE 461110)到含有SP、Gln和P/S的IMDM培养基中，在37℃、5％CO2孵育30分钟。用分析培养基洗涤细胞两次；重悬浮在1mL分析培养基中，计数并稀释。
[00498]抗体调理作用：一旦如上述制备了目标细胞，用合适的抗体调理它们。对于Fc变体来说，将50μL的1×105个细胞/mL添加到2×浓度的携带Fc变体的抗体中。终浓度如下：Ch-4-4-20终浓度为0.5-1μg/mL；Ch4D5终浓度是30ng/mL-ng/mL。
[00499]对于具有Fc变体的4-4-20抗体来说，将调理的目标细胞添加到效应细胞以产生75∶1的效应：目标比例。对于具有Fc变体的Ch4D5抗体来说，达到50∶1或75∶1的效应：目标比例。用于分析的有效的PBMC梯度从100∶1到1∶1。在室温下在57G在Beckman离心机中以200rpm将细胞旋转沉淀1分钟。在37℃、5％CO2孵育细胞3-3.5小时。孵育之后，在10℃在Beckman离心机中以1000rpm(约220xg)旋转细胞五分钟。收集20μl上清液；添加200μL Eu溶液，在旋转摇动器上以120rpm在室温下摇动混合物15分钟。在时间分辨的荧光计(Victor 1420，Perkin Elmer)中测定荧光。
结果
[00500]如上所述，将变异Fc区亚克隆到哺乳动物表达载体中，所述表达载体含有抗荧光素单克隆抗体4-4-20(Kranz et al.，1982J.Biol.Chem，257(12)：6987-6995)的重链。变体4-4-20重链与轻链克隆在人类肾脏细胞系(293H)中短暂地共表达。收集上清液，使用ADCC分析进行分析。附图12显示了突变体的ADCC活性是浓度依赖性的。如表8中概括的，五种具有变异Fc区的免疫球蛋白具有相对于野生型ch 4-4-20的增强的ADCC活性。五种突变体如下：＝MGFc-27(G316D、A378V、D399E)；MGFc-31(P247L、N421K)；MGFc-10(K288N、A330S、P396L)；MGFc-28(N315I、V379M、T394M)；MGFc-29(F243I、V379L、G420V)。
[00501]分析了具有变异Fc区的其他4-4-20免疫球蛋白的相对于具有野生型Fc区的4-4-20免疫球蛋白的ADCC活性。这些结果在表15中概括。
[00502]如早先对4-4-20抗体所描述的相同方案也进行ADCC分析，然而，变异Fc区被克隆到特异于人类表皮生长因子受体2(HER2/neu)的人源化抗体(Ab4D5)中。在这种情况下，SK-BR-3细胞被用作目标细胞，其用携带变异Fc区的HER2/neu抗体调理。HER2/neu是由SK-BR-3细胞内源表达的，因而呈现在这些细胞表面。附图13显示了携带变异Fc区的HER2/neu抗体的ADCC活性。表16概括了在HER2/neu抗体的环境中突变体的ADCC活性。通过比较突变体和特定细胞裂解百分比值所需的野生型抗体的浓度，来进行标准化。
[00503]如附图13所示，相对于野生抗体，克隆到人源化抗HER2/neu抗体中的MGFc-5(V379M)，MGFc-9(P243I，V379L)，MGFc-10(K288N，A330S，P396L)，MGFc-13(K334E，T359N，T366S)，和MGFc-27(G316D，A378V，D399E)突变体展现了更高％的SK-BR-3细胞裂解。
6.8Fc突变体的动力参数的分析
[00504]使用BIAcore分析(BIAcore instrument 1000，BIAcore Inc.，Piscataway，N.J.)来分析携带Fc突变的ch4-4-20抗体与FcγRIIIA和FcγRIIB结合的动力参数。用于这个分析中是是可溶的单体蛋白，如以上6.2节所述FcγRIIIA的细胞外区连接到接头AVITAG序列。用于这个分析的FcγRIIB是根据在2003年1月13日提交的美国临时申请No.60/439,709中描述的方法制备的可溶二聚蛋白，通过完全引用将它合并在此。简要地，使用的FcγRIIB是融合到人类IgG2的铰链-CH2-CH3结构域的FcγRIIB的细胞外结构域。
[00505]通过胺联结化学作用(通过用NHS/EDC的混合物修饰羧甲基基团)将BSA-FITC(10mM醋酸盐缓冲液中36μg/mL，pH 5.0)传感器芯片表面的四组流动细胞之一(流动细胞2)上，从而约5000应答单位(RU)的BSA-FITC被固定在表面上。在这之后，用1MEt-NH2的注射“脱帽”未反应的活性酯。一旦制备了合适的表面，通过以5μL/mL的流速20μg/mL溶液的一分钟注射使携带Fc突变的ch 4-4-20抗体经过表面。结合到表面的ch4-4-20抗体的水平在400和700RU之间。然后，以100μL/min将HBS-P缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，.005％表面活性剂P20，3mM EDTA，pH 7.4)中受体(FcγRIIIA和FcγRIIB-Fc融合蛋白)的稀释系列注射到表面上。不同的受体稀释度之间的抗体再生优选的通过100mM NaHCO3 pH9.4；3M NaCl的单次5秒注射液来进行。
[00506]在分析的开始和结束将受体的相同稀释度注射到没有任何ch-4-4-20抗体的BSA-FITC表面作为查考注射。
[00507]一旦收集到完整的数据集，使用由厂家BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的计算机算法将产生的结合曲线全局性地拟合。这些算法计算Kon和Koff，从中作为两个速率常数的比例(即，Koff/Kon)推断出表观平衡结合常数Kd。如何产生单独的速率常数的更详细的处理可以在BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中找到。
[00508]比对两种不同浓度(对FcγRIIIA为200nM和800nM，对FcγRIIB融合蛋白为200nM和400nM)的结合曲线，反应调节到相同水平的捕获的抗体，从实验曲线中减去参考曲线。缔合合解离阶段单独地拟合。离解速率常数从解离阶段的32-34秒间隔获得；缔合阶段拟合通过1∶1Langmuir模型获得，在基础Rmax和chi2指标上选择基础拟合。
结果
[00509]附图14显示了在BSA-FITC固定化的传感器芯片上具有突变Fc区的ch 4-4-20抗体的捕获。约20μg/mL浓度的6μL抗体以5mL/min注射到BSA-FITC表面上。附图15是FcγRIIIA与携带变异Fc区的ch-4-4-20抗体的实时结合的sensogram。在200nM浓度分析FcγRIIIA的结合，在野生型ch-4-4-20抗体获得的反应水平处将共振信号反应标准化。通过拟合在两种不同FcγRIIIA浓度200和800nM获得的数据来获得\FcγRIIIA与ch-4-4-20抗体结合的动力参数(附图16)。实线表明了缔合似合，其是根据对32-34秒间隔的解离曲线计算的Koff值获得的。KD和Koff代表从所使用的两种不同FcγRIIIA浓度计算的平均数。附图17是FcγRIIB-Fc融合蛋白与携带变异Fc区的ch-4-4-20抗体的实时结合的sensogram。在200nM浓度分析FcγRIIB-Fc融合蛋白的结合，在野生型ch-4-4-20抗体获得的反应水平处将共振信号反应标准化。通过拟合在两种不同FcγRIIB-Fc融合蛋白浓度200和800nM获得的数据来获得FcγRIIB-Fc融合蛋白与ch-4-4-20抗体结合的动力参数(附图18)。实线表明了缔合拟合，其是根据对32-34秒间隔的解离曲线计算的Koff值获得的。KD和Koff代表从所使用的两种不同FcγRIIB-Fc融合蛋白浓度计算的平均数。
[00510]从BIAcore分析测定的动力参数(Kon和Koff)与通过ELISA分析测定的突变体的特征以及在ADCC分析中测定的突变体的功能活性相关。具体地，如表17中所见，具有相对于野生型蛋白增强的ADCC活性、以及如ELISA分析测定的具有增强的对FcγRIIIA的结合的突变体，具有对FcγRIIIA的改善的Koff(即，更低的Koff)。因此，相对于野生型蛋白突变Fc蛋白对FcγRIIIA的更低的Koff值可能具有增强的ADCC功能。另一方面，如表18中所见，具有相对于野生型蛋白增强的ADCC活性、以及如ELISA分析测定的具有对FcγRIIB-Fc融合蛋白降低的结合的突变体，具有对FcγRIIB-Fc融合蛋白更高的Koff。
[00511]因而，对于FcγRIIIA和FcγRIIB的Koff值可用作突变体将在功能分析例如ADCC分析中如何表现的预示性度量。实际上，相对于ADCC数据标绘了突变体与野生型蛋白对于FcγRIIIA和FcγRIIB-Fc融合蛋白的Koff值的比值(附图19)。具体地，就对于FcγRIIIA的Koff值来说，相对与ADCC数据标绘了Koff(wt)/Koff(mutant)的比值；就对于FcγRIIB的Koff值来说，相对于ADCC数据标绘了Koff(mut)/Koff(wt)的比值。高于一(1)的数字显示了相对于野生型对于FcγRIIIA降低的离解速率合对于FcγRIIB-Fc提高的离解速率。落入标明的框中的突变体具有对于FcγRIIIA结合的更低的解离速率，以及对于FcγRIIB-Fc结合的更高的解离速率，并具有增强的ADCC功能。
表17.通过200nM和800nM的结合曲线的“独立拟合”获得的FcRIIIa与ch4-4-20Ab结合的动力参数
| Ch4-4-20Ab | BIAcoreKd，nM | Kon1/Ms | Koff，1/s | ELISA，OD | ADCC，％ |
| Wt(0225) | 319 | 6.0×105 | 0.170 | 0.5 | 17.5 |
| Mut11(0225) | 90 | 8.22×105 | 0.075 | 0.37 | 32 |
| Mut5(0225) | 214 | 8.2×105 | 0.172 | 0.75 | 26 |
| Mut6(0225) | 264 | 6.67×105 | 0.175 | 0.6 | 23 |
| Mut8(0225) | 234 | 8.3×105 | 0.196 | 0.5 | 22 |
| Mut10(0225) | 128 | 9.04×105 | 0.115 | 1.0 | 41 |
| Mut12(0225) | 111 | 1.04×106 | 0.115 | 1.0 | 37 |
| Mut15(0225) | 67.9 | 1.97×106 | 0.133 | 1.0 | 15 |
| Mut16(0225) | 84.8 | 1.60×106 | 0.133 | 1.0 | 15 |
| Mut18(0225) | 92 | 1.23×106 | 0.112 | 1.0 | 28 |
| Mut25(0225) | 48.6 | 2.05×106 | 0.1 | 1.0 | 41 |
| Mut14(0225) | 75.4 | 1.37×106 | 0.1 | 1.1 | 28 |
| Mut17(0225) | 70.5 | 1.42×106 | 0.1 | 1.25 | 30 |
| Mut19(0225) | 100 | 1.20×106 | 0.120 | 0.75 | 11 |
| Mut20(0225) | 71.5 | 1.75×106 | 0.126 | 0.5 | 10 |
| Mut23(0225) | 70.2 | 1.43×106 | 0.105 | 1.25 | 25 |
突出的突变体不适合根据ELISA或ADCC数据的组。
表18.通过200nM和800nM结合曲线的“独立拟合”获得的FcRIIB-Fc与野生型合突变ch4-4-20Ab结合的动力参数。
| Ch4-4-20Ab | BIAcore Kd，nM | Kon1/Ms | Koff，1/s | ELISA，OD | ADCC，％ |
| Wt(0225) | 61.4 | 0.085 | 0.4 | 17.5 | |
| Mut11(0225) | 82.3 | 0.1 | 0.08 | 32 | |
| Mut5(0225) | 50 | 0.057 | 0.6 | 26 | |
| Mut6(0225) | 66.5 | 0.060 | 0.35 | 23 | |
| Mut8(0225) | 44.2 | 0.068 | 0.25 | 22 | |
| Mut10(0225) | 41.3 | 0.05 | 1.2 | 41 | |
| Mut12(0225) | 40.1 | 0.051 | 0.4 | 37 | |
| Mut15(0225) | 37.8 | 0.040 | 1.55 | 15 | |
| Mut16(0225) | 40 | 0.043 | 1.55 | 15 | |
| Mut18(0225) | 51.7 | 0.043 | 1.25 | 28 | |
| Mut25(0225) | 0.112 | 0.08 | 41 | ||
| Mut14(0225) | 95.6 | 0.089 | 0.13 | 28 | |
| Mut17(0225) | 55.3 | 0.056 | 0.38 | 30 | |
| Mut19(0225) | 45.3 | 0.046 | 1.0 | 11 | |
| Mut20(0225) | 24.1 | 0.028 | 0.8 | 10 | |
| Mut23(0225) | 108 | 0.107 | 0.1 | 25 | |
6.9使用固相分析使用多轮富集筛选Fc突变体
[00512]以下的突变体筛选目的在于鉴定显示了提高的与FcγRIIIA的结合和降低的与FcγRIIB的结合的其他组突变体。通过ELISA继之以在4-4-20系统中测试ADCC来进行选定的Fc变体的二次筛选。然后使用荧光素包衣的SK-BR3细胞作为目标和从人类供体分离的PBMC作为效应细胞群体，主要根据它们经由4-4-20介导ADCC的能力来选择突变体。显示了ADCC中相关的提高，例如因子为2的增强的Fc突变，然后被克隆到抗-HER2/neu或抗-CD20chAbs中，使用合适的肿瘤细胞作为目标在ADCC分析中测试。还通过BIAcore分析突变体，测定它们相关的Koff。
[00513]筛选1：使用包被FcγRIIB的磁性珠子的连续的固相耗尽和选择，继之以用包被FcγRIIIA的磁性珠子选择这个筛选的目的是鉴定不再结合FcγRIIB或显示了降低的与FcγRIIB的结合的Fc突变体。用包被FcγRIIB的磁性珠子(“My One”，Dynal)孵育10倍过量的天然库(～107个细胞)。通过将含有混合物的试管置于磁场中从未结合的部分中分离与珠子结合的酵母。除去未与珠子结合的那些酵母细胞并置于新鲜培养基中。然后将它们与包被FcγRIIIA的珠子结合。通过将含有混合物的试管置于磁场中从未结合的部分中分离与珠子结合的酵母。除去未结合的酵母，通过强力的旋涡除去结合的细胞回收的细胞重新再含有葡萄糖的培养基中生长，在含有半乳糖的选择培养基中重新诱导。重复选择过程。最终的培养物然后用于俘获DNA。通过PCR扩增含有Fc结构域的插入物并克隆到4-4-20中。通过4-4-20ELISA和ADCC分析筛选大约90个Fc突变体，产生的阳性突变体在表19中示出。
表19：通过使用包被FcγRIIB的磁性珠子的连续的固相耗尽和选择，继之以用包被FcγRIIIA的磁性珠子选择来选择的突变体
[00514]筛选2&3：通过FACS、平衡和动力学筛选选择的筛选：第一次库筛选鉴定了在位置396、氨基酸从脯氨酸变化到亮氨酸(P396L)的突变。这个Fc变体显示了与FcγRIIIA和FcγRIIB都提高的结合。使用P396L作为基础系构建了第二个库。使用PCR诱变来产生～107个突变体，它们每一个都含有P396L突变并含有其他的核苷酸变化。使用两组条件筛选P396L库。
[00515]使用生物素化的FcγRIIIA-接头-avitag作为单体、使用已经描述的方法进行平衡筛选。在0.5mL大约7nM FcγRIIIA中孵育大约10倍过量的库(108个细胞)1小时。通过FACS分选混合物，选择binders的上1.2％。选择的酵母细胞在含有葡萄糖的选择培养基中生长，在含有半乳糖的选择培养基中诱导。平衡筛选重复第二次，设置分选门来收集binders的上0.2％。然后将选择的酵母细胞在葡萄糖中在选择条件下生长。这个培养物然后用于俘获DNA。通过PCR扩增含有Fc结构域的插入物，使用已经描述的方法克隆到编码4-4-20可变区的核苷酸序列中。通过4-4-20ELISA和ADCC分析筛选大约90个Fc突变体，产生的阳性突变体在表20中示出。
表20：使用平衡筛选用大约7nM的FcRIIIA浓度选择的突变体
[00516]还进行了动力学的筛选来鉴定在结合FcγRIIIA中具有改善的Koff的突变体。确定条件用于使用具有展示在酵母表面的P396L Fc变体的菌株筛选P396L库。简要地，用0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接头-avitag单体孵育在诱导条件下生长的细胞1小时。洗涤细胞来除去标记的配体。然后用0.1μM未标记的FcγRIIIA-接头-avitag单体孵育标记的细胞不同的时间，洗涤，然后用SA:PE染色用于FACS分析(附图20)。还用山羊抗人Fc来染色细胞来显示在实验期间维持了Fc展示。
[00517]根据竞争研究，确定了1分钟的孵育引起了约50％的细胞染色损失。选择这个时点用于使用P396L库的动力学筛选。在0.5mL体积中与0.1μM生物素化的FcγRIIIA-接头-avitag单体孵育大约10倍过量的库(108个细胞)。洗涤细胞，然后与未标记配体孵育1分钟。随后，洗涤细胞并用SA:PE标记。通过FACS分选混合物，选择binders的上0.3％。选择的酵母细胞在含有葡萄糖的选择培养基中生长，在含有半乳糖的选择培养基中诱导。动力学筛选重复第二次，设置分选门来收集binders的上0.2％。将未选择的P396L库与通过FACS选择了改善的结合的酵母细胞比较(附图21)。直方图显示了用FcγRIIIA/PE和山羊抗人类Fc/FITC共染色的细胞的百分比(右上方)。
[00518]然后将来自第二次分选的选择的酵母细胞在葡萄糖中在选择条件下生长。这个培养物然后用于俘获DNA。通过PCR扩增含有Fc结构域的插入物，使用如上所述的方法克隆到编码4-4-20可变区的核苷酸序列中。通过4-4-21ELISA和ADCC分析筛选大约90个Fc突变体，产生的阳性突变体在表21中示出。
表21：通过FACS使用等摩尔量未标记的CD16A动力学筛选1分钟选择的突变体
筛选4和5：使用FcγRIIIA 158V等位基因，组合固相FcγRIIB耗尽步骤和通过FACS分选的FcγRIIIA选择
[00519]分析来自筛选1的Fc变体显示了从第二次筛选选择的突变具有对FcγRIIIA和FcγRIIB都改善的结合。因此，数据表明在建立的条件下使用磁性珠子(固相)连续耗尽和选择未能有效地选择FcγRIIIA和FcγRIIB的差异结合。因此，为了更有效地筛选结合FcγRIIIA、而具有降低的FcγRIIB结合或不与FcγRIIB结合的突变体，将固相FcγRIIB耗尽步骤与通过FACS分选的FcγRIIIA选择组合。这种组合鉴定了以大于或等于野生型Fc的亲合性结合FcγRIIIA的Fc变体。
[00520]用包被FcγRIIB的磁性珠子孵育10倍过量的天然库(～107个细胞)。通过将含有混合物的试管置于磁场中从未结合的部分中分离与珠子结合的酵母。除去未与珠子结合的那些酵母细胞并置于新鲜培养基中，随后在含有半乳糖的培养基中重新诱导。通过磁性珠子的FcγRIIB耗尽重复5次。分析产生的酵母群体，发现显示了超过50％的山羊人抗人Fc染色的细胞，和非常小百分比的细胞被FcγRIIIA染色。然后使用0.1μM生物素化的FcγRIIIA接头-avitag通过FACS分选来选择这些细胞两次(数据未显示)。FcγRIIIA是158V同种型。在每次分选之后分析酵母细胞对FcγRIIIA和FcγRIIB的结合，并与野生型Fc结构域的结合相比较(附图22A-B)。
[00521]然后将来自第二次分选的选择的酵母细胞在葡萄糖中在选择条件下生长。这个培养物然后用于捕捞DNA。通过PCR扩增含有Fc结构域的插入物，克隆到编码4-4-20可变区的核苷酸序列中。通过4-4-22ELISA和ADCC分析来筛选大约90个Fc突变体，产生的阳性突变体在表22中示出(突变体61-66)。
表22：通过使用包被CD32B的珠子的磁性珠子耗尽和最终通过FACS使用FcγRIIIA 158缬氨酸或158苯丙氨酸的选择来选择的突变体
[00522]使用FcγRIIIA的158F等位基因筛选Fc突变体：存在着具有不同的IgG1Fc结构域结合亲合性的FcγRIIIA受体的两种不同的等位基因(Koene et al.，1997，Blood 90：1109-1114；Wu et al.，1997，J.Clin.Invest.100：1059-70)。158F等位基因以158V等位基因低1/5-10的结合常数结合Fc结构域。早先所有使用酵母显示的Fc筛选都是使用高结合158V等位基因作为配体进行的。在这个实验中，使用生物素化的的FcγRIIIA158F-接头-avitag单体作为配体从FcγRIIB耗尽的酵母群体中选择Fc突变体。分选门被设置为选择FcγRIIIA 158Fbinders的上百分之0.25。通过FACS分析产生的富集的群体(附图22B)。然后分离单独的克隆，通过FACS来分析它们与不同FcγR的结合(附图22B)。分析来自群体的单独克隆引起了鉴定处携带5个突变的单个突变体MgFc67(V284M、S298N、K334E、R355W、R416S)，其具有对FcγRIIIA增强的结合和对FcγRIIB降低的结合。
通过对筛选1、2和3的ADCC分析来第二次筛选突变体
[00523]然后使用标准的ADCC分析来分析上述筛选中选出的突变体，以确定由携带Fc突变体的ch4-4-20介导的裂解的相对速率。使用已经如上所述的方法构建携带Fc变体的ch4-4-20抗体。SK-BR3细胞被用作目标，效应细胞是如上描述的(6.7节)使用Ficoll梯度从供体分离的PBMC。突变体产生的ADCC活性在表23中概括。
[00524]如在表23中所见，使用上述基于FcγRIIB耗尽和FcγRIIIA选择的第一和第二次筛选分离的突变体显示了相对于野生型的增强的ADCC活性。
表23：在用荧光素包被的SKBR3细胞上由4-4-20抗荧光素抗体介导的ADCC的分析
[00525]使用0.5μg/mL ch4-4-20分析突变体37、38、39、41、43。所有其他抗体在1μg/mL测试。所有速率针对野生型ch4-4-20(IgG1)标准化。
[00526]通过替换单克隆抗体的Fc结构域，将突变体另外地克隆到抗肿瘤单克隆抗体4D5(抗HER2/neu)和抗CD20单克隆抗体2H7的重链中。使用标准方法通过短暂的转染入293H细胞和在蛋白G柱上纯化，来表达和纯化这些嵌合的单克隆抗体，并在ADCC分析中测试。使用SK-BR3细胞作为目标在ADCC分析中测试嵌合的4D5抗体(附图23)，而使用Daudi细胞作为目标在ADCC分析中测试嵌合的2H7抗体(附图24)。
[00527]经由BIAcore的突变体的第二次筛选：然后通过BIAcore来分析在以上的筛选中选择的突变体，以确定结合FcγRIIIA(158V)和FcγRIIB的动力参数。使用的方法与上文6.8节中公开的类似。
[00528]如从使用ch4-4-20单克隆抗体中的Fc突变体的实验测定的，显示的数据是相对于野生型解离速率的Koff值。相对数大于一表明Koff速率的降低。小于一的数字表明解离速率的提高。
[00529]显示了对FcγRIIIA的解离速率的降低的突变体是MgFc38(K392、P396L)、MgFc43(Y319F、P352L、P396L)、MgFc42(D221E、D270E、V308A、Q311H、P396L、G402D)、MgFc43b(K288R、T307A、K344E、P396L)、MgFc44(K334N、P396L)、MgFc46(P217S、P396L)、MgFc49(K261N、K210M、P396L)。显示了对FcγRIIB的解离速率的降低的突变体是MgFc38(K392、P396L)、MgFc39(E293V、Q295E、A327T)、MgFc43(K288R、T307A、K344E、P396L)、MgFc44(K334N、P396L)。Biacore数据在表24中概括。
表24：BIAcore数据。
6.10PBMC介导的ADCC分析
[00530]材料和方法
[00531]通过基于PBMC的ADCC使用60∶1的效应：目标比例测试了显示与FcγRIIIA的改善的结合的Fc变体。使用两种不同的肿瘤模型系统作为目标，SK-BR3(抗HER2/neu)和Daudi(抗CD20)。对每个突变体测定特异性裂解百分比。使用线性回归分析来标绘数据，设置最大裂解百分比为100％。
[00532]经由信号转导途径在免疫系统效应细胞上激活ADCC，所述信号转导途径是由低亲合性FcγR和免疫复合物之间的相互作用触发的。效应细胞群体来自原始血液或活化的单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)。用铕加载目标细胞，与MAb孵育，随后与效应细胞群体孵育。铕与51Cr起到同样的作用，但它是非放射性的，在荧光平板读取器中检测释放的铕。使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)从供体的外周血(PBM)收获的淋巴细胞主要含有天然杀伤细胞(NK)。大多数ADCC活性将经由在它们表面含有FcγRIIIA而不是FcγRIIB的NK发生。
[00533]使用分别表达HER2/neu和CD20的两种不同的目标细胞群体SK-BR-3和Daudi进行实验。使用Ch4-4-20/FITC包被的SK-BR-3、Ch4D5/SKBR3和Rituxan/Daudi来建立ADCC分析(数据未显示)。使用鉴定的Fc突变修饰嵌合的MAb。将Fc突变体克隆到Ch4D5中。使用纯化的Ab来调理SK-BR-3细胞或Dau di细胞。将Fc突变体克隆到Ch4D5中。
[00534]结果。Fc突变在SK BR3细胞中显示了改善的PBMC介导的ADCC活性(附图27)。图表显示了标准ADCC分析的线性回归分析。使用75∶1的效应物对目标比，在3logs上滴定抗体。裂解％＝(实验的释放-SR)/(MR-SR)＊100。
[00535]Fc突变在Daudi细胞中显示了改善的PBMC介导的ADCC活性(附图28)。
6.11基于单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)的ADCC分析
[00536]在小鼠肿瘤模型中FcγR依赖性肿瘤细胞杀伤是由巨噬细胞和NK细胞介导的(Clynes et al.，1998，PNAS USA，95：652-6)。来自供体的淘选的单核细胞被用作效应细胞来分析Fc突变体在ADCC分析中触发细胞的细胞毒性的效力。FcγRI、FcγR3A和FcγR2B的表达模式受不同生长条件的影响。使用FcR特异性MAb通过FACS检查冷冻的单核细胞的FcγR表达，所述单核细胞培养在含有不同组合的细胞因子和人类血清的培养基中。(附图29)。培养的细胞用FcγR特异性抗体染色并通过FACS来分析以确定MDM FcR分布型。最好地模拟巨噬细胞体内FcγR表达，即，显示了最大部分的表达CD16和CD32B的细胞的条件被用于基于单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)的ADCC分析。对于附图29中的实验，冷冻淘选的单核细胞在含有M-CSF(条件1)或GM-CSF(条件2)的DMEM和20％FBS中生长8天。对于附图30中的实验，在ADCC分析之前，冷冻淘选的单核细胞在含有GM-CSF、IL-2和IFNγ的DMEM和20％FBS中培养2天。也已经开发了容许高水平的CD16和CD32B表达的无血清条件(数据未显示)。简要地，纯化的单核细胞在含有GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-10 IL-1β的Macrophage-SFM(Invitrogen)中生长6-8天。虽然使用细胞因子的混合物在这些培养物中CD32B+/CD16+细胞的发生率是最高的，两种或多种细胞因子的组合也会提高FcγR表达(M-CSF/IL-6、M-CSF/IL-10；或M-CSF/IL-1β)。对于ADCC分析，添加IFNγ持续最后的24-48小时。
[00537]基于MDM的ADCC需要＞16小时的孵育时间来过程目标细胞杀伤。用铟-111加载目标细胞，其长孵育期地在目标细胞内保持。使用γ计数器测定铟释放。所有其他试剂、Abs和目标细胞都类似于基于PBMC的ADCC分析。由于FcγRI的ADCC活性可以使用抗FcRI阻断抗体(M21，Ancell)来有效地阻断。分析条件稍微不同于基于PBMC的分析。20∶1目标比效应；在37℃18-14小时孵育。
[00538]测试了显示改善的PBMC ADCC、提高的对FcγRIIIA的结合、或降低的对FcγRIIB的结合的Fc突变体(附图30)。
6.12Fc突变对补体活性的影响
[00539]最初根据它们对FcγRIIIA的提高的结合鉴定了Fc突变体。随后验证这些突变体对所有低亲合性受体的改善的亲合性，和在很多情况下在由PBMC介导的ADCC中的改善的活性。体内抗体介导的细胞毒性可以通过多种机制发生。除了ADCC之外，其他可能的机制包括补体依赖性细胞毒性(CDC)和细胞凋亡。C1q与免疫球蛋白的Fc区的结合启动级联，引起通过CDC的细胞裂解。已经在一系列Fc突变体中研究了C1q和Fc之间的相互作用。这些实验的结果表明，C1q和低亲合性FcR结合Fc的重叠区，然而Fc内确切的接触残基不同。
[00540]检查了在基于PBMC的分析中显示了改善的ADCC的突变体在CDC中的效果。在抗CD20Ch-mAb 2H7中分析了抗体。对于测试的每一个突变ch-mAb我们检测了改善的CDC。有趣地，即使这些突变体是为了它们改善的ADCC而选择的，它们也显示了增强的CDC。
[00541]材料和方法。CDC分析被用于测试Fc突变体，使用抗CD20和Daudi细胞作为目标。豚鼠血清用作补体的来源(US Biological)。CDC分析类似于基于PBMC的ADCC。用铕加载目标细胞并用ChMAb调理。然而，添加补体，豚鼠血清，替代效应细胞。附图31显示了分析的流程图。在3个数量级上滴定抗CD20ChMab。计算裂解％。Daudi细胞(3×106)用BADTA试剂标记。1×104个细胞等分到96孔板的孔中。使用3倍稀释度将抗体滴入孔中。容许调理反应在37℃在5％CO2中进行30-40分钟。添加豚鼠血清到20％的终浓度。容许反应在37℃在5％CO2中进行3.5小时。随后，添加100uls细胞培养基到反应中，使细胞旋转沉淀。为了检测，将20uls上清液添加到200uls的铕溶液中，在Victor2(Wallac)中读取平板。
[00542]结果：将显示了对活化性FcR或C1q的改善的结合的所有突变体置于CDC分析中(附图32)。显示了对FcγRIIIA的增强的结合的Fc突变体也显示了改善的补体活性。每个突变体显示了相比野生型增强的补体活性。测试的突变体是双突变体。在每种情况下，存在的突变之一是P396L。
[00543]为了确定CDC的提高是否与C1q和IgG1 Fc的提高的结合相关，使用表面胞质团共振实时地测量两种蛋白之间的结合。为了检查C1q和IgG1Fc之间的结合，将Fc变体克隆到抗CD32B ch-mAb 2B6中。这容许我们经由可溶的CD32B蛋白将wt和突变抗体捕获到玻璃载片上(附图34A)。在CDC中测试的四个突变体中三个也在Biacore中检查。所有3种都显示了相比野生型Fc的增强的Koff(附图34B)。C1q结合2B6突变体的Biacore形式证明了具有P396L突变的突变体的增强的结合(附图35)。突变D270E可以不同的程度地降低C1q结合。FcγR和C1q结合的动力学分析的概述在以下的表25中描绘。
表25结合突变体2B6的FcγR和C1q的动力学分析
6.13设计具有与FcγRIIB降低的结合的Fc变体
[00544]根据降低与FcγRIIB的结合并提高与FcγRIIA 131H的结合的Fc突变体的选择，鉴定了许多包括D270E的突变体。单独地测试了每个突变与低亲合性Fc受体的结合以及它们的等位变体。
[00545]D270E具有结合特征，所述结合特征暗示了它将特异性地降低FcγRIIB结合。与一些突变组合测试了D270E，所述突变是早先根据它们与所有FcR的改善的结合鉴定的。
[00546]结果。如表26和27以及附图36和37所示，增加D270E突变增强了FcγRIIIA和FcγRIIA H131结合并降低了与FcγRIIB的结合。附图38显示了相对于Koff的MDM ADCC数据的标绘图，Koff是对CD32A H131H结合选择突变体所测定的。
表26.增加D270E突变增强了FcγRIIIA和FcγRIIA H131结合并降低了FcγRIIB结合
| 4D5突变体 | 3aV158 | 3aF158 | 2bfcagl | 2aR131Fcagl | 2aH131Fcagl |
| Wt pure | 0.175 | 0.408 | 0.078 | 0.067 | 0.046 |
| MgFc55 | 0.148 | 0.381 | 0.036 | 0.033 | 0.029 |
| MgFc55/60 | 0.120 | 0.320 | 0.092 | 0.087 | 0.013 |
| MgFc55/60+R292G | 0.116 | 0.405 | 0.124 | 0.112 | 0.037 |
| MgFc55/60+Y300L | 0.106 | 0.304 | 0.092 | 0.087 | 0.015 |
| MgFc52 | 0.140 | 0.359 | 0.038 | 0.040 | 0.026 |
| MgFc52/60 | 0.122 | 0.315 | 0.094 | 0.087 | 0.013 |
| MgFc59 | 0.145 | 0.378 | 0.039 | 0.047 | 0.033 |
| MgFc59/60 | 0.117 | 0.273 | 0.088 | 0.082 | 0.012 |
| MgFc31 | 0.125 | 0.305 | 0.040 | 0.043 | 0.030 |
| MgFc31/60 | 0.085 | 0.215 | 0.139 | 0.132 | 0.020 |
| MgFc51 | 0.135 | 0.442 | 0.060 | 0.047 | 0.062 |
| MgFc51/60 | 0.098 | 0.264 | 0.118 | 0.106 | 0.023 |
| MgFc38 | 0.108 | 0.292 | 0.034 | 0.025 | 0.032 |
| MgFc38/60 | 0.089 | 0.232 | 0.101 | 0.093 | 0.021 |
表274D5突变体的动力学特征
[00547]在此描述和要求权利的发明不被限制在此处公开的特定实施方式的范围内，因为这些实施方式意欲作为本发明的几个方面的例示。任何等同的实施方式都将处在本发明的范围内。实际上，根据以上的说明，除了在此显示和描述的之外，本发明的各种修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。这种修改也将落在附随的权利要求的范围之中。
[00548]引用了整个申请中的各种出版物。为了所有目的，通过完全引用将它们的内容合并到本申请中。
序列表
<110>MacroGenics，Inc.
<120>具有变异Fc区的抗体的鉴定和工程化以及使用方法
<130>11183-020-228
<140>有待转让
<141>
<150>10/902,588
<151>2004-07-28
<150>10/754,922
<151>2004-01-09
<150>60/439,498
<151>2003-01-09
<150>60/456,041
<151>2003-03-19
<150>60/514,549
<151>2003-10-23
<160>10
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：5’接头.avitag
<400>1
ggccgcaggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt ctgaacgaca tcttcgaggc 60
tcagaaaatc gaatggcacg aatgat 86
<210>2
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：3’接头.avitag
<400>2
ctagatcatt cgtgccattc gattttctga gcctcgaaga tgtcgttcag accagaacca 60
ccaccaccag aaccaccacc acctgc 86
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：FcR3A左侧
<400>3
gttggatcct ccaactgctc tgctacttct agttt 35
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：FcR3A右侧
<400>4
gaaaagctta aagaatgatg agatggttga cact 34
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：FcR2B右侧
<400>5
gaagtcgacaatgatcccca ttggtgaaga g 31
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：FcR2B左侧
<400>6
gttagatctt gctgtgctat tcctggctcc 30
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：IgG1右侧
<400>7
atagtcgacc actgatttac ccggaga 27
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：IgG1左侧
<400>8
ggaattcaac accaaggtgg acaagaaagtt 31
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<220>
<223>引物：mcr025；chl(f’)
<400>9
aaaggatccg cgagctcagc ctccaccaag g 31
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物：H021
<400>10
gtctgctcga agcattaacc 20
Claims (104)
1.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以相对于包含野生型Fc区的多肽的改变的亲合性结合FcγR，条件是所述至少一个氨基酸修饰不单独地是位置255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439的任一处的替换，或不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360、326或430的任一处的丙氨酸；位置330的赖氨酸；位置339的苏氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的丝氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的组氨酸；位置334的缬氨酸；或位置334的亮氨酸；位置335的赖氨酸位置268的天冬酰胺；位置272的谷氨酰胺；位置286的谷氨酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；位置290的丝氨酸；位置320的甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；位置322的谷氨酸；位置326的丝氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；位置330的赖氨酸；位置335谷氨酰胺；或位置301的甲硫氨酸。
2.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，条件是所述至少一个氨基酸修饰不单独地是在位置329、331或332的替换，或不具有位置256、290、298、312、326、333、334、359、360或430的任一处的丙氨酸；位置330的赖氨酸；位置339的苏氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的丝氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334甲硫氨酸；位置334的组氨酸；位置334的缬氨酸；位置330的赖氨酸；位置335的赖氨酸；或位置334的亮氨酸。
3.权利要求2的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰包含选自以下构成的组的一组替换：在位置339用缬氨酸以及在位置347用组氨酸替换；在位置251用脯氨酸以及在位置415用异亮氨酸替换；在位置185用甲硫氨酸、和在位置218用天冬酰胺、和在位置292用亮氨酸、和在位置399用谷氨酸替换；在位置290用脯氨酸以及在位置142用脯氨酸替换；在位置141用缬氨酸、在位置268用亮氨酸、在位置288用谷氨酸以及在位置291用丝氨酸替换；在位置133用甲硫氨酸、在位置149用酪氨酸、在位置205用谷氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置384用赖氨酸替换；在位置125用亮氨酸、在位置215用异亮氨酸以及在位置408用异亮氨酸替换；在位置395用异亮氨酸替换；在位置247用组氨酸替换；在位置396用组氨酸替换；在位置392用精氨酸替换；在位置415用异亮氨酸以及在位置251用苯丙氨酸替换；在位置301用半胱氨酸、在位置252用亮氨酸以及在位置192用苏氨酸替换；在位置315用异亮氨酸替换；在位置132用异亮氨酸替换；在位置162用缬氨酸替换；在位置348用甲硫氨酸、在位置334用天冬酰胺、在位置275用异亮氨酸、在位置202用甲硫氨酸以及在位置147用苏氨酸替换；在位置310用酪氨酸、在位置289用丙氨酸以及位置337用谷氨酸替换；在位置119用苯丙氨酸、在位置371用丝氨酸、在位置407用缬氨酸以及在位置258用天冬氨酸替换；在位置409用精氨酸以及在位置166用天冬酰胺替换；在位置408用异亮氨酸、在位置215用异亮氨酸以及在位置125用异亮氨酸替换；在位置396用亮氨酸替换；在位置385用谷氨酸以及在位置247用组氨酸替换；在位置379用甲硫氨酸替换；在位置219用酪氨酸替换；在位置282用甲硫氨酸替换；在位置276用异亮氨酸、在位置334用天冬酰胺以及在位置348用甲硫氨酸替换；在位置401用缬氨酸替换；在位置280用亮氨酸以及在位置395用丝氨酸替换；在位置222用天冬酰胺替换；在位置246用苏氨酸以及在位置319用苯丙氨酸替换；在位置243用异亮氨酸以及在位置379用亮氨酸替换；在位置246用苏氨酸以及在位置396用组氨酸替换；在位置268用天冬氨酸以及在位置318用天冬氨酸替换；在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；在位置243用亮氨酸、在位置255用亮氨酸以及在位置318用赖氨酸替换；在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺以及在位置366用丝氨酸替换；在位置377用苯丙氨酸替换；在位置334用异亮氨酸替换；在位置244用组氨酸、在位置358用甲硫氨酸、在位置379用甲硫氨酸、在位置384用赖氨酸以及在位置378用甲硫氨酸替换；在位置247用用亮氨酸替换；在位置217用丝氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置408用精氨酸替换；在位置247用亮氨酸、在位置253用天冬酰胺以及在位置334用天冬酰胺替换；在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；在位置334用谷氨酸以及在位置380用天冬氨酸替换；在位置256用丝氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置334用谷氨酸以及在位置390用丝氨酸替换；在位置372用酪氨酸替换；在位置246用异亮氨酸以及在位置334用天冬酰胺替换；在位置335用天冬酰胺、在位置370用谷氨酸、在位置378用谷氨酸、在位置394用甲硫氨酸以及在位置424用亮氨酸替换；在位置320用谷氨酸以及在位置326用谷氨酸替换；在位置224用亮氨酸替换；在位置375用半胱氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；在位置233用天冬氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；和在位置334用谷氨酸、在位置359用天冬酰胺、在位置366用丝氨酸以及在位置386用精氨酸替换。
4.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，并且所述多肽进一步以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIB更低的亲合性特异性结合FcγRIIB，条件是所述变异Fc区不具有在位置256、298、333或334的任一处的丙氨酸。
5.权利要求1或2的多肽，其中所述修饰包含在Fc区中的至少一个氨基酸替换。
6.权利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修饰包含在Fc区的CH2结构域中的至少一个氨基酸修饰。
7.权利要求6的多肽，其中所述氨基酸修饰包含Pro 247用另一个氨基酸在该位置的替换。
8.权利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修饰包含在Fc区的CH3结构域中的至少一个氨基酸修饰。
9.权利要求8的多肽，其中所述氨基酸修饰包含在位置396用另一个氨基酸在该位置的替换。
10.权利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修饰包含在Fc区的CH2结构域中的至少一个氨基酸修饰和在CH3结构域中的至少一个氨基酸修饰。
11.权利要求6的多肽，其中所述CH2结构域中的氨基酸修饰包含在位置251、292、268、288、291或247用另一个氨基酸在该位置替换。
12.权利要求8的多肽，其中所述CH3结构域中的氨基酸修饰包含在位置347、415、399、383、384、407、395或396用另一个氨基酸在该位置替换。
13.权利要求10的多肽，进一步包含在Fc区的绞链区中的至少一个氨基酸修饰。
14.权利要求1或2的多肽，其中所述氨基酸修饰包含在Fc区的绞链区中的至少一个氨基酸修饰。
15.权利要求1、2或4的任一项的多肽，其中亲本多肽的Fc区是人类IgG Fc区。
16.权利要求15的多肽，其中所述人类IgG Fc区是人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。
17.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽是抗体。
18.包含变异Fc区的抗体，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述抗体以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，和所述抗体进一步的以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIB更低的亲合性特异性结合FcγRIIB，条件是所述变异Fc区不具有在位置256、298、333或334的任一处的丙氨酸。
19.权利要求17的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体或人类抗体。
20.包含编码权利要求1或2的任一项的多肽的核苷酸序列的核酸。
21.包含权利要求20的核酸的载体。
22.权利要求21的载体，其是表达载体。
23.包含权利要求22的核酸的宿主细胞。
24.重组生产权利要求1或2的多肽的方法，所述方法包括：(i)在适合于所述多肽的表达的条件下，在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的宿主细胞；和(ii)从所述培养基回收所述多肽。
25.权利要求17或18的抗体，其中所述抗体以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIIA高至少一倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
26.特异性结合癌症抗原的治疗性抗体，所述治疗性抗体包含变异Fc区，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述治疗性抗体以比包含野生型Fc区的治疗性抗体结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，条件是所述至少一个氨基酸修饰不单独地是在位置329、331或332处的替换，或不具有在位置256、290、298、312、333、334、359、360或430的任一处的丙氨酸；位置330的赖氨酸；位置339的苏氨酸；位置320的甲硫氨酸；位置326的丝氨酸；位置326的天冬酰胺；位置326的天冬氨酸；位置326的谷氨酸；位置334的谷氨酰胺；位置334的谷氨酸；位置334的甲硫氨酸；位置334的组氨酸；位置334的缬氨酸；或位置334的亮氨酸。
27.特异性结合癌症抗原的治疗性抗体，所述治疗性抗体包含变异Fc区，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述治疗性抗体以比包含野生型Fc区的治疗性抗体结合FcγRIIIA更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，和所述治疗性抗体进一步的以比包含野生型Fc区的治疗性抗体结合FcγRIIB更低的亲合性特异性结合FcγRIIB，条件是所述变异Fc区不单独地具有在位置256、298、333或334任一处的丙氨酸。
28.权利要求26或27的治疗性抗体，其中所述治疗性抗体比包含野生型Fc区的治疗性抗体更有效1倍地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
29.权利要求26或27的治疗性抗体，其中所述治疗性抗体是、、IC14、PANOREXTM、IMC-225、VITAXINTM、Campath 1H/LDP-03、LYMPHOCIDETM或ZEVLINTM。
30.权利要求26或27的治疗性抗体，其中所述癌症抗原是MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰基葡糖胺基转移酶、p15、β-连结蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人类乳头状瘤病毒-E6、人类乳头状瘤病毒-E7或MUC-1。
31.在患有以癌症抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求26或27的治疗性抗体。
32.权利要求31的方法，其中所述癌症抗原是MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰基葡糖胺基转移酶、p15、β-连结蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人类乳头状瘤病毒-E6、人类乳头状瘤病毒-E7或MUC-1。
33.权利要求31的方法，其中所述癌症抗原是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫颈癌或胰腺癌抗原。
34.权利要求31的方法，进一步包括施用一种或多种其他癌症治疗。
35.权利要求34的方法，其中所述其他癌症治疗选自由化学治疗、免疫治疗、放射治疗、激素治疗或手术构成的组。
36.权利要求31的方法，其中所述患者是人类。
37.药物组合物，包含治疗有效量的一种或多种权利要求1或2的多肽，和药学上可接受的载体。
38.药物组合物，包含治疗有效量的一种或多种权利要求17或18的抗体，和药学上可接受的载体。
39.药物组合物，包含治疗有效量的一种或多种权利要求26或27的治疗性抗体，和药学上可接受的载体。
40.权利要求26或27的药物组合物，进一步包含一种或多种其他抗癌试剂。
41.权利要求40的药物组合物，其中所述抗癌试剂是化学治疗试剂、放射治疗试剂、激素治疗试剂或免疫治疗试剂。
42.包含编码权利要求17或18的任一项的抗体的重链的核苷酸序列的核酸。
43.包含权利要求42的核酸的载体。
44.权利要求43的载体，其是表达载体。
45.包含权利要求44的核酸的宿主细胞。
46.重组生产权利要求17或18的抗体的方法，所述方法包括：(i)在适合于所述抗体的表达的条件下，在培养基中培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞；和(ii)从所述培养基回收所述抗体。
47.产生四聚FcγR复合物的方法，其中相对于单体FcγR对Fc区的亲合性，所述四聚复合物具有对Fc区增强的亲合性，包括：
(a)产生融合蛋白，从而15氨基酸AVITAG序列可操作地连接到FcγR的可溶区；
(b)使步骤(a)中产生的蛋白生物素化；
(c)以合适的摩尔比混合步骤(b)中产生的生物素化的蛋白和链霉抗生物素蛋白-藻红素，
从而形成四聚FcγR复合物。
48.通过权利要求47的方法产生的四聚FcγR复合物。
49.权利要求48的四聚FcγR复合物，其中所述复合物以比单体FcγR复合物结合Fc区更高7倍的亲和性结合Fc区。
50.权利要求48的四聚FcγR复合物，其中所述复合物以比单体FcγR复合物结合Fc区更高9倍的亲和性结合Fc区。
51.权利要求47的方法，其中所述四聚FcγR复合物是四聚FcγRIIIA复合物，以及步骤(a)中使用的所述可溶区是FcγRIIIA的可溶区。
52.权利要求47的方法，其中所述四聚FcγR复合物是四聚FcγRIIB复合物，以及步骤(a)中使用的所述可溶区是FcγRIIB的可溶区。
53.权利要求47的方法，其中步骤(a)中产生的蛋白以酶学手段生物素化。
54.权利要求47的方法，其中步骤(a)中产生的蛋白用E.coli BirA酶生物素化。
55.权利要求47的方法，其中步骤(a)中产生的生物素化的蛋白以1∶5摩尔比与链霉抗生物素蛋白-藻红素混合(1X链霉抗生物素蛋白-藻红素：5X生物素化的蛋白)。
56.在患有以癌症抗原为特征的癌症的患者中治疗或控制癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种权利要求17、18、26或27的抗体。
57.在患有以癌症抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用特异性结合所述癌症抗原的治疗有效量的一种或多种权利要求17、18、26或27的抗体。
58.在有需要的患者中治疗自体免疫失调的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述分子以比包含野生型Fc区的可比较分子更大的亲合性特异性结合FcγRIIB，和所述分子进一步的以比包含野生型Fc区的可比较分子更低的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
59.权利要求58的方法，其中所述自体免疫失调是类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、关节强硬性脊椎炎、Rieter’s综合症、银屑病或红斑狼疮。
60.权利要求58的方法，进一步包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种抗炎症试剂。
61.权利要求58的方法，进一步包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种免疫调节试剂。
62.权利要求61的方法，其中至少一种免疫调节试剂是小的有机分子。
63.权利要求62的方法，其中所述小的有机分子是氨甲蝶呤、leflunomide、环磷酰胺、环孢菌素A、FK506、mycophenolate mofetil、雷帕霉素、mizoribine、deoxyspergualin、brequinar、malonitrolamide、类固醇或皮质类固醇。
64.权利要求60的方法，其中所述至少一种抗炎症试剂是非甾族抗炎症药物。
65.权利要求64的方法，其中所述非甾族抗炎症药物是阿斯匹林、布洛芬、diclofenac、nabumetone、甲氧萘丙酸或ketoproten。
66.在有需要的患者中治疗传染性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含变异Fc区的分子，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述分子以比包含野生型Fc区的可比较分子更大的亲合性特异性结合FcγRIIB，和所述分子进一步的以比包含野生型Fc区的可比较分子更低的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
67.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大3倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
68.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大7倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
69.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大9倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
70.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIIA更大99倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
71.权利要求17或18的抗体，其中所述抗体以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIIA更大3倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
72.权利要求17或18的抗体，其中所述抗体以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIIA更大7倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
73.权利要求17或18的抗体，其中所述抗体以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIIA更大9倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
74.权利要求17或18的抗体，其中所述抗体以比包含野生型Fc区的可比较抗体结合FcγRIIIA更大99倍的亲合性特异性结合FcγRIIIA。
75.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以比包含野生型Fc区的可比较多肽更大的亲合性特异性结合FcγRIIIA，和所述多肽进一步的以比包含野生型Fc区的可比较多肽结合FcγRIIB更低的亲合性特异性结合FcγRIIB，其中所述至少一个氨基酸修饰包含选自以下构成的组的一组替换，在位置243用异亮氨酸以及在位置379用亮氨酸替换；在位置288用天冬酰胺、在位置330用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；在位置243用亮氨酸以及在位置255用亮氨酸替换；在位置288用甲硫氨酸以及在位置334用谷氨酸替换；在位置316用天冬氨酸、在位置378用缬氨酸以及在位置399用谷氨酸替换；在位置315用异亮氨酸、在位置379用甲硫氨酸以及在位置399用谷氨酸替换；在位置243用异亮氨酸、在位置379用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换；在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；在位置293用缬氨酸、在位置295用谷氨酸以及在位置327用苏氨酸替换；在位置268用天冬酰胺以及在位置396用亮氨酸替换；在位置319用苯丙氨酸、在位置352用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换；在位置248用甲硫氨酸替换；在位置247用亮氨酸以及在位置420用缬氨酸替换；334用谷氨酸以及在位置292用亮氨酸替换。
76.权利要求75的多肽，其中所述多肽是抗体。
77.权利要求76的抗体，其中所述抗体具有相对于包含野生型Fc区的可比较抗体增强的ADCC活性。
78.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置255用亮氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。
79.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置370用谷氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。
80.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置392用苏氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。
81.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置221用谷氨酸、在位置270用谷氨酸、在位置308用丙氨酸、在位置311用组氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置402用天冬氨酸替换。
82.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置243用亮氨酸、在位置305用异亮氨酸、在位置378用天冬氨酸、在位置404用丝氨酸以及在位置396用亮氨酸替换。
83.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置284用甲硫氨酸、在位置298用天冬酰胺、在位置334用谷氨酸、在位置355用色氨酸以及在位置416用苏氨酸替换。
84.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以相对于包含野生型Fc区的多肽改变的亲合性结合FcγR，条件是所述至少一个氨基酸修饰不处在Fc-FcγR的接口区域。
85.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽具有相对于包含野生型Fc区的多肽改变的CDC活性，条件是所述至少一个氨基酸修饰不处在Fc-FcγR的接口区域。
86.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽具有相对于包含野生型Fc区的多肽改变的ADCC活性，条件是所述至少一个氨基酸修饰不处在Fc-FcγR的接口区域。
87.权利要求85的多肽，其中所述多肽进一步具有改变的ADCC活性。
88.权利要求84的多肽，其中所述多肽具有增强的CDC活性，从而所述多肽具有增强的Clq结合亲合性。
89.权利要求85的多肽，其中所述CDC活性被增强，从而所述多肽具有增强的Clq结合亲合性。
90.权利要求84的多肽，其中所述多肽具有增强的CDC活性，从而Clq结合亲合性不被改变。
91.权利要求85的多肽，其中所述CDC活性被增强，从而Clq结合亲合性不被改变。
92.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置247用亮氨酸、在位置421用赖氨酸以及在位置270用谷氨酸替换。
93.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置419用组氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替换。
94.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置370用谷氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替换。
95.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置255用亮氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替换。
96.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置240用丙氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替换。
97.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置392用苏氨酸、在位置396用亮氨酸以及在位置270用谷氨酸替换。
98.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置292用脯氨酸以及在位置305用异亮氨酸替换。
99.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置270用谷氨酸、在位置316用天冬氨酸以及在位置416用甘氨酸替换。
100.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个氨基酸修饰包含在位置284用甲硫氨酸、在位置292用亮氨酸以及在位置370用天冬酰胺替换。
101.包含变异Fc区的多肽，其中所述变异Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，从而所述多肽以与包含野生型Fc区的多肽相比改变的亲合性结合FcγR，其中所述至少一个氨基酸修饰处在Fc区的CH1结构域中。
102.权利要求101的多肽，其中所述多肽是抗体。
103.权利要求102的多肽，其中所述抗体具有相对于包含野生型Fc区的可比较抗体增强的ADCC活性。
104.权利要求102的多肽，其中所述抗体具有相对于包含野生型Fc区的可比较抗体增强的CDC活性。
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