KR101913743B1 - 혈중 반감기 연장을 위한 항체 Fc 변이체들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 Fc 변이체는 광범위한 항체 및 Fc 융합체 산물에 있어서의 용도를 가질 수 있다. 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 치료용, 진단용, 또는 연구용 시약(reagent), 바람직하게는 치료용 시약이다. 본 발명의 Fc 변이체는 일부 아미노산 서열의 최적화를 통하여 체 내 반감기를 극대화 할 수 있으며, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 표적 항원, 예를 들어, 암 세포를 함유하는 표적 세포를 죽이는 데에 사용된다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는, 예를 들어 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 대하여 길항 작용하기 위하여, 표적 항원을 블로킹하거나, 길항 작용하거나, 또는 방해하는 데 사용된다.

Description

혈중 반감기 연장을 위한 항체 Fc 변이체들{Antibody Fc variants for Prolonged Serum Half-Life}

본 발명은 혈중 반감기가 연장된 신규한 항체 Fc 변이체들 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 유전자 재조합, 세포 배양 등 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 이는 생명현상에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라, 각종 질병들의 발병 기작을 규명하는데 결정적 역할을 함으로써 효과적인 질병 진단과 치료의 길을 마련해 삶의 질 향상에 크게 기여 하고 있다. 특히, 1975년에 B 세포(B Cell)와 골수암 세포(Myeoloma cell)를 융합하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술(Hybridoma technology)이 개발(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)되면서 암, 자가면역질환, 염증, 심혈관 질환, 감염 등의 임상 분야에서 치료용 항체를 이용한 면역 치료(Immunotherapy)에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.

치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴 (Herceptin), 아바스틴 (Avastin), 리툭산 (Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다.

항체의 Fc 부위는 면역 백혈구 또는 혈청 보체 분자를 소집하여, 암세포 또는 감염된 세포와 같은 손상된 세포들이 제거될 수 있도록 역할을 한다. Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 Fc 상의 부위는 신생(neonatal) 수용체 FcRn과의 상호 작용을 매개하며, 그의 결합은 엔도솜(endosome)으로부터 혈류(bloodstream)로 세포내 이입된 항체를 재순환시킨다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766). 이 과정은, 전체 길이 분자의 거대한 크기에 기인하여, 신장 여과(kidney filtration)의 저지와 연관되어, 1주 내지 3주 범위의 유리한 항체 혈청 반감기(antibody serum half-life)를 갖는다. 또한, FcRn에 대한 Fc의 결합은 항체 운반에 있어서도 중요한 역할을 담당한다. 따라서, Fc 부위는 세포 내 수송(intracellular trafficking) 및 리사이클 기작을 통하여 항체가 순환되어 연장된 혈청 지속성(prolonged serum persistence)을 유지하는데 필수적인 역할을 한다.

치료제로서 항체 또는 Fc 융합 단백질의 투여는 반감기의 특성을 고려하여, 정해진 빈도의 주사를 필요로 한다. 생체 내에서 더욱 긴 반감기는 더욱 낮은 빈도의 주사 또는 더욱 적은 투여량을 가능하게 하는 명백한 장점이 있다. 이에 따라, 현재 진행되고 있는 많은 임상연구에서 항체의 반감기를 증가시키기 위해 Fc 부위에 돌연변이를 도입하거나 ADCC 효과를 극대화시키기 위해 변이를 도입한 Fc 도메인을 통해 차세대 항암 항체 치료제나 항암 단백질 치료제 개발에 많은 노력을 쏟고 있다 (Modified from Cancer Immunol Res. 2015 / Thomson Reuters).

하지만, 상기 연구진에서 Fc 도메인에 일부 돌연변이를 도입하여 증가된 FcRn 결합 친화성 및 생체 내 반감기를 갖는 일부 단백질 및 항체를 발굴하기 위해 노력하고 있지만, 아직까지 생체 내 반감기를 크게 향상시키지 못하고 있는 것이 현실이며, 보다 최적화된 돌연변이를 도입한 항체의 개발이 절실히 요구되는 상황이다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 기존의 단백질 또는 항체 치료제의 체 내 반감기를 효율적으로 증가시키기 위한 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써, 단백질 또는 항체 치료제의 활성에는 거의 영향을 주지 않으면서 반감기를 극대화 시킬 수 있는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 기존의 단백질 또는 항체 치료제의 체 내 반감기를 효율적으로 증가시키기 위한 방법으로 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환 및 최적화하여 Fc 변이체를 제조함으로써, 이를 포함하는 단백질 또는 항체 치료제의 반감기를 극대화 시킬 수 있는 방법을 찾고자 하였다.

항체는 특정 항원에 특이적으로 결합을 나타내는 단백질로, 천연 항체는 통상 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로다이머 당단백질이다.

본 발명에서 사용되는 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있으며, 바람직하게는 IgG이다. 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 단편과 1개의 Fc 단편을 형성하며, 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys 226의 N-말단을 파파인 분해함으로써 생성된다(Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).

항체 Fc 도메인은 IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 IgG 항체의 Fc 도메인, 혹은 이들의 변형일 수 있다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 도메인은 IgG 항체의 Fc 도메인(예를 들면 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인)이다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인(예를 들면 항HER2 항체의 Fc 도메인, 바람직하게는 트라스트주맙의 Fc 도메인, 보다 바람직하게는 서열목록 제28서열의 Fc 도메인)일 수 있다. 본 발명의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 일부 또는 전체가 당화되어 있지 않거나 당화되어 있을 수 있다. 또한, 폴리펩타이드에 Fc 도메인에 더해 항체에서 유래하는 하나 이상의 영역이 포함될 수도 있다. 추가적으로, 상기 폴리펩타이드에는 항체 유래의 항원 결합 도메인(antigen binding domain)이 포함될 수도 있으며, 복수의 폴리펩타이드가 항체 또는 항체형 단백질을 형성할 수도 있다.

본 명세서에서 항체 Fc 도메인의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른다(Kabat et al., in of Proteins of Immunological Interest5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호).

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템에 따른 하기의 아미노산 치환을 포함한다: a) M428L; 및 b) Q311R 또는 L309G.

본 발명은 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 및 해리를 조정하는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체에 관한 것이다. 특히, 낮은 pH에서 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도(binding affinity)를 나타내고, 높은 pH에서 실질적으로 변화된 결합을 나타내지 않은 Fc 변이체, 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 pH 5.6 내지 6.2(바람직하게는 pH 5.8 내지 6.0)에서 FcRn에 대한 결합 친화도(binding affinity)가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상 또는 100배 이상 증가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 pH 7.0 내지 7.8(바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6)에서 FcRn(neonatal Fc receptor)으로부터 해리(dissociation)되는 정도가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 동일하거나 실질적으로 변화되지 않을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형 Fc 또는 기 개발된 타 Fc 변이체와 비교하여 약산성 조건(예를 들어, pH 5.8 내지 6.0)에서는 매우 향상된 결합 친화도를 나타내었으며, 중성 조건(예를 들어, pH 7.0)에서는 동일하거나 실질적으로 동등 또는 그 이상의 수준의 해리 정도를 나타내었다(실시예 4 및 8).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형과 비교하여 반감기 (Half-life)가 증가된 것이다.

본 발명의 치환된 Fc 변이체의 반감기는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상 또는 10배 이상 증가될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형과 비교하여 월등히 향상된 체 내 반감기를 나타내었다(실시예 11, 표 3).

본 명세서에서, “Fc 감마 수용체”또는 “FcγR” 은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질 계통의 임의의 구성원을 의미하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 이의 예로서, FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc을 포함하는 FcγRI(CD64); FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 그리고 FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 포함하는 FcγRIII(CD16), 그리고 임의의 발견되지 않은 FcγR 또는 FcγR이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. FcγR은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 기타 다른 임의의 생물체로부터 유래될 수도 있다.

본 명세서에서, “FcRn” 또는 “neonatal Fc receptor”는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 FcRn은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 임의의 생물체로부터 유래될 수도 있다. 기능적 FcRn 단백질은 경쇄 및 중쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.

본 명세서에서 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 항체 Fc 영역의 최적화 (M428L 및 Q311R; 또는 M428L 및 L309G)를 통해 Fc 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드의 반감기를 극대화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.

본 명세서에서 용어 벡터는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).

본 명세서에서 용어 발현 벡터는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 숙주세포는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.

본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:

a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법을 제공한다:

a) 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.

본 발명의 제조방법에 있어서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:

a) 카밧 넘버링 시스템에 따른 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및

b) 상기 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.2에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.

본 발명의 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

상기 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 넘버링 시스템에 따른 Q311R 또는 L309G 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리 (FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Sta r Plus, FACScan 및 FACSort 기기 (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 상기 항체, 상기 핵산분자 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 대조군(예를 들어, 트라스트주맙) 대비 동등 또는 그 이상의 ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity) 활성을 나타내어, 상기 현저한 반감기 증가와 더불어 높은 항암활성을 갖는다(실시예 13, 도 18).

본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 폴리펩타이드, 항체, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체를 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 Fc 변이체는 일부 아미노산 서열의 최적화를 통하여 체 내 반감기를 극대화 할 수 있으며, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 terameric FcRn과 dimeric FcRn의 발현 및 정제를 위한 발현용 vector 및 정제 후 SDS-PAGE 겔 사진을 나타낸다.
도 2는 M252 및 M428에 18가지의 아미노산이 들어 갈 수 있도록 제작하기 위한 라이브러리 모식도를 나타낸다.
도 3은 2M 라이브러리 탐색 과정 및 선별된 M428L 변이체를 나타낸다.
도 4는 M428L을 기본으로 하여 제작된 error 라이브러리와 point 라이브러리의 모식도를 나타낸다.
도 5는 Error 라이브러리(도 5a) 및 point 라이브러리(도 5b)에서 발굴한 변이체들의 FACS 형광세기 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 트라스트주맙 중쇄 및 경쇄를 동물세포 내에서 발현하기 위한 플라스미드를 나타낸다.
도 7은 야생형 트라스트주맙의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 8은 상업용 트라스트주맙 및 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 물성 비교 결과를 나타낸다(A: CE-cIEF, B: SEC).
도 9는 N-Glycan profiling에 의한 상업용 트라스트주맙 및 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 물성 비교 결과를 나타낸다.
도 10은 10종의 트라스트주맙 Fc 변이체 발현 및 정제 결과를 나타낸다(A: Affinity Chromatography, B: SDS-PAGE Analysis, C: List of Final Yield).
도 11은 트라스트주맙 Fc 변이체의 SEC 특성분석 결과를 나타낸다.
도 12는 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 FcRn 결합력 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 BiaCore에 의한 pH 6.0과 7.4에서의 트라스트주맙 Fc변이체와 hFcRn과의 결합력 측정결과를 나타낸다(A: pH 6.0(capture method) B: pH 7.4(Avid Format)에서의 결합력 측정).
도 14는 일반 마우스(C57BL/6J (B6))와 인간 FcRn Tg 마우스에서의 상업용 및 연구실 제작 트라스트주맙의 약동학 비교 결과를 나타낸다.
도 15는 인간 FcRn Tg 마우스에서 Fc 변이체의 약동학 분석결과를 나타낸다(정맥주사로 각 변이체 5 mg/kg 주사, n=5).
도 16은 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 FcγRs 결합력 측정결과를 나타낸다.
도 17은 Normal IgG 와 대조군(트라스트주맙) 대비 트라스트주맙 Fc 변이체의 Effector Function 비교결과를 나타낸다(ADCC assay).
도 18은 트라스트주맙 Fc 변이체의 Effector Function(ADCC) 비교 결과를 나타낸다.
도 19는 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 C1q 결합력 측정결과를 나타낸다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. Fc 변이체 라이브러리 탐색을 하기 위한 FcRn (neonatal Fc receptor) 발현 및 정제

FcRn에 pH-의존적 결합력이 향상된 Fc 변이체를 탐색하기 위하여 terameric FcRn과 dimeric FcRn의 발현 및 정제를 수행하기 위하여 발현용 벡터를 준비하였다(도 1). Tetrameric FcRn을 얻기 위해서 pMAZ-β2microglobulin-GSlinker-FcRnα-chain-streptavidin-His의 DNA 플라스미드를 확보하였다. 이 DNA를 HEK 293F 세포에 co-transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 7000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 후 Ni-NTA resin(Qiagen)을 넣어주어 16시간 동안 4℃에서 FcRn과 레진을 결합하게 하였다. 컬럼에 FcRn과 결합한 레진을 흘려 주고 50 ml wash-1 buffer(PBS), 25 ml wash-2 buffer(PBS + 10 mM imidazole), 25 ml wash-3 buffer(PBS + 20 mM imidazole), 200 μl wash-4 buffer(PBS + 250 mM imidazole)를 흘려주어 tFcRn 이외의 단백질을 제거하였다. 그리고 2.5 ml elution buffer(PBS + 250 mM imidazole)를 흘려주어 tFcRn을 얻었다. 그리고 buffer를 바꾸기 위하여 centrifugal filter units(Merck Millipore)을 사용하였다. Dimeric FcRn을 얻기 위해서 Oslo 대학교에서 받은 pcDNA-FcRnα-chain-GST-β2 microglobulin 플라스미드를 확보하였다. 이 DNA를 HEK 293F 세포에 co-transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 7000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 후 Glutathione agarose 4B(incospharm) 레진을 넣어주어 16시간 동안 4℃에서 FcRn과 레진을 결합하게 하였다. 컬럼에 FcRn과 결합한레진을 흘려 주고 10 ml wash buffer(PBS)를 흘려주어 dFcRn 이외의 단백질을 제거하였다. 그리고 2.5 ml elution buffer(50 mM Tris-HCl + 10 mM GSH pH 8.0)를 흘려주고 buffer를 바꾸기 위하여 centrifugal filter units 3K(Merck Millipore)을 사용하였다. 정제 후 SDS-PAGE 겔을 이용하여 크기를 확인 하였다(도 1). 정제된 terameric FcRn과 dimeric FcRn에 형광 신호를 낼 수 있도록 Alexa 488를 이용하여 형광 표지를 하였다.

실시예 2. Fc 변이체 2M 라이브러리 (library) 제작

트라스트주맙(Trastzumab)에 있는 Fc 부분의 유전자(서열목록 제29서열)를 SfiI 제한효소를 이용하여 pMopac12-NlpA-Fc-FLAG를 제작하였다. 제작된 벡터를 기반으로 Fc 내에 두 개의 Met부분을 cys과 Met을 제외한 나머지 18가지의 다른 아미노산으로 치환될 수 있도록 pMopac12-seq-Fw, Fc-M252-1-Rv, Fc-M252-2-Rv, Fc-M252-3-Rv, Fc-M428-Fw, Fc-M428-1-Rv, Fc-M428-2-Rv, Fc-M428-3-Rv, Fc-M428-frg3-Fw, pMopac12-seq-Rv 프라이머를 이용하여 라이브러리 insert를 제작하였다(표 1, 도 2). 제작된 insert를 SfiI 제한효소 처리하여 같은 SfiI으로 처리된 벡터와 라이게이션하였다. 그 후 대장균 Jude1((F'[Tn10(Tet^r )proAB⁺ lacI ^qΔ(lacZ)M15] mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG)에 형질전환하여 거대 Fc 변이체 2M 라이브러리(라이브러리 크기: 1x10⁹)를 구축하였다.

[표 1] 클로닝에 사용된 프라이머들(서열목록 제1서열 내지 제27서열)

실시예 3. 박테리아배양 및 유세포 분리기 (flow cytometry )를 이용한 Fc 변이체 2M 라이브러리 탐색

구축된 2M Fc 변이체 라이브러리 탐색을 위하여 대장균 Jude1 세포에 형질전환되어 있는 Fc 변이체 라이브러리 세포 1 ml을 37℃ 250 rpm shaking 조건으로 2%(w/v) 글루코오스에 항생제는 클로람페니콜(40 μg/mL)이 포함된 Terrific Broth(TB) 배지에 넣어 주고 4시간 배양을 하였다. 진탕배양된 라이브러리 세포를 TB 배지에 1:100으로 접종한 후 37℃ 250 rpm shaking으로 OD₆₀₀가 0.5에 도달할 때 까지 배양하였다. 그 후 cooling을 위해 20분 동안 25℃에서 배양한 후 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)를 넣어 발현유도를 하였다. 배양이 끝난 후 세포를 회수하여 OD600 normalize를 통해 균일한 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 재현탁(resuspension)하고 1분간 원심분리하는 세척과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M 수크로오스, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA(pH 8.0)]로 재현탁하여 37℃, 30분간 회전시켜 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 1 ml의 Solution A[0.5 M 수크로오스, 20 mM MgCl₂, 10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 재현탁과 원심분리를 하였다. 1 ml의 SolutionA와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 재현탁한 뒤 37℃, 15분 간 회전시켜 펩티도글라이칸 층을 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 재현탁한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 형광 표지된 tetrameric FcγRIIIa-Alexa 488 flour 프로브를 함께 넣고 상온에서 회전시켜 spheroplast에 형광 프로브를 라벨링하였다. 라벨링후 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 유세포 분리기(Flow cytometry: S3 sortor (Bio-rad))를 이용하여 높은 형광을 보이는 상위 3% 세포들을 회수하기 위해 선별(sorting) 작업을 진행 하였고 형광이 높은 세포들의 순도를 높이기 위해서 선별된 세포들을 다시 재선별 (resorting)하였다. 재선별된 샘플을 pMopac12-seq-Fw와 pMopac12-seq-Rv 프라이머로 Taq 폴리머레이즈(Biosesang)를 이용해 PCR로 유전자를 증폭하고 SfiI 제한효소 처리, 라이게이션, 형질전환 과정을 거쳐 sorting된 세포의 유전자들이 증폭된 서브라이브러리를 제작하였다. 이 과정을 총 2라운드에 걸쳐 반복한 후, 40여개의 개별 클론들을 각각 분석하여 야생형 Fc 보다 pH 5.8에서 FcRn과 높은 친화도를 보이는 M428L 변이체를 선별하였다(도 3).

실시예 3. Fc 변이체 error 라이브러리 및 point 라이브러리 제작

발굴된 M428L을 주형으로 하여 추가로 두 가지 라이브러리를 제작하였다. 첫 번째 라이브러리는 error prone PCR 기법을 이용하여 Fc에 변이를 도입하여 error 라이브러리를 제작하였다. Error rate은 Fc(680 bp)에 0.3% error(2.04 bp)가 들어 갈 수 있도록 ep-Fc-Fw, ep-Fc-Rv 프라이머를 이용하여 라이브러리(라이브러리 크기: 2x10⁸)를 제조하였다. 두 번째 라이브러리는 M428L을 주형으로 하고 Fc와 FcRn결합 부위를 선정하여 해당 부위에 무작위적으로 돌연변이가 도입되도록 pMopac12-seq-Fw, pMopac12-seq-Rv, Fc-Sub#0-Rv, Fc-Sub#1-1-Fw, Fc-Sub#1-2-Fw, Fc-Sub#1-3-Fw, Fc-Sub#1-4-Fw, Fc-Sub#1-5-Fw, Fc-Sub#1-Rv, Fc-Sub#2-1-Fw, Fc-Sub#2-2-Fw, Fc-Sub#2-3-Fw, Fc-Sub#2-Rv, Fc-Sub#3-1-Fw, Fc-Sub#3-2-Fw, Fc-Sub#3-3-Fw, Fc-Sub#3-4-Fw 프라이머를 이용하여 point 라이브러리를 제작하였다(도 4). 그 후 위와 같은 방법으로 Jude1에 형질전환하여 Fc 변이체 라이브러리를 구축하였다.

실시예 4. 박테리아배양 및 유세포 분리기(flow cytometry )를 이용한 Fc 변이체 error 및 point 라이브러리 탐색과 PFc3, PFc29, PFc41, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88 등의 변이체 선별

앞서 발굴된 M428L을 기본으로 하여 추가적으로 제작된 error 라이브러리와 point 라이브러리를 위와 같은 방법으로 선별 및 재선별 작업을 진행하였다. error 라이브러리는 5 라운드에 거쳐 반복하였고, point 라이브러리는 1회에 거쳐 선별을 진행한 후 두 가지 라이브러리에서 나온 그룹에서 각각 100여개의 개별 클론들을 분석하여 pH 5.8에서 FcRn에 높은 친화도를 보이고 pH 7.4에서는 낮은 친화도를 보이는 Fc 변이체들을 선별하였다. FACS를 이용하여 각각을 분석한 결과 error 라이브러리에서 발굴된 EFc6, EFc29, EFc41, EFc46, EFc70, EFc90 EFc82, EFc88은 야생형 Fc 보다 pH 5.8에서 높은 형광세기를 보였지만 선행연구에서 발굴된 메디이뮨(Medimmune)의 YTE (Gabriel J. Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother. 2013 Dec; 57(12): 61476153)나 젠코(Xencor)의 LS(미국 특허등록번호 제8,324,351호) 보다 pH 5.8에서 높은 형광 세기를 나타내었으며, pH 7.4에서 LS보다 낮은 형광을 나타내는 변이체는 EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88 이라는 것을 확인하였다. 또한 point 라이브러리에서 발굴된 변이체 PFc3, PFc29, PFc41는 YTE나 LS 보다 pH 5.8에서 높은 형광 세기를 보였지만 PFc30은 낮은 형광세기를 보였다. 그리고 PFc29, PFc41은 pH 7.4에서 LS 보다 낮은 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 최종적으로 혈중 반감기를 향상 시킬 것으로 예상되는 EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88, PFc3, PFc29, PFc41을 선정하였다(표 2, 도 5).

[표 2] 발굴한 변이체의 점 돌연변이

돌연변이위치는 Kabat EU 넘버링시스템(Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호에 따름.

실시예 5. Fc 변이체 도입을 위한 대조군 트라스트주맙 생산 및 정제

본 발명에서는 IgG1 치료용 항체 중 대표적인 트라스트주맙(trastuzumab, Herceptin^ⓡ)을 선정하여, 발굴된 Fc 변이체를 도입하고 향후 대조군으로 사용하고자 하였다.

야생형 트라스트주맙 유전자는 Drug Bank(http://www.drugbank.ca/)의 아미노산 서열로부터 back-translation과 동시에 mammalian codon optimization을 통해 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 각각을 합성(Genscript) 하였다. 합성된 트라스트주맙 중쇄 유전자는 pOptiVEC-Fc 벡터에 트라스트주맙 경쇄 유전자는 pDNA3.3 벡터에 각각 서브클로닝하였다(도 6). 트라스트주맙 중쇄 및 경쇄를 코딩하고 있는 동물세포 발현용 플라스미드들을 각각 제조하여 HEK293세포에서 발현 및 정제하였다.

HEK 293F에서 배양 후 Protein A 친화도 크로마토크래피(AKTA prime plus, cat # 11001313)와 젤여과 크로마토그래피(HiTrap MabselectSure, GE, cat #11-0034-95)를 이용하여 야생형 트라스트주맙을 정제하였고, 300 ml 배양액으로부터 7.7 mg의 고순도 야생형 트라스트주맙을 확보하였다(도 7).

실시예 6. 연구실 제작( in-house ) 및 상업용( commercial ) 트라스트주맙 물성 비교 분석

CHO suspension 배양으로 생산된 상업용(commercial) 트라스트주맙과 달리 연구실에서 제작(in-house)한 in-house 트라스트주맙은 HEK293에서 생산하였기 때문에 선별된 Fc-변이체를 도입하여 그 기능을 분석 하기 전 두 가지 형태의 기본 특성 분석을 하였다. CE(Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter)에 의한 분석은 pH 3-10의 구배를 형성하는 Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes(GE Healthcare, 17-0456-01)를 사용하여 시료의 pI값 및 Charge variants를 분석하였다. 분석 결과 SEC(Size Exclusion Chromatography :Tskgel G3000swxl, Tosoh)에 의한 impurity는 없었으며, CE(Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter)에 의한 charge variant에 의한 pI값은 상업용의 경우 8.27-8.74이고 main peak의 PI가 8.62이며, 자체 생산한 트라스트주맙의 PI는 8.29-8.78, main peak은 8.65로 둘 다 거의 유사하였다(도 8). 그러나 cIEF 분석 결과 연구실에서 제작한 트라스트주맙에서 main peak외 나머지 peak에서의 약간의 함량차이가 관찰되었고 이것은 상업용의 경우 CHO에서 생산되나, 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 생산 세포주가 HEK293으로 Glycan pattern이 달라 sialic acid등으로 인한 oxdation일 가능성도 있어 Glycan 분석도 진행 하였다(도 9).

Glycan 분석은 단백질에서 PNGase F(NEB, 186007990-1)를 이용하여 N-glycan을 떼어낸 후 RapiFluor-MS reagent(Waters, 186007989-1)를 이용하여 라벨링 후 UPLC 시스템(Acquity UPLC I class, Waters, FLR detector)을 이용하여 분석 실시하였다. Glycan 분석 결과 당 패턴은 유사하나 각 조성 당의 함량 차이만 보여 이는 sialic acid에 의한 oxidation이 원인은 아닌 것으로 보이며, 생산 세포주 차이에 의해 나타나는 것으로 보였고, 결합력 분석 및 약동학 분석에는 큰 영향이 없음을 확인하여(Data not shown) 선별된 Fc 변이체들을 도입하여 생산하였다.

실시예 7. Fc 변이체 생산, 정제 및 물성 분석

상업용과 연구실에서 제작한 야생형 외에 LS(XenCor), YTE(MedImmune), 428L등의 대조군 변이체 5종과 PFc29, PFc41, EFc29, EFc41 및 EFc82 등 5종의 선별된 변이체를 HEK 293F 동물세포에 형질주입하였다. 형질주입 하루 전날 HEK293F cell을 1x10⁶ cells/ml의 밀도로 300 ml 계대배양하고 다음날 Polyethylenimine(PEI, Polyscience, 23966)을 이용하여 형질주입하였다. Freestyle 293 expression 배양액(Gibco, 12338-018) 30 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 2:1의 비율로 먼저 섞고, 다음으로 PEI : 변이체유전자 = 1:2 비율로 섞어 상온에서 20분간 두었다가 전날 계대배양 해 놓은 세포에 섞고 shaking CO₂ 인큐베이터에서 37℃, 125 rpm, 8 %　CO₂ 조건으로 6일간 배양한 후 원심 분리하여 상등액만 취하였다.

상등액으로부터의 단백질 정제는 HiTrap MabselectSure 칼럼을 장착한 AKTA prime plus를 이용하여 친화 크로마토그래피로 수행하였다. 상등액 300 ml을 분당 3 ml의 속도로 흘려주고, 100 ml의 1xPBS로 씻어준 후 IgG Elution buffer(Thermo scientific , 21009)를 분당 5 ml의 속도로 5 ml 씩 6개의 절편(fraction)을 수집하고 1M Tris (pH9.0) 500 ul를 섞어 중화시켜준 후, 각 절편을 Bradford (BioRad, 5000001) 용액으로 단백질을 확인하여 새 튜브에 취하였다. 30K Amicon ultra centrifugal filter(UFC903096)를 이용하여 정제된 변이체들을 농축한 다음 물성 분석하였다(도 10 및 11).

연구실 제작 야생형 트라스트주맙 외 각 Fc 변이체들을 protein A로 정제 후 SDS-PAGE에 의해 순도 90% 이상 순도 및 분자량을 확인하였고, 효능평가 및 순도 분석에 요구되는 고순도 단백질 시료 확보(순도 97% 이상)를 위해 SEC-HPLC(도 11A) 실험을 진행하였다. isocratic condition(이동상 1X PBS pH 7.0, 1 ml/min 유속)에서 분석한 결과, Fc 변이체 모두 main peak에 대한 retention time이 동일하며 분자량 예측 결과 예상 분자량으로 확인 하였다(도 11B).

실시예 8. ELISA를 통한 Fc 변이체의 FcRn 결합력 측정

앞서 준비된 변이체들의 FcRn pH-의존적 결합력과 effect function을 나타낼 수 있도록 하는 FcγRs, C1q와의 결합력을 측정해 보기 위하여 ELISA 측정을 진행하였다. 먼저 FcRn에 pH-의존적 결합력을 보기 위하여 0.05 M Na₂CO₃ pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 5.8/pH 7.4)로 상온에서 2 시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST (pH 5.8/pH 7.4) 180 μl로 4회 씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 5.8/pH 7.4)으로 serially dilution된 FcRn를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 anti-GST-HRP conjugate(GE Healthcare) 50 μl 씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl 씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H₂SO₄ 50 μl 씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 발굴한 변이체는 FcRn에 대해서 pH 5.8에서는 LS 변이체와 비슷한 결합력을 가지고 pH 7.4에서는 LS 보다 더 잘 해리가 되는 것을 볼 수 있었다(도 12).

실시예 9. pH 6.0과 pH 7.4에서 트라스트주맙 Fc 변이체들과 monomeric hFcRn과의 결합력 측정 비교 분석

이와 같이, 물성 분석으로 확인된 상업용과 연구실 제작 트라스트주맙 외 선별된 Fc 변이체들의 pH에 따른 인간 FcRn과의 결합력 차이를 비교하기 위해 Biacore T200(GE Healthcare) 장비를 이용하여 K_D값을 측정 비교하였다. pH 6.0 조건에서는 문헌(Yeung YA. et al., J. Immunol,2009)에 따라 antigen-mediated antibody capture 방식으로 인간 FcRn을 analyte로 사용하였다. HER2 ECD domain이 ∼3,000 response units(RU) 수준으로 고정된 CM5 chip 표면에 Fc 변이체를 리간드로 running buffer(50 mM Phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.005% surfactant P20, pH 6.0)에 희석하여 ~300 RU 수준으로 주입하여 capture하였다. Analyte인 monomeric FcRn(Sinobiological inc., CT009-H08H)은 125 nM에서부터 FcRn running buffer에 순차적으로 희석하여 30 ul/min 유속으로 2분 동안 injection하고, 2분 동안 dissociation하여 결합력을 측정하였다. 각 cycle 마다 10 mM Glycine(pH1.5) 30 ml/min의 유속으로 30초간 regeneration을 수행하였다. Sensogram은 BIAevaluation software(Biacore)에서 1:1 binding model을 적용하여 분석하였다. 그 결과, Fc 변이체가 대조군으로 사용된 상업용 트라스트주맙(15 nM) 및 연구실 제작 트라스트주맙(16.9 nM)과 backbone으로 사용된 428L(9 nM)보다는 결합력이 좋아졌지만(PFc 3: 5.6 nM, PFc29 : 6.8 nM, PFc 41: 5.9 nM 등), 세계 최고로 알려진 YTE(5.7 nM)와 LS(4.1 nM)보다는 결합력이 다소 낮았으나 그 값의 차이가 거의 오차범위내로 비슷함을 확인하였다. pH 7.0 조건에서는 리간드와 analytes가 잘 결합하지 않으므로 monomeric hFcRn을 direct immobilization 한 다음 Fc 변이체들을 농도별로 주입하는 avid format(Zalevsky J et al. Nat. Biotechnol,2010)으로 측정하였다. 인간 FcRn ECD doamin(Sino Biological)을 CM5 chip 표면에 ∼1,500 RU 수준으로 고정화하였다. FcRn이 고정된 chip 표면에 Fc 변이체들을 3000 nM에서부터 HBS-EP(pH 7.4)에 순차적으로 희석하여 5 ml/min의 유속으로 2분간 injection하였다. 결합한 Fc 변이체들은 2분 동안 해리시켰으며, 각 cycle이 끝나면 chip 표면을 100 mM Tris(pH 9.0)로 regeneration 하였다(conatat time 30초; 유속 30 ul/min). 이중, Fc 변이체들 2종 (PFc29, PFc41)이 pH 6.0 조건에서 높은 결합력을 유지하면서 pH 7.4 조건에서는 YTE와 LS보다 빠르게 해리되는 것 (ELISA 결과와 일치)으로 보아 반감기 증가 효과를 기대할 수 있음을 예상하였고(도 13), 실제 인간 FcRn Tg 마우스에서 체내 약동학실험을 진행하였다.

실시예 10. 일반 B6 마우스와 hFcRn Tg 마우스에서 상업용 및 연구실 제작 트라스트주맙 생체 내( in vivo ) PK 실험비교 분석

인간 FcRn Tg 마우스와 유전적 background가 동일한 B6 일반 마우스(중앙실험동물센터, C57BL/6J(B6))에서의 PK분석 결과, 논문에서 보고된 것과 같이 일반 마우스 FcRn과 인간 항체의 Fc와의 친화력이 인간 FcRn과 인간항체 Fc보다 높게 나옴을 확인하였다. 그러나, 일반 마우스에서의 PK값은 연구실 제작 및 상업용 항체간의 variation이 보였고 연구실 제작 항체가 unstable해 보였으나, Tg 마우스(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Prkdcscid Tg(Jackson lab, CAGFCGRT)276Dcr/DcrJ)에선 일반 마우스보다는 AUC가 다소 낮으나 연구실 제작 및 상업용 항체간의 약동학 경향은 비슷하게 측정됨이 확인되었다. 따라서, Tg 마우스에서의 실제 체내 약동학 분석에 HEK293에서 생산한 연구실 제작 유래 Fc 변이체들의 실험 측정에 문제가 없음을 확인하였다(도 14).

실시예 11. LS, YTE 외 두 종 변이체(PFc29 및 PFc41)등 4종에 대한 hFcRn Tg 마우스 약동학

ELISA 와 BiaCore장비로 pH 6.0 및 pH 7.4에서 측정했던 결합력 결과가 일관성 있게 나와 이를 토대로 pH 6.0 acidic 조건에서 LS 만큼 결합력이 좋고 pH 7.4에서 해리력이 LS보다 더 좋았던, PFc29와 PFc41의 2 종류를 선별하였다. 이와 동시에, 현 세계 최고라고 알려진 XenCor의 LS mutant와 MedImmune의 YTE를 대조군으로 총 4종의 트라스트주맙 Fc 변이체를 인간 FcRn Tg 마우스 20마리(각 군당 5마리씩 5 mg/kg을 I.V (미정맥)로 주사 후 facial vein에서 채혈(총 12회 → 0, 30min, 1, 6, 24hr, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50day))에서 얻어진 혈액을 이용하여 ELISA로 농도분석한 후 WinNonlin으로 non-compartmental analysis (NCA) 실시하였다. ELISA와 BiaCore 분석 결과에서 예상했던 대로, Fc 변이체 2종 (PFc29 및 PFc41) 모두 체내 반감기 증가 효과를 보여주었으며, 특히 PFc29의 경우 선행연구에서 발굴된 LS보다 높은 반감기 효과를 보였다(도 15, 표 3).

[표 3] 마우스 정맥 투여 (5 mg/kg) 후 트라스트주맙 Fc 변이체의 비구획적 약동학 파라미터 분석(Data are expressed as mean ±SD (n = 5))

t_1/2, terminal half-life; T_max, time at maximal concentration; C₀, extrapolated zero time concentration; C_max, maximal concentration; AUC_last, area under the curve from administration to the last measured concentration; AUC_inf, area under the curve from administration to infinity; AUC_%Extrap, percentage of the extrapolated area under the curve at the total area under the curve;V_z, volume of distribution; CL, clearance.

실시예 12. ELISA를 통한 Fc 변이체의 FcγRs 결합력 측정

FcγRs와의 결합력을 측정하기 위하여 0.05 M Na₂CO₃ pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk (GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST(pH 7.4) 180 μl로 4 회씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 7.4)으로 serially dilution된 FcγRs를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 FcRs는 anti-GST-HRP conjugate (GE Healthcare) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1 시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H₂SO₄ 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 각 실험은 모두 duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 각각의 FcγRs[FcγRI, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(V), FcγRIIIa(F))에 대한 결합력을 확인할 수 있었다(도 16).

실시예 13. Fc 변이체의 항체 의존성 세포-매개의 세포독성 ( ADCC )에 의한 작동체 기능 ( Effector Function) 측정

트라스트주맙 Fc 변이체의 항체 의존성 세포-매개의 세포독성 ADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 활성은 ADCC 리포터 바이오어세이 키트(reporter bioassay kit, Promega, G7010)을 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 표적 세포(Target cells)로 사용되는 SKBR-3을 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 5X10³ cells/100 ㎕ 씩 분주한 후 37℃ CO₂ 배양기에서 20시간동안 배양하였다. 20시간 경과 후 멀티 피펫을 이용하여 플레이트의 각 웰에서 95 ㎕의 배양 배지를 제거하고 ADCC 리포터 바이오어세이 키트 에서 제공된 ADCC assay buffer 25 ㎕를 각 웰에 분주하였다. Normal IgG, 트라스트주맙과 트라스트주맙 Fc 변이체는 ADCC assay buffer에 농도 별로 희석하여 준비한 후, 세포가 있는 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰당 25 ㎕씩 분주하고 효과기 세포 (effector cells)를 첨가할 때까지 상온에 두었다. 키트에서 제공하는 효과기 세포는 37℃ 항온수조에서 2-3분간 녹인 후 630 ㎕를 취하여 ADCC assay buffer 3.6 mL과 혼합하였다. 표적 세포와 항체 희석물을 포함하는 플레이트에 준비된 효과기 세포를 웰당 25 ㎕씩 분주한 후 37 ℃ CO₂ 배양기에서 6시간 동안 반응시켰다. 시간이 경과되면 플레이트를 꺼내 15분간 상온에 둔 후, Bio-Glo^TMLuciferase assay reagent를 웰 당 75 ㎕ 씩 첨가하고 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 루미노미터(luminometer, Enspire multimode plate reader)를 이용하여 각 웰의 루미네센스(luminescence)를 측정하였다. 각 시험 항체들의 ADCC 활성도는 실험한 결과의 평균값을 Fold induction으로 표시하였고, 다음 식을 사용하여 결정되었다:

Fold induction =

RLU(induced¹-background²)/RLU(noantibodycontrol³-background)

1.induced: 표적세포, 시험 항체 그리고 효과기 세포가 혼합된 시료로부터 획득된 RLU 값

2. background: ADCC assay buffer에서 획득한 RLU 값

3. no antibody control: 표적세포와 효과기 세포만 혼합된 시료에서 획득한 RLU 값.

SKBR-3에 대한 트라스트주맙과 트라스트주맙 Fc 변이체(LS, YTE, PFC29 및 PFC41)의 ADCC 활성을 상호 비교하였다(도 17). 그 결과, 가장 높은 농도에서의 최대 활성값을 기준으로 각 시험물질의 ADCC 활성은 양성 대조물질인 트라스트주맙에 비해 LS는 약 1.5배, PFc29는 1.18배 그리고 PFc41은 1.27배 높았으나, YTE는 4.2배 낮은 활성을 보였다. 결과적으로, 트라스트주맙 Fc 변이체 2종(PFc29 및 PFc41)과 대조 변이체 LS는 기존 대조약 (Trastuzumab) 대비 1.18-1.5배 향상된 ADCC 활성을 보였다. 그러나, 다음 그림에서 보는 바와 같이 측정된 변이체 각각의 EC50 값을 보았을 때, 대조군 LS (EC50=0.05575 ug/mL) 보다 본 발명에서 찾은 Fc 변이체 PFc29 (EC50=0.04543 ug/mL)와 PFc41 (EC50=0.05405 ug/mL)가 더 안정된 효능을 보임을 확인하였다(도 18).

실시예 14. ELISA를 통한 Fc 변이체의 C1q 결합력 측정

C1q와의 결합력을 측정하기 위하여 0.05 M Na₂CO₃ pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST(pH 7.4) 180 μl로 4 회씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 7.4)으로 serially dilution된 Complement C1q Human (Millipore)를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 anti-C1qHRP conjugate(Invitrogen) 50 μl 씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl 씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H₂SO₄ 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 분석 결과 C1q 결합력이 선행연구에서 발굴된 LS와 YTE 보다 본 연구에서 발굴한 PFc29이 높은 결합력을 보였다(도 19).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation Osong Hi-Tech Medical Industry Promotion Foundation <120> Antibody Fc variants for Prolonged Serum Half-Life <130> HP7178 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMopac12-seq-Fw <400> 1 ccaggcttta cactttatgc 20 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-1-Rv <400> 2 cctcaggggt ccgggagatg wagagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-2-Rv <400> 3 cctcaggggt ccgggagatk nbgagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M252-3-Rv <400> 4 cctcaggggt ccgggagatc cagagggtgt ccttgggttt tggg 44 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-Fw <400> 5 atctcccgga cccctgagg 19 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-M428-1-Rv <400> 6 gtagtggttg tgcagagcct catggwacac ggagcatgag aagacgttcc 50 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Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 29 <211> 681 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681

Claims (12)

1. 인간 IgG 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 Fc 변이체는 야생형(wild type)과 비교하여 반감기(Half-life)가 증가된 것이며, 상기 반감기의 증가는 야생형 인간 항체 Fc 도메인에서 일부 아미노산의 치환에 의하며, 상기 일부 아미노산의 치환은 카밧 넘버링 시스템 (Kabat numbering system)에 따른 하기의 아미노산 치환으로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드:
   a) M428L; 및
   b) Q311R.
   
2. 삭제
3. 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
   
4. 제 3 항에 있어서 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
   
5. 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
   
6. 제 5 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
   
7. 제 6 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
   
8. 삭제
9. 하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 인간 IgG 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법:
   a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
   b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
   
10. 하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 IgG 항체의 제조방법:
    a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.
    
11. 삭제
12. 삭제

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