KR20230041219A - 선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들 - Google Patents

선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들 Download PDF

Info

Publication number
KR20230041219A
KR20230041219A KR1020210124556A KR20210124556A KR20230041219A KR 20230041219 A KR20230041219 A KR 20230041219A KR 1020210124556 A KR1020210124556 A KR 1020210124556A KR 20210124556 A KR20210124556 A KR 20210124556A KR 20230041219 A KR20230041219 A KR 20230041219A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
val
lys
leu
pro
ser
Prior art date
Application number
KR1020210124556A
Other languages
English (en)
Inventor
정상택
조미경
김수연
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020210124556A priority Critical patent/KR20230041219A/ko
Priority to PCT/KR2022/013481 priority patent/WO2023043124A1/ko
Publication of KR20230041219A publication Critical patent/KR20230041219A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된 당화 Fc 변이체에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체들은 종래의 항체 치료제로서 승인받은 항체들보다 면역 저해 수용체인 FcγRⅡb와의 결합력이 감소되고, 면역 활성화 수용체인 FcγRⅢa와의 결합력이 향상되어 (A/I 비율 증가), 현저히 향상된 ADCC 유도능을 가지며, 치료용 단백질 의약품의 면역 작용 기작을 극대화할 수 있는 효과가 있으므로 항체 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들{Glycosylated Fc variants with improved binding selectivity to Fc gamma receptor IIIa}
본 발명은 FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된 당화 Fc 변이체에 관한 것이다.
전 세계적으로 유전자 재조합, 세포 배양 등 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 이는 생명현상에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라, 각종 질병들의 발병 기작을 규명하는데 결정적 역할을 함으로써 효과적인 질병 진단과 치료의 길을 마련해 삶의 질 향상에 크게 기여 하고 있다. 특히, 1975년에 B 세포(B Cell)와 골수암 세포(Myeoloma cell)를 융합하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술(Hybridoma technology)이 개발(Kohler and Milstein, Nature , 256:495-497, 1975)되면서 암, 자가면역질환, 염증, 심혈관 질환, 감염 등의 임상 분야에서 치료용 항체를 이용한 면역 치료(Immunotherapy)에 대한 연구 개발이 활발히 이루어지고 있다
항체는 체액성 및 세포성 면역계 사이의 연결고리를 제공하며, 항체의 Fab 영역이 항원을 인식하는 반면, Fc 도메인 부분은 모든 면역 적격 세포에 의해 차별적으로 발현되는 세포 상의 항체(면역글로불린)에 대한 수용체 (Fc 수용체 또는 FcR)에 결합한다. 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합함으로써 Fc 영역을 통해 세포에 결합하며, 항체가 세포 표면 상의 Fc 수용체에 결합하면 항체-코팅 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 살세포에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해 (항체-의존적 세포-매개 세포독성, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity 또는 ADCC), 염증 매개체의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생성의 제어를 포함하여 중요하고도 다양한 여러 생물학적 반응을 촉발한다 (Deo, Y.M. et al., Immunol. Today 18(3):127-135 (1997)). 이와 같이, Fc 도메인은 면역세포의 모집과 ADCC 및 ADCP(antibody dependent cellular phagocytosis)에 결정적인 역할을 하며, 특히, 항체의 작용기 기능(effector function)인 ADCC 및 ADCP 기능은 많은 세포의 표면에 존재하는 Fc 수용체와의 상호작용에 의존한다. 사람의 Fc 수용체는 5가지로 분류되며, 항체가 어떠한 Fc 수용체에 결합되는지에 따라 모집되는 면역세포의 종류가 결정된다. 따라서, 특정한 세포를 모집할 수 있도록 항체를 변형하는 시도는 치료 분야에 있어서 매우 중요하다고 할 수 있다.
치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴(Herceptin), 아바스틴(Avastin), 리툭산(Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다.
현재 의약품으로서 항체의 작용은 항원과 결합하여 항원의 작용을 저해하는 직접적인 방식과, 항원과 결합한 항체의 Fc 감마 부위와 Fc 감마 수용체(Fc gamma receptor, FCGR)를 가지는 효과세포(자연살해세포, 대식세포 등)에 의한 간접적인 항원제거 방식이 있다. 최근 개발 중인 항체 치료제의 경우, 항원과의 결합으로 인한 항원의 작용을 막음과 동시에 항체의 Fc 감마 부위를 효과세포가 인식하여 공격 및 제거하는 ADCC 기전으로 약제의 효과를 높이고 있다. 최근 ADCC와 관련된 연구로, Fc 감마 부위 수용체의 유전자형에 따라 Fc 감마와 Fc 감마 수용체의 결합력에 영향을 주는 것으로 밝혀졌으며, 항체 기반 치료제의 효율이 환자의 Fc 감마 수용체인 FCGR2A 단백질(FcγRⅢa)의 131번째 아미노산과 FCGR3A 단백질의 158번째 아미노산의 아미노산 서열의 다양성에 따라 달라진다는 다수의 연구가 발표되었다. 일 예로 유방암 치료제인 허셉틴(trastuzumab)의 경우 전임상 연구에서 FCGR2A 131 H/H 혹은 FCGR3A 158 V/V 유전자형에서 항체 의존성 세포독성이 유의적인 차이를 보이며 증가하였다는 연구가 2008년에 Musolino등에 의하여 보고되었다. 그러나, 포유동물의 항체의 Fc 부위 변형에 의해 특정 Fc 수용체에 대한 결합력이 증가되지만, 다른 Fc 수용체에 대한 결합력도 유지를 하기 때문에 바람직하지 않은 면역반응을 여전히 유지하는 문제가 있다. 인간의 5 종류의 주요 FcγR 중 4가지는 면역 활성화 또는 염증 반응을 유도하고, FcγRⅡb는 면역 저해 또는 항염증 반응을 유도하는데, 대부분의 자연적으로 생산된 항체 또는 재조합된 당화 항체는 활성화 및 저해 Fc 수용체에 모두 결합을 한다. ADCC를 통해 치료용 IgG 항체의 암세포 사멸 효능을 가장 강력하게 유도하는 면역세포는 자연살해세포(NK 세포)로 NK 세포는 다른 면역세포들(예를 들어,　monocytes, macrophages, dendritic cells 등)과는 달리 표면에 FcγRⅢa를 발현하고, FcγRI과 FcγRⅡa, FcγRⅡb 및 FcγRⅢb는 발현하지 않기 때문에 암세포 사멸 작용기작을 극대화하기 위해서는 IgG 항체의 Fc 부위의 최적화를 통해 NK 세포 표면에 발현되는 FcγRⅢa와의 친화도를 향상시키는 것이 필수적이다. 또한. NK 세포 뿐만 아니라 혈액에 존재하는 다양한 면역 세포들의 복합적인 면역 반응을 고려하면 항체의 Fc 도메인이 활성화 FcγR에 결합하는 능력 (A)과 저해 FcγRⅡb에 결합하는 능력 (I)의 비율(A/I ratio)이 높을수록 우수한 ADCC 유도능을 보이기 때문에 저해 수용체인 FcγRⅡb 결합력 대비 활성화 수용체 결합력을 선택적으로 높이는 것이 매우 절실한 실정이다 (Boruchov et al, J Clin Invest, 115(10):2914-23, 2005). 하지만, FcγRⅡb는 활성화 FcγR와 96%의 상동성을 갖는 문제로 인하여, 당화항체에 유전적 돌연변이를 도입하여 A/I ratio를 증가시키기 위한 노력은 큰 결실을 거두지 못하고 있다.
본 발명의 목적은 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체들을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 특정 Fc 감마 수용체에 특이적인 당화 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 Fc 도메인 변이체, 또는 상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 벡터, 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된 당화 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 특정 Fc 감마 수용체와의 선택적 결합력이 증대된 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체들을 제공
또한, 본 발명은 상기 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체를 포함하는 당화 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공
또한, 본 발명은 상기 Fc 도메인 변이체, 또는 상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 벡터, 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Fc 도메인 변이체, 또는 상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된 당화 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체들은 종래의 항체 치료제로서 승인받은 항체들보다 면역 저해 수용체인 FcγRⅡb와의 결합력이 감소되고, 면역 활성화 수용체인 FcγRⅢa와의 결합력이 향상되어 (A/I 비율 증가), 현저히 향상된 ADCC 유도능을 가지며, 치료용 단백질 의약품의 면역 작용 기작을 극대화할 수 있는 효과가 있으므로 항체 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 공지된 돌연변이들의 단순조합으로 구성된 4종의 트라스트주맙 Fc 변이체들 (XMa, XMt, MM 및 XMM) (A) 및 FcγRⅡb-GST 단백질 (B)을 고순도 정제한 후 SDS-PAGE 젤로 확인한 도이다.
도 2는 정제된 트라스트주맙 Fc 변이체들 (트라스트주맙-XMa, XMt, MM 및 XMM)의 FcγRⅡb 결합력을 분석한 ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 당화 Fc의 포유류 세포 디스플레이 기술에 대한 개략도를 나타낸 도이다.
도 4는 고순도로 정제된 사합체 FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅢa-158F-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅡb-스트렙타비딘, FcγRⅢa-158V-GST 및 FcγRⅢa-158F-GST을 SDS-PAGE 젤로 확인한 도이다.
도 5는 형광 표지된 사합체 FcγRⅢa-Alexa488, 사합체 FcγRⅢa-Alexa647 및 Protein A-FITC와 CHO 세포 발현 야생형 Fc 또는 Fc-T299L의 결합 활성을 분석한 도이다.
도 6은 당화 Fc 엔지니어링을 위한 셔플(shuffle) 라이브러리의 개략도를 나타낸 도이다.
도 7은 CHO 세포 디스플레이를 이용한 당화 Fc 엔지니어링 모식도 및 스크리닝 결과 확보한 당화 Fc 변이체의 돌연변이들의 유전자 로고(gene logo)를 나타낸 도이다.
도 8은 모델 항체인 트라스트주맙 중쇄 유전자에 당화 Fc 변이체들을 클로닝하여 발현 백터를 트랜스펙션하여 배양한 Expi293F 세포 배양액을 이용하여 FcγRⅢa 결합력을 분석한 ELISA 결과 및 발굴한 Fc 변이체들의 돌연변이 서열을 나타낸 도이다.
도 9는 높은 FcγRⅢa 결합력을 보이는 당화 Fc 변이체가 포함된 트라스트주맙 Fc 변이체들 (PS101, PS102, PS105, PS106, PS107, PS205, PS207, PS301, PS303 및 PS305)을 정제한 후 SDS-PAGE 젤로 확인한 도이다.
도 10 및 11은 선별한 당화 트라스트주맙 Fc 변이체들 (PS101, PS102, PS105, PS106, PS107, PS205, PS207, PS301, PS303 및 PS305)의 FcγRⅢa-158V, FcγRⅢa-158F 및 FcγRⅡb와의 결합력을 ELISA로 분석한 도이다.
도 12는 본 발명의 트라스트주맙 Fc 변이체들 (PS101, PS102, PS105, PS106, PS107, PS205, PS207, PS301, PS303 및 PS305), 및 기존에 B-세포 림프종 및 유방암 치료제로 US FDA 승인을 받은 당화 항체인 tafasitamab 및 margetuximab의 Fc가 각각 도입된 트라스트주맙 Fc 변이체 DE 및 VLPLL의 FcγRⅢa-158V, FcγRⅡb, FcγRⅢa-158F 또는 FcγRⅡb에 대한 결합 경향성을 비교 분석한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.
일 측면에서, 본 발명은 야생형(Wild type) 인간 항체 Fc 도메인에서, 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링된 222, 224, 239, 243, 247, 252, 292, 300, 303, 305, 330, 332, 339, 356, 361, 387, 396, 405 및 415 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 243, 247, 292, 300, 305, 330, 332, 339, 387, 396 및 415 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 K222N, H224R, S239D, F243L, P247I, M252V, R292P, Y300L, V303I, V305I, A330L, I332E, A339Q, D356G, N361D, P387Q, P396L, F405L 및 S415G로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F243L, P247I, R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q, P387Q, P396L 및 S415G로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체는 서열번호 22 내지 35의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는 PS105일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F243L, P247I, R292P, A330L, I332E, A339Q, P396L, S415G의 아미노산 치환을 포함하는 PS207일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F243L, P247I, R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는 PS101일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 H224R, F243L, P247I, R292P, Y300L, V303I, V305I, A330L, I332E, A339Q 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는 PS102일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F243L, P247I, R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q, D356G 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는 PS107일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F243L, P247I, M252V, R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q, D356G 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는 PS106일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F243L, P247I, R292P, Y300L, A330L, I332E 및 P396L의 아미노산 치환을 포함하는 PS205일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 K222N, F243L, P247I, R292P, Y300L, V305I, A330L 및 I332E의 아미노산 치환을 포함하는 PS301일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 S239D, P247I, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q, N361D 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는 PS303일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 S239D, R292P, Y300L, A330L, A339Q, P387Q 및 F405L의 아미노산 치환을 포함하는 PS305일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 FcγRⅢa와의 결합력이 향상되고, FcγRⅡb와의 결합력이 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체는 향상된 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 유도능을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 인간 항체 (면역글로불린)가 IgA, IgM, IgE, IgD 또는 IgG, 또는 이들의 변형일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있고, 항-HER2 항체인 것이 바람직하고, 트라스트주맙인 것이 더욱 바람직하다. 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 도메인과 1개의 Fc 도메인을 형성하며, 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys 226의 N-말단을 파파인 분해함으로써 생성된다 (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).
일 구현예에서, 야생형 인간 항체 Fc 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 36의 핵산분자로 코딩될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 영역에서 아미노산의 변이를 포함하는 변이체는 모 항체 Fc 영역을 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의되고, 통상의 항체 넘버링은 카밧에 의한 EU 인덱스에 따른다 (Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991).
본 발명에서 사용된, 용어 "Fc 도메인 변이체"는 "Fc 변이체"와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "야생형 (wild-type) 폴리펩타이드"는 후에 변형되어 유도체를 생산하는 비변형 폴리 펩타이드를 의미한다. 야생형 폴리펩타이드는 자연에서 발견되는 폴리펩타이드 또는 자연에서 발견되는 폴리펩타이드의 유도체 또는 조작된 것일 수 있다. 야생형 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 그 자체, 상기 야생형 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 이를 코딩하는 아미노산 서열을 언급하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 용어 "야생형 항체"는 아미노산 잔기가 변형되어 유도체를 생성하게 되는 비변형된 항체 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 용어와 호환적으로, 아미노산 변형이 도입되어 유도체를 생성하게 되는 비변형된 항체 폴리펩타이드를 의미하는 "모(parent) 항체"이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "아미노산 변형/변이"는 폴리펩타이드 서열의 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 치환을 의미한다. 본 발명에서 사용된, 용어 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 야생형 인간 항체 Fc 도메인의 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서의 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 예를 들면, T299A 치환을 포함하는 Fc 변이체는 야생형 항체의 Fc 도메인의 아미노산 서열에서 299번째 아미노산 잔기인 트레오닌이 류신으로 대체된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Fc 변이체"는 야생형 항체 Fc 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 Fc 변이체는 야생형 항체 Fc 도메인 (영역 또는 단편)과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 그로 인해 아미노산 서열에 있어 차이를 갖는다. 본 발명에 따른 Fc 변이체의 아미노산 서열은 야생형 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 상동하다. 예를 들면, 본 발명에 따른 Fc 변이체의 아미노산 서열은 야생형 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 가질 것이다. 아미노산 변형은 분자생물학적 방법을 사용하여 유전적으로 수행될 수 있거나, 또는 효소적 또는 화학적 방법을 이용하여 수행될 수도 있다.
본 발명의 Fc 변이체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 인간 항체의 Fc 변이체는 특정 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 코딩한 후, 원하는 경우, 숙주세포 내로 클로닝되고, 발현 및 검정되는 핵산 형성에 이용된다. 이를 위한 다양한 방법이 문헌 (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons)에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 Fc 변이체를 코딩하는 핵산은 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어(regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명에 따른 Fc 변이체를 코딩하는 핵산 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명에 따른 Fc 변이체가 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 하여 본 발명에 따른 Fc 변이체를 생산한다.
따라서, 본 발명의 범위에는 Fc 변이체를 코딩하는 핵산이 도입된 숙주세포를 단백질 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 숙주세포로부터 발현된 Fc 변이체를 정제 또는 분리하는 단계를 포함하는 Fc 변이체의 제조방법이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 항체는 당화 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 13의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 중쇄 불변 영역 도메인 2(CH2) 및 서열번호 14 내지 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 중쇄 불변 영역 도메인 3(CH3)를 포함할 수 있으며, 서열번호 5 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 도메인 2(CH2) 및 서열번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 도메인 3(CH3)를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 효과기 작용을 증가시킬 수 있으며, 야생형 Fc 도메인과 비교하여 FcγRⅢa와의 결합력이 향상되고 FcγRⅡb와의 결합력이 감소됨으로써 높은 FcγRⅢa 결합 선택성을 가져 A/I 비율이 높은 특성을 가지므로, 항체-매개성 세포독성작용(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)이 증가될 수 있다.
본 발명에서, A/I 비율은 항체의 Fc 도메인이 활성화 FcγR에 결합하는 능력(A)과 저해 FcγRⅡb에 결합하는 능력(I)의 비율(A/I ratio)로서, A/I 비율이 높을수록 우수한 ADCC 유도능을 보이기 때문에 저해 수용체인 FcγRⅡb 결합력 대비 활성화 수용체 결합력을 선택적으로 높이는 것이 중요하다.
일반적으로, 포유동물이 발현하여 당화(glycosylated)되어 있는 당화 항체는 Fc 부위에 수식된 당 사슬에 의해 단백질의 구조가 안정화되어 항체가 Fc 수용체에 결합할 수 있지만, 모든 FcγR에 대한 결합력을 가지기 때문에 면역 반응 활성화와 동시에 저해가 나타나는 문제가 있어왔으며, 이와 반대로, 박테리아에서 생산되는 무당화(aglycosylated) 항체는 Fc 부위에 결합된 탄화수소 사슬이 없기 때문에 Fc 수용체에 결합을 하지 못하여 ADCC 기능을 나타낼 수 없는 문제가 있으나, 본 발명의 항체는 '무당화' 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이기 때문에 선택적으로 FcγR에 대한 결합력을 향상시켜 면역 반응을 조절할 수 있는 효과가 있다.
항체는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법으로 분리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제방법은 크로마토그래피 기술, 전기영동, 면역, 침강, 투석, 여과, 농축, 및 크로마토포커싱 (chromatofocusing) 기술을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 박테리아 단백질 A, G, 및 L과 같은 다양한 천연 단백질이 항체와 결합하며, 상기 단백질은 정제에 이용될 수 있다. 종종, 특정 융합 파트너에 의한 정제가 가능할 수 있다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.
상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1 , CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명에서 용어, "Fc 도메인", "Fc 단편" 또는 "Fc 영역"은 Fab 도메인/단편과 함께 항체를 이루며, Fab 도메인/단편은 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과, 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어지고, Fc 도메인/단편은 중쇄의 두 번째 불변 영역(CH2) 및 세 번째 불변 영역(CH3)로 이루어진다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 Fc 변이체를 코딩하는 핵산분자는 37 내지 50의 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 이를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 분자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
본 발명에 따른 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어 (regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 생산할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있으며, 동물 세포주는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포일 수 있고, 박테리아는 대장균일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 치료제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 Fc 도메인 변이체 또는 이를 포함하는 단백질 결합체에 인간의 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 싸이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체가 결합되어 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 Fc 도메인 변이체 또는 이를 포함하는 단백질 결합체에 항체 약물이 결합될 수 있으며, 암 치료용 항체 약물은 트라스투주맙(Trastzumab), 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(bevacizumab), 리툭시맙(rituximab), 바실릭시맙(basiliximab), 인플릭시맙(infliximab), 이필리무맙(Ipilimumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있다.
항체 치료제에서 타깃 항원으로 면역세포들을 모집하여 전달하는 기작은 가장 중요한 기작 중 하나이며, 항체의 Fc 도메인이 면역세포의 모집과 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)에 결정적인 역할을 하므로, 본 발명의 Fc 감마 수용체에 선택적 결합력이 증가된 Fc 변이체는 치료용 항체로 이용되기에 유리하다. 특히, 항체의 ADCC 기능은 많은 세포의 표면에 존재하는 Fc감마 수용체(FcγR)와의 상호작용에 의존하며, 사람의 5가지 Fc 수용체 중 항체가 어떠한 Fc 수용체에 결합되는지에 따라 모집되는 면역세포의 종류가 결정되기 때문에 특정한 세포를 모집할 수 있도록 항체를 변형하는 시도는 치료 분야에 있어서 매우 중요하다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 높은 FcγRⅢa 결합 선택성을 가져 높은 A/I 비율을 가지므로, 자연살해세포(NK 세포)를 통해 효과기 작용을 증가시켜 항체-매개성 세포독성작용 (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 증가시킬 수 있다. 가장 강력한 암세포 사멸 효능을 가지고 있는 자연살해세포(NK 세포)는 다른 면역세포들 (예:　monocytes, macrophages, dendritic cells)과는 달리 표면에 FcγRⅢa를 발현하고, FcγRI과 FcγRⅡa, FcγRⅡb 및 FcγRⅢb는 발현하지 않으므로, 본 발명의 FcγRⅢa 결합 선택성을 가지는 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 NK 세포를 통해 암세포 사멸 작용 기작을 극대화할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역원성 세포사멸 유도제를 추가로 포함할 수 있으며, 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin) 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 탁산계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 화학적 항암 약물(항암제) 등과 함께 투여함으로써, 암세포의 사멸 효과를 통해 종래의 항암제의 암치료 효과를 증가시킬 수 있다. 병용 투여는 상기 항암제와 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 상기 항암제의 예시에는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 플리카마이신(plicamycin) 및 마이토마이신 C(mitomycin C); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 암세포의 사멸 또는 암의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 조성물의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
본 발명은 상기 Fc 도메인 변이체를 비펩타이드성 중합체를 통해 생리활성 폴리펩타이드에 공유결합으로 연결하여 지속성 약물 제제를 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 제조방법은 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 Fc 도메인 변이체를 공유결합으로 연결하는 단계; 및 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 Fc 도메인 변이체가 공유결합으로 연결된 결합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 본 발명의 Fc 도메인 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 b) 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 b) 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계를 포함하는 FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된 당화 항체의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Fc 돌연변이들의 단순 조합으로 구성된 트라스트주맙 Fc 변이체들 제작 및 분석
1-1. 단순 조합 트라스트주맙 Fc 변이체들 제작
기존에 공지된 트라스트주맙(trastuzumab) Fc 변이체들의 단순 조합에 의한 효과를 확인하기 위해 DEL 변이체 (S239D/I332E/A330L: 야생형 Fc에 비해 A/I ratio 9배 향상, B 세포 림프종 치료제(Monjuvi, Tafasitamab)로 2020년 7월 31일 US FDA 승인), LPLIL 변이체 (F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L: FcγRⅢa-158V에 대한 결합력 10배 향상) 및 IQ 변이체 (P247I/A339Q: ADCC 유도능 6배 향상)들의 단순 조합으로 구성된 Fc 변이체들을 제작하였다 (XMa: S239D/F243L/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/P396L, XMt: S239D/P247I/A330L/I332E/A339Q, MM: F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A339Q/P396L 및 XMM: S239D/F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/P396L) (표 1). 상기 Fc 변이체들을 모델 항체인 트라스트주맙의 중쇄 유전자에 클로닝하고, 경쇄 유전자와 함께 Expi293F 세포에 PEI(polyethylenimine) (Polyscience, 23966)로 co-트랜스펙션(transfection)함으로써 임시 발현을 유도하였다. co-트랜스펙션한 Expi293F 세포를 37℃, 125 rpm 및 8%　CO2 조건에서 7일간의 배양 후, 배양액을 회수하여 PBS로 평형을 맞춘 다음 Protein A 친화도 크로마토그래피를 통해 트라스트주맙 Fc 변이체들을 정제하였다 (도 1A).
1-2. FcγRⅡb-GST 생산
면역 반응을 하향 조절(down-regulation)하여 ADCC 활성을 약화시키는 역할을 하는 Fc 수용체인 FcγRⅡb에 대한 단순 조합 트라스트주맙 Fc 변이체들의 결합력을 확인하기 위해 FcγRⅡb-GST를 생산하였다. 구체적으로, GST가 FcγRⅡb의 C-말단에 융합된 유전자가 동물세포 발현용 벡터에 클로닝되어 있는 플라스미드를 PEI를 이용해 Expi293F 세포에 트랜스펙션한 뒤 37℃, 125 rpm 및 8%　CO2 조건에서 7일간 임시발현을 진행하였다. 그런 다음, 세포 배양액을 회수한 뒤, PBS로 평형을 맞추고, anti-GST 친화도 크로마토그래피를 통해 고순도의 FcγRⅡb-GST을 확보하였다 (도 1B).
1-3. 단순 조합 트라스트주맙 Fc 변이체들의 FcγRⅡb 결합력 분석
상기 실시예 1-1에서 정제하여 준비한 트라스트주맙 Fc 변이체들 (XMa, XMt, MM 및 XMM)의 FcγRⅡb에 대한 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 진행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 FcγRⅡb-GST를 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96웰 마이크로플레이트 (Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후 100 μl의 4% 스킴밀크 (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 그 후, 0.05% PBST 180 μl로 4회씩 세척하고 1% 스킴밀크로 희석하여 준비한 상기 실시예 1-1의 당화 트라스트주맙 Fc 변이체들을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이를 세척한 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl씩 첨가하여 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척하였다. 그 후, 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가하여 발색한 뒤 2 M H2SO4을 50 μl씩 처리하여 반응을 종료시키고 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다. 그 결과, 공지된 돌연변이들의 단순 조합으로 구성된 트라스트주맙 Fc 변이체들이 각각 B-세포 림프종 및 Her2 양성 유방암 치료제로 US FDA 승인을 받은 ADCC 향상 당화 Fc 변이체들 (B 세포 림프종 치료제(Monjuvi, Tafasitamab)로 2020년 7월 31일 US FDA 승인받은 DE (S239E/I332E) 및 Her2 양성 유방암 치료제(Margenza, Margetuximab)로 2020년 12월 16일 US FDA 승인받은 VLPLL (L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L))보다 현저히 높은 FcγRⅡb 결합력을 가지는 것으로 나타나 (도 2), ADCC 활성 유도에 부정적 영향을 끼칠 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 당화 Fc 변이체 스크리닝을 위한 포유류 세포 디스플레이 시스템 구축
ADCC 유도능을 극대화할 수 있는 Fc 돌연변이들의 최적의 조합을 찾고 새로운 당화 Fc 변이체를 발굴하기 위해 Fc 라이브러리를 제작하였다. 구체적으로, 당화 Fc를 포유류 세포 표면에 디스플레이하고 안정적으로 스크리닝하기 위해 스테이블 세포주(stable cell line) 제작에 활용되는 FLP-FRT 유전자 재조합(gene recombination) 시스템을 활용하였으며, 세포막에 디스플레이하기 위해 Fc의 C-말단에 PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor) 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인을 융합하였다. Fc-PDGFR 유전자는 FRT 사이트(site)가 삽입되어 있는 pcDNA5/FRT 플라스미드(Invitrogen, V601020)에 클로닝하여 준비하였다. 해당 플라스미드를 유전자 재조합을 일으키는 효소인 FLP를 발현하는 pOG44플라스미드 (Invitrogen, V600520)와 함께 FRT 사이트가 삽입된 CHO 세포 (Invitrogen, R75807)에 co-트랜스펙션하여 유전자 재조합을 유도함으로써 CHO 세포의 염색체 DNA(chromosomal DNA)에 Fc-PDGFR DNA가 통합(Integration)되어 당화 Fc 안정적 발현 CHO 세포주가 제작되었다 (도 3). 이 때 트랜스펙션 후 유전자 통합이 일어난 CHO 세포들만 선별하기 위해 하이그로마이신(hygromycin)-B 저항성 유전자를 함께 통합되도록 하였으며, 500 μg/ml의 하이그로마이신-B (Invitrogen, 10687010)를 처리함으로써 당화 Fc 안정적 발현 CHO 세포주를 선별하여 당화 Fc 변이체 스크리닝을 위한 포유류 세포 디스플레이 시스템을 구축하였다.
실시예 3. 결합력 분석을 위한 FcγRs 제작
3-1. 발현 및 정제
확립된 당화 Fc의 CHO 세포 디스플레이 시스템 및 Fc 라이브러리 안정적 발현 세포주를 FACS 스크리닝하고, 발굴할 Fc 변이체들의 FcγRs 결합력을 분석하기 위해 FcγRⅢa 및 FcγRⅡb를 제작 및 생산하였다. FcγRs 중 FcγRⅢa 및 FcγRⅡb는 Fc와의 결합력이 낮은 저친화성 수용체(low affinity receptor)로 알려져 있기 때문에 각 수용체의 C-말단에 스트렙타비딘(streptavidin)을 융합하여, Fc와의 가시적 결합 친화도를 향상시켜 효율적인 FACS 스크리닝이 가능한 사합체(tetrameric) FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘-His, 사합체 FcγRⅢa-158F-스트렙타비딘-His 및 사합체 FcγRⅡb-스트렙타비딘-His를 제조하였다. 또한, 발굴할 당화 Fc 변이체들의 FcγRs 결합력을 ELISA로 분석하기 위해, FcγRⅢa-158V-GST 및 FcγRⅢa-158F-GST를 제작하였다. 각각의 단백질들은 동물세포 발현용 벡터에 클로닝하여 준비한 다음, PEI를 이용해 Expi293F 세포에 트랜스펙션한 뒤, 37℃, 125 rpm 및 8%　CO2 조건에서 7일간 배양하여 얻었다. 배양 후, 상등액을 회수하여 PBS로 평형을 맞추고 Ni-NTA(Anti-His) 또는 anti-GST 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 그 결과, 고순도의 사합체 FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅢa-158F-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅡb-스트렙타비딘, FcγRⅢa-158V-GST 및 FcγRⅢa-158F-GST가 정제되었다 (도 4).
3-2. 기능 검증
상기 실시예 3-1에서 제작 및 생산한 단백질들 중 FACS 스크리닝을 위해 준비한 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘은 Alexa488(Invitrogen, A10235) 및 Alexa647(Invitrogen, A20173)의 형광 염료(dye)를 표지하여 무형광 사합체 FcγRⅡb-스트렙타비딘와의 경쟁적 결합을 통한 Fc 변이체들의 선별(sorting)이 가능하도록 준비하였으며, 디스플레이된 Fc 변이체들의 발현 여부 및 레벨을 확인하기 위해 FcγRs와 결합부위가 겹치지 않는 Protein A (Amicogen, 1070020)에 FITC (Invitrogen, F6434)를 컨쥬게이션(conjugation)하여 준비하였다. 형광 염료들 (alexa488, Alexa647 및 FITC)의 컨쥬게이션은 각각의 제조사에서 제공한 메뉴얼에 따라 수행하였다. 형광 표지된 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘-Alexa488, 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘-Alexa647 및 Protein A-FITC를 각각 CHO 세포에 디스플레이 된 야생형 Fc 및 FcγRs 결합력이 제거된 Fc 변이체 (Fc-T299L)에 결합 유도한 뒤 활성을 확인하였다.
그 결과, Protein A-FITC 결합에 의한 형광 신호를 통해 Protein A-FITC가 정상적인 활성을 가지며, CHO 세포에 디스플레이된 야생형(wild-type) Fc 및 Fc-T299L이 안정적으로 발현되어 서로 유사한 발현 수준을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5). 또한, 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘-Alexa488 및 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘-Alexa647 역시 야생형 Fc에는 정상적으로 결합하고, FcγRs 결합력이 제거된 Fc 변이체인 Fc-T299L에는 결합하지 않는 것으로 나타나 (도 5), Alexa488/647 형광 표지 FcγRⅢa 역시 우수한 활성을 가지며, CHO 세포에 디스플레이 된 Fc들이 정상적으로 발현되고 각각의 기능을 수행하는 것을 성공적으로 검증하였다.
실시예 4. 포유류 세포 디스플레이를 이용한 FcγRⅢa 선택적 결합력 향상 당화 Fc 변이체 라이브러리 구축
확립된 CHO 세포 Fc 디스플레이 시스템을 통해 당화 Fc를 엔지니어링하고, FcγRⅢa 결합력이 향상된 당화 Fc 변이체를 선별하기 위해 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리를 이용하여 DEL 변이체, LPLIL 변이체 및 IQ 변이체의 돌연변이들을 셔플링(shuffling)하여 FcγRⅢa 결합을 극대화할 수 있는 최적의 돌연변이 조합을 탐색하였다 (도 6). 라이브러리 유전자는 상기 실시예 2에서 확립한 Fc 안정적 발현 포유류 세포주 제조 방법과 동일한 방법으로 FLP 발현 플라스미드와 co-트랜스펙션한 후 하이그로마이신-B 배지를 이용한 선별 과정을 거쳐 당화 Fc 변이체 라이브러리 안정적 발현 CHO 세포주를 제작하였다.
실시예 5. 포유류 세포 디스플레이를 이용한 FcγRⅢa 선택적 결합력 향상 Fc 변이체 선별
상기 실시예 2에서 확립한 CHO 세포 Fc 디스플레이 시스템 및 상기 실시예 4에서 확립한 Fc 라이브러리 안정적 발현 CHO 세포주를 이용하여, FcγRⅢa 결합력이 향상된 당화 Fc를 선별하기 위해, 라이브러리 안정적 발현 CHO 세포주에서 FcγRⅢa-Alexa647, Protein A-FITC 또는 FcγRⅢa-Alexa647과 무형광 FcγRⅡb, Protein A-FITC의 결합을 유도한 뒤, Protein A-FITC에 의한 발현 수준과 FcγRⅢa 결합을 동시에 모니터링하여 1R의 FACS 선별을 수행하였다. 이로써 우수한 FcγRⅢa 결합력 및 선택성을 보일 것으로 예상되는 세포 집단(population)을 선별하였고, 선별된 당화 Fc 변이체 발현 CHO 세포들을 유전체 DNA(genomic DNA) 프렙(prep.)을 통해 회수한 뒤, 염기서열을 확인하여 최종적으로 조작된(engineered) 당화 Fc 변이체들을 선별하였다 (도 7).
실시예 6. 트라스트주맙 Fc 변이체들의 FcγRⅢa 결합력 분석
당화 Fc 변이체들을 발현 및 정제하기 위해, 모델 항체인 트라스트주맙 중쇄 유전자에 클로닝하여 발현 백터를 제조하였다. 구체적으로, Freestyle293 발현 배양액 (Gibco, 12338-018) 3 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 1:1의 비율로 먼저 섞고, PEI(polyethylenimine) (Polyscience, 23966) 및 변이체 유전자를 4:1의 비율로 섞어 상온에서 20분간 인큐베이션한 뒤, 2x106 cells/ml의 밀도로 30 ml 계대배양한 Expi293F 세포에 섞어 shaking CO2 인큐베이터에서 37℃, 125 rpm 및 8%　CO2의 조건으로 7일간 배양한 후 원심분리하여 상등액만 취하였다. 상등액은 25×PBS로 평형을 맞춘 후 0.2 μm 시린지 필터로 여과하였다. Her2 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain)을 4℃에서 하룻밤 동안 코팅해 둔 high binding 96웰 플레이트 (Costar, 3590)에 상기 여과한 트라스트주맙 Fc 변이체 발현 배양액을 50 μl씩 넣어 1시간 동안 고정화하였다. 그 후, 100 μl의 4% 스킴밀크 (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회씩 세척한 뒤 1% 스킴밀크에 20 μg/ml 및 0.02 μg/ml의 FcγRⅢa-GST를 각각 50 μl씩 각 웰에 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 고트 항-GST-HRP (GE Healthcare, RPN1236V) 50 μl을 각각 처리하여 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4을 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료시킨 다음, Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에서 개발한 신규한 Fc 변이체들 중 PS301, PS303, PS305, PS205, PS207, PS101, PS102, PS105, PS106 및 PS107 (표 1)이 Her2 양성 유방암 치료제로 승인 받은 기존에 공지된 마르게툭시맙(margetuximab)인 VLPLL 변이체와 유사하거나 현저히 높은 FcγRⅢa 결합력을 가지는 것을 확인하였다 (도 8).
# 돌연변이
PS301 K222N/F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E
PS303 S239D/P247I/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/N361D/P387Q
PS305 S239D/R292P/Y300L/A330L/A339Q/P387Q/F405L
PS205 F243L/P247I/R292P/Y300L/A330L/I332E/P396L
PS207 F243L/P247I/R292P/A330L/I332E/A339Q/P396L/S415G
PS101 F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/P387Q
PS102 H224R/F243L/P247I/R292P/Y300L/V303I/V305I/A330L/I332E/A339Q/P387Q
PS105 R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/P387Q
PS106 F243L/P247I/M252V/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/D356G/P387Q
PS107 F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/D356G/P387Q
XMa S239D/F243L/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/P396L
XMt S239D/P247I/A330L/I332E/A339Q
MM F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A339Q/P396L
XMM S239D/F243L/P247I/R292P/Y300L/V305I/A330L/I332E/A339Q/P396L
실시예 7. FcγRⅢa 결합력 향상 당화 트라스트주맙 Fc 변이체의 정제
상기 실시예 6에서 배양액 ELISA를 통해 높은 FcγRⅢa 결합력을 가지는 것으로 확인된 트라스트주맙 Fc 변이체들을 정제하기 위해, 변이체들에 Protein A 레진(resin)을 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 교반한 후 스핀다운(spin down)하여 레진을 회수한 후 2 ml PBS로 세척하고 300 μl의 100 mM 글라이신 pH 2.7 버퍼로 용출(elution)한 뒤, 100 μl의 1 M Tris-HCl pH 8.0을 이용하여 중화하였다. 버퍼를 바꾸기 위하여 Amicon Ultra-4 centrifugal filter units 30K (Merck Millipore, UFC503096)을 사용하였다. 그 결과, 높은 순도의 당화 항체 트라스트주맙 Fc 변이체들이 정제되었음을 확인하였다 (도 9).
실시예 8. 당화 트라스트주맙 Fc 변이체들의 FcγRⅢa 및 FcγRⅡb 결합력 ELISA 분석
상기 실시예 7에서 발현 및 정제한 당화 트라스트주맙 Fc 변이체들의 FcγRⅢa 및 FcγRⅡb에 대한 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 진행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 FcγRs-GST (FcγRⅢa-158V-GST, FcγRⅢa-158F-GST 및 FcγRⅡb-GST)를 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96웰 플레이트 (Costar, 3590)에 분주하고 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후, 100 μl의 4% 스킴밀크 (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 그 후, 0.05% PBST 180 μl로 4 회씩 세척한 뒤 1% 스킴밀크로 연속 희석된 각각의 당화 트라스트주맙 Fc 변이체들을 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 세척한 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl씩을 처리하여 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척하였다. 그 뒤, 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028) 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4을 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 당화 트라스트주맙 Fc 변이체들이 각각 B-세포 림프종 및 Her2 양성 유방암 치료제로 US FDA 승인을 받은 당화 Fc 변이체들 (DE 및 VLPLL) 및 기존에 공지된 돌연변이들의 단순 조합으로 구성된 Fc 변이체들 (XMa, XMt, MM 및 XMM)보다 현저히 높은 FcγRⅢa/FcγRⅡb 선택적 결합력을 가지는 것으로 나타났다 (도 10 및 11). 특히, 공지된 기능 향상 Fc 변이체 돌연변이들의 단순 조합이 아닌 당화 항체 Fc 변이체 거대 라이브러리 탐색으로 선별적으로 일부 돌연변이들이 추가되고 삭제되어 최적화된 돌연변이들이 포함된 Fc 변이체들이 FcγRⅢa/FcγRⅡb 선택적 결합력 유도에 매우 효과적인 것으로 나타났으며 (도 12), 이들의 결합 특성에 따라 하기 표 2와 같이 3 그룹으로 구분하였다.
Figure pat00001
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Glycosylated Fc variants with increased selectively binding to Fc gamma receptor IIIa <130> DP-2021-0705 <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS301) <400> 1 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS303) <400> 2 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS305) <400> 3 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS205) <400> 4 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS207) <400> 5 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS101, PS107) <400> 6 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS102) <400> 7 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Ile Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS105) <400> 8 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (PS106) <400> 9 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Val Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (XMa) <400> 10 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 11 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (XMt) <400> 11 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (MM) <400> 12 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 (XMM) <400> 13 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln 100 105 110 Lys <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (PS303) <400> 14 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (PS305) <400> 15 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (PS205, XMa, MM, XMM) <400> 16 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (PS207) <400> 17 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Gly Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (PS101, PS102, PS105) <400> 18 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (PS106, PS107) <400> 19 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Gly 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 (WT, PS301, XMt) <400> 20 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 21 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WT Fc <400> 21 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 22 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS301 <400> 22 Asp Asn Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 23 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS303 <400> 23 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 24 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS305 <400> 24 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 25 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS205 <400> 25 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 26 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS207 <400> 26 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Gly Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 27 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS101 <400> 27 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 28 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS102 <400> 28 Asp Lys Thr Arg Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Ile Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 29 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS105 <400> 29 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 30 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS106 <400> 30 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Val 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Gly Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 31 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PS107 <400> 31 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Gly Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Gln Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 32 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XMa <400> 32 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 33 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XMt <400> 33 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 34 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MM <400> 34 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 35 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XMM <400> 35 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Asp Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 36 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT Fc <400> 36 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 37 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS301 <400> 37 gacaatactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcctcc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcccgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 38 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS303 <400> 38 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accggacgtc 60 ttcctcttcc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgtgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 gaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 39 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS305 <400> 39 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accggacgtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcccgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccatcgaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcctcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 40 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS205 <400> 40 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctccttc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcgttctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctctggt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 41 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS207 <400> 41 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctccttc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgttctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctctggt gctggactcc 540 gacggctctt tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agggcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 42 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS101 <400> 42 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcctcc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 43 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS102 <400> 43 gacaaaactc gcacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcctcc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtgatca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 44 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS105 <400> 44 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaaaacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 45 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS106 <400> 45 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcctcc ccccaaaaat caaggacacc ctcgtgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgcgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccggggtga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 46 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PS107 <400> 46 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcctcc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcctgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccggggtga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagca ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 47 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XMa <400> 47 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accggacgtc 60 ttcctcctgc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcccgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcatcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggacga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctctggt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 48 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XMt <400> 48 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accggacgtc 60 ttcctcttcc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggacga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 49 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MM <400> 49 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcctgc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcccgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcatcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggacga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctctggt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 50 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XMM <400> 50 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accggacgtc 60 ttcctcctgc ccccaaaaat caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcccgagg agcagtacaa cagcacgctg 240 cgtgtggtca gcatcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaggaga aaaccatctc caaacagaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggacga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctctggt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681

Claims (17)

  1. 야생형(Wild type) 인간 항체 Fc 도메인에서, 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링된 243, 247, 292, 300, 305, 330, 332, 339, 387, 396 및 415 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  2. 제 1항에 있어서, F243L, P247I, R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q, P387Q, P396L 및 S415G로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  3. 제 1항에 있어서, R292P, Y300L, V305I, A330L, I332E, A339Q 및 P387Q의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  4. 제 1항에 있어서, F243L, P247I, R292P, A330L, I332E, A339Q, P396L, S415G의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  5. 제 1항에 있어서, 야생형 Fc 도메인과 비교하여 FcγRⅢa와의 결합력이 향상된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  6. 제 1항에 있어서, 야생형 Fc 도메인과 비교하여 FcγRⅡb와의 결합력이 감소된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  7. 제 1항에 있어서, 향상된 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 유도능을 가지는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
  8. 제 1항의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 항체는 당화 항체인, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  10. 제 8항에 있어서, 서열번호 5 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 도메인 2(CH2) 및 서열번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 도메인 3(CH3)를 포함하는, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
  11. 제 1항의 Fc 도메인 변이체, 또는 제 8항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자.
  12. 제 11항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  13. 제 12항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  14. 제 1항의 Fc 도메인 변이체, 또는 제 8항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. a) 제 1항의 Fc 도메인 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법.
  17. a) 제 8항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계를 포함하는 FcγRⅢa에 대한 선택적 결합력이 향상된 당화 항체의 제조방법.
KR1020210124556A 2021-09-17 2021-09-17 선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들 KR20230041219A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210124556A KR20230041219A (ko) 2021-09-17 2021-09-17 선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들
PCT/KR2022/013481 WO2023043124A1 (ko) 2021-09-17 2022-09-07 Fcγrⅲa 결합력이 향상된 당화 fc 변이체들

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210124556A KR20230041219A (ko) 2021-09-17 2021-09-17 선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230041219A true KR20230041219A (ko) 2023-03-24

Family

ID=85872737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210124556A KR20230041219A (ko) 2021-09-17 2021-09-17 선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230041219A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112996810B (zh) 针对cd20和cd3的双特异性抗体及其用途
RU2745648C2 (ru) Биспецифические белки и способы их получения
US20190002563A1 (en) Bispecific Monovalent Diabodies That are Capable of Binding B7-H3 and CD3, and Uses Thereof
CN107484416A (zh) 能够结合cd19和cd3的双特异性单价双抗体及其用途
KR20190129896A (ko) Tgf-β-수용체 엑토도메인 융합 분자 및 그의 용도
WO2021170082A1 (zh) 抗cd47/抗pd-l1抗体及其应用
KR101924485B1 (ko) 혈중 반감기 연장을 위한 항체 Fc 변이체들
KR101957431B1 (ko) 혈중 반감기 연장을 위한 항체 Fc 변이체들
KR101913743B1 (ko) 혈중 반감기 연장을 위한 항체 Fc 변이체들
KR101900384B1 (ko) Ｆｃγ 수용체에 대한 결합 특이성이 향상된 무당화 항체 Ｆｃ 영역
KR101883886B1 (ko) 암 치료용 무당화 항체 Fc 영역
CN115038721A (zh) pH敏感性Fc变体
KR101792205B1 (ko) 혈중 지속성 연장을 위한 항체 Fc 변이체들
KR20230041219A (ko) 선택적 FcγRⅢa 결합력이 증가된 당화 Fc 변이체들
KR20230041218A (ko) FcγRⅢa 결합력이 향상된 당화 Fc 변이체들
KR101792191B1 (ko) 연장된 혈중 반감기를 위한 항체 Fc 변이체들
KR20230041211A (ko) 다양한 Fc 감마 수용체들과의 결합력이 증대된 Fc 변이체
KR20230041210A (ko) Fc 감마 수용체와의 결합력이 증대된 Fc 변이체
KR20230055235A (ko) pH-의존 FcRn 결합력과 FcγRIIa 결합 선택성이 향상된 인간 IgG1 Fc 변이체
GB2571036A (en) Aglycosylated antibody fc region for treating cancer
KR20230042638A (ko) FcγRⅢa 선택적 결합력 향상 당화 Fc 변이체들
KR101872455B1 (ko) 신규한 돌연변이를 포함하는 항체 Ｆｃ 영역
WO2023043124A1 (ko) Fcγrⅲa 결합력이 향상된 당화 fc 변이체들
WO2023208014A1 (en) Antibodies binding bcma and cd3 and uses thereof
WO2023068710A1 (ko) PH-의존 FCRN 결합력과 FCγRⅢA 결합 선택성이 향상된 FC 변이체들