KR101872455B1 - 신규한 돌연변이를 포함하는 항체 Ｆｃ 영역 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체 중 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 선택적 결합력이 우수하여 암의 치료에 유용하다.

Description

신규한 돌연변이를 포함하는 항체 Ｆｃ 영역{Antibody Fc Region Comprising a New Mutation}

본 발명은 암치료에 유용한 항체 Fc 영역 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 유전자 재조합, 세포 배양 등 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 이는 생명현상에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라, 각종 질병들의 발병 기작을 규명하는데 결정적 역할을 함으로써 효과적인 질병 진단과 치료의 길을 마련해 삶의 질 향상에 크게 기여 하고 있다. 특히, 1975년에 B 세포(B Cell)와 골수암 세포(Myeoloma cell)를 융합하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술(Hybridoma technology)이 개발(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)되면서 암, 자가면역질환, 염증, 심혈관 질환, 감염 등의 임상 분야에서 치료용 항체를 이용한 면역 치료(Immunotherapy)에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.

치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴(Herceptin), 아바스틴(Avastin), 리툭산(Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다.

치료용 항체의 가장 중요한 기작 중 하나는 면역세포들을 모집하여 타깃 항원으로 전달하는 기작인데, 항체의 Fc 도메인이 면역세포의 모집과 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)및 ADCP(antibody dependent cellular phagocytosis)에 결정적인 역할을 한다. 특히, 항체의 effetor function인 ADCC 및 ADCP 기능은 많은 세포의 표면에 존재하는 Fc 수용체(FcR)와의 상호작용에 의존한다. 사람의 Fc 수용체는 5가지로 분류되며, 항체가 어떠한 Fc 수용체에 결합되는지에 따라 모집되는 면역세포의 종류가 결정된다. 따라서, 특정한 세포를 모집할 수 있도록 항체를 변형하는 시도는 치료 분야에 있어서 매우 중요하다고 할 수 있다.

하지만, 현재까지 대부분의 시도는 포유동물이 발현하는 IgG 분자를 이용하여 Fc 도메인을 변형하는 것이었다. 포유동물의 항체는 당화(glycosylated)되어 있는데, 이러한 당화 항체 Fc 부위에 수식된 탄화수소 사슬이 단백질의 구조를 안정화 해주어 항체가 Fc 수용체에 결합할 수 있도록 한다. 이와 반대로, 박테리아에서 생산되는 무당화(aglycosylated) 항체는 Fc 부위에 결합된 탄화수소 사슬이 없기 때문에 Fc 수용체에 결합을 하지 못하여 ADCC와 ADCP 기능을 나타낼 수 없다. 따라서, Fc 수용체에 결합을 할 수 있는 무당화 항체가 개발된다면, 기존 동물세포가 아닌 박테리아를 이용한 생산이 가능하여 생산 원가를 절감할 수 있는 장점을 가질 수 있다.

또한, Fc 부위를 변형한 포유동물의 항체는 특정 Fc 수용체에 대한 결합력이 증가되지만, 다른 Fc 수용체에 대한 결합력도 유지를 하기 때문에 바람직하지 않은 면역반응을 여전히 유지하는 문제가 있다. 인간에게는 5 종류의 주요 FcγR가 존재한다. 상기 수용체 중 4가지는 면역 활성화 또는 염증 반응을 유도하고, FcγRIIb는 면역 저해 또는 항염증 반응을 유도하는데, 대부분의 자연적으로 생산된 항체 또는 재조합된 당화 항체는 활성화 및 저해 Fc 수용체에 모두 결합을 한다. 항체의 ADCC 및 ADCP 유도능은 활성화 FcγR에 결합하는 능력과 저해 FcγRIIb에 결합하는 능력의 비율(A/I ratio)에 달려 있다(Boruchov et al, J Clin Invest, 115(10):2914-23, 2005). 하지만, FcγRIIb는 활성화 FcγR와 96%의 상동성을 갖는 문제로 인하여, 당화항체에 유전적 돌연변이를 도입하여 A/I ratio를 증가시키기 위한 노력은 큰 결실을 거두지 못하고 있는 실정이다.

추가적으로, 현재 임상에 이용되고 있는 치료용 IgG 항체를 이용한 암세포 사멸 작용기작에 관여하는 여러 가지의 면역세포들 중 자연살해세포(NK 세포)는 가장 강력한 암세포 사멸 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데, 다른 면역세포들(예:　monocytes, macrophages, dendritic cells)과는 달리 NK 세포는 표면에 FcγRIIIa를 발현하고, FcγRI과 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIb는 발현하지 않는 특징을 갖는다. monocytes나 macrophages, dendritic cells 등의 면역세포들은 ADCP에 의해 암세포를 효과적으로 제거할 수 있는데, 이 기작은 monocytes나 macrophages, dendritic cells의 표면에 과별현 되어있는 FcγRIIa와의 결합에 의해 유도된다. 따라서 기존의 치료용 항체와 차별화 할 수 있도록 암세포 사멸 작용기작을 극대화하기 위해서는 IgG 항체의 Fc 부위의 최적화를 통해 NK 세포 표면에 발현되는 FcγRIIIa와의 친화도를 향상시키는 것과 monocytes, macrophages, dendritic cells의 표면에 발현되는 FcγRIIa와의 친화도를 증가시키는 것이 필수적이다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 기존의 당화 항체가 갖는 비균질의 문제가 없고 FcγR와의 향상된 결합력을 보유한 항체를 개발하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체 중 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 선택적으로 결합력이 크게 향상됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 무당화 항체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 기존의 당화 항체가 갖는 비균질의 문제가 없고 NK 세포의 표면에 발현된 FcγRIIIa와의 향상된 결합력을 보유한 무당화 항체를 개발하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체 중 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 선택적으로 결합력이 크게 향상됨을 확인하였다.

항체는 특정 항원에 특이적으로 결합을 나타내는 단백질로, 천연 항체는 통상 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로다이머 당단백질이다.

본 발명에서 사용되는 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있으며, 바람직하게는 IgG이다. 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 단편과 1개의 Fc 단편을 형성하며, 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys 226의 N-말단을 파파인 분해함으로써 생성된다(Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).

항체 Fc 도메인은 IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 IgG 항체의 Fc 도메인, 혹은 이들의 변형일 수 있다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 도메인은 IgG 항체의 Fc 도메인(예를 들면 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인)이다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인(예를 들면 항HER2 항체의 Fc 도메인, 보다 구체적으로는 트라스트주맙의 Fc 도메인)일 수 있다. 본 발명의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 전체가 당화되어 있지 않거나 폴리펩타이드의 일부(예를 들면, Fc 도메인)만이 당화되지 않을 수 있다. 또한, 폴리펩타이드에 Fc 도메인에 더해 항체에서 유래하는 하나 이상의 영역이 포함될 수도 있다. 추가적으로, 상기 폴리펩타이드에는 항체 유래의 항원 결합 도메인(antigen binding domain)이 포함될 수도 있으며, 복수의 폴리펩타이드가 항체 또는 항체형 단백질을 형성할 수도 있다.

본 명세서에서 항체 Fc 도메인의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카밧 EU 넘버링 시스템(Kabat EU numbering system)에 따른다(Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 도메인은 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 N421S의 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 일 실시 양태에 있어서는 무당화 Fc 도메인은 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, FcγRIIIb 또는 FcαRI 중의 하나 이상에 결합할 수 있도록 변이되며, 바람직하게는 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 결합할 수 있도록 변이된다. 상기 변이된 무당화 Fc 도메인은 상기 Fc 수용체 중 어느 하나 이상에 대한 결합력이 야생형 당화 Fc 도메인과 비교하여 10% 이내, 20% 이내, 30% 이내, 40% 이내, 50% 이내, 60% 이내, 70% 이내, 80% 이내, 90% 이내 또는 100% 이내이거나, 야생형 당화 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상 또는 20배 이상 증가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드가 포함하는 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 대한 결합력이 향상된 것이다.

본 발명의 실시예에 따르면, S298G, T299A, N390D, E382V 및 M428L만이 치환된 Fc 도메인(Fc1004, 미국 등록특허 제8,952,132호)은 야생형 Fc 도메인과 같이 FcγRIIIa와 결합하지 않고, T299A, K326I, A327Y 및 L328G만이 치환된 Fc 도메인(A/IYG, 미국 등록특허 제8,815,237호) 역시 야생형 Fc 도메인에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합력 증가가 상당히 약하다. 또한, FcγRIIa(R131)에 대한 결합력은 Fc1004에서 크게 증가되기는 하지만, FcγRIIa(H131)에 대한 결합력은 Fc1004에서 일부 증가에 그친다.

본 발명의 상기 N421S 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인의 FcγRIIIa에 대한 결합력은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 향상되는 것을 확인하였으며, 특히 A/IYG, Fc1004-IYG 또는/및 V264E와의 조합으로 크게 향상되는 것을 확인하였다(실시예 5).

또한, 본 발명의 상기 N421S 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인의 FcγRIIa에 대한 결합력은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 향상되는 것을 확인하였으며, 특히 Fc1004 또는/및 V264E와의 조합으로 크게 향상되는 것을 확인하였다(실시예 4).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “항체”는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체와 이들의 단편을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체는 무당화(aglycosylated) 항체이다.

현재 상용화된 모든 치료용 항체들은 동물세포 배양을 통해 제조되고 있는데 항체를 생산할 때 다양한 당(carbohydrate) 변이체들이 항체 단백질에 수식되게 되고, 이로 인한 당화 비균질성(glycan heterogeniety)은 항체의 효능과 안정성에 변이를 유발하며, 항체 제조 공정 중 정제, 분석, QC(Quality Control)에 많은 비용을 요구하게 된다.

고가의 동물세포 배양 시스템이 요구되는 상기 당화 항체에 비해 무당화(aglycosylated) 항체는 박테리아에서 대량 생산이 가능하고 속도와 비용 면에서 탁월한 우수성을 지닌다. 하지만, 당화 항체의 Asn297 아미노산에 생성된 N-linked glycan은 항체의 구조와 기능에 결정적인 역할을 하는데, 무당화 항체 Fc 영역은 동물세포에서 생산이 되는 당화(glycosylated) 항체 Fc와 다르게 상위 CH2 영역이 닫혀져 있는 구조(closed structure) 혹은 아주 가변적인 구조 (flexible structure)를 가지게 되며, 이에 따라 무당화 항체는 NK 세포 모집과 활성화에 결정적인 역할을 담당하는 FcγRIIIa에 결합을 하지 못하고, 또한 macrophage와 neutrophile, monocyte등의 면역세포의 모집과 활성화 역할에 크게 관여하는 FcγRIIa와도 결합하지 못하기 때문에 암세포 사멸 작용기작을 보이지 못하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 무당화 항체 Fc 영역의 최적화(Fc1004 또는 A/IYG)를 통해 당화 비균질성 문제가 없고 저렴한 비용으로 박테리아에서도 생산이 가능함과 동시에 NK 세포 macrophage, monocyte, neutrophile등의 면역세포 표면에 발현된 FcγRIIIa 또는 FcγRIIa와의 향상된 결합력으로 암세포 사멸 작용기작을 극대화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:

a) 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법을 제공한다:

a) 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.

본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. “단리된 핵산”은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결”된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 “작동가능하게 연결된”은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.

본 명세서에서 용어 “벡터”는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생(exogenous) 또는 이종(heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).

본 명세서에서 용어 “발현 벡터”는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “숙주세포”는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 숙주세포는 세균(bacteria)세포, 보다 바람직하게는 그람 음성 세균세포이다. 상기 세포는 내막과 외막 사이에 원형질막 주위 공간 영역(periplasmic region)을 가지는 점에서 본 발명의 실시에 적합하다. 본 발명의 바람직한 숙주세포의 예로는 E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Haemophilus influenza, Bordotella pertussi, Erwinia amylovora, Rhizobium sp .등 이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:

a) 상기 N421S 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인에 무작위적인 점 돌연변이를 가하는 단계를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 구축하는 단계; 및

b) 상기 라이브러리에서 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 선별하는 단계.

본 발명의 치환된 Fc 도메인은 상기 N421S 아미노산 치환과 더불어, 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가적인 아미노산이 치환된 Fc 도메인은 박테리아 세포(바람직하게는, 대장균)를 이용하여 Fc 라이브러리를 구축하고, 이로부터 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa와 높은 친화도를 보이는 변이체들을 선별할 수 있다.

상기 Fc 도메인의 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, T350A, E382V, N390D 및 M428L으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 S298G, T299A, E382V, N390D 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환; T299A, K326I, A327Y 및 L328G의 추가적인 아미노산 치환; V264E의 추가적인 아미노산 치환; 및 이들 치환의 조합 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 T299A, K326I, A327Y 및 L328G의 추가적인 아미노산 치환; V264E, T299A, K326I, A327Y 및 L328G의 추가적인 아미노산 치환; S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환; V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환; S298G, T299A, E382V, N390D 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환; 및 V264E, S298G, T299A, E382V, N390D 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 추가적인 아미노산 치환일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리(FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기(Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO(Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 벡터, 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터의 약제학적 유효량을 객체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체를 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체 중 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 선택적 결합력이 우수하여 암의 치료에 유용하다.

도 1은 Tetrameric FcγRIIIa의 정제(왼쪽, SDS-PAGE) 사진과 활성 확인을 위한 ELISA(오른쪽) 실험결과를 나타낸다.
도 2는 Alexa 488 Flour를 이용한 tetrameric FcγRIIIa 형광 표지 후 활성 확인을 위한 ELISA 실험결과를 나타낸다.
도 3은 Dimeric FcγRIIa의 정제(왼쪽, SDS-PAGE) 사진과 활성 확인을 위한 ELISA(오른쪽) 실험결과를 나타낸다.
도 4는 Alexa 488 Flour를 이용한 dimeric FcγRIIa 형광 표지 후 활성 확인을 위한 ELISA 실험결과를 나타낸다.
도 5는 야생형과 Fc1004, Fc1004-N421S, Fc1004-V264E-N421S의 FcγRIIa에 대한 결합력을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 6은 Tetrameric FcγRIIIa와 변이체들(야생형, A/IYG, A/IYG-V264E-N421S, Fc1004-IYG-N421S, Fc1004-IYG-V264E-N421S)의 친화도를 분석한 그래프를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 항체를 full-length IgG 형태로 박테리아 내막에 디스플레이 하기 위한 Fc 변이체 클로닝

A/IYG(미국특허등록번호 제8,815,237호) 변이체와 Fc1004-IYG를 full-length IgG 디스플레이 하기 위하여 각 Fc 변이체를 중쇄 형태의 플라스미드로 제작하였다. pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(wild type)-FLAG 플라스미드에 T299A 치환이 이루어지도록 2개의 절편으로 나눈 뒤 각각의 가닥을 프라이머 MJ#36, MJ#43/MJ#42, MJ#37를 이용하여 Vent polymerase(New England Biolab)로 증폭하였다. 두 개의 절편은 프라이머 MJ#36, MJ#37을 이용하여 assembly PCR 과정 및 SfiI(New England Biolab) cut, T4 DNA ligase(invitrogen)을 이용한 라이게이션 과정을 차례로 진행해 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(T299A)-FLAG 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하고 프라이머 MJ#36, MJ#39/MJ#38, MJ#37을 사용해 위와 동일한 방법으로 326IYG 치환을 가하였다(pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG)-FLAG 제작). 동일한 프라이머인 MJ#36, MJ#39/MJ#38, MJ#37을 사용하여 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004)-FLAG에 326IYG 점 돌연변이를 도입해 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-IYG)-FLAG을 제작하였다.

Fc1004-N421S, Fc1004-V264E-N421S를 full-length IgG 디스플레이 하기 위하여 각 Fc 변이체를 중쇄 형태의 플라스미드로 제작하였다. pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004)-FLAG 플라스미드에 N421S 치환이 이루어지도록 프라이머 MJ#185, MJ#186을 이용하여 Pfu turbo polymerase(Agilent)로 플라스미드 전체를 증폭하여 site-directed mutagenesis를 수행하였다. PCR 후에는 DpnI(New England Biolab)을 2시간 동안 처리한 다음 transformation하였다. 본 과정을 통해 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-N421S)-FLAG 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하고 프라이머 MJ#191, MJ#192을 사용해 위와 동일한 방법으로 V264E 치환을 가하였다(pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(F1004-V264E-N421S)-FLAG 제작).

A/IYG-V264E-N421S를 full-length IgG 디스플레이 하기 위하여 Fc 변이체를 중쇄 형태의 플라스미드로 제작하였다. pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG)-FLAG 플라스미드에 N421S 치환이 이루어지도록 프라이머 MJ#185, MJ#186 (표 1)을 이용하여 Pfu turbo polymerase(Agilent)로 플라스미드 전체를 증폭하여 site-directed mutagenesis를 수행하였다. PCR 후에는 DpnI(New England Biolab)을 2시간 동안 처리한 다음 transformation하였다. 본 과정을 통해 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG-N421S)-FLAG 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하고 프라이머 MJ#191, MJ#192을 사용해 위와 동일한 방법으로 V264E 치환을 가하였다(pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG-V264E-N421S)-FLAG 제작).

실험에 사용한 프라이머

프라이머 #	뉴클레오타이드 서열 (5’→3’)
MJ#36 (서열목록 제19서열)	CGCAGCGAGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAGGTTCAATTAGTGGAATCTG
MJ#43 (서열목록 제20서열)	GGACGCTGACCACACGGTACGCGCTGTTGTACTGCTCCTCCCG
MJ#42 (서열목록 제21서열)	CGGGAGGAGCAGTACAACAGCGCGTACCGTGTGGTCAGCGTCC
MJ#37 (서열목록 제22서열)	CGCAATTCGGCCCCCGAGGCCCCTTTACCCGGGGACAGGGAG
MJ#39 (서열목록 제23서열)	GGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGCCATAAATGTTGGAGACCTTGCATTTGTACTCCTTG
MJ#38 (서열목록 제24서열)	CAAGGAGTACAAATGCAAGGTCTCCAACATTTATGGCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC
MJ#185(서열목록 제25서열)	GCAGCAGGGGAGCGTCTTCTCAT
MJ#186(서열목록 제26서열)	ATGAGAAGACGCTCCCCTGCTGC
MJ#191(서열목록 제27서열)	ATGCGTGGTGGAGGACGTGAGCC
MJ#192(서열목록 제28서열)	GGCTCACGTCCTCCACCACGCAT

실시예 2: Tetrameric FcγRIIIa의 제조와 Alexa488 fluor를 이용한 형광 표지

pMAZ-FcγRIIIa(V158)-FLAG-Streptavidin-His 플라스미드를 HEK 293F 세포에 300 ㎖ 규모로 임시 발현하여 1 ㎖의 Ni-NTA agarose(Qiagen) 슬러리를 이용한 친화도 크로마토그래피를 수행하였다. 배양이 끝난 현탁배양액은 7000 rpm, 10 분간 원심분리를 통해 세포를 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추고 bottle top filter를 이용해 0.2 μm 필터(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 Ni-NTA 슬러리를 첨가해 4℃, 16 시간 교반한 다음 폴리프로필렌 칼럼(Thermo Fisher Scientific)에 흘려주었다. pass-through solution을 취해 한 번 더 레진에 흘려서 바인딩 시킨 뒤, 50 ㎖의 1x PBS, 25 ㎖의 10 mM 이미다졸 버퍼, 25 ㎖의 20 mM 이미다졸 버퍼, 200 ㎕의 250 mM 이미다졸 버퍼 순으로 세척 과정을 수행하였다. 2.5 ㎖의 250 mM 이미다졸 버퍼로 elution을 받아 Amicon Ultra-4(Merck Millipore)을 통해 PBS로 버퍼를 교체한 후 농축 과정을 거쳐 SDS-PAGE를 통해 정제된 단백질을 확인하였다(도 1). 정제된 단백질은 ELISA를 실시하여 Rituxan(Roche)과의 결합 여부 분석을 통해 활성을 확인한 후, 1 ㎎을 취하여 Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 형광 표지 하였다. 형광 표지 후 활성 여부를 ELISA를 통해 분석하였다(도 2). 이로써 고순도의 active한 tetrameric FcγRIIIa를 성공적으로 제조하였으며, Alexa 488 flour 형광 물질을 표지한 이후에도 단백질의 활성이 유지되는 것을 확인하였다.

실시예 3: Dimeric FcγRIIa (H131), Dimeric FcγRIIa(R131)의 제조와 Alexa488 fluor를 이용한 형광 표지

pMAZ-FcγRIIa(H131)-FLAG-GST, pMAZ-FcγRIIa(R131)-FLAG-GST 플라스미드를 HEK 293F 세포에 300 ml 규모로 임시 발현하여 1 ml의 glutathione agarose 4B(Incospharm) 슬러리를 이용한 친화도 크로마토그래피를 수행하였다. 배양이 끝난 현탁배양액은 7000 rpm, 10 분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추고 bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 glutathione agarose 4B 슬러리를 첨가해 4 ℃, 16 시간 교반한 다음 폴리프로필렌 칼럼(Thermo Fisher Scientific)에 흘려주었다. pass-through solution을 취해 한 번 더 레진에 흘려서 바인딩 시킨 뒤, 10 column volume(CV)의 1x PBS로 세척 과정을 수행하였다. 10 CV의 50 mM Tris-HCl 10 mM reduced glutathione(SIGMA) pH 8.0 용액으로 elution을 받아 Amicon Ultra-4(Merck Millipore)을 통해 PBS로 buffer를 교체한 후 농축 과정을 거쳐 SDS-PAGE를 통해 정제된 단백질을 확인하였다(도 3). 정제된 단백질은 ELISA를 실시하여 리툭산과의 결합 여부 분석을 통해 활성을 확인한 후, 각각 1 mg을 취하여 Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 형광 표지 하였다. 형광 표지 후 활성 여부를 ELISA를 통해 분석하였다(도 4). 이로써 고순도의 active 한 dimeric FcγRIIa(H/R131)를 성공적으로 제조하였으며, Alexa 488 flour 형광 물질을 표지한 이후에도 단백질의 활성이 유지되는 것을 확인하였다.

실시예 4: 야생형과 Fc1004의 FcγRIIa(H/R131)에 대한 결합력 비교

분석할 클론들은 heavy chain을 코딩하는 플라스미드인 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(wild type)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-N421S)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-V264E-N421S)-FLAG 형태 이므로 E . coli Jude1 cell(F' [　Tn10 (Tet^r ) proAB⁺ lacI ^q Δ(lacZ)M15] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG) (Kawarasaki et al, 2003)에 pBAD30-Km-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc 플라스미드와 함께 transformation하여 중쇄 및 경쇄가 각각 원형질막 주위 공간 영역(periplasmic region)에 발현될 수 있도록 준비하였다. Terrific broth(TB, BD)에 glucose(Sigma-Aldrich)가 2% 함유된 배지 5 ml에서 각각 37 ℃, 16 시간 배양한 후 TB 5.5 ml을 100 ml 플라스크에 분주하여 1:100 접종하였다. OD₆₀₀=0.6까지 배양한 후 20 분간 25 ℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 0.2% arabinose, 1 mM IPTG를 첨가하여 25 ℃, 250 rpm, 20 시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD₆₀₀ normalize를 통해 균일한 양 만큼씩 14000 rpm, 1 분간 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1 분간 원심분리하는 세척과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA (pH 8.0)]로 resuspension하여 37 ℃, 30 분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl₂, 10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 SolutionA와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 resuspension한 뒤 37 ℃, 15 분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 형광 표지 된 20 nM의 dimeric FcγRIIa(H131)-Alexa 488 flour, dimeric FcγRIIa(R131)-Alexa 488 flour probe를 각각 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 프로브를 라벨링하였다. 라벨링 후 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 Guava(Merck Millipore) 장비를 이용해 분석하였다(도 5). 그 결과 기존에 알려져 있는 대로 야생형(형광 mean 값: 57.98, 53.65)에 비해 Fc1004(88.06, 196.91)의 FcγRIIa에 대한 결합력이 H131, R131 isotype에서 각각 상승된 것으로 나타났다. 나아가 Fc1004에 N421S 점 돌연변이가 도입된 변이체의 경우 FcγRIIa(H/R131)와의 결합에 의한 형광 신호 세기가 각각 115.11, 250.16으로 Fc1004 보다도 상승되었다. 또 V264E 점 돌연변이가 추가로 포함된 Fc1004-V264E-N421S의 경우에는 Fc1004-N421S 보다 형광 신호가 증가되어(137.41) FcγRIIa(H131)와의 결합력이 더 증가 되는 것으로 나타났으며, FcγRIIa(R131)과의 결합에 의한 형광 신호 세기는 255.16으로 N421S와 비슷한 수준을 유지 하는 것을 확인하였다.

실시예 5: 야생형과 A/ IYG , A/ IYG - V264E - N421S , Fc1004 - IYG - N421S , Fc1004 -IYG-V264E, N421S의 FcγRIIIa에 대한 결합력 비교

분석할 클론들은 중쇄를 코딩하는 플라스미드인 pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(wild type)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG-V264E-N421S)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-IYG-N421S)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-IYG-V264E-N421S)-FLAG 형태 이므로 E . coli Jude1 cell(F' [　Tn10 (Tet^r ) proAB⁺ lacI ^q Δ(lacZ)M15] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG) (Kawarasaki et al, 2003)에 pBAD30-Km-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc 플라스미드와 함께 transformation하여 중쇄 및 경쇄가 각각 원형질막 주위 공간 영역(periplasmic region)에 발현될 수 있도록 준비하였다. Terrific broth(TB, BD)에 glucose(Sigma-Aldrich)가 2% 함유된 배지 5 ml에서 각각 37 ℃, 16 시간 배양한 후 TB 5.5 ml을 100 ml 플라스크에 분주하여 1:100 접종하였다. OD₆₀₀=0.6까지 배양한 후 20 분간 25 ℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 0.2% arabinose, 1 mM IPTG를 첨가하여 25 ℃, 250 rpm, 20 시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD₆₀₀ normalize를 통해 균일한 양 만큼씩 14000 rpm, 1 분간 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1 분간 원심분리하는 세척과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA (pH 8.0)]로 resuspension하여 37 ℃, 30 분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl₂, 10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 SolutionA와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 resuspension한 뒤 37 ℃, 15 분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 형광 표지 된 5 nM의 tetrameric FcγRIIIa-Alexa 488 flour probe를 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 프로브를 라벨링하였다. 라벨링 후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 Guava(Merck Millipore) 장비를 이용해 분석하였다(도 6). 그 결과 AIYG의 경우, V264E와 N421S 점 돌연변이가 조합을 이루어 도입된 변이체가 FcγRIIIa에 대한 결합력이 증가되었음이 확인되었다(A/IYG의 형광 mean 값: 51.16, A/IYG-V264E, N421S: 109.36). 또, Fc1004-IYG-N421S에 V264E 점 돌연변이가 추가로 가해진 변이체의 FcγRIIIa와 결합에 의한 형광 신호 세기가 144.74에서 221.9로 증가하여 FcγRIIIa에 대한 친화도가 증가되었음을 확인하였다.

상기 FcγRIIa 및 FcγRIIIa와 높은 친화도를 보이는 변이체들의 점 돌연변이 위치는 다음과 같다(표 2, 돌연변이 위치는 Kabat EU 넘버링 시스템(Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호에 따름).

주요 변이체들의 점 돌연변이

Fc 변이체	점 돌연변이
A/IYG (서열목록 제5서열)	T299A, K326I, A327Y, L328G
Fc1004 (서열목록 제3서열)	S298G, T299A, E382V, N390D, M428L
Fc1004-IYG (서열목록 제7서열)	S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D, M428L
Fc1004-N421S (서열목록 제9서열)	Fc1004-421S
Fc1004-V264E-N421S (서열목록 제11서열)	Fc1004-V264E-N421S
A/IYG-V264E-N421S (서열목록 제13서열)	A/IYG-V264E-N421S
Fc1004-IYG-N421S (서열목록 제15서열)	Fc1004-IYG-N421S
Fc1004-IYG-V264E-N421S (서열목록 제17서열)	Fc1004-IYG-V264E-N421S

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Antibody Fc Region Comprising a New Mutation <130> HPC-7111 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 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cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Fc Sequence (Fc1004) <400> 3 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 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atgggcagcc ggagaacgac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctctt tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gttacatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 5 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Fc Sequence (A/IYG) <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ile Tyr Gly Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 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taaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggtgagca atgggcagcc ggagaacgac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctctt tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gttacatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 9 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Fc Sequence (Fc1004-N421S) <400> 9 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Glu Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ile Tyr Gly Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Val Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asp Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Ser Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 18 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Fc Sequence (Fc1004-IYG-V264E-N421S) <400> 18 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ctccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg aggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cggcgcgtac 240 cgtgtggtca gtgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaaa 300 tgcaaggtct ccaacattta tggcccagcc cccatcgaga aaaccatctc taaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggtgagta atgggcagcc ggagaacgac tacaagacca cacctcccgt gctggactcc 540 gacggctctt tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 agcgtcttct catgctccgt gttacatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ccccgggtaa a 681 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#36) <400> 19 cgcagcgagg cccagccggc catggcggag gttcaattag tggaatctg 49 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#43) <400> 20 ggacgctgac cacacggtac gcgctgttgt actgctcctc ccg 43 <210> 21 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#42) <400> 21 cgggaggagc agtacaacag cgcgtaccgt gtggtcagcg tcc 43 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#37) <400> 22 cgcaattcgg cccccgaggc ccctttaccc ggggacaggg ag 42 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#39) <400> 23 ggttttctcg atgggggctg ggccataaat gttggagacc ttgcatttgt actccttg 58 <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#38) <400> 24 caaggagtac aaatgcaagg tctccaacat ttatggccca gcccccatcg agaaaacc 58 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#185) <400> 25 gcagcagggg agcgtcttct cat 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#186) <400> 26 atgagaagac gctcccctgc tgc 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#191) <400> 27 atgcgtggtg gaggacgtga gcc 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer (MJ#192) <400> 28 ggctcacgtc ctccaccacg cat 23

Claims (12)

1. 인간 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 Fc 도메인은 카밧 EU 넘버링 시스템(Kabat EU numbering system)에 따른 하기의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인은 치환되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 대한 결합력이 향상된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드:
   a) S298G, T299A, N390D, E382V, N421S 및 M428L 치환; 또는
   b) V264E, T299A, K326I, A327Y, L328G 및 N421S 치환.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
   
5. 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
   
6. 제 5 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
   
7. 제 6 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
   
9. 삭제
10. 하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법:
    a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
    
11. 하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법:
    a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.
    
12. 하기의 단계를 포함하는 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법:
    a) 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 N421S; 및 추가적으로 S298G, T299A, N390D, E382V 및 M428L의 아미노산 치환 또는 V264E, T299A, K326I, A327Y 및 L328G의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인에 추가적으로 무작위적인 점 돌연변이를 가한 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 구축하는 단계; 및
    b) 상기 라이브러리에서 FcγRIIa 또는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 선별하는 단계.
    

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