KR101985863B1

KR101985863B1 - ADCC 향상을 위한 항체 Fc 변이체

Info

Publication number: KR101985863B1
Application number: KR1020170136669A
Authority: KR
Inventors: 정상택; 윤현웅; 조미경
Original assignee: 국민대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2019-06-04
Also published as: KR20190044348A

Abstract

본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체에 대한 결합력이 우수하여 암의 치료에 유용하며, 박테리아 배양을 통해서 균질의 무당화 항체로 제조될 수 있다.

Description

ADCC 향상을 위한 항체 Fc 변이체{An Antibody Fc Variant for Enhancing ADCC Activity}

본 발명은 ＦｃγRIIIa와의 결합력이 증가되어 ADCC 효능이 향상된 Fc 변이체 및 이를 포함하는 항체에 관한 것이다.

전 세계적으로 유전자 재조합, 세포 배양 등 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 이는 생명현상에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라, 각종 질병들의 발병 기작을 규명하는데 결정적 역할을 함으로써 효과적인 질병 진단과 치료의 길을 마련해 삶의 질 향상에 크게 기여 하고 있다. 특히, 1975년에 B 세포 (B Cell)와 골수암 세포 (Myeoloma cell)를 융합하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술(Hybridoma technology)이 개발(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)되면서 암, 자가면역질환, 염증, 심혈관 질환, 감염 등의 임상 분야에서 치료용 항체를 이용한 면역 치료(Immunotherapy)에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.

치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴(Herceptin), 아바스틴(Avastin), 리툭산(Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다.

치료용 항체의 가장 중요한 기작 중 하나는 면역세포들을 모집하여 타깃 항원으로 전달하는 기작인데, 항체의 Fc 도메인이 면역세포의 모집과 ADCC( antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)에 결정적인 역할을 한다. 특히, 항체의 ADCC 기능은 많은 세포의 표면에 존재하는 Fc 수용체(FcR)와의 상호작용에 의존한다. 사람의 Fc 수용체는 5가지로 분류되며, 항체가 어떠한 Fc 수용체에 결합되는지에 따라 모집되는 면역세포의 종류가 결정된다. 따라서, 특정한 세포를 모집할 수 있도록 항체를 변형하는 시도는 치료 분야에 있어서 매우 중요하다고 할 수 있다.

하지만, 현재까지 대부분의 시도는 포유동물이 발현하는 IgG 분자를 이용하여 Fc 도메인을 변형하는 것이었다. 포유동물의 항체는 당화(glycosylated)되어 있는데, 이러한 당화 항체 Fc 부위에 수식된 탄화수소 사슬이 단백질의 구조를 안정화 해주어 항체가 Fc 수용체에 결합할 수 있도록 한다. 이와 반대로, 박테리아에서 생산되는 무당화(aglycosylated) 항체는 Fc 부위에 결합된 탄화수소 사슬이 없기 때문에 Fc 수용체에 결합을 하지 못하여 ADCC 기능을 나타낼 수 없다. 따라서, Fc 수용체에 결합을 할 수 있는 무당화 항체가 개발된다면, 기존 동물세포가 아닌 박테리아를 이용한 생산이 가능하여 생산 원가를 절감할 수 있는 장점을 가질 수 있다.

또한, Fc 부위를 변형한 포유동물의 항체는 특정 Fc 수용체에 대한 결합력이 증가되지만, 다른 Fc 수용체에 대한 결합력도 유지를 하기 때문에 바람직하지 않은 면역반응을 여전히 유지하는 문제가 있다. 인간에게는 5 종류의 주요 FcγR가 존재한다. 상기 수용체 중 4가지는 면역 활성화 또는 염증 반응을 유도하고, FcγRIIb는 면역 저해 또는 항염증 반응을 유도하는데, 대부분의 자연적으로 생산된 항체 또는 재조합된 당화 항체는 활성화 및 저해 Fc 수용체에 모두 결합을 한다. 항체의 ADCC 유도능은 활성화 FcγR에 결합하는 능력과 저해 FcγRIIb에 결합하는 능력의 비율(A/I ratio)에 달려 있다(Boruchov et al, J Clin Invest, 115(10):2914-23, 2005). 하지만, FcγRIIb는 활성화 FcγR와 96%의 상동성을 갖는 문제로 인하여, 당화항체에 유전적 돌연변이를 도입하여 A/I ratio를 증가시키기 위한 노력은 큰 결실을 거두지 못하고 있는 실정이다.

추가적으로, 현재 임상에 이용되고 있는 치료용 IgG 항체를 이용한 암세포 사멸 작용기작에 관여하는 여러 가지의 면역세포들 중 자연살해세포(NK 세포)는 가장 강력한 암세포 사멸 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데, 다른 면역세포들(예:　monocytes, macrophages, dendritic cells)과는 달리 NK 세포는 표면에 FcγRIIIa를 발현하고, FcγRI과 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIb는 발현하지 않는 특징을 갖는다. 따라서 기존의 치료용 항체와 차별화 할 수 있도록 암세포 사멸 작용기작을 극대화하기 위해서는 IgG 항체의 Fc 부위의 최적화를 통해 NK 세포 표면에 발현되는 FcγRIIIa와의 친화도를 향상시키는 것이 필수적이다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 기존의 당화 항체가 갖는 비균질의 문제가 없고 NK 세포의 표면에 발현된 FcγRIIIa와의 증가된 결합력을 보유하여 ADCC 효능이 향상된 항체를 개발하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 FcγR에 대한 결합력이 크게 향상되고, 이를 통해 NK 세포의 암세포 사멸효과가 증대됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 기존의 당화 항체가 갖는 비균질의 문제가 없고 FcγR와의 향상된 결합력을 보유한 항체를 개발하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체 중 FcγRIIIa에 결합력이 크게 향상되고, 이를 통해 NK 세포의 암세포 사멸효과가 증대됨을 확인하였다.

항체는 특정 항원에 특이적으로 결합을 나타내는 단백질로, 천연 항체는 통상 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로다이머 당단백질이다.

본 발명에서 사용되는 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있으며, 바람직하게는 IgG이다. 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 단편과 1개의 Fc 단편을 형성하며, 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys 226의 N-말단을 파파인 분해함으로써 생성된다(Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).

항체 Fc 도메인은 IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 IgG 항체의 Fc 도메인, 혹은 이들의 변형일 수 있다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 도메인은 IgG 항체의 Fc 도메인(예를 들면 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인)이다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인(예를 들면 항HER2 항체의 Fc 도메인, 보다 구체적으로는 트라스트주맙의 Fc 도메인)일 수 있다. 본 발명의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 전체가 당화되어 있지 않거나 폴리펩타이드의 일부(예를 들면, Fc 도메인)만이 당화되지 않을 수 있다. 또한, 폴리펩타이드에 Fc 도메인에 더해 항체에서 유래하는 하나 이상의 영역이 포함될 수도 있다. 추가적으로, 상기 폴리펩타이드에는 항체 유래의 항원 결합 도메인(antigen binding domain)이 포함될 수도 있으며, 복수의 폴리펩타이드가 항체 또는 항체형 단백질을 형성할 수도 있다.

본 명세서에서 항체 Fc 도메인의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른다(Kabat et al., in of Proteins of Immunological Interest5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른 하기의 아미노산 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산 치환을 포함한다: L235V, G236A, S239D, F243L, V264E, S267E, R292P, Q295R, S298G, T299A, Y300L, K326I, A327Y, L328F, L328G, L328W, A330L, P331A, I332E, I332Y, T350A, D357G, E382V, N390D, T394A, P396L, F405S, M428I 및 M428L.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 도메인은 카밧 넘버링 시스템에 따른 하기의 7가지 아미노산 치환을 포함한다: S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V 및 N390D.

본 발명의 일 실시 양태에 있어서는 무당화 Fc 도메인은 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, FcγRIIIb 또는 FcαRI 중의 하나 이상에 결합할 수 있도록 변이된다. 상기 변이된 무당화 Fc 도메인은 상기 Fc 수용체 중 어느 하나 이상에 대한 결합력이 야생형 당화 Fc 도메인과 비교하여 10% 이내, 20% 이내, 30% 이내, 40% 이내, 50% 이내, 60% 이내, 70% 이내, 80% 이내, 90% 이내 또는 100% 이내이거나, 야생형 당화 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상 또는 20배 이상 증가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드가 포함하는 Fc 도메인은 상기 7가지 아미노산으로 치환되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합력이 향상된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 카밧 넘버링 시스템에 따른 235, 236, 239, 243, 264, 267, 292, 295, 298, 299, 300, 326, 327, 328, 328, 330, 331, 332, 350, 357, 382, 390, 394, 396, 405, 428 및 428번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 L235V, G236A, S239D, F243L, V264E, S267E, R292P, Q295R, Y300L, L328F, L328W, A330L, P331A, I332E, I332Y, T350A, D357G, T394A, P396L, F405S, M428I 및 M428L으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 2이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 V264E, Y300L, T350A, D357G, T394A, F405S 및 M428L으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 T394A 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 V264E, T350A, T394A 및 M428L의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 V264E 및 Y300L의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 V264E, Y300L 및 D357G의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 V264E, Y300L 및 F405S의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 V264E, Y300L, D357G 및 F405S의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 Fc 변이체 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드들은 야생형 Fc 도메인에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합력이 크게 증가된다(도 9 및 도 10).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체는 무당화(aglycosylated) 항체인 것이다.

본 명세서에서 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체와 이들의 단편을 의미한다.

현재 상용화된 모든 치료용 항체들은 동물세포 배양을 통해 제조되고 있는데 항체를 생산할 때 다양한 당(carbohydrate) 변이체들이 항체 단백질에 수식되게 되고, 이로 인한 당화 비균질성(glycan heterogeniety)은 항체의 효능과 안정성에 변이를 유발하며, 항체 제조 공정 중 정제, 분석, QC(Quality Control)에 많은 비용을 요구하게 된다.

고가의 동물세포 배양 시스템이 요구되는 상기 당화 항체에 비해 무당화 항체(aglycosylated)는 박테리아에서 대량 생산이 가능하고 속도와 비용 면에서 탁월한 우수성을 지닌다. 하지만, 당화 항체의 Asn297 아미노산에 생성된 N-linked glycan은 항체의 구조와 기능에 결정적인 역할을 하는데, 무당화 항체 Fc 영역은 동물세포에서 생산이 되는 당화(glycosylated) 항체 Fc와 다르게 상위 CH2 영역이 닫혀져 있는 구조(closed structure) 혹은 아주 가변적인 구조 (flexible structure)를 가지게 되며, 이에 따라 무당화 항체는 NK 세포 모집과 활성화에 결정적인 역할을 담당하는 FcγRIIIa에 결합을 하지 못하고, 암세포 사멸 작용기작을 보이지 못하게 된다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 기존 Fc 수용체에의 높은 결합력을 갖는 변이체들의 변이 위치(L235V, G236A, S239D, F243L, V264E, S267E, R292P, S298G, T299A, Y300L, K326I, A327Y, L328G, L328F, A330L, I332E, T350A, E382V, N390D, P396L, M428L 등)를 조합 및 추가적인 아미노산 치환을 이용하여 최적의 조합을 갖는 변이체를 발굴하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 무당화 항체 Fc 영역의 최적화(S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V 및 N390D의 7가지 아미노산으로 치환)를 통해 당화 비균질성 문제가 없고 저렴한 비용으로 박테리아에서도 생산이 가능함과 동시에 NK 세포의 표면에 발현된 FcγRIIIa와의 향상된 결합력으로 암세포 사멸 작용기작을 극대화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:

a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법을 제공한다:

a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 무당화 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.

본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.

본 명세서에서 용어 벡터는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생(exogenous) 또는 이종(heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).

본 명세서에서 용어 발현 벡터는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 숙주세포는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 숙주세포는 세균(bacteria)세포, 보다 바람직하게는 그람 음성 세균세포이다. 상기 세포는 내막과 외막 사이에 원형질막 주위 공간 영역(periplasmic region)을 가지는 점에서 본 발명의 실시에 적합하다. 본 발명의 바람직한 숙주세포의 예로는 E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Haemophilus influenza, Bordotella pertussi, Erwinia amylovora, Rhizobium sp .등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:

a) 상기 7가지 아미노산 치환(S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V 및 M428L)을 포함하는 Fc 도메인에 무작위적인 점 돌연변이를 가하는 단계를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 구축하는 단계; 및

b) 상기 라이브러리에서 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 선별하는 단계.

본 발명의 치환된 Fc 도메인은 상기 7가지 아미노산 치환과 더불어, 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 박테리아 세포(바람직하게는, 대장균)를 이용하여 Fc 라이브러리를 구축하였으며, 이로부터 FcγRIIIa와 높은 친화도를 보이는 변이체들을 선별하였다(실시예 5 및 6).

상기 Fc 도메인의 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 카밧 넘버링 시스템에 따른 235, 236, 239, 243, 264, 267, 292, 295, 300, 330, 331, 332, 350, 357, 394, 396, 405 및 428번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 1 또는 2 이상의 추가적인 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 V264E, Y300L, T350A, D357G, T394A, F405S 및 M428L로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리(FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기(Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO(Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 인간용 또는 동물용으로 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체를 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 Fc 수용체에 대한 결합력이 우수하여 암의 치료에 유용하며, 박테리아 배양을 통해서 균질의 무당화 항체로 제조될 수 있다.

도 1은 gIII 단백질과 세포막의 유동성에 의해 self-assemble되어 dimer를 이룬 Fc를 나타낸다.
도 2는 NlpA leader peptide와 세포막의 유동성에 의해 self-assemble되어 dimer를 이룬 Fc를 나타낸다.
도 3은 gIII 도메인 및 NlpA leader peptide와 세포막의 유동성을 이용한 dimeric Fc 디스플레이와 기존의 Full-length IgG 디스플레이 기법의 FcγRIIIa 결합 여부 및 신호 차이 비교를 나타낸다.
도 4는 A세포 내막에서 bevacizumab VH/VL의 assemble에 의한 항원 결합을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 구축한 라이브러리의 모식도와 gIII를 이용한 항체 Fc 도메인 디스플레이 모식도를 나타낸다.
도 6은 5라운드 스크리닝 후 매 라운드의 라이브러리와 wild type 허셉틴 Fc의 FcγRIIIa에 대한 친화도를 비교한 것(6A)과 이의 형광 세기를 막대 그래프로 비교한 것이다(6B).
도 7은 FcγRIIIa에 대해 높은 친화도를 갖는 변이체들을 나타낸다(A: No. 25(HW 25), B: No. 86(HW 86))
도 8은 No. 25(HW 25) 및 No. 86(HW 86)의 아미노산 서열을 야생형 허셉틴의 Fc 서열과 비교(A) 및 HW 25와 HW 86의 염기 서열(B)을 나타낸다.
도 9는 HW 25의 357번 글라이신을 아스파르트산으로, 405번째 세린을 페닐알라닌으로 되돌린 후 FcγRIIIa에 대한 친화도를 분석한 결과를 나타낸다(No.25-G357D는 HW 25의 돌연변이 중 357번 아미노산만 wild type으로 되돌린 것, No.25-S405F는 HW 25의 돌연변이 중 405번 아미노산만 wild type으로 되돌린 것, No.25-G357D/S405F는 HW 25의 돌연변이 중 357번 및 405번 아미노산만 wild type으로 되돌린 것).
도 10은 HW 86에서 발견된 T394A 변이 도입 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 HW 86의 ADCC 효능 테스트 결과를 나타낸다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: gIII 도메인과 세포막 유동성을 이용한 dimeric Fc 디스플레이를 위한 벡터 구축(야생형 WT Fc , MG48)

gIII 단백질이 융합된 monomer 형태의 Fc 단백질을 세포막의 유동성에 의해 dimer로 self-assemble 되도록 하기 위하여 플라스미드를 제작하였다(도 1). Vent polymerase (New England Biolab)와 프라이머 MJ#183, MJ#184를 이용해 각각 증폭한 야생형 WT Fc와 MG48 유전자를 SfiI(New England Biolab)으로 제한효소 처리하여 insert를 만들고 SfiI 제한효소 처리 된 pAK200 vector와 ligation 하였다. 그 후 대장균 Jude1((F' [Tn10(Tet^r )proAB⁺ lacI ^qΔ(lacZ)M15]mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(araleu)7697galUgalKrpsLendA1nupG) (Kawarasaki et al, 2003)에 transformation 하여 single clone을 확보한 후 염기서열 분석을 통해 WT Fc와 MG48이 pAK200에 성공적으로 삽입된 것을 확인하였다.

실험에 사용한 프라이머

프라이머 #	뉴클레오타이드 서열 (5→3)
MJ#1(서열목록 제1서열)	CCAGGCTTTACACTTTATGC
MJ#183(서열목록 제2서열)	CGAACTGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACAAAACTCACACATG
MJ#184(서열목록 제3서열)	AGTTCGGGCCCCCGAGGCCCCTTTACCCGGGGACAGGGAG
MJ#228(서열목록 제4서열)	CGCAGCGAGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACATCCAGATGACTCAATCACCCAGTTCAC
MJ#229(서열목록 제5서열)	CTTAACGCGGCCCCCGAGGCCCCGGTCCGCTTAATCTCCACTTTGGTTCC
MJ#232(서열목록 제6서열)	CGCAGCGAGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAAGTCCAGCTGGTGGAGTCCG
MJ#233(서열목록 제7서열)	CTTAACGCGGCCCCCGAGGCCCCACTGCTTACTGTAACAAGAGTGCCCTG
MJ#236(서열목록 제8서열)	CCCTAAAATCTAGACTATTAGGCGCGCCCTTTGTCATC

실시예 2: NlpA leader peptide와 세포막 유동성을 이용한 dimeric Fc 디스플레이를 위한 벡터 구축(야생형 WT Fc, MG48)

NlpA leader peptide가 융합된 monomer 형태의 Fc 단백질을 세포막의 유동성에 의해 dimer로 self-assemble 되도록 하기 위하여 플라스미드를 제작하였다(도 2). Vent polymerase(New England Biolab)와 프라이머 MJ#183, MJ#184를 이용해 각각 증폭한 야생형 WT Fc와 MG48 유전자를 SfiI(New England Biolab)으로 제한효소 처리하여 insert를 만들고 SfiI 제한효소 처리 된 pMopac12-NlpA-FLAG vector와 ligation 하였다. 그 후 대장균 Jude1에 transformation 하여 single clone을 확보한 후 염기서열 분석을 통해 WT Fc와 MG48이 해당 벡터에 성공적으로 삽입된 것을 확인하였다.

실시예 3: 세포막 유동성을 이용한 항체 단편 디스플레이를 위한 벡터 구축

Bevacizumab의 VH와 VL부분을 각각 프라이머 MJ#232와 MJ#233, MJ#228과 MJ#229을 사용하여 vent polymerase (New England Biolab)로 증폭하였다. 증폭한 유전자는 SfiI(New England Biolab)으로 제한효소 처리한 후 동일한 제한효소로 준비한 pMopac12-NlpA-FLAG vector와 pMopac12-NlpA-His-cMyc vector에 각각 ligation을 진행하였다. 이 플라스미드를 Jude1에 transformation하여 single colony의 염기서열 확인을 통해 pMopac12-NlpA-VH(bevacizumab)-FLAG과 pMopac12-NlpA-VL(bevacizumab)-His-cMyc이 완성된 것을 확인하였다. 그런 다음, VH와 VL을 하나의 vector에서 발현하기 위해 bicistronic 형태로 제작하였다. 앞서 제작한 pMopac12-NlpA-VH(bevacizumab)-FLAG을 template로 하여 프라이머 MJ#1, MJ#236으로 증폭하였다. 이 DNA 절편을 XbaI(New England Biolab)으로 제한효소처리 한 뒤, 동일하게 제한효소 처리 된 pMopac12-NlpA-VL(bevacizumab)-His-cMyc vector에 ligation하였다. 염기서열 분석 결과 pMopac12-NlpA-VH(bevacizumab)-FLAG-NlpA-VL(bevacizumab)-His-cMyc의 bicistronic 플라스미드가 만들어진 것을 확인하였다.

실시예 4. Full-length IgG 디스플레이를 위한 대장균 배양

pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(WT)-FLAG, pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(MG48)-FLAG는 Jude1 cell에 pBAD30-Km-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc 플라스미드와 함께 형질전환 (transformation)하여 heavy chain과 light chain이 각각 세포간극 영역에 발현될 수 있도록 준비하였다. TB에 glucose가 2% 함유된 배지 5 ml에서 각각 37℃, 16시간 배양한 후 TB 5.5 ml을 100 ml 플라스크에 분주하여 1:100 접종하였다. OD₆₀₀=0.6까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 0.2% arabinose, 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 20시간 동안 과발현하였다. 과발현 후 OD₆₀₀normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다.

실시예 5. 세포막 유동성과 NlpA 혹은 gIII를 이용한 dimeric Fc 디스플레이를 위한 대장균 배양

제작한 pAK200-Fc(WT/MG48)-gIII와 pMopac12-NlpA-Fc(WT/MG48)-FLAG 플라스미드는 Jude1 박테리아 세포에 형질전환한 뒤, 2% glucose가 첨가된 TB 배지 5 ml에서 37℃, 16시간 전배양한 후 5 ml의 TB 배지에 1:100 접종하여 OD₆₀₀=0.6에 도달할때까지 배양하였다. 곧바로 25℃, 250 rpm에서 20분간 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD₆₀₀값을 측정하여 normalize된 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다.

실시예 6. 세포막 유동성 기반의 항체 단편 디스플레이를 위한 대장균 배양

제작한 pMopac12-NlpA-VH(bevacizumab)-FLAG-NlpA-VL(bevacizumab)-His-cMyc 플라스미드는 Jude1 박테리아 세포에 transformation한 뒤, TB+2% glucose 배지 5 ml에서 37℃, 16시간 전배양한 후 5 ml의 TB 배지에 1:100 접종하여 OD₆₀₀=0.6까지 배양하였다. 곧바로 25℃, 250 rpm에서 20분간 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 과발현 하였다. 과발현 후 OD₆₀₀값을 측정하여 normalize된 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다.

실시예 7. 단백질 변이체 탐색 및 분석을 위한 세포외막과 펩티도글리칸 층 제거

1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 resuspension하고 1분간 원심분리하는 wash과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA (pH 8.0)]로 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl₂,10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 resuspension과 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 resuspension한 뒤 37℃, 15분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다.

실시예 8. 유세포 분석기를 이용한 세포막 유동성 기반의 Fc 변이체 디스플레이 시스템 검증

본 발명에서 개발한 세포막 유동성 기반의 dimeric Fc 디스플레이 시스템을 기존의 Full-length IgG 디스플레이 시스템과 비교하기 위해 각각 배양한 뒤 FcγRIIIa와의 결합력을 비교 분석하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 5 nM의 tetrameric FcγRIIIa-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 Guava(Merck Millipore) 장비를 이용해 분석하였다(도 3). Monomeric Fc 형태에서는 FcγRIIIa 결합이 불가능하다는 과학적 사실을 바탕으로 분석해 본 결과, NlpA 및 gIII에 융합된 monomer의 Fc 단백질이 세포막의 유동성을 통해 dimer 형태의 Fc로 디스플레이되는 것을 확인하였으며, 기존의 full-length IgG 디스플레이 기법보다 %CV 값이 낮고, negative clone과 positive clone 간 형광 신호 값(Mean fluorescence intensity, MFI)의 차이가 큰 것을 확인할 수 있었으며, 따라서 서 Fc 변이체를 포함한 해당 목적 단백질이 균질성이 높게 박테리아에 디스플레이 되고, 효과적인 유세포 분석기를 활용한 단백질과 리간드의 결합력 분석과 단백질 변이체 라이브러리 탐색이 효과적일 수 있음을 확인하였다.

실시예 9: 유세포 분석기를 이용한 세포막 유동성 기반의 항체 단편 디스플레이 시스템 검증

Fc 이외에 multimer를 이루는 단백질들이 막의 유동성을 이용한 본 시스템으로 self-assemble이 가능한 지의 여부를 확인하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 이 실험은 단일도메인 항체 (VHH)로 항원결합이 가능한 낙타류와 상어류를 제외하고 질병 치료와 진단에 이용되고 있는 인간을 포함한 포유류 IgG 항체들은 항원 결합을 위해서는 VH와 VL이 assemble 되어야 하고, VH 혹은 VL이 assemble 되지 않으면 항원과의 결합 능력을 가지지 못한다는 과학적 사실에 근거해 진행하였다. 세포외막과 펩티도글리칸 층이 제거된 항체 결합부위들 (VH, VL)을 디스플레이하고 있는 대장균을 원심분리 하여 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 75 nM의 VEGF-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 labeling하였다. Labeling후 1 ml의 PBS로 1회 wash한 후 Guava(Merck Millipore) 장비를 이용해 분석하였다(도 4). 그 결과, VH 혹은 VL만 디스플레이된 상태의 경우 empty cell인 Jude1과 유사한 형광세기를 나타내는 것으로 보아 항원인 VEGF와 결합하지 않은 것이 확인되었다. 또한 VH와 VL이 함께 발현되는 경우 박테리아 세포 내막의 유동성으로 인하여 VH와 VL이 assemble되어 디스플레이 됨으로써 항원과 성공적으로 결합하는 것이 확인되었다. 이로써 Fc 단백질 이외에도 multimer를 이루는 각종 단백질들이 디스플레이되어 self-assemble이 가능하다는 것을 확인하였다.

실시예 10: FcγRIIIa에의 결합력 향상 변이체 발굴을 위한 라이브러리 구축

FcγR에 대한 결합력을 향상시킨 Fc 변이체에 대한 연구는 여러 기관에서 진행되고 있으며, 선행연구에서 다양한 기능향상 Fc 변이체들이 발굴되었다. 발굴된 다양한 Fc 변이체들의 조합을 통해 가장 최적의 조합을 갖는 Fc 변이체를 찾는 것을 목표로 하였으며, 이를 위해 실험 방법이 간단하고 다루기 쉬운 대장균에서 무당화 항체 Fc를 디스플레이하기 위한 라이브러리를 디자인하여 구축하였다. 다양한 종류의 FcγR에 대한 항체 Fc의 결합 부위는 CH1-CH2 접합부 도메인과 근접한 지역에 집중되어있으므로, FcγRIIIa가 아닌 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 등 여타 FcγR에 대한 결합력을 향상시킨 변이체도 FcγRIIIa에의 결합력에 영향을 줄 수 있는 가능성이 있다. 따라서 FcγRIIIa에만 국한하지 않고 모든 FcγR들에 대해 친화도를 향상시킨 변이체들을 탐색하였으며, 본 연구실에서 선행 연구를 통해 발굴된 무당화 항체 Fc 변이체 뿐 아니라 Xencore, Macrogenics와 같은 Fc 엔지니어링 전문 기업에서 발굴된 당화 항체 Fc 변이체 또한 후보군으로 채택하였다(표 2). 그 결과 무당화 항체 8종, 당화 항체 4종을 선별, 29개의 변이 위치에 30 종류의 변이를 갖는 변이체들을 동정하였으며, 29개의 변이 위치에 30개의 변이가 각각 존재하거나 존재하지 않는 두 가지의 경우의 수를 갖도록 하는 조합을 구상하였다. 이를 위하여, degenerate codon을 갖는 프라이머(표 3)를 이용해 무작위적 조합을 갖는 Fc 변이체를 coding하는 유전자를 구축하였으며, Fc의 CH1-CH2 접합부가 FcγR의 결합에 중요한 역할을 하므로 이 부분이 디스플레이 이후 노출되도록 하기 위해, N-말단이 아닌 C-말단을 통해 항체 Fc를 디스플레이하는 것이 요구되었다. 그러므로 박테리오 파지 유래의 geneIII 신호단백질을 이용하는 pAK200 플라스미드를 벡터로 이용하여 세포막 유동성을 통한 대장균 세포간극영역에 C-말단 디스플레이가 가능하게 하였으며, 다양한 Fc 변이체들이 도입된 거대 Fc 변이체 라이브러리를 구축하였다(도 5).

라이브러리 구축을 위해 선별된 변이체의 종류

변이체	돌연변이 위치
Xencor2a	G236A
Xencor3a	S239D / A330L / I332E
Xencor2b	S267E / L328F
Macrogenics	L235V / F243L / R292P / Y300L / P396L
Fc 11	E382V
Fc 5	E382V / M428I
Fc 5-2a	S298G / T299A / E382V / M428I
Fc 1004	S298G / T299A / E382V / N390D / M428L
Fc 701	Q295R / L328W / P331A / I332Y / E382V / M428L
A/IYG	T299A / K326I / A327Y / L328G
Fc 1004/IYG	S298G / T299A / K326I / A327Y / L328G / E382V / N390D / M428L
MG 48	V264E / S298G / T299A / K326I / A327Y / L328G / T350A / E382V / N390D / M428L

(돌연변이 위치는 Kabat EU 넘버링 시스템(Kabat et al., in of Proteins of Immunological Interest5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호에 따름)

실험에 사용한 프라이머

프라이머 #	뉴클레오타이드 서열 (5→3)
1Fw(서열목록 제9서열)	GACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAA
2Rv(서열목록 제10서열)	GAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGG GGAARGAGGAAGACTGACGGTCCCCCTAMGAG TTCAGGTGCTGGGCACGGTG
2Rv S239D(서열목록 제11서열)	GAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGG GGAARGAGGAAGACATCCGGTCCCCCTAMGAG TTCAGGTGCTGGGCACGGTG
3Fw(서열목록 제12서열)	CCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGA CCCCTGAGGTCACATGCGTG
4Rv(서열목록 제13서열)	CAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTC GTGGCTCACGTCTWCCAC CACGCATGTGACCTCAGGGG
4Rv S267E(서열목록 제14서열)	CAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTC GTGTTCCACGTCTWCCAC CACGCATGTGACCTCAGGGG
5Fw(서열목록 제15서열)	GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG
6Rv(서열목록 제16서열)	GGTGAGGACGCTGACCACACG GTACGCGCYGTTGTATYGCTCCTCTSG CGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTC
6Rv Y300V(서열목록 제17서열)	GGTGAGGACGCTGACCACACG CACCGCGCYGTTGTATYGCTCCTCTSG CGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTC
7Fw(서열목록 제18서열)	CGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
8Rv(서열목록 제19서열)	CTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTT CTCGATTGSTRMTGGMVHGKMTWTGTTGGA GACCTTGCACTTGTACTCCTTGCC
8Rv I332Y(서열목록 제20서열)	CTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTT CTCATATGSTRMTGGMVHGKMTWTGTTGGA GACCTTGCACTTGTACTCCTTGCC
8Rv I332E(서열목록 제21서열)	CTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTT CTCTTCTGSTRMTGGMVHGKMTWTGTTGGA GACCTTGCACTTGTACTCCTTGCC
9Fw(서열목록 제22서열)	AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAG CCCCGAGAACCACAGGTGTACRCA CTGCCCCCATCCCGGGATG
10Rv(서열목록 제23서열)	GCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAG GCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCAGCT CATCCCGGGATGGGGGCAG
11Fw(서열목록 제24서열)	CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGWA AGCAATGGGCAGCCGGAGAAC
12Rv(서열목록 제25서열)	GAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAG TCCAGCACGGGAGGTGTGGTCTTGTAGTY GTTCTCCGGCTGCCCATTGCT
12Rv P396L(서열목록 제26서열)	GAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAG TCCAGCACCAGAGGTGTGGTCTTGTAGTY GTTCTCCGGCTGCCCATTGCT
13Fw(서열목록 제27서열)	CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC
14Rv(서열목록 제28서열)	TTTACCCGGGGACAGGGAGAGG CTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGSAKCACGGAGCATGA GAAGACGTTCCCCTGCTGCCAC
Pro-amplificationRv(서열목록 제29서열)	CTCTAG GGCCCCCGAGGCCCC GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC

실시예 11: 구축된 라이브러리의 스크리닝

구축된 라이브러리를 250 ml 플라스트에 담은 TB (Becton, Dickinson and company (New Jersey, USA)) + 2% glucose (Sigma Aldrich (Missouri, USA)) 배지 25 ml에 37℃, 4시간 전배양을 진행한 뒤, terrific broth에 1:100으로 접종하여 OD600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 본배양을 진행하였다. 본배양이 끝난 후 25℃에서 1 mM IPTG (Biosesang (Sungnam, South Korea))를 이용하여 5시간 인덕션을 진행하고 인덕션이 끝난 후 8/OD600으로 셀 솔루션을 회수하였다. 회수된 세포를 Tris-HCl (pH 8.0) 1 ml로 세척을 진행한 뒤, 14000 rpm에서 1분간 원심분리 뒤, 같은 작업을 1 회 더 실시하였다. 그 후 회수된 세포를 STE(0.5 M Sucrose-10 mM Tris-10 mM EDTA(pH 8.0)) 1 ml로 resuspension하고 37℃에서 30분간 교반하였다. 교반 후 세포를 14,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 solution A(0.5 M sucrose, 20 mM MgCl₂, 10 mM MOPS pH 6.8)로 풀었다. 그 후 다시 14,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 pellet을 1 mg/ml의 lysozyme(Sigma Aldrich (Missouri, USA))을 포함하는 solution A로 풀어 37℃에서 15분간 교반하였다. 교반한 세포를 14000 rpm에서 1분간 원심분리한 뒤, PBS 1 ml로 풀어 준비하였다. 형광 표지된 FcγRIIIa가 들어있는 PBS와 7:15의 비율로 섞어 1 ml를 만든 뒤, 상온에서 1시간동안 교반하였다. 형광 표지가 끝난 스페로플라스트 (spheroplast)들을 14,000 rpm에서 1분간 원심분리 한 뒤, PBS로 세척하고 다시 14,000 rpm에서 1분간 원심분리하는 과정을 2회 걸쳐 wash를 진행하였다.

FcγRIIIa로 lableling이 끝난 스페로플라스트를 1:15의 비율로 1 X PBS에 희석한 뒤, 유세포 분석기(S3 cell sorter, BioRad)를 통하여 스크리닝을 진행하였다. 형광 표지된 FcγRIIIa에 의해 나타나는 형광 세기가 높은 스페로플라스트는 그만큼 FcγRIIIa에 대한 높은 친화도를 갖는 변이체를 갖고 있다는 것을 의미하므로, 형광 세기가 상위 3 %에 해당하는 스페로플라스트를 스크리닝을 통해 수집하였다. 회수된 스페로플라스트를 다시 유세포 분석기를 통해 스크리닝함으로써, 스크리닝 과정에서 같이 회수되는 negative clone들을 제거하고 FcγRIIIa에 대해 높은 친화도를 갖는 변이체들의 비율을 높이는 재스크리닝 과정을 거쳤다. 얻어진 스페로플라스트를 PCR을 이용해 양성 변이체 DNA를 증폭하여 회수하였고, 다시 디스플레이 벡터에 클로닝하여 라이브러리를 구축하였다. 이러한 스크리닝 후 라이브러리 구축 과정을 총 5회 반복하였으며, 사용되는 형광 표지 FcγRIIIa의 농도를 점차 줄여나감으로써 스크리닝이 진행될수록 FcγRIIIa에 대해 더욱 높은 친화도를 갖는 변이체들로 라이브러리가 증폭되도록 진행하였다.

실시예 12: 스크리닝 후 라이브러리 평가 및 개별 변이체 분석

5회의 반복 스크리닝 이후, 모든 스크리닝의 단계에서 구축된 라이브러리들과 시작 라이브러리를 250 ml 플라스트에 담은 TB + 2% glucose 배지 25 ml에 37℃, 4시간 전배양을 진행한 뒤, TB 배지에 1:100으로 접종하여 OD600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 본배양을 진행하였다. 본배양이 끝난 후 25℃에서 1 mM IPTG를 이용하여 5시간 인덕션을 진행하고 인덕션이 끝난 후 8 ml/OD600 분량의 세포들을 회수하였다. 또한 비교군으로 사용된 무당화 wild type Fc 시험관에 5 ml의 TB + 2% glucose 배지에 접종한 뒤, 37℃에 밤새 전배양을 진행하고 TB 배지 5 ml에 위와 같은 본배양, 인덕션 과정을 거치고 세포 회수 과정을 진행하였다. 회수된 모든 라이브러리와 비교군을 상기 기재한 것과 같은 방법으로 스페로플라스트를 제조한 다음, 그 형광 세기를 비교한 결과(Guava, Millipore), FcγR에 대한 친화도가 높은 변이체들만 선별한 결과로 모든 라이브러리가 야생형 무당화 Fc보다 높은 FcγRIIIa 친화도를 나타냈으며, 스크리닝이 진행되면서 라이브러리에 FcγRIIIa에 대해 높은 친화도를 갖는 변이체들의 비율이 증폭되었음을 확인할 수 있었다(도 6).

라이브러리를 이용한 스크리닝이 성공적으로 완료되었음을 확인한 이후, 마지막 라운드 스크리닝 이후 구축한 라이브러리에서 개별 변이체들을 선별하여 각각 변이체들의 FcγRIIIa에 대한 결합력을 측정하고자 하였다. 실험관에 5 ml의 TB + 2% glucose 배지에 개별 변이체 콜로니를 접종한 뒤, 37℃에서 밤새도록 전배양을 하였다. 그리고 5 ml의 TB 배지에 1:100으로 접종하여 OD600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 본배양을 진행하였고, 1 mM의 IPTG를 이용하여 25℃에서 5시간 동안 인덕션을 진행하였다. 인덕션이 완료된 이후 대장균을 8 ml/OD600의 양만큼 harvest를 진행한 뒤, 상기에 기재한 스페로플라스팅 과정을 거쳐 개별 변이체들의 스페로플라스트를 제작한 뒤, 유세포 분석기를 통해 그 형광의 세기를 측정하였다. 그 결과 100개의 개별 변이체들 중 특별히 FcγRIIIa에 높은 친화도를 보이는 변이체들을 선별하고 동정하였음(표 4, 도 7 및 8)

발굴된 변이체들의 이름 및 변이 위치

변이체	돌연변이 위치
HW 25	V264E/ S298G/ T299A/ Y300L/ K326I/ A327Y/ L328G/ D357G/ E382V/ N390D/ F405S
HW 86	V264E/ S298G/ T299A/ K326I/ A327Y/ L328G/ T350A/ E382V/ N390D/ T394A/ M428L

실시예 13: 발굴된 변이체들을 이용한 추가적인 실험

발굴된 HW 25와 HW 86에는 기존에 라이브러리를 구축하기 위해 구상한 변이 위치가 아닌, 스크리닝 과정 중 DNA를 증폭하기 위해 PCR을 수행하는 과정에서 도입된 의도치 않은 변이가 존재하였다. 이러한 변이들의 존재가 FcγRIIIa에의 친화도에 어떤 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 각각의 변이들을 야생형 Fc의 서열로 되돌리기 위해 Quik change kit (Agilent)를 이용한 PCR 과정을 거쳤으며, 클로닝이 완료된 변이체들을 유세포 분석기를 통해 FcγRIIIa에 대한 친화도를 비교하였다. HW 25의 경우 D357G와 F405S를 다시 357D와 405F로 되돌린 결과 두 가지 변이 모두 FcγRIIIa에 대한 친화도 향상에 기여 하는 것으로 확인되었다(도 9).

T394A의 경우, 본원 발명자들이 보유한 변이체인 Fc 1004/IYG에 이 T394A 변이를 도입하였다. 클로닝이 완료된 이후 유세포 분석기를 통해 FcγRIIIa에 대한 친화도를 분석한 결과, T394A 변이가 도입됨으로써 FcγRIIIa에 대한 친화도가 증가함을 확인하였다(도 10).

실시예 14: 동물 세포에서의 IgG 발현 및 정제

발굴된 변이체와 대조군을 추가 실험에 사용하기 위해 단백질로써 발현, 정제하는 실험을 계획하였다. 디스플레이는 항체 Fc의 형태로 진행되었으며, 실질적인 효능을 분석을 위해서는 항체의 형태로 발현 정제를 해야 하므로, trastzumab의 VH-CH1을 코딩하는 DNA와 연결하여 항체 중쇄를 코딩하는 DNA를 수득한 뒤, BssHII/ XbaI처리 하였다. 그 후 클로닝을 위해 동물세포 발현용 벡터인 pMAZ 벡터를 제한 효소인 BssHII/XbaI으로 처리한 다음 라이게이션 하여 pMAZ-IgH(trastzumab), pMAZ-IgH(No.25), pMAZ-IgH(No.25-DG), pMAZ-IgH(No.86)의 네 가지 플라스미드를 구축하였다. 이를 trastzumab의 경쇄를 코딩하는 pMAZ 플라스미드를 HEK293F에 형질 전환하여 항체를 발현하였다.

그 후, 세포를 3000 × g로 20분간 원심분리하여 상층액을 수집하였으며, 1 × PBS가 되도록 25 × PBS를 섞어 희석한 뒤, 0.22 uM 필터로 필터하였다. 필터하고 난 상층액에 1 x× PBS로 평형을 잡은 protein A 레진을 넣고 밤새 교반하여 결합 유도를 하였으며, 컬럼에 레진을 충전하고 1 × PBS를 레진 부피의 50 배만큼 흘려 세퍽 하였다. 그 후 100 mM glycine(pH 3.0)으로 바인딩된 항체를 받아내었으며, 즉시 1 M Tris(pH 8.0)을 넣어 중성 pH로 중화시켰다. 정제된 항체를 3 kDa 컬럼 튜브를 통해 7,500 × g에 25분간 원심 분리를 하고 1 × PBS를 채워주었으며, 다시 7,500 X g에 25분간 원심 분리 이후 1 × PBS를 채워주는 일련의 과정을 반복하여 버퍼 중 1 × PBS의 비율이 99% 이상이 되도록 하였다.

실시예 15: 대장균에서의 IgG 발현 및 정제

추가 대조군으로 사용하기 위해 대장균에서 full-length trastzumab을 발현, 정제하였다. 먼저 trastzumab의 중쇄와 경쇄를 코딩하면서, PelB 신호단백질을 이용하는 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드를 DsbC-chaperon을 코딩하는 플라스미드와 같이 MG1655 대장균에 도입하였으며, R/2 배지(KH₂PO₄ 6.75 g/l, (NH₄)₂HPO₄ 2.0 g/l, Citric acid monohydrate 0.93 g/l, MgSO₄.7H₂O 0.7 g/l, TMS 5.0 ml/l, 2 % glucose)에 계대 배양을 한 뒤, fermantor jar에 2 L의 R/2 배지를 만든 뒤 1:100의 비율로 희석하여 본배양을 진행 하였다. 그리고 OD600이 70이 되도록 배양을 진행한 후 , 1 mM IPTG를 이용하여 인덕션을 진행하였다. 8시간의 배양 후 대장균을 회수하였으며, 1.2 L 100 mM Tris, 10 mM EDTA (pH 7.4) 용액에 대장균을 resuspension 시키고, lysozyme을 4 mg/ wet cell g의 분량으로 첨가한 후 30℃에서 16시간 동안 incubation하여 대장균을 파쇄하였다. 파쇄한 대장균은 14,000 × g에서 30분간 원심분리 한뒤 상등액을 회수하고 상기 기재한 방법으로 정제를 진행하였다.

실시예 16: ADCC 분석을 통한 암세포 사멸 효능 검증

ADCC를 측정하기 위한 타겟 세포인 SKBR-3를 McCoy’s medium + 10% FBS + 1 x anti-anti에서 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였으며, 후에 어세이 버퍼(RPMI + 10% heat inactivated FBS + 30 ng/ml recombinant human IL-2)에 현탁하고, 96-well plate (V-bottom)에 well 당 1 x 10⁴cells/50 μl/well 로 접종하였다. 동물세포에서 발현한 IgG를 어세이 버퍼에 최고 농도 20 μg/ml 에서 0 μg/ml까지 1/5씩 serial dilution하여 총 8개 농도로 준비하고 SKBR-3 cell이 분주된 각 well 당 10 μl씩 첨가한 후 1시간동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 이후 PBMC는 37℃ water bath에서 2-3분 동안 재빨리 녹인 후 50 ml tube에 옮기고 10 ml의 응고 방지용 버퍼(1 ml CTL Anti-aggregate Wash ^TM20xSolution+19mLRPMI)를 처리한 후 1회 인버팅하여 PBMC가 잘 혼합되도록 하고, 300 g에서 10분간 원심 분리하여 조심스럽게 상층액을 제거하고 10 ml의 응고 방지용 버퍼를 넣은 후 세포를 현탁하였다. 그리고 300 × g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거한 뒤, 1 ml의 어세이 버퍼를 넣어 현탁 후 세포를 계수하였다. 계수한 PBMC는 2.5 x 10⁶cells/mL 농도로 어세이 버퍼에 희석하여 준비하고, 타겟 세포와 물질이 분주된 plate의 각 well당 50 μl씩 첨가한 뒤 37℃, 5% CO₂incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 300 × g에서 5분간 원심분리를 진행하여 상층액 50 μl를 취하고 SpectraPlate 96-well plate에 옮긴 후, CytoTox 96 Reagent를 각 well 당 50 μl씩 첨가하여 30분간 상온에서 반응시킨 다음, 50 μl 의 반응 종결 용액(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit에서 제공함)을 첨가하여 반응을 종료시킨 후 VersaMax로 490 nm에서 흡광도를 측정하고 결과값을 수집하였다. 그 결과 HW 86은 야생형 trastzumab에 비해 2배 가량 ADCC 효능이 증대되었음을 관찰하였다(도 11).

<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> An Antibody Fc Variant for Enhancing ADCC Activity <130> HP7489 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ#1 <400> 1 ccaggcttta cactttatgc 20 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ#183 <400> 2 cgaactggcc cagccggcca tggcggacaa aactcacaca tg 42 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ#184 <400> 3 agttcgggcc cccgaggccc ctttacccgg ggacagggag 40 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ#228 <400> 4 cgcagcgagg cccagccggc catggcggac atccagatga ctcaatcacc cagttcac 58 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ#229 <400> 5 cttaacgcgg cccccgaggc cccggtccgc ttaatctcca ctttggttcc 50 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ#232 <400> 6 cgcagcgagg cccagccggc catggcggaa gtccagctgg tggagtccg 49 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Val Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asp Tyr Lys Thr Ala Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims

인간 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서,
상기 Fc 도메인은 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른 S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V 및 N390D의 아미노산 치환; 및
추가적으로 1) V264E, Y300L, D357G 및 F405S의 아미노산 치환 또는 2) V264E, T350A, T394A 및 M428L의 아미노산 치환;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
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제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인은 치환되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합력이 향상된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
제 12 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
제 13 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
제 14 항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1 항의 폴리펩타이드, 제 11 항의 항체, 제 12 항의 핵산분자 또는 제 13 항의 벡터를 포함하고, 상기 폴리펩타이드, 항체 또는 핵산분자는 암 항원을 인식하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법:
a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법:
a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.
하기의 단계를 포함하는 FcγRIIIa에 결합하는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법:
a) 카밧 넘버링 시스템에 따른 S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V 및 N390D의 아미노산 치환; 및 추가적으로 1) V264E, Y300L, D357G 및 F405S의 아미노산 치환 또는 2) V264E, T350A, T394A 및 M428L의 아미노산 치환;을 포함하는 Fc 도메인에 추가적으로 무작위적인 점 돌연변이를 가한 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 구축하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리에서 야생형의 경우보다 FcγRIIIa에 결합력이 향상된 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 선별하는 단계.
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