CN116143932A - 一种针对IgE的抗体或其抗原结合片段以及Fc变体 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种在中性或碱性条件下特异性结合IgE的抗体或其抗原结合片段,和包含其的药物组合物和试剂盒,还涉及它们在降低或抑制IgE水平或预防和/或治疗受试者的与IgE相关的疾病中的用途。本申请还涉及一种IgG Fc的Fc变体以及包含编码其核苷酸序列的核酸分子和载体,还涉及包含所述IgG Fc的Fc变体的抗体或其抗原结合片段,以及它们在降低或抑制IgE水平或预防和/或治疗受试者的与IgE相关的疾病中的用途。
Description
技术领域
本申请涉及一种特异性结合IgE的抗体或其抗原结合片段以及包含其的药物组合物和试剂盒,还涉及它们在降低或抑制IgE水平或预防和/或治疗受试者的与IgE相关的疾病中的用途。本申请还涉及一种IgG Fc的Fc变体以及包含编码其核苷酸序列的核酸分子和载体,还涉及包含所述Fc变体的抗体或其抗原结合片段,以及它们在降低或抑制IgE水平或预防和/或治疗受试者的与IgE相关的疾病中的用途。
背景技术
IgE(免疫球蛋白E)是在I型超敏反应性疾病,如过敏性鼻炎、过敏性咳嗽、哮喘、异位性皮炎、湿疹、急慢性荨麻疹等发病机制中起主要作用的免疫分子。IgE与两种主要受体FcεRI和FcεRII(CD23)相互作用,分别参与不同的免疫过程。其中FcεRI是IgE的高亲和力受体,存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞等免疫细胞表面。该受体在IgE的诱导下交联,引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞等活化脱粒,释放组胺、前列腺素、白三烯等生物活性介质,造成局部或全身性炎症反应等生理功能紊乱,即I型超敏反应。IgE与低亲和力受体CD23的相互作用则涉及抗原呈递、抗原跨气道和肠上皮转运以及IgE合成调节等免疫过程。
奥马珠单抗(Omalizumab)作为一种人源化的抗IgE单克隆抗体,是目前唯一临床批准使用的IgE靶向治疗药物,用于治疗严重过敏性哮喘和高IgE血液患者。奥马珠单抗对IgE的结合可同时抑制IgE与两种受体的相互作用,起到对IgE的中和作用,从而治疗过敏。然而在临床使用中,奥马珠单抗在降低游离IgE的同时却显著增高了患者血液总IgE含量。这是由于奥马珠单抗作为一种IgG型抗体,自身具有较长的半衰期。在临床治疗过程中,IgE被奥马珠单抗中和的同时也受到了奥马珠单抗的保护。当被奥马珠单抗结合的IgE遇到胞吞时,反而会随奥马珠单抗一起通过FcRn被重新循环释放到细胞外,不被溶酶体降解,因而大大延长了IgE的半衰期,造成血液中IgE的大量积累。作为一款中和抗体,为取得药效,奥马珠单抗的用量就不能低于患者体内IgE的总量,否则就一定会有部分IgE未被中和。因此,为了应对患者体内IgE的不断分泌,就需要提供大量的奥马珠单抗以保证对IgE的中和作用,临床表现为需要给患者多次大剂量注射奥马珠单抗。这给患者带来较大的经济负担,同时还可能造成贫血等不良反应。不仅如此,奥马珠单抗的每次临床用药上限为600mg,如果患者长期接触过敏原,体内IgE长期大量分泌,那么奥马珠单抗还将面临失效的风险。
因此,有必要开发一款高效且用药剂量低的新一代抗过敏或抗哮喘药物。
发明内容
为了解决上述问题,本申请提供了如下三方面的抗体。
在第一方面,本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)所含有的VH互补决定区1-3(CDR1-3)和/或轻链可变区(VL)所含有的VL互补决定区1-3(CDR1-3)中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;
其中,奥马珠单克隆抗体包含:如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中含有的VHCDR1、VH CDR2以及VH CDR3;和,如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中含有的VL CDR1、VLCDR2以及VL CDR3。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1和/或VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;优选地,所述置换为保守置换。
在某些实施方案中,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中,所述奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)包含序列为SEQ IDNO:16的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:17的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:18的VH CDR3;轻链可变区(VL)包含序列为SEQ ID NO:19的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:20的VL CDR2、序列为SEQID NO:21的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第30、31、32、33、35、36位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和33位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和32位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第55、56、57位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1和VL CDR2中各自独立地具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1中具有3个,4个,5个或6个组氨酸残基的置换,且在VL CDR2中具有2个或3个组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换,并在第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、33、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、34、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区所含有的VH CDR1和/或VH CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体重链可变区的第26,28,30,31,54位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个)组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:22所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:30所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:38所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:46所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ IDNO:47所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:54所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:62所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:63所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:70所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:71所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:78所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:79所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:86所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:94所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:95所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:102所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:103所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:110所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:111所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:24的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:25的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:26的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:27的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:28的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:29的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:32的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:33的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:34的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:35的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:36的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:37的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:40的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:41的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:42的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:43的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:44的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:45的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:48的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:49的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:50的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:51的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:52的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:53的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:56的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:57的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:58的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:59的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:60的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:61的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:64的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:65的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:66的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:67的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:68的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:69的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:72的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:73的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:74的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:75的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:76的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:77的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:80的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:81的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:82的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:83的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:84的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:85的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:88的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:89的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:90的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:91的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:92的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:93的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:96的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:97的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:98的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:99的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:100的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:101的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:104的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:105的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:106的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:107的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:108的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:109的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:112的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:113的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:114的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:115的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:116的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:117的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段进一步包含恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含的是IgG重链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含的轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:12所示的重链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:13所示的轻链恒定区。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其包含Fc区。
在某些实施方案中,所述Fc区是IgG的Fc或Fc变体;其中,所述Fc变体与IgG的Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加。
在第二方面,本申请提供了一种IgG Fc的Fc变体,以及包含所述Fc变体的抗体或其抗原结合片段。
本申请提供了一种IgG Fc的Fc变体,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328、330和331位氨基酸残基处具有3处氨基酸残基的置换和1处氨基酸残基的缺失。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328和330位氨基酸残基处具有氨基酸残基的置换,在331位氨基酸残基处具有氨基酸残基的缺失;其中,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的第327位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的第328位氨基酸残基处具有色氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的第330位氨基酸残基处具有丝氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述氨基酸位点是由Eu编号系统获得的。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第252位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第254位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第256位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述氨基酸位点是由Eu编号系统获得的。
在某些实施方案中,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:7的第37、39和41位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第37位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第39位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第41位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:118所示的序列。
在另一方面,本申请提供了另外一种IgG Fc的Fc变体。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQID NO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:8所示的序列。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQID NO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第37、39和41位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:119所示的序列。
在某些实施方案中,如前所述的Fc变体,其中,所述FcγR选自FcγRI,FcγRIIa,FcγRIIb,FcγRIIc,FcγRIIIa,FcγRIIIb,或其任意组合。
在某些实施方案中,所述FcγR源自哺乳动物(例如,鼠,人)。
在某些实施方案中,所述FcγR是人FcγRIIb。
本申请还提供了一种融合蛋白,其包含如前所述的Fc变体。
本申请还提供了分离的核酸分子,其包含编码如前所述的Fc变体或如前所述的融合蛋白的核苷酸序列。
本申请还提供了载体,其包含如前所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中,所述载体为克隆载体或表达载体。
本申请还提供了宿主细胞,其包含如前所述的分离的核酸分子或如前所述的载体。
本申请还提供了制备如前所述的Fc变体或如前所述的融合蛋白,其包括,在允许所述多肽或蛋白表达的条件下,培养如前所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述Fc变体或所述融合蛋白。
本申请还提供了一种抗体或其抗原结合片段,其包含如前所述的Fc变体。
在某些实施方案中,所述抗体为鼠源化抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在某些实施方案中,第一方面的抗体包含如第二方面所述的IgG Fc的Fc变体。在某些实施方案中,第二方面的抗体包含如第一方面所述的在奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)所含有的VH CDR1-3和/或轻链可变区(VL)所含有的VL CDR1-3中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加。在某些实施方案中,第一和第二方面所述的抗体包含如第三方面所述的抗体或其抗原结合片段的特征。
在第三方面,本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)所含有的VH CDR1-3和/或轻链可变区(VL)所含有的VL CDR1-3中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;
其中,奥马珠单克隆抗体包含:如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中含有的VHCDR1、VH CDR2以及VH CDR3;和,如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中含有的VL CDR1、VLCDR2以及VL CDR3;
并且,所述抗体还包含IgG Fc的Fc变体。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1和/或VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;优选地,所述置换为保守置换。
在某些实施方案中,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中,所述奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)包含序列为SEQ IDNO:16的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:17的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:18的VH CDR3;轻链可变区(VL)包含序列为SEQ ID NO:19的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:20的VL CDR2、序列为SEQID NO:21的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第30、31、32、33、35、36位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和33位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和32位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第55、56、57位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1和VL CDR2中各自独立地具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1中具有3个,4个,5个或6个组氨酸残基的置换,且在VL CDR2中具有2个或3个组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换,并在第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、33、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、34、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区所含有的VH CDR1和/或VH CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体重链可变区的第26,28,30,31,54位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个)组氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:22所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:30所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:38所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:46所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:47所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:54所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:62所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:63所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:70所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:71所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:78所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:79所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:86所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:94所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:95所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:102所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:103所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:110所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:111所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:24的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:25的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:26的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:27的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:28的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:29的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:32的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:33的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:34的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:35的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:36的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:37的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:40的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:41的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:42的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:43的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:44的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:45的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:48的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:49的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:50的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:51的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:52的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:53的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:56的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:57的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:58的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:59的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:60的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:61的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:64的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:65的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:66的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:67的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:68的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:69的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:72的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:73的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:74的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:75的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:76的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:77的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:80的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:81的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:82的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:83的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:84的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:85的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:88的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:89的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:90的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:91的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:92的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:93的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:96的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:97的VHCDR2、序列为SEQ ID NO:98的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:99的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:100的VL CDR2、序列为SEQ IDNO:101的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:104的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:105的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:106的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:107的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:108的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:109的VL CDR3。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段包含:含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:112的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:113的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:114的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:115的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:116的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:117的VL CDR3。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328、330和331位氨基酸残基处具有3处氨基酸残基的置换和1处氨基酸残基的缺失。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328和330位氨基酸残基处具有氨基酸残基的置换,在331位氨基酸残基处具有氨基酸残基的缺失;其中,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加;
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG的Fc的第327、328和330位氨基酸残基处具有氨基酸残基的置换,在331位氨基酸残基处具有氨基酸残基的缺失。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc多肽的第327位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc多肽的第328位氨基酸残基处具有色氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc多肽的第330位氨基酸残基处具有丝氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述氨基酸位点是由Eu编号系统获得的。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第252位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第254位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第256位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述氨基酸位点是由Eu编号系统获得的。
在某些实施方案中,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:7的第37、39和41位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第37位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第39位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第41位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:118所示的序列。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQID NO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸。
在某些实施方案中,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:8所示的序列。
在某些实施方案中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQID NO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第37、39和41位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸。
在某些实施方案中,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加。
在某些实施方案中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:119所示的序列。
在某些实施方案中,所述FcγR选自FcγRI,FcγRIIa,FcγRIIb,FcγRIIc,FcγRIIIa,FcγRIIIb,或其任意组合。
在某些实施方案中,所述FcγR源自哺乳动物(例如,鼠,人)。
在某些实施方案中,所述FcγR是人FcγRIIb。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段进一步包含恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含的是IgG重链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含的轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:12所示的重链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:13所示的轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区,重链恒定区,IgG的Fc或Fc变体。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链具有如SEQ ID NO:4,9,11,120或121所示的序列。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段的重链具有如SEQ ID NO:4,9,11,120或121所示的序列,且所述抗体或其抗原结合片段的轻链具有如SEQ ID NO:5所示的序列。
在某些实施方案中,所述抗体为鼠源化抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段带有标记。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在第四方面,本申请还提供了一种分离的核酸分子,其包含编码如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在第五方面,本申请提供了载体,其包含如前所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中,所述载体为克隆载体或表达载体。
在第六方面,本申请提供了宿主细胞,其包含如前所述的分离的核酸分子或如前所述的载体。
在第七方面,本申请提供了制备如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养如前所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在第八方面,本申请提供了多特异性分子,其包含如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述多特异性分子特异性结合IgE,并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
在某些实施方案中,所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二特异性结合分子(例如第二抗体)。
在第九方面,本申请提供了药物组合物,其包含如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段或如前所述的多特异性分子,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中,药物组合物还包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中,所述另外的药学活性剂是具有抗过敏或抗哮喘的药物。
在第十方面,本申请提供了试剂盒,其含有如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在某些实施方案中,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别如前所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述第二抗体还包括可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在第十一方面,本申请提供了如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、如前所述的多特异性分子或如前所述的药物组合物用于制备药物的用途,所述药物用于降低或抑制IgE水平或者用于预防和/或治疗受试者的与IgE相关的疾病。
在某些实施方案中,与IgE相关的疾病是1型超敏反应性疾病。
在某些实施方案中,所述与IgE相关的疾病选自过敏反应,过敏性鼻炎,过敏性咳嗽,过敏性休克,食物过敏,超敏反应,哮喘(如中至重度持续性过敏性哮喘),慢性荨麻疹(如慢性自发性荨麻疹),急性荨麻疹,急性支气管痉挛,异位性皮炎,炎性皮肤病,湿疹,喉头水肿,血管神经性水肿,鼻息肉,鼻窦炎症等。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人、猴或鼠。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段单独使用,或与另外的药学活性剂联合使用。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在中性或碱性条件下与IgE特异性结合;优选地,所述中性或碱性条件为pH大于等于7(例如,pH等于7.4)的条件。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在pH等于6的条件下不与IgE特异性结合。
在第十二方面,本申请提供了一种用于在受试者中降低或抑制IgE水平或者预防和/或治疗与IgE相关的疾病的方法,所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、如前所述的多特异性分子或如前所述的药物组合物。
在某些实施方案中,与IgE相关的疾病是1型超敏反应性疾病。
在某些实施方案中,所述与IgE相关的疾病选自过敏反应,过敏性鼻炎,过敏性咳嗽,过敏性休克,食物过敏,超敏反应,哮喘(如中至重度持续性过敏性哮喘),慢性荨麻疹(如慢性自发性荨麻疹),急性荨麻疹,急性支气管痉挛,异位性皮炎,炎性皮肤病,湿疹,喉头水肿,血管神经性水肿,鼻息肉,鼻窦炎症等。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人、猴或鼠。
在某些实施方案中,所述方法还包括施用另外的具有抗过敏或抗哮喘活性的药物。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在中性或碱性条件下与IgE特异性结合;优选地,所述中性或碱性条件为pH大于等于7(例如,pH等于7.4)的条件。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在pH等于6的条件下不与IgE特异性结合。
在第十三方面,本申请提供了一种检测IgE在样品中的存在或其量的方法,其包括以下步骤:
(1)将所述样品与如第一方面、第二方面或第三方面所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与IgE之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中,所述IgE是人源IgE。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在中性或碱性条件下与IgE特异性结合;优选地,所述中性或碱性条件为pH大于等于7(例如,pH等于7.4)的条件。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段在pH等于6的条件下不与IgE特异性结合。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“IgG”是指由免疫球蛋白γ基因所编码的一种多肽。在人类中,IgG包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中,IgG包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。抗体IgG类中已知的Ig结构域VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL以及CL。
如本文中所使用的,术语“Fc”、“Fc区”具有相同的含义,可以互换使用。其是指免疫球蛋白结构域第一恒定区以外的恒定区。在某些实施方案中,Fc是指IgA、IgD和IgG免疫球蛋白结构域的最后两个恒定区。在某些实施方案中,Fc是指IgE和IgM免疫球蛋白结构域的最后三个恒定区。在某些实施方案中,Fc包含N-末端的柔性铰链。在某些实施方案中,Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。在某些实施方案中,Fc是由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。在某些实施方案中,人IgG重链Fc区的编号方式依照Kabat的EU标引方式(参见,例如,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。在某些实施方案中,Fc是分离的Fc区域,或位于抗体或其抗原结合片段中的Fc区域,或是含有Fc区域氨基酸序列的多肽。
如本文中所使用的,术语“Fcγ受体”或“FcγR”具有相同的含义,可以互换使用。其是指能够结合IgG Fc区,且由FcγR基因所编码的蛋白。Fcγ受体包括但不限于FcγRI(CD64),包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc;FcγRII(CD32),包含同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc;以及FcγRIII(CD16),包含同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2);上述内容可参见,例如,Jefferis等.,2002,ImmunolLett 82:57-65。FcγR可来自任何生物体,包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴子和人。
其中,FcγRIIa是一种活化型受体,与炎症发生及组织损伤有关,是导致自身免疫性疾病的重要受体之一。目前,已有研究证实,降低IgG与FcγRIIa的结合,有利于降低自身免疫性疾病的发生。FcγRIIb的结构较特殊,其介导的是免疫抑制信号,激活后会下调细胞的相应功能。FcγRIIb主要在髓系细胞和B细胞表面(是B细胞表面唯一的FcR)表达,在B细胞功能的负调节中起到重要作用。
如本文中所使用的,术语“pH依赖性”是指酸性pH下抗体的抗原结合活性不同于中性或碱性pH下抗体的抗原结合活性。在某些实施方案中,pH依赖性是指酸性pH下抗体的抗原结合活性弱于中性或碱性pH下抗体的抗原结合活性。
本文所用的术语“抗体”是指能够特异性结合靶抗原的源自免疫球蛋白的分子,所述源自免疫球蛋白的分子通过位于其可变区中的至少一个抗原结合位点来结合所述靶抗原。当提及术语“抗体”时,除非上下文明确指出,其不仅包括完整抗体,而且包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段。“完整抗体”典型地由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“框架区”或“FR”残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、(Fab’)2、Fd、Fv、二硫键连接的Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody,sdAb)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005;Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的,术语“全长抗体”意指,由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中,“全长重链”是指这样的多肽链,其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成;优选地,“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种,例如人;也可以是嵌合抗体或鼠源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位,这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的,术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“(Fab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段;术语“Fab’片段”意指还原连接(Fab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段,由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的,术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是,能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为,六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而,即便是一个可变区(例如Fd片段,其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原,尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的,术语“scFv”是指,包含VL和VH结构域的单个多肽链,其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Roseburg和Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在一些情况下,scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成di-scFv,其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成(scFv)2,其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
术语“多特异性抗体”是指对两种或两种以上(例如三种或四种)不同抗原(或表位)具有结合特异性的抗体。多特异性抗体包含对不同抗原(或表位)具有结合特异性的多个抗原结合结构域,从而能够结合至少两个不同的结合位点和/或靶分子。多特异性抗体所包含的各个抗原结合结构域可以各自独立地选自全长抗体(例如IgG抗体)或其抗原结合片段(例如Fv片段、Fab片段、(Fab’)2片段或scFv)。在一些情况下,各个抗原结合结构域通过肽接头连接。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指,这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在某些实施方案中,术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体,其中抗体的重链可变区和轻链可变区来自第一抗体,而抗体的重链恒定区和轻链恒定区来自第二抗体。
如本文中所使用的,术语“鼠源化抗体”可包括这样的抗体,其中抗体的重链可变区和轻链可变区来自全人源抗体、而抗体的重链恒定区和轻链恒定区来自鼠源恒定区。如本文中所使用的,术语“全人源抗体”是指一种抗体,组成的抗体氨基酸序列全部来自人类,可以通过噬菌体及酵母展示、转基因动物、单个B细胞等技术获得。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990;59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中,可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的,本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,其实例包括但不限于,酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质,如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如,)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,稀释剂,维持渗透压的试剂,延迟吸收的试剂,防腐剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水,水性缓冲液(如缓冲盐水),醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如硫柳汞,2-苯氧乙醇,对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义,其能够稳定药物中的活性成分的期望活性,包括但不限于谷氨酸钠,明胶,SPGA,糖类(如山梨醇,甘露醇,淀粉,蔗糖,乳糖,葡聚糖,或葡萄糖),氨基酸(如谷氨酸,甘氨酸),蛋白质(如干燥乳清,白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中,所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中,此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的,术语“预防”是指,为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的,术语“治疗”是指,为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的,有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即,不再恶化)疾病的状态,延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部),无论是可检测或是不可检测的。此外,“治疗”还可以指,与期望的存活期相比(如果未接受治疗),延长存活期。
如本文中所使用的,术语“受试者”是指哺乳动物,例如人、猴、鼠。在某些实施方案中,所述受试者(例如人、猴、鼠)患有与α-Synuclein相关的疾病(例如帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩或其组合),或者,具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的,术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如,预防疾病有效量是指,足以预防,阻止,或延迟所述疾病的发生的量;治疗疾病有效量是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如,对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的,术语“EU”是一种抗体的编号系统,也称为EU NumberingSystem or Scheme。其的由来是上个世纪60年代末(1968-1969),Gerald M Edelman等人分离纯化得到第一个人IgG1免疫球蛋白,命名为Eu,测定了其氨基酸序列并为其编号(Edelman GM et al,1969,Proc Natl Acad USA,63:78-85)。其它的免疫球蛋白的重链恒定区与Eu进行氨基酸序列比对,对应氨基酸位置就是Eu编号。
发明的有益效果
在第一方面,本申请在奥马珠单抗含有的CDR序列的基础上进行组氨酸突变,获得了对IgE具有pH依赖性的抗体。本申请的具有pH依赖性的抗体具备下述优势:在体液弱碱性环境中与IgE结合后,能够频繁携带IgE被细胞内吞。当抗体与IgE的复合物被胞吞进入内吞小体的弱酸性环境时,抗体与IgE分离,此后IgE被运输至溶酶体降解,而抗体则随FcRn重新循环到细胞外,再次介导IgE的胞吞降解。由此,本申请的具有pH依赖性的抗体有利于降低用药剂量,具有成药潜力。
在第二方面,本申请对IgG抗体的Fc区进行突变,获得了对FcγRIIb具有高亲和力的含有Fc变体的抗体,所述抗体对人源FcγRIIb和鼠源FcγRIIb具有相似的高亲和力。
进一步的,本申请通过实验证实了具有上述两种突变的抗体与现有技术中的抗体(例如,奥马珠单抗)相比,延长了抗体的血清半衰期,而且能够在较低的用药剂量下,对IgE快速清除。并且,不仅能够降低小鼠体内的总IgE含量,还能降低游离的IgE含量。因此,本申请在与IgE相关的疾病(例如,1型超敏反应性疾病)中具有较大的应用潜能,显示出了巨大的成药潜力。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了噬菌体展示建库策略和筛选出的抗体的建库区序列,其中,图中“建库序列”中的简并碱基S代表C或G,R代表A或G,Y代表C或T,M代表A或C,W代表A或T;所列“筛选到的序列”均为已证实的具有pH依赖性的IgE抗体的核酸序列,与奥马珠单抗核酸序列有差异的碱基用阴影标出。
图2显示了奥马珠单抗和12种筛选出的抗体在pH 7.4和pH 6.0条件下与IgE的SPR曲线。
图3显示了FcγRIIb高亲和力Fc的筛选结果,其中,图3中的A显示了哺乳动物展示系统三轮流式细胞仪筛选结果,图3中的B显示了野生型IgG Fc与Fc-EWPS突变体氨基酸序列的比较结果,图3中的C显示了用SPR技术检测的Fc-EWPS突变体与其他FcγR受体亲和力的横向比较结果。
图4显示了小鼠体内IgE清除实验的结果。其中,图4中的A显示了实验方案,包括给药时间、剂量,IgE的注射时间、剂量,以及取血时间点。图4中的B显示了血清中总IgE含量测定方法。图4中的C显示了血清中游离IgE含量测定方法。图4中的D显示了野生型C57小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化。图4中的E显示了野生型C57小鼠血清中的游离IgE(freeIgE)含量随时间的变化。图4中的F显示了C57来源的FcγRIIb人源化小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化。图4中的G显示了C57来源的FcγRIIb人源化小鼠血清中的游离IgE含量随时间的变化。
图5显示了用药剂量对IgE清除效果的影响。其中,图5中的A-C显示了不同用药剂量下,小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化。图5中的D-F显示了不同用药剂量下,小鼠血清中的游离IgE(free IgE)含量随时间的变化。图5中的G显示了不同奥马珠单抗用药剂量下,游离IgE含量变化曲线的比较。50μg,20μg和10μg给药量对应的游离IgE曲线取自面板(D-F)中相应的曲线,100μg奥马珠单抗给药量对应游离IgE曲线取自图4G中相应的曲线。图5中的H显示了不同NK-2-12-EWPS用药剂量下,游离IgE含量变化曲线的比较。50μg,20μg和10μg给药量对应的游离IgE曲线取自面板(D-F)中相应的曲线,100μg NK-2-12-EWPS给药量对应游离IgE曲线取自图4G中相应的曲线。图5中的I显示了奥马珠单抗用药100μg时的IgE含量变化曲线(曲线取自图4G),与NK-2-12-EWPS用药20μg时的IgE含量变化曲线的比较。
图6显示了NK-2-12-SELF的小鼠体内IgE清除实验结果。其中,图6中的A显示了野生型C57小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化。图6中的B显示了野生型C57小鼠血清中的游离IgE(free IgE)含量随时间的变化。图6中的C显示了C57来源的FcγRIIb人源化小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化。图6中的D显示了C57来源的FcγRIIb人源化小鼠血清中的游离IgE含量随时间的变化。
图7显示了NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF的血清半衰期和用药剂量对小鼠体内IgE清除效果的影响,其中,图7中的A为NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-EWPS在FcRn人源化小鼠体内的药代动力学曲线;图7中的B为NK-2-12-YTE-SELF和NK-2-12-SELF在FcRn人源化小鼠体内的药代动力学曲线;图7中的C为NK-2-12-YTE-EWPS不同用药剂量下,FcγRIIb人源化小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化;图7中的D为NK-2-12-YTE-EWPS不同用药剂量下,FcγRIIb人源化小鼠血清中的游离IgE含量随时间的变化;图7中的E为NK-2-12-YTE-SELF不同用药剂量下,FcγRIIb人源化小鼠血清中的总IgE含量随时间的变化;图7中的F为NK-2-12-YTE-SELF不同用药剂量下,FcγRIIb人源化小鼠血清中的游离IgE含量随时间的变化。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1:序列的描述
注:序列中的方框所标出的氨基酸残基为突变后的氨基酸残基,下划线标出的是IgG Fc的铰链区。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如,本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术,可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis),《分子克隆:实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第2次编辑(1989);《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑,(1987));《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司):《PCR 2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995)),以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.抗体的筛选和获得
1.噬菌体文库的建立
通过分析公开的奥马珠单抗与IgE的复合物结构(PDB:5HYS),发明人发现奥马珠单抗主要通过重链CDR1(HCDR1)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)和轻链CDR2(LCDR2)与IgE的Fc段CH3区结合,而重链CDR2(HCDR2)中仅有Tyr54与IgE接触,轻链CDR3(LCDR3)则完全不与IgE接触。因此发明人合成了编码VH-VL(scFv)形式奥马珠单抗(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列和含有简并碱基的引物(基因和引物均委托苏州金唯智生物科技有限公司合成),通过Overlap PCR的方法对奥马珠单抗scFv基因中的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2四个区域以及重链Tyr54的密码子进行了建库(建库区域序列如图1所示)。
此后,将scFv基因文库构建到噬菌体展示质粒pCGMT3的两个SfiI酶切位点之间形成质粒文库,转入大肠杆菌XL1-Blue。然后按照噬菌体展示的标准方法,用辅助噬菌体M13KO7感染含有质粒文库的大肠杆菌XL1-Blue,繁殖出重组噬菌体文库用于后续筛选。
发明人还根据奥马珠单抗与IgE的复合物结构(PDB:5HYS)中的IgE Fc氨基酸序列,合成了带有AVI标签和6×His标签的IgE Fc基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成),并构建到了哺乳动物细胞表达载体pTT5(NovoPro,货号:V001466)中,用HEK293F细胞(Thermo Fisher Scientific,货号R79007)和FreeStyleTM培养基(GibcoTM,货号:12338-018)进行了蛋白表达。此后,发明人使用AKTA蛋白纯化仪(GE Healthcare,型号:pure)和HisTrap HP层析柱(GE Healthcare,货号:17524701)按照设备说明书所述纯化步骤,纯化获得了带有6×His和AVI标签的IgE Fc,并用生物素化试剂盒(GeneCopoeia,货号:BI001)对纯化获得的部分蛋白进行了生物素化,将生物素连接到IgE Fc的AVI标签处,用于后续淘选步骤。
淘选时,首先将生物素化的IgE Fc结合于链霉亲和素磁珠(Invitrogen,货号:11205D)作为固定相。然后按照噬菌体展示的标准方法,先将结合有IgE Fc的磁珠与溶于BSA-PBST pH7.4(添加5% BSA和0.05% Tween 20的PBS pH7.4)的噬菌体文库室温共孵育两小时,再用PBST pH 7.4(添加0.05% Tween 20的PBS pH7.4)洗涤磁珠四次,以去除非特异吸附的噬菌体,最后用PBS pH 6.0进行洗脱,由此来获得在pH7.4时与IgE结合,在pH 6.0时与IgE解离的噬菌体。此后按照噬菌体展示的标准方法,用洗脱获得的噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue,使淘选后的文库质粒进入菌体,然后再用辅助噬菌体M13KO7感染菌体,扩增繁殖重组噬菌体,用于下一轮淘选。
经过三轮淘选之后,重组噬菌体得到了明显的富集,富集倍数达到581倍,提示已获得对IgE Fc具有pH依赖性结合能力的噬菌体。
2.抗体的获得
对经过三轮淘选获得的噬菌体进行质粒测序,结果显示在随机挑选的150个单克隆中,图1中所示的NK-2-12序列高频出现,超过三分之一的scFv序列均为该序列,而其他序列则鲜有重复出现。发明人将NK-2-12以及其他14种随机挑选的克隆的序列(共计15个序列)构建到了pTT5(NovoPro,货号:V001466)载体中,形成完整抗体基因。然后用前述表达IgE Fc的方法进行了表达,并使用AKTA蛋白纯化仪(GE Healthcare,型号:pure)和HiTrap Protein AHP层析柱(GE Healthcare,货号:29048576)按照设备说明书所述纯化步骤,纯化获得了这15种抗体。通过公司测序获得了这些抗体的序列,具体如表3所示。其中,NK-2-12的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
此外发明人还合成了带有6×His标签的人源IgE型抗鸡卵清溶菌酶(anti-HEL)抗体的基因(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成),构建到了pTT5(NovoPro,货号:V001466)质粒中,并用前述表达纯化IgE Fc的方法对其进行了表达纯化,用于后续研究。该人源anti-HEL IgE重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,该人源anti-HEL IgE轻链氨基酸序列SEQ ID NO:3所示。
发明人利用表面等离子共振(SPR)技术检测了上述15种抗体以及奥马珠单抗在PBS pH 7.4和PBS pH 6.0条件下对IgE的亲和力。具体方法为,首先将anti-6×His抗体通过氨基偶联试剂(Cytiva,货号:BR-1000-50)固定于Series S CM5芯片(Cytiva,货号:29-1049-88)上,然后将芯片安装到表面等离子共振仪(GE Healthcare,型号:Biacore T200)上。将带有6×His标签的anti-HEL IgE用特定pH的PBS稀释至浓度400nM,并以10μl/min的流速流过芯片60s,进行进样捕获。再将上述15种抗体溶于同样pH的PBS中,并用该PBS配置成2倍系列稀释的溶液梯度(如500nM,250nM,125nM,至15.625nM等),以30μl/min的流速进样,结合120s,再用该PBS流过芯片解离240s。然后用10mM Glycine-HCl(pH 1.5)再生缓冲液以流速30μl/min洗脱IgE和抗体30s,对芯片进行再生。在上述IgE捕获、进样和解离步骤中,测量在pH 7.4条件下抗体与IgE的亲和力时,所用PBS均为PBS pH7.4;测量在pH 6.0条件下抗体与IgE的亲和力时,所用PBS均为PBS pH 6.0。经由IgE捕获、进样、解离和芯片再生循环交替进行后,获得的数据经仪器配套软件Biacore T200 Evaluation Software按照稳态结合模型进行拟合,得到对应的结合常数Ka和解离常数Kd,再计算得到结合解离常数KD(KD=Kd/Ka)。
测量结果显示,15种被测抗体中的12种(编号分别为NK-2-12、NK-2-5、NK-177、NK-76、NK-1-6、NK-1-5、NK-174、NK-100、NK-2-4、NK-1-11、NK-77和NK-181,建库区核酸序列如图1所示)表现出了与IgE结合的pH依赖性(SPR曲线如图2所示,计算出的KD如表2所示)。这12种抗体均在pH 7.4条件下与IgE结合,并且结合解离常数KD多数在10-8mol/L数量级,少数为10-7mol/L数量级,而在pH 6.0条件下完全检测不到抗体与IgE的结合。作为对照的奥马珠单抗则未表现出对IgE结合的pH依赖性,无论在pH 7.4还是pH 6.0条件下均表现出与IgE很高的亲和力(图2,表2)。
表2.筛选出的抗体与IgE的结合解离常数
注:“ND”表示检测不到结合活性。
表3.抗体的序列(Kabat)
实施例2.与pH依赖性相关的突变位点的分析
对比分析这12种抗体的建库区序列(图1)显示HCDR3区几乎不出现突变,证明HCDR3是抗体与IgE结合的核心区域,对产生突变的耐受性极低。HCDR1区中12种抗体没有显示出较为统一的突变(图1),而且包括NK-2-12在内的5种抗体在该区域内完全不含有突变,证明HCDR1的突变不是实现抗体与IgE的pH依赖性结合的关键因素。在12种抗体中,NK-2-5和NK-177的序列仅在重链Y54这一位点有所区别(图1)。两种抗体都表现出了与IgE结合的pH依赖性,但在pH 7.4条件下含有重链Y54H突变的NK-2-5比不含该突变的NK-177表现出了略高的亲和力(表2),证明重链Y54H突变对抗体的pH依赖性贡献较小,但对体液环境下抗体与IgE的亲和力有一定正面作用。
在12种抗体的LCDR1中出现有大量且统一的组氨酸替换突变(图1,表4)。奥马珠单抗LCDR1原氨基酸序列为30-DYDGDSY-36,除其中的D34几乎不发生组氨酸替换突变以外,在12种pH依赖性抗体中,其他6个氨基酸残基的组氨酸替代突变(奥马珠单抗轻链基础上的D30H、Y31H、D32H、G33H、S35H和Y36H)均以超过三分之二的高频出现。在12种抗体中,有5种抗体包含全部上述6个组氨酸替代突变,有4种抗体(包括NK-2-12在内)包含上述6个组氨酸替代突变中的5个。剩余的3种抗体中,有2种抗体包含上述6个组氨酸替代突变中的4个,1种抗体包含上述6个组氨酸替代突变中的3个。
在LCDR2区中,12种抗体同样出现了高度统一的组氨酸替换突变(图1,表4),主要表现为对奥马珠单抗LCDR2原氨基酸序列53-YAASY-57的S56H和Y57H突变,在部分抗体中还出现有A55H突变。在12种pH依赖性抗体中,多达11种同时包含S56H和Y57H突变,而且全部12种抗体都包含A55H、S56H和Y57H突变中的至少两个,证明这三个突变的组合对于实现与IgE的pH依赖性结合起重要作用。除此以外,NK-2-12的LCDR2除拥有上述S56H和Y57H的两个点突变以外,还在Ala55和S56H突变氨基酸之间意外插入了一个组氨酸残基(将该插入氨基酸残基编号为55a,该插入突变命名为H55a插入突变)。比较NK-2-12和NK-100两种抗体的序列显示,二者仅在LCDR2区有所差异。NK-100在该区域包含A55H、S56H和Y57H三个连续的组氨酸替代突变,NK-2-12则保留了Ala55,但却由H55a插入突变和S56H、Y57H同样构成了三个连续的组氨酸突变(图1,表4)。NK-2-12和NK-100虽然都表现出了对IgE的pH依赖性,但在pH7.4条件下NK-2-12对IgE的亲和力远高于NK-100(表2),这表明H55a的插入具有重要的正面作用。不仅如此,如前所述,NK-2-12的序列在噬菌体展示筛选结果中是唯一高频出现的序列,表明与其他抗体相比NK-2-12必然还具有某种特殊的优势,例如可能更利于表达或折叠等。
表4.筛选出的抗体的LCDR1和LCDR2氨基酸序列
注:“*”表示H55a插入突变。
综上,数据分析表明,在奥马珠单抗轻链序列的基础上引入D30H、Y31H、D32H、G33H、S35H、Y36H、A55H、H55a插入突变、S56H、Y57H突变或这些突变的组合,可制备出在人体生理pH(~pH 7.4)条件下能与IgE结合,而在pH 6.0条件下不与IgE的结合的抗体。
本申请的具有pH依赖性的抗体具备下述优势:在体液弱碱性环境中与IgE结合后,能够频繁携带IgE被细胞内吞。当抗体与IgE的复合物被胞吞进入内吞小体的弱酸性环境时,抗体与IgE分离,此后IgE被运输至溶酶体降解,而抗体则随FcRn重新循环到细胞外,再次介导IgE的胞吞降解。由此,本申请的具有pH依赖性的抗体有利于降低用药剂量,具有成药潜力。
实施例3.突变位点与pH依赖性之间的关联性
为进一步验证上述LCDR1和LCDR2区域相关突变与抗体pH依赖性的关系,发明人在NK-2-12的基础上,将LCDR1和LCDR2区域所包含的部分突变位点回复突变成了奥马珠单抗的相应序列,并测试了相关回复突变抗体在pH 7.4和pH 6.0条件下与IgE的结合解离常数。抗体的表达纯化方法和结合解离常数测定方法如实施例1所述。具体来说,由表4中的NK-2-12抗体为基础,改造构建了抗体NK-2-12-L1,具体改造的CDR序列请见表5,其余CDR序列与NK-2-12抗体相同。
结果显示,与NK-2-12相比,将NK-2-12的LCDR2序列回复成奥马珠单抗的LCDR2序列(NK-2-12-L1)几乎不会改变抗体在pH 7.4时与IgE的亲和力,但是在pH 6.0条件下抗体与IgE的亲和力有所提高,结合解离常数由检测不到(ND)变为10-5数量级(表5)。这说明LCDR2区域所包含突变对于抗体实现与IgE的pH依赖性结合是有贡献的。但同时也能看到,即使缺少了LCDR2区域的突变,抗体仍能够维持相当高水平的pH依赖性,抗体在pH 7.4和pH6.0条件下与IgE的结合解离常数仍然相差350余倍,证明LCDR1所包含突变可在相当大程度上独立实现抗体与IgE的pH依赖性结合。
因此,上述实验表明,在奥马珠单抗含有的CDR序列的基础上,仅对LCDR1的部分氨基酸位点进行组氨酸突变,获得的抗体仍然具有pH依赖性,即,抗体在pH 7.4和pH 6.0条件下与IgE的结合解离常数具有较大差距。
表5.回复突变抗体的LCDR1和LCDR2氨基酸序列和与IgE的结合解离常数
*H55a插入突变,ND表示检测不到。
实施例4.FcγRIIb高亲和力Fc的筛选获得
1.FcγRIIb高亲和力Fc的筛选
发明人设计了一种新型建库策略,对IgG Fc中与FcγRIIb接触的区域进行了随机建库,并在此基础上使用发明人团队前期开发并发表的哺乳动物展示筛选系统(Chen etal.,2021,doi:10.7150/thno.51299),从中筛选出了一种能够增强与受体FcγRIIb亲和力的IgG Fc突变体。
根据野生型IgG Fc(wtFc,SEQ ID NO:6)与FcγRIIa(PDB:3RY6)和FcγRIIIa(PDB:1E4K)等FcγR的复合物结构,IgG Fc氨基酸序列中的第327-331位氨基酸(氨基酸序列为ALPAP)是Fc与受体相互作用的关键部位之一。本申请的发明人提出通过Overlap PCR的方法,对IgG Fc核酸序列中对应氨基酸序列的第327-331位氨基酸进行建库,将该区域原本的五个连续的密码子改成四个连续的NNK(N代表任意碱基,K代表G或T碱基)密码子,使基因的翻译产物在该区域序列由ALPAP变为四个连续的随机氨基酸残基。此后,发明人按照团队之前所发表的哺乳动物展示筛选系统中所述的方法,构建了哺乳动物展示库,并对受体FcγRIIb的胞外区进行了筛选,以获得对FcγRIIb具有特异性高亲和力的IgG Fc突变体。
筛选结果显示,经过三轮筛选,对FcγRIIb具有更高亲和力的细胞得到了富集(图3A)。随机挑取其中20个单细胞克隆进行测序,发现筛选到的序列高度统一,约70%的序列均是将野生型IgG Fc氨基酸序列第327-331位氨基酸的ALPAP替换成为了EWPS(将该突变命名为EWPS突变,图3B)。带有EWPS突变的IgG Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(方框标出EWPS突变,下划线标出IgG Fc的铰链区)。
2.IgG Fc-EWPS突变体与受体FcγRIIb的亲和力鉴定
发明人用前述方法,纯化了IgG Fc-EWPS突变体,然后用SPR技术分别检测了IgGFc-EWPS突变体与带有6×His标签的人源FcγRIIb胞外区(ACROBiosystems,货号:CDB-H5228)以及带有6×His标签的鼠源FcγRIIb胞外区(ACROBiosystems,货号:CDB-M52H7)的结合解离常数。结果显示IgG Fc-EWPS突变体对人源FcγRIIb的KD为2.47×10-7mol/L,比发明人团队此前公开报道的野生型IgG Fc对人源FcγRIIb的亲结合解离常数(KD=2.41×10-6)低一个数量级,证明EWPS突变确实大幅提高了人源IgG Fc与人源FcγRIIb的亲和力。同时,IgG Fc-EWPS突变体对鼠源FcγRIIb的KD为2.94×10-7mol/L,与对人源FcγRIIb的解离常数相近。
发明人进一步横向比较了IgG Fc-EWPS突变体与人源FcγRIIIaF158(ACROBiosystems,货号:CDB-H5220)、FcγRIIIaV158(ACROBiosystems,货号:CD8-H52H4),以及FcγRIIaH131(ACROBiosystems,货号:CD1-H5223)等受体的亲和力。结果显示,与野生型IgG Fc相比,IgG Fc-EWPS除与FcγRIIb的亲和力有大幅升高以外,与FcγRIIIaF158和FcγRIIaH131的亲和力无明显变化(图3C),而与FcγRIIIaV158的亲和力则有显著下降。这些进一步证明了EWPS突变能够较为特异性地增强IgG Fc与FcγRIIb的亲和力。
综上,IgG Fc的EWPS突变体特异性地对受体FcγRIIb具有高亲和力。同时IgG Fc的EWPS突变体对人源FcγRIIb和鼠源FcγRIIb具有相似的亲和力,因此EWPS突变具有可在FcγRIIb非转基因小鼠模型上使用的优势。
实施例5.NK-2-12-EWPS在小鼠体内对人源IgE的清除效果
发明人在前述抗体NK-2-12的基础上,将前述能够增强抗体与受体FcγRIIb亲和力的EWPS突变引入到抗体的Fc端,构成NK-2-12-EWPS抗体。NK-2-12-EWPS重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示(方框标出引入的组氨酸突变和EWPS突变),NK-2-12-EWPS轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
表达纯化后的NK-2-12-EWPS抗体被用于在野生型C57小鼠(购自维通利华)或C57来源的FcγRIIb人源化小鼠体内检测对人源IgE的清除效果。实验时,对照组和实验组均随机分组,每组5只小鼠。实验方法如图4A所示,其中向小鼠腹腔注射的IgE为实施例1所述的人源anti-HEL IgE。在向小鼠腹腔注射IgE之前30分钟时,先按100μg/只的剂量向小鼠腹腔注射待测抗体(NK-2-12或NK-2-12-EWPS)作为各实验组,或注射奥马珠单抗作为正对照组,或不做任何注射作为负对照组。待按50μg/只的剂量向小鼠腹腔注射IgE之后,于1、2、3、8、22小时五个时间点取小鼠尾静脉血(每只每次取血50μl),室温静置待其凝固之后离心获得血清。
血清中总人源IgE含量检测方法如图4B所示,为标准的夹心法ELISA。包被96孔酶标板所用抗体为鼠源IgM型抗人IgE抗体HP6061(Southern Biotech,货号:9240-01),使用浓度为该抗体说明书中的推荐浓度。如说明书所述,该抗体结合人IgE时与奥马珠单抗或FcεRI均不发生冲突,即该抗体既能结合游离的IgE,又能结合已与奥马珠单抗或FcεRI结合的IgE。抗体HP6029(Southern Biotech,货号:9250-05)是鼠源IgG型抗人IgE的HRP酶联抗体,如说明书所述,该抗体结合人IgE时与HP6061或奥马珠单抗均不发生冲突。因此该酶联抗体可按照说明书中的推荐浓度,配合底物ABTS(Thermo Scientific,货号:002024),用来探测被HP6061捕捉到的IgE总量。检测血清中的总IgE含量时,首先用上述两种抗体和已知浓度的IgE建立标准曲线,用于测算待测血清样品中的IgE浓度。
血清中游离人源IgE含量检测方法为改进的夹心法ELISA,如图4C所示。包被96孔酶标板所用蛋白为IgE的受体FcεRI(义翘神州,货号:13193-HNAH),使用浓度为1μg/ml。只有游离IgE才能被其受体FcεRI捕捉到。由于酶联抗体HP6029与FcεRI之间有表位冲突,因此不能用于检测被FcεRI捕捉到的IgE浓度。因此可先用HP6061来结合被FcεRI捕捉到的IgE,再用山羊源抗鼠IgM的HRP酶联抗体,配合底物ABTS来检测HP6061的含量,以反映游离IgE的含量。检测血清中的游离IgE含量时,同样需要先用已知浓度的IgE通过上述方法建立标准曲线,用于测算待测血清样品中的游离IgE浓度。
野生型C57小鼠体内IgE清除实验结果如图4D和4E所示。向小鼠体内注射奥马珠单抗会导致IgE半衰期的延长,表现为该组小鼠血清中的IgE始终含量高于只注射IgE的负对照组小鼠(图4D)。这与临床上注射奥马珠单抗会造成患者血液中的总IgE含量进一步升高完全一致。相反,作为一款上市药物,奥马珠单抗对于降低小鼠血清中的游离IgE浓度则起到了显著的效果(图4E)。本申请的NK-2-12-EWPS抗体,在降低小鼠体内总IgE方面表现出了优异的效果。在注射有NK-2-12-EWPS的小鼠体内,血清中的IgE在2~3小时之后就基本被完全清除(图4D),表现远优于奥马珠单抗。由于NK-2-12-EWPS在短时间内就已清除掉了小鼠血清中几乎全部IgE,因此小鼠血清中的游离IgE含量同样极低(图4E),全程低于注射奥马珠单抗的小鼠。而Fc端未做改造的NK-2-12抗体在降低小鼠体内总IgE和游离IgE方面,则均未表现出效果(图4D,E)。
为更贴近人体环境,发明人进一步验证了NK-2-12-EWPS在C57来源的FcγRIIb人源化转基因小鼠(南模生物,货号:NM-HU-2000010)体内对人源IgE的清除效果。实验结果与野生型C57小鼠体内人源IgE清除实验结果类似,注射奥马珠单抗有效降低了小鼠体内的游离IgE,但又延长了IgE的半衰期,造成了IgE总量的积累(图4F,G)。Fc端未做改造的NK-2-12抗体同样未能降低小鼠体内总IgE和游离IgE(图4F,G)。而注射NK-2-12-EWPS的小鼠体内的IgE得到了迅速地清除,无论小鼠体内总IgE含量和游离IgE含量,均全程低于注射奥马珠单抗组(图4F,G)。
这些小鼠体内实验均都表明NK-2-12-EWPS能够通过不同于奥马珠单抗的机制,降低体内IgE含量。尤其NK-2-12-EWPS具有降低体内总IgE的能力,这是奥马珠单抗所不具备的。即使在降低游离IgE方面,NK-2-12-EWPS也在很大程度上优于奥马珠单抗,因此具有重大成药潜力。
实施例6.NK-2-12-EWPS在小鼠体内的用药剂量研究
原理上,奥马珠单抗是通过对IgE的中和来降低游离IgE含量。因此,为获得充足的中和效果,奥马珠单抗的用量就不能低于患者体内IgE的总量,否则就一定会有部分IgE未被中和。事实上,奥马珠单抗的临床用量通常需要高达上百倍于患者体内的IgE总量(根据公开的《奥马珠单抗的中国剂量表》计算得到)。而发明人提出的NK-2-12-EWPS抗体则是通过对全部IgE的清除,来降低体内的游离IgE含量的。因此,理论上NK-2-12-EWPS的用量不需要高于患者体内的IgE总量,即可充分降低患者体内游离IgE含量。
发明人在C57来源的FcγRIIb人源化小鼠体内,按照实施例5所述方法,将每只鼠的人源IgE的腹腔注射量固定为50μg的前提下,检测了50μg、20μg和10μg给药量(对应IgE注射量的100%、40%和20%)情况下小鼠体内总IgE和游离IgE含量随时间的变化。
结果显示,使用奥马珠单抗时,无论剂量大小均会导致血清中总IgE含量升高,奥马珠单抗剂量越大血清中的总IgE含量越高(图5A-C)。在游离IgE方面,当奥马珠单抗用量不低于IgE注射量时,表现出较好的中和效果,游离IgE含量从一开始即降低到了一个较低的水平(图5D)。但当奥马珠单抗用量低于IgE注射量时,IgE无法得到充分中和,游离IgE含量只是类似未注射治疗性抗体的负对照组那样随时间缓慢下降,而不是被迅速降低(图5D-F)。纵向比较使用不同剂量奥马珠单抗时的游离IgE曲线,可更明显地看到奥马珠单抗用量变化对中和效果的影响(图5G)。奥马珠单抗用量是否高于IgE注射量,是奥马珠能够充分降低血清游离IgE的分水岭,这也与常识相符。比较奥马珠单抗用量为50μg和实施例5中所述的用量为100μg(分别对应IgE注射量的100%和200%)时的游离IgE含量变化曲线,发现更高的奥马珠单抗用量并没有进一步降低小鼠体内的IgE含量,考虑测量误差因素,两次实验曲线基本相同(图5G)。这证明奥马珠单抗用量的增加对中和效果的进一步增益有限,这与化学热力学理论相符。根据结合解离公式,要想进一步降低游离IgE含量,就需要呈数量级地增加奥马珠单抗的用量。此外,由于抗体存在结合解离常数,因此一定会有一部分抗原与抗体解离,呈游离状态。因此,尽管上述两次实验中奥马珠单抗的用量均未低于IgE总量,但小鼠体内游离IgE水平却始终略高于基线水平(图5G,I)。
与奥马珠单抗的情况不同,使用NK-2-12-EWPS时,即使抗体用量低于IgE注射量,仍然具有良好的IgE清除效果。小鼠血清中的总IgE和游离IgE含量均在最初的几个小时内迅速下降(图5A-E)。当NK-2-12-EWPS用量(20μg)仅为IgE注射量的40%时,小鼠血清IgE含量也能在3小时内被降低到基线水平(图5A-E)。进一步将NK-2-12-EWPS用量降低至10μg(仅对应IgE注射量的20%)时,小鼠血清IgE含量才未能在3小时内降低到基线水平(图5A-E)。纵向比较不同NK-2-12-EWPS剂量时的游离IgE曲线,可观察到当NK-2-12-EWPS存在时,其剂量的降低主要影响第一个小时时间点的IgE含量,而不改变IgE含量急剧降低的趋势(图5H)。仅当NK-2-12-EWPS用量过低(10μg抗体用量,对应IgE注射量的20%)时,会小幅延缓IgE清除速度(图5H),这些与使用奥马珠单抗时的情况不同。
进一步比较使用20μg(对应IgE注射量的40%)NK-2-12-EWPS和使用100μg(对应IgE注射量的200%)奥马珠单抗时的血清游离IgE曲线,可见从第二小时时间点起,20μgNK-2-12-EWPS即显示出了优于100μg奥马珠单抗的游离IgE控制效果。仅在第一小时时间点处,100μg奥马珠单抗对应的游离IgE含量低于20μg NK-2-12-EWPS对应的游离IgE含量(图5I)。这表明NK-2-12-EWPS作为一款人源IgE清除型抗体,注射到体内后需要大约一个小时的时间积累药效,此后即使NK-2-12-EWPS的用量远低于奥马珠单抗仍能发挥出优于奥马珠单抗的游离IgE控制效果。
综上,NK-2-12-EWPS作为一种新概念的人源IgE清除型抗体,与奥马珠单抗相比具有用量低效果好的特点,具有重大成药潜力。此外,考虑实际临床场合,给患者注射足量的奥马珠单抗之后,患者体内的IgE几乎被全部中和,因此过敏症状减轻或消失。但是由于过敏原并未消失,在其持续刺激下,患者体内仍在不断产生IgE。当患者体内新产生的IgE超过了奥马珠单抗的冗余量时,即患者体内的总IgE含量高于总奥马珠单抗含量时,过敏症状将不可避免地再次呈现。而发明人提出的NK-2-12-EWPS则是起到不断清除IgE的作用,因此即使患者体内仍在不断产生IgE,NK-2-12-EWPS也能长效地将患者体内游离IgE维持在极低的水平,从而长期控制过敏症状。从这个角度看NK-2-12-EWPS尤其适用于需要长期用药的慢性过敏患者。
实施例7.NK-2-12-SELF在小鼠体内对人源IgE的清除效果
Chu等人在2008年发表的论文(Chu et al.,2008,doi:10.1016/j.molimm.2008.06.027)中描述了另一种能够增强抗体与受体FcγRIIb亲和力的突变方案,即S267E/L328F双点突变(SELF突变)方案。发明人同样将该SELF突变引入到了实施例1所述抗体NK-2-12的Fc端,构成了NK2-12-SELF抗体。带有SELF突变的IgG Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,NK-2-12-SELF重链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示(方框标出引入的组氨酸突变和SELF突变),NK-2-12-SELF轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示(方框标出引入的组氨酸突变,该序列与前述NK-2-12抗体轻链序列相同)。
表达纯化后的NK-2-12-SELF抗体,按照实施例5所述方法,同样被用于在野生型C57小鼠,或C57来源的FcγRIIb人源化小鼠体内进行人源IgE的清除实验。实验结果显示,在野生型C57小鼠体内,NK-2-12-SELF表现出了一定的降低总IgE和游离IgE的能力(图6A,B),但效果远不及NK-2-12-EWPS(图4D,E)。尤其在较长的一段时间内小鼠体内游离IgE浓度高于使用奥马珠单抗组。然而,这并不意味着NK-2-12-SELF不具备成药潜力。因为SELF突变不同于EWPS突变,后者对人和鼠FcγRIIb均具有较高的亲和力,SELF突变则仅对人FcγRIIb具有较高的亲和力,发明人未检出SELF突变与鼠FcγRIIb之间的亲和力,因此在野生型C57小鼠体内对人源IgE的清除能力较差。相反,在C57来源的FcγRIIb人源化小鼠体内,NK-2-12-SELF抗体表现出了优异的人源IgE清除能力。小鼠体内总IgE含量和游离IgE含量不仅均全程低于奥马珠单抗组,甚至与NK-2-12-EWPS相比(图4F,G),NK2-12-SELF能够更快地将小鼠体内的IgE降低到基线水平(图6C,D)。
实施例8.NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF具备小鼠体内人源IgE清除能力和更长的血清半衰期
在前述实施例合成的带有SELF突变的IgG Fc和带有EWPS突变的IgG Fc的基础上,本实施例进一步引入了三个位点的突变(即M252Y/S254T/T256E),并将突变后的片段分别命名为:带有YTE-EWPS突变的IgG Fc(其氨基酸序列如SEQ ID NO:118所示)和带有YTE-SELF突变的IgG Fc(其氨基酸序列如SEQ ID NO:119所示)。
进一步的,通过上述两种Fc片段和上述实施例获得的抗体NK-2-12,分别构建了NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF两种抗体。其中,NK-2-12-YTE-EWPS抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:120所示,NK-2-12-YTE-EWPS抗体的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示;NK-2-12-YTE-SELF抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示,NK-2-12-YTE-SELF轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
表达并纯化四种抗体NK-2-12-YTE-EWPS,NK-2-12-YTE-SELF,NK-2-12-EWPS和NK-2-12-SELF,并分别注射到FcRn人源化小鼠(南模生物,货号:NM-HU-00109)的腹腔内,用于检测血清半衰期。实验时,每种抗体以10mg/kg的剂量,向随机分组的3只FcRn人源化小鼠的腹腔内注射,此后于45分钟、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时和240小时,共14个时间点取小鼠尾静脉血,室温静置待其凝固之后离心获得血清。血清中人源抗体含量的检测方法为标准的夹心法ELISA。其中包被96孔酶标板所用抗体为山羊抗人IgG Fc抗体(Jackson,货号:109-006-098),HRP酶联山羊抗人IgG(H+L)抗体(Jackson,货号:109-036-088)配合底物ABTS(ThermoScientific,货号:002024)被用来探测被捕捉到的人源IgG含量。两种抗体的使用浓度均为抗体说明书中的推荐浓度。检测小鼠血清样品中人源IgG含量时,先用上述两种抗体和已知浓度的人源IgG建立标准曲线,再用该标准曲线测算血清样品中的人源IgG浓度。
实验结果如图7所示,图7A显示,NK-2-12-YTE-EWPS的血清半衰期较NK-2-12-EWPS的血清半衰期有显著延长。NK-2-12-EWPS计算出的血清半衰期为39.6小时,NK-2-12-YTE-EWPS的血清半衰期则为66.9小时。相似地,图7B显示,NK-2-12-SELF计算出的血清半衰期为62.7小时,而NK-2-12-YTE-SELF的血清半衰期则提高到了103.8小时。两种带有YTE突变的抗体的血清半衰期均分别得到了显著延长。
需要说明的是,虽然检测结果显示带有SELF突变的抗体在小鼠体内半衰期相对较长,但是其真实原因是由于带有SELF突变的抗体与鼠源FcγRIIb不结合(如实施例7所述),因而不易被小鼠细胞内吞,因此,造成了带有SELF突变的抗体在小鼠体内半衰期较长的假象。然而,由于带有EWPS突变或SELF突变的抗体与人FcγRIIb具有相似的高亲和力,在人体内均易被人体细胞内吞,因而带有EWPS突变或SELF突变的抗体在人体内应具有相似的血清半衰期。
因此,不宜对从小鼠体内测出的NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF的血清半衰期做横向比较,同理,亦不宜对NK-2-12-EWPS和NK-2-12-SELF的小鼠血清半衰期做横向比较。
发明人按照实施例5所述方法,在C57来源的FcγRIIb人源化小鼠体内检测了不同给药量下NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF对人源IgE的清除效果。结果如图7C-7F所示,NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF均能在短时间内就将FcγRIIb人源化小鼠体内的总人源IgE和游离人源IgE浓度降低到基线水平。不仅如此,实验结果还显示,即使将两种抗体的用药量降低至原来的五分之一,即将用药量由100μg降低到20μg,两种抗体对人源IgE的清除效果仍未见明显降低。与奥马珠单抗相比,NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF即使用药量仅为20μg,也能使受试小鼠体内的总IgE含量和游离IgE含量几乎全程低于用药100μg的奥马珠单抗组。因此NK-2-12-YTE-EWPS和NK-2-12-YTE-SELF两种抗体无论在降低体内总IgE含量还是游离IgE含量方面,均具有远超奥马珠单抗的药效。
综上,带有YTE-EWPS突变的IgG Fc和带有YTE-SELF突变的IgG Fc不仅延长了抗体的血清半衰期,而且还对抗体的药效起到了增益效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (54)
1.一种抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)所含有的VH互补决定区1-3(CDR1-3)和/或轻链可变区(VL)所含有的VL互补决定区1-3(CDR1-3)中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;
其中,奥马珠单克隆抗体包含:如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中含有的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3;和,如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中含有的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VLCDR1和/或VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;优选地,所述置换为保守置换;
优选地,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义;
优选地,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat编号系统定义;
优选地,所述奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)包含序列为SEQ ID NO:16的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:17的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:18的VH CDR3;轻链可变区(VL)包含序列为SEQ ID NO:19的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:20的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:21的VL CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第30、31、32、33、35、36位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列的任意一项或多项特征:
(1)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(2)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(3)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(4)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(5)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和33位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;或
(6)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和32位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第55、56、57位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列的任意一项或多项特征:
(1)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(2)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(3)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;或
(4)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1和VL CDR2中各自独立地具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VLCDR1中具有3个,4个,5个或6个组氨酸残基的置换,且在VL CDR2中具有2个或3个组氨酸残基的置换;
其中,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列的任意一项或多项特征:
(1)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换,并在第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加;
(2)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(3)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(4)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(5)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(6)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、33、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(7)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(8)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、34、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;或
(9)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区所含有的VH CDR1和/或VH CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体重链可变区的第26,28,30,31,54位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个)组氨酸残基的置换。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)如SEQ ID NO:22所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(b)如SEQ ID NO:30所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(c)如SEQ ID NO:38所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(d)如SEQ ID NO:46所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:47所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(e)如SEQ ID NO:54所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(f)如SEQ ID NO:62所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:63所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(g)如SEQ ID NO:70所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:71所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(h)如SEQ ID NO:78所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:79所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(i)如SEQ ID NO:86所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(j)如SEQ ID NO:94所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:95所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(k)如SEQ ID NO:102所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:103所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;或,
(l)如SEQ ID NO:110所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:111所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
7.如权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:24的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:25的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:26的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:27的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:28的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:29的VL CDR3;
(b)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:32的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:33的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:34的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:35的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:36的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:37的VL CDR3;
(c)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:40的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:41的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:42的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:43的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:44的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:45的VL CDR3;
(d)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:48的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:49的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:50的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:51的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:52的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:53的VL CDR3;
(e)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:56的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:57的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:58的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:59的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:60的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:61的VL CDR3;
(f)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:64的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:65的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:66的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:67的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:68的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:69的VL CDR3;
(g)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:72的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:73的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:74的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:75的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:76的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:77的VL CDR3;
(h)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:80的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:81的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:82的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:83的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:84的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:85的VL CDR3;
(i)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:88的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:89的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:90的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:91的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:92的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:93的VL CDR3;
(j)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:96的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:97的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:98的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:99的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:100的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:101的VL CDR3;
(k)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:104的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:105的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:106的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:107的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:108的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:109的VL CDR3;或,
(l)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:112的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:113的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:114的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:115的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:116的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:117的VL CDR3。
8.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其进一步包含恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含的是IgG重链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含的轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:12所示的重链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:13所示的轻链恒定区。
9.如权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含Fc区;
优选地,所述Fc区是IgG的Fc或Fc变体;其中,所述Fc变体与IgG的Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加。
10.如权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb);和/或,所述抗体为鼠源化抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
11.一种IgG Fc的Fc变体,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328、330和331位氨基酸残基处具有3处氨基酸残基的置换和1处氨基酸残基的缺失。
12.权利要求11所述的Fc变体,其中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328和330位氨基酸残基处具有氨基酸残基的置换,在331位氨基酸残基处具有氨基酸残基的缺失;其中,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的第327位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的第328位氨基酸残基处具有色氨酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的第330位氨基酸残基处具有丝氨酸残基的置换。
13.权利要求11或12所述的Fc变体,其中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
14.权利要求11或12所述的Fc变体,其中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第252位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第254位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第256位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
15.权利要求13所述的Fc变体,其中,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:7的第37、39和41位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第37位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第39位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第41位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
16.权利要求14或15所述的Fc变体,其中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:118所示的序列。
17.一种IgG Fc的Fc变体,其中,
所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQ IDNO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸;
优选地,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加;
优选地,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:8。
18.权利要求17所述的Fc变体,其中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQ IDNO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第37、39和41位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸;
优选地,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:119所示的序列。
19.权利要求12-18任一项所述的Fc变体,其中,FcγR选自FcγRI,FcγRIIa,FcγRIIb,FcγRIIc,FcγRIIIa,FcγRIIIb,或其任意组合;
优选地,所述FcγR源自哺乳动物(例如,鼠,人);
优选地,所述FcγR是人FcγRIIb。
20.一种融合蛋白,其包含权利要求11-19任一项所述的Fc变体。
21.分离的核酸分子,其包含编码权利要求11-19任一项所述的Fc变体或权利要求20所述的融合蛋白的核苷酸序列。
22.载体,其包含权利要求21所述的分离的核酸分子;优选地,所述载体为克隆载体或表达载体。
23.宿主细胞,其包含权利要求21所述的分离的核酸分子或权利要求22所述的载体。
24.制备权利要求11-19任一项所述的Fc变体或权利要求20所述的融合蛋白,其包括,在允许所述多肽或蛋白表达的条件下,培养权利要求23所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述Fc变体或所述融合蛋白。
25.一种抗体或其抗原结合片段,其包含权利要求11-19任一项所述的Fc变体。
26.权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体为鼠源化抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
27.一种抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)所含有的VH CDR1-3和/或轻链可变区(VL)所含有的VL CDR1-3中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;
其中,奥马珠单克隆抗体包含:如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中含有的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3;和,如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中含有的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VLCDR1和/或VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;优选地,所述置换为保守置换;
并且,所述抗体还包含IgG Fc的Fc变体。
28.权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述奥马珠单克隆抗体的VHCDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义;
优选地,所述奥马珠单克隆抗体的VH CDR1-3和/或VL CDR1-3由Kabat编号系统定义;
优选地,所述奥马珠单克隆抗体的重链可变区(VH)包含序列为SEQ ID NO:16的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:17的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:18的VH CDR3;轻链可变区(VL)包含序列为SEQ ID NO:19的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:20的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:21的VL CDR3。
29.如权利要求27或28所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第30、31、32、33、35、36位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列的任意一项或多项特征:
(1)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(2)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(3)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(4)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33和36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(5)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和33位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;或
(6)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31和32位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
30.如权利要求27-29任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区的第55、56、57位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列的任意一项或多项特征:
(1)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(2)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(3)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;或
(4)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加。
31.如权利要求27-30任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VL CDR1和VL CDR2中各自独立地具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体轻链可变区所含有的VLCDR1中具有3个,4个,5个或6个组氨酸残基的置换,且在VL CDR2中具有2个或3个组氨酸残基的置换;
其中,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下列的任意一项或多项特征:
(1)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换,并在第56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换和1个组氨酸残基的添加;
(2)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(3)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(4)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、36、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(5)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(6)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、33、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(7)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、35、36、55和56位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;
(8)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、34、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换;或
(9)其在如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的第30、31、32、33、35、36、55、56和57位氨基酸残基中具有组氨酸残基的置换。
32.如权利要求27-31任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其在奥马珠单克隆抗体的重链可变区所含有的VH CDR1和/或VH CDR2中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个)组氨酸残基的置换和/或添加;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在奥马珠单克隆抗体重链可变区的第26,28,30,31,54位氨基酸残基中具有一个或几个(例如,2个,3个,4个,5个)组氨酸残基的置换。
33.如权利要求27-32任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
(a)如SEQ ID NO:22所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(b)如SEQ ID NO:30所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(c)如SEQ ID NO:38所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:39所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(d)如SEQ ID NO:46所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:47所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(e)如SEQ ID NO:54所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(f)如SEQ ID NO:62所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:63所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(g)如SEQ ID NO:70所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:71所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(h)如SEQ ID NO:78所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:79所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(i)如SEQ ID NO:86所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(j)如SEQ ID NO:94所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:95所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;
(k)如SEQ ID NO:102所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:103所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR;或,
(l)如SEQ ID NO:110所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR;和/或,如SEQ ID NO:111所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
34.如权利要求27-33任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:24的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:25的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:26的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:27的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:28的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:29的VL CDR3;
(b)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:32的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:33的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:34的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:35的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:36的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:37的VL CDR3;
(c)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:40的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:41的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:42的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:43的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:44的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:45的VL CDR3;
(d)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:48的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:49的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:50的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:51的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:52的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:53的VL CDR3;
(e)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:56的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:57的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:58的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:59的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:60的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:61的VL CDR3;
(f)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:64的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:65的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:66的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:67的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:68的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:69的VL CDR3;
(g)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:72的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:73的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:74的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:75的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:76的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:77的VL CDR3;
(h)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:80的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:81的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:82的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:83的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:84的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:85的VL CDR3;
(i)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:88的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:89的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:90的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:91的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:92的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:93的VL CDR3;
(j)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:96的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:97的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:98的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:99的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:100的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:101的VL CDR3;
(k)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:104的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:105的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:106的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:107的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:108的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:109的VL CDR3;或,
(l)含有下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:112的VHCDR1、序列为SEQ ID NO:113的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:114的VH CDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:115的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:116的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:117的VL CDR3。
35.如权利要求27-34任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述Fc变体在IgGFc的氨基酸序列的第327、328、330和331位氨基酸残基处具有3处氨基酸残基的置换和1处氨基酸残基的缺失;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第327、328和330位氨基酸残基处具有氨基酸残基的置换,在331位氨基酸残基处具有氨基酸残基的缺失;其中,所述Fc变体与IgGFc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的第327位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的第328位氨基酸残基处具有色氨酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体在IgG Fc的第330位氨基酸残基处具有丝氨酸残基的置换。
36.权利要求35所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
37.权利要求35所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第252位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第254位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第256位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
38.权利要求36所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:7的第37、39和41位氨基酸残基处也具有氨基酸残基的置换;
优选地,所述Fc变体具有选自下列的一项或多项特征:
(1)所述Fc变体在IgG Fc的第37位氨基酸残基处具有酪氨酸残基的置换;
(2)所述Fc变体在IgG Fc的第39位氨基酸残基处具有苏氨酸残基的置换;
(3)所述Fc变体在IgG Fc的第41位氨基酸残基处具有谷氨酸残基的置换。
39.权利要求37或38所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述Fc变体具有如SEQ IDNO:118所示的序列。
40.权利要求27-34任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,
所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQ IDNO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸;
优选地,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加;
优选地,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:8所示的序列。
41.权利要求27-34任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,
所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第267位氨基酸残基置换为谷氨酸和第328位氨基酸残基置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在IgG Fc的氨基酸序列的第252,254和256位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸;
或者,
所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第52位氨基酸残基置换为谷氨酸,对应于SEQ IDNO:6的第113位氨基酸残基处置换为苯丙氨酸;并且,所述Fc变体在对应于SEQ ID NO:6的第37、39和41位氨基酸残基处也分别置换为酪氨酸、苏氨酸和谷氨酸;
优选地,所述Fc变体与IgG Fc相比,对Fcγ受体(FcγR)的亲和力增加;
优选地,所述Fc变体具有如SEQ ID NO:119所示的序列。
42.权利要求35-41任一项所述的抗体或其抗原结合片段,所述FcγR选自FcγRI,FcγRIIa,FcγRIIb,FcγRIIc,FcγRIIIa,FcγRIIIb,或其任意组合;
优选地,所述FcγR源自哺乳动物(例如,鼠,人);
优选地,所述FcγR是人FcγRIIb。
43.权利要求27-41任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其进一步包含恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含的是IgG重链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含的轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:12所示的重链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:13所示的轻链恒定区;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区,重链恒定区,IgG的Fc或Fc变体;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链具有如SEQ ID NO:4,9,11,120或121所示的序列;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链具有如SEQ ID NO:4,9,11,120或121所示的序列,且所述抗体或其抗原结合片段的轻链具有如SEQ ID NO:5所示的序列;
优选地,所述抗体为鼠源化抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
44.权利要求27-43任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段带有标记;优选地,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
45.分离的核酸分子,其包含编码权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
46.载体,其包含权利要求45所述的分离的核酸分子;优选地,所述载体为克隆载体或表达载体。
47.宿主细胞,其包含权利要求45所述的分离的核酸分子或权利要求46所述的载体。
48.制备权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养权利要求47所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
49.多特异性分子,其包含权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述多特异性分子特异性结合IgE,并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标;
优选地,所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二特异性结合分子(例如第二抗体)。
50.药物组合物,其包含权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求49所述的多特异性分子,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂;
优选地,药物组合物还包含另外的药学活性剂;
优选地,所述另外的药学活性剂是具有抗过敏或抗哮喘的药物。
51.试剂盒,其含有权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素;
优选地,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述第二抗体还包括可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
52.如权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求45所述的分离的核酸分子、权利要求46所述的载体、权利要求47所述的宿主细胞、权利要求49所述的多特异性分子或权利要求50所述的药物组合物用于制备药物的用途,所述药物用于降低或抑制IgE水平或者用于预防和/或治疗受试者的与IgE相关的疾病;
优选地,与IgE相关的疾病是1型超敏反应性疾病;
优选地,所述与IgE相关的疾病选自过敏反应,过敏性鼻炎,过敏性咳嗽,过敏性休克,食物过敏,超敏反应,哮喘(如中至重度持续性过敏性哮喘),慢性荨麻疹(如慢性自发性荨麻疹),急性荨麻疹,急性支气管痉挛,异位性皮炎,炎性皮肤病,湿疹,喉头水肿,血管神经性水肿,鼻息肉,鼻窦炎症;
优选地,所述受试者为哺乳动物,例如人、猴或鼠;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段单独使用,或与另外的药学活性剂联合使用;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在中性或碱性条件下与IgE特异性结合;优选地,所述中性或碱性条件为pH大于等于7(例如,pH等于7.4)的条件;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在pH等于6的条件下不与IgE特异性结合。
53.一种用于在受试者中降低或抑制IgE水平或者预防和/或治疗与IgE相关的疾病的方法,所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求45所述的分离的核酸分子、权利要求46所述的载体、权利要求47所述的宿主细胞、权利要求49所述的多特异性分子或权利要求50所述的药物组合物;
优选地,与IgE相关的疾病是1型超敏反应性疾病;
优选地,所述与IgE相关的疾病选自过敏反应,过敏性鼻炎,过敏性咳嗽,过敏性休克,食物过敏,超敏反应,哮喘(如中至重度持续性过敏性哮喘),慢性荨麻疹(如慢性自发性荨麻疹),急性荨麻疹,急性支气管痉挛,异位性皮炎,炎性皮肤病,湿疹,喉头水肿,血管神经性水肿,鼻息肉,鼻窦炎症;
优选地,所述受试者为哺乳动物,例如人、猴或鼠;
优选地,所述方法还包括施用另外的具有抗过敏或抗哮喘活性的药物;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在中性或碱性条件下与IgE特异性结合;优选地,所述中性或碱性条件为pH大于等于7(例如,pH等于7.4)的条件;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在pH等于6的条件下不与IgE特异性结合。
54.一种检测IgE在样品中的存在或其量的方法,其包括以下步骤:
(1)将所述样品与权利要求1-10或25-44任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与IgE之间复合物的形成或检测所述复合物的量;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记;
优选地,所述IgE是人源IgE;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在中性或碱性条件下与IgE特异性结合;优选地,所述中性或碱性条件为pH大于等于7(例如,pH等于7.4)的条件;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段在pH等于6的条件下不与IgE特异性结合。
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