CN112912393A - 工程化的fc - Google Patents

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Abstract

公开了一种包含Fc区的抗原结合分子，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，和(i i)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，对应于第330位处的L，对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G的一个或多个。还公开了这种Fc区的组成多肽，编码这种抗原结合分子和多肽的核酸，包含这种抗原结合分子、多肽和核酸的组合物，以及使用这些的方法。

Description

工程化的FC
本申请要求于2018年10月25日提交的GB 1817354.2的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用合并于此。
发明领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地抗体技术。
发明背景
调节(增强或衰减)抗体FC效应功能(ADCC，ADCP，CDC)的两种主要(非相互排斥)策略是通过改变Fc：Fc受体和Fc：补体成分1q(C1)相互作用。
最常见的方法涉及向Fc区的多肽链提供氨基酸取代以产生对称(同型二聚体)IgG分子。
或者，抗体可以是糖工程化的；最常见的策略包括通过操纵宿主细胞中的聚糖生物合成途径来进行N-连接的寡聚糖的修饰，以及体外重塑聚糖。修饰包括去岩藻糖基化，增加的末端半乳糖基化和增加的末端唾液酸化。
然而，影响效应功能的已知修饰具有缺点。去岩藻糖(Afucosyl)抗体的生产在技术上具有挑战性，通常需要在突变细胞类型(例如LEC13 CHO细胞，FUT8敲除CHO细胞等)中表达或从治疗的细胞中表达以减少参与聚糖合成/加工的因子的表达(例如用FUT8 siRNA或几夫碱(kifunensine)抑制剂处理的细胞)，或者需要在其表达后用抗体制剂处理，以除去具有岩藻糖基残基的聚糖。这种抗体制剂经常被岩藻糖基化的抗体污染，使得在岩藻糖基化抗体制剂上的Fcγ受体结合活性的提高限制为～3倍(参见例如Chung等人，MAbs(2012)4(3)：326-340)。
相对于具有未取代的Fc区的抗体，通过在Fc区中引入氨基酸取代改善效应功能的现有方法通常与ADCC活性提高～2-5倍有关。
仍然需要具有改进的结构和功能性质的Fc区。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种任选地分离的抗原结合分子，
其包含Fc区，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，和(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，对应于第330位处的L，对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G中的一个或多个。
除非另有说明，否则Fc区的多肽的位置根据Eu编号系统，如在Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(第五版)，公共卫生服务，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，1991中所述。
在一些实施方式中，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，和对应于第330位处的L；或对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，和对应于第332位处的E；或对应于第236位处的A和对应于第239位处的D；或对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G。
在一些实施方式中，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，和对应于第330位处的L。
在一些实施方式中，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，和对应于第332位处的E。
在一些实施方式中，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A和对应于第239位处的D。
在一些实施方式中，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G。
在一些实施方式中，所述Fc区包含含有与SEQ ID NO:39、38、37、41、22、21、20或24具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
还提供了一种任选分离的多肽，其包含：与SEQ ID NO：31或6具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6编号的特定位置处的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，在第103位的L，在第105位的E，在第118位的K，和在第203位的G的一个或多个。
在一些实施方式中，所述多肽在相对于SEQ ID NO：31或6的特定位置包含以下氨基酸残基：在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，在第103位的L，和在第105位的E；或在第9位的A，在第12位的D，和在第105位的E；或在第9位的A和在第12位的D；或在第118位的K，和在第203位的G。
在一些实施方式中，所述多肽在相对于SEQ ID NO：31或6的特定位置包含以下氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，在第103位的L，和在第105位的E。
在一些实施方式中，所述多肽在相对于SEQ ID NO：31或6的特定位置包含以下氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，和在第105位的E。
在一些实施方式中，所述多肽在相对于SEQ ID NO：31或6的特定位置包含以下氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A和在第12位的D。
在一些实施方式中，所述多肽在相对于SEQ ID NO：31或6的特定位置包含以下氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第118位的K，和在第203位的G。
还提供了一种任选分离的多肽，其包含SEQ ID NO：39、38、37、41、22、21、20或24的氨基酸序列。
还提供了一种任选分离的Fc区，其包含如本文所述的多肽。
还提供了一种任选分离的抗原结合分子，其包含如本文所述的多肽或Fc区。
还提供了一种或多种任选分离的核酸，其编码如本文所述的抗原结合分子、多肽或Fc区。
还提供了一种或多种表达载体，其包含如本文所述的一种或多种核酸。
还提供了一种细胞，其包含如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、或一种或多种表达载体。
还提供了一种方法，包括在适于表达来自一种或多种核酸或一种或多种表达载体的抗原结合分子、多肽或Fc区的条件下，培养如本文所述的包含一种或多种核酸或一种或多种表达载体的细胞。
还提供了一种组合物，其包含如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、或细胞。
还提供了如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞、或组合物在医学治疗方法或预防方法中的用途。
还提供了如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞、或组合物在治疗或预防癌症、感染性疾病或自身免疫疾病的方法中的用途。
还提供了如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞、或组合物在制备用于治疗或预防癌症、感染性疾病或自身免疫疾病的方法的药物中的用途。
还提供了一种治疗或预防癌症、感染性疾病或自身免疫疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞、或组合物。
还提供了一种方法，任选地是一种杀伤表达靶抗原的细胞的体外方法，包括使表达靶抗原的细胞与如本文所述的抗原结合分子、多肽、Fc区、一种或多种核酸、一种或多种表达载体、细胞、或组合物接触。
说明
本发明基于意外发现，Fc区取代的特定组合可用于提供具有组合性有利性质的抗原结合分子。
特别地，本发明人已经确定了用于提供分子内二硫桥的Fc区取代可以与Fc区取代组合用于增强效应活性，以获得对于活化的Fcγ受体和FcRn受体具有意外地高亲和力，相比抑制性Fcγ受体对活化的Fcγ受体有高选择性，以及高稳定性的Fc区。
抗原结合分子
本发明提供了抗原结合分子。所述抗原结合分子可以以分离的或基本上纯化的形式提供。
“抗原结合分子”是指能够结合靶抗原的分子，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab')2、Fab2、双抗体、三抗体、scFv-Fc、小抗体、单域抗体(例如VhH)等)，只要它们表现出与相关靶分子的结合即可。
本发明的抗原结合分子包含能够结合靶抗原和Fc区的部分。
在一些实施方式中，所述能够结合靶抗原的部分包含能够特异性结合靶抗原的抗体的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。
在一些实施方式中，能够结合靶抗原的部分包含能结合靶抗原的适配体或由适配体组成，所述适配体(例如核酸适配体)能够结合靶抗原(如在Zhou和Rossi，Nat Rev DrugDiscov2017 16(3):181-202中综述)。在一些实施方式中，能够与靶抗原结合的部分包含抗原结合肽/多肽或由其组成，例如肽适配体、硫氧还蛋白、单体、抗运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、avimer、knottin、fynomer、atrimer、DARPin、亲和体、纳米抗体(即单域抗体(sdAb))亲和素(affilin)、犰狳重复蛋白(ArmRP)、OBody或纤连蛋白–如在Reverdatto等人，Curr Top Med Chem.2015；15(12)：1082-1101中所综述，其通过引用整体并入本文(也参见例如Boersma等人，J Biol Chem(2011)286：41273-85和Emanuel等人，Mabs(2011)3：38-48)。
本发明的抗原结合分子通常包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含能够特异性结合靶抗原的抗体的VH和VL。由VH和VL形成的抗原结合部分在本文中也可以称为Fv区。
抗原结合分子可以是或可以包含抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。抗原结合分子可包含一个以上的一起形成抗原结合结构域的多肽。所述多肽可以共价或非共价结合。抗原结合分子可以指一个以上的多肽(例如2、3、4、6或8个多肽)的非共价或共价复合物，例如包含两个重链多肽和两个轻链多肽的IgG样抗原结合分子。
可以使用能够结合靶抗原的单克隆抗体(mAb)的序列设计和制备本发明的抗原结合分子。抗体的抗原结合部分是能够与给定抗体特异性的靶标结合的抗体的任何片段。抗体的抗原结合部分包括可变片段(Fv)和Fab片段。
抗体通常包含六个互补决定区CDR；三个在重链可变(VH)区中：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，以及三个在轻链可变(VL)区中：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。六个CDR共同定义了抗体的互补部分，它是抗体与靶抗原结合的部分。
VH区和VL区包含每个CDR两侧的框架区(FR)，这些框架区为CDR提供了支架。从N末端到C末端，VH区包含以下结构：N末端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C末端；以及VL区包含以下结构：N末端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C末端。
定义抗体CDR和FR有几种不同的惯例，例如Kabat等人在《具有免疫学意义的蛋白质序列》第5版，美国国立卫生研究院公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达(1991)，Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)中描述的惯例，以及VBASE2，如Retter等人，Nucl.Natl.Acad.Sci.(2005)33(增刊1)：D671-D674中所述。本文所述抗体克隆的VH区和VL区的CDR和FR是根据国际IMGT(ImMunoGeneTics)信息系统定义的(LeFranc等人，NucleicAcids Res.(2015)43(数据库期号)：D413-22)，其使用IMGT V-DOMAIN编号规则，如Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.(2003)27:55-77中所述。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含能够与靶抗原结合的抗原结合分子的CDR。在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含能够与靶抗原结合的抗原结合分子的FR。在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含能够与靶抗原结合的抗原结合分子的CDR和FR。即，在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含能够与靶抗原结合的抗原结合分子的VH区和VL区。在一些实施方式中，根据本发明的抗原结合分子包含与靶抗原结合的Fv区。在一些实施方式中，所述Fv区包括含有VH和VL(例如VH-VL融合多肽)的多肽。在一些实施方式中，所述VH和VL区被提供为通过接头序列连接的单个多肽(例如，如本文所述)；即作为单链Fv(scFv)。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含能够与靶抗原结合的Fab片段。Fab片段包含VH和VL区，并且还包含免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)。在一些实施方式中，抗原结合分子包含含有VH、CH1、VL和CL(例如Cκ或Cλ)的Fab区。在一些实施方式中，Fab区包含含有VH和CH1的多肽(例如VH-CH1融合多肽)，和含有VL和CL的多肽(例如VL-CL融合多肽)。在一些实施方式中，Fab区包含含有VH和CL的多肽(例如VH-CL融合多肽)和含有VL和CH的多肽(例如VL-CH1融合多肽)；也就是说，在一些实施方式中，Fab区是CrossFab区。在一些实施方式中，Fab或CrossFab的VH、CH1、VL和CL区被提供为通过接头序列连接的单个多肽，即单链Fab(scFab)或单链CrossFab(scCrossFab)。
在例如Schroeder和Cavacini的J Allergy Clin Immunol.(2010)125(202):S41-S52中描述了不同种类的免疫球蛋白及其结构，其通过引用整体并入本文。G型免疫球蛋白(即IgG)是约150kDa的糖蛋白，包含两条重链和两条轻链。从N末端到C末端，重链包含VH，其后是包含三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区，类似地，轻链包含VL，其后是CL。根据重链，免疫球蛋白可以分为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，IgA(例如IgA1、IgA2)，IgD，IgE或IgM。轻链可以是κ(kappa)或λ(lambda)。
免疫球蛋白重链恒定区序列可以是或可以衍生自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM的重链恒定序列。
在一些实施方式中，重链恒定区序列可以是或可以衍生自IgG的重链恒定序列。在一些实施方式中，重链恒定区序列可以是或可以衍生自人IgG的重链恒定序列。
在一些实施方式中，重链恒定区序列可以是或可以衍生自人IgG1同种异型(例如G1m1、G1m2、G1m3或G1m17)的重链恒定序列。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定序列是人免疫球蛋白G1恒定序列，G1m1同种异型(IGHG1；UniProt：P01857-1,v1；SEQ ID NO:1)。SEQ ID NO：1的1至98位形成CH1区(SEQ ID NO：2)。SEQ ID NO：1的99至110位在CH1和CH2区之间形成铰链区(SEQ IDNO：3)。SEQ ID NO：1的111至223位形成CH2区(SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：1的224至330位形成CH3区(SEQ ID NO：5)。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定序列是人免疫球蛋白G1恒定序列，G1M3同种异型(SEQ ID NO：28)。SEQ ID NO：28的1至98位形成CH1区(SEQ ID NO：29)。SEQID NO：28的99至110位在CH1和CH2区之间形成铰链区(SEQ ID NO：3)。SEQ ID NO：28的111至223位形成CH2区(SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：28的224至330位形成CH3区(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含一个或多个CH1区。在一些实施方式中，CH1区包含SEQ ID NO：2的序列或由其组成，或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，CH1区包含SEQ ID NO：29的序列或由其组成，或与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含一个或多个CH1-CH2铰链区。在一些实施方式中，CH1-CH2铰链区包含SEQ ID NO：3的序列或由其组成，或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含免疫球蛋白轻链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定序列是人免疫球蛋白κ恒定序列(IGKC；Cκ；UNIPROT：p01834-1，v2；SEQ ID NO：7)。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定序列是人免疫球蛋白λ恒定序列(IGLC；Cλ)，例如IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7。在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含一个或多个CL区。在一些实施方式中，CL区包含SEQ ID NO：7的序列或由其组成，或与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
本发明的抗原结合分子可以以任何合适的形式提供，只要其包括至少一个抗原结合部分和至少一个Fc区。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含抗原结合部分，其包含或由靶抗原特异的Fv、scFv、Fab、scFab、Crossfab、ScCrossfab、VhH、双抗体或三抗体之一组成。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含多个(例如2、3、4、5、6、7、8等)抗原结合部分。在抗原结合分子包含多种抗原结合部分的实施方式中，抗原结合部分可以是相同的或不相同的。在一些实施方式中，所述抗原结合部分可以各自独立地是根据本文所述的抗原结合部分的任何实施方式的抗原结合部分。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子是单特异性的(即，包括一种类型的抗原结合部分)。作为说明，本公开的实验实施例中表征的抗原结合分子是HER3的单特异性。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子是多特异性的(例如双特异性，三特异性等)；即，在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含多种(例如2、3等)不同类型的抗原结合部分。多特异性抗原结合分子可与不同的表位结合。多特异性抗原结合分子可与不同的靶抗原结合。
根据本发明的抗原结合分子显示出至少与靶抗原的单价结合。结合价是指对给定靶标的抗原结合分子中的结合位点的数量。在一些实施方式中，对给定靶标的抗原结合分子是多价(例如二价，三价等)。作为说明，在本公开的实验实施例中表征的抗原结合分子包括两个相同的HER3结合位点，因此是单特异性的二价抗原结合分子。
除了能够结合靶抗原的部分之外，本发明的抗原结合分子包含Fc区。
抗原结合部分(以及因此的抗原结合分子)特异性的靶抗原可以是任何靶抗原。在一些实施方式中，所述靶抗原是一种抗原，其表达/活性或其上调的表达/活性与疾病或病症正相关(例如癌症、感染性疾病或自身免疫疾病)。在一些实施方式中，所述靶抗原在表达靶抗原细胞的细胞表面表达。
在一些实施方式中，所述靶抗原由传染原(infectious agent)、细胞或组织中希望破坏或去除的细胞表达。在一些实施方式中，所述靶抗原由病原体，细胞或组织中希望引导免疫应答(例如体液或细胞介导的免疫应答)的细胞表达。在一些实施方式中，所述靶抗原与癌症、感染性疾病或自身免疫疾病有关。
在一些实施方式中，所述靶抗原由癌细胞、传染原，传染原感染的细胞或自身免疫效应细胞表达(即自身免疫病理学的效应器)。
在一些实施方式中，所述靶抗原是癌细胞抗原(即癌细胞表达或过表达的抗原)。癌细胞抗原的表达可能与癌症有关。癌细胞抗原可以由癌细胞异常表达(例如，癌细胞抗原可以异常定位表达)，或者可以由癌细胞以异常结构表达。癌细胞抗原可能能够引发免疫反应。在一些实施方式中，所述抗原在癌细胞的细胞表面表达(即癌细胞抗原是癌细胞表面抗原)。在一些实施方式中，与本文所述的抗原结合分子结合的抗原的部分展示在癌细胞的外表面上(即是细胞外的)。癌细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方式中，所述癌细胞抗原是其表达与癌症症状的发展、进展或严重性相关的抗原。与癌症相关的抗原可能与癌症的原因或病理有关，或者可能由于癌症而异常表达。在一些实施方式中，所述癌细胞抗原是与相应的非癌细胞(例如，源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比，其表达被癌细胞上调(例如在RNA和/或蛋白质水平上)的抗原。在一些实施方式中，所述癌症相关抗原可以优先由癌细胞表达，而不由相应的非癌细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的非癌细胞)表达。在一些实施方式中，所述癌症相关抗原可以是突变的癌基因或突变的抑癌基因的产物。在一些实施方式中，与癌症相关的抗原可以是过度表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的癌症抗原、癌胚抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。
在一些实施方案中，所述靶抗原是传染原的抗原。所述抗原可以是由传染原表达的抗原。所述抗原可以是存在于传染原感染细胞的细胞表面的抗原。所述抗原可以是存在于内化(例如吞噬)传染原细胞的细胞表面的抗原。所述抗原可以是其表达与传染原感染有关的抗原，例如，由传染原感染的细胞异常表达的抗原。在一些实施方式中，所述靶抗原是一种其表达(例如在RNA和/或蛋白质水平)被传染原感染的细胞上调的抗原，例如，与相应的未感染细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的未感染细胞)的表达水平相比。在一些实施方式中，所述靶抗原可以优先被传染原感染的细胞表达，而不是由相应的未感染细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的未感染细胞)表达。
在一些实施方式中，所述靶抗原是自身免疫效应细胞的抗原(即自身免疫效应细胞表达或过表达的抗原)。所述抗原的表达可能与自身免疫病理有关。在一些实施方式中，所述抗原在自身免疫效应细胞的细胞表面表达。在一些实施方式中，由本文所述的抗原结合分子结合的抗原部分展示在自身免疫效应细胞(即细胞外)的外表面上。在一些实施方式中，所述抗原是一种表达与自身免疫性疾病/病症的发展、进展或严重程度有关的抗原。所述抗原可能与自身免疫疾病/病症的病因或病理有关。在一些实施方式中，所述抗原的表达(例如，在RNA和/或蛋白质水平)被自身免疫效应细胞上调，例如与源自相同组织/细胞类型的非自身免疫效应细胞的细胞相比。在一些实施方式中，所述抗原可以优先由自身免疫效应细胞表达，而不是由相应的非自身免疫效应细胞的细胞表达。
在一些实施方式中，所述靶抗原是HER3。在一些实施方式中，所述靶抗原是VISTA。在一些实施方式中，所述靶抗原是CD47。在一些实施方式中，所述靶抗原是CD33。在一些实施方式中，所述靶抗原是BCMA。在一些实施方式中，所述靶抗原是TACI。
Fc区
本发明提供了包含Fc区的抗原结合分子。还提供了Fc区。Fc区可以以分离的或基本上纯化的形式提供。
Fc区提供与Fc受体和免疫系统其他分子的相互作用，以产生功能效应。例如，在Jefferis等人，Immunol Rev 1998 163：59-76中对IgG Fc介导的效应子功能进行了综述(其通过引用整体并入本文)，并产生了由Fc介导的免疫细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、NK细胞和T细胞)的募集和激活，其通过Fc区与免疫细胞表达的Fc受体之间的相互作用，通过Fc区与补体蛋白C1q结合招募补体通路成分，进而激活补体级联产生。
在IgG中、IgA和IgD同种型中，Fc区由一个多肽的CH2和CH3区以及另一多肽的CH2和CH3区组成。来自两个多肽的CH2和CH3区一起形成Fc区。在IgM和IgE同种型中，Fc区包含三个恒定结构域(CH2、CH3和CH4)，以及来自两个多肽的CH2至CH4一起构成Fc区。
在根据本公开的各个方面的优选实施方式中，Fc区包括两种多肽，每种多肽包含CH2区和CH3区。
Fc介导的功能包括Fc受体结合、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、膜攻击复合物(MAC)形成、细胞脱粒、细胞因子和/或趋化因子的产生、以及抗原的加工和呈递。
影响Fc介导的功能的抗体Fc区的修饰在本领域中是已知的，例如那些如Wang等人，Protein Cell(2018)9(1)：63-73所述，其通过引用整体并入本文。已知影响抗体效应功能的示例性Fc区修饰总结于Wang等人，Protein Cell(2018)9(1)：63-73的表1中。
取代的组合F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L描述于Stavenhagen等人，CancerRes.(2007)，以增加与FcγRIIIa的结合，从而增强ADCC。取代的组合S239D/I332E或S239D/I332E/A330L描述于Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA.(2006)103:4005–4010，以增加与FcγRIIIa的结合，从而增强ADCC。还描述了取代的组合S239D/I332E/A330L，以降低与FcγRIIb的结合，从而增强ADCC。取代的组合S298A/E333A/K334A描述于Shields等人，J BiolChem.(2001)276:6591–6604，以增加与FcγRIIIa的结合，从而增强ADCC。在一个重链中的取代组合L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A，以及在其他重链中的取代组合D270E/K326D/A330M/K334E，描述于Mimoto等人，MAbs.(2013):5:229–236，以增加与FcγRIIIa的结合，从而增加ADCC。取代的组合G236A/S239D/I332E描述于Richards等人,MolCancer Ther.(2008)7:2517–2527，以增加与FcγRIIa的结合以及与FcγRIIIa的结合，从而增强ADCP。
取代的组合K326W/E333S描述于Idusogie等人，J Immunol.(2001)166(4):2571-5，以增加与C1q的结合，从而增强CDC。取代的组合S267E/H268F/S324T描述于Moore等人，MAbs.(2010)2(2):181-9，以增加与C1q的结合，从而增强CDC。Natsume等人，Cancer Res.(2008)68(10):3863-72中描述的取代的组合报道了增加与C1q的结合，从而增强CDC。取代的组合E345R/E430G/S440Y描述于Diebolder等人，Science(2014)343(6176):1260-3，以增加六聚化，从而增强CDC。
取代的组合E345K/E430G描述于de Jong等人，Plos Biol.(2016)14(1)：e1002344，以增加六聚形成和补体激活，从而增强CDC。
取代的组合M252Y/S254T/T256E描述于Dall’Acqua等人，J Immunol.(2002)169：5171-5180，以增加在pH6.0下与FcRn的结合，从而增加抗原结合分子半衰期。取代的组合M428L/N434S描述于Zalevsky等人，Nat Biotechnol.(2010)28：157-159，以增加在pH6.0下与FCRN的结合，从而增加抗原结合分子半衰期。
取代的组合L242C，K334C描述于Gong等人，J Biol Chem.(2009)284(21)：14203-10和McConnell等人，Protein Eng Des Sel.(2013)26(2)：151-64，以增加抗体恒定结构域的热稳定性。
在本文中将重链恒定区/Fc区/CH2-CH3区/CH2区/CH3区描述为包含“对应于”参考位置/替换的位置/替换时，考虑了在同源重链恒定区/Fc区/CH2-CH3区/CH2区/CH3区的等同位置/取代。
如果Fc区被描述为包括特定位置/取代，则所述位置/取代可以存在于一个或两个多肽链中，所述多肽链在一起形成Fc区。
除非另有说明，否则本文的位置是指根据Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(第5版)，美国国立卫生研究院公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达，1991中所述的Eu编码系统编码的人免疫球蛋白恒定区氨基酸序列的位置。
人IgG1(G1m1)重链恒定区的同源重链恒定区是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m1)重链恒定区(即SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的重链恒定区。人IgG1(G1m1)的同源Fc区(G1M1)是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m1)的CH2-CH3区(即SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的Fc区。人IgG1(G1m1)的同源CH2区(G1M1)是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m1)的CH2区(即SEQID NO：4所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的CH2区。人IgG1(G1m1)的同源CH3区(G1M1)是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m1)的CH3区(即SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的CH3区。
人IgG1(G1m3)重链恒定区的同源重链恒定区是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m3)重链恒定区(即SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的重链恒定区。人IgG1(G1m3)的同源FC区(G1M1)是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m3)的CH2-CH3区(即SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的Fc区。人IgG1(G1m3)的同源CH2区(G1M1)是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m3)的CH2区(即SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的CH2区。人IgG1(G1m3)的同源CH3区(G1M1)是包含氨基酸序列与人IgG1(G1m3)的CH3区(即SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的CH3区。
可以通过序列比对在人IgG1中鉴定那些对应的位置，其可以例如使用序列比对软件如ClustalOmega(
Figure BDA0003039667430000131
J.2005，BioInformatics 21,951-960)执行。
作为说明，人IgG1中的取代L242C和K334C对应于第125位的I>C取代，以及第217位的R>C取代，位于小鼠Igγ-2A链C区，A等位基因，根据SEQ ID NO：25编号。
在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加Fc介导的功能。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加ADCC。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加ADCP。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加或降低CDC。与包含相应的未修饰的Fc区的抗原结合分子相比，包含含有修饰以增加Fc介导的功能(例如ADCC、ADCP、CDC)的Fc区的抗原结合分子诱导相关效应子功能的水平提高。与包含相应的未修饰的Fc区的抗原结合分子相比，包含含有修饰以降低Fc介导的功能(例如CDC)的Fc区的抗原结合分子诱导相关效应功能的水平降低。
在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与Fc受体的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与Fcγ受体的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRIIIa的结合。
在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRIIa的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcγRIIb的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以减少与FcγRIIb的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与FcRn的结合。
在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加与补体蛋白的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加或减少与C1q的结合。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以促进抗原结合分子的六聚化。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加抗原结合分子的半衰期。在一些实施方式中，Fc区含有修饰以增加共接合。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包括一种以上的多肽，其包含重链恒定区或包括CH2-CH3区)以下的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)：对应于第242位处的C；对应于第334位处的C；对应于第236位处的A；对应于第239位处的D；对应于第332位处的E；对应于第330位处的L；对应于第345位处的K；和对应于第430位处的G。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包括一种以上的多肽，其包含重链恒定区或包括CH2-CH3区)一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)以下的取代(或对应的取代)：L242C、K334C、G236A、S239D、I332E、A330L、E345K和E430G。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第242位处的C。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第334位处的C。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第242位处的C和对应于第334位处的C。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第236位处的A。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第239位处的D。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第236位处的A和对应于第239位处的D。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第332位处的E。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D和对应于第332位处的E。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第330位处的L。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E和对应于第330位处的L。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH3-CH3区或包括CH3区)对应于第345位处的K。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH3-CH3区或包括CH3区)对应于第430位处的G。在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH3-CH3区或包括CH3区，包括)对应于第345位处的K和对应于第430位处的G。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第242位处的C，对应于第334位处的C，对应于第236位处的A和对应于第239位处的D。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第242位处的C，对应于第334位处的C，对应于第236位处的A，对应于第239位处的D和对应于第332位处的E。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)对应于第242位处的C，对应于第334位处的C，对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E和对应于第330位处的L。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区或包括CH2-CH3区)对应于第242位处的C，对应于第334位处的C，对应于第345位处的K和对应于第430位处的G。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)L242C取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)K334C取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)L242C取代(或等同的取代)和K334C取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)G236A取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)S239D取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)G236A取代(或等同的取代)和S239D取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)I332E取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)G236A取代(或等同的取代)，S239D取代(或等同的取代)和I332E取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)A330L取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)G236A取代(或等同的取代)，S239D取代(或等同的取代)，I332E取代(或等同的取代)和A330L取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH3-CH3区或包括CH3区)E345K取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH3-CH3区或包括CH3区)E430G取代(或等同的取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH3-CH3区或CH3区)E345K取代(或等同的取代)和E430G取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)L242C取代(或等同的取代)，K334C取代(或等同的取代)，G236A取代(或等同的取代)和S239D取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)L242C取代(或等同的取代)，K334C取代(或等同的取代)，G236A取代(或等同的取代)和S239D取代(或等同的取代)，以及I332E取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区、CH2-CH3区或包括CH2区)L242C取代(或等同的取代)，K334C取代(或等同的取代)，G236A取代(或等同的取代)，S239D取代(或等同的取代)，I332E取代(或等同的取代)和A330L取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含(例如包含一种以上的多肽，其包含重链恒定区或包括CH2-CH3区)L242C取代(或等同的取代)，K334C取代(或等同的取代)，E345K取代(或等同的取代)，和E430G取代(或等同的取代)。
在一些实施方式中，Fc区包含一种或多种多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：8、9、10、11、12、13、14或15具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方式中，Fc区包含一种或多种多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：16、17、18、19、20、21、22、23、24、33、34、35、36、37、38、39、40或41具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包括一种以上的多肽，其包含重链恒定区或包括CH2-CH3区)以下的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)：对应于第243位处的L，对应于第292位处的P，对应于第300位处的L，和对应于第305位处的I，和对应于第396位处的L；对应于第239位处的D和对应于第332位处的E；对应于第239为处的D，对应于第332位处的E，和对应于第330位处的L；对应于第298位处的A，对应于第333位处的A和对应于第334位处的A；对应于第234位处的Y，对应于第235位处的Q，对应于第235位处的W，对应于第239位处的M，对应于第268处的D，对应于第270位处的E和对应于第298位处的A；对应于第270位处的E，对应于第326位处的D，对应于第330位处的M和对应于第334位处的E；对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，和对应于第332位处的E；对应于第326位处的W，和对应于第333位处的S；对应于第267位处的E，对应于第268位处的F和对应于第324位处的T；对应于第345位处的R，对应于第430位处的G，和对应于第440位处的Y；对应于第252位处的Y，对应于第254位处的T，和对应于第256位处的E；对应于第428位处的L，和对应于第434位处的S。
在一些实施方式中，Fc区包括(例如包括一种以上的多肽，其包含重链恒定区或包括CH2-CH3区)一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)以下的取代组合(或对应的取代)：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；S239D/I332E；S239D/I332E/A330L；S298A/E333A/K334A；L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A；D270E/K326D/A330M/K334E；G236A/S239D/I332E；K326W/E333S；S267E/H268F/S324T；E345R/E430G/S440Y；M252Y/S254T/T256E；和M428L/N434S。
在一些实施方式中，Fc区或多肽包括Fc区连接的寡糖的修饰(相对于野生型IgG1的Fc区连接的寡糖)。Fc区的糖工程化在Kellner等人，Transfus Med Hemother(2017)44：327-336中描述，其通过引用整体并入本文。连接至N297人IgG1 Fc的寡糖的存在对于与Fcγ受体和C1q的结合是重要的，并且已经证明了降低N-聚糖中的岩藻糖或唾液酸含量改善ADCC活性。
已经使用各种不同的方法来制备带有糖工程化的Fc区的抗体，包括从细胞生产，所述细胞缺乏参与聚糖加工/修饰的一种或多种酶的活性。例如，通过从修饰的细胞中表达制备具有N-聚糖中的岩藻糖降低的Fc，所述修饰用于降低岩藻糖基转移酶的蛋白质表达(例如通过基因敲除或反义干扰)。或者，可以使用用于去除岩藻糖残基的因子处理抗体。修饰抗体Fc聚糖的其他方法包括从具有N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶上调表达的细胞中表达，用于产生具有平分型GlcNAc的N-聚糖，其改善了Fc受体结合。
在一些实施方式中，Fc区或多肽包含缺乏岩藻糖的N-聚糖。在一些实施方式中，Fc区或多肽包含缺乏唾液酸的N-聚糖。在一些实施方式中，Fc区或多肽缺少含有岩藻糖的N-聚糖。在一些实施方式中，Fc区或多肽缺少含有唾液酸的N-聚糖。在一些实施方式中，Fc区或多肽包含缺乏岩藻糖的N-聚糖。在一些实施方式中，Fc区或多肽包含含有平分型GlcNAc的N-聚糖。
在一些实施方式中，Fc区包含一种或多种在促进Fc区的组成性多肽缔合的CH2和CH3区中的修饰。抗原结合分子的组成性多肽的重组共表达和随后的缔合导致几种可能的组合。为了在重组生产中提高抗原结合分子中所需多肽组合的产率，在Fc区中引入促进重链多肽所需组合的缔合的修饰是有利的。修饰可以促进例如不同多肽链的CH2和/或CH3区之间的疏水和/或静电相互作用。例如，适当的修饰在Ha等人，Front.Immnol(2016)7：394中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，本发明的抗原抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包括根据以下形式之一的Fc区的CH3区中的成对取代，如Ha等人，Immnol(2016)7：394的表1中所示：KiH、KiH s-s、HA-TF、ZW1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVT s-s、SEED或A107。在一些实施方式中，本发明的抗原抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包括根据以下形式之一的Fc区的CH3区中的成对取代，如Brinkmann和Kontermann，MAbs(2017)9(2)：182-212的表1所示(其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方式中，Fc区包含“柞臼结构(knob-into-hole)”或“KiH”修饰，例如，如美国专利US 7,695,936和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001年)中所述。在这样的实施方式中，Fc区的一个CH3区包含“柞”修饰，而另一个CH3区包含“臼”修饰。“柞”和“臼”的修饰位于相应的CH3区域内，因此“柞”可以位于“臼”中，以促进多肽的异二聚(和抑制同二聚)和/或稳定异二聚。通过将具有小链的氨基酸替换为具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)来构建“柞”。通过将具有大侧链的氨基酸替换为具有较小侧链的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)来产生“臼”。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子的Fc区的一个CH3区包含T366W取代(本文中的Fc、CH2和CH3区中的位置/取代基的编号是根据所述的EU编号系统在Kabat等人的《免疫学感兴趣的蛋白质序列》，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，贝塞斯达，马里兰州，1991出版中述及)，且Fc区的另一个CH3区包含Y407V取代。在一些实施方式中，抗原结合分子的Fc区的一个CH3区包含T366W取代，且Fc区的另一CH3区包含T366S和L368A取代。在一些实施方式中，抗原结合分子的Fc区的一个CH3区包含T366W取代，且Fc区的另一个CH3区包含Y407V、T366S和L368A取代。
在一些实施方式中，所述Fc区包含如WO 2014/131694 A1中所述的DD-KK修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含K392D和K409D取代，且Fc区的另一个CH3区包含E356K和D399K取代。所述修饰促进CH3区之间的静电相互作用。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含如Labrijn等人，Proc Natl AcadSci USA.(2013)110(13)：5145-50中所述修饰的Fc区，称为“双抗体(Duobody)”形式。在一些实施方式中，一个CH3区包含K409R取代，且Fc区的另一个CH3区包含K405L取代。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Strop等人，JMol Biol.J.Biol.(2012)420(3):204-19中所述的“EEE-RRR”修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含D221E、P228E和L368E取代，且Fc区的另一个CH3区包含D221R、P228R和K409R取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含一Fc区，该Fc区包含Choi等人，Mol CancerTher(2013)12(12)：2748-59中所述的“EW-RVT”修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含K360E和K409W取代，且Fc区的另一个CH3区包含Q347R、D399V和F405T取代。
在一些实施方式中，一个CH3区包含S354C取代，且Fc区的另一个CH3区包含Y349C取代。这些半胱氨酸残基的引入导致在Fc区的两个CH3区之间形成二硫桥，进一步稳定了异二聚体(Carter(2001)，J Immunol Methods 248，7-15)。
在一些实施方式中，Fc区包含“KiHS-S”修饰。在一些实施方式中，一个CH3区包含T366W和S354C取代，且Fc区的另一个CH3区包含T366S、L368A、Y407V和Y349C取代。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Davis等人，Protein Eng Des Sel(2010)23(4)：195-202中所述的“SEED”修饰，其中人IgG1 CH3和IgACH3的β-链段被交换。
在一些实施方式中，一个CH3区包含S364H和F405A取代，且Fc区的另一个CH3区包含Y349T和T394F取代(参见例如Moore等人，MAbs(2011)3(6)：546–57)。
在一些实施方式中，一个CH3区包含T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，而另一个Fc区的CH3区包含T350V、T366L、K392L和T394W取代(例如参见Von Kreudenstein等人，MAbs(2013)5(5)：646-54)。
在一些实施方式中，一个CH3区包含K360D、D399M和Y407A取代，而Fc区的另一个CH3区包含E345R、Q347R、T366V和K409V取代(参见例如Leaver-Fay等人，Structure(2016)24(4)：641-51)。
在某些实施方式中，一个CH3区包含K370E和K409W取代，而另一个Fc区CH3区包含E357N、D399V和F405T取代(参见例如Choi等人，PLoS One(2015)10(12)：e0145349)。
Fc受体
Fc受体是与免疫球蛋白的Fc区结合的多肽。Fc受体的结构和功能综述于例如Masuda等人，Inflamm Allergy Drug Targets(2009)8(1)：80-86和Bruhns，Blood(2012)119：5640-5649，两者均通过引用整体并入本文。
Fc受体在包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和NK细胞的造血细胞表面表达。它们包括与IgG结合的Fcγ受体，IgE的高亲和力受体(FcεRI)，IgA受体以及IgA和IgM的聚合Ig受体。新生儿Fc受体(FcRn)是IgG的另一种Fc受体，并参与跨上皮屏障的IgG转运(胞吞作用)，保护IgG免受降解和抗原呈递。人类具有六类不同的Fcγ受体(小鼠直系同源物显示在圆括号中)：FcγRI(mFcγRI)、FcγRIIa(mFcγRIII)、FcγRIIb(mFcγRIIb)、FcγRIIc、FcγRIIIa(mFcγRIV)和FcγRIIIb。
Fcγ受体可能是激活性的或抑制性的。激活性Fcγ受体FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa在其细胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，并且通过Fc的连接导致表达该受体的细胞的激活。
抑制性Fcγ受体FcγRIIb在其细胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)，并在通过Fc连接后负调控细胞的活化和脱粒、细胞增殖、内吞作用和吞噬作用。
在本说明书中，“Fcγ受体”可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同工型、片段、变体(包括突变体)或同源物。类似地，“FcγRI”、“FcγRIIa”、“FcγRIIb”、“FcγRIIc”、“FcγRIIIa”和“FcγRIIIb”分别指任何物种的FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb，并且包括来自任何物种的同工型、片段、变体(包括突变体)或同源物。变体Fcγ受体包括例如人FCγRIIIa的158V和158F多晶态型，和人FCγRIIa的167H和167R多晶态型。
在一些实施方式中，Fcγ受体(例如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、猕猴、非人灵长类或人类)和/或啮齿动物(例如大鼠或小鼠)。同工型、片段、变体或同源物可以任选地表征为与给定物种(例如人类)的Fcγ受体(例如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)的未成熟或成熟同工型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同工型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同工型、片段、变体或同源物，例如具有通过合适的功能特性/活性分析所确定的参考Fcγ受体的功能特性/活性。例如，FcγRI的同工型、片段、变体或同源物可以例如是显示与人IgG1Fc相关。
在本说明书中，“FcRn受体”可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同工型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
在一些实施方式中，FcRn受体来自哺乳动物(例如灵长类(恒河猴、猕猴、非人灵长类或人类)和/或啮齿动物(例如大鼠或小鼠))。同工型、片段、变体或同系物可以任选地表征为与来自给定物种(例如人类)的FcRn受体的不成熟或成熟同工型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列同一性。
同工型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同工型、片段、变体或同源物，例如，具有参照FcRn的功能特性/活性，而该功能特性/活性是由合适的分析方法所确定的。例如，FcRn的同工型、片段、变体或同源物可以例如是显示与人IgG1 Fc相关。
本发明的抗原结合分子或Fc区可以是或可以包含多肽的复合物。本发明还提供了本文所述的抗原结合分子和Fc区的多肽组分。所述多肽可以分离或基本上以纯化的形式提供。
接头和其他序列
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子和多肽在氨基酸序列之间包含一个或多个接头序列。可以在一个或多个如本文所述的抗原结合分子/Fc区/多肽的VH、VL、CH1-CH2铰链区、CH2区和CH3区中的一端或两端提供接头序列。
接头序列是技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许由接头序列连接的氨基酸序列的相对运动。柔性接头是技术人员已知的，并且在Chen等人，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中鉴定了几种。柔性接头序列通常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
在一些实施方式中，所述接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方式中，所述接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方式中，所述接头序列的长度为1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-30个氨基酸。在一些实施方式中，所述接头序列包括或由包含一个或多个(例如1、2、3、4)SEQ ID NO：26或27所示的氨基酸序列的串联拷贝的氨基酸序列组成。
本发明的抗原结合分子和多肽可以另外包含其他氨基酸或氨基酸序列。例如，所述抗原结合分子和多肽可包含氨基酸序列，以促进抗原结合分子/多肽的表达、折叠、运输、加工、纯化或检测。例如，所述抗原结合分子/多肽可以包含任选地在抗原结合分子/多肽的N-或C-末端编码的His(例如6XHis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素标签的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合分子/多肽包含可检测的部分，例如荧光、发光、免疫检测、放射、化学、核酸或酶标记。
本发明的抗原结合分子、Fc区和多肽可以另外包含信号肽(也称为前导序列或信号序列)。信号肽通常由5-30个疏水性氨基酸序列组成，形成单个α螺旋。分泌的蛋白质和在细胞表面表达的蛋白质通常包含信号肽。
信号肽可以存在于抗原结合分子/Fc区/多肽的N-末端，并且可以存在于新合成的抗原结合分子/Fc区/多肽中。信号肽负责抗原结合分子/Fc区/多肽的有效运输和分泌。信号肽通常通过切割去除，因此不包含在表达抗原结合分子/Fc区/多肽的细胞分泌的成熟抗原结合分子/Fc区/多肽中。
信号肽对于许多蛋白质而言是已知的，并且记录在诸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源(Protein Information Resource)、蛋白质数据库(ProteinData Bank)、Ensembl和InterPro等数据库中，和/或可以使用诸如SignalP(Petersen等人，2011Nature Methods 8：785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl，2008Bioinformatics24：2172-2176)之类的氨基酸序列分析工具识别/预测。
标签和缀合物
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子另外包含可检测的部分。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含可检测的部分，例如荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫可检测标记(例如表位标记)、放射性标记、化学、核酸或酶标记。所述抗原结合分子可以被可检测部分共价或非共价标记。
荧光标记包括例如荧光素、若丹明、别藻蓝蛋白、曙红和NDB、稀土(例如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm))的绿色荧光蛋白(GFP)螯合物、四甲基若丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3和Cy5。放射性标记物包括放射性同位素诸如碘123、碘125、碘126、碘131、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞207、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、铜67、氟18、钇90、钯100、铋217和锑211。发光标记包括放射性发光、化学发光(例如a啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)和生物发光标记。免疫可检测的标记包括半抗原、肽/多肽、抗体、受体和配体，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或洋地黄毒苷。核酸标记包括适配体。酶标记包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和萤光素酶。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与化学部分缀合。所述化学部分可以是用于提供治疗效果的部分。抗体-药物缀合物在Parslow等人，Biomedicines.2016年9月；4(3)：14中综述。在一些实施方式中，所述化学部分可以是药物部分(例如细胞毒性剂)。在一些实施方式中，所述药物部分可以是化学治疗剂。在一些实施方式中，所述药物部分选自卡奇霉素(calicheamicin)、DM1、DM4、单甲基奥他汀E(MMAE)、单甲基奥他汀F(MMAF)、SN-38、阿霉素、杜卡霉素(duocarmycin)、D6.5和PBD。
功能性质
本文所述的抗原结合分子、Fc区和多肽可以通过参考某些功能性质来表征。
在一些实施方式中，包含本文所述的Fc区的抗原结合分子可具有以下一种或多种性质：
与激活性Fcγ受体结合(例如，hFCγRIIa(例如hFCγRIIa167H，hFCγRIIa167R)，hFCγRIIIa(例如hFCγRIIIa158V，hFCγRIIIa158F)，mFCγRIV，mFCγRIII)；
与FcRn(例如hFcRn，mFcRn)结合；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与激活性Fcγ受体(例如，hFcγRIIa(例如hFcγRIIa167H，hFcγRIIa167R)，hFcγRIIIa(例如hFcγRIIIa158V，hFcγRIIIa158F)，mFcγRIV，mFcγRIII)的结合增加；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与FcRn(例如hFcRn，mFcRn)的结合增加；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与抑制性Fcγ受体(例如，hFcγRIIb,mFcγRIIb)的结合减少；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与激活性Fcγ受体的结合增强和/或选择性高于抑制性Fcγ受体(例如，对hFcγRIIa的选择性高于hFcγRIIb)；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与补体蛋白(例如C1q)的结合增加或减少；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，六聚化增加；
与具有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，ADCC活性增加。
与具有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，ADCP活性增加。
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，CDC活性增加；
与具有由SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，热稳定性相似或增加；或
与具有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，对体内肿瘤生长的抑制增加。
与Fc受体的结合可以通过本领域技术人员熟知的方法分析，包括例如ELISA、表面等离子体共振(SPR；参见例如Hearty等人，Methods Mol Biol(2012)907：411-442)、生物层干涉法(参见例如Lad等人，(2015)J Biomol Screen 20(4):498-507)。亲和力可以被测定，并且可以被表示为例如KD值。
与另一个Fc受体相比，与给定的Fc受体结合的选择性可以例如通过确定与每个受体结合的亲和力来确定。结合的选择性可以表示为与不同Fc受体结合的KD值的分数。
ADCC活性可以通过例如根据Yamashita等人，Scientific Reports(2016)6：19772(通过引用整体并入本文)中描述的方法，或通过例如在Jedema等人，Blood(2004)103：2677–82(通过引用整体并入本文)中所描述的51Cr释放法来分析。也可以使用Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒，根据制造商的说明分析ADCC活性(如本文实施例5中所述)。
ADCP可以通过例如根据Kamen等人，J Immunol(2017)198(1增刊)157.17中描述的方法(通过引用整体并入本文)分析。
诱导CDC的能力可以通过例如使用C1q结合测定分析，例如Schlothauer等人，Protein Engineering，Design and Selection(2016)，29(10)：457-466(其通过引用整体并入本文)中所述。
抗原结合分子的热稳定性可以通过本领域技术人员熟知的方法分析，包括差示扫描几何法和差示扫描量热法(DSC)，其描述于例如He等人，J Pharm Sci.(2010),其通过引用整体并入本文。热稳定性可通过熔融温度(Tm)、去折叠温度或分散温度(例如以℃或F°表示)来反映。
肿瘤生长抑制可以在合适的体内模型(例如，细胞系衍生的异种移植模型，如A549细胞衍生模型)中分析。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子与激活性Fcγ受体(例如，hFcγRIIa(例如hFcγRIIa167H，hFcγRIIa167R)，hFcγRIIIa(例如hFcγRIIIa158V，hFcγRIIIa158F)，mFcγRIV，mFcγRIII)结合的亲和力是含有由具有SEQ IDNO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子与激活性Fcγ受体结合的亲和力的1倍以上，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍以上，或20倍以上。在一些实施方式中，包含本文所述Fc区的抗原结合分子结合激活性Fcγ受体的KD是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子结合激活性Fcγ受体的KD的1倍以下，例如，0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06倍以下，或0.05倍以下。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子与激活性Fcγ受体(例如，hFCγRIIa(例如hFcγRIIa167H，hFcγRIIa167R)，hFcγRIIIa(例如hFcγRIIIa158V，hFcγRIIIa158F)，mFcγRIV，mFcγRIII)的KD为1000nm或更小，优选≤500nm，≤100nm，≤75nm，≤40nm，≤30nm，≤20nm，≤15nm，≤12.5nm，≤10nm，≤12.5nm，≤10nm，≤12.5nm，≤10nm，≤12.5nm。9nm，≤8nm，≤7nm，≤6nm，≤5nm，≤4nm≤3nm，≤2nm或≤1nm之一。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子与FcRn(例如hFcRn,mFcRn)结合的亲和力是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子与激活性Fcγ受体结合的亲和力的1倍以上，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍以上，或20倍以上。在一些实施方式中，包含本文所述Fc区的抗原结合分子结合活性FcRn的KD是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子结合FcRn的KD的1倍以下，例如，0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06倍以下，或0.05倍以下。
在一些实施方案中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子结合的FcRn(例如hFcRn,mFcRn)的KD为1000nm或更小，优选≤500nm，≤100nm，≤75nm，≤50nm，≤40nm，≤30nm，≤20nm，≤15nm，≤12.5nm，≤10nm，≤9nm，≤8nm，≤7nm，≤6nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm或≤1nm。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子与抑制性Fcγ受体(例如，hFcγRIIb,mFcγRIIb)结合的亲和力是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子与抑制性Fcγ受体结合的亲和力的1倍以下，例如0.9、0.8、4、5、6、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2倍以下，或0.1倍以下。在一些实施方式中，包含本文所述Fc区的抗原结合分子结合抑制性Fcγ受体的KD是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子结合抑制性Fcγ受体的KD的1倍以上，例如，2、3、4、5、6、7、8、9倍以上，或10倍以上。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子与抑制性Fcγ受体(例如，hFcγRIIb,mFcγRIIb)结合的KD为1nm或更大，优选≥5nm，≥10nm，≥50nm，≥100nm，≥500nm，≥1000nm，≥2000nm，≥3000nm，≥4000nm或≥5000nm之一。
在一些实施方案中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子对激活性Fcγ受体(例如hFcγRIIa)相对于抑制性Fcγ受体(例如hFcγRIIb)的结合的选择性是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子表现出的结合选择性的1倍以上，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍以上，或20倍以上。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子表现出的ADCC是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子表现出的ADCC的1倍以上，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍以上，或20倍以上。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子在ADCC活性测定中测得的EC50(ng/ml)是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子测得的EC50(ng/ml)的1倍以下，例如，0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.5、0.4、0.3、0.2倍以下、或0.1倍以下。
在一些实施方案中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子在ADCC活性测定中测得的EC50(ng/ml)为500ng/ml或更低，优选≤400ng/ml，≤300ng/ml，≤200ng/ml，≤100ng/ml，≤90ng/ml，≤80ng/ml，≤70ng/ml，≤60ng/ml，≤50ng/ml，≤40ng/ml，≤30ng/ml，≤20ng/ml，或≤10ng/ml之一。
在一些实施方案中，包含如本文所述的Fc区的一种抗原结合分子的熔融温度、去折叠温度或分散温度可以是含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子的熔融温度、去折叠温度或分散温度的≥0.75倍且≤1.25倍，例如≥0.8倍且≤1.2倍，≥0.9倍且≥1.1倍，≥0.91倍且≤1.09倍，≥0.92倍且≤1.08倍，≥0.93倍且≤1.07倍，≥0.94倍且≤1.06倍，≥0.95倍且≤1.05倍，≥0.96倍且≤1.04倍，≥0.97倍且≤1.03倍，≥0.98倍且≤1.02倍，或≥0.99倍且≤1.01倍。
在一些实施方案中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子可以抑制体内肿瘤生长至观察到的含有由具有SEQ ID NO：6或31的氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子肿瘤生长抑制的水平的1倍以上，例如≥1.01倍，≥1.02倍，≥1.03倍，≥1.04倍，≥1.05倍，≥1.1倍，≥1.3倍，≥1.4倍，≥1.5倍，≥1.6倍≥1.7倍，≥1.8倍，≥1.9倍，≥2次倍，≥3倍，≥4倍，≥5倍，≥6倍，≥7倍，≥78，≥9倍或≥10倍。
核酸和载体
本发明提供了一种或多种编码根据本发明的抗原结合分子、Fc区或多肽的核酸。
在一些实施方式中，所述核酸是纯化的或分离的，例如来自其他核酸或天然存在的生物材料。在一些实施方式中，所述核酸包含DNA和/或RNA或由其组成。
本发明还提供了一种或多种载体，其包含根据本发明的一种或多种核酸。
核苷酸序列可以包含在载体中，例如表达载体。如本文所用，“载体”是用作运载体的核酸分子，其将外源核酸转移到细胞中。所述载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。这样的载体可以包括与编码要表达的序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于表达来自根据本发明的载体的肽或多肽。
术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中所选核苷酸序列和调节性核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)以将核苷酸序列的表达置于调节序列影响或控制下的方式共价连接(从而形成表达盒)。因此，如果调节序列能够影响核酸序列的转录，则该调节序列可操作地连接至所选核酸序列。然后可以将所得的转录本翻译成所需的肽/多肽。
合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(MLV)来源的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘苗病毒载体和疱疹病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在一些实施方式中，所述载体可以是真核载体，例如包含在真核细胞中表达来自载体的蛋白质所必需的元件。在一些实施方式中，所述载体可以是哺乳动物载体，例如包含巨细胞病毒(CMV)或SV40启动子以驱动蛋白质表达。
根据本发明的抗原结合分子或Fc区的组成性多肽可以由多种核酸中的不同核酸，或由多种载体中的不同载体编码。
包含/表达抗原结合分子和多肽的细胞
本发明还提供了包含或表达根据本发明的抗原结合分子、Fc区或多肽的细胞。还提供了一种细胞，其包含或表达根据本发明的一种核酸或多种核酸，一种载体或多种载体。
所述细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。所述哺乳动物可以是灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人类灵长类动物或人类)或非人类哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括任何啮齿目的动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括母牛，例如奶牛，或牛科(Bos)目的任何动物)、马(包括马科(Equidae)目的任何动物)、驴和非人类灵长类动物)。
本发明还提供了一种产生包含根据本发明的一种或多种核酸或载体生物细胞的方法，包括将根据本发明的一种核酸或多种核酸，一种载体或多种载体导入细胞内。在一些实施方式中，将根据本发明的分离的核酸或载体导入细胞包括转化、转染、电穿孔或转导(例如逆转录病毒转导)。
本发明还提供了一种生产表达/包含本发明的抗原结合分子、Fc区或多肽的细胞的方法，其包括将根据本发明的一种核酸或多种核酸，一种载体或多种载体导入细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括在适合于细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方式中，所述方法是体外进行的。
本发明还提供了通过根据本发明的方法获得或可获得的细胞。
生产抗原结合分子、Fc区和多肽
根据本发明的抗原结合分子、Fc区和多肽可以根据技术人员已知的多肽生产方法来制备。
多肽可以通过化学合成制备，例如液相或固相合成。例如，可以使用例如Chandrudu等人，Molecules(2013)，18：4373-4388中描述的方法合成肽/多肽，其通过引用整体并入本文。
或者，可以通过重组表达生产抗原结合分子、Fc区和多肽。适用于重组生产多肽的分子生物学技术是本领域众所周知的，例如Green和Sambrook在《分子克隆：实验室手册(第4版)，冷泉港出版社，2012年，以及在Nat Methods.(2008)；5(2)：135-146中所述，两者均通过引用整体并入本文。重组生产抗原结合分子的方法也描述在Frenzel等人，FrontImmunol.(2013)；4：217以及Kunert和Reinhart，Appl Microbiol Biotechnol.(2016)100：3451–3461，两者均通过引用整体并入本文。
在某些情况下，本发明的抗原结合分子和Fc区由一种以上的多肽链组成。在这种情况下，生产可包括不止一种多肽的转录和翻译，以及随后的多肽链缔合以形成抗原结合分子。
对于根据本发明的重组生产，可以使用适合于表达多肽的任何细胞。所述细胞可以是原核生物或真核生物。在一些实施方式中，所述细胞是原核细胞，例如古细菌或细菌的细胞。在一些实施方式中，所述细菌可以是革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科的细菌，例如大肠杆菌。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细，例如CHO、HEK(例如HEK293)、HeLa或COS细胞。
在某些情况下，所述细胞不是原核细胞，因为某些原核细胞不允许与真核细胞相同的折叠或翻译后修饰。另外，在真核生物中可能有非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白质。也可以利用特异性质粒以增强蛋白质向培养基中分泌。
在一些实施方式中，多肽可以通过无细胞蛋白质合成(CFPS)，例如使用根据Zemella等人，Chembiochem(2015)16(17)：2420-2431中所述的系统，其通过引用整体并入本文。
生产可以涉及经修饰以表达目的多肽的真核细胞的培养或发酵。所述培养或发酵可在配备有适当养分、空气/氧气和/或生长因子的生物反应器中进行。分泌的蛋白质可通过从细胞分离培养基/发酵液，提取蛋白质含量并分离单个蛋白以分离分泌的多肽来收集。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的，并且描述于例如Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册》(第4版；以上通过引用并入本文)。
生物反应器包括一个或多个可以在其中培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，反应物连续流入反应器，培养细胞连续流出反应器。或者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如pH、氧气、进出容器的流速以及容器内的搅动，从而为培养的细胞提供最佳条件。
在培养表达抗原结合分子/Fc区/多肽的细胞之后，可以分离出目的的多肽。可以使用本领域已知的从细胞分离蛋白质的任何合适方法。为了分离多肽，可能有必要将细胞与营养培养基分离。如果多肽是从细胞分泌的，则可以通过离心将细胞与含有分泌的目的多肽的培养基分离。如果目的多肽聚集在细胞内，则蛋白质分离可包括离心以从细胞培养基中分离出细胞，用裂解缓冲液处理细胞沉淀，以及例如通过超声处理、快速冻融或渗透裂解来裂解细胞。
然后可能需要从上清液或培养基中分离目标多肽，所述上清液或培养基可以包含其他蛋白质和非蛋白质成分。从上清液或培养基中分离蛋白质成分的常用方法是沉淀。不同溶解度的蛋白质会在不同浓度的沉淀剂(例如硫酸铵)下沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下提取水溶性蛋白质。因此，通过添加不同的浓度增加的沉淀剂，可以区分具有不同溶解度的蛋白质。随后可使用透析法从分离的蛋白质中去除硫酸铵。
区分不同蛋白质的其他方法(例如离子交换层析和尺寸色谱法)是本领域已知的。这些可以用作沉淀的替代，或者可以在沉淀之后进行。
一旦从培养物中分离出目标多肽，就可能需要或必须浓缩多肽。浓缩蛋白质的许多方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。
组合物
本发明还提供了包含如本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸、表达载体和细胞的组合物。
本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸、表达载体和细胞可以配制成用于临床用途的药物组合物或药物，并且可以包含药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。可以将组合物配制成用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、肿瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或经皮给药途径，包括注射或输注。
合适的制剂可以在无菌或等渗培养基中包含抗原结合分子。药物和药物组合物可以配制成包括凝胶在内的流体形式。可以配制流体制剂以通过注射或输注(例如经由导管)施用于人体或动物体的选定区域。
在一些实施方式中，将所述组合物配制成用于注射或输注，例如进入血管或肿瘤的制剂。
根据本文所述的发明，还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，这种生产方法可以包括一个或多个选自以下的步骤：生产如本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸(或其多个)、表达载体(或其多个)或细胞；分离本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸(或其多个)、表达载体(或其多个)或细胞；和/或将本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸(或其多个)、表达载体(或其多个)或细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本文描述的本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗疾病/病症(例如癌症)的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸(或其多个)、表达载体(或其多个)或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。
使用本公开的制品的方法
本公开的制品可用于采用Fc效应功能的方法。
特别地，本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于采用Fc介导的效应功能的方法，例如抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)、抗体-依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、膜攻击复合物(MAC)的形成、细胞脱粒、细胞因子和/或趋化因子生产，或抗原加工和呈递。
这些方法包括：用于杀伤表达靶抗原的细胞的方法，用于减少表达靶抗原的细胞数的方法，用于抑制表达靶抗原的细胞活性的方法，用于增强针对表达靶抗原的细胞的免疫应答的方法，促进表达靶抗原的细胞裂解的方法，用于增加表达靶抗原的细胞吞噬作用的方法。
所述方法可以包括使细胞或表达靶抗原的细胞与本文所述的抗原结合分子、细胞或组合物接触。在一些实施方式中，所述方法进一步包含使表达靶抗原的细胞与相关活性的效应细胞(例如NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞(用于ADCC)、吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、组织树突状细胞、肥大细胞)接触。所述方法可以是体外、体内或离体方法。
本文所述的抗原结合分子、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于治疗和预防方法。
本发明提供了本文所述的抗原结合分子、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物，用于医疗或预防方法。还提供了本文所述的抗原结合分子、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗或预防有效量的如本文所述的抗原结合分子、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物。
所述方法可以有效地减少疾病/病症的发展或进展，缓解疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的病理。所述方法可以有效地预防疾病/病症的进展，例如防止疾病/病症恶化或减慢其发展速度。在一些实施方式中，所述方法可以导致疾病/病症的改善，例如减轻疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的严重性/活动性的其他一些相关因素。在一些实施方式中，所述方法可以防止疾病/病症发展到后期(例如慢性期或转移)。
应当理解，本发明的制品可以用于治疗/预防将从表达靶抗原的细胞的数目和/或活性的减少中受益的任何疾病/病症。例如，所述疾病/病症可以是在病理上涉及表达靶抗原的细胞，例如靶抗原水平的增加，或表达靶抗原的细胞数量/比例增加与该疾病/病症的发作、发展或进展和/或该疾病/病症的一种或多种症状的严重程度正相关的疾病/病症，或靶抗原水平的增加，或表达靶抗原的细胞数量/比例增加是该疾病/病症发作、发展或进展的危险因素。
在一些实施方式中，所述待治疗/预防的疾病/病症是特征在于表达靶抗原的细胞的数目/比例/活性增加的疾病/病症，例如与在没有疾病/病症的情况下表达靶抗原的细胞的数量/比例/活性相比。
在一些实施方式中，所述待治疗/预防的疾病/病症是癌症。所述癌症可以是任何有害的细胞增殖(或任何通过有害的细胞增殖表现出来的疾病)、赘生物或肿瘤。所述癌症可能是良性或恶性的，以及可能是原发性或继发性的(转移性的)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。癌症可以是源自例如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞的组织/细胞。
待治疗的肿瘤可能是神经或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢神经系统或周围神经系统，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例如包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、非小细胞肺癌、血液癌和肉瘤。
所述治疗/预防可以针对以下一种或多种：延缓/预防癌症症状的发作/进展，降低癌症症状的严重性，降低癌症细胞的存活/生长/侵袭/转移，减少癌细胞的数目和/或增加受试者的存活率。
在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症包括表达靶抗原的细胞。在一些实施方式中，所述待治疗/预防的癌症是靶抗原阳性的癌症。在一些实施方式中，所述癌症过表达靶抗原。靶抗原的过表达可以通过检测靶抗原的表达水平，其表达水平大于由等同的非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。
靶抗原表达可以通过任何合适的方式确定。表达可以是基因表达或蛋白质表达。基因表达可以通过检测编码靶抗原的mRNA，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)确定。蛋白质表达可以通过检测靶抗原，例如通过基于抗体的方法(例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术或ELISA)确定。
在一些实施方式中，可以基于在例如从受试者获得的样品中，对表达靶抗原的癌症的检测或过表达靶抗原的癌症的检测来选择治疗的患者。
在一些实施方式中，根据本发明的待处理/预防的癌症选自：实体癌、液体癌、胃癌(例如胃癌、胃腺癌、胃肠腺癌)、肝癌(肝细胞癌、胆管癌)、头部和颈部癌症(例如头部和颈部鳞状细胞癌)、乳腺癌、卵巢癌(例如卵巢癌)、肺癌(例如NSCLC、肺腺癌、鳞状肺细胞癌)、脑癌(例如胶质母细胞瘤)、皮肤癌(例如黑色素瘤)、前列腺癌、口腔癌(例如口咽癌)、肾癌(例如肾细胞癌)、结直肠癌(例如结直肠癌)、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、血液系统恶性肿瘤、髓系血液学恶性肿瘤、淋巴细胞血液系统恶性肿瘤、髓细胞增生综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、胸腺瘤或多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方式中，所述疾病/病症是一种感染性疾病(即由感染原引起的疾病/病症)。在这样的实施方式中，治疗可以旨在减少感染细胞的数量(例如，在与细胞内病原体感染相关的感染性疾病的情况下)和/或杀死感染原。
感染可以是任何感染或感染性疾病，例如病毒、细菌、真菌或寄生感染。在一些实施方式中，所述疾病/病症可能与细胞内病原体感染有关。在一些实施方式中，所述疾病/病症可能与病毒感染有关。在一些实施方式中，可能特别考虑治疗慢性/持续感染。所述感染可能是慢性、持续、潜伏或缓慢的，并且可能是病毒、细菌、真菌或寄生虫感染的结果。因此，可以向患有细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。
可以治疗的细菌感染的例子包括由芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、绿弧菌(Vibrio chloerae)、葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、大肠杆菌(Escherichia)、克雷伯菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、耶尔森氏菌(Yersinia)、欧文氏菌(Erwina)、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria sp)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、分枝杆菌(mycobacteria)(例如结核分枝杆菌)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的感染。例如，所述细菌感染可以是败血症或结核病。可以治疗的病毒感染的例子包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒和人类感染乳头瘤病毒(HPV)的感染。可以治疗的真菌感染的例子包括链格孢菌(Alternaria sp)、曲霉(Aspergillus sp)、念珠菌(Candidasp)和组织胞浆菌(Histoplasma sp)的感染。所述真菌感染可能是败血症或组织胞浆菌病。可以治疗的寄生虫感染的例子包括疟原虫种(例如恶性疟原虫、约氏疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫或夏伯蒂疟原虫)的感染。寄生虫感染可以是诸如疟疾、利什曼病和弓形体病的疾病。
在一些实施方式中，所述疾病/病症是一种自身免疫疾病。在一些实施方式中，所述自身免疫疾病选自：糖尿病型1型、乳糜泻、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、炎症性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
本发明的制剂优选以“治疗有效”或“预防有效”的量施用，这足以显示出对受试者的治疗或预防益处。实际施用的量以及施用的速率和时程将取决于疾病/病症的性质和严重程度以及所施用的特定制品。治疗处方(例如剂量等的决定)由全科医生和其他医生负责，并且通常考虑待治疗的疾病/病症、个体受试者的状况、给药部位、给药方法和其他从业者已知的因素。上述技术和方案的示例可以在2000年由利平科特，威廉&威尔金斯出版社出版的《雷明顿药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第20版)中找到。
给药可以是单独的，也可以是与其他治疗方法联合使用的，可以同时或相继给药，这取决于待治疗的疾病。本文所述的抗原结合分子或组合物和治疗剂可以同时或依次施用。
同时给药是指将本发明的制品和另一治疗剂一起给药，例如作为含有两种药物的药物组合物(联合制剂)，或紧接着彼此并任选地通过相同的给药途径，例如同一条动脉、静脉或其他血管。顺序给药是指一种药物给药后在给定时间间隔后施用另一种药物。不需要通过相同的途径来施用两种药剂，尽管在某些实施方式中是这种情况。所述时间间隔可以是任何时间间隔。
化学疗法和放射疗法分别是指使用药物或电离辐射治疗癌症(例如，使用X射线或γ射线进行放射治疗)。所述药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、适配体、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白质。所述药物可以配制成药物组合物或药剂。所述制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性制剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体。
一种治疗可能涉及一种以上药物的给药。药物可以单独或与其他治疗组合地给药，也可以根据待治疗的病症同时或依次给药。例如，化学疗法可以是涉及两种药物给药的联合疗法，其中的一种或多种可以旨在治疗癌症。
所述化学疗法可以通过一种或多种给药途径给药，例如肠胃外、静脉内注射、口服、皮下、皮内或瘤内。
所述化学疗法可以根据治疗方案进行。所述治疗方案可以是化学疗法施用的预定时间表、计划、方案或计划表，其可以由医师或医学从业者准备并且可以定制以适合需要治疗的患者。所述治疗方案可以表示以下一种或多种：向患者施用的化学疗法的类型；每种药物或放射的剂量；给药之间的时间间隔；每次治疗的时间；任何治疗假期的数量和性质(如果有的话)。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，并指明每种药物的给药方式。
化疗药物可以选自：阿比昔步、醋酸阿比特龙，阿比特赛(甲氨蝶呤)、阿伯克森(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼、AC-T、阿克里斯(维布妥昔单抗注射液)、ADE、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿霉素(盐酸阿霉素)、双马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、阿凯泽(奈妥吡坦和帕洛诺司琼盐酸盐)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、艾乐沙(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、阿利巴(盐酸帕潘立布)、注射用爱克兰(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、阿洛西(盐酸帕洛诺司琼)、阿仑里格(布加替尼)、安布洛星(氯胺丁)、氨苄青霉素(氯胺丁)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿雷地亚(帕米膦酸二钠)、阿利米得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、阿拉农(奈拉滨)、三氧化二砷、阿泽拉(奥法木单抗)、天冬酰胺酶菊基腐病菌、阿佐里珠单抗、阿瓦斯汀(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、耶卡他、阿昔替尼、阿扎胞苷、巴文昔奥(阿维鲁单抗)、BEACOPP、贝森努(亚硝脲氮芥)、贝利达(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝彭撒(奥英妥珠单抗)、贝伐单抗、贝沙罗汀、贝克撒(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(亚硝脲氮芥)、博来霉素、博纳吐单抗、倍林妥(博纳吐单抗)、硼替佐米、博苏利夫(博舒替尼)、博舒替尼,维布妥昔单抗、布里格替尼、BuMel、白消安、白消安注射液(白消安)、卡巴他赛、卡波美(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、卡昆斯(阿卡替尼)、坎帕斯(阿仑单抗)、坎普托萨尔(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、卡拉克(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、卡铂-他克索、卡非佐米、卡莫布雷斯(卡莫斯汀)、卡莫斯汀、卡莫斯汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、头孢呋啶(盐酸柔红霉素)、塞瓦里克斯(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、氯丁苯比昔尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、氯法雷克斯(氯法拉滨)、克洛拉(氯法拉滨)、CMF、柯美替尼、可美屈(苹果酸卡博替尼)、盐酸帕潘西伯、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(放线菌素)、考特里(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、赛拉萨(雷米单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、癌得星(环磷酰胺)、达拉非尼、达卡巴嗪、达根(地西他滨)、放线菌素、达雷木单抗、兆珂(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、得非乐(去纤苷钠)、德加列里克斯、地尼白介素、地诺单抗、得颇赛(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸地雷佐生、地那妥昔单抗、多西他赛、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-多姆(达卡巴嗪)、杜鲁伐单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用药)、埃立特(拉布立酶)、表阿霉素(盐酸表柔比星)、依洛珠单抗、依洛沙汀(奥沙利铂)、艾曲泊帕、意美(阿瑞匹坦)、埃利昔地(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、乙必妥(西妥昔单抗)、甲磺酸依立普林、瑞利奇(维莫德吉)、盐酸埃洛替尼、欧文泽(天冬酰胺酶菊基腐病菌)、Ethyol(阿米磷汀)、依托磷酸(依托泊苷磷酸酯)、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、依法西酯(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、依维他命(盐酸雷洛昔芬)、依伏美拉(盐酸麦法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用药)、法乐通(托瑞米芬)、法达克(帕诺比司他)、芙仕得(氟维司汀)、FEC、弗隆(来曲唑)、菲格拉斯汀、氟达拉(氟达拉滨磷酸盐)、氟达拉滨磷酸盐、氟络合物(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部用药、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、福尔菲里、福尔菲里-贝伐单抗、福尔菲里-西妥昔单抗、福尔菲林、福尔福斯、福洛廷(对乙酰氨基甲酸酯)、FU-LV、氟维司琼、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、加济瓦(奥比努珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-西沙丁胺、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗、吉姆萨尔(盐酸吉西他滨)、吉洛特里夫(阿法替尼二马来酸酯)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、格利亚德尔(卡莫斯汀植入物)、格利亚德尔晶片(卡莫斯汀植入物)、羧肽酶、醋酸戈瑟琳酯、哈文(甲磺酸依立布林)、赫曼戈(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、HPV二价疫苗、重组、HPV九价疫苗、重组、HPV四价疫苗、重组和美新(盐酸托泊替康)、羟基脲(羟脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(帕博西尼)、伊布利他单抗、依鲁替尼、ICE、伊克鲁西格(盐酸波纳替尼)、伊达霉素(盐酸依达比星)、盐酸依达比星、伊达利西布、伊迪法(甲磺酸依西替尼)、伊菲克斯(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、异环磷酰胺(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、伊马替尼甲磺酸盐、伊布维卡(依鲁替尼)、因芬齐(杜鲁伐单抗)、咪喹莫特、利吉克(溶瘤病毒)、英利它(阿昔替尼)、依托珠单抗、干扰素Alfa-2b、重组白介素2(阿地白介素)、内含子A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西单抗和托西单抗、伊匹单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、伊斯托达克斯(罗米地辛)、伊沙贝比隆、柠檬酸依沙佐米、伊沙普拉(伊沙匹隆)、贾卡菲(磷酸鲁索替尼)、JEB、耶夫塔纳(卡巴他赛)、卡西拉(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、酮咯芬(盐酸雷洛昔芬)、开皮文斯(帕利弗明)、凯特鲁达(派姆单抗)、基斯卡利(瑞博西尼)、金里亚(提香根核)、凯泼利斯(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、拉鲁佛(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸伦伐替尼、伦维玛(甲磺酸伦伐替尼)、来曲唑、白细胞钙、勒克兰(氯丁酸)、醋酸亮丙瑞林、洛伐他汀(克拉屈滨)、勒武兰(氨基乙酰丙酸)、利福林(氯丁酸)、力普多(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、朗瑟夫(三氟吡啶和盐酸提普拉西奇)、卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、长效卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、长效卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、林帕扎(奥拉帕利布)、马其波(硫酸长春新碱脂质体)、曼图兰(盐酸卡巴嗪)、盐酸异丙草胺、醋酸孕甾酮、麦金尼斯特(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、梅斯纳、梅斯内克斯(梅斯纳)、甲唑拉酮(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴代甲基纳曲酮、梅克赛特(甲氨蝶呤)、梅克赛特-AQ(甲氨蝶呤)、甲骨膜素、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、线粒体曲霉菌素(丝裂霉素C)、MOPP、莫唑比尔(培来沙福)、芥子碱(盐酸甲氧乙胺)、突变霉素(丝裂霉素C)、米勒兰(白消安)、迈洛萨尔(阿扎胞苷)、米洛塔格(吉妥珠单抗)、纳米粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒配方)、纳维滨(酒石酸维诺瑞滨)、尼珠单抗、奈拉拉宾、尼奥萨(环磷酰胺)、马来酸、耐力士(马来酸奈拉替尼)、内匹坦特和帕洛诺司琼盐酸盐、诺拉斯塔(培格非司亭)、纽泼金(菲格拉斯汀)、蕾莎瓦(索拉非尼甲苯磺酸酯)、尼兰德龙(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、尼拉罗(柠檬酸依沙米布)、甲苯磺酸尼拉帕布一水合物、尼伏鲁单抗、诺尔维德斯(柠檬酸他莫昔芬)、纳雷特(罗米洛司汀)、奥比努妥珠单抗、奥多佐(索尼得昔)、OEPA、奥他妥单抗、OFF、奥拉帕利布、奥拉单抗、甲磺酸琥珀酸奥马西汀、恩卡斯帕(培加曲霉酶)、盐酸恩丹西酮、奥尼维德(盐酸伊立替康脂质体)、奥塔克(地尼白介素)、奥普达(尼武单抗)、OPPA、奥西替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、PAD、帕布昔利布、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和内匹坦特、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕诺比司他、派拉特(卡铂)、顺铂(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、吡非司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、佩列塔(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、铂醇(顺铂)、铂醇-AQ(顺铂)、培来沙福、泊马度胺、波马利斯特(泊马度胺)、盐酸帕那替尼、波特拉扎(尼珠单抗)、普拉曲酸、泼尼松(prednisone)、盐酸丙卡巴嗪、普罗白介素(阿地白介素)、普罗利亚(地诺单抗)、普罗马塔(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、普列威(西普赛尔)、普里涅特霍尔(巯基嘌呤)、普里克桑(巯基嘌呤)、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫昔单抗、芥酸酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、雷戈非尼、口服溴甲纳曲酮(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、瑞复美(来那度胺)、瑞马特雷(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、瑞妥生(利妥昔单抗)、瑞妥生海拉(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地辛、罗米普司汀、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、鲁巴拉卡(樟脑磺酸瑞卡帕布)、樟脑磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、里达普(米哚妥林)、司兰索胸膜内气雾剂(滑石粉)、西妥昔单抗、西普赛尔、长效索马图林(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、普赖赛尔(达沙替尼)、斯坦福特V、无菌滑石粉(滑石粉)、斯特拉泰克(滑石粉)、斯蒂瓦尔加(雷戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、萨拉特龙(PEG干扰素Alfa-2b)、西尔万特(西妥昔单抗)、三利伯(盐酸奥美他汀)、太伯洛(硫鸟嘌呤)、TAC、塔菲拉尔(达拉非尼)、塔格里索(奥西替尼)、滑石粉、塔利莫金拉帕维克、他莫昔芬柠檬酸盐、他拉滨PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(盐酸厄洛替尼)、塔格列汀(贝沙罗汀)、塔西格(尼洛替尼)、紫杉醇(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)、特森特里克(阿佐利珠单抗)、特莫达(替莫唑胺)、替莫唑胺、替莫罗莫司、沙利度胺、沙利度(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、蒂奥帕、提香根核、托拉克(氟尿嘧啶-局部用药)、盐酸托泊替康、托瑞米芬、托里赛尔(特罗罗莫司)、托西单抗和碘I 131托西单抗、托泰克(盐酸地雷佐生)、TPF、曲贝丁、曲美替尼、曲妥珠单抗、特雷安达(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷盐酸/替吡嘧啶、曲森诺克斯(三氧化二砷)、泰克布(拉帕替尼二甲苯磺酸酯)、由吐新(地昔单抗)、尿苷三乙酸酯、VAC、戊柔比星、缬沙星(戊柔比星)、万得他尼、VAMP、瓦鲁比(盐酸罗拉匹坦)、维克替比(帕尼单抗)、VeIP、维尔斑(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、维尔萨(硫酸长春碱)、维拉非尼、维耐托克(威尼托克斯)、威尼托克斯、韦尔泽尼奥(阿贝马西比)、维德尔(醋酸亮丙瑞林)、维达扎(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、文卡萨PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、长春新碱硫酸盐脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、维斯托加德(三乙酸尿苷)、伏拉沙泽(葡糖苷酶)、伏立诺他、沃曲恩(盐酸帕唑帕尼)、维克斯(盐酸达柔比星和阿糖胞苷脂质体)、维考弗林(盐酸左索夫林钙)、赛可瑞(克鲁索替尼)、希罗达(卡培他滨)、希莱里、施乐、狄诺赛麦(地诺单抗)、克索菲戈(二氯化镭223)、克斯坦迪(恩杂鲁胺)、耶佛(伊匹单抗)、耶卡他(艾克西)、翁德利斯(特拉贝丁)、扎特拉普(阿柏西普)、扎尔西奥(菲格拉斯汀)、泽朱拉(甲苯磺酸尼泊拉布一水合物)、泽尔博拉夫(维拉非尼)、泽伐林(伊布利他单抗)、新卡德(盐酸地雷佐生)、阿柏西普、佐夫兰(盐酸恩丹西酮)、诺雷德(醋酸戈塞瑞林)、唑来膦酸、佐林扎(伏立诺他)、佐美塔(唑来膦酸)、齐德利格(伊达利西布)、扎卡迪亚(色瑞替尼)和扎迪加(醋酸阿比特龙)。
在一些实施方式中，所述治疗可包括施用皮质类固醇，例如，地塞米松和/或泼尼松。
可以提供多剂量的生产的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物。一个或多个或每个剂量可以用于同时或依次施用另一种治疗剂。
多个剂量可以通过预定时间间隔分开，该预定时间间隔可选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天之一，或1、2、3、4、5或6个月。举例来说，剂量可以每7、14、21或28天(正负3、2或1天)给予一次。
受试者
根据本文所述的本发明的各方面的受试者可以是任何动物或人类。所述受试者优选是哺乳动物，更优选是人类。所述受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述受试者可以是男性或女性。所述受试者可以是患者。所述受试者可能已经被诊断出患有需要治疗的疾病或病症(例如癌症)，可能被怀疑患有这种疾病/病症，或者可能处于发展/患有这种疾病/病症的风险中。
在根据本发明的实施方式中，所述受试者优选是人类受试者。在一些实施方式中，根据本发明的治疗或预防方法的待治疗的受试者是患有癌症或处于患癌风险中的受试者。在根据本发明的实施方式中，可以基于所述疾病/病症的某些标志物的表征，根据所述方法选择受试者进行治疗。
试剂盒
在本文所述的本发明的一些方面，提供了一套多部件试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可具有至少一个容器，所述容器具有预定量的如本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于产生如本文所述的抗原结合分子、Fc区、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物的材料。
所述试剂盒可提供抗原结合分子、Fc区、多肽、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物，以及为治疗特定疾病/病症而给予患者的说明书。
在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包括至少一个容器，所述容器具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化学治疗剂)。在这样的实施方式中，所述试剂盒还可以包含第二种药物或药物组合物，使得可以同时或分别施用两种药物或药物组合物，从而提供针对特定疾病或病症的联合治疗。所述治疗剂还可以被配制成以适合于注射或输注至肿瘤或血液的形式。
序列同一性
如本文所用，“序列同一性”是指在比对序列并在必要时引入缺口以实现序列之间最大的序列同一性百分比后，实验对象序列中与参考序列中的核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸残基的百分比。为了确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的序列同一性百分比，成对和多重序列比对可以以本领域技术人员已知的多种方式来实现，例如，使用诸如ClustalOmega(
Figure BDA0003039667430000412
J.2005，Bioinformatics 21，951-960)、T-Coffee(Notredame等人，2000,J.Mol.Biol.(2000)302，205-217)、Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005，BMCBioinformatics，6(298))和MAFFT(Katoh和Standley 2013，Molecular Biology andEvolution，30(4)772–780)之类的可公开获得的计算机软件。使用此类软件时，优选使用默认参数(例如对于间隙罚分和延伸罚分)。
序列
Figure BDA0003039667430000411
Figure BDA0003039667430000421
Figure BDA0003039667430000431
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本发明包括所描述的各方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这种组合。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
现在将通过示例的方式，参照附图说明本发明的方面和实施方式。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施方式将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
在整个说明书中，包括所附的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。在本文中范围可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将被理解为该特定值形成另一实施方式。
在本文公开了核酸序列的情况下，也明确考虑了其反向互补。
本文所述的方法可优选体外进行。术语“体外”旨在涵盖用培养中的细胞进行的程序，而术语“体内”旨在涵盖用/在完整的多细胞生物上进行的程序。
附图简要说明
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验。
图1A至1E.图表显示了原始数据的一阶导数，该原始数据是通过差示扫描荧光法分析包含不同Fc区的抗原结合分子的热稳定性获得的。(1A)显示了WT Fc和LCKC Fc的数据，(1B)显示了GASD Fc和GASD_LCKC Fc的数据，(1C)显示了GASDIE Fc和GASDIE_LCKC Fc的数据，(1D)显示了GASDALIE Fc和GASDALIE_LCKC Fc的数据，(1E)显示了EKEG Fc和EKEG_LCKC Fc的数据。
图2A和2B.表格和条形图总结了图1A至1E所示的数据。(2A)总结了所有分子的数据。(2B)提供了图表表示LCKC Fc(LCKC)、GASDIE_LCKC Fc(GASDIE-LCKC)和GASDIE Fc(GARDIE)形式抗原结合分子相对于WT Fc(WT IgG1)的Tm改变(以℃)。
图3A至3J.传感图显示了包含不同的Fc区的抗原结合分子与人FcγRIIIA-158V的结合。(3A)显示了WT Fc的数据，(3B)显示了GASD Fc的数据，(3C)显示了GASDIE Fc的数据，(3D)显示了LCKC Fc的数据，(3E)显示了GASD_LCKC Fc的数据，(3F)显示了GASDIE_LCKC Fc的数据，(3G)显示了GASDALIE Fc的数据，(3H)显示了EKEG Fc的数据，(3I)显示了GASDALIE_LCKC Fc的数据，以及(3J)显示了EKEG_LCKC Fc的数据。
图4.表格总结了图3A至3J所示的数据。
图5A至5J.传感图显示了包含不同的Fc区的抗原结合分子与人Fcγ受体的结合。(5A)显示了WT Fc与hFcγRIIIa-158F结合的数据，(5B)显示了WT Fc与hFcγRIIIa-158V结合的数据，(5C)显示了WT Fc与hFcγRIIa-167H结合的数据，(5D)显示了GASDALIE_LCKC Fc与hFcγRIIIa-158F结合的数据，(5E)显示了GASDALIE_LCKC Fc与hFcγRIIIa-158V结合的数据，(5F)显示了GASDALIE_LCKC Fc与hFcγRIIa-167H结合的数据，(5G)显示了WT Fc与hFcγRIIa-167R结合的数据，(5H)表示了WT Fc与hFcγRIIb结合的数据，(5I)显示了GASDALIE_LCKC Fc与hFcγRIIa-167R结合的数据，以及(5J)显示了GASDALIE_LCKC Fc与hFcγRIIb结合的数据。
图6A至6F.传感图显示了包含不同的Fc区的抗原结合分子与小鼠Fcγ受体的结合。(6A)显示了WT Fc与mFcγRIV结合的数据，(6B)显示了WT Fc与mFcγRIII结合的数据，(6C)显示了WT Fc与mFcγRIIb结合的数据，(6D)显示了GASDALIE_LCKC Fc与mFcγRIV结合的数据，(6E)显示了GASDALIE_LCKC Fc与mFCγRIII结合的数据，以及(6F)显示了GASDALIE_LCKC Fc与mFcγRIIb结合的数据。
图7A至7D.传感图显示了包含不同Fc区的抗原结合分子与人(h)和小鼠(m)FcRn受体的结合。(7A)显示了WT Fc与hFcRn结合的数据，(7B)显示了WT Fc与mFcRn结合的数据，(7C)显示了GASDALIE_LCKC Fc与hFcRn结合的数据，(7D)显示了GASDALIE_LCKC Fc与mFcRn结合的数据。
图8.表格总结了图5A至5J、6A至6F和7A至7D所示的数据。
图9A和9B.图表和条形图显示了由包含不同Fc区的抗原结合分子介导的靶向抗原表达的细胞的ADCC，通过LDH释放测定法测定。(9A)显示了WT Fc或GASDALIE_LCKC Fc区靶向抗原表达细胞的ADCC活性。显示了EC50值。(9B)显示了WT Fc、GASDALIE_LCKC Fc区或N297Q Fc靶向抗原表达细胞的相对ADCC活性。
图10.图表显示了显示A549细胞系衍生小鼠肺腺癌模型中肿瘤体积随时间变化的分析结果。包含WT Fc或GASDALIE_LCKC Fc的抗原结合分子通过静脉注射施用，25mg/kg每两周1次，共6周。对照处理组接受相同体积的PBS(溶媒)。
实施例
实施例1：制备包含工程化的Fc区的抗原结合分子
本发明人制备了包含重链的抗原结合分子，其在CH2和/或CH3区中的位置包括氨基酸取代，以研究取代对Fc效应功能的结果。
制备抗原结合分子，其包括：(i)包含对HER3特异的抗体的轻链可变区(VL)和恒定区轻链(Cκ)的轻链，和(ii)包含对HER3特异的抗体的重链可变区(VH)和人免疫球蛋白G1(G1m3同种异型)重链恒定区1(CH1)，铰链区，重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。
CH2和CH3区要么未被取代，要么具有如下取代组合：
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按照制造商的说明，使用1)Expi293瞬时表达系统试剂盒(美国生命技术公司)，或2)HEK293-6E瞬时表达系统(CNRC-NRC，加拿大)表达抗原结合分子。
1)Expi293瞬时表达系统：
细胞系维护：
HEK293F细胞(Expi293F)获自生命技术公司(美国)。在无血清、无蛋白质、化学成分确定的培养基(Expi293表达培养基，赛默飞世尔，美国)中，并添加50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco，美国)，在带有振动平台的8％CO2和80％加湿培养箱中，37℃培养细胞。
转染：
按照其制造商的方案，使用ExpiFectamine 293试剂盒(Gibco，美国)，用编码重链和轻链的表达质粒转染Expi293F细胞。简而言之，对维持状态的细胞通过快速离心(spindown)培养物进行培养基更换以去除抗生素，然后在转染前1天将细胞沉淀重悬于没有抗生素的新鲜培养基中。每次转染，在转染当天将2.5×106/ml的活细胞接种在摇瓶中。在减少血清的培养基Opti-MEM(Gibco，美国)中于室温孵育25分钟形成DNA-ExpiFectamine复合物，然后将其加入到细胞中。在转染后16-18小时将增强子加入到转染的细胞中。在转染后第4天，将等量的培养基添加至转染子，以防止细胞聚集。在第7天通过4000x g离心15分钟收获转染子，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
2)HEK293-6E瞬时表达系统：
细胞系维护：
HEK293-6E细胞获自加拿大国家研究委员会。在无血清、无蛋白质、化学成分明确的Freestyle F17培养基(英杰公司，美国)中，并添加0.1％Kolliphor-P188和4mM L-谷氨酰胺(Gibco，美国)和25μg/ml G-418，在带有振荡平台的5％CO2和80％湿润培养箱中37℃培养细胞。
转染：
按照其制造商的方案，使用PEIproTM(Polyplus，美国)，用编码重链和轻链的表达质粒转染HEK293-6E细胞。简而言之，将维持状态下的细胞通过离心进行培养基更换以去除抗生素，在转染前1天将细胞沉淀用不含抗生素的新鲜培养基重悬。每次转染在转染当天将1.5-2×106/ml的活细胞接种在摇瓶中。将DNA和PEIproTM以1：1的比例混合，然后在F17培养基中于室温孵育5分钟形成复合物，然后加入到细胞中。在转染后24-48小时将0.5％(w/v)的胰蛋白N1加入转染子。在第6-7天通过4000x g离心15分钟收获转染子，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
亲和纯化，缓冲液交换和存储：
使用液相色谱系统AKTA Start(GE保健公司，英国)纯化由转染细胞分泌到培养上清液中的抗原结合分子。具体地说，将上清液以5ml/min的结合速率加载到HiTrap ProteinG色谱柱(GE Healthcare，英国)上，然后用10倍柱体积的洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)洗涤。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗脱结合的单克隆抗体，并将洗脱液分馏至装有适量的中和缓冲液(1M Tris，pH 9)的收集管中。使用30K MWCO蛋白浓缩器(赛默飞世尔，美国)或3.5K MWCO透析盒(赛默飞世尔，美国)将含有纯化的单克隆抗体的中和洗脱缓冲液交换为PBS。通过0.22μm过滤器对单克隆抗体进行灭菌，将其等分并在-80℃速冻保存。
实施例2：通过差示扫描荧光法对包含工程化Fc区的抗原结合分子的热稳定性分 析
通过差示扫描荧光法评估如实施例1中所述制备的抗原结合分子的热稳定性。
简而言之，在25μlPBS中制备0.2mg/ml的抗体和Sypro橙色染料(赛默飞世尔)的反应混合物，一式三份，转移到MicroAmp光学96孔反应板(赛默飞世尔)的孔中，并用MicroAmp光学粘合膜密封(赛默飞世尔)。熔解曲线在7500快速实时PCR系统(应用生物系统)中运行，选择TAMRA作为报告基因，ROX作为参比荧光。热曲线包括在25℃下2分钟的初始步骤和在99℃下2分钟的最终步骤，其升温速率为1.2％。将原始数据的一阶导数绘制为温度的函数，以获得导数熔解曲线。
从导数曲线的峰中确定重链解配对的解链温度(Tm)。
结果显示在图1A至1E中。
还测定了抗原结合分子Fab区中的轻链与重链解配对的Tm值。
差示扫描荧光法实验的结果总结在图2A所示的表中。
LCKC取代的引入稳定了所测试的所有工程化变体的Fc区(即GASD、GASDIE、GASDALIE、EKEG)，但未稳定WT Fc区。LCKC增加工程化Fc变体的Tm在9.9℃和23.2℃之间。LCKC将WT Fc的Tm降低8.5℃。
缺乏LCKC取代的工程化FC变体的热稳定性的等级顺序如下：WT(69.7℃)>GASD(63.6℃)>EKEG(60.3℃)>GASDALIE(48.1℃)≈GASDIE(40.0℃)。
包含LCKC取代的工程化Fc变体的热稳定性的等级顺序如下：GASD_LCKC(75.9℃)>EKEG_LCKC(70.2℃)>GASDALIE_LCKC(63.3℃)≈GASDIE_LCKC(63.2℃)>WT_LCKC(61.2℃)。
具有相对于Fc WT的LCKC取代的工程化Fc变体的热稳定性的变化如下：GASD_LCKC(+6.2℃)>EKEG_LCKC(+0.5℃)>GASDALIE_LCKC(-6.4℃)≈GASDIE_LCKC(-6.5℃)。
LCKC取代的引入不会显著影响Fab区的热稳定性。
实施例3：对含有针对人Fc受体FcγRIIIA-158V的工程化Fc区的抗原结合分子的 亲和力分析
使用Pall ForteBio Octet Red384系统通过生物层干涉法(BLI)，评估如实施例1中所述制备的抗原结合分子与人Fc受体FcγRIIa结合。
抗五-his(His1k)生物传感器购自Forte Bio(18-5120)，并在PBS缓冲液(pH7.2)中孵育60秒，以获得第一个基线，随后在PBS pH 7.2中用有组氨酸标签的人FcγRIIIa-158V上样120秒。上样后，在PBS缓冲液(pH7.2)中孵育生物传感器60秒以获得第二个基线，然后在pH 7.2的PBS中用稀释的系列测试抗原结合分子(以15.6nM至500nM范围的浓度)孵育60秒，以获得缔合曲线。最后，将生物传感器在PBS pH 7.2中孵育120秒，以获得解离曲线。
通过将缔合和解离数据与1：1结合模型进行整体拟合来计算动力学常数和亲和常数。
结果显示于图3A至3J中，并且总结在图4所示的表中。
与WT Fc相比，GASD、GASDIE、GASDALIE和EKEG Fc变体显示出对人FcγRIIIA-158V增加的结合亲和力。
亲和力的等级顺序如下：GASDALIE≈GASDIE>GASD≈EKEG>WT。
所观察到的工程化Fc变体的结合亲和力的增加似乎主要是由于解离动力学的降低。
LCKC取代的引入没有显著改变WT Fc或GASD、GASDIE、GASDALIE和EKE Fc变体对人FCγRIIIa-158V的结合亲和力。
亲和力的等级顺序与缺乏LCKC取代的分子相同(即GASDALIE_LCKC≈GASDIE_LCKC>GASD_LCKC≈EKEG_LCKC>WT_LCKC)。
实施例4：对含有针对人和小鼠Fc受体的工程化Fc区的抗原结合分子的亲和力分 析
使用Pall ForteBio Octet Red384系统通过生物层干涉法(BLI)分析实施例1中所述制备的抗原结合分子WT和GASDALIE_LCKC用于结合：
·人Fc受体：hFcγRIIIa-158F、hFcγRIIIa-158V、hFcγRIIa-167H、hFcγRIIa-167R、hFcγRIIb和hFcRn；和
·小鼠Fc受体：mFcγRIV(hFcγRIIIa的同系物)，mFcγRIII(hFcγRIIa的同系物)，mFcγRIIb(hFcγRIIb的同系物)和mFcRn。
将抗五-HIS(HIS1K)生物传感器在PBS缓冲液中孵育60秒以获得第一个基线，随后用PBS中的组氨酸标签的Fc受体上样120秒。上样后，将生物传感器在PBS缓冲液(对于Fcγ受体为pH 7.2，和对于FcRn为pH 5.8)中孵育60秒，以获得第二基线，然后在PBS(对于Fcγ受体为pH 7.2，和对于FcRn为pH 5.8)中用稀释的系列测试抗原结合分子(以125nm至4000nm(研究与Fcγ受体的结合的实验)，或75nm至1000nm(研究与FcRn受体的实验)的浓度范围)孵育60秒，以获得缔合曲线。最后，将生物传感器在PBS(对于mFcγR为pH 7.2，对于mFcRn为pH 5.8)中孵育120秒，以获得解离曲线。
PBS pH 7.2用于研究与Fcγ受体结合的实验，并且PBS pH 5.8用于研究与FcRn受体结合的实验。
通过将缔合和解离数据与1：1结合模型进行整体拟合来计算动力学常数和亲和常数。
结果显示于图5A至5J，图6A至6F，7A至7D中，并且总结在图8所示的表中。
GASDALIE_LCKC变体Fc相对于WT Fc显示出与激活性Fcγ受体和FcRn受体增加的亲和力：hFcγRIIIa-158F、hFcγRIIIa-158V、hFcγRIIa-167H和hFcγRIIa-167R、hFcRn、mFcγRIV和mFcRn。
GASDALIE_LCKC变体Fc相对于WT Fc显示对抑制性Fcγ受体hFcγRIIb的亲和力降低。
对于与mFcγRIII和mFcγRIIb结合的亲和力，GASDALIE_LCKC变体Fc相对于WT Fc没有显著不同的差异。
总的来说，与人抑制性Fcγ受体相比，GASDALIE_LCKC变体Fc显示对人和小鼠激活性Fcγ受体和FcRn的亲和力增加，以及对人激活性Fcγ受体的选择性增加。
实施例5：包含工程化Fc区的抗原结合分子的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)分析
在体外试验中，分析如实施例1所述制备的抗原结合分子WT和GASDALIE_LCKC对表达靶抗原(HER3)的细胞产生ADCC的能力。
用编码人HER3的构建体稳定转染的HEK 293 T细胞被用作测定中的靶细胞(使用HER3特异性抗体通过流式细胞术通过分析来证实细胞表面的靶细胞)。
简而言之，将靶细胞以20000个细胞/孔的密度接种于96孔U-底板的孔中。将细胞与终浓度范围为50000ng/ml至0.18ng/ml(50000ng/ml、8333ng/ml、1389ng/ml、231ng/ml、38.6ng/ml、6.4ng/ml、1.1ng/ml和0.18ng/ml)的系列稀释的WT或GASDALIE_LCKC抗原结合分子一起孵育，或不做处理。将细胞在37℃下，5％CO2中孵育30分钟。
随后将效应细胞(人自然杀伤细胞系NoGFPCD16.NK92；176V)以60000个细胞/孔的密度加入到孔中(即效应细胞：靶细胞比为3：1)。
包括以下对照条件：靶细胞最大LDH释放(仅含有靶细胞)，自发释放(在没有抗原结合分子的情况下，含有靶细胞和效应细胞)和背景(仅细胞培养基)。
快速离心平板并在37℃和5％CO2下孵育21小时。
使用Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒进行LDH释放测定。向靶细胞最大LDH释放对照孔中加入10μl裂解缓冲液(10x)，并在37℃和5％CO2下孵育20分钟。孵育后，将平板快速离心，将50ml上清液转移以清理平底96孔板。通过加入50μl含有LDH底物的测定混合物至上清液中以开始反应，并在37℃下孵育30分钟。通过加入50μl终止液停止反应，使用BiotekSynergy HT酶标仪记录490nm和680nm处的吸光度。
将测试样品的吸光度校正为背景和自发释放对照条件下获得的值，计算相对于靶细胞最大LDH释放控制的细胞毒性百分比，并绘制为抗体浓度的函数。计算EC50值(ng/ml)。
结果如图9A和9B所示。包含WT Fc和GASDALIE_LCKC Fc的抗原结合分子引发表达靶抗原的细胞产生浓度依赖性ADCC。
与包含WT Fc的抗原结合分子相比，包含GASDALIE_LCKC Fc的抗原结合分子具有增加的最大细胞毒性，并且相对于WT，EC50降低了6倍(图9B)。
实施例6：包含工程化Fc区的抗原结合分子的体内肿瘤生长抑制分析
大约6-8周龄的雌性NCr裸鼠购自Invivos(新加坡)。将动物圈养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
通过右侧皮下注射5×106A549细胞(表达HER3的肺癌细胞)来建立异位肿瘤。小鼠每两周一次静脉注射给药25mg/kg包含WT-Fc的抗原结合分子(n＝6)，或包含GASDALIE_LCKC取代(n＝6)的抗原结合分子(n＝6)，共6周。对照处理组接受同等体积的PBS(溶媒；n＝8)。
使用数字卡尺每周测量3次肿瘤体积，并使用公式[L×W2/2]计算。一旦对照组的肿瘤长度>1.5cm，就认为已达到研究终点。
结果如图10所示。发现包含GASDALIE_LCKC取代的抗原结合分子在抑制肿瘤生长上比包含WT-Fc的抗原结合分子更显著得有效。
实施例7：引入GASDALIE_LCKC取代的可能序列倾向(liabilities)/免疫原性序列 分析
本发明人接下来研究了将GASDALIE_LCKC取代引入人源化IgG1抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)是否影响与抗体产生相关的性质，或在治疗中的用途。
发明人通过对曲妥珠单抗组成多肽的氨基酸序列以及包含GASDALIE_LCKC取代的曲妥珠单抗进行电子分析，研究了GASDALIE_LCKC取代预测是否会影响N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖基化、天冬酰胺(Asn)脱酰胺、溶解度和免疫原性。
在曲妥珠单抗的Fc区引入GASDALIE_LCKC取代预计不会影响N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖基化、天冬酰胺脱酰胺，也不会引入任何免疫原性肽，并且预计会导致溶解度增加2％。
实施例8：结论
相对于WT Fc，包含GASDALIE_LCKC Fc的抗原结合分子被证明具有以下有利性质的组合：
(i)对激活性Fcγ受体的亲和力增加(与人FcγRIIIa激活性受体的结合增加>12倍，与鼠FcγRIV激活性受体的结合相似)；
(ii)对新生儿Fc受体FcRn的亲和力增加；
(iii)对抑制性Fcγ受体的亲和力降低；
(iv)对激活性Fcγ受体相对于抑制Fcγ受体的选择性增加；
(v)相似的热稳定性；
(vi)增加的体外ADCC活性(增加6倍)；
(vii)改善体内肿瘤生长抑制；
(viii)没有额外的序列倾向/免疫原性。
序列表
<110> 蜂鸟生物科技控股私人有限公司 (所有指定国)
R·克莱格 I （仅针对莱索托）
<120> 工程化的Fc
<130> 007565849
<150> GB 1817354.2
<151> 2018-10-25
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人IgG1 G1m1同种异型恒定区(IGHG1; UniProt:P01857-1, v1)
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH1 IgG1 (P01857-1，v1的1-98位)
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链IgG1 (P01857-1，v1的99-110位)
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2 IgG1 (P01857-1，v1的111-223位)
<400> 4
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH3 IgG1 (P01857-1, v1的224-330位)
<400> 5
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 6
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3 IgG1
<400> 6
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Cκ CL (IGCK; UniProt: P01834-1, v2)
<400> 7
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_GASD
<400> 8
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_GASDIE
<400> 9
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_GASDALIE
<400> 10
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_LCKC
<400> 11
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_GASDLCKC
<400> 12
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_GASDIELCKC
<400> 13
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2_GASDALIELCKC
<400> 14
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH3_EKEG
<400> 15
Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 16
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASD
<400> 16
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 17
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDIE
<400> 17
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 18
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDALIE
<400> 18
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 19
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_LCKC
<400> 19
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 20
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDLCKC
<400> 20
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 21
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDIELCKC
<400> 21
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 22
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDALIELCKC
<400> 22
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 23
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_EKEG
<400> 23
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_LCKCEKEG
<400> 24
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 小鼠IGγ-2A链C区，A等位基因 (UniProt:P01863-1, v1)
<400> 25
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G4S 接头
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)3 接头
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> 人IgG1恒定区（G1m3同种异型）
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH1 IgG1 (G1m3)
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH3 IgG1 (G1m3)
<400> 30
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 31
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3 (G1m3)
<400> 31
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH3_EKEG (G1m3)
<400> 32
Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 33
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASD (G1m3)
<400> 33
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 34
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDIE (G1m3)
<400> 34
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 35
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDALIE (G1m3)
<400> 35
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 36
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_LCKC (G1m3)
<400> 36
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 37
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDLCKC (G1m3)
<400> 37
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 38
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDIELCKC (G1m3)
<400> 38
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 39
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_GASDALIELCKC (G1m3)
<400> 39
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 40
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_EKEG (G1m3)
<400> 40
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 41
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2-CH3_LCKCEKEG (G1m3)
<400> 41
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Cys Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220

Claims (24)

1.一种任选分离的包含Fc区的抗原结合分子，所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，和(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，对应于第330位处的L，对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，和对应于第330位处的L；或对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，和对应于第332位处的E；或对应于第236位处的A和对应于第239位处的D；或对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，对应于第332位处的E，和对应于第330位处的L。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A，对应于第239位处的D，和对应于第332位处的E。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第236位处的A和对应于第239位处的D。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包含多肽，其具有：(i)对应于第242位处的C，和对应于第334位处的C，以及(ii)对应于第345位处的K，和对应于第430位处的G。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包含含有氨基酸序列与SEQ ID NO：39、38、37、41、22、21、20或24具有至少60％序列同一性的多肽。
8.一种任选分离的多肽，其包含：与SEQ ID NO：31或6具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6的特定位置处编号的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，和(ii)在第9位的A，在第12位的D，在第103位的L，在第105位的E，在第118位的K，和在第203位的G中的一个或多个。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6的特定位置处编号的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，在第103位的L，和在第105位的E；或在第9位的A，在第12位的D，和在第105位的E；或在第9位的A，和在第12位的D；或在第118位的K，和在第203位的G。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6的特定位置处编号的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，在第103位的L，和在第105位的E。
11.根据权利要求8或权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6的指定位置处编号的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，在第12位的D，和在第105位的E。
12.根据权利要求8或权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6的特定位置处编号的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第9位的A，和在第12位的D。
13.根据权利要求8或权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:31或6的特定位置处编号的下列氨基酸残基：(i)在第15位的C，和在第107位的C，以及(ii)在第118位的K，和在第203位的G。
14.一种任选分离的多肽，其包含SEQ ID NO：39、38、37、41、22、21、20或24的氨基酸序列。
15.一种任选分离的Fc区，其包含根据权利要求8至14中任一项所述的多肽。
16.一种任选分离的抗原结合分子，其包含根据权利要求7至13中任一项所述的多肽，或根据权利要求14所述的Fc区。
17.一种或多种任选分离的核酸，其编码根据权利要求1至7或16中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求8至14任一项所述的多肽，或根据权利要求15所述的Fc区。
18.一种或多种表达载体，其包含根据权利要求17所述的一种或多种核酸。
19.一种细胞，其包含根据权利要求1至7或16中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求8至14中任一项所述的多肽，根据权利要求15所述的Fc区，根据权利要求17所述的一种或多种核酸，或根据权利要求18所述的一种或多种表达载体。
20.一种方法，其包含在适合表达来自于一种或多种核酸或一种或多种表达载体的抗原结合分子、多肽或Fc区的条件下，培养包含根据权利要求17所述的一种或多种核酸，或根据权利要求18所述的一种或多种表达载体的细胞。
21.一种组合物，其包含根据权利要求1至7或16中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求8至14中任一项所述的多肽，根据权利要求15所述的Fc区，根据权利要求17所述的一种或多种核酸，根据权利要求18所述的一种或多种表达载体，或根据权利要求19所述的细胞。
22.根据权利要求1至7或16中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求8至14中任一项所述的多肽，根据权利要求15所述的Fc区，根据权利要求17所述的一种或多种核酸，根据权利要求18所述的一种或多种表达载体，根据权利要求19所述的细胞，或根据权利要求21所述的组合物，其用于医学治疗或预防的方法。
23.根据权利要求1至7或16中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求8至14中任一项所述的多肽，根据权利要求15所述的Fc区，根据权利要求17所述的一种或多种核酸，根据权利要求18所述的一种或多种表达载体，根据权利要求19所述的细胞，或根据权利要求21所述的组合物，其用于治疗或预防癌症、感染性疾病或自身免疫疾病的方法。
24.一种方法，任选地是杀伤表达靶抗原的细胞的体外方法，包括将表达靶抗原的细胞与根据权利要求1至7或16中任一项所述的抗原结合分子，根据权利要求8至14中任一项所述的多肽，根据权利要求15所述的Fc区，根据权利要求19所述的细胞，或根据权利要求21所述的组合物接触。
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