CN109879962B - 抗tnf单链抗体、抗il-6单链抗体及其融合蛋白及其应用 - Google Patents
抗tnf单链抗体、抗il-6单链抗体及其融合蛋白及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤坏死因子和抗白介素6的单链抗体及其融合蛋白，所述融合蛋白既具有抗体的特异性识别作用，同时这种识别性又可以被特异性受体阻断，利用人角质形成细胞系HaCaT评价该双特异抗体的抗银屑病可能，结果显示本发明公开的抗肿瘤坏死因子抗体和抗白介素6抗体以及它们组成的双特异抗体均能使该细胞系的CXCL1和IL8的表达量降低。所述融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本，具有广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明公开了一种抗TNF单链抗体、抗白介素6单链抗体及其融合蛋白及其应用，属于免疫学和分子生物学领域。
背景技术
炎症尤其是慢性炎症对机体有着巨大的损害，炎症部位长时间释放大量细胞因子和炎症介质，不仅引起局部组织器官病变，使患者产生痛苦，而且长时间的炎症更容易导致肿瘤发生。在炎症中较为常见的两种细胞因子为肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，针对这两个因子研发的抗体药物也已经上市，如治疗类风湿性关节炎的阿达木单抗。
TNF主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生。1985年Shalaby把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)命名为TNF-β。虽然TNF-α与TNF-β仅有约30％的同源性，但它们却拥有共同的受体。TNFα的生物学活性占TNF总活性的70％～95％，因此目前常说的TNF多指TNF-α。
白细胞介素-6(Interleukelin-6,IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子,也是机体复杂的细胞因子网络中的关键因子,它可以调节其他细胞因子的作用,在发生炎症、坏死或由于肿瘤细胞抗原刺激免疫细胞分泌IL-6增高等情况下,血清中IL-6增加，过量表达IL-6往往与某些疾病相关(Keto等,1997)。由于IL-6所具有的广泛的生物学活性和潜在的临床应用前景,受到广泛关注,从发现至今国内外学者对其结构、生物学特性、作用机制及临床应用等做了大量研究。
单核巨噬细胞是免疫系统的第一道防线，能独立鉴定抗原并提供信息传递，从而诱发免疫反应，在这些过程中释放一系列单核因子包括肿瘤坏死因子(TNFa)、白细胞介素一6(IL－VI)、白细胞介素－1(IL-I)等，亦称前炎性细胞因子。
抗体药物已作为炎症患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。
目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(Antibody conjugate complex，ADC)，另一种是双特异抗体。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，ADCs由一个抗体或一个抗体片段ScFv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。
小分子抗体片段的另外一个应用方面是双特异抗体。双特异性抗体(BsAbs)就是可以识别两个不同表位的抗体。相比正常抗体，BsAbs在癌症治疗中有一些无法比拟的优势：1.BsAbs可增强特异性免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。2.BsAbs可以同时作用于两种不同的通路，发挥独特或加倍的抗肿瘤作用。3.BsAbs可识别靶细胞表面两个抗原表位，增强结合能力。
最新的肿瘤生物治疗方法CAR-T是目前认为最有效的肿瘤治疗手段。但是这种方法如果运用不当会出现一种非常严重的副反应细胞因子风暴，这种症状还可以出现在外伤、感染等多种疾病中。细胞因子风暴(cytokine storm)是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭的重要原因。如果能在细胞因子大量升高初期及时阻断这些因子的生物学功能，就可减轻对机体的损伤。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的目的是研发出一种具有双重识别功能的特异性单链抗体，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强了的抗炎症作用的双特异抗体。
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗肿瘤坏死因子的单链抗体，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。
在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。
在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
其次，本发明还提供了另一种抗IL6的单链抗体。所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。
在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。
在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明还提供抗肿瘤坏死因子和抗白介素6的双特异单链抗体融合蛋白。作为优选，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
在一个最为优选的技术方案中，所述双特异单链抗体的连接顺序为抗肿瘤坏死因子单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗白介素6单链抗体的轻链可变区和重链可变区。
最后，本发明提供了上述双特异抗体在制备抗炎或治疗银屑病药物中的应用。
本发明选取具有确定性炎症因子的肿瘤坏死因子TNFa和白细胞介素6IL6入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗TNFa和IL6的ScFv，然后利用连接短肽linker将两种单链抗体串联起来，构建成双特异抗体。
本发明将两种特异性的单链抗体用分子生物学技术串联在一起，一端为抗肿瘤坏死因子a，另一端为抗白介素6单链抗体识别并阻断TNFa和IL6的生物学功能，利用人角质形成细胞系HaCaT评价该双特异抗体的抗银屑病可能，结果显示本发明公开的抗肿瘤坏死因子抗体和抗白介素6抗体以及它们组成的双特异抗体均能使该细胞系的CXCL1和IL8的表达量降低。该双特异抗体对Th1占主导的炎性皮肤病的治疗机制可能均与其抑制角质形成细胞分泌CXCL1和IL8有关,从而减少Th1细胞进入皮肤,减轻炎性反应。
本发明独特的发明构思在于将两种单链抗体串联成双特异识别抗体，不仅能拓宽了抗炎方式，而且还增强了的抗炎作用。在结合试验中，两种单链抗体均与各自的蛋白具有较高水平的亲和力，而且单链抗体与靶蛋白的结合均可以被它们相应的配体阻断。而且由于本发明选用的是抗体小分子片段，该双特异性抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。
附图说明
图1.VH和VL PCR产物鉴定图；
图2.载体图谱和重组载体鉴定图；
图3.TNFa-IL6双特异抗体聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；
图4.筛选出的抗TNFa ScFv与TNFa蛋白的结合试验；
图5.TNFR对TNFa ScFv和TNFa蛋白结合的阻断试验；
图6.筛选出的抗IL6 ScFv与IL6蛋白的结合试验；
图7.IL6R对IL6 ScFv和IL6蛋白结合的阻断试验；
图8.TNFa-IL6双特异抗体抑制人角质形成细胞系HaCaT分泌CXCL1和IL8。
A-B：IL6和TNFa诱导HaCaT细胞分泌CXCL1和IL8。
C-D：抗TNFa单链抗体、抗IL6单链抗体和抗TNFa-IL6双特异抗体显著抑制IL6和TNFa诱导的HaCaT细胞分泌的CXCL1和IL8水平。
具体实施方式
本发明公开了一种抗TNF单链抗体及抗白介素6单链抗体的双特异抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1抗TNFa和抗IL6双特异抗体的制备
1.1高库容量天然抗体库的建立。
分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。
1.2细胞总RNA的提取
按每5×106cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5min，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，室温孵育3min。4℃，10,000×g离心15min，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10min。4℃，12,000×g离心10min，弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5min，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无RNase的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。
1.3逆转录合成cDNA第一链
先用无RNase的DNase I处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至12μl，70℃，加热10min。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer 5μl；dNTP(10mmol/L)5μl；RNA酶抑制剂1μl,MMLV逆转录酶1μl,补加DEPC水至25μl，42℃，保温60min进行逆转录反应，70℃，15min灭活酶活性。
1.4 PCR扩增VH和VL基因
以逆转录合成cDNA第一链为模板，采用人ScFv抗体库引物扩增所表达的VH和VL基因。反应体系如下：
| cDNA第一链产物 | 1μl |
| 引物1(正向) | 1μl |
| 引物2(反向) | 1μl |
| 10×buffer | 5μl |
| 10mmol/L dNTP | 1μl |
| Pyrobest高保真酶 | 0.5μl |
加去离子水至终体积为50μl。
PCR参数：94℃变性3min后，再以94℃30sec；61℃30sec；72℃1min，进行PCR，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。
PCR产物回收
(1)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5ml离心管中。
(2)加入400μl溶胶液A，70℃溶解5分钟，至凝胶全部溶解。
(3)加入200μl溶胶液B，混均后将全部液体吸入回收柱中。
(4)12,000×g离心1分钟，弃废液。
(5)加入500μl中和液，12,000×g离心1分钟，弃废液。
(6)加入700μl洗涤液，12,000×g离心1分钟，弃废液。
重复步骤6)1次。
(7)12,000×g离心2分钟，弃废液，将回收柱移入新的接收管上，室温干燥5分钟。
(8)加入30μl去离子水，12,000×g离心1分钟，洗脱DNA片段，于-20℃保存备用。
1.5搭桥PCR法进行VH和VL的拼接
将制备的VH和VL片段作为模板，进行VH和VL片段的串联。
PCR反应体系：
| 10×PCR反应缓冲液 | 5μl |
| dNTP(2.5mM) | 2μl |
| VH PCR产物 | 1μl |
| VL PCR产物 | 1μl |
| RSC-F | 1μl |
| RSC-B | 1μl |
| Pfu DNA聚合酶 | 1μl |
| ddH2O | 39μl |
| Total | 50μl |
PCR反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟半，最后72℃延伸10分钟。重复胶回收步骤，PCR产物溶于30μl ddH2O中。图1为VH和VL PCR产物鉴定图，其中泳道1VL，泳道2VH，泳道3VH+VL串联体。
1.6连接到噬菌体载体上，
Sfi1酶切载体和PCR产物
| 10×酶切反应缓冲液 | 6μl |
| PCR产物(或载体) | 15μl |
| Sfi I | 6μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 33μl |
| 合计 | 60μl |
37℃酶切2小时，用相同的方法回收酶切片段。
连接反应
| 10×连接反应缓冲液 | 1μl |
| 酶切后PCR产物 | 7μl |
| 酶切后的载体 | 1μl |
| T4DNA连接酶 | 1μl |
| 合计 | 10μl |
上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。酶切后的片段与pComb3XSS载体片段连接，构建成重组质粒。图2为重组载体电泳鉴定图。其中，1为重组体片段pComb3XSS载体酶切图谱，2为分子量标记。
1.7转化和表达
将构建好的载体(质粒)转化(电转)到大肠杆菌内(特定的大肠杆菌)，扩增大肠杆菌并加辅助噬菌体，收集重组后的噬菌体就是噬菌体抗体库。
经检测百人天然ScFv抗体库的库容量为2*1010，完全满足抗体筛选的需要。
1.8 TNFa和IL6抗体的筛选
从抗体库中取出10ul在大肠杆菌中扩增，收集扩增后的抗体库，TNFa和IL6蛋白分别包被ELISA板后加入抗体库，孵育后冲洗非特异噬菌体，消化特异结合噬菌体，富集后将消化的噬菌体感染大肠杆菌涂板，挑取单克隆菌团并小量诱导，小量诱导后的单克隆菌上清做ELISA筛选阳性克隆，经过多次验证，选取亲和力和特异性都高(亲和力达到10-8-10- 9KD)的阳性克隆进行抗体表达。图4为筛选出的TNFa ScFv与TNFa蛋白的结合试验。图6为筛选出的IL6 ScFv与IL6蛋白的结合试验。其中OD值最高的抗TNFa ScFv7号克隆和抗IL6ScFv 5号克隆是本发明要保护的序列。图5为TNFR阻断抗TNFa ScFv与TNFa结合试验。图7为IL6阻断抗IL6 ScFv与IL6结合试验。由图可见TNFa和IL6均能有效阻断单链抗体与相应蛋白的结合，而且随着浓度的增加阻断效果也增强。说明我们专利保护的抗体序列能有效阻断TNFa和IL6与其配体的结合。
将阳性克隆中的质粒提取并转化到其他表达菌，或将抗体基因连接到其他载体再转化到相应表达菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。图3为表达的抗TNFa ScFv、抗IL6 ScFv、TNFa-IL6双特异ScFv的聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图。泳道1为抗TNFa ScFv，泳道2为抗IL6 ScFv，泳道3为空白孔，泳道4为纯化后TNFa-IL6双特异ScFv(10ug/ml)，泳道5为TNFa-IL6双特异ScFv。TNFa-IL6双特异ScFv分子量为50KD左右，而抗TNFa ScFv和抗IL6 ScFv分子量均为30KD。
大肠杆菌DH5α为本室保存，基因型为：supE44ΔlacU169
hsdR17recA1 end1 gyr96 thi-1relA1,用于质粒的扩增与转化。
大肠杆菌BL21(DE3),基因型为hsdS gal(λcIts857ind1 Sam7 nin5lacUV5-T7),用于重组蛋白质的表达。
pGEM-T Easy：用于PCR产物的克隆，购自Promega公司。
原核表达质粒载体pET30，pET42，pGEX-4t-1均为本室保存。
实施例2.双特异抗体的纯化
将两种ScFv的序列进行重新基因合成，使其按照抗肿瘤坏死因子单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗白介素6单链抗体的轻链可变区和重链可变区的顺序重新组成新的双特异抗体。抗肿瘤坏死因子的单链抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5、6和7所示。其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
抗IL6的单链抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.10、11和12所示，重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
抗肿瘤坏死因子和抗白介素6的双特异单链抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示。
以上由北京诺赛生物科技有限公司合成。
挑单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。
将上述菌液按1:100的比例接种到一个含有400ml LB(抗生素)的锥形瓶中，37℃剧烈振荡培养2h。
加入终浓度为1mmol/L IPTG，于37℃诱导表达3-4h。
收集培养液，5,000rpm离心10min，弃上清。PBS洗菌体沉淀。
用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10sec/300W/30次，每次间隔15sec的参数，超声破碎细胞。12,000rpm离心20min，收集上清。
重组蛋白质的纯化
将含有六个组氨酸标记的融合蛋白TNFa ScFv-GH-His6和IL6 ScFv-GH-His6以0.45μm滤膜过滤，准备过柱。
HisTrap kit亲和柱用Binding Buffer 10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/min。
使用Binding Buffer洗柱。
使用6ml Elution Buffer洗脱柱子。分管收集洗脱液。取少量进行SDS-PAGE鉴定，富含目的蛋白的各管于-70℃保存。
实施例3.双特异抗体抑制人角质形成细胞系HaCaT分泌CXCL1和IL8
目的:观察免疫抑制剂对人角质形成细胞系HaCaT分泌CXCL1和IL8的影响。
方法:用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗TNFa单链抗体、抗IL6单链抗体和抗TNFa-IL6双特异抗体与TNFa和IL6共同作用后培养24h的HaCaT细胞上清中的CXCL1和IL8水平。
结果见图8，无刺激条件下HaCaT细胞本身不表达CXCL1和IL8。IL6和TNFa均可诱导HaCaT细胞表达CXCL1和IL8。同时抗TNFa单链抗体、抗IL6单链抗体和抗TNFa-IL6双特异抗体均显著抑制IL6和TNFa诱导的HaCaT细胞分泌的CXCL1和IL8水平,差异有统计学意义；并且抑制作用均呈明显的剂量依赖性。
结论:抗TNFa-IL6双特异抗体对Th1占主导的炎性皮肤病的治疗机制可能均与其抑制角质形成细胞分泌CXCL1和IL8有关,从而减少Th1细胞进入皮肤,减轻炎性反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 瑞非特（北京）生物技术有限公司
<120> 抗TNF单链抗体、抗IL-6单链抗体及其融合蛋白及其应用
<130> PT20171113
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artifial
<400> 15
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> Artifial
<400> 16
Ala Arg Gly Gly Gln Trp Leu Pro Glu Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 110
<212> PRT
<213> Artifial
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gln Trp Leu Pro Glu Trp Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> Artifial
<400> 18
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 19
<211> 511
<212> PRT
<213> Artifial
<400> 19
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Tyr Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Leu Tyr Leu
20 25 30
Ala Asn Ser Val Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly
165 170 175
Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg
180 185 190
Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ala Ala Val
210 215 220
His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Thr Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Val Val Thr Gln Pro Pro
260 265 270
Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly
275 280 285
Thr Ser Gly Asp Ile Gly Gly Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
290 295 300
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Arg Asn Arg Pro Ser
305 310 315 320
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
325 330 335
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Gly Phe Tyr Tyr Cys
340 345 350
Thr Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
355 360 365
Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Gln Val Gln Leu
370 375 380
Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
385 390 395 400
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp
405 410 415
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn
420 425 430
Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Trp Val
435 440 445
Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
450 455 460
Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly
465 470 475 480
Gln Trp Leu Pro Glu Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Asp Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser
500 505 510
Claims (10)
1.一种抗肿瘤生长因子的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。
3.根据权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。
4.根据权利要求3所述的单链抗体，其特征在于，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
5.一种抗白介素6的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。
6.根据权利要求5所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。
7.根据权利要求6所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。
8.根据权利要求7所述的单链抗体，其特征在于，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示。
9.一种含有权利要求1和5所述单链抗体的融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
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| CN103059137A (zh) * | 2011-10-21 | 2013-04-24 | 神州细胞工程有限公司 | 抗hIL6R高亲和力抗体的制备及应用 |
Non-Patent Citations (2)
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| An affibody-adalimumab hybrid blocks combined IL-6 and TNF-triggered serum amyloid A secretion in vivo;F. Yu等;《mAbs》;20141231;第6卷(第6期);第1598-1607页 * |
| 人源化抗体CDP571在克罗恩病中的疗效观察;吴明瑶;《中国医院药学杂志》;20121230;第32卷(第24期);第1997-2000页 * |
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