CN114933655B - 抗cd123抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了特异性结合CD123的抗体，所述抗体包含有：如SEQ IDNo.4‑6所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.13‑15所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。本发明单克隆抗体既可用于检测表达CD123的细胞，也能够单独或与其它方法联合应用在肿瘤免疫治疗中，即能够有效运用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。
Description
分案申请
本申请是申请号为201911099300.9，申请日为2019年11月12日，发明名称为“抗CD123抗体及其应用”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及免疫学领域，更具体地，本发明涉及抗CD123抗体及其应用。
背景技术
LSCs是由Lapidot等证实存在的第一种肿瘤干细胞，它具有与正常造血干细胞相似的无限增殖和自我更新能力，大部分处于静止期，具有自我保护机制和生存于高度保护性微环境之中，能够逃脱常规化疗药物的杀伤，LSCs的持续存在被认为是白血病发生、复发、耐药的根源，有效清除LSCs已成为白血病治疗的重要目标。
AML HSCs除了具有与正常造血干细胞一致的表面抗原表型(CD34+、CD38-、CD71-、HLA-DR-)外，还有一些自身相对特异的表面抗原表型(CD90-/CD117-/CD123+)。CD123是白细胞介素3受体(interleukin-3receptor，IL-3R)α链，能特异识别并结合白细胞介素3(Interleukin-3，IL-3。IL-3主要由受到抗原刺激而被活化的辅助T细胞产生，可促进细胞的生长和增殖。它与肿瘤、过敏性炎症、自身免疫性疾病的发生有关。CD123在大多数AML患者原始白血病细胞中表达。而且AML HSCs高表达CD123，正常造血干细胞不表达或弱表达，对CD123阳性细胞群的功能进行研究发现:把CD34+/CD123+细胞亚群植入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内，可引发小鼠AML。此外，CD123弱表达在单核细胞、内皮细胞和树突状细胞。CD123已成为靶向治疗AML的重要靶点之一。
7G3为鼠源抗CD123单克隆抗体，Sun等发现7G3能与IL-3Rα链结合，抑制其与IL-3结合，从而拮抗IL-3的功能。Jin等证实7G3能够显著减少AMLLSC在NOD/SCID小鼠中的归巢，减慢小鼠体内白血病细胞增长速度，显著延长小鼠存活时间，体外实验显示7G3能通过抑制IL-3介导的细胞内信号转导杀伤CD34+CD38-LSCs，对正常骨髓细胞的影响较小。
目前临床上大部分CD123抗体药物均为7G3改造而来，如CSL360是一个由7G3衍生的IgG1重组嵌合单克隆抗体，是与放射性核素111铟与偶联而成的放射性免疫治疗剂，CSL362也是7G3的衍生物，通过抗体工程技术使它与自然杀伤细胞(naturalkil-ler，NK)表面的CD16有较强亲和力，虽然抗CD123抗体为人类最终治愈AML带来新的希望，但是目前还没有抗CD123抗体被正式应用于临床治疗。有些抗CD123抗体并没有达到预期的治疗效果，如一项由40例复发、耐药和高危AML患者参加的非盲、剂量递增的CSL360I期临床试验，结果显示虽然患者对CSL360的治疗是可耐受的，但只有2例患者对治疗有反应，其中1例患者获得完全缓解，说明CSL360对绝大多数患者无效，并不适合用于临床治疗。
因此，虽然抗CD123抗体为人类最终治愈AML带来新的希望，但目前还需要寻找一种亲和力高、特异性强，适用于临床的抗CD123的抗体。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中CD123抗体的亲和力低，特异性差的问题，提供了抗CD123抗体及其应用。
本发明提供的技术方案为：
特异性结合CD123的抗体，所述抗体包含有：
a)如SEQ ID No.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
b)如SEQ ID No.4-6所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
c)如SEQ ID No.7-9所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
本发明所述抗体均为单克隆抗体。
在本发明中，所述与其80％以上同一性的，是指本发明中所述核苷酸、氨基酸序列具有80％以上同一性。可以以合适的方式对其进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的表达水平、亲和力和/或解离性质，而这些突变后的核苷酸或氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体还包含有：
a)如SEQ ID No.10-12所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
b)如SEQ ID No.13-15所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
c)如SEQ ID No.16-18所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
上述a)、b)、c)三组重链可变区的CDR序列和三组轻链可变区的CDR序列可任意组合，其均能实现本发明的目的。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体包含如SEQ ID No.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.10-12所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域，该抗体被标记为6E11。在本发明的另一个实施方式中，所述抗体包含如SEQ IDNo.4-6所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQID No.13-15所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域，该抗体被标记为8D7。在本发明的另一个实施方式中，所述抗体包含如SEQ ID No.7-9所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.16-18所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域，该抗体被标记为12H7。
在本发明中，上述抗体为鼠源IgG1亚型，轻链均为κ链。
本发明的另一个方面，是提供了特异性结合CD123的抗原结合部分，所述抗原结合部分包含有：
a)如SEQ ID No.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
b)如SEQ ID No.4-6所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
c)如SEQ ID No.7-9所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；
其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
所述特异性结合CD123的抗原结合部分可使用本领域技术人员公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗原结合部分还包含有：
a)如SEQ ID No.10-12所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
b)如SEQ ID No.13-15所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或
c)如SEQ ID No.16-18所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
上述a)、b)、c)三组重链可变区的CDR序列和三组轻链可变区的CDR序列可任意组合，其均能实现本发明的目的。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述述抗原结合部分包含如SEQ ID No.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.10-12所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。在本发明的另一个实施方式中，所述述抗原结合部分包含如SEQ IDNo.4-6所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQID No.13-15所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。在本发明的另一个实施方式中，所述述抗原结合部分包含如SEQ ID No.7-9所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.16-18所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体包含有：
a)如SEQ ID No.19所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID No.20所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列；或
b)如SEQ ID No.21所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID No.22所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列；或
c)如SEQ ID No.23所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID No.24所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体包含有：
a)如SEQ ID No.25所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID No.26所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列；或
b)如SEQ ID No.27所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID No.28所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列；或
c)如SEQ ID No.29所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID No.30所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列。
更优选地，在本发明的实施方式中，所述抗体是由保藏编号为CGMCC18849(8D7)、CGMCC 18847(12H7)或CGMCC 18848(6E11)的细胞产生的单克隆抗体。
在本发明中，可以采用Kohler等在Nature 256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。
免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可以利用弗氏佐剂(弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂)或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1996)。
将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type Cμlture Collection，Rockville，Md.USA)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。
在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。
利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A 琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来，进而得到所述单克隆抗体。
本发明的另一个方面，是提供了一种分离的细胞，所述细胞包含有上述抗体，或上述抗原结合部分；
所述细胞为选自SP2/0、YB2/0、IR983F、人骨髓瘤Namalwa、PERC6或CHO细胞系。
本发明的另一个方面，是提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述抗体，或上述抗原结合部分。
进一步地，本发明的多核苷酸序列可以以合适的方法插入到任意合适的表达载体中，例如，细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的另一个方面，是提供了上述抗体，或上述抗原结合部分，或上述细胞在制备检测或治疗肿瘤的产品中的用途。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤优选为血液肿瘤，更优选为非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T型急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓细胞白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)或慢性骨髓细胞白血病(CML)。
上述肿瘤还可以包括、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
上述检测肿瘤的产品可以为检测样本中CD123含量的试剂、试剂盒或细胞培养板。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述抗体，或上述抗原结合部分，或上述细胞，或上述多核苷酸，以及药学上可接受的载体。
上述药物组合物可以为口服剂或注射剂。
本发明的另一个方面，是提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
a)上述抗体，或上述抗原结合部分；
b)选自药物、酶、可检测标记物、毒素、细胞因子或放射性核素的偶联部分。
本发明中的抗体或抗原结合部分可以以任意合适的方式与偶联部分进行偶联，形成偶联物，例如，抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)，用来预防或治疗肿瘤。
本发明的有益效果为：
本发明提供的抗CD123单克隆抗体6E11、8D7、12H7均与CD123蛋白具有高亲和性，Kd值分别为2.09×10-9M，2.10×10-9M，2.01×10-9M。且结合特异性强，三株抗体均与阴性细胞Jurkat、BJAB无交叉反应。通过10例病人样本的检测，均能特异性识别样本中的CD123阳性细胞，与CD123阴性的病人标本无交叉反应。6E11、8D7、12H7能通过Western Blot的方法特异性结合线性化CD123蛋白。基于这些特性，本发明单克隆抗体既可用于检测表达CD123的细胞，也能够单独或与其它方法联合应用在肿瘤免疫治疗中，即能够有效运用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。
生物保藏信息：
保藏编号：CGMCC No.18849
保藏日期：2019年11月4日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
分类命名：杂交瘤细胞株
保藏编号：CGMCC No.18847
保藏日期：2019年11月4日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
分类命名：杂交瘤细胞株
保藏编号：CGMCC No.18848
保藏日期：2019年11月4日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
分类命名：杂交瘤细胞株
附图说明
图1为本发明抗体6E11、8D7、12H7与3T3/CD123+细胞的亲和常数分析结果图；
图2为本发明抗体6E11、8D7、12H7与CD123阳性细胞系THP-1的结合结果图，其中，a为同型阴性对照，b为商品CD123抗体阳性对照；
图3为本发明抗体6E11、8D7、12H7与CD123阴性细胞系BJAB、Jurkat的结合结果图；
图4为本发明抗体6E11、8D7、12H7与白血病人样本的结合结果图，其中A为CD123阳性病人标本，B为CD123阴性病人标本；
图5为Western Blot法检测抗体与3T3/CD123+细胞细胞总蛋白中CD123的结合特异性结果图；
图6为FACS法检测本发明12H7、6E11、8D7与商品抗体7G3的竞争关系结果图。
序列说明
SEQ ID No.1为本发明抗体6E11的重链可变区CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID No.2为本发明抗体6E11的重链可变区CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID No.3为本发明抗体6E11的重链可变区CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID No.4为本发明抗体8D7的重链可变区CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID No.5为本发明抗体8D7的重链可变区CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID No.6为本发明抗体8D7的重链可变区CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID No.7为本发明抗体12H7的重链可变区CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID No.8为本发明抗体12H7的重链可变区CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID No.9为本发明抗体12H7的重链可变区CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID No.10为本发明抗体6E11的轻链可变区CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID No.11为本发明抗体6E11的轻链可变区CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID No.12为本发明抗体6E11的轻链可变区CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID No.13为本发明抗体8D7的轻链可变区CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID No.14为本发明抗体8D7的轻链可变区CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID No.15为本发明抗体8D7的轻链可变区CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID No.16为本发明抗体12H7的轻链可变区CDR1的氨基酸序列；
SEQ ID No.17为本发明抗体12H7的轻链可变区CDR2的氨基酸序列；
SEQ ID No.18为本发明抗体12H7的轻链可变区CDR3的氨基酸序列；
SEQ ID No.19为本发明抗体6E11的重链可变区的核苷酸序列；
SEQ ID No.20为本发明抗体6E11的轻链可变区的核苷酸序列；
SEQ ID No.21为本发明抗体8D7的重链可变区的核苷酸序列；
SEQ ID No.22为本发明抗体8D7的轻链可变区的核苷酸序列；
SEQ ID No.23为本发明抗体12H7的重链可变区的核苷酸序列；
SEQ ID No.24为本发明抗体12H7的轻链可变区的核苷酸序列；
SEQ ID No.25为本发明抗体6E11的重链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID No.26为本发明抗体6E11的轻链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID No.27为本发明抗体8D7的重链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID No.28为本发明抗体8D7的轻链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID No.29为本发明抗体12H7的重链可变区的氨基酸序列；
SEQ ID No.30为本发明抗体12H7的轻链可变区的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了抗CD123抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明中使用的术语“抗体”，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL 由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本发明中使用的术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv等。
其中，术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
本发明中使用的术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
本发明中使用的术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选
以人CD123蛋白为免疫原，采用腹腔注射的方式免疫Balb/c小鼠，分别在初次免疫后的第3周和第5周进行加强免疫，在加强免疫后的第8天取小鼠尾血，室温静置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，收集血清，以PBS稀释成不同浓度：1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1：12800。收集THP-1细胞，PBS洗1次，细胞计数，每个样品用1×106个细胞，将100μl不同稀释度的血清加入到细胞中，阴性对照组以为未免疫小鼠血清代替抗血清，4℃孵育1小时，PBS洗两次；加入PE标记大鼠抗小鼠IgG抗体2μl，4℃避光孵育40分钟；细胞重悬于500μl PBS缓冲液中，流式细胞仪检测血清中抗体与细胞的结合百分率及荧光强度；以平均荧光强度为阴性对照两倍以上为有效效价，效价高于6400时，方可进行融合。融合前3天，对免疫小鼠通过尾静脉注射免疫原的方式进行冲击免疫。取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合(以10：1比例)，融合时在37℃水浴的环境下，将50％的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有HAT的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x107细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。
当所述克隆足够大时，每孔取100μl上清液与2×105个THP-1细胞共孵育，进行检测，方法与检测效价相同。平均免疫荧光强度为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37℃、5％CO2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的三株单克隆抗体编号分别为6E11、8D7、12H7，均为鼠源IgG1亚型，轻链均为κ链。
实施例2：腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。以终浓度为33％的饱和硫酸铵对抗体进行粗纯，方法为取1份腹水加1份PBS,滴加1份饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃过夜，10000rpm离心10min除去上清，用少量PBS溶解沉淀，在4℃环境下用PBS透析除盐24h，期间换液3次。粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。
实施例3：单克隆抗体效价检测
对抗体纯品进行荧光标记，PE直标6E11、8D7、12H7抗体。标记后的抗体以终浓度400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM、0.4nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM、0.0125nM、0.0061nM、0.003nM分别与2.5×1053T3(转染CD123)室温共孵育30min，注意避光。1800rpm，10min离心，弃上清，PBS洗细胞，重复三次，将细胞重悬于400μl的PBS中，FACS测定荧光强度，统计Mean值。用数据分析软件GraphPad Prism 5计算抗体的Kd值。结果如图1所示，12H7,6E11,8D7的Kd值分别为2.09×10-9M，2.10×10-9M，2.01×10-9M。
实施例4：RT-PCR法克隆Ig可变区基因
1、总RNA提取，单链cDNA合成：
用Trizol法(试剂盒购自Invitrogen)分别提取6E11、8D7、12H7、杂交瘤细胞株的的总RNA，用M-MLV逆转录酶(购自Invitrogen)将总RNA逆转为cDNA文库。
2、RT-PCR扩增抗人CD123抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因片段：
重链骨架区上游引物
P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’
重链可变区下游引物
P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’
轻链前导肽上游引物
P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’
轻链可变区下游引物
P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’
配制PCR反应体系(50μl)如下：
cDNA:2μl、上游引物(10μM):2μl、下游引物(10μM)：2μl、d NTP mixture：2μl、pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl、10X pfu BufferⅡ:5μl、ddH2O:补足至50μl。反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，连接体系如下：VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。
配制反应体系(25μl)如下：菌液：1μl、上游引物(10μM)：1μl、下游引物(10μM)：1μl、dNTP Mixture(各2.5Mm)2μl、Taq DNA聚合酶(5U/μl)：0.5μl、10×Taq Buffer(Mg2+plus)：2.5μl、补水至25μl。反应条件同前。选取菌P阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到6E11、8D7、12H7的重链、轻链可变区序列，符合典型抗体可变区序列特征。
实施例5：与高表达CD123的THP-1细胞特异性结合
FACS检测抗体6E11、8D7、12H7与THP-1表面CD123蛋白的结合：抗体以终浓度0.1nM分别与1×106THP-1细胞进行孵育，室温孵育40min，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入APC标记大鼠抗小鼠IgG1抗体2μl，室温避光孵育40分钟；细胞重悬于500μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果如图2所示，可见三株抗体均能有效结合THP-1细胞，且亲和力强于相同浓度的CD123商品抗体7G3(BD：560087)。
实施例6：与CD123阴性细胞的交叉反应
将抗体以100nM的终浓度分别与2x105个BJAB、Jurkat细胞(CD123阴性)进行孵育，以CD123商品抗体作为对照。4℃孵育1小时，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入PE标记大鼠抗小鼠IgG1抗体2μl，4℃避光孵育40分钟；细胞重悬于500μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果如图3所示，6E11、8D7、12H7与BJAB、Jurkat细胞均无交叉反应，结合特异性良好。
实施例7：抗体12H7和8D7与白血病人样本的结合
取CD123阴性、阳性(各5例)白血病人外周血500ul，裂红离心后，将PE直标的抗体12H7、8D7、6E11分别以0.06μg/test的用量与之进行孵育，以CD123商品抗体(BD：340545)作为阳性对照，使用浓度为0.125μg/test。4℃孵育1小时，PBS洗两次；细胞重悬于500μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果如图4所示，12H7、6E11、8D7与病人样本的结合分群与商品CD123抗体完全一致，能够特异性识别出病人标本中的CD123阳性细胞，与病人样本中的CD123阴性细胞无交叉反应，且抗体12H7、8D7、6E11的用量为商品抗体的二分之一，与CD123蛋白的亲和力更强。
实施例8：Western Blot法检测抗体与3T3/CD123+细胞总蛋白中CD123的结合特异性
收集3T3/CD123+细胞，预冷PBS洗两遍，加入100μl预冷的RIPA裂解液(强)和1μlPMSF(100mM)，转移至1.5mLEP管内，冰浴，水平摇床震摇30分钟；4℃12,000rpm离心15分钟，收集上清，用BCA法蛋白定量。以40ug/孔的蛋白量进行上样，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后，将NC膜加入含5％脱脂奶(PBST配制)的封闭液中，室温封闭2小时。用5％脱脂奶将抗体6E11、8D7、12H7分别稀释至4μg/ml，封闭结束后加入稀释后的抗体，4℃轻摇孵育过夜。去除一抗，PBST洗3次，每次10分钟，室温温和摇动；用封闭液按1:3000比例稀释HRP偶联二抗(山羊抗鼠)，将二抗工作液滴加至NC膜中，室温温和摇动2小时；去除二抗，PBST洗3次，每次10分钟，室温温和摇动。使用ECL底物显色液、荧光/化学发光成像分析仪对NC膜进行曝光，结果如图5所示，每孔所上样品为等量的3T3/CD123+细胞总蛋白(40ug)；所用抗体孵育浓度均为4μg/ml。可见6E11、8D7、12H7能特异性结合线性化后的人CD123蛋白，结合能力明显强于对照CD123抗体13C3。
实施例9：FACS法检测12H7,6E11,8D7与商品抗体7G3的竞争关系
取分别取抗体12H7、6E11、8D7杂交瘤培养上清6.25ul、12.5ul、25ul、50ul、100ul，同时每孔加入2.5ul商品PD-1抗体(BD：560087；Clone：7G3；APC直标)，PBS将终体积调节至200ul，与2×105THP-1细胞室温避光孵育30min。1800rpm，10min离心，弃上清，PBS洗细胞，重复三次，将细胞重悬于400μl的PBS中，FACS测定荧光强度，统计Mean值。结果如图6所示，可见12H7、6E11、8D7都仅能与商品抗体7G3产生部分竞争，抗原表位并不完全一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所） 克拉玛依市中心医院
<120> 抗CD123抗体及其应用
<130> None
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 1
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1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 2
Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> Mouse
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<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 4
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<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Mouse
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<213> Mouse
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<213> Mouse
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<213> Mouse
<400> 11
Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser
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<211> 9
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<213> Mouse
<400> 12
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<211> 11
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<400> 17
Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 18
Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Trp Thr
1 5
<210> 19
<211> 357
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 19
caggtgcagc ttcaggagtc tggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc aatgattttg cctggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagtt tcagtggtag cacttcctac 180
aacccatctc tcaaaggtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240
ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attcctgtgc aagaggaggg 300
atgattacgc cctacttttc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctccgca 357
<210> 20
<211> 342
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 20
gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga ttcagtttct 60
atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120
tacctgcaca ggcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180
tctggggtgc cagacaggtt cagtggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agctcaataa agcctgagga cttgggagtg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ct 342
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<212> DNA
<213> Mouse
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caggtgcagc tgcaggagtc aggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggtta ctcaatcacc aatgattata cctggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaattgga atggatgggt tacataagtt tcagtggtat cactagccac 180
aacccatctc tcaacagtcg aatctctatt actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240
ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtac aagaggggtg 300
gacttctggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctccgca 339
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<212> DNA
<213> Mouse
<400> 22
gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgct gggccagcca aagtattagc aacagcctac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaagttt gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcgacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag ggtcacacct ggcctcacac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgggct 327
<210> 23
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<212> DNA
<213> Mouse
<400> 23
caggtgaagc ttcaggagtc tggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattttg cctggaactg ggtccggcag 120
tttccaggag acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtgg cactaactac 180
cacccatctc tcaaagatcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccaggtcttc 240
ctgcagttaa attctgtgac tactgaggac acagccacgt attactgtgc aagaggaggg 300
atgattacgc cctactttgc ctactggggc caagggactc tggtcactgt ctccgca 357
<210> 24
<211> 342
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 24
gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60
atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120
tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180
tctggggtgc cagacaggtt cagtggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcacaataa agcctgagga cttgggaata tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ct 342
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Met Ile Thr Pro Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 26
<211> 114
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 26
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Ser Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ile Thr Ser His Asn Pro Ser Leu
50 55 60
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Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Trp Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asp Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100 105
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 29
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
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<211> 114
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Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
1 5 10 15
Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
Claims (9)
1.特异性结合CD123的抗体，其特征在于，所述抗体包含有：
如SEQ ID No.4-6所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.13-15所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
2.特异性结合CD123的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分包含有：
如SEQ ID No.4-6所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和如SEQ ID No.13-15所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；
其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，编码所述抗体的核苷酸序列包含有：
如SEQ ID No.21所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区核苷酸序列和如SEQID No.22所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区核苷酸序列。
4.根据权利要求1或3所述的抗体，其特征在于，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNo.18849的细胞产生的单克隆抗体。
5.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞包含有如权利要求1、3或4所述的抗体，或如权利要求2所述的抗原结合部分；
所述细胞为选自SP2/0、YB2/0、IR983F、人骨髓瘤Namalwa、PERC6或CHO细胞系。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1、3或4所述的抗体，或如权利要求2所述的抗原结合部分。
7.如权利要求1、3或4所述的抗体，或如权利要求2所述的抗原结合部分，或如权利要求5所述的细胞在制备检测AML的产品中的用途。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1、3或4所述的抗体，或如权利要求2所述的抗原结合部分，或如权利要求5所述的细胞，或如权利要求6所述的多核苷酸，以及药学上可接受的载体。
9.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
a)如权利要求1、3或4所述的抗体，或如权利要求2所述的抗原结合部分；
b)选自药物、酶、可检测标记物、毒素、细胞因子的偶联部分。
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