CN117946273A - Cd70的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗CD70的抗体及其应用。本公开提供的抗人CD70抗体与CD70蛋白具有高亲和性，且结合特异性强，与阴性细胞3T3、Kasumi‑1、Jurkat、K562、Kg1a和Nalm6无交叉反应。基于这些特性该抗体既可用于检测表达CD70的细胞，也能够单独或与其它方法联合应用在肿瘤免疫治疗中，即能够有效运用于制备治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等的药物。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药领域，具体地，本公开涉及一种抗CD70的抗体及其应用。
背景技术
CD70(CD27配体)是一种细胞表面蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族(TNFsuperfamily),是一种II型跨膜糖蛋白，由193个氨基酸组成，分子量为50kDa。基于其他TNF超家族的同源序列预测显示，CD70以同源三聚体的形式与三个CD27同源二聚体相结合。CD70与CD27相结合，从而激活下游的NFκB和c-Jun激酶途径，进一步促进细胞的增殖、存活与分化。
CD70在多种恶性疾病中，包括急性髓系白血病(AML)、恶性淋巴瘤和某些实体肿瘤中高表达，且其过度表达在肿瘤细胞中可能发挥促进肿瘤生长和免疫逃逸的作用。而在正常组织中，CD70仅在活化的免疫细胞上限制性表达，且表达水平较低，这使得CD70成为免疫治疗的一个理想靶点。除此以外，研究表明CD70-CD27信号通路在免疫逃逸中发挥重要作用。肿瘤细胞通过高表达CD70持续作用于T细胞表面的CD27，促进抑制性调节T细胞的增殖，增加T细胞的凋亡与耗竭，从而发挥免疫抑制作用，在免疫逃逸中发挥作用。而研究发现CD70抗体的应用可以通过阻断CD70-CD27信号通路消除肿瘤微环境中的免疫抑制作用。
综上，靶向CD70的治疗可以通过特异性杀伤表达CD70的肿瘤细胞群，及阻断CD70-CD27信号轴消除促肿瘤作用来发挥作用。目前已有多种靶向CD70的疗法在临床前及临床研究中取得进展，如：抗体药物偶联物(ADC)MDX-1203、AMG 172、SGN-75和SGN-CD70A均已完成I期临床，SEA-CD70目前正在骨髓恶性肿瘤的治疗中进行临床试验研究；ARGX-110等药物通过携带Fc受体(FcγRIII)基于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作用激活免疫效应细胞并阻断靶蛋白，已证明可以有效消除接受低甲基化药物治疗的AML患者的白血病干细胞(LSC)；靶向CD70的CAR-T细胞疗法包括anti-hCD70 CAR(NCT02830724),4SCAR70(NCT03125577),CARCD70(NCT04662294),CTX130(NCT04438083)及ALLO316(NCT04696731)正在血液肿瘤和实体恶性肿瘤患者中进行I/II期临床试验的评估。
尽管CD70抗体疗法在血液恶性肿瘤和实体瘤的治疗中展现出巨大的潜力，但因安全性和疗效有限等诸多问题，目前仍没有靶向CD70的疗法被正式应用于临床。因此我们需要进一步探索和开发靶向CD70的抗体，为其临床研究及应用提供新的可能。
发明内容
解决的技术问题：
本公开的一个方面，是针对现有技术中缺少效果理想的靶向CD70的抗体的缺陷，提供了一种分离的抗体。
技术方案：
一种分离的抗体，所述抗体特异性结合人CD70蛋白，所述抗体包括：
如SEQ ID No.1、9、17或25所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.2、10、18或26所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列；
如SEQ ID No.3、11、19或27所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列；
如SEQ ID No.4、12、20或28所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.5、13、21或29所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列；和
如SEQ ID No.6、14、22或30所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列。
在本公开的某些实施方式中，所述抗体包括：
如SEQ ID No.7、15、23或31所示的重链可变区的氨基酸序列；和
如SEQ ID No.8、16、24或32所示的轻链可变区的氨基酸序列。
在本公开的某些实施方式中，所述抗体可以是哺乳动物来源的抗体，例如，鼠、兔、羊、马、猴、猪、骆驼、鲨鱼、鸡，等。在本公开的另一些实施方式中，所述抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
在本公开的某些实施方式中，所述抗体可以为IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述抗体的类型可以为IgG。进一步地，在本公开的某些实施方式中，所述抗体可以为选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种或几种。优选地，所述抗体可以为IgG1。
在本公开的某些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。
在本公开的某些实施方式中，所述抗体包括Fc部分。作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述抗体的Fc部分经过修饰或改造以增强其ADCC活性、CDC活性或ADCP活性。
本公开的另一个方面，是提供了一种分离的抗原结合部分，所述抗原结合部分特异性结合人CD70蛋白，所述抗原结合部分包括选自以下氨基酸序列中的一种或几种：如SEQID No.1、7、13或19所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.1、9、17或25所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.2、10、18或26所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列；
如SEQ ID No.3、11、19或27所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列；
如SEQ ID No.4、12、20或28所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.5、13、21或29所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列；或
如SEQ ID No.6、14、22或30所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列。
在本公开的某些实施方式中，所述抗原结合部分包括：
如SEQ ID No.7、15、23或31所示的重链可变区的氨基酸序列；和/或
如SEQ ID No.8、16、24或32所示的轻链可变区的氨基酸序列。
在本公开的某些实施方式中，所述抗原结合部分可以为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、FCL、dAb、单链抗体scFv、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
本公开的另一个方面，是提供了一种多价抗体，所述多价抗体的单体为上述抗体或上述抗原结合部分。所述多价抗体可以为，例如，二价、三价、四价、六价、九价，等。可以利用现有技术中合适的方法制备所述多价抗体。
本公开的另一个方面，是提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述抗体、上述抗原结合部分或上述多价抗体。在本公开的某些实施方式中，所述多核苷酸还编码选自如SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32所示的氨基酸序列中的一种或几种，其中，所述氨基酸序列或其组合构成上述抗体，上述抗原结合部分，或上述多价抗体。
本公开的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包括上述多核苷酸。
本公开的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述抗体，上述抗原结合部分，上述多价抗体，或上述多核苷酸。在本公开中，所述细胞可以为任意合适的作为生产目标蛋白质工具的宿主细胞。例如，SP2/0、YB2/0、IR983F、人骨髓瘤Namalwa、PERC6或CHO细胞系、昆虫细胞、大肠杆菌细胞。
本公开的另一个方面，是提供了一种产生抗CD70抗体或抗原结合部分的方法，将上述细胞进行蛋白质表达后，直接或间接地获得所述抗CD70抗体或抗原结合部分。
本公开的另一个方面，是提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体至少选择性结合人CD70，所述多特异性抗体包含上述抗体或上述抗原结合部分；所述多特异性抗体为单价抗体或多价抗体。所述多特异性抗体可以为，例如，双特异性、三特异性。所述多价抗体可以为，例如，二价、三价、四价、六价、九价，等。可以利用现有技术中合适的方法制备所述多价抗体。
本公开的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述抗体，上述抗原结合部分，上述多价抗体，上述多核苷酸，上述细胞，或上述多特异性抗体，以及药学上可接受的载体。为了实现更好的治疗效果，在本公开的某些实施方式中，所述药物组合物中还可以包含其他治疗性药物。
本公开的另一个方面，是提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括：a)上述抗体，上述抗原结合部分，上述多价抗体或上述多特异性抗体；和b)治疗剂或可检测标记物；和c)上述a)与b)两部分的连接体；其中，所述治疗剂包括药物、酶、毒素、细胞因子或放射性核素。
本公开的另一个方面，是提供了上述抗体，上述抗原结合部分，上述多价抗体，上述多核苷酸，上述细胞，上述多特异性抗体，上述药物组合物，或上述免疫缀合物在制备治疗血液肿瘤的药物中的用途。作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述血液肿瘤为浆细胞瘤。更优选地，在本公开的某些实施方式中，所述血液肿瘤为多发性骨髓瘤。
本公开的另一个方面，是提供了上述抗体，上述抗原结合部分，上述多价抗体，或上述多特异性抗体在制备检测样本中CD70的存在或者水平的产品中的用途。
有益效果：
本公开提供的抗人CD70抗体与CD70蛋白具有高亲和性，且结合特异性强，与阴性细胞3T3、Kasumi-1、Jurkat、K562、Kg1a和Nalm6无交叉反应。基于这些特性该抗体既可用于检测表达CD70的细胞，也能够单独或与其它方法联合应用在肿瘤免疫治疗中，即能够有效运用于制备治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等的药物。
附图说明
图1为本公开实施例中Roche小鼠单克隆抗体亚型检测试剂对1F2、10B8、19A4和11D6亚型的检测结果图；
图2为本公开实施例中10B8、19A4、1F2和11D6纯品的SDS-PAGE图，其中，1:10B8粗纯产物；2:10B8纯品；3:19A4粗纯产物；4:19A4纯品；5:1F2粗纯产物；6:1F2纯品；7:11D6粗纯产物；8:11D6纯品；M：Marker；
图3为本公开实施例中1F2、10B8、19A4和11D6与Molm13细胞的亲和常数分析结果图；
图4为本公开实施例中抗体1F2、10B8、19A4和11D6与hCD70阳性细胞系HL-60、NB4、U937、Molm13、MV-4-11、Raji、Thp-1、U266的FACS结合峰形图，其中，黑色为阴性对照，紫色为商业抗体阳性对照，绿色为1F2，橙色为10B8，红色为19A4，蓝色为11D6；
图5为本公开实施例中FACS法检测抗体1F2、10B8、19A4、11D6、113-15与hCD70阳性细胞系Molm-13、THP-1的结合结果图，其中，绿色为同型阴性对照，蓝色为商品CD70抗体113-15，红色分别为1F2、10B8、19A4和11D6抗体；
图6为本公开实施例中抗体1F2、10B8、19A4和11D6与hCD70阴性细胞系K562、3T3、Jurkat、Kasumi-1、Kg1a、Nalm-6非特异性交叉结合FACS峰形图，其中，黑色为阴性对照，紫色为商业抗体阳性对照，绿色为1F2抗体，橙色为10B8抗体，红色为19A4抗体，蓝色为11D6抗体。
序列说明
具体实施方式
本发明公开了一种CD70的抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“一个(一种)”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。术语“多个(多种)”是指两个(种)或更多个(种)。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。分子生物学常见术语的定义可见Lewin’s GENES XII，JocelynE.Krebs/Elliott S.Goldstein/Stephen T.Kilpatrick，出版Jones&Bartlett，2018。
分离的抗体：
本公开中的术语“分离的”是指脱离了其天然环境或分离前存在的环境，与其他组分分开的物质或实体。例如，分离的蛋白质实质上没有来自它所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其他蛋白质。所述分开的比例可以为，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。分离的物质相对于它们分离前的物质而言，可能具有不同的纯度水平。
本公开中的术语“抗体”，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。在本公开的某些实施方式中，所述抗体可以为IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述抗体的类型可以为IgG。进一步地，在本公开的某些实施方式中，所述抗体可以为选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种或几种。优选地，所述抗体可以为IgG1。
在本公开的某些实施方式中，使用哺乳动物细胞产生所述抗体。例如，利用杂交瘤技术在哺乳动物细胞中产生单克隆抗体。可以采用Kohler等在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。
免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可以利用弗氏佐剂(弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂)或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。
将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type Cμlture Collection，Rockville，Md.USA)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。
在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。
利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来，进而得到所述单克隆抗体。
在本公开的某些实施方式中，所述分离的抗体可以为人源化抗体。抗体人源化或可以改善抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的描述及方法可参考Riechmann,L.,Clark,M.,Waldmann,H.,&Winter,G.(1988).Reshaping human antibodies fortherapy.Nature,332(6162),323–327.
在本公开的某些实施方式中，通过对所述抗体Fc(可结晶区域片段，Fc)进行改造以增强其通过结合Fc受体或补体触发效应功能(effector functions)。这些功能可以包括：补体依赖的细胞毒性反应(complement-dependent cytotoxicity,CDC)、抗体依赖的细胞介导的毒性反应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)以及抗体依赖的细胞吞噬反应(Antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP)。上述改造可以包括：1)改造糖基化，例如，位于Fc区域的297位天冬氨酸(N297)可被N-乙酰葡糖胺修饰。N297突变成丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q),或甘氨酸(G)均会阻碍抗体的糖基化，从而降低Fc介导的效应功能。抗体去糖基化后，诱导ADCC或CDC活性的能力会下降；唾液酸(sialic acid)修饰会降低与FcγRIIIa的结合力，因而导致CDC和ADCC活性的降低。2)点突变，例如，LALA突变(L234A/L235A)会导致抗体对FcγR亲和力的改变(消除对低亲和力的FcγR的结合以及降低对FcγRI的结合)，从而显著降低其ADCC和CDC活性。另外，通过跨亚型抗体的组合也会调节抗体的效应功能。
本公开具体实施方式中的抗体如以下表1所示。
表1
分离的抗原结合部分：
本公开中的术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv等。
其中，术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。
在本公开的某些实施方式中，利用蛋白酶消化的方法制备上述抗原结合部分，使用的蛋白酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。在本公开的另一些实施方式中，利用化学试剂处理的方法制备上述抗原结合部分。在本公开的另一些实施方式中，利用基因工程的方法制备上述抗原结合部分。即，将包含有所述抗原结合部分全部或部分基因序列的片段连接至合适的载体，并进行表达。所述表达的载体的例子包括，细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
所述抗体或抗原结合部分的修饰：
除以上对抗体Fc段进行修饰以改善其性能以外，还可以对抗体或抗原结合部分的其他部分进行氨基酸修饰，以产生不显著影响抗体性质的功能等效可变区和/或CDR以及具有增强或减低活性和/或亲和力的变体。此类修饰的例子包括氨基酸残基的保守性取代(替换)、不显著改变抗体的功能活性或使抗体对其靶抗原的亲和力成熟的一或多个氨基酸缺失或添加。互为保守性取代(替换)的氨基酸残基的例子可以为以下组中的氨基酸，1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。
多价抗体以及多特异性抗体：
本公开中的多价抗体包括至少两个本公开中所述的抗体或者抗原结合部分，其能够竞争性地结合人CD70分子，并产生与单价抗体不同的效果。所述多价抗体可以利用，例如，蛋白质融合、增加连接体、共价键或非共价键的方法获得。
本公开中的多特异性抗体，例如，双特异性抗体、三特异性抗体，包括本公开中所述的抗体或者抗原结合部分，其除了竞争性地结合人CD70分子以外，还能够结合至少一个其他的不同位点或目标分子。例如，BCMA、CD38、CD40、IL-6、CS1、SLAMF7、PD-1、PD-L1、GPRC5D、TRAF2、VEGF，等。所述多特异性抗体可以通过直接连接或通过连接体连接在一起。可以通过重组的方法，表达所述多特异性抗体。为了实现更好的治疗效果，所述多特异性抗体可以是单价的，也可以是多价的。
本公开中的术语“多核苷酸”也可交换使用为“核酸”，是指任何长度的核苷酸的链，且包括DNA或RNA。其可以包括任意已知的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸或碱基。
本公开中的术语“载体”是指能够运送和/或表达一种或多种目标基因的多核苷酸分子。载体的示例可以为，病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体及某些真核细胞诸如产生细胞。
药物组合物：
本公开中的术语“药物组合物”是指除含有本公开所述抗体，所述抗原结合部分，所述多价抗体，所述多核苷酸，所述载体，所述细胞，或所述多特异性抗体以外，还包含至少一种其他物质的组合物。该其他物质可以为，例如，药学上可接受的载体、赋形剂、生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂，等。也可以为其他治疗药剂，例如，化学治疗药物：马法兰、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱，等；糖皮质激素类药物：泼尼松、地塞米松，等；免疫调节药物：沙利度胺、来那度胺、泊马度胺，等。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例：
实施例1：抗人CD70抗体的制备
1、小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选
以人CD70阳性细胞系为免疫原，采用腹腔注射的方式免疫Balb/c小鼠，分别在初次免疫后的第2周和第4周进行加强免疫，在加强免疫后的第8天取小鼠尾血，室温静置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，收集血清；以PBS稀释尾血上清成不同浓度：1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1：12800。收集CD70阳性细胞，PBS洗1次，细胞计数，调整样本密度为1×107/ml，将100μl不同稀释度的血清加入到100μl细胞中，阴性对照组以CD70阴性细胞为检测细胞，4℃孵育30min，PBS洗两次；以1:500的比例加入APC标记的抗小鼠F(ab)2二抗，室温避光孵育30min，PBS洗两次；细胞重悬于200μl PBS缓冲液中，流式细胞仪检测血清中抗体与细胞的结合百分率及荧光强度；以平均荧光强度为阴性对照两倍以上为有效效价，有效效价高于6400时，方可进行融合。融合前3天，对免疫小鼠通过尾静脉注射免疫原的方式进行冲击免疫。取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合(以10：1比例)，融合时在37℃水浴的环境下，将50％的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1.5min，再在5min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，5min离心，弃去上清，用含有HAT的半固体培养基重悬细胞，并移液入10cm平皿(10ml/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。当所述克隆足够大时，挑取单克隆至每孔铺满200μl完全培养基的96孔板中继续培养3-4天。细胞显微镜下观察96孔板中细胞克隆足够大时，取对应孔上清液100μl，与阳性细胞共孵育，方法与检测效价相同。当K562-CD70的平均荧光强度高于K562细胞时，将该空视为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔200μl，37℃、5％ CO2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本实施例中的四株单克隆抗体编号分别为1F2、10B8、19A4和11D6，均为鼠源IgG1亚型，轻链均为κ链。(如图1所示)
2、腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/500μl/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。以终浓度为33％的饱和硫酸铵对抗体进行粗纯，方法为取1份腹水加1份PBS,滴加1份饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃过夜，10000rpm离心10min除去上清，用少量PBS溶解沉淀，在4℃环境下用PBS透析除盐24h，期间换液3次。粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。对抗体纯品进行BCA定量检测纯品抗体的蛋白浓度。取10μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，可见纯品抗体在150kDa处有单一条带，经巯基乙醇还原后，在25kDa处和50kDa处分别有轻重链条带(如图2所示)。
3、单克隆抗体效价检测
对抗体纯品行BCA定量，以终浓度200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6,25nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM、0.4nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM分别与2×105Molm13细胞(hCD70阳性细胞系)室温共孵育30min，PBS清洗2遍后加入APC标记的抗小鼠F(ab)2二抗，室温避光孵育30min，PBS洗两次；细胞重悬于200μl PBS缓冲液中，FACS测定荧光强度，统计Mean值。用数据分析软件GraphPad Prism 7计算抗体的Kd值。1F2、10B8、19A4和11D6的Kd值分别为1.789×10-9M，1.649×10-9M，9.12×10-9M，0.6437×10-9M。(结果如图3所示)
4、RT-PCR法克隆可变区基因
用TRIzol试剂分别提取1F2、10B8、19A4和11D6杂交瘤细胞株的总RNA,并以RNA为模板利用逆转录酶合成cDNA文库。RT-PCR扩增抗人CD70抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因片段。引物序列如表2所示：
表2
配制PCR反应体系(50μl)如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；2×Pfu PCR Master mix:25μl；ddH2O:补足至50μl。反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，连接体系如下：VL PCR产物/VH PCR产物各70ng；pMD19-T(simple)载体1μl；Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl。4℃连接过夜，连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落送检测序。成功克隆得到1F2、10B8、19A4和11D6的重链、轻链可变区序列，符合典型抗体可变区序列特征。
实施例2：流式细胞术检测抗体1F2、10B8、19A4和11D6与hCD70阳性细胞系特异性结合
FACS检测抗体1F2、10B8、19A4和11D6与hCD70阳性细胞系NB4、Molm13、U937、MV-4-11、U266、HL-60、Raji、MM1S细胞膜表面hCD70蛋白的结合：抗体1F2、10B8、19A4和11D6分别与NB4、Molm13、U937、MV-4-11、U266、HL-60、Raji、MM1S细胞进行孵育，以CD70商品抗体(BDBiosciences：Ki-24)作为阳性对照，室温孵育30min，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入APC标记的抗小鼠F(ab)2二抗1ul，室温避光孵育30分钟；细胞重悬于500μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果见图4：可见四株抗体与八株hCD70+细胞系均能有效结合。
FACS法比较抗体1F2、10B8、19A4、11D6与CD70商品抗体113-15(Biolegend)结合Molm-13和THP-1细胞膜表面CD70蛋白的能力强弱：
本实施例的四株单克隆抗体及商品抗体均以终浓度5nM分别与2×105Molm-13和THP-1细胞进行孵育，4℃孵育30min，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入抗小鼠F(ab)2二抗1μl，4℃避光孵育30min；细胞重悬于100μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果见图5：可见抗体1F2、10B8、19A4、11D6均能有效结合Molm-13及THP-1细胞株，且抗体1F2、10B8、11D6结合亲和力强于相同浓度的hCD70商品抗体113-15(Biolegend)。
实施例3：流式细胞术检测抗体1F2、10B8、19A4和11D6与hCD70阴性细胞系的非特异交叉反应
将四种CD70单克隆抗体分别与K562、3T3、Jurkat、Kasumi-1、Kg1a、Nalm-6细胞系(hCD70表达均为阴性)进行孵育，以CD70商品抗体(BD Biosciences：Ki-24)作为对照。室温孵育30min，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入APC标记的抗小鼠F(ab)2二抗1ul，室温避光孵育30分钟；细胞重悬于500μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果见图5：1F2、10B8、19A4和11D6与K562、3T3、Jurkat、Kasumi-1、Kg1a、Nalm-6细胞均无交叉反应，结合特异性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (18)
1.一种分离的抗体，其特征在于，所述抗体特异性结合人CD70蛋白，所述抗体包括：
如SEQ ID No.1、9、17或25所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.2、10、18或26所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列；
如SEQ ID No.3、11、19或27所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列；
如SEQ ID No.4、12、20或28所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.5、13、21或29所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列；和
如SEQ ID No.6、14、22或30所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其特征在于，所述抗体包括：
如SEQ ID No.7、15、23或31所示的重链可变区的氨基酸序列；和
如SEQ ID No.8、16、24或32所示的轻链可变区的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其特征在于，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
4.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其特征在于，所述抗体为选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种或几种；
优选地，所述抗体为IgG1。
5.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其特征在于，所述抗体的Fc部分经过修饰或改造以增强其ADCC活性、CDC活性或ADCP活性。
6.一种分离的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分特异性结合人CD70蛋白，所述抗原结合部分包括选自以下氨基酸序列中的一种或几种：
如SEQ ID No.1、9、17或25所示的重链可变区的CDRH1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.2、10、18或26所示的重链可变区的CDRH2的氨基酸序列；
如SEQ ID No.3、11、19或27所示的重链可变区的CDRH3的氨基酸序列；
如SEQ ID No.4、12、20或28所示的轻链可变区的CDRL1的氨基酸序列；
如SEQ ID No.5、13、21或29所示的轻链可变区的CDRL2的氨基酸序列；或
如SEQ ID No.6、14、22或30所示的轻链可变区的CDRL3的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的分离的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分包括：
如SEQ ID No.7、15、23或31所示的重链可变区的氨基酸序列；和/或
如SEQ ID No.8、16、24或32所示的轻链可变区的氨基酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的分离的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、FCL、dAb、单链抗体scFv、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
9.一种多价抗体，其特征在于，所述多价抗体的单体为如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，或如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分。
10.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，或如权利要求9所述的多价抗体；
所述多核苷酸还编码选自如SEQ ID No.1-32所示的氨基酸序列中的一种或几种，其中，所述氨基酸序列或其组合构成如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，或如权利要求9所述的多价抗体。
11.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求10所述的多核苷酸。
12.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，如权利要求9所述的多价抗体，如权利要求10所述的多核苷酸，或如权利要求11所述的载体。
13.一种产生抗CD70抗体或抗原结合部分的方法，其特征在于，将如权利要求12所述的细胞进行蛋白质表达后，直接或间接地获得所述抗CD70抗体或抗原结合部分。
14.一种多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体至少选择性结合人CD70，所述多特异性抗体包含如权利要求1～5任意一项中所述的抗体或如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分；所述多特异性抗体为单价抗体或多价抗体。
15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，如权利要求9所述的多价抗体，如权利要求10所述的多核苷酸，如权利要求11所述的载体，如权利要求12所述的细胞，或如权利要求13所述的多特异性抗体，以及药学上可接受的载体；
优选地，所述药物组合物中还包含其他治疗性药物。
16.一种免疫缀合物，其特征在于，所述免疫缀合物包括：
a)如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，如权利要求9所述的多价抗体或如权利要求13所述的多特异性抗体；和
b)治疗剂或可检测标记物；和
c)上述a)与b)两部分的连接体；
其中，所述治疗剂包括药物、酶、毒素、细胞因子或放射性核素。
17.如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，如权利要求9所述的多价抗体，如权利要求10所述的多核苷酸，如权利要求11所述的载体，如权利要求12所述的细胞，如权利要求14所述的多特异性抗体，如权利要求15所述的药物组合物，或如权利要求16所述的免疫缀合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述肿瘤为急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、胰腺癌、鼻咽癌、卵巢癌或非小细胞肺癌。
18.如权利要求1～5任意一项中所述的抗体，如权利要求6、7、8中所述的抗原结合部分，如权利要求9所述的多价抗体或如权利要求14所述的多特异性抗体在制备检测样本中CD70的存在或者水平的产品中的用途。
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