CN113527484A - 抗cd47单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体领域，具体涉及一种抗CD47单克隆抗体，本发明公开了该单克隆抗体的高度可变区序列，本发明所提供的抗CD47单克隆抗体具有良好的结合活性，抗凝集效果好，SIRPα阻断效力强；促吞噬作用明显；ForteBio检测抗体亲和力常数，KD值低于1×10‑11nM，抗体亲和力高。具有较强的吞噬功能，显示出较好的抗肿瘤效果。

Description

抗CD47单克隆抗体
技术领域
本发明属于基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及一种抗CD47单克隆抗体。
背景技术
CD47抗体又称为整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，是免疫球蛋白超家族成员，在结构上包括一个氨基端细胞外可变区域，由3～5个高度疏水的跨膜片段构成的跨膜区域和一个亲水的羧基端胞质尾区组成。CD47广泛表达于各种组织细胞的表面，尤其在肿瘤细胞表面呈现高表达，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、卵巢癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤等。斯坦福大学的Weissman等人系统的研究了多种实体瘤中CD47的表达水平，结果表明，所有人类实体瘤细胞中的CD47都呈高表达，其平均表达水平是对应正常细胞的3.3倍左右。而且，他们发现实体瘤病人CD47的水平与预后指数呈负相关。此外，CD47被确认为白血病和实体瘤两者的癌干细胞标记(Majeti，等人，2009Cell，138:286-99；Rendtlew等人，2007Br J Haematal138:756-60；Chan等人，2009Proc Acad Sci USA,106:14016-21；Majeti,等人2011Oncogene,30:1009-19)。
SIRPα(信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα))，又称SHPS-1(含Src同源2结构域蛋白酪氨酸激酶底物-1(Src homology 2domain-containing protein tyrosinephosphatase substeate-1))/BIT(具有酪酸的活化基序的脑免疫球蛋白样分子(brainimmunoglobulin-like molecule with tyrosine-based activation motifs))/CD172a，也是跨膜糖蛋白，胞外区3个免疫球蛋白样结构域，细胞内结构域具有典型的免疫受体酪氨酸抑制性序列(ITIM)，具有4个酪氨酸残基，是潜在的磷酸化位点。
CD47是SIRPα的配体，二者通过胞外结构域相互作用，形成细胞间的通讯复合物。CD47与SIRPα结合后，诱导SIRPα胞内ITIM磷酸化，磷酸化位点结合进而激活含有SH2(Src同源2(Src homology 2))结构域的酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，引发信号传递的级联反应。SHP-1主要表达于造血细胞，负向调节这些细胞的功能；而SHP-2表达非常广泛，调节小G蛋白Ras和Rho，正向控制细胞生长和增殖。
SIRPα在神经元以及髓系造血细胞(如巨噬细胞和树突细胞)中表达丰富，而CD47则表达于多数细胞中。CD47-SIRPα信号系统对调节巨噬细胞对成熟血细胞的吞噬具有重要作用。正常健康细胞(如红细胞或血小板)表面的CD47分子与巨噬细胞上的受体SIRPα相互作用产生抑制性信号，抑制其吞噬活性，达到调节血细胞的生命周期及其在血液中的数量的目的。单核细胞上的SIRPα与红细胞上的CD47作用，通过肌球蛋白-IIA去磷酸化抑制Fcγ受体依赖的吞噬作用。CD47-SIRPα信号系统抑制树突细胞激活，参与神经系统发育、中性粒细胞趋化激活和基质细胞支持的造血细胞生成等多种生理活动，同时在诱导T细胞免疫耐受、活化、凋亡等方面也发挥着多种调节作用。
近年来，CD47-SIRPα信号系统通过调节巨噬细胞的肿瘤免疫监视中发挥的作用受到重视。CD47在许多恶性肿瘤，如卵巢癌、急性骨髓白血病(AML)、B细胞淋巴瘤和实体瘤中的表达水平显著上调，而且这种上调与恶性肿瘤患者的不良预后直接相关。在人髓性白血病细胞(低水平表达内源CD47，不能移植于Rag2-I12rg-小鼠)中表达小鼠CD47，可以抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，促进肿瘤细胞成功移植。可以推断，肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα作用，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的清除，促进肿瘤在体内的生长和转移，高表达CD47是肿瘤细胞逃逸免疫监视的普遍机制，阻断CD47-SIRPα作用，可能是新的肿瘤免疫治疗策略。
抗CD47抗体单独使用或者与其他肿瘤抗原抗体联合应用，在人急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)以及许多实体瘤的小鼠移植模型上都显示了很好的抑制肿瘤生长的作用。人源化抗CD47单克隆抗体诱导巨噬细胞对人原代AML细胞的吞噬作用，在体内彻底清除人AML细胞，使得移植小鼠长期无病生存；与利妥昔单抗联合作用，能清楚NHL肿瘤，治愈异种移植小鼠。而且，抗CD47抗体的安全性在猴体内得到证实。除了抗CD47抗体，高亲和力的SIRPα突变体(CD172a)也可以拮抗CD47进而阻断CD47-SIRPα信号通路，在AML模型上能显著增加巨噬细胞对AML细胞的吞噬作用，并抑制肿瘤的生长。
然而，针对该靶点的抗体主要研究瓶颈是开发出不与红细胞结合或者不具有显著凝集作用的单克隆抗体药物。
发明内容
本发明基于现有技术的不足，提供一种人鼠嵌合与CD47特异性结合，阻断CD47与SIRPα的相互作用，并且不具有显著血细胞凝集活性。
本发明第一方面是提供一种人鼠嵌合与CD47特异性结合的抗体，
所述抗CD47抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区。
其中HCDR1的序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10；
HCDR2的序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11；
HCDR3的序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12；
LCDR1的序列为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20；
LCDR2的序列为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21；
LCDR3的序列为SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：22。
CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常具有3个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)即重链可变区通常包括三个互补决定区，即CDRH1、CDRH2和CDRH3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：5所示的HCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：9所示的HCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：9所示的HCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：12所示的HCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：15所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：19所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：19所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：22所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：5所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：9所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：9所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR3。
在一种实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：12所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的LCDR3。
在一种实施方式中，所述抗CD47抗体的重链可变区和轻链可变区中还包括框架区，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。
在一种优选的实施方案中，所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：23所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；或者
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；或者
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；或者
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示。
本发明的第二方面，提供一种特异性结合人CD47的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：23、24、25或26中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：27、28、29或30中任何一项具有至少90％的一致性。
本发明确定抗CD47抗体的重链和轻链可变区序列的方法是：根据抗体基因恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PMDA19-T(simple)载体中，转化大肠杆菌大肠杆菌E.coli DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒后测序。
本发明所述抗体为单克隆抗体，所述抗体能结合并中和人CD47，进而阻断CD47-SIRPα信号通路。在一种实施方案中，所述抗体能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。在一种实施方案中，所述抗体抑制肿瘤细胞的体内生长。在一种实施方案中，所述抗体不增加巨噬细胞对正常血细胞的吞噬。在一种实施例方案中，所述抗体不具有显著血细胞凝集活性。
在一种实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。
在一种实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
在一种实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区；在一种优选的实施方案中，本发明所述抗体人源化改造所用骨架为IgG1，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一种实施方案中，人源化抗体的制备可采用如下的方法：
将鼠源抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据例如抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等等选出，所选的模板可以使多个序列的混合物或者可以使共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。最终确定人源化抗体的重链轻链可变区氨基酸序列。根据人源化抗体的氨基酸序列设计并合成可变区基因，并制备IgG1版本、IgG2版本或IgG4版本的人源化抗体。
本发明确定抗CD47单克隆抗体亚型的方法是提取杂交瘤细胞培养上清液，采用IsoStripTM小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Sino Biologicallnc，货号SEK003)鉴定抗体亚型。
在一种实施方案中，人鼠嵌合与CD47特异性结合的抗体，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示。
在一种实施方案中，人鼠嵌合与CD47特异性结合的抗体，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示。
在一种实施方案中，人鼠嵌合与CD47特异性结合的抗体，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示。
在一种实施方案中，人鼠嵌合与CD47特异性结合的抗体，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。
本发明的第三方面，提供一种核苷酸分子，编码如上所述的抗CD47单克隆抗体。
在一种实施方式中，所述核苷酸分子编码抗CD47单克隆抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示。在另一种实施方式中，所述核苷酸分子编码抗CD47单克隆抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示。在另一种实施方式中，所述核苷酸分子编码抗CD47单克隆抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO：37所示。在另一种实施方式中，所述核苷酸分子编码抗CD47单克隆抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示。
本发明的第四方面，提供了表达载体，包括本发明提供的编码抗CD47单克隆抗体的核苷酸分子。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
本发明的第五方面，提供了宿主细胞，转化本发明所述的表达载体。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。进一步举例可以是CHO细胞、BHK细胞或HEK293细胞；在一种优选的实施方案中，所述的宿主细胞为CHO细胞。
本发明的第六方面，提供了一种CD47单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养如上所述宿主细胞，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
所述宿主细胞在合适的表达条件下表达所述的抗人CD47单克隆抗体或者是通过杂交瘤技术获取稳定分泌抗人CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯化分组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其他各种液相层析技术及这些方法的结合。
在一种试验方案中，所述抗CD47抗体可通过如下方法制备：将目的基因序列及载体pCHO1.0均用限制性内切酶AvrII、BstZ17I酶切，并回收目的片段，用T4连接酶连接，构建表达载体。分别转化E.coli DH5α感受态，提取质粒获得重组表达质粒，用限制性内切酶PvuI进行线性化，转染CHO-S细胞，并用嘌呤霉素和MTX进行加压筛选，得到表达目的蛋白的细胞库，经过克隆化培养，表达量测定以及亲和力排序后最终筛选到表达所述抗体的单克隆细胞株；制备得到抗体蛋白后进一步纯化，测定抗体的纯度，测定纯化抗体的亲和力、血细胞凝集效果、SIRPα阻断效力和促吞噬作用。
在一种优选实施方案中，所述抗体纯化方法为亲和层析法，具体步骤为：首先制备proteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，将离心并过滤的细胞培养上清过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，用甘氨酸-盐酸缓冲溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析后备用。
在一种优选实施方案中，所述测定抗体纯度的方法为SDS-PAGE法，具体步骤为：按照中国药典2015年版第四部的方法进行电泳，电泳图扫描，鉴定其分子量和表达量。
在一种优选实施方案中，所述测定抗体亲和力的方法为ForteBio法，具体步骤为：ProteinA传感器固化纯化后的CD47抗体，将稀释后的CD47蛋白与固化CD47 ProteinA传感器结合，解离，分别得到结合常数，解离常数，最后得出CD47单克隆抗体的亲和力常数。
在一种优选实施方案中，所述测定抗体阻断人CD47与人SIRPα的结合的方法为ELISA法，在CD47抗体量增加的条件下监控重组SIRPα-his的结合。使用HRP偶联的抗his二抗确定结合的SIRPα。
在一种优选实施方案中，所述测定抗体促吞噬作用的方法为流式细胞术，具体步骤为：将巨噬细胞接种在细胞板中并使其附着24小时，用CFSE染料标记靶人类癌细胞(Jurkat)并与不同抗CD47单抗或无抗体共孵育，随后将其添加到巨噬细胞培养液中共同孵育，用PBS洗去未被吞噬的靶细胞，收集巨噬细胞，利用抗人CD14-APC对巨噬细胞进行染色，用流式细胞仪进行分析。
本发明所述抗CD47单克隆抗体、结合物和/或偶联物在制备阻断CD47与SIRPα结合的制剂中的应用，抗CD47单抗阻断CD47与SIRPα结合的EC50值较低，显示出较强的SIRPα阻断效力。
本发明所述抗CD47单克隆抗体、结合物和/或偶联物在促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用中的应用，该效果通过流式细胞术测定，结果以吞噬率表示。本发明提供抗体对jurkat细胞的吞噬率60％以上。
本发明的第七方面，提供如上所述抗CD47抗体在制备抗肿瘤治疗药物中的用途、或制备诊断肿瘤药物中的用途。
所述肿瘤治疗药物通过阻断CD47来促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的功能从而杀伤肿瘤细胞。
所述肿瘤治疗药物可以使以肿瘤细胞表面功能性表达的CD47抗原为靶标，结合或作用于CD47抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤包括但不限于肺癌、胃癌、宫颈癌、B淋巴瘤。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的抗CD47单克隆抗体，纯化后抗体纯度在95％以上；抗体抗凝集效果好，SIRPα阻断效力强；促吞噬作用明显；ForteBio检测抗体亲和力常数，KD值低于1×10- 11nM，抗体亲和力高。具有较强的吞噬功能，显示出较好的抗肿瘤效果。
附图说明
图1是CD47抗体的电泳图谱；
图2是CD47抗体与细胞表面抗原的结合活性曲线图。
图3A是CD47抗体剂量依赖性阻断人CD47与人SIRPa的结合曲线图1。
图3B是CD47抗体剂量依赖性阻断人CD47与人SIRPa的结合曲线图2。
图4是CD47抗体促进吞噬细胞的吞噬作用曲线图。
图5是血细胞凝集试验结果图。
具体实施方式
如本文所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体。
本文所用，“单克隆抗体”意指具有共同的重链氨基酸序列和共同的轻链氨基酸序列的抗体分子、抗体的制剂，这与含有不同氨基酸序列的抗体混合物的“多克隆”抗体制剂相反。应用于本发明的抗体源于单个拷贝或克隆，包括例如任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是产生它的方法。单克隆抗体可以通过几种已知技术产生，例如噬菌体技术、细菌、酵母或核糖体展示，以及由杂交瘤衍生的抗体举例说明的经典方法。因此术语(单克隆)指衍生自一个核酸克隆的所有抗体。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来获得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256:495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(US4816567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nather，352:624-628(1991)和Marks等，Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是由相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的可变区域重链的可变区相对。特殊的氨基酸在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本发明的抗体包括重组抗体。如本文所用“重组抗体”是指通过重组方法制造、表达产生或分离的抗体，例如用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体文库分离的抗体；从动物(例如小鼠)中分离的抗体，因其人免疫球蛋白基因而是转基因的；或以任何其他方式制造、表达、产生或分离的抗体，其中特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他DNA序列组装。用于抗体工程化和改进的当前方法的综述可见于例如P.Chsmes编辑，(2012)Antibody Engineering:Methods and Protocals,SecondEdition(Methods in Molecular Biology，Book 9070)，Humana Press等。重组抗体包括，例如嵌合抗体和人源化抗体。
“嵌合”蛋白质含有至少一个融合多肽，该融合多肽在序列中与自然界中所发生的位置不同的位置处包含区域。该区域在正常情况下可以存在于单独的蛋白质中，而在融合多肽中被放在一起；或者它们在正常情况下可以存在于同一蛋白质中，但在融合多肽中以新的布置放置。例如，嵌合蛋白质可以通过化学合成，或通过创建并翻译其中肽区域以所希望的关系进行编码的多核苷酸来构建。本文所用“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中来自哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的可变结构域的序列被移植到来源另一种哺乳动物物种(例如人)的种系的恒定结构域的序列上。
“结构域”是指蛋白质的一部分，它在物理上或功能上与该蛋白质或肽的其他部分区分开。物理上定义的结构域包括极具疏水性或亲水性的氨基酸序列，如那些膜结合的或细胞质结合的序列。结构域还可以通过例如由基因复制引起的内部同源性来定义。功能上定义的结构域具有不同的生物学功能。例如，受体的配体结合域是与配体结合的结构域。抗原结合域是指抗原结合单元与抗体中与抗原结合的部分。功能上定义的结构域不需要由连续的氨基酸序列编码。功能上定义的结构域可以含有一个或多个物理上定义的结构域。例如，受体通常被分为胞外配体结合域、跨膜结构域和胞内效应结构域。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为架构区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈p一折叠构型，由形成接连环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分p折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明载体的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于自然的、偶然的或有意的突变，该后代可以不必与原始亲本细胞(在形态学上或在基因组或总DNA互补性上)完全相同。宿主细胞包括在体内用本发明的载体转染的细胞。“宿主细胞”可以是指原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系，其可以用作或已经用作重组载体或其他转移多核苷酸的接受者，并且包括已经转染的原始细胞的后代。应当理解，由于自然的、偶然的或有意的突变，单细胞的后代可以不必在形态学上或在基因组或总DNA互补性上与原始亲本完全相同。
“载体”是一种核酸分子，优选自我复制性的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。该属于包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞中的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。“表达载体”指在引入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含能够用来产生所需表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
术语“治疗”在本文中用来泛指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果就完全或部分防止疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于该疾病的不良反应而言可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖在哺乳动物中对疾病的任何治疗，该哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类动物，包括人类和其他猿类，特别是人，并且该术语包括：(a)防止疾病或症状在可能易患该疾病或症状但尚未发生诊断的受试者中发生；(b)抑制疾病症状；(c)阻止疾病的发展；(d)缓解疾病症状；(e)引起疾病或症状消退；或其任意组合。
术语“癌症”、“肿瘤”和“癌”在本申请中可以互换，是指这样的细胞：它们表现出相对自主的生长，使得它们表现出异常生长表型，其特征在于细胞增殖的显著失控。通常，在本申请中用于监测或治疗的目标细胞包括癌前(例如良性)、恶性、转移前、转移性和非转移性细胞。
吞噬细胞是指能够吞噬的细胞。吞噬细胞的非限制性类别包括吞噬细胞、单个核细胞(例如，组织细胞和单核细胞)、多形核白细胞(例如嗜中性粒细胞)和树突细胞。
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
在实施例给出的数值范围内，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术以及相关领域的常规技术。除非另外说明以下述实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1鼠源抗体的获得
1、免疫程序
使用下列程序免疫五只7周龄雌性BALB/c或NZB/W小鼠。对小鼠以25μg蛋白抗原每只小鼠(总体积125μL每只小鼠)每3周腹膜内注射混合于CpG-ODN佐剂中的人CD47抗原。在第二次加强后7天通过隐静脉切口进行测试出血。该测试出血(免疫血清)通过间接ELISA测定法测试，以测定融合的最佳的两只应答小鼠。该小鼠可能需要第3次和第4次加强和加强后7天的另一次测试出血以评定融合前的滴度。当该抗体滴度足够高时，对该最佳的两只应答小鼠经由侧尾静脉给予最终的静脉内加强。在第IV次加强后四天，将小鼠安乐死用于融合。收获脾脏，且将从脾脏中分离的淋巴细胞用于融合过程中以产生杂交瘤。杂交瘤开发分离淋巴细胞且在聚乙二醇(PEG1500)的存在下依照标准罗氏方案与鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合。使用单步克隆方法(HAT选择)培养融合的细胞。此方法使用基于半固体甲基纤维素的HAT选择性培养基以使杂交瘤选择与克隆组合成一个步骤。单一细胞衍生的杂交瘤在半固体培养基上生长以形成单克隆集落。在融合事件后十天，将1154个所得的杂交瘤克隆转移至96孔组织培养板，并在含有HT的培养基中生长直至达到对数生长中期(5天)。
2、杂交瘤筛选
来自该1154个杂交瘤的组织培养上清液通过间接ELISA利用筛选的抗原(初级筛选)测试，且使用山羊抗IgG/IgM(H&L)-HRP二抗探测IgG和IgM抗体二者，并用TMB底物显色。在此测定中，取>0.2OD的克隆进行下一轮测试。利用筛选的抗原再测试阳性培养物以确认分泌，利用不相关抗原(人转铁蛋白)以消除非特异性或“粘性”单抗并排除假阳性。所有感兴趣的克隆通过抗体捕获ELISA进行同种型分析以确定它们是IgG还是IgM同种型。
3、杂交瘤细胞培养
在转移至96孔板后，将感兴趣的杂交瘤细胞系在24孔培养板中维持培养32天。这期间称为稳定期并测试克隆是否保持稳定和分泌。在此稳定期间，临时冷冻的细胞系备份由所有感兴趣的克隆组成，保存在-80℃(可存活6个月)。在此期间，定期地测试杂交瘤的分泌和特异性。
4、亚克隆
对顶级杂交瘤细胞系(克隆)亚克隆以确保单克隆性。通过使用单步克隆系统再次铺板亲本克隆来进行亚克隆。将24至90个亚克隆转移至96孔培养板。通过间接ELISA和抗体捕获ELISA筛选亚克隆。采用每个亲本的顶级亚克隆用于培养中的扩增。对任何<50％克隆的亲本克隆进行了第二轮的亚克隆。
实施例2抗CD47鼠源单克隆抗体的亚型鉴定及可变区扩增
1、抗体亚型鉴定
取杂交瘤细胞培养上清，采用IsoStripTM小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(SinoBiologicallnc，货号SEK003)鉴定抗体亚型。单克隆抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1亚型均为IgG1(Kappa)。
2、抗体可变区扩增
将候选杂交瘤细胞CD47-5A10、5G11、9C6、11F1分别培养至总数量107细胞，1000rpm离心10min收集细胞，并以试剂盒(Takara)提取总RNA，用反转录试剂盒primescript TMRT-PCR合成第一链cDNA，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区DNA序列。根据亚型鉴定结果，获取该抗体亚型的重链和轻链恒定区序列，涉及特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。杂交瘤克隆CD47-5A10、5G11、9C6、11F1分泌抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列如表1所示。
1)鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1的重链可变区的克隆
为设计鼠源抗体的人源化，首先须获得含候选鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1重链和轻链可变区编码序列的DNA片段。用mRNA纯化试剂盒(Takara)从小鼠杂交瘤细胞CD47-5A10、5G11、9C6、11F1分离出MRNA，依此制备cDNA(prime script TM RT-PCR试剂盒，Takara)。通过聚合酶链式反应(PCR)从cDNA中分离重链可变区DNA片段。PCR的5’-引物使用0.4μm的5'-CCTAGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(引物1)，PCR的3’(引物2)引物3’与小鼠IgG1重链恒定区同源反应。将胶纯化后得到的DNA片段克隆入PMDA19-T(simple)载体并测序，得到编码鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1重链的可变区核苷酸序列和氨基酸序列。鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：31-34所示；鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：23-26所示。
2)鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1的轻链可变区的克隆
以相似的PCR方法，使用5’引物5'-CCTAGGGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3'(引物3)和另一个与小鼠免疫球蛋白轻链恒定区同源反义的3’引物，即5'-CATATGGTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'(引物4)，从cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆入TOPO-TA载体并测序，得到编码CD47-5A10、5G11、9C6、11F1小鼠杂交瘤轻链的可变区核苷酸序列和氨基酸序列。鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：35-38所示；鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1氢链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：27-30所示。
实施例3抗CD47人鼠嵌合抗体制备
1、抗CD47人鼠嵌合抗体的制备
对鼠源抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1进行人源化研究以降低其免疫原性。将CD47-5A10、5G11、9C6、11F1的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据例如抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等选出，所选的模板可以使多个序列的混合物或者可以使共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。最终确定人源化5A10重链、轻链可变区氨基酸序列、人源化5G11重链、轻链可变区氨基酸序列、人源化9C6重链、轻链可变区氨基酸序列、人源化11F1重链轻链可变区氨基酸序列。根据人源化抗体的氨基酸序列设计并合成可变区基因，并制备IgG1版本的人源化抗体CD47-5A10-huIgG1、CD47-5G11-huIgG1、CD47-9C6-huIgG1、CD47-11F1-huIgG1。
CD47-5A10-huIgG1的嵌合抗体重链氨基酸序列(5A10加下划线)如SEQ ID NO.39所示。
SEQ ID NO.39：5A10-huIgG1-H
EVKLQESGPELVKPGASVKMSCTASGFTFTNYIIYWVRQEPGQGLEWIAYINPYNDDTEYNEKFKGKAT LTSDKSSTTVYMELSSLPSEDSAVYYCARGGIRAMDYWGQGTTVTVSSHMASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD47-5A10-huIgG1的嵌合抗体轻链氨基酸序列(5A10加下划线)如SEQ ID NO.40所示。
SEQ ID NO.40：5A10-huIgG1-L
GLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLAWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTEFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRAKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CD47-5G11-huIgG1的嵌合抗体重链氨基酸序列(5G11加下划线)如SEQ ID NO.41所示。
SEQ ID NO.41：5G11-huIgG1-H
EVKLQESGPELVKPGASVKISCKASGDSATGYYIHWVKQSPENSLEWIGEINPTSGGTSYSQKFKGKAT LSVDKSSSTVYMQLKSLTSEESAVYYCSGGYYAAYWGQGTTVTVSSHMASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD47-5G11-huIgG1的嵌合抗体轻链氨基酸序列(5G11加下划线)如SEQ ID NO.42所示。
SEQ ID NO.42：5G11-huIgG1-L
DIQLTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYSAKTLAAGVPSRFSGSGSGT QFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTIGPGTKLEKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CD47-9C6-huIgG1的嵌合抗体重链氨基酸序列(9C6加下划线)如SEQ ID NO.43所示。SEQ ID NO.43：9C6-huIgG1-H
EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGDSITGYYIHWVKQSPENSLEWIGEINPTSGGTSYSQKFKGKAT LSLDKSSTTVYMQLKSLTSEESAVYYCSGGYYAAYWGQGTTVTVSSHMASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD47-9C6-huIgG1的嵌合抗体轻链氨基酸序列(9C6加下划线)如SEQ ID NO.44所示。SEQ ID NO.44：9C6-huIgG1-L
DIQLTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYSAKTLAEGVPSRFSGSGSGT QFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTIGPGTKLEKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CD47-11F1-huIgG1的嵌合抗体重链氨基酸序列(11F1加下划线)如SEQ ID NO.45所示。SEQ ID NO.45：11F1-huIgG1-H
EVQLQESGPELVKPGASVKISCKSSDYSFTDYYIHWVKHSHVKSLEWIGRLNPYNGVTIYNQNFKDKAS LTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARSRRYGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD47-11F1-huIgG1的嵌合抗体轻链氨基酸序列(11F1加下划线)如SEQ ID NO.46所示。
SEQ ID NO.46：11F1-huIgG1-L
DIQLTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGR DYSFSISNLEPEDIATYYCLHYDNLRTFGGGTKLEKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人源化抗体CD47-5A10-huIgG1、CD47-5G11-huIgG1、CD47-9C6-huIgG1、CD47-11F1-huIgG1其重链及轻链可变区氨基酸序列如表1所示，其中CDR区以IMGT法定义。
Figure BDA0002454506990000161
Figure BDA0002454506990000171
Figure BDA0002454506990000181
2、抗人CD47抗体表达载体构建、表达、制备
(1)CD47抗体表达载体构建
根据上述获得的重链和轻链序列，设计编码CD47-5A10-huIgG1、CD47-5G11-huIgG1、CD47-9C6-huIgG1、CD47-11F1-huIgG1的cDNA插入到pCHO1.0真核表达载体中，构建人源化表达载体。该表达载体质粒含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期启动因子-增强子。同时，载体质粒中含有可选择标记基因，从而在细菌中赋予卡那青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予puromycin抗性。另外，载体质粒中含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)共扩增抗体基因和DHER基因。
(2)CD47抗体表达
将上述已构建的重组表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达人源化抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR缺陷型的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。优选的转染方法是脂质体转染，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降，电穿孔和原生质融合等。将测序正确的质粒菌液利用OMEGA试剂盒提取质粒，并用核酸内切酶PvuI进行线性化处理。将线性化后质粒浓缩至浓度在1μg/μl以上，用转染试剂FreestyleTM MAX进行转染。转染前24h将CHO-STM细胞传代至0.5×106/ml，转染时，调整细胞密度至1×106/ml。将50μg质粒和50μl Freestyle MAX分别加入OptiPRO-SFM至1.5ml，将转染试剂溶液加至质粒溶液混匀，室温静置10min后，缓慢滴加至细胞中，完成转染。转染2天后，加入含有20ug/mlpuromycin以及200nM MTX(Sigma)。为了实现较高水平的表达，用受MTX药物抑制的DHFR基因共扩增转染的抗体基因。用极限稀释亚克隆转染子及ELISA方法测定各细胞系的分泌率，选出高水平表达抗体的细胞株CD47-5A10–huIgG1-1B8、CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6。
(3)CD47抗体纯化
将步骤(2)获得的细胞株CD47-5A10–huIgG1-1B8，CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6扩大培养，并收集细胞培养上清。采用Protein A亲和层析法纯化抗体。首先制备ProteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，将离心并0.4μm滤膜过滤的细胞培养上清过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LpH7.5的甘氨酸-盐酸缓冲溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析后备用。所制备出的抗体分别命名为CD47-5A10–huIgG1-1B8，CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6。
实施例4 SDS-PAGE检测目的蛋白分子量和表达量
SDS-PAGE还原电泳检测目的蛋白大小及纯度。按照中国药典2015年版第四部的方法进行电泳，电泳图扫描结果见图1，鉴定单克隆抗体分子量和表达量。根据电泳结果，轻链约25KD、重链约50KD，蛋白纯度均大于95％。
实施例5抗人CD47嵌合抗体细胞表面抗原结合活性测定
将细胞表面表达人CD47跨膜蛋白的CHO-tm-CD47细胞接种于含10％FBS的1640培养基中，37℃，5.0％CO2培养。收集2×106/ml个对数生长期的CHO-tm-CD47细胞，DPBS洗两遍，96孔板每孔200μl细胞，加筛选得到的抗CD47单克隆抗体10μg/ml，37℃，5.0％CO2培养箱中，孵育1小时，PBS洗3次，加FITC标记荧光二抗10μg/ml，37℃，5.0％CO2培养箱中，孵育1小时，PBS洗3次，最后每孔加200μlPBS，流式细胞仪(Becton-Dickinson，SanJose，CA，US)检测抗体与CHO-tm-CD47细胞的结合活性。结果见表2和图2。阳性对照抗体为CC90002和Hu5F9，FlowJo软件分析抗体EC50结果。从表2结果可知，四种嵌合抗体的EC50值均小于对照抗体CC90002和Hu5F9。
表2抗体EC50值
抗体 EC50(ng/ml)
CD47-5A10-huIgG1-1B8 25.8
CD47-5G11-huIgG1-2E10 23.34
CD47-9C6-huIgG1-4B6 14.82
CD47-11F1-huIgG1-10G6 11.42
CC90002 31.63
Hu5F9 31.24
实施例6抗人CD47嵌合抗体亲和力测定
对于选定的抗人CD47人源化抗体CD47-5A10-huIgG1-1B8，CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-hu IgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6的亲和力测定是利用Fortebio技术，根据仪器Fortebio的说明书进行操作。在测定试验里，用Fortebio测目的蛋白亲和力。ProteinA传感器固化纯化后的CD47抗体，将CD47抗体蛋白倍比稀释6个浓度，与固化CD47ProteinA传感器结合，解离，分别得到结合常数、解离常数，最后得出CD47单克隆抗体的亲和力常数。处理得到的数据，用Fortebio的分析软件1:1结合的模型拟合试验数据，拟合数据与实验数据基本一致，得到结合和解离速率常数Ka和Kd，用Kd/Ka得到平衡解离常数KD，结果见表3。人源化抗体CD47-5A10、5G11、9C6、11F1的KD值小于1×10-11M，保留了亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，大大降低了其免疫原性。
表3嵌合抗体亲和力测定
抗体 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
CD47-5A10-huIgG1-1B8 4.85×10<sup>-12</sup> 7.85×10<sup>6</sup> 3.81×10<sup>-5</sup>
CD47-5G11-huIgG1-2E10 6.22×10<sup>-12</sup> 3.15×10<sup>6</sup> 1.96×10<sup>-5</sup>
CD47-9C6-huIgG1-4B6 1.29×10<sup>-12</sup> 8.53×10<sup>6</sup> 1.10×10<sup>-5</sup>
CD47-11F1-huIgG1-10G6 1.02×10<sup>-12</sup> 3.57×10<sup>6</sup> 3.64×10<sup>-</sup>5
CC90002 2.80×10<sup>-9</sup> 3.75×10<sup>5</sup> 1.04×10<sup>-3</sup>
Hu5F9 7.16×10<sup>-9</sup> 6.47×10<sup>4</sup> 4.63×10<sup>-4</sup>
实施例7抗CD47嵌合抗体剂量依赖性阻断人CD47与人SIRPa的结合
通过ELISA法测量CD47抗体的SIRPα-His的结合，包被：人CD47-hFc用PBS稀释成2μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔100μL，4℃下孵育过夜。封闭：洗板3次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，室温下孵育1小时。将抗体与SIRPα-His的混合：纯化的CD47-5A10-huIgG1-1B8，CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6抗体分别用PBST稀释成20μg/ml，以PBST溶液进行3倍梯度稀释，共稀释7个梯度：人SIRPα-His蛋白用PBST稀释成500ng/ml，1:1混合不同稀释梯度的抗体和SIRPα-his蛋白，室温下孵育30min。加入抗体与SIRPα-his蛋白的混合物：每孔100μL，室温下反应1h，对照孔加入IgG同种型对照Rituximab与人SIRP-his蛋白的混合物。加二抗：洗板3次后，加入抗His标签抗体，HRP(1:3000)，每孔100μL，室温条件下反应1小时。显色：洗板4次后，加TMB显色液，每孔100μL，室温下避光显色30分钟。终止：直接加终止液2.0M H2SO4终止反应，每孔100μL。检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据。数据处理：将原始数据输入到软件SoftMax Pro6.2.1中进行数据处理。结果如图3A、图3B和表4所示，根据表4可知，与市售抗体Hu5F9、专利提供的抗体CC90002相比较，本发明的抗体CD47-5A10-huIgG1-1B8，CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6均显示出增强的SIRPα阻断效力。
表4抗体阻断CD47与SIRPα结合的测定
抗体 EC50(ng/ml)
CD47-5A10-huIgG1-1B8 89.37
CD47-5G11-huIgG1-2E10 109.3
CD47-9C6-huIgG1-4B6 93.28
CD47-11F1-huIgG1-10G6 61.06
CC-90002 155.9
Hu5F9 146.8
实施例8抗CD47嵌合抗体促进吞噬细胞的吞噬作用
CD47是一种细胞表面受体，其在肿瘤细胞上上调并还被认为通过与其天然配体SIRR-α发生相互作用促进免疫逃逸。CD47与巨噬细胞上的SIRPα的结合导致吞噬活性下降。如下文详细所述，可以确定本发明所述抗CD47抗体的SIRPα阻断活性和CD47结合是否存在人巨噬细胞存在的情况下促进了肿瘤细胞吞噬作用。
PBMC分离自人血，通过在ATM-V培养基中培养7天，使单核细胞分化为巨噬细胞。这些单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)变得具有粘附力，其他细胞被清洗掉。刮下MDM并将其重新铺在12孔盘中，使其粘附24小时。选择人肿瘤细胞系Jurkat作为靶细胞类型，原因是其高CD47表达。使用0.3μM CFSE在37℃标记Jurkat细胞15分钟，随后清洗并将其以每个巨噬细胞四个肿瘤细胞的比例添加至MDM，并以多种浓度添加CD47抗体。对靶细胞进行3个小时的吞噬作用。随后使用PBS洗去未被吞噬的靶细胞。刮下剩余的巨噬细胞，使用针对偶联至DyLite 649的巨噬细胞标记CD14的抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。通过在FL4阳性(CD14+)的活细胞上门选随后评估FL1(CFSE+)阳性细胞百分比的方式测量吞噬作用。以巨噬细胞本底的吞噬率作为起始，计算出各个样品的吞噬率，结果见图4和表5。从表5可知，本发明的抗CD47-5A10–huIgG1-1B8，CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6抗体均具有较高的吞噬效果。
表5抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的测定试验
抗体 吞噬率/％
CD47-5A10-huIgG1-1B8 60
CD47-5G11-huIgG1-2E10 70
CD47-9C6-huIgG1-4B6 75
CD47-11F1-huIgG1-10G6 82
CC90002 50
Hu5F9 54
无抗体 6
实施例9血细胞凝集试验
红细胞表面高表达CD47，因此抗CD47单抗可以和红细胞表面的CD47特异性结合。由于每个抗体由两个抗原结合位点，因而抗CD47单抗可能导致红细胞凝集。导致红细胞凝集的单抗在体内会引起贫血、红细胞数量减少等副作用。抗CD47单抗是否导致红细胞凝集主要取决于单抗在CD47分子上的识别表位。本实施例利用经典的血凝试验对抗CD47单抗导致红细胞凝集的能力进行了分析。将实施例所得到的CD47-5A10-huIgG1-1B8、CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6抗体(均为40μg/ml)用PBS稀释进行一系列的倍比稀释，然后再微量血凝反应板中与制备的1％红细胞悬液混合，置于微量振荡器上振荡1min混匀。将微量血凝反应板于25℃室温精置1h后用照相记录红细胞凝集过程，并将微量血凝反应板倾斜45°角持续数分钟，通过红细胞流动速率快慢来进一步确定红细胞凝集程度。红细胞凝集程度可分为4个等级：4凝成均匀薄层，倾斜不流动；3凝成均匀薄层，倾斜有轻微流动；2凝成少量薄层，倾斜流动较快；1未有薄层形成，倾斜后与对照孔流动速度一样。结果如图5所示，人鼠嵌合抗体CD47-5A10-huIgG1-1B8、CD47-5G11-huIgG1-2E10、CD47-9C6-huIgG1-4B6、CD47-11F1-huIgG1-10G6抗体均不引起或不具有显著凝集。
序列表
<110> 鲁南制药集团股份有限公司
<120> 抗CD47单克隆抗体
<130> 2020
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 31
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ttggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcacgg cttctggatt cacattcact aactatatta tatactgggt gaggcaggag 120
cctggacagg gccttgagtg gattgcatat attaatccct acaatgatga tactgaatat 180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccac cacagtctac 240
atggagctca gcagcctgcc ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggga 300
ataagagcta tggactaccg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc acatatg 357
<210> 32
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaggtcaaac tgcaggagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtga ctcagccact ggctactaca tacactgggt gaagcaaagt 120
cctgaaaata gtcttgagtg gattggagag atcaatccta cttctggggg tactagctac 180
agccagaagt tcaagggcaa ggccacttta agtgtagata aatcctccag cacagtctha 240
catgcagctc aagagcctga catctgaaga gtctgcagtc tattactgtt ctggaggtta 300
ctacgcggct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcacata tg 352
<210> 33
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaggtccagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtga ctcaatcact ggctactaca tacactgggt gaagcaaagt 120
cctgaaaata gtcttgagtg gattggagag atcaatccta cttctggggg tactagctac 180
agccagaagt tcaagggcaa ggccacatta agtttagata aatcctccac cacagtctac 240
atgcagctca agagcctgac atctgaagag tctgcagtct attactgttc tggaggttac 300
tacgcggctt actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcacatat g 351
<210> 34
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaggtcaagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagt cttctgatta ctcattcact gactactaca tacactgggt gaagcacagc 120
catgtaaaga gccttgagtg gattggacgt ttaaatcctt acaatggtgt tactatctac 180
aaccagaatt tcaaggacaa ggccagcttg actgtagata agtcttccag cacagcctac 240
atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagatcgagg 300
aggtacgggg ctatggacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 35
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gggctgatgt tctggattcc tgcttccagc agtgatgtat tgatgaccca aactccactc 60
tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc tccatctctt gcagatctag tcagaccatt 120
gtacatagta atggaaacac ctatttagca tggtacctgc agaaaccagg ccagtctcca 180
aagctcctga tctacaaagt ctccaaccgg ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc 240
agtggatcag ggacagaatt cacactcaag atcagcagag tggaggctga ggatctggga 300
gtttattact gctttcaagg atcacatgtc ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg 360
gaaatcaaac gggct 375
<210> 36
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cctagggaca ttcagctgac ccagtctcca gcctccctat ctgcatctgt gggagaaact 60
gtcaccatca catgtcgagc aagtgagaat atttacagtt atttagcatg gtatcagcag 120
aaacagggaa aatctcctca gctcctggtc tatagtgcaa aaaccttagc agaaggtgtg 180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatcaggc acacagtttt ctctgaagat caatagcctg 240
cagcctgaag attttgggag ttattactgt caacatcatt atggaactcc gctcacgatc 300
ggtcctggga ccaagctgga gatc 324
<210> 37
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cctagggaca ttcagctgac ccagtctcca gcctccctat ctgcatctgt gggagaaact 60
gtcaccatca catgtcgagc aagtgagaat atttacagtt atttagcatg gtatcagcag 120
aaacagggaa aatctcctca gctcctggtc tatagtgcaa aaaccttagc agaaggtgtg 180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatcaggc acacagtttt ctctgaagat caatagcctg 240
cagcctgaag attttgggag ttattactgt caacatcatt atggaactcc gctcacgatc 300
ggtcctggga ccaagctgga gatc 324
<210> 38
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cctagggaca ttcagctgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctct gggaggcaaa 60
gtcaccatca cttgcaaggc aagccaagac attaacaagt atatagcttg gtaccaacac 120
aagcctggaa aaggtcctag gctgctcata cattacacat ctacattgca gccaggcatc 180
ccatcaaggt tcagtggaag tgggtctggg agagattatt ccttcagcat cagcaacctg 240
gagcctgaag atattgcaac ttattattgt ctacactatg ataatcttcg gacgttcggt 300
ggagggacca agctggagat cgaa 324

Claims (10)

1.一种抗CD47单克隆抗体，所述抗CD47抗体包括HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区；其中，
HCDR1的序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10；
HCDR2的序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11；
HCDR3的序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12；
LCDR1的序列为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20；
LCDR2的序列为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21；LCDR3的序列为SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：22。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的HCDR3；或，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR3；或，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR3；或，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的HCDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的LCDR3；或，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR3；或，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的LCDR3；或，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的LCDR3。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的的互补决定区如包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ IDNO：13所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的LCDR3；或者，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：19所示的LCDR3；或者，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQID NO：19所示的LCDR3；或者，
包括氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的LCDR3。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；或者，
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；或者，
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；或者，
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示。
6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；或，
其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示；或，
其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示；或，
其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。
7.一种核苷酸分子，编码如权利要求1-6任一项权利要求所述的抗CD47单克隆抗体。
8.一种表达载体，含有权利要求7所述的核苷酸分子。
9.一种宿主细胞，转化如权利要求8所述的表达载体。
10.如权利要求1-6任一项所述的CD47单克隆抗体在制备抗肿瘤治疗药物中的用途、或制备诊断肿瘤药物中的用途。
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