CN113912731A - 一种抗fgl1抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段及其用途以及药物组合物。本发明提供的抗FGL1抗体能够特异性地与FGL1结合，阻断FGL1与LAG‑3的结合，逆转FGL1对T细胞的抑制作用，激活T细胞分泌细胞因子。

Description

一种抗FGL1抗体及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，具体涉及一种抗FGL1抗体及其应用。
背景技术
LAG-3(淋巴细胞活化基因3)是一种免疫抑制受体，于1990年被发现(Triebel等，1990，J.Exp.Med.171：1393-4053)。它被鉴定为在活化的自然杀伤(NK)细胞和T淋巴细胞中选择性转录。LAG3蛋白是一种由498个氨基酸构成的I型膜蛋白，包括信号肽，细胞外区域，跨膜区域和细胞质区域，选择性表达在活化的T淋巴细胞、NK细胞和树突状细胞上。LAG-3蛋白由4种具有高度同源性的胞外免疫球蛋白超家族类似(IgSF-like)结构域(D1-D4)组成，其对T细胞的调节功能与PD-1类似，主要作为递送抑制信号的受体起作用。细胞外区域具有四个Ig结构域，并且整个蛋白质与CD4具有序列相似性。
LAG-3作为一种免疫抑制受体，主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHC-II)为典型配体；另外有两个预测配体，LSECtin(表达于黑色素瘤细胞)和Galectin-3(表达于肿瘤微环境中的基质细胞和CD8+T细胞)。然而，MHC-II亚型多，T细胞受体与HLA肽复合物的相互作用，是否仅对LAG-3的抑制功能负责也存在争议。LAG-3与MHC-II的相互作用阻止了相同的MHC分子与TCR和CD4的结合，从而抑制了TCR信号。且LAG-3与其他免疫检查点共同抑制T细胞活化，尤其是PD-1，靶向抑制性免疫检查点的拮抗剂抗体可以恢复T细胞功能。而LAG-3通过细胞质尾部的KIEELE基序传递抑制信号，所以，仅仅针对LAG-3开发单克隆抗体，药效并不是十分理想。
FGL-1(Fibrinogen-likeprotein1，纤维蛋白原样蛋白1，又名HPS)在正常生理条件下，主要由肝细胞分泌，并参与其有丝分裂和代谢功能。2019年4月人类证明了FGL1是LAG-3的抑制性功能配体，该配体独立于MHC-II，且FGL1-LAG-3信号通路独立于PD1通路。FGL1抑制抗原特异性T细胞活化，FGL1在小鼠体内的消除促进T细胞免疫。通过单克隆抗体阻断FGL1-LAG-3相互作用可以刺激肿瘤免疫并且以受体—配体相互依赖的方式治疗已建立的小鼠肿瘤。FGL1是人类癌细胞的高表达产物，肿瘤患者血浆中FGL1的升高与预后不良及抗PD1/PDL1治疗耐药有关。
本发明将FGL1作为免疫治疗的靶点，开发了新的抗FGL1抗体。
发明内容
针对现有问题的不足，在本申请中，发明人开发了具有良好性能的抗FGL1抗体，其能够特异性识别/结合FGL1，阻断FGL1与MHC II或LAG-3的结合，并且能够在体外/体内增强免疫细胞活性，刺激免疫应答。该抗FGL1抗体具有用于预防和/或治疗肿瘤、感染或自身免疫性疾病的潜力。
本发明的第一个目的是提供一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述抗FGL1抗体或其抗原结合片段的鼠源抗体、纳米抗体、嵌合抗体、全人抗体或人源化抗体。
本发明的第三个目的是提供上述抗FGL1抗体或其抗原结合片段的单特异性、双特异性、多特异性抗体、抗体偶联物或细胞治疗。
本发明的第四个目的是提供上述抗FGL1抗体或其抗原结合片段的编码基因。
本发明的第五个目的是提供上述抗FGL1抗体或其抗原结合片段的制备方法。
本发明的第六个目的是提供一种药物组合物。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合区域全部或部分包含在SEQ ID NO：163所述的氨基酸序列内。
优选的，所述抗体或其抗原结合片段以1nM或更小的KD结合FGL1。
更优选的，所述抗体或其抗原结合片段以1pM或更小的KD结合FGL1。
优选的，所述抗体为鼠源抗体、纳米抗体、嵌合抗体、全人抗体或人源化抗体。
优选的，所述抗体为单特异性、双特异性、多特异性抗体、抗体偶联物或细胞治疗。
优选的，所述抗体偶联物为细胞毒性部分、放射性同位素、药物或细胞因子。
优选的，所述双特异性抗体包括上述任一所述的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
更优选的，所述双特异性抗体为抗FGL1/CD3双特异性抗体、抗FGL1/PD-1双特异性抗体、抗FGL1/PD-L1双特异性抗体或抗FGL1/CD16A双特异性抗体。
优选的，所述抗体为单克隆抗体。
一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，
(a)重链可变区的CDR1，选自SEQ ID NO：37-44的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：37-44的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：37-44的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的CDR2，选自SEQ ID NO：47-54的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：47-54的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：47-54的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的CDR3，选自SEQ ID NO：57-64的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：57-64的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：57-64的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(d)轻链可变区的CDR1，选自SEQ ID NO：67-74的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：67-74的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：67-74的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)轻链可变区的CDR2，选自SEQ ID NO：75-82的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：75-82的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：75-82的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(f)轻链可变区的CDR3，选自SEQ ID NO：83-90的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：83-90的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：83-90的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
优选的，所述重链可变区还包括框架区FR，所述的框架区FR包括：
(a)选自SEQ ID NO：91-98任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：91-98给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：91-98的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR1，
(b)选自SEQ ID NO：101-108任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：101-108给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：101-108的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR2，
(c)选自SEQ ID NO：111-118任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：111-118给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：111-118的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR3，
和
(d)选自SEQ ID NO：121-128任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：121-128给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与选自SEQ ID NO：121-128的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR4；
优选的，所述轻链可变区还包括框架区FR，所述的框架区FR包括：
(e)选自SEQ ID NO：131-138任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：131-138给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：131-138的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR1，
(f)选自SEQ ID NO：139-146任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：139-146给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：139-146的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR2，
(g)选自SEQ ID NO：147-154任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：147-154给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：147-154的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR3，
和
(h)选自SEQ ID NO：155-162任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：155-162给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与选自SEQ ID NO：155-162的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：57组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：83组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：91所示的FR1、SEQ ID NO：101所示的FR2、SEQ ID NO：111所示的FR3和SEQ ID NO：121所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：131所示的FR1、SEQ ID NO：139所示的FR2、SEQ ID NO：147所示的FR3和SEQ ID NO：155所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：58组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：84组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：92所示的FR1、SEQ ID NO：102所示的FR2、SEQ ID NO：112所示的FR3和SEQ ID NO：122所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：132所示的FR1、SEQ ID NO：140所示的FR2、SEQ ID NO：148所示的FR3和SEQ ID NO：156所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：59组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：85组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：93所示的FR1、SEQ ID NO：103所示的FR2、SEQ ID NO：113所示的FR3和SEQ ID NO：123所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：133所示的FR1、SEQ ID NO：141所示的FR2、SEQ ID NO：149所示的FR3和SEQ ID NO：157所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：60组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：86组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：94所示的FR1、SEQ ID NO：104所示的FR2、SEQ ID NO：114所示的FR3和SEQ ID NO：124所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：134所示的FR1、SEQ ID NO：142所示的FR2、SEQ ID NO：150所示的FR3和SEQ ID NO：158所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：61组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：71、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：87组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：95所示的FR1、SEQ ID NO：105所示的FR2、SEQ ID NO：115所示的FR3和SEQ ID NO：125所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：135所示的FR1、SEQ ID NO：143所示的FR2、SEQ ID NO：151所示的FR3和SEQ ID NO：159所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：62组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：72、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：88组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：96所示的FR1、SEQ ID NO：106所示的FR2、SEQ ID NO：116所示的FR3和SEQ ID NO：126所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：136所示的FR1、SEQ ID NO：144所示的FR2、SEQ ID NO：152所示的FR3和SEQ ID NO：160所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：63组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：89组成；
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：97所示的FR1、SEQ ID NO：107所示的FR2、SEQ ID NO：117所示的FR3和SEQ ID NO：127所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：137所示的FR1、SEQ ID NO：145所示的FR2、SEQ ID NO：153所示的FR3和SEQ ID NO：161所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：64组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：90组成。
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：98所示的FR1、SEQ ID NO：108所示的FR2、SEQ ID NO：118所示的FR3和SEQ ID NO：128所示的FR4。
更优选的，所述轻链可变区包括框架区FR和上述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：138所示的FR1、SEQ ID NO：146所示的FR2、SEQ ID NO：154所示的FR3和SEQ ID NO：162所示的FR4。
一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，
(a)重链可变区的CDR1，选自SEQ ID NO：45-46的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：45-46的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：45-46的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的CDR2，选自SEQ ID NO：55-56的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：55-56的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：55-56的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的CDR3，选自SEQ ID NO：65-66的任一氨基酸序列，或与SEQ IDNO：65-66的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：65-66的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
优选的，所述重链可变区还包括框架区FR，所述的框架区FR包括：
(a)选自SEQ ID NO：99-100任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：99-100给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：99-100的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR1，
(b)选自SEQ ID NO：109-110任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：109-110给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：109-110的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR2。
(c)选自SEQ ID NO：119-120任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：119-120给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：119-120的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR3，
和
(d)选自SEQ ID NO：129-130任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：129-130给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与选自SEQ ID NO：129-130的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：65组成。
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：99所示的FR1、SEQ ID NO：109所示的FR2、SEQ ID NO：119所示的FR3和SEQ ID NO：129所示的FR4。
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：66组成。
更优选的，所述重链可变区包括框架区FR和上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；更加优选的，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO：100所示的FR1、SEQ ID NO：110所示的FR2、SEQ ID NO：120所示的FR3和SEQ ID NO：130所示的FR4。
一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区；其特征在于，其中：
所述重链可变区具有SEQ ID NO：1-8给出的任一氨基酸序列，
或与SEQ ID NO：1-8给出的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，
或与SEQ ID NO：1-8的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO：21-28给出的任一氨基酸序列；
或与SEQ ID NO：21-28给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，
或与SEQ ID NO：21-28的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
优选的，所述重链可变区和轻链可变区选自如下(1)-(8)中的任一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：21；
(2)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：22；
(3)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：23；
(4)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：24；
(5)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：25；
(6)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：26；
(7)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：27；
(8)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：28。
一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区；其中：
所述重链可变区具有SEQ ID NO：9-10给出的任一氨基酸序列，
或与SEQ ID NO：9-10给出的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，
或与SEQ ID NO：9-10的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
优选的，所述重链可变区选自SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
本发明公开融合蛋白，其包含上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明公开编码上述任一所述的抗FGL1抗体的基因。优选的，所述基因选自如下(1)-(10)中的任一种：
(1)含有如SEQ ID NO：11所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：29所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(2)含有如SEQ ID NO：12所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：30所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(3)含有如SEQ ID NO：13所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：31所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(4)含有如SEQ ID NO：14所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：32所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(5)含有如SEQ ID NO：15所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：33所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(6)含有如SEQ ID NO：16所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：34所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(7)含有如SEQ ID NO：17所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：35所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(8)含有如SEQ ID NO：18所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQID NO：36所示的编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(9)含有如SEQ ID NO：19所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列；
(10)含有如SEQ ID NO：20所述的编码抗体重链可变区的核苷酸序列。
本发明公开上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明公开上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗FGL1抗体中的应用。
本发明公开上述任一所述的抗体或其抗原结合片段在如下(a)和/或(b)和/或(c)中的应用：
(a)抑制癌细胞迁移的药物中的应用；
(b)治疗癌症的药物中的应用；
(c)治疗自身免疫病药物中的应用。
优选的，所述药物可以与一种或多种药物同时、分开或依次施用。
本发明公开一种药物组合物，其包含上述抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。
本发明公开上述抗体或其抗原结合片段，在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明公开上述抗体或其抗原结合片段，在制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌为肺癌、肝癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、头颈癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。
缩写及术语定义
在本文中使用以下缩写：
CDR：抗体可变区中的互补决定区
FR：抗体构架区，即抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH：抗体重链可变区
VL：抗体轻链可变区
IgG：免疫球蛋白G
mAb：单克隆抗体
ELISA：酶联免疫吸附测定
FACS：荧光激活细胞分选术
PCR：聚合酶链式反应
IL-2：白细胞介素2
IFN：干扰素
在本说明书中，术语“抗体”可以指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成而制备的免疫球蛋白。抗体可从天然存在该抗体的血浆或血清等的天然资源、或者产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中、动物免疫血清中、噬菌体文库、噬菌体展示小鼠免疫抗体库、噬菌体展示羊驼免疫库、人天然噬菌体展示抗体库等筛选进行重建得到分离。备选地，可通过使用基因重组等的技术部分或完全地合成。优选的抗体包括，例如，免疫球蛋白的同种型或这些同种型的亚类的抗体。已知人免疫球蛋白包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类别(同种型)。在这些同种型中，本发明的抗体可以包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。
在一些实施例中，本说明书中所使用的“抗体”由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成，或者只有轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
在一些实施例中，本说明书术语“抗体”指只包含重链的单域抗体，其包括全长抗体、单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合免疫球蛋白”或“嵌合抗体”是指其可变区衍生自第一物种而其恒定区衍生自第二物种的免疫球蛋白或抗体。嵌合免疫球蛋白或抗体可以例如通过基因工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构建。
术语“人天然噬菌体展示抗体库筛选”，是以靶蛋白或过表达细胞株作为抗原，进行人天然噬菌体展示抗体库海选。根据海选结果，挑取足够数量单克隆进行初筛，挑取阳性克隆进行测序，并进行序列多样性分析，挑选出序列特异性的抗体克隆，之后进行抗体样品制备。本说明书中“人天然噬菌体展示抗体库”和“人天然库”可互换使用。术语“噬菌体展示羊驼免疫库筛选”，是以靶蛋白或过表达细胞株作为抗原，免疫羊驼，优选免疫效价高的羊驼PBMC细胞进行免疫库构建。以靶蛋白或过表达细胞株作为抗原，进行羊驼纳米抗体噬菌体展示抗体库海选，挑取足够数量单克隆进行初筛，挑取阳性克隆进行测序，并进行序列多样性分析，挑选出序列特异性的抗体克隆，之后进行抗体样品制备。本说明书中“噬菌体展示羊驼免疫库”和“羊驼噬菌体文库”可互换使用。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的多肽片段，例如全长抗体的多肽片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(如技术来自Ablynx)、结构域抗体(如技术来自Domantis)、和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和各种类型的润湿剂。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即是所利用的宿主细胞外来的，例如由细菌细胞产生的人多肽。本文将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。本文所述抗体中氨基酸位置的编号(例如Fc区的氨基酸残基)和目标区域，例如CDR，使用Kabat系统。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,Clustal W,Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。
短语“包含具有FGL1结合活性的抗体可变区的结构域”是指以下抗体部分，其包含特异性结合上述FGL1蛋白或FGL1蛋白的部分肽的全部或部分并且还与其互补的区域。可以从一种或多种抗体的可变结构域提供包含抗体可变区的结构域。优选地，包含抗体可变区的结构域包含抗体轻链和重链可变区(VL和VH)。此种包含抗体可变区的结构域的合适的实例包括“单链Fv(scFv)”、“单链抗体”、“Fv”、“单链Fv 2(scFv2)”、“Fab”、“F(ab)2”、“VHH”等。
“特异性”表示参与特异性结合的分子之一不显示任何与不同于结合伙伴分子中的一个或数个的分子的显著结合。此外，在含抗体可变区的结构域对抗原中的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该术语。当含抗体可变区的结构域所结合的表位被包含在数个不同抗原中时，包含含抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以结合具有所述表位的各种抗原。
“表位”意指抗原中的抗原决定簇，并且是指在本说明书中公开的包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域所结合的抗原位点。因此，例如可以根据其结构来定义表位。另外，也可以根据识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。当抗原是肽或多肽时，表位可以由形成表位的氨基酸残基指定。或者，当表位是糖链时，表位可以通过其特定的糖链结构来确定。
例如，下面可以确认包含含有具有FGL1结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子对FGL1分子中存在的线性表位的识别。为了上述目的，合成包含构成FGL1细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。所述肽可以是化学合成的。备选地，其可以通过使用编码对应于胞外结构域的氨基酸序列的FGL1的cDNA中的区域的遗传工程方法获得。接下来，评估包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽和包含含有具有FGL1结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子之间的结合活性。例如，使用固定的线性肽作为抗原的ELISA能够评估抗原结合分子对肽的结合活性。备选地,可以基于线性肽在抗原结合分子与表达FGL1的细胞的结合中引起的抑制水平来阐明对线性肽的结合活性。这些测试可以阐明抗原结合分子对线性肽的结合活性。
此外，以下可以确认包含具有FGL1结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子对表位的三维结构的识别。制备表达FGL1的细胞以用于上述目的。例如，当包含具有FGL1结合活性的抗体可变区的结构域的测试抗原结合分子接触表达FGL1的细胞时，其与所述细胞紧密结合，但是另一方面，存在这样的情况，其中抗原结合分子基本上不结合固定的包含构成FGL1的胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。在这些情况中，“基本上不结合”是指，相对于对表达人FGL1的细胞的结合活性，结合活性为80％以下，通常为50％以下,优选为30％以下，并且特别优选为15％以下。
作为测定含有FGL1抗原结合结构域的测试抗原结合分子与表达FGL1的细胞的结合活性的方法，例如可以举出：Antibodies：A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。BR，可以基于使用表达FGL1的细胞为抗原的ELISA或荧光激活细胞分选术(FACS)的原理进行评价。
本发明的抗原结合分子中的含抗体可变区的结构域可以结合相同的表位。本文中，相同的表位可以存在于包含SEQ ID N0:163氨基酸序列的蛋白质中。备选地，本发明的抗原结合分子中的含抗体可变区的结构域可以分别结合不同的表位。本文中，不同的表位可以存在于包含SEQ ID N0:163的氨基酸序列的蛋白质中。
更加优选的，本申请公开了一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合表位，所述表位全部或部分包含在SEQ ID NO：163所述的氨基酸序列内。
制作具有所需结合活性的抗体的方法是本领域技术人员已知的。下面为与纤维蛋白原样蛋白1，又名HPS的FGL1结合的抗体(抗FGL1抗体)的制作方法之一。
抗FGL1抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗FGL1抗体，可以优选制备来源于哺乳动物的单克隆抗体。这些来源于哺乳动物的单克隆抗体包含由杂交瘤产生的抗体、噬菌体表面展示技术筛选得到产生或由宿主细胞所产生的抗体，所述宿主细胞通过基因工程技术用携带抗体基因的表达载体转化。
产生单克隆抗体的杂交瘤，可以通过使用公知技术，例如以如下方式来制作。具体地，使用FGL1蛋白质作为致敏性抗原，按照常规的免疫方法对哺乳动物进行免疫。利用常规的细胞融合法使获得的免疫细胞与公知的亲本细胞相融合。然后，利用常规的筛选法，通过筛选产生单克隆抗体的细胞，可以选择产生抗FGL1抗体的杂交瘤。
具体而言，单克隆抗体的制作以如下方式来进行。首先，从常规生化试剂商店购买得到FGL1蛋白质。将FGL1蛋白用作致敏性抗原以用于哺乳动物中的免疫。FGL1的部分肽也可被用作致敏性抗原。在此情况中，所述部分肽也可以通过化学合成自人FGL1氨基酸序列获得。此外，其也可以通过将FGL1基因的一部分整合到表达载体中并将其表达而获得。此外，其也可以通过使用蛋白酶将FGL1蛋白降解获得，但是用作部分肽的FGL1肽的区域和尺寸不特别地受限于具体实施方案。组成被用作致敏性抗原的肽的氨基酸的数目为至少五个以上，或优选地例如，六个以上，或七个以上。更具体地，由8至50个残基或优选地10至30个残基组成的肽可被用作致敏性抗原。
备选地，可以将FGL1蛋白质的所需的部分多肽或肽与不同的多肽融合而成的融合蛋白质作为致敏性抗原来利用。为了制备用作致敏性抗原的融合蛋白质，例如可以优选利用抗体的Fc片段和肽标签等。表达融合蛋白质的载体可以通过使编码所需的两种或其以上的多肽片段的基因在符合读框内进行融合，并将该融合基因如上述插入到表达载体中来制作。融合蛋白质的制作方法记载于Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J等,MolecularCloning 2nd ed.,9.47～9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.Press)中。用作致敏性抗原的FGL1的获得方法和使用FGL1的免疫方法也具体地记载于W02003/000883、W02004/022754、W02006/006693中。
作为用该致敏性抗原免疫的哺乳动物，不限于特定的动物。但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来进行选择。一般来说优选使用啮齿类的动物如小鼠、大鼠和仓鼠、羊驼、兔和猴。
按照公知的方法利用致敏性抗原对上述的动物进行免疫。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内、足底或皮下注射给予致敏性抗原来实施免疫。具体地，用PBS(磷酸盐缓冲盐水)，生理盐水等适当稀释致敏抗原。如果需要，将常规佐剂如弗氏完全佐剂与抗原混合，并将混合物乳化。然后，以4至21天的间隔将致敏抗原多次给予哺乳动物。在致敏性抗原的免疫时可以使用适当的载体，特别是在使用分子量较小的部分肽作为致敏性抗原的情况下，将与白蛋白、钥孔虫戚血兰素(KIH)等的载体蛋白质结合而成的该致敏性抗原肽用于免疫有时也为理想的情况。
另外，产生所需抗体的杂交瘤也可以使用DNA免疫以如下方式来制作。DNA免疫是指，在施用了已在免疫动物中使编码抗原蛋白质的基因能够表达的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，通过使致敏性抗原在该免疫动物的活体内表达，而赋予免疫刺激的免疫方法。与对免疫动物施用蛋白质抗原的一般免疫方法相比较，DNA免疫期待以下的优越性：维持FGL1这样的蛋白质的结构而能够赋予免疫刺激；以及无需纯化免疫抗原。
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物施用表达FGL1蛋白质的DNA。编码FGL1的DNA可以通过PCR等公知的方法来合成。所得FGL1被插入到适当的表达载体中，并对免疫动物进行施用。作为表达载体，可以适合利用例如PCDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体施用到活体内的方法，可以利用通常使用的方法。例如，通过将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入到免疫动物个体的细胞内来进行DNA免疫。识别FGL1的抗体的制作也可以使用国际公开W0 2003/104453所记载的方法来制作。
在如上所述免疫哺乳动物后，在血清中证实了FGL1结合抗体滴度的增加。然后，从哺乳动物收集免疫细胞，然后进行细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别是可以使用脾细胞。
作为与上述免疫细胞相融合的细胞，可以使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记。选择标记是指在特定的培养条件下能够(或者不能够)存活的特性。公知的选择标记有：缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(以下省略为缺乏HGPRT)、或者缺乏胸苷激酶(以下省略为缺乏TK)等。具有缺乏HGPRT或TK的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下省略为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞虽然在HAT选择培养中不能进行DNA合成而死亡。但如果与正常的细胞相融合，则利用正常细胞的补救途径可以持续DNA的合成，因此在HAT选择培养中也可以增殖。
缺乏HGPRT或缺乏TK的细胞分别可以在含有6-硫鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下省略为8AG)、或者5'-溴脱氧尿苷的培养基中选择。将这些嘧啶类似物摄入到DNA中的正常细胞将死亡。同时，不摄入这些嘧啶类似物的、缺乏这些酶的细胞可以在选择培养中存活。此外被称为G418抗性的选择标记通过新霉素抗性基因赋予对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适合于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。
例如，可以优选使用包括以下细胞的骨髓瘤细胞:P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)；
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)；
NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6⑺，511-519)；
MPC-11(Cell(1976)8⑶,405-415)；
SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)；
F0(J.Immunol.Methods(1980)35(1～2),1-21)；
S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)；
R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上是按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(MethodsEnzymol.(1981)73,3-46)等，来进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体而言，例如可以在细胞融合促进剂的存在下，在常规的营养培养液中实施上述细胞融合。融合促进剂包括例如聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)。根据需要可以添加例如二甲基亚砜等的辅助剂以进一步提高融合效率。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞优选使用1～10倍的免疫细胞。作为用于上述细胞融合的培养液，可以使用例如适合于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及该种的细胞培养中使用的常规的培养液。并且可以适合添加胎牛血清(FCS)等的血清补液。
就细胞融合而言，可以将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合。再以通常30％～60％(w/v)的浓度添加预先加热到37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1,000～6,000左右)。通过对混合液进行缓慢混合可以形成所需的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐渐添加上述例举的适当培养液到细胞中，并且将其重复离心以除去上清。可以除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
如此获得的杂交瘤可以用常规的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述HAT培养液的培养持续到所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的足够时间。通常，所述足够的时间为数天至数周。接着，可以利用常规的有限稀释法实施产生所需抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
如此获得的杂交瘤可以通过利用基于在细胞融合中使用的骨髓瘤所具有的选择标记的选择培养液来进行选择。例如具有缺乏HGPRT或TK的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。即，在将HAT敏感性的骨髓瘤细胞用于细胞融合的情况下，在HAT培养液中，与正常细胞成功进行细胞融合的细胞可以选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养持续到使所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的足够时间。具体而言，通常可以通过数天至数周的培养，选择所需的杂交瘤。接着，可以利用常规的有限稀释法实施产生所需抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
可以通过基于抗原抗体反应的公知筛选方法来实施所需抗体的筛选和单一克隆。例如，结合于FGL1的单克隆抗体，可以结合于在细胞表面表达的FGL1。这样的单克隆抗体，例如可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)进行筛选。FACS是指通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞，测定各细胞所发出的荧光进而使结合于细胞表面的抗体的测定成为可能的系统。
为了通过FACS对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达FGL1的细胞。用于筛选的优选细胞为强制表达FGL1的哺乳动物细胞。用作对照，可以使用未转化的哺乳动物细胞作为宿主细胞来选择性地检测对细胞表面的FGL1的抗体的结合活性。即，通过选择产生不结合于宿主细胞、结合于强制表达FGL1的细胞的抗体的杂交瘤，可以获得产生抗FGL1抗体的杂交瘤。
备选地，抗体对于固定的表达FGL1的细胞的结合活性可以基于ELISA的原理进行评价。例如，使表达FGL1的细胞固定在ELISA板的孔内。通过使杂交瘤的培养上清与孔内的固定的细胞相接触，来检测结合于固定细胞上的抗体。当单克隆抗体为小鼠由来的情况下，结合于细胞上的抗体可以通过抗小鼠免疫球蛋白抗体来检测。通过上述筛选而选择的、具有抗原结合能的、产生所需抗体的杂交瘤，可以通过有限稀释法等进行克隆。
如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中继代培养。另外，该杂交瘤可以在液态氮中长期保存。
将该杂交瘤按照常规的方法进行培养，可以从其培养上清中获得所需的单克隆抗体。或者将杂交瘤施用于与其具有适应性的哺乳动物并进行增殖，可以从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适合于获得高纯度的抗体。
由从该杂交瘤等的抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体也可以被适合地利用。通过将克隆的抗体基因插入到适当的载体并导入到宿主中，由该基因所编码的抗体得以表达。用于抗体基因的分离、向载体插入基因、以及宿主细胞的转化的方法，例如通过Vandamme等人已经确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。如下所述，重组抗体的制备方法也是公知的。
例如，可以从表达抗FGL1抗体的杂交瘤细胞中制备编码抗FGL1抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，可以利用例如以下所述的方法：
胍超速离心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)；和AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)。所提取的mRNA可以使用mRNA提纯试剂盒(GEHealthcare Bioscience)等来进行纯化。或者，如QuickPrep mRNA提纯试剂盒(GEHealthcare Bioscience)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒也得以市售。可以使用这样的试剂盒从杂交瘤中获得mRNA。可以使用逆转录酶由所制备的mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可以使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA SynthesisKit(生化学工业社)等来合成。另外，为了合成和扩增cDNA，可以适当利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)和基于PCR的5'-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002；Nucleic Acids Res.(1989)17⑻,2919-2932)。并且，在这样的cDNA的合成的过程中，可以在cDNA的两末端导入后述的适当的限制酶位点。
由所得PCR产物纯化作为目标的cDNA片段，接着使其与载体DNA相连接。如此，重组载体得以制作，将其导入到大肠杆菌等中。选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所需的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有作为目标的cDNA核苷酸序列，可以利用公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了分离编码可变区的基因，利用使用了可变区基因扩增用引物的5'-RACE法是简便的。首先以由杂交瘤细胞提取的RNA为模板合成cDNA,获得5'-RACE cDNA文库。可以适当使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒来合成5'-RACE cDNA文库。
以所得5'-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列可以设计小鼠抗体基因扩增用引物。这些引物的核苷酸序列依赖于免疫球蛋白的亚类而不同。因此，优选地是预先使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(RocheDiagnostics)等的市售试剂盒来决定亚类。
具体而言，可以利用能够扩增编码作为重链的Y1、Y 2a、Y 2b、Y 3作为轻链的k链和&链的基因的引物以分离编码小鼠IgG的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常可以利用在与可变区相近的恒定区位点退火的引物作为3'侧引物。另一方面，连接到5'RACE cDNA文库构建试剂盒的引物用作5'侧引物。
利用如此扩增的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合而组成的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白的FGL1结合活性为指标，可以筛选所需的抗体。例如以分离对抗FGL1的抗体为目的时，进一步优选的是抗体与FGL1的结合为特异性的。与FGL1结合的抗体例如可以通过以下步骤进行筛选：
(1)将含有由杂交瘤分离的cDNA所编码的V区的抗体与FGL1的细胞相接触；
(2)检测表达FGL1的细胞与抗体结合；和
(3)选择与表达FGL1的细胞结合的抗体。
检测抗体与表达FGL1的细胞结合的方法是公知的。具体而言，能够通过前面所述的FACS等技术检测到抗体与表达FGL1的细胞的结合。为了评价抗体的结合活性可以适当利用表达FGL1的细胞的固定样品。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法还包括使用噬菌体载体的淘选方法。在抗体基因是从表达多克隆抗体的细胞群的重链和轻链亚类文库分离的情况下，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可以通过用适当的接头序列进行连接来形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入到噬菌体载体可以获得scFv呈现于表面的噬菌体。该噬菌体与目的抗原接触。通过收集与抗原结合的噬菌体,可以分离编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该过程，可以浓缩具有所需结合活性的scFv。
分离编码目标抗FGL1抗体的V区的cDNA后，通过识别插入到该cDNA两末端的限制酶位点的限制酶来消化该cDNA。优选的限制酶识别并切割出现在抗体基因的核苷酸序列中的频率低的核苷酸序列。并且优选将赋予粘性末端的限制酶切位点导入到载体中以将单拷贝的消化片段以正确的方向插入。如上所述消化编码抗FGL1抗体的V区的cDNA，并将其插入合适的表达载体中以构建抗体表达载体。在这种情况下，如果编码抗体恒定区(C区)的基因和编码上述V区的基因符合读框地融合，则获得嵌合抗体。本文中，“嵌合抗体”是指恒定区的起点不同于可变区的起点。因此，除了小鼠-人等的异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过向已经具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，切除上述V区基因的限制酶的识别序列可以适当地置于携带编码所需抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5'侧。通过使利用相同组合的限制酶消化的两基因符合读框的融合来构建嵌合抗体表达载体。
为了制备抗FGL1抗体，抗体基因被插入到表达载体中使所述基因在表达控制区的控制下表达。用于表达抗体的表达控制区包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基末端附加适当的信号序列使得表达的抗体分泌到细胞外。此外还附接其他适合的信号序列。所表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切割，并且产生的多肽可以作为成熟多肽分泌到细胞外。接着，通过用该表达载体来转化适当的宿主细胞，可以获得表达编码抗FGL1抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别被插入到不同的表达载体中。通过用插入有H链和L链的载体共转染相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者能够利用其中插入编码H链和L链的DNA的单一表达载体转化宿主细胞(参照国际公开W0 94/11523)。
通过将所分离的抗体基因导入到适当的宿主用来制备抗体的宿主细胞/表达载体的各自组合是公知的。这些表达系统均可以应用于包含本发明的抗体可变区的结构域的分离。用作宿主细胞的适当的真核细胞包括动物细胞、植物细胞、或者真菌细胞。具体而言，动物细胞包括例如以下细胞：
(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、Hela、Vero等；
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等；
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
此外，作为植物细胞，使用来源于烟草(Nicotiana)属如烟草(Nicotianatabacum)的细胞的抗体基因表达系统是已知的。愈伤组织培养的细胞可以适当地用于转化植物细胞。
此外，以下细胞可用作真菌细胞：
酵母：酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；
丝状真菌：曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)。
另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞的情况下，可以适当利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等的细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入包含目标抗体基因的表达载体。通过将所转化的细胞在体外进行培养，可以从该转化细胞的培养物中获得所需的抗体。
除了上述宿主细胞外，转基因动物也可用于产生重组抗体。即，从导入了编码所需抗体的基因的动物可以获得该抗体。例如，抗体基因可以通过符合读框的插入到编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部来构建融合基因。作为分泌到乳汁中的蛋白质，可以利用例如山羊B酪蛋白等。含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段被注入到山羊的胚胎中，并且然后该胚胎被导入到雌性山羊体内。由接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中可以作为与乳汁蛋白质的融合蛋白质获得所需抗体。另外，为了使转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊施用激素(Ebert,K.M等，Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
当将本文中所述的抗原结合分子施用于人时，来源于已被人工修饰而减小针对人等的异源抗原性的遗传重组抗体的结构域可被合适地用作包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域。此种遗传重组的抗体包括，例如，人源化抗体。这些经修饰的抗体通过已知方法被合适地制备。
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体，具体而言，将非人动物抗体、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的人源化抗体等是公知的。也已知为了获得人源化抗体的常规的基因重组方法。具体而言，作为将小鼠的抗体的CDR移植到人的FR的方法，例如重叠序列延伸PCR(overlap extension PCR)是公知的。在重叠序列延伸PCR中，在用于合成人抗体的FR的引物上附加编码想要移植的小鼠抗体CDR的核苷酸序列。对于4个FR分别准备引物。通常认为当将小鼠CDR移植到人FR中时,选择与小鼠的FR同一性高的人FR对于维持CDR的功能是有利的。即，通常优选利用包含与想要移植的小鼠CDR相邻的FR的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列的人FR。
此外，还已知使用人抗体文库通过淘选制备人抗体的技术。例如，通过噬菌体展示方法将人抗体的V区表达为噬菌体表面上的单链抗体(scFv)。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列可以通过分析所选噬菌体的基因来确定。测定与抗原结合的scFv的DNA序列。通过使该V区序列与所需人抗体C区的序列符合读框的融合并且插入到适当的表达载体中，能够制作表达载体。将表达载体导入适于表达的细胞，例如上述那些。可以通过在细胞中表达人编码抗体的基因来产生人抗体。这些方法是已经公知的(参照国际专利公开号WO1992/001047，WO1992/02079，WO1993/006213，WO1993/011236，WO1993/019172，WO1995/001438，WO1995/015388)。
有益效果
本发明提供的抗FGL1抗体能够特异性地与FGL1结合，阻断FGL1与LAG-3的结合，逆转FGL1对T细胞的抑制作用，激活T细胞分泌细胞因子；上述功能接近或超过目前抗FGL1抗体的水准。
附图说明
图1为抗FGL1抗体与人FGL1结合的ELISA结果示意图；
图2为抗FGL1抗体与鼠FGL1结合的ELISA结果示意图；
图3为抗FGL1抗体阻断FGL1与人LAG3结合的FACS结果示意图；
图4a和图4b为抗FGL1抗体逆转人FGL1对T细胞的抑制效果示意图；
图5为小鼠给药后肿瘤体积的曲线图。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：动物免疫
小鼠免疫：用重组人FGL1-his蛋白(Sinobio，Cat：13484-H08B)和猴FGL1-huFC(Acro，Cat：FG1-C5269)作为免疫原，免疫小鼠，为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只。提前3天采取阴性血清，首次免疫，以皮下免疫、腹腔免疫和足底免疫方式多点注射60μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组人FGL1-his蛋白，第12天以皮下免疫和足底免疫方式多点注射30μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组人FGL1-his蛋白进行二次免疫，两周后、再两周后以二次免疫相同的方式注射30μg猴FGL1-huFc免疫原进行第四次免疫。6天后，通过在1：100至1：1000000的不同稀释度下，在重组人FGL1-huFc蛋白包被的ELISA板中对从尾部放血收集的血清进行试验来评估抗血清滴度。当效价结果满足要求，在>1：1000000的稀释度下检测到抗人FGL1抗体时，可收获小鼠脾脏和淋巴结，进行细胞融合与噬菌体库构建。
羊驼免疫：准备重组人FGL1-his蛋白(Sinobio，Cat：13484-H08B)和猴FGL1-huFc(Acro，Cat：FG1-C5269)作为免疫原，每次免疫总的抗原量保持在1-2mg之间，体积在2mL以下，将抗原和佐剂1：1乳化使其形成均匀混合物4℃保存。记录羊驼耳号后开始免疫实验，每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点注射，每点注射0.4mL混合好的抗原，免疫后观察半小时确认羊驼状态良好，无不适症状，每2周免疫一次，一共进行7次免疫。在第6、7次免疫后间隔5-7天进行采血，采血从羊驼颈部静脉采取，每次取25-30mL血液，分3个采血管收集。在第4、5、6次免疫前进行采血用于免疫评价，采血从羊驼颈部静脉采取，每次取5mL血液，血液当天使用预冷25℃离心机，400xg离心30分钟，分离保存上层血清。而后分离淋巴细胞，即在15mL的离心管中先加入3mL细胞分离液，然后缓慢加入3mL血液。加入血液时小心缓慢以防止血液和分离液混匀，之后离心机预冷至室温，400xg离心30分钟后，观察离心管中血液分离情况，用200μL移液器小心吸取出中间棉状上层免疫细胞至新的15mL离心管中，上层血清保存在新的离心管中，-80℃保存。每管加入室温放置的10mL PBS缓冲液，25℃、400xg离心20分钟，去除上清液，每管加入室温放置的5mL PBS缓冲液，25℃，400xg离心20分钟。使用血球计数板计算细胞数目。去除上清液，根据细胞数目使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞得到107/mL溶解液，-80℃保存。
实施例2：细胞融合
骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)于融合前一天将细胞传代，使实验时细胞处于对数生长期，融合前将细胞收集于离心管中，经100转/分离心8分钟，弃上清液并加入10mL无血清1640培养基将细胞混匀备用。实验用B淋巴细胞和淋巴结细胞取自经重组人FGL1-his与猴FGL1-huFc蛋白交替免疫的小鼠，融合前将小鼠处死取出脾脏和淋巴结，加入10mL无血清1640培养基将细胞压磨过网，得细胞悬液经1000转/分离心8分钟，弃上清液并加入无血清1640培养基将细胞混匀备用。融合体选择培养中所用的饲养细胞取自未经免疫的动物腹腔中的巨噬细胞；融合前将收集的巨噬细胞悬液经100转/分离心8分钟，弃上清液并加入25mLHAT选择培养基混匀，分装于2块24孔培养板中，以辅助新的杂种—B淋巴细胞杂交瘤生长。
将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1:1混合，将其悬浮液以1000转/分离心8分钟，取沉淀，用PM液洗两次。再取沉淀加PM液至1.2mL，向三个多电极小池各注入0.4mL细胞悬浮液。对每个电极小池依次施加如下电场条件：电介质电泳之交流电场——正弦信号频率为1MHz，振幅为250V/cm，施加30秒钟；然后立即加穿孔RC电脉冲——幅度为5kV/cm，脉冲宽度为20μs，脉冲个数为3，时间间隔为l秒钟。室温下静置10分钟，再用总量为5mL的PFM液将融合物冲洗取出，于37℃温育30分钟。然后经100转/分离心8分钟，取沉淀，加入250mLHAT混匀并分注于24孔培养板(已有饲养细胞104个/孔)，放入CO2培养箱于37℃培养。
实施例3：ELISA方法筛选杂交瘤阳性克隆
采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原人FGL1-his蛋白的包被浓度。检测抗原包被缓冲液横向梯度稀释，每孔50μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔50μL，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗第三次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h，PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD450的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。
采用建好的ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，50μL/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体，50μL/孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，TMB显色10min，显示终止后酶标仪测定OD450读数。被测孔OD450读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。将细胞株扩增至在T75培养瓶内，培养至细胞覆盖率为80-90％，将细胞上清弃去，加入30ml hybridoma-SFM(Gibco)，37℃，5％CO2培养。培养2-3天后添加30mL hybridoma-SFM，细胞活率低于30％则可添加新鲜的活细胞。培养6-7天，待细胞存活率低于20％，低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。
实施例4：噬菌体文库构建
噬菌体文库构建的方法是通用的，共构建三个噬菌体文库，来源于不同的外周血淋巴细胞，其中羊驼噬菌体文库来源羊驼免疫来源的外周血淋巴细胞，小鼠噬菌体文库来源于小鼠免疫后的小鼠外周血淋巴细胞，人天然库(商业通用平台)来源于混合的人天然外周血淋巴细胞。噬菌体文库构建过程如下：提取RNA，将用Trizol保存的外周血淋巴细胞转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿混匀；室温静置5分钟后4℃12000g离心15分钟；小心将离心后的上清液转移到新的离心管；往新离心管中加入0.5-1倍体积的异丙醇；室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟；使用与Trizol保存的外周血淋巴细胞等体积的75％乙醇清洗沉淀，4℃7500g离心5分钟后溶解于适量的无RNA酶的水中。而后反转录cDNA，按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的RNA反转录成cDNA。然后扩增抗体片段，从反转录的cNDA中扩增特定的抗体片段使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA模板2μL，正向引物2μL，反向引物2μL，10X Taq Buffer 5μL，dNTP 4μL，Taq(HS)0.25μL，无菌水补足到50μL。PCR的反应条件为：98℃3分钟；95℃30秒，57℃30秒，68℃40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环；68℃5分钟。将得到的PCR扩增产物跑琼1％脂糖凝胶电泳，可以看到一条1.0kb左右一条0.7kb左右的两条条带，对0.7kb大小的条带切胶使用DNA纯化回收试剂盒按说明书进行回收。从上一步PCR扩增并回收后DNA片段中再次扩增特定的抗体片段使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：DNA模板2μL，正向引物2μL，反向引物2μL，10X Taq Buffer 5μL，dNTP 4μL，Taq(HS)0.25μL，无菌水补足到50μL。PCR的反应条件为：98℃3分钟；95℃50秒，55℃30秒，72℃40秒，重复12个循环；72℃10分钟。将得到的PCR扩增产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收。继而克隆至噬菌体质粒，即将上一步扩增得到的抗体基因序列和噬菌体载体使用BglI酶切，酶切体系为：扩增基因12μg或者载体3μg，10X BglI Buffer 3μL,BglI 4.5μL,补足水到30μL。酶切在37℃反应3-4小时。酶切后使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收载体和扩增基因后进行连接反应。连接反应体系为：载体200ng，扩增基因80ng，T4连接酶2μL，10X连接缓冲液5μL，加水直至50μL，在4℃过夜反应，将连接产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收，并使用超纯水溶解。接着转化至SS320感受态细胞，将电转杯置于冰上预冷，待SS320感受态细胞融化后加入1μL回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的Bacteria转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入1mLSOC培养基，将细胞37℃复苏60分钟后涂在含有四环素和氨苄抗性的LB培养板上过夜生长。将过夜生长后的培养板上的细胞用LB培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20％的甘油后保存在-80℃。将上一步刮下的数目约为109个细胞转移到100mL预先加入四环素和氨苄抗生素的2X YT培养液中，37℃220rpm培养直至OD600达到0.5。按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为的卡那霉素和0.2mM的IPTG，30℃过夜培养。将过夜培养的细胞4℃13000rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的5X PEG8000/NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃13000rpm离心10分钟去除上清后加入1mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入250μL 5X PEG8000/NaCl后冰上孵育10分钟，4℃16000g离心15分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mL PBS中得到噬菌体库。
实施例5：噬菌体文库筛选阳性抗体
将100μg人FGL1-huFc抗体加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4℃过夜孵育。而后将扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体500μL加入到1mL 3％BSA中，室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3％BSA，室温旋转孵育2h。最后将封闭后的免疫管用含有0.01％吐温的PBS洗3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。而后将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01％吐温的PBS洗20次，每次5分钟。而后往免疫管中加入1mL 100mM三甲酰亚胺，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和三甲酰亚胺，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。而后将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。将上一步筛选得到的噬菌体稀释106倍后，取100μL加入到OD600为0.5的SS320菌液中，37℃培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养板上，37℃过夜培养第二天得到单克隆菌落。挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养液的96孔细胞培养板上，37℃培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体，30℃过夜培养。第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。将过夜包被抗原和用3％BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。用含有0.05％吐温的PBS清洗3次后，用人FGL1-his作为一抗，用相应的二抗抗-VHH-HRP或抗鼠Fab-HRP，TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序，得到抗体的基因序列。
实施例6：抗体基因序列测序构建与表达
将杂交瘤筛选得到的序列进行抗体基因测序，最终获得了4条抗体SH-01、SH-02、SH-03、SH-04的可变区，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸/核苷酸序列分别如下所示：
(1)SH-01重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：57；
SH-01重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
SH-01重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：11；
SH-01轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：67、SEQID NO：75和SEQ ID NO：83；
SH-01轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：21；
SH-01轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：29；
(2)SH-02重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：58；
SH-02重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；
SH-02重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：12；
SH-02轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：68、SEQID NO：76和SEQ ID NO：84；
SH-02轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：22；
SH-02轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：30；
(3)SH-03重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：59；
SH-03重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；
SH-03重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：13；
SH-03轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：69、SEQID NO：77和SEQ ID NO：85；
SH-03轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：23；
SH-03轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：31；
(4)SH-04重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：60；
SH-04重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
SH-04重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：14；
SH-04轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：70、SEQID NO：78和SEQ ID NO：86；
SH-04轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：24；
SH-04轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：32。
将人天然噬菌体展示抗体库筛选得到的序列进行抗体基因测序，最终获得了4条抗体SH-05、SH-06、SH-07、SH-08的可变区，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸/核苷酸序列分别如下所示：
(5)SH-05重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：61；
SH-05重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
SH-05重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：15；
SH-05轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：71、SEQID NO：79和SEQ ID NO：87；
SH-05轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：25；
SH-05轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：33；
(6)SH-06重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：62；
SH-06重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6；
SH-06重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：16；
SH-06轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：72、SEQID NO：80和SEQ ID NO：88；
SH-06轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：26；
SH-06轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：34；
(7)SH-07重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：63；
SH-07重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：7；
SH-07重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：17；
SH-07轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：73、SEQID NO：81和SEQ ID NO：89；
SH-07轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：27；
SH-07轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：35；
(8)SH-08重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：64；
SH-08重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：8；
SH-08重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：18；
SH-08轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：74、SEQID NO：82和SEQ ID NO：90；
SH-08轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：28；
SH-08轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：36。
将噬菌体展示羊驼免疫库筛选得到的序列进行抗体基因测序，最终获得了2条抗体SH-09和SH-10的可变区，其可变区的氨基酸/核苷酸序列分别如下所示：
(9)SH-09可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：55和SEQ ID NO：65；
SH-09可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9；
SH-09可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：19；
(10)SH-10可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO：46、SEQID NO：56和SEQ ID NO：66；
SH-10可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：10；
SH-10可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：20。
将通过杂交瘤和噬菌体文库筛选测序得到的抗体片段进行基因合成，构建到人IgG框架中，而后利用分子克隆技术，将抗体片段插入PCDNA3.1载体中，构建成哺乳动物细胞表达质粒，利用脂质体转染方式，导入宿主细胞株CHO细胞，利用细胞fed-batch获得发酵上清液，取发酵液上清进行亲和层析、离子交换层析等一系列步骤的纯化，最终纯化得到构建的单克隆抗体。对纯化后的单克隆抗体检测表达量、纯度、内毒素等。
抗体SH-01、SH-02、SH-03、SH-04的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：164，轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：165。
抗体SH-05、SH-06、SH-07、SH-08的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：164，轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：165。
抗体SH-09、SH-10恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：164。
实施例7：抗体的生产与纯化
用rProteinA sepharose Fast Flow(GE公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1M Tris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的杂交瘤细胞培养上清加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度。
实施例8：ELISA方法进行种属交叉检测
用人或小鼠FGL1蛋白，通过ELISA检测方法确定抗体与人、鼠FGL1蛋白的亲和力。将包被人FGL1-his或鼠FGL1-his的平板4℃过夜孵育，用5％PBS-milk封闭过后的96孔ELISA板中加入待检测抗体，室温孵育1h。用含有0.05％吐温的PBS清洗3次后，用检测抗体作为一抗，用human-IgG-FC-HRP作为二抗，TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。Elisa方法筛选出与人FGL1特异性结合，且与鼠有种属交叉反应的抗体，最终确定FGL1抗体与人、鼠FGL1蛋白的亲和力。
检测抗FGL1抗体与人FGL1的结合情况，结果见图1，检测抗FGL1抗体与鼠FGL1的结合情况，结果见图2。结果显示，抗FGL1抗体与人FGL1结合活性EC50在0.06-2.3μg/mL之间。抗FGL1抗体与鼠FGL1蛋白的结合活性EC50在0.06-2.3μg/mL之间。可见，抗FGL1抗体具有较好的结合活性。
实施例9：FACS测定抗FGL1抗体对huLAG-3-CHO-K1的阻断活性
用携带人LAG3(Ref登记号NP_002277.4)的慢病毒载体转导入CHO-K1细胞系，得到huLAG3-CHO-K1稳转细胞系。将抗FGL1与人FGL1-mFc(Sinobio，Cat:13484-H38H)(终浓度0.6μg/ml)在4℃孵育1h。将细胞加入平底板中，离心去除上清，加入100μL抗体与huFGL1-mFc稀释液到细胞中，4℃孵育1h，FACS缓冲液清洗细胞3次，并与PE抗鼠IgG Fc(Abcam，98742)抗体4℃孵育30分钟，FACS缓冲液清洗细胞后，使用流式细胞仪分析(FACS)抗FGL1抗体对FGL1与LAG-3结合的阻断作用。
检测抗FGL1抗体阻断LAG3与人FGL1结合的活性结果见图3。结果显示10条抗FGL1抗体都具有阻断LAG3与FGL1结合的活性。
实施例10：抗FGL1抗体FGL1介导的对人T细胞的抑制
将1μg/mL抗人CD3抗体(OKT3)与0.5μg/mL抗人CD28抗体包被在96孔平底组织培养板，4℃孵育过夜。吸出包被液，使用1×PBS清洗孔3次，立即将10μg/ml的FGL1-his或对照品(huLAG3-huFc)加入到96孔平底组织培养板中，37℃孵育3h，然后使用1×PBS清洗平板3次，而后将来自健康人供体的全PBMC 1.5E5/孔添加到孔中，将96孔平底组织培养板置于CO2培养箱中，37℃、5％CO2孵育72小时。取出少量上清液，ELISA检测其IFN-γ表达水平，结果见图4a和图4b。在图4a和图4b中，每一个抗体在横坐标上对应的部分，抗体浓度从左向右逐渐降低，纵坐标表示相对应抗体浓度的对应OD450值，反应IFN-γ的相对含量值。
结果显示人FGL1会抑制T细胞功能，抑制IFN-γ释放，抗FGL1抗体可以逆转人FGL1介导的对人T细胞的抑制，促进IFN-γ的释放。
实施例11：抗FGL1抗体与FGL1亲和力验证
设备：Biacore(GE)。
传感器芯片：CM5芯片(GE)。
(1)固定：
活化剂准备：在使用前立即混合400mM EDC和100mM NHS(GE)制备。
以10μL/min的流速激活CM5传感器芯片420s。然后用30μg/mL的抗人Fc IgG在10mMNaAc(pH4.5)中以10μL/min的流速注入通道。用1M乙醇胺-盐酸(GE)以10μL/min的流速灭活芯片420s。
(2)样品捕获：
运行缓冲液1×HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％吐温20，pH7.4)中的样品用抗人Fc IgG以10μL/min的流速捕获到Fc2上。将10nm的人FGL1-his蛋白(Sinobio；Cat：13484-H08B)和运行缓冲液以30min的流速依次注入Fc1-Fc2，结合180s，然后解离3600s。每解离后注入10mM甘氨酸(pH1.5)作为再生缓冲液。
(3)再生：
用10mM甘氨酸(pH1.5)再生芯片。
(4)数据分析：
从测试结果图中减去参考通道Fc1和缓冲通道的结果图。实验数据符合1：1结合模型。用分子量35kDa计算人FGL1蛋白的摩尔浓度。
结果见表1，抗FGL1抗体与FGL1间SPR亲和力高，达到1pM。
表1
Figure BDA0003091471800000371
Figure BDA0003091471800000381
实施例12：体内抗肿瘤药效评价
在小鼠结肠癌细胞系MC38移植肿瘤C57BL/MC38小鼠模型中，对具有人鼠交叉的抗体SH-07进行体内抗肿瘤药效评价。利用肠癌细胞系MC38建立C57BL/MC38小鼠模型，评价抗体SH-07给药后对肿瘤生长的影响。
小鼠结肠癌MC38细胞体外单层培养，将0.1mL(1.5x107cells)MC38细胞皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到100mm3时开始分组给药。
给予荷瘤小鼠腹腔和尾静脉交替注射抗体SH-07(5mpk)、PDL1抗体Avelumab(1mpk)、Comb即Avelumab(1mpk)+SH-07(5mpk)，每3天给药一次，每周给药两次，并给与相同体积PBS作为对照，共给药8次。
每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察肿瘤生长和药物治疗对动物日常行为表现的影响如行为活动，摄食摄水量(仅目测)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物数量记录各组内动物死亡数和副作用。
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周三次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。药物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝【1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。
小鼠结肠癌细胞系MC38移植瘤模型荷瘤鼠分别给予PBS对照，抗体SH-07(5mpk)、Avelumab(1mpk)、Comb的肿瘤生长曲线如图5所述，其中横坐标表示接种MC38细胞后的天数，纵坐标表示肿瘤体积，肿瘤抑瘤率TGI(％)见表2。
表2
Figure BDA0003091471800000391
开始细胞接种7天后，达到100mm3进行分笼与给药，给药后28天，模型对照组荷瘤体积生长至678±115mm3，较第7天分组时增长8倍。给药28天时，Avelumab-1mpk对照抗体组小鼠荷瘤体积为449±189mm3，较对照组肿瘤生长抑制率为33.8％；候选分子SH-07测试抗体较对照组肿瘤生长抑制率为30.5％，表现出较好的肿瘤生长抑制效果，当联合Avelumab治疗时肿瘤抑制率为40.6％，表现出协同PD1\PD-L1靶点抑制肿瘤生长，且较空白对照组具有统计学显著性差异。在实验过程中，所有给药组小鼠均未显示有显著性体重下降，无发病现象，没有出现小鼠死亡，间接表示目前给药量没有明显的毒副作用，有良好的耐受性。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
序列表
<110> 盛禾（中国）生物制药有限公司
<120> 一种抗FGL1抗体及其应用
<160> 165
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asp His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Thr Val Ser Ala
115
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asp His Asn Glu Lys Phe
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Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Leu Arg Phe Leu Leu Arg Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Ala Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ser Val Met Gly Tyr Ala Pro Arg Val Arg Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Thr Gly Arg Arg Ser Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Pro Ser Pro Ser Gly Gly Arg Gly Phe Arg Pro Thr
100 105 110
Thr Ala Arg Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 9
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Leu Asp Phe Tyr
20 25 30
Thr Ile Gly Trp Phe Leu Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Ser Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asp Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Leu Ala Gly Arg Gly Cys Met Arg Ser Pro Ile Thr Thr Asp
100 105 110
Glu Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Ser Gly Pro His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Gln Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Gly Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr Glu Gly Phe Tyr Cys Ser Pro Thr Leu Ser Gln Gly Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactaca taaactgggt gaagcagaag 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaagcgggaa tactgatcac 180
aatgagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgctgtct atttctgttt aagattttta 300
ctacggtctg cttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 12
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactaca taaactgggt gaagcagaag 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaagcgggaa tactgatcac 180
aatgagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgctgtct atttctgttt aagattttta 300
ctacggtctg cttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 13
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ttggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactggtt gagacagaag 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaagcgctaa tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccatattg actgttgaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgctgtct atttctgtgc aagatggtta 300
ctccgctctg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 14
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaggtccagc tgcaacagtc cggacctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aggtactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gatcggaatg attgatcctt ctgatagtta tacaagctac 180
aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac gctacggccc 300
ggccttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 15
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggagtc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccgtcaagct 120
ccggggaagg gtctggagtg ggtctctctt attagttggg atggtggtag cacctactat 180
gcagactctg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaaattct 300
ggtaggagga actggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcatca 357
<210> 16
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
agtgtaatgg gttatgcccc ccgggtgagg gcttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct catca 375
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaattaacg 300
ggccgtcggt cgtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcatca 357
<210> 18
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatttt 300
cctagtccta gtggtggcag gggtttccga ccaacgacgg cacgcggcta cggtatggac 360
gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcatca 396
<210> 19
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt caacttggat ttttatacca taggctggtt cctccaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcatgt attagtaata gtggtggtag ctcggtctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca gcgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgga ccctgaggac acagccgttt attactgtgc agccttggcc 300
gggcggggtt gtatgcggtc tccgattact accgacgagt atgactcctg gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc g 381
<210> 20
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggcga cactttggat tattatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg agtctcatgt attaggagta gtggtagcgg cccgcactat 180
tcagactccg tgcaggaccg atttatcatc tccagagaca acgccagggg cacggtgtat 240
ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acagccgttt attactgtgc agccactgag 300
ggattctact gttcaccgac tttgtcccag ggggagtatg actactgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctcg 378
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Ala Gly Asp Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser His Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ser
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Lys Ser Asp Ile Gly Thr Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Asn Val
35 40 45
Ile Ile Tyr Asn Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Gly Thr His Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Ile Val Leu
100 105 110
<210> 29
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatccaatc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tatgcagtct 240
gaagacctgg cagattattt ctgccagcaa tatagcagct atcctctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 30
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60
ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgctagtt atccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 31
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtacacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210> 32
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctaac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccctgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 34
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagtctgccc tgactcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccggacagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caatatcgga actaatactg tgaactggta ccagcagctc 120
ccgggaacgg cccccaaact cctcatctat tctactaatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgttcg tcatgggctg gcgacctgaa tggtcgcctg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 35
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gacatccaga tgatccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagt cactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ctccctcgtt cggccaaggg 300
accaaggtgg aaatcaaa 318
<210> 36
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcatcatc 60
tcctgcactg gaagcaagag tgacattggt acttataact ttgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa tgtcatcatt tataatgtca ataagaggcc ctccggggtt 180
tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga tttttactgc agctcgtata caagcagcgg cactcatgtc 300
ttcggaagtg ggaccaaggt catcgtccta 330
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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<210> 41
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp
1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp
1 5 10
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Phe Pro Ser Pro Ser Gly Gly Arg Gly Phe Arg Pro Thr Thr Ala Arg
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Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp
20
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Leu Ala Gly Arg Gly Cys Met Arg Ser Pro Ile Thr Thr Asp Glu Tyr
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Tyr Trp
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Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp
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Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
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Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Val Asn Trp
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1 5
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Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly
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Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
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Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Trp Thr Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Trp Ala Gly Asp Leu Asn Gly Arg Leu Phe
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<400> 89
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ser Phe
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Ser Tyr Thr Ser Ser Gly Thr His Val Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
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Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser
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Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Leu Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met
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<210> 105
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Leu
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Phe Leu Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys
1 5 10
<210> 110
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys
1 5 10
<210> 111
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Phe Cys Leu Arg
35
<210> 112
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Phe Cys Leu Arg
35
<210> 113
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Phe Cys Ala Arg
35
<210> 114
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Thr
35
<210> 115
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
1 5 10 15
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 116
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
1 5 10 15
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 117
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
1 5 10 15
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Lys
35
<210> 118
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
35
<210> 119
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
1 5 10 15
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asp Pro Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 120
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Asp Ser Val Gln Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Gly
1 5 10 15
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 131
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys
20
<210> 132
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg
20
<210> 133
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg
20
<210> 134
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Ser Val Thr Cys Lys
20
<210> 135
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
20
<210> 136
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg
1 5 10 15
Val Thr Ile Ser Cys Ser
20
<210> 137
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
20
<210> 138
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
1 5 10 15
Ile Ile Ile Ser Cys Thr
20
<210> 139
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 142
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 146
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Asn Val Ile Ile Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 147
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln
20 25 30
<210> 148
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu
20 25 30
<210> 149
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
20 25 30
<210> 150
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln
20 25 30
<210> 151
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
20 25 30
<210> 152
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser
20 25 30
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
20 25 30
<210> 154
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Ser
20 25 30
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
Gly Ser Gly Thr Lys Val Ile Val Leu
1 5
<210> 163
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
Met Ala Lys Val Phe Ser Phe Ile Leu Val Thr Thr Ala Leu Thr Met
1 5 10 15
Gly Arg Glu Ile Ser Ala Leu Glu Asp Cys Ala Gln Glu Gln Met Arg
20 25 30
Leu Arg Ala Gln Val Arg Leu Leu Glu Thr Arg Val Lys Gln Gln Gln
35 40 45
Val Lys Ile Lys Gln Leu Leu Gln Glu Asn Glu Val Gln Phe Leu Asp
50 55 60
Lys Gly Asp Glu Asn Thr Val Ile Asp Leu Gly Ser Lys Arg Gln Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Cys Ser Glu Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Lys Leu Ser Gly Phe
85 90 95
Tyr Lys Ile Lys Pro Leu Gln Ser Pro Ala Glu Phe Ser Val Tyr Cys
100 105 110
Asp Met Ser Asp Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Ser Asp
115 120 125
Gly Ser Glu Asn Phe Asn Arg Gly Trp Lys Asp Tyr Glu Asn Gly Phe
130 135 140
Gly Asn Phe Val Gln Lys His Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Lys Asn
145 150 155 160
Leu His Phe Leu Thr Thr Gln Glu Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Asp Leu
165 170 175
Ala Asp Phe Glu Lys Asn Ser Arg Tyr Ala Gln Tyr Lys Asn Phe Lys
180 185 190
Val Gly Asp Glu Lys Asn Phe Tyr Glu Leu Asn Ile Gly Glu Tyr Ser
195 200 205
Gly Thr Ala Gly Asp Ser Leu Ala Gly Asn Phe His Pro Glu Val Gln
210 215 220
Trp Trp Ala Ser His Gln Arg Met Lys Phe Ser Thr Trp Asp Arg Asp
225 230 235 240
His Asp Asn Tyr Glu Gly Asn Cys Ala Glu Glu Asp Gln Ser Gly Trp
245 250 255
Trp Phe Asn Arg Cys His Ser Ala Asn Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Ser
260 265 270
Gly Pro Tyr Thr Ala Lys Thr Asp Asn Gly Ile Val Trp Tyr Thr Trp
275 280 285
His Gly Trp Trp Tyr Ser Leu Lys Ser Val Val Met Lys Ile Arg Pro
290 295 300
Asn Asp Phe Ile Pro Asn Val Ile
305 310
<210> 164
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段结合区域全部或部分包含在SEQ ID NO：163所述的氨基酸序列内。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段以1nM或更小的KD结合FGL1。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体、纳米抗体、嵌合抗体、全人抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单特异性、双特异性、多特异性抗体、抗体偶联物或细胞治疗；优选的，所述抗体偶联物为细胞毒性部分、放射性同位素、药物或细胞因子。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述双特异性抗体包括权利要求1-3任一所述的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段；优选的，所述双特异性抗体为抗FGL1/CD3双特异性抗体、抗FGL1/PD-1双特异性抗体、抗FGL1/PD-L1双特异性抗体或抗FGL1/CD16A双特异性抗体。
6.根据权利要求1-3任一所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
7.一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，
(a)重链可变区的CDR1，选自SEQ ID NO：37-44的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：37-44的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：37-44的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的CDR2，选自SEQ ID NO：47-54的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：47-54的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：47-54的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的CDR3，选自SEQ ID NO：57-64的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57-64的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：57-64的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(d)轻链可变区的CDR1，选自SEQ ID NO：67-74的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：67-74的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：67-74的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(e)轻链可变区的CDR2，选自SEQ ID NO：75-82的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：75-82的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：75-82的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(f)轻链可变区的CDR3，选自SEQ ID NO：83-90的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：83-90的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：83-90的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：47和SEQ ID NO：57组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：83组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：48和SEQ ID NO：58组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：84组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：59组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：85组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：50和SEQ ID NO：60组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：86组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：51和SEQ ID NO：61组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：87组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：52和SEQ ID NO：62组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：88组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：53和SEQ ID NO：63组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：89组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：54和SEQ ID NO：64组成，且所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：90组成。
8.一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，其特征在于，所述重链可变区包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，
(a)重链可变区的CDR1，选自SEQ ID NO：45-46的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：45-46的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：45-46的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(b)重链可变区的CDR2，选自SEQ ID NO：55-56的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：55-56的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：55-56的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
(c)重链可变区的CDR3，选自SEQ ID NO：65-66的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO：65-66的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：65-66的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：55和SEQ ID NO：65组成；
优选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由氨基酸序列SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：66组成。
9.根据权利要求7所述的一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区还包括框架区FR，所述框架区FR包括：
(a)选自SEQ ID NO：91-98任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：91-98给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：91-98的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR1，
(b)选自SEQ ID NO：101-108任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：101-108给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：101-108的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR2，
(c)选自SEQ ID NO：111-118任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：111-118给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：111-118的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR3，
和
(d)选自SEQ ID NO：121-128任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：121-128给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与选自SEQ ID NO：121-128的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR4；
优选的，所述轻链可变区还包括框架区FR，所述框架区FR包括：
(e)选自SEQ ID NO：131-138任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：131-138给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：131-138的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR1，
(f)选自SEQ ID NO：139-146任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：139-146给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：139-146的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR2，
(g)选自SEQ ID NO：147-154任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：147-154给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：147-154的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR3，
和
(h)选自SEQ ID NO：155-162任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：155-162给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与选自SEQ ID NO：155-162的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR4。
10.根据权利要求8所述的一种抗FGL1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包括框架区FR，所述框架区FR包括：
(a)选自SEQ ID NO：99-100任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：99-100给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：99-100的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR1，
(b)选自SEQ ID NO：109-110任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：109-110给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：109-110的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR2。
(c)选自SEQ ID NO：119-120任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：119-120给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与SEQ ID NO：119-120的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR3，
和
(d)选自SEQ ID NO：129-130任一氨基酸序列、
或与SEQ ID NO：129-130给出的任一氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或以上同一性的序列、
或与选自SEQ ID NO：129-130的任一氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列所示的FR4。
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