KR20220087457A - Lif에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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준 타오
웬라이 저우
샨샨 허
하이옌 양
홍링 왕
귀췬 양
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Abstract

LIF에 특이적인 결합 분자 및 그의 용도가 제공된다. 구체적으로, LIF에 결합하여 LIF의 활성을 억제하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 또한, 질병의 치료에서 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도가 제공된다.

Description

LIF에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
본 발명은 LIF에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도, 및 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 치료 방법에 관한 것이다.
백혈병억제인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)는 IL6형 사이토카인의 구성원으로, 이는 세포의 증식, 분화 및 생존을 각각 자극하거나 억제하는 등 다양한 생물학적 활성을 갖는다[1]. 인간 LIF 단백질은 202개의 아미노산을 가지며, 이는 세포막 표면에 GP130과 LIFR이라는 두 개의 수용체를 가지고 있다. LIF 단백질은 이 두 수용체에 결합하여 두 수용체가 이종이량체(heterodimer)를 형성하도록 하여 MAPK 신호전달 경로 및 JAK/STAT 신호전달 경로와 같은 다운스트림 신호 전달 경로를 활성화한다[2]. LIF 단백질의 과발현과 LIF 단백질의 증가된 혈청 수준은 다발성 종양의 불량한 예후와 상관관계가 있다고 보고되었다[3, 4]. LIF는 암 줄기세포의 핵심 조절인자로서 줄기세포 유지, 자가-재생, 다능성 등에 중요한 역할을 하며 화학내성(chemoresistance)과 관련이 있다[5, 6]. 또한, LIF는 종양의 성장과 전이를 촉진할 수도 있다[7]. 최근 증거는 LIF가 종양에서 자가분비(autocrine) 및 주변분비(paracrine) 기전을 통해 JAK-STAT3 신호전달 경로를 상향 조절함으로써, 종양 성장을 촉진하고 면역 반응을 억제하는 역할을 한다는 것을 나타낸다[8, 9, 10]. 따라서, LIF는 잠재적인 치료 표적이다. 그러나, 현재 개발된 LIF 표적에 대한 치료 방법은 낙관적이지 않다. 예를 들어, 많은 문헌에서 RNA 간섭에 의해 LIF 단백질의 발현을 감소시키면 종양 성장을 억제할 수 있다고 보고하지만[11, 12], RNA 간섭 기술은 불량한 표적화, 짧은 반감기, 불량한 막 투과성의 약점이 있으며, 의약을 만들기가 어렵다. EC359는 LIFR에 대한 소분자 억제제이다. 이는 LIFR이 LIF에 결합하는 것을 억제할 뿐만 아니라, OSM, CTF1 및 CNTF가 LIFR에 결합하는 것을 억제할 수 있다[13]. 이러한 추가적 억제가 추가적 독성을 유발하는지 여부는 알려져 있지 않으며, LIF 단백질에 특이적인 소분자 억제제는 아직 보고되지 않았다. LIF 단백질을 표적으로 하는 단 한 개의 항체 약물이 현재 임상 개발 단계에 있으며, 이의 관련 안전성 및 유효성 데이터는 아직 공개되지 않았다.
따라서, LIF 표적에 대한 약물 및 병용 요법을 개발하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 LIF에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 및 질병의 치료에서의 그의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 LIF 단백질의 아미노산 서열 TYGPDTSGKDVFQKK(서열번호 61)로 표시되는 에피토프 또는 다른 포유류 종의 상응하는 아미노산 서열의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다:
(a) 서열번호 1 또는 66, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(b) 서열번호 2 또는 67, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;
(c) 서열번호 3 또는 68, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
(d) 서열번호 4 또는 69, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(e) 서열번호 5, 45, 또는 70, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
(f) 서열번호 6 또는 71, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3.
선택적으로, LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 또는 HCDR3은 17개 이하의 아미노산의 추가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가진다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 1, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(b) 서열번호 2, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;
(c) 서열번호 3, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
(d) 서열번호 4, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(e) 서열번호 5 또는 45, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(f) 서열번호 6, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3.
선택적으로, LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 또는 HCDR3은 17개 이하의 아미노산의 추가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가진다.
일부 구현예에서, 선택적으로, LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 또는 HCDR3은 9개 이하의 아미노산의 추가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가진다.
일부 구현예에서, 선택적으로, LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 또는 HCDR3은 5개 이하의 아미노산의 추가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가진다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
1) (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3;
2) (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3; 또는
3) (a) 서열번호 66을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 67을 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 68을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 69를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 70을 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 71을 포함하는 HCDR3.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
1) (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3; 또는
2) (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 66을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 67을 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 68을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 69를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 70을 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 71을 포함하는 HCDR3.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 완전 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 인간화(humanized) 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 단리된 항체는 인간 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 또는 그의 프레임워크 영역 변이체를 포함하는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 7, 11, 15, 19, 46, 74 또는 82, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(ii) 서열번호 23, 27, 31, 48, 75 또는 83, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 7, 11, 15, 19 또는 46, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(ii) 서열번호 23, 27, 31 또는 48, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 7, 11, 15 또는 19, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(ii) 서열번호 23, 27 또는 31, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 (i)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 (ii)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
2) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
3) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
4) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
5) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
6) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
7) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
8) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
9) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
10) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
11) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
12) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
13) 서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
14) 서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 또는
15) 서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
2) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
3) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
4) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
5) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
6) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
7) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
8) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
9) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
10) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
11) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 또는
12) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 1) 내지 15)로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다:
(a) 서열번호 7, 11, 15, 19, 46 또는 82 중 어느 하나와 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(ii) 서열번호 23, 27, 31, 48 또는 83 중 어느 하나와 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서:
(I) 경쇄는 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39, 50 또는 54, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(II) 중쇄는 서열번호 25, 29, 33, 35, 52 또는 56, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 여기서:
(I) 경쇄는 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39 또는 50, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(II) 중쇄는 서열번호 25, 29, 33, 35 또는 52, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 여기서:
(I) 경쇄는 서열번호 9, 13, 17 또는 21, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(II) 중쇄는 서열번호 25, 29 또는 33, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 경쇄는 (I)로부터 선택되는 경쇄와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 (II)로부터 선택되는 중쇄와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
2) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
3) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
4) 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
5) 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
6) 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
7) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
8) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
9) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
10) 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
11) 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
12) 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
13) 서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
14) 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
15) 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
16) 서열번호 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 56의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 경쇄 및 중쇄는 각각 1) 내지 16)으로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열번호 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 56의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 11로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 19로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된(engineered) 항체, 인간 항체, 이중특이성 항체, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2이다.
일부 구현예에서, 단리된 항체는 IgG이다.
일부 구현예에서, 단리된 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 백혈병억제인자(LIF) 길항제이다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 LIF에 대한 결합에 대해 경쟁하거나 교차(cross) 경쟁할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 분자는 DNA 또는 RNA이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 분자는 DNA이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 7, 11, 15, 19, 46 또는 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
(ii) 서열번호 23, 27, 31, 48 또는 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 7, 11, 15, 19 또는 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
(ii) 서열번호 23, 27, 31 또는 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 7, 11, 15, 또는 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
(ii) 서열번호 23, 27 또는 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 제1 핵산 분자는 (i)로부터 선택되는 제1 핵산 분자에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 가지는 DNA를 포함하고; 제2 핵산 분자는 (ii)로부터 선택되는 제2 핵산 분자에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 가지는 DNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
2) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
3) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
4) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
5) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
6) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
7) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
8) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
9) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
10) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
11) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
12) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
13) 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
14) 서열번호 74의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 75의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자; 또는
15) 서열번호 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
2) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
3) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
4) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
5) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
6) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
7) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
8) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
9) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
10) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
11) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자; 또는
12) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 74의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 75의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 제1 핵산 서열은 각각 1) 내지 15)로부터 선택되는 제1 핵산 서열 또는 제2 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 가지는 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 8에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 12에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 16에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 20에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 47에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 74의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 76에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA는 서열번호 72에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA는 서열번호 24에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA는 서열번호 28에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA는 서열번호 32에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA는 서열번호 49에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 75의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA는 서열번호 77에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA는 서열번호 73에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
(I) 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39, 50 또는 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 서열; 및
(II) 서열번호 25, 29, 33, 35, 52 또는 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 서열.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
(I) 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39 또는 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 서열; 및
(II) 서열번호 25, 29, 33, 35 또는 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 서열.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
(I) 서열번호 9, 13, 17 또는 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 서열; 및
(II) 서열번호 25, 29 또는 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 서열.
일부 구현예에서, 제1 핵산 분자는 (I)로부터 선택되는 제1 핵산 분자에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 가지는 DNA를 포함하고; 제2 핵산 분자는 (II)로부터 선택되는 제2 핵산 분자에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 가지는 DNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
2) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
3) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
4) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
5) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
6) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
7) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
8) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
9) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
10) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
11) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
12) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
13) 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
14) 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
15) 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자; 또는
16) 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 1) 내지 16)으로부터 선택되는 제1 핵산 분자 또는 제2 핵산 분자에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 가지는 DNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 조성물은 하기를 포함한다:
서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
일부 구현예에서, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 10에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 14에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 18에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 22에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 38에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 40에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 51에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 55에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 26에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 30에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 34에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 36에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 53에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA는 서열번호 57에 나타나 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 조성물을 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터 또는 바이러스 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포는 벡터 형질전환에 의해 수득된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 대장균(escherichia coli), 피치아(pichia) 효모, 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 인간 배아 신장 293 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 단계 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 생물학적 샘플에서 LIF를 검출하기 위한 시약을 제공한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 LIF 수준을 갖는 것으로 의심되는 임의의 조직이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 상기 언급된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단하는데 사용되는 약제의 제조에 있어서의 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 상기 언급된 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단하는데 사용하기 위한 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 상기 언급된 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 상기 언급된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, LIF와 관련된 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, LIF와 관련된 질병 또는 상태는 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 교모세포종(glioblastoma), 폐암, 난소암, 대장암(colorectal cancer), 췌장암 또는 전립선암을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 LIF와 관련된 질병 또는 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 상기 언급된 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, LIF와 관련된 질병 또는 상태는 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 교모세포종, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암 또는 전립선암을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 LIF와 관련된 질병 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 상기 언급된 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, LIF와 관련된 질병 또는 상태가 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 교모세포종, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암 또는 전립선암을 포함한다.
LIF와 관련된 질병 또는 상태는 LIF와 LIFR 및/또는 GP130을 차단하는 것이 질병 또는 상태를 치료, 완화, 경감 및/또는 안정화할 수 있음을 의미한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 대상체의 조직 또는 액체 샘플을 수득하는 단계, (ii) 조직 또는 액체 샘플을 상기 언급된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 상기 언급된 시약에 노출시키는 단계; 및 (iii) (ii)의 조직 또는 액체 샘플에 대한 LIF 결합을 대조군 샘플에 대한 LIF 결합과 비교하고, 여기서 대조군 샘플과 비교하여 결합된 LIF의 양의 증가는 비정상적 수준의 LIF 생산, 발현 또는 활성화를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 LIF를 검출하는 방법을 제공한다
일부 구현예에서, 조직 또는 액체 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 LIF 수준을 갖는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함한다.
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참고: CDR 및 프레임워크 영역의 모든 아미노산 번호는 Kabat 시스템의 EU 인덱스(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 따라 주석 처리하였다. 모든 서열은 시그널 펩티드를 포함하지 않는다. aa: 아미노산, nt: 뉴클레오티드.
도 1은 인간 LIF 단백질에 대한 본 발명의 LIF 항체의 결합 능력을 나타낸다.
도 2는 마우스 LIF 단백질에 대한 본 발명의 LIF 항체의 결합 능력을 나타낸다.
도 3은 사이노몰구스 원숭이(machin) LIF 단백질에 대한 본 발명의 LIF 항체의 결합 능력을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 38E10E1C11 항체의 항원에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
도 5는 인간 LIF 단백질에 대한 결합에 대해 LIFR과 경쟁하는 본 발명의 38E10E1C11 항체의 능력을 나타낸다.
도 6은 인간 LIF 단백질에 대한 결합에 대해 GP130 수용체와 경쟁하는 본 발명의 P36-333 항체의 능력을 나타낸다.
도 7은 IL-6 패밀리 단백질과 본 발명의 38E10E1C11 항체 및 P36-333 항체의 교차 반응성을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 38E10E1C11R 항체가 변성된 인간 LIF 단백질을 인식함을 나타낸다.
도 9의 패널 A는 본 발명의 38E10E1C11 항체가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 결장암 세포(HCT116)의 인산화를 억제함을 나타내고; 도 9의 패널 B는 본 발명의 38E10E1C11 항체가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 췌장암 세포(KP4)에서의 STAT3의 인산화를 억제함을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 38E10E1C11 항체가 CT26-hLIF 세포에 의해 분비되는 인간 LIF에 의한 췌장암 세포 KP4에서의 STAT3의 활성화를 차단함을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 P36-333 항체가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 결장암 세포(HCT116)에서의 STAT3의 인산화를 억제함을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 38E10E1C11 및 P36-033 항체가 LIF에 의해 유발된 M1 세포의 증식 억제를 역전시키는 것을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 38E10E1C11 항체가 BABL/c 마우스에서 CT26-hLIF 세포의 성장을 억제함을 나타낸다.
도 14는 인간 LIF 단백질에 의한 자극에 대한 3개의 인간 췌장암 세포주의 민감성을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 38E10E1C11R 항체가 LIF 단백질에 의해 자극된 KP4 세포에서의 STAT3의 인산화를 억제함을 나타낸다.
도 16의 패널 A는 본 발명의 38E10E1C11 항체에 의한 전장 인간 LIF 단백질 및 이형(heterozygous) LIF 단백질의 인식에 대한 실험 결과를 나타내고, 도 16의 패널 B는 본 발명의 38E10E1C11 항체가 전장 인간 LIF 단백질 및 이형 LIF 단백질에 의한 M1 세포 증식 억제를 역전시킬 수 있다는 실험 결과를 나타낸다.
도 17A 및 도 17B는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 항원 결합 특성의 실험 결과를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 비특이적 결합 친화력 실험 결과를 나타낸다.
도 19는 인간 LIF 단백질 결합에 대해 LIFR과 경쟁하는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 실험 결과를 나타낸다.
도 20은 인간 LIF 단백질 결합에 대해 GP130과 경쟁하는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 실험 결과를 나타낸다.
도 21은 항원 특이성을 인식하는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 실험 결과를 나타낸다.
도 22의 패널 A는 전장 인간 LIF 단백질 및 이형 LIF 단백질을 인식하는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 실험 결과를 나타내고; 도 22의 패널 B는 전장 LIF 단백질 및 하이브리드 단백질에 의한 M1 세포 증식의 억제를 차단하는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 실험 결과를 나타낸다.
도 23은 LIF 단백질에 의해 유도된 STAT3의 인산화를 억제하는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체의 실험 결과를 나타낸다.
도 24는 본 발명의 인간화 항-LIF 항체가 인간 LIF 단백질에 의한 M1 세포 증식 억제를 역전시킬 수 있다는 실험 결과를 나타낸다.
도 25는 HTFR 방법에 의해 검출된 인간화 항-LIF 항체에 의해 억제된 LIF 단백질-유도 STAT3의 인산화 수준 및 총 STAT3 수준을 나타낸다.
도 26은 인간화 항-LIF 항체의 ADCC 효과를 나타낸다.
정의
본 명세서가 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 설명된다.
본원에서 사용되는 용어 "LIF(Leukemia Inhibitory Factor)"는 백혈병억제인자를 의미한다. LIF의 아미노산 서열은 공개적으로 이용 가능하다(Ref Seq NM_001257135). 일부 구현예에서, LIF는 인간 LIF, 마우스 LIF(Ref Seq NM_001039537.2), 또는 시노몰구스 원숭이(machin) LIF(XM_015457518.1)일 수 있다. 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, LIF는 재조합 및/또는 글리코실화 또는 비-글리코실화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 이의 단일 사슬을 포함할 수 있다. "항체"는 일 구현예에서, 이황화(disulfide) 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 일부 자연 발생 IgG, IgD 및 IgA 항체에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 일부 자연 발생 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라고 하는 초가변성 영역, 및 프레임워크 영역(framework region, FR)이라고 하는 더 보존된 영역으로 더 세분화될 수 있으며, 이들은 양자가 혼합된(intermingled) 배열이다. 여기서, VH 영역의 CDR은 HCDR로 약칭되며, 즉, VH 영역의 3개의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 약칭될 수 있고; VL 영역의 CDR은 LCDR로 약칭되며, 즉 VL 영역의 3개 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3으로 약칭될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 이펙터 세포) 및 고전적 보체(complement) 시스템의 첫 번째 구성요소(C1q)를 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체의 중쇄는 말단 라이신(K), 또는 말단 글리신 및 라이신(GK)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 임의의 중쇄 서열 및 중쇄 불변 영역 서열은 서열의 마지막 아미노산이 제공하는 것과 상관없이 GK 또는 G로 끝나거나, 또는 K 또는 GK가 결여될 수 있다. 이는 항체의 발현 과정에서 말단 라이신이 그리고 때때로는 글리신과 라이신이 절단되기 때문이다.
항체는 전형적으로 10-7 내지 10-11 M 이하의 해리 상수(KD)에 의해 반영되는 높은 친화도로 그의 동족(cognate) 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10-6 M보다 큰 임의의 KD는 일반적으로 비특이적으로 결합하는 것을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체란 항원 및 실질적으로 동일한 항원에는 고친화도로 결합하나, 관련되지 않은 항원에는 고친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭하며, 이는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5 × 10-9 M 이하, 가장 바람직하게는 10-8 M 내지 10-10 M 이하의 KD를 가지는 것을 의미한다. 항원은 주어진 항원에 대해 높은 정도의 서열 동일성을 나타내는 경우, 예를 들어, 주어진 항원의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 경우 주어진 항원과 "실질적으로 동일"하다.
면역글로불린은 IgA, 분비성 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지 않는 일반적으로 알려진 이소타입 중 임의의 것일 수 있다. IgG 이소타입은 일부 종에서 서브클래스로 나뉜다: 인간의 경우 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 그리고 마우스의 경우 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-LIF 항체는 인간 IgG1 또는 IgG2 이소타입의 것이다. 면역글로불린, 예를 들어 인간 IgG1은 여러 동종이형(allotype)으로 존재하며, 이들은 기껏해야 몇 개의 아미노산에서 서로 다르다. "항체"는, 예를 들어, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 모두; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 사슬 항체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 항체의 "항원-결합 부분" 또는 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 항-LIF 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가(monovalent) 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가(bivalent) 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 서로 다른 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 사용하여 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 이들은 연결될 수 있으며, 여기서 VL이 및 VH 영역은 쌍을 이루어 단일 사슬 Fv(scFv)로 알려진 1가 분자를 형성한다; 예를 들어 Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단일 사슬 항체 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 및 기타 잠재적 구성은 Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301에 설명되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
"보존적 변형 형태의 아미노산 서열"이라는 용어는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하며, 변형에는 아미노산 치환, 부가 및 결실이 포함된다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR 매개 돌연변이유발과 같은 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄가 있는 아미노산(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄가 있는 아미노산(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 유지된 기능에 대해 테스트될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형의 수는 1개 또는 2개 이하이다.
본원에 기재된 아미노산 서열의 변형, 특히 인간 중쇄 불변 영역의 서열을 아시아인 집단에서 발견되는 것과 같은 원하는 동종이형에 적응시키기 위한 인간 중쇄 불변 영역의 변형이 본 발명에서 바람직하다.
예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 그룹을 프레임워크(예컨대 인간 프레임워크)에 이식(graft)하여 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 영역은 인간 생식계열(germline) 또는 비-생식계열 유전자 서열일 수 있다. 이러한 방식으로 프레임워크는 생식계열일 수 있으며, 유사한(comparable) 위치에서 가장 유사한 인간 생식계열 프레임워크의 잔기와 일치하도록 프레임워크의 하나 이상의 잔기가 교환될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 결합 구성원(binding member)은 인간 생식계열 프레임워크, 예를 들어 인간 생식계열 IgG VH 프레임워크 내에 HCDR 그룹을 가지는 단리된 VH 도메인일 수 있다. 결합 구성원은 또한 인간 생식계열 IgG VL 프레임워크에서와 같이 LCDR 그룹을 함유하는 VL 도메인을 가질 수 있다.
VH 및/또는 VL 스캐폴드 잔기는, 예컨대 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여, 본원에 예시된 바와 같이, 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 본 발명의 VH 또는 VL 도메인, 또는 결합 구성원은 이러한 VL 도메인을 포함한다.
하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 변경이 이루어질 수 있으며, 이러한 변경은 일반적으로 기능 손실을 초래하지 않으므로, 이러한 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 LIF에 결합 및/또는 중화하는 능력을 유지해야 한다. 이는 본원에 기재된 분석 방법에 의해 측정된 바와 같이, 변경되지 않은 결합 구성원과 동일한 수의 결합 및/또는 중화 능력을 유지할 수 있다. 이러한 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 LIF에 결합 및/또는 중화하는 개선된 능력을 가질 수 있다.
변경에는 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산으로 교체, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-자연 발생 또는 비-표준 형태로 변형, 또는 하나 이상의 비-자연 발생 또는 비-표준 아미노산 잔기를 서열에 삽입하는 것이 포함될 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 위치 및 수의 예시는 본 명세서의 다른 곳에서 설명된다. 자연 발생 아미노산에는 이들의 표준 한 글자(one-letter) 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 식별되는 20개의 "표준" L-아미노산이 포함된다. 비-표준 아미노산은 폴리펩티드 골격에 통합되거나 기존 아미노산 잔기로부터 변형될 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 4-히드록시프롤린, 5-히드록시리신, 3-메틸히스티딘, N-에틸세린 등과 같은 여러 자연 발생 비-표준 아미노산이 당업계에 알려져 있다(Voet & Voet, 1995, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley)). N-α 위치에서 유도체화된 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N-말단에만 위치할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수 있다. 따라서 변경에는 L-아미노산을 사용한 변형 또는 L-아미노산을 D-아미노산으로 교체하는 것이 포함될 수 있다. 포르밀화, 아세틸화 및/또는 인산화 형태의 아미노산이 공지되어 있고, 본 발명의 아미노산은 그와 같이 변형될 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 및 항체 도메인 내의 아미노산 서열은 상기 기재된 비-천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비-표준 아미노산(예컨대 D-아미노산)은 합성 동안, 또는 아미노산 합성 후에 "원래" 표준 아미노산의 변형 또는 치환에 의해 아미노산 서열 내로 통합될 수 있다.
비-표준 및/또는 비-자연 발생 아미노산의 사용은 구조 및 기능의 다양성을 개선하고, 본 발명의 결합 구성원에서 원하는 LIF 결합 및 중화 특성을 달성할 가능성을 증가시킬 수 있다. 또한, 표준 L-아미노산과 비교하여, D-아미노산 및 그 유사체는 인간과 같은 동물에 투여 후 생체 내에서 L-아미노산으로 폴리펩티드의 분해로 인해 더 나은 약동학적 특성을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명의 CDR-유도된 서열을 가지는 새로운 VH 또는 VL 영역의 생성은 VH 및/또는 VL 유전자로부터 선택된 하나 이상의 무작위 돌연변이유발을 사용하여 모든 변이(variant) 영역에서 돌연변이체를 생성할 수 있다. 이러한 기술은 오류가 발생하기 쉬운 PCR(error-prone PCR)을 사용하는 Gram et al. (Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3576-3580)에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 모든 변이 영역 또는 CDR 그룹에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어진다.
사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역의 표적화된 돌연변이유발이다. 이러한 방법은 Barbas et al. (Barbas et al., 1994, Proc. Natl Acad. Sci., USA, 91: 3809-3813) 및 Schier et al. (Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 551-567)에 의해 공개되었다.
상기 기재된 모든 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 이러한 방법을 사용하고 본 발명의 결합 구성원을 제공하기 위해 당업계의 통상적인 방법을 채택할 수 있을 것이다.
본원에 개시된 특정 서열을 가지는 임의의 VH 및 VL 도메인 아미노산 서열 변이체가 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변화(아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 약 17개 미만, 9개 미만, 또는 5개 미만의 이러한 변화를 가진다.
상기 나타낸 바와 같이, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 변이 구조 영역 또는 그의 대부분에서 CDR로서 보유될 수 있다. 실질적으로 본원에 기재된 HCDR3 서열은 본 발명의 구현예를 나타내고, 이들 각각은 인간 항체 변이 영역 또는 그의 대부분에서 CDR로서, 선택적으로 본 발명의 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3과 조합하여 보유될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 또는 모든 항체가 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체의 조성물을 의미한다. 전형적으로 이러한 모노클로날 항체는 세포 또는 핵산을 암호화하는 단일 항체로부터 유래될 것이고, 임의의 서열 변경을 의도적으로 도입하지 않고 증식될 것이다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 임의의 불변 영역을 갖는 모노클로날 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마, 예를 들어 트랜스제닉(transgenic) 또는 트랜스염색체(transchromosomal) 비-인간 동물(예를 들어, 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스)로부터 유래된 B 세포를 불멸화 세포(immortalized cell)와 융합시켜 수득한 하이브리도마에 의해 생산된다. 용어 "mAb"는 모노클로날 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함하며, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합의(combinatorial) 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 활용하고 생식계열 유전자에 의해 암호화되는 가변 영역 및 불변 영역을 포함하지만, 예를 들어 항체 성숙 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이(예를 들어, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117- 1125 참조), 가변 영역은 항원 결합 도메인을 함유하며, 이는 외인성 항원에 특이적인 항체를 형성하도록 재배열되는 다양한 유전자에 의해 암호화된다. 재배열 이외에, 가변 영역은 외인성 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 다중의 단일 아미노산 변화(체세포 돌연변이(somatic mutation) 또는 초돌연변이(hypermutation)로 지칭됨)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대한 추가 반응(즉, 이소타입 스위치)으로 변경된다. 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 서열은 원래 생식계열 서열과 동일하지 않을 수 있지만, 대신에 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).
"인간" 항체(HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가지는 항체를 지칭한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본원에 기재된 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지는 않는다. "인간" 항체 및 "완전한 인간" 항체라는 용어는 동의어로 사용된다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 인간화 형태의 항체의 일 구현예에서, CDR 도메인 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 인간 면역글로불린으로부터의 아미노산으로 대체된 반면, 하나 이상의 CDR 영역 내의 일부, 대부분 또는 모든 아미노산은 변하지 않는다. 특정 항원에 결합하는 항체의 능력을 없애지 않는 한 아미노산의 작은 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형이 허용된다. "인간화" 항체는 원래 항체와 유사한 항원 특이성을 유지한다.
"키메라 항체"는 가변 영역이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역이 다른 종으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 예컨대 가변 영역이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역이 인간 항체로부터 유래된 항체이다.
본 발명의 기능적 항체 단편은 PEG화 또는 리포솜으로의 혼입과 같은 화학적 변형에 의해 반감기가 증가된 임의의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명의 항체는 이중특이성(bispecific) 항체를 포함한다. 이중특이성 또는 이중기능성 항체는 2개의 상이한 변이 영역이 동일한 분자에 통합된 2세대 모노클로날 항체를 형성한다(Holliger and Bohlen, 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). 새로운 이펙터 기능을 모집하거나 일부 분자를 종양 세포 표면으로 표적화하는 능력에 대해, 진단 및 치료 분야에서의 이들의 적용이 해명되었다. 이중특이성 항체가 사용되는 경우, 예를 들어 화학적으로 제조되거나 하이브리드로부터 유래된 하이브리도마는 다양한 방법으로 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체일 수 있거나(Holliger P. & Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449: 1993), 또는 상기 언급된 이중특이성 항체 단편 중 임의의 것일 수 있다. 이들 항체는 화학적 방법 또는 체세포적 방법에 의해 수득될 수 있지만, 동등하게 바람직하게는 이종이량체화(heterodimerization)의 실행을 허용하고 수득된 항체의 정제 공정을 용이하게 하는 유전 공학 방법에 의해 수득될 수 있다. 이중특이성 항체의 예는 BiTETM 방법의 것들을 포함하는데, 여기서 상이한 특이성을 가지는 2개의 항체의 결합 도메인이 사용되고 짧은 가요성 펩티드에 의해 직접 연결될 수 있다. 이것은 짧은 단일 폴리펩티드 사슬에 두 개의 항체를 결합시킨다. 디아바디(diabody) 및 scFc는 변이 영역만을 사용하여 Fc 영역 없이 구성되며, 이는 잠재적으로 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응의 효과를 감소시킨다.
이중특이성 항체는 완전 IgG, 이중특이성 (Fab')2, (Fab')PEG, 디아바디 또는 기타 이중특이성 scFv로 구성될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 2개의 이중특이성 항체를 연결하여 4가(tetravalent) 항체를 형성할 수 있다.
이중특이성 전체 항체와 비교하여, 이중특이성 디아바디는 또한 E. coli에서 쉽게 구성되고 발현될 수 있기 때문에 특히 유용하다. 파지 디스플레이 라이브러리(WO1994/13804)를 사용하여, 적절한 결합 특이성을 갖는 디아바디(및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)를 쉽게 선택할 수 있다. 디아바디의 한쪽 팔이 일정하게 유지되면, 다른 쪽 팔이 돌연변이된 라이브러리가 준비되고, 적절한 특이성의 항체가 선택된다. 이중특이성 전체 항체는 Ridgeway et al.(Ridgeway, J.B.B. et al., Protein Eng. 9, 616-621, 1996) 또는 WO1996/27011, WO1998/50431 및 WO2006/028936에 기술된 다양한 엔지니어링 방법으로 제조할 수 있다.
"변형된 중쇄 불변 영역"은 불변 도메인 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역을 지칭하며, 여기서 불변 도메인 중 하나 이상은 상이한 이소타입(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 변형된 불변 영역은 인간 IgG2 CH1 도메인 및 인간 IgG1 CH2 도메인 및 인간 IgG1 CH3 도메인에 융합된 인간 IgG2 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 변형된 불변 영역은 또한 야생형 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 도메인 내의 아미노산 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)를 지칭한다.
"동종이형(allotype)"은 특정 이소타입 그룹에서 자연적으로 발생하는 변이체를 지칭하며, 이 변이체는 몇 개의 아미노산에서 상이하다(예를 들어 Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1 참조). 본원에 기재된 항체는 임의의 동종이형일 수 있다.
본원에서 달리 명시되지 않는 한, 모든 아미노산 번호는 Kabat 시스템의 EU 인덱스(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 따른다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 용어는 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, LIF에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 LIF 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 LIF의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종의 다른 LIF 단백질과 교차 반응성을 가질 수 있다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용, 또는 그로부터 발생하는 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, ADCC 및 항체 의존성 세포 매개 식세포작용(antibody dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP)와 같은 FcγR 매개 이펙터 기능, 및 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합될 것을 요구한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이러한 수용체의 대립형질(allelic) 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3개의 활성화 수용체(마우스의 경우 FcγRⅠ, FcγRⅢ, 및 FcγRⅣ; 인간의 경우 FcγRⅠA, FcγRⅡA, 및 FcγRⅢA)와 1개의 억제성 수용체(FcγRⅡB)로 구성된다. 인간 FcγR의 다양한 특성이 표 A에 요약되어 있다. 대다수의 선천적 이펙터 세포 유형은 하나 이상의 활성화 FcγR 및 억제성 FcγRⅡB를 공동 발현하는 반면, 자연 살해(natural killer, NK) 세포는 마우스와 인간에서 하나의 활성화 Fc 수용체(마우스의 경우 FcγRⅢ 및 인간의 경우 FcγRⅢA)를 선택적으로 발현하고 억제성 FcγRⅡB를 발현하지 않는다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하며, 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형은 뮤린 IgG2a와 동등하다고 여겨진다.
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"힌지", "힌지 도메인" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 불변 영역의 도메인을 지칭하며, 힌지의 상부, 중간 및 하부 부분을 포함한다(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083). 힌지는 항체의 결합 영역과 이펙터 영역 사이에 다양한 수준의 유연성을 제공하고 2개의 중쇄 불변 영역 사이의 분자간 이황화 결합을 위한 부위도 제공한다.
용어 "힌지"는 야생형 힌지 뿐만 아니라 그의 변이체(예: 비-자연 발생 힌지 또는 변형된 힌지)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "IgG2 힌지"는 야생형 IgG2 힌지, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5개 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어, 치환, 결실 또는 추가를 가지는 변이체를 포함한다.
용어 "CH1 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 가변 도메인을 힌지에 연결하는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인 뿐만 아니라 그의 변이체(예를 들어, 비-자연 발생 CH1 도메인 또는 변형된 CH1 도메인)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어, 치환, 결실 또는 추가를 가지는 그의 변이체를 포함한다. 예시적인 CH1 도메인은 ADCC, CDC 또는 반감기와 같은 항체의 생물학적 활성을 변화시키는 돌연변이를 가지는 CH1 도메인을 포함한다.
용어 "CH2 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 힌지를 CH3 도메인에 연결하는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인 뿐만 아니라 그의 변이체(예를 들어, 비-자연 발생 CH2 도메인 또는 변형된 CH2 도메인)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어, 치환, 결실 또는 추가를 가지는 그의 변이체를 포함한다. 예시적인 CH2 도메인은 ADCC, CDC 또는 반감기와 같은 항체의 생물학적 활성을 변화시키는 돌연변이를 가지는 CH2 도메인을 포함한다.
용어 "CH3 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 CH2 도메인의 C-말단에 있는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인 뿐만 아니라 그의 변이체(예를 들어, 비-자연 발생 CH3 도메인 또는 변형된 CH3 도메인)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어, 치환, 결실 또는 추가를 가지는 그의 변이체를 포함한다. 예시적인 CH3 도메인은 ADCC, CDC 또는 반감기와 같은 항체의 생물학적 활성을 변화시키는 돌연변이를 가지는 CH3 도메인을 포함한다.
"CL 도메인"은 경쇄의 불변 도메인을 의미한다. 용어 "CL 도메인"은 야생형 CL 도메인 및 그의 변이체를 포함한다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "천연 서열 Fc"는 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 Fc는 Fc의 다양한 동종이형을 포함한다(예를 들어, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1 참조).
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원(예를 들어, LIF) 상의 부위를 지칭한다. 단백질 항원 내의 에피토프는 인접(contiguous) 아미노산(보통 선형 에피토프) 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비인접(noncontiguous) 아미노산(보통 구조적 에피토프) 양자 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 항상 그런 것은 아니지만 전형적으로 변성(denaturing) 용매에 노출될 때 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리할 때 전형적으로 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 구조에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 어떤 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지 결정하는 방법(즉, 에피토프 매핑)은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 면역블롯팅 및 면역침전 분석을 포함하며, 여기서 중첩되거나 인접한 펩티드(예: LIF로부터)는 주어진 항체(예: 항-LIF 항체)와의 반응성에 대해 테스트된다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당업계의 기술 및 본 명세서에 설명된 기술, 예를 들어 x-선 결정학, 2차원 핵 자기 공명 및 HDX-MS를 포함한다(예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) 참조).
"표적에 대한 결합에 대해 다른 항체와 경쟁하는" 항체는 표적에 대한 다른 항체의 결합을 억제(부분적으로 또는 완전히 억제)하는 항체를 지칭한다. 2개의 항체가 표적에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 하나의 항체가 표적에 대한 다른 항체의 결합을 억제하는지 여부 및 그 정도는 실시예에 기재된 것과 같은 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 다른 항체와 경쟁하고, 결합의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 억제한다. 억제 또는 경쟁의 정도는 어떤 항체가 "차단(blocking) 항체"(즉, 표적과 먼저 배양되는 저온 항체(cold antibody))인지에 따라 다를 수 있다. 경쟁 분석은 예를 들어 Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Pro toe; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 또는 Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999 에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 경쟁 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접한 에피토프에 결합한다(예를 들어, 입체 장애(steric hindrance)에 의해 입증됨).
다른 경쟁 결합 분석은 다음을 포함한다: 고체상 직접 또는 간접 방사선면역분석(radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(enzyme immunoassay, EIA), 샌드위치 경쟁 분석(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983) 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) 참조); 고체상 직접 표지(labeled) 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); I-125 라벨을 사용하는 고체상 직접 라벨 RIA(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지 RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)).
본원에서 사용되는 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합(association) 속도 상수를 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에서 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리(dissociation) 속도 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현되는 평형 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체의 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 분석하는 것이며, 바람직하게는 Biacore® 표면 플라즈몬 공명 시스템 또는 유세포 분석 및 스캐차드(Scatchard)와 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 분석하는 것이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 시험관내 또는 생체내 분석의 맥락에서 용어 "EC50"은 최대 반응(maximal response)의 50%인 반응, 즉 최대 반응과 기준선 사이의 중간을 유도하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 농도를 지칭한다.
기능 분석에서, "IC50"이라는 용어는 생물학적 반응을 최대값의 50%로 감소시킬 수 있는 결합 구성원의 농도이며 nM을 단위로 한다. 리간드 결합 연구에서, IC50은 수용체 결합을 최대 특이적 결합 수준의 50%로 감소시키는 농도이다. IC50은 결합 구성원 농도의 로그의 함수로서 최대 생물학적 활성 반응의 백분율을 표시(plotting)하고, S 함수를 데이터에 맞추는 Origin(OriginLab Software Company, Northampton, Massachusetts, USA)과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 IC50 값을 생성함으로써 계산할 수 있다. 효능은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되거나 참조되는 하나 이상의 분석 방법을 사용하여 결정 또는 측정된다. 결합 구성원의 중화 효능은 기하 평균(Geomean)으로 표현될 수 있다.
본원에서 대상(object)에 적용되는 것으로 사용되는 "자연 발생"이라는 용어는 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연의 소스로부터 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생이다.
"폴리펩티드"는 사슬 길이에 대한 상한 없이 연속적으로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 사슬을 지칭한다. 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기는 글리코실화, 인산화 또는 이황화 결합과 같은 변형을 포함할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있으며, cDNA일 수 있다. 또한, 본원에 기재된 서열번호에 기재된 서열의 "보존적 서열 변형"이 제공되며, 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 항원에 대한 결합을 폐지하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형이 제공된다. 이러한 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 아미노산 추가 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 변형은 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 본원에 기재된 서열번호 내로 도입될 수 있다. 보존적 서열 변형은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄가 있는 아미노산(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄가 있는 아미노산(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄가 있는 아미노산(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다.
핵산과 관련하여, "실질적인 동일성"이라는 용어는 최적으로 정렬되고 비교될 때, 적절한 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실과 함께, 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 적어도 약 80%의 뉴클레오티드에서, 일반적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드에서 동일하다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 세그먼트가 선택적 혼성화 조건 하에서 사슬의 상보체에 혼성화될 때, 실질적인 동일성이 존재한다.
폴리펩티드와 관련하여, "실질적인 동일성"이라는 용어는 최적으로 정렬되고 비교될 때, 적절한 아미노산의 삽입 또는 결실과 함께, 2개의 폴리펩티드 또는 이의 지정된 서열이 적어도 약 80%의 아미노산에서, 일반적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 아미노산에서 동일하다는 것을 나타낸다.
두 서열 간의 동일성 %는 서열이 최적으로 정렬될 때 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이며(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100), 최적의 정렬은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭(gap)의 수와 각 갭의 길이를 고려하여 결정된다. 서열의 비교 및 2개의 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스와 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 사용가능)을 사용하여 결정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔여 테이블, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller(CABIOS, 4: 11-17 (1989))의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나와 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 이용가능)에 통합된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열(query sequence)"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)으로 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12를 사용하여 수행되어 본원에 기재된 핵산 분자와 동일한 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3을 사용하여 수행되어 본원에 기재된 단백질 분자와 동일한 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예: XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.
이러한 핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 널리 공지된 기타 방법을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포성 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포성 핵산(예: 염색체의 다른 부분) 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게" 된다. F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 참조.
핵산, 예를 들어 cDNA는 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 암호화 서열의 경우, 이들 돌연변이는 원하는 대로 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 천연 V, D, J, 불변, 스위치 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 동일하거나 이들로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"로, 이는 다른 DNA 세그먼트가 연결될 수 있는 원형 이중 사슬 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 다른 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜(episomal) 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예: 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포, 및 아마도 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 단백질, 펩티드 또는 합텐(hapten)과 같은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질을 지칭한다. 항원은 LIF 또는 이의 단편일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "억제" 또는 "차단"(예를 들어, LIF 결합 또는 활성의 억제/차단을 지칭함)은 상호교환적으로 사용되며 부분적 및 완전한 억제/차단 둘 다를 포함한다.
본원에서 사용되는 "암"은 신체에서 비정상 세포의 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 광범위한 질병 그룹을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열은 악성 종양이나 세포를 형성할 수 있기 때문에, 이들은 이웃 조직을 침범하여 림프계나 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질병과 관련된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후(indicia)의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전(reversing), 경감, 개선, 억제, 또는 늦추거나 예방하는 것을 목적으로 대상체에 임의의 유형의 개입 또는 과정을 수행하거나 대상체에 활성제를 투여하는 것을 지칭한다. 예방은 질병이 없는 대상체에게 질병이 발생하는 것을 예방하거나 질병이 발생하면 그 영향을 최소화하기 위해 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "유효 용량(dose)" 또는 "유효 투여량(dosage)"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 투여량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용될 때 질병 증상의 중증도의 감소, 질병 무증상 기간의 빈도와 기간의 증가, 또는 질병의 고통(affliction)으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증되는 질병 퇴행을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 "예방적 유효량" 또는 "예방적 유효 투여량"은 질병이 발병하거나 질병의 재발을 겪을 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 때 질병, 질병의 발달 또는 재발을 억제하는 약물의 양이다. 질병 퇴행을 촉진하거나 질병의 진행 또는 재발을 억제하는 치료제 또는 예방제의 능력은, 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 분석에서 제제의 활성을 분석함으로써와 같이, 당업자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
"환자" 및 "대상체"라는 용어는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 모든 인간 또는 인간이 아닌 동물을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 암에 걸린 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. "인간이 아닌 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비포유동물, 예컨대 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
실시예
실시예 1: 항-인간 LIF 모노클로날 항체의 스크리닝 및 동정
1.1 하이브리도마 방법에 의한 항-인간 LIF 모노클로날 항체 38E10E1C11의 제조
모노클로날 항체 제조 방법(Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495)에 따라, 재조합 인간 LIF 단백질(Sino Biological에서 구입)을 사용하여 BABL/c 마우스를 면역화시켰다. 25 μg 재조합 인간 LIF 단백질과 동일한 부피의 프로인트 완전 어쥬번트(Freund's complete adjuvant)를 사용하여 등(back)의 다중 피하 주사에 의해 초기 면역화하였다. 4주 후, 프로인트 불완전 어주번트와 25 μg의 재조합 인간 LIF 단백질을 사용하여 2차 면역화하였다. 간접 ELISA 방법을 사용하여 20일 후 항체의 역가를 검출하였다. 2-3주 간격 후, 50 μg의 재조합 인간 LIF 단백질을 복강내 주사하여 면역화를 강화하였다. 3일 후, 동물을 희생시키고 융합을 위해 비장 세포를 채취하였다.
대수 성장기의 마우스 골수종 세포 SP2/0을 취하여 계수하고, 면역화된 마우스의 비장 세포 현탁액을 제조하였다. 비장 세포를 통상적인 방법에 따라 50% PEG를 사용하여 SP2/0 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 영양막 세포(trophoblast cell)(6주령 BABL/c 마우스 복막 대식세포)의 96-웰 플레이트에 첨가하고, 1% HAT 및 20% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 스크리닝 및 배양하였다. 클론이 플레이트 바닥의 1/3까지 성장했을 때, 배양 상청액을 수집하였다. ELISA 플레이트를 재조합 인간 LIF 단백질로 코팅하고, 간접 ELISA 방법을 사용하여 배양 상청액에서 항-LIF 항체를 검출하고 항-인간 LIF 항체를 분비하는 클론을 스크리닝하였다. 또한, 한계 희석법(limiting dilution)을 이용한 모노클로날 항체화(antibodyization)를 통해 고친화성 항-인간 LIF 모노클로날 항체를 안정적으로 분비하는 세포주를 수득하였고, 분비 항체를 38E10E1C11로 표지하였다. 38E10E1C11 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 전장 유전자 서열은 각각 서열번호 42 및 서열번호 44에 나타낸 바와 같이 결정되었고, 38E10E1C11 항체의 경쇄 및 중쇄의 상응하는 전장 아미노산 서열은 각각 서열번호 41 및 서열번호 43에 나타내었다; 38E10E1C11 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 유전자 서열은 각각 서열번호 76 및 서열번호 77에 나타내었고; 38E10E1C11 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 75에 나타내었다. Kabat 시스템에 따라, 38E10E1C11 항체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타내었고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타내었고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내었고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 45에 나타내었고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타내었다. 38E10E1C11 항체의 면역글로불린 타입 및 서브타입을 확인하였다(결과는 IgG1 서브타입, κ 타입 경쇄임).
항체를 안정적으로 분비할 수 있는 하이브리도마 세포주를 얻은 후, thermo fisher 사의 CD 하이브리도마 무혈청 배지로 세포를 길들여 무혈청 현탁 진탕 배양에 적응시킨 후, 무혈청 배지를 사용하여 항체를 발현 및 정제하였다.
1.2 파지 디스플레이 기술에 의한 항-인간 LIF 모노클로날 항체 P36-033의 제조
재조합 인간 LIF 단백질을 사용하여 BABL/c 마우스를 면역화시켰다. 25 μg 재조합 인간 LIF 단백질과 동일한 부피의 프로인트 완전 어쥬번트를 사용하여 등(back)의 다중 피하 주사에 의해 초기 면역화하였다. 4주 후, 프로인트 불완전 어주번트와 25 μg의 재조합 인간 LIF 단백질을 사용하여 2차 면역화하였다. 간접 ELISA 방법을 사용하여 20일 후 항체의 역가를 검출하였다. 2-3주 간격 후, 50 μg의 재조합 인간 LIF 단백질을 복강내 주사하여 면역화를 강화하였다. 3일 후, 동물을 희생시키고 융합을 위해 비장 세포를 채취하였다. Invitrogen Company의 TRIZOL Reagent를 사용하여 비장 세포로부터 총 RNA를 추출하고 Invitrogen cDNA Reverse Transcription Kit를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 항체 유전자를 마우스 경쇄 및 중쇄 가변영역의 축퇴(degenerate) 프라이머로 증폭시켜 파지 디스플레이 벡터로 구축하고, 파지 항체 라이브러리를 구축하였다. 열자동 자기 비드 선별 시스템을 사용하여 파지 항체 라이브러리의 제거 및 선별하였고, 파지 ELISA를 사용하여 재조합 인간 LIF 단백질에 결합할 수 있는 E. coli 클론을 선별하였고, 항체의 서열을 결정하였다. 또한, ELISA 및 세포 생존율 확인에 의해 P36-033 항체를 수득하였다. P36-033 항체의 경쇄 및 중쇄의 전장 유전자 서열은 각각 서열번호 55 및 서열번호 57에 나타내었고, P36-033 항체의 경쇄 및 중쇄의 상응하는 전장 아미노산 서열은 각각 서열번호 54 및 서열번호 56에 나타내었다; P36-033 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 유전자 서열은 각각 서열번호 72 및 서열번호 73에 나타내었고, P36-033 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 82 및 서열번호 83에 나타내었다. Kabat 시스템에 따라, P36-033 항체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 66에 나타내었고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 67에 나타내었고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 68에 나타내었고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 69에 나타내었고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 70에 나타내었고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 71에 나타내었다.
1.3 양성 대조군 항체 5D8의 발현 및 정제
WO 2018/115960 A1의 특허문헌의 보고에 따르면, 항체 5D8은 LIF 단백질과 GP130의 결합을 억제하는 항체이다. 특허문헌에 따르면, 상기 발명의 다중의 유전자 서열을 합성하고, 서로 다른 경쇄와 중쇄를 서로 다른 조합으로 짝지어 인간 IgG1 형태의 전장 항체를 구축하고, 그 중 LIF 단백질에 가장 잘 결합하는 하나를 결국 발견하였고, 한편 그것은 재조합 인간 LIF 단백질이 인간 GP130과 결합하는 것을 차단할 수 있고, 세포 생존력 확인을 통해 HCT116 세포에서 재조합 인간 LIF 단백질에 의한 STAT3의 인산화를 차단할 수 있으므로, 본 발명에서는 이를 후속 시험에서 양성 대조군 항체로서 5D8로 명명하였다. 5D8 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 전장 유전자 서열은 각각 서열번호 63 및 서열번호 65에 나타낸 바와 같이 결정되었고, 5D8 항체의 중쇄 및 경쇄의 상응하는 전장 아미노산 서열은 각각 서열번호 62 및 서열번호 64에 나타내었고; 5D8 항체의 가변 영역을 암호화하는 유전자 서열은 각각 서열번호 80 및 서열번호 81에 나타낸 바와 같이 결정되었고, 5D8 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 78 및 서열번호 79에 나타내었다.
실시예 2: 인간 LIF 단백질에 대한 항-인간 LIF 항체의 결합 실험
재조합 인간 LIF 단백질을 1 μg/mL로 희석하고, 효소 표지 플레이트에 코팅하고, 100 μL의 단백질을 모든 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 효소 표지 플레이트를 꺼내 액체를 버리고, PBST로 3회 세척하고 PBS 중 2% BSA로 상온에서 1시간 블로킹한 후, PBST로 3회 세척하고, 항-인간 LIF 항체 38E10E1C11, 5D8 및 P36-033을 상이한 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 액체를 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 플레이트에 HRP-표지된 염소 항-마우스 Fab 항체 또는 염소 항-인간 FC 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 액체를 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 TMB 발색 용액과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 2 mol/L H2SO4를 첨가하여 발색을 멈추고, 450 nm에서의 흡광도를 자동화된 플레이트 광도계(automated plate photometer)로 정량화하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 결과는 인간 LIF 단백질에 대한 38E10E1C11 항체와 P36-033 항체의 결합이 인간 LIF 단백질에 대한 5D8 항체의 결합보다 더 강하다는 것을 보여준다.
실시예 3: 마우스 LIF 단백질에 대한 항-인간 LIF 항체의 결합 실험
재조합 마우스 LIF 단백질(ACRO Biosystems에서 구입)을 1 μg/mL로 희석하고, 효소 표지 플레이트에 코팅하고, 100 μL의 단백질을 모든 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 효소 표지 플레이트를 꺼내 액체를 버리고, PBST로 3회 세척하고 PBS 중 2% BSA로 상온에서 1시간 블로킹한 후, PBST로 3회 세척하고, 항-인간 LIF 항체 38E10E1C11, 5D8 및 P36-033을 상이한 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 액체를 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 플레이트에 HRP-표지된 염소 항-마우스 Fab 항체 또는 염소 항-인간 FC 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 액체를 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 TMB 발색 용액과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 2 mol/L H2SO4를 첨가하여 발색을 멈추고, 450 nm에서의 흡광도를 자동화된 플레이트 광도계로 정량화하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 결과는 38E10E1C11 항체는 마우스 LIF 단백질에 대한 결합 활성이 없고, P36-033 항체는 5D8 항체보다 낮은 마우스 LIF 단백질에 대한 결합 활성이 있음을 보여준다.
실시예 4: 시노몰구스 원숭이( Machin ) LIF 단백질에 대한 항-인간 LIF 항체의 결합 실험
재조합 시노몰구스 원숭이 LIF 단백질(Sino biological에서 구입)을 0.5 μg/mL로 희석하고, 효소 표지 플레이트에 코팅하고, 100 μL의 단백질을 모든 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 효소 표지 플레이트를 꺼내 액체를 버리고, PBST로 3회 세척하고 PBS 중 2% BSA로 상온에서 1시간 블로킹한 후, PBST로 3회 세척하고, 항-인간 LIF 항체 38E10E1C11, 5D8 및 P36-033을 상이한 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 액체를 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 플레이트에 HRP-표지된 염소 항-마우스 Fab 항체 또는 염소 항-인간 FC 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 액체를 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 TMB 발색 용액과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 2 mol/L H2SO4를 첨가하여 발색을 멈추고, 450 nm에서의 흡광도를 자동화된 플레이트 광도계로 정량화하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 결과는 38E10E1C11 및 P36-033의 결합 활성이 5D8의 결합 활성보다 우수함을 보여준다.
실시예 5: 항-인간 LIF 항체의 친화도 분석
재조합 인간 LIF 단백질에 대한 정제된 모노클로날 항체의 친화도를 KinExA 4000에 의해 결정하였다. 200 mg PMMA 경질 비드에 30 μg의 38E10E1C11 항체를 첨가하고 코팅 용액을 1 mL으로 추가로 첨가하였다. 완충액 조성은 1× PBS, pH 7.4, 0.02% NaN3이었다. 그리고 비드가 용액에 완전히 현탁되었는지 확인하고, 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 비드는 자연적으로 침전되거나 저속으로 빠르게 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 비드를 1% BSA를 함유하는 PBS로 블로킹하였다. 300 pM 항원 용액 15 mL 및 240 pM Ab2(38E10E1C11) 용액 15 mL를 준비하였다. 0.6 mL의 300 pM 항원 및 0.6 mL의 240 pM 항체 Ab2(38E10E1C11)를 서로 다른 샘플 튜브에 별도로 넣었다. 두 개의 튜브에 있는 시료를 잘 혼합하여 하나의 튜브에 합쳤고, 이때 항원의 농도는 150 pM이었고, 항체 Ab2(38E10E1C11)의 농도는 120 pM이었으며, 용액을 튜브 홀더의 해당 위치에 놓았다. 16개의 그룹을 준비하였고, 각 그룹의 인큐베이션 시간을 다르게 하였다. 각 그룹에 1 μg/ml 스트렙트아비딘 단백질, DyLight 650 용액을 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션하도록 설정된 기계에서 검출하였다. KinExatm Pro 소프트웨어에서, n-커브 분석을 위한 평형 해리 상수(Kd)를 미지의 리간드 모델을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 결과는 인간 LIF 단백질에 대한 38E10E1C11 mAb의 친화도가 4.52×10-12 M임을 보여준다.
실시예 6: P36-033 mAb 및 38E10E1C11 mAb는 인간 LIF 단백질에 대한 결합에 대해 LIFR과 경쟁한다
재조합 인간 LIF 단백질을 효소 표지 플레이트에 1 μg/mL 농도로 코팅하고, 0.6125 μg/mL 농도의 LIFR 단백질(인간 FC와 융합 발현됨)을 첨가하고(50 μL/웰), 항-인간 LIF 항체 38E10E1C11, P36-033, 및 CHO 세포에 의해 재조합적으로 발현되는 38E10E1C11R(서열번호 41 및 43)을 서로 다른 농도로 동시에 별도로 첨가하고(50 μL/웰), 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 4회 세척한 후, HRP-표지된 염소 항-마우스 FC 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 TMB 발색 용액을 10분 동안 첨가하였다. 450 nm에서의 흡광도를 효소 표지 측정기를 사용하여 정량화하고, 데이터를 Origin pro 9 소프트웨어를 사용하여 분석하고 플롯팅하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 결과는 38E10E1C11 mAb 및 38E10E1C11R은 인간 LIFR에 대한 인간 LIF의 결합을 억제할 수 있는 반면, P36-033 mAb는 인간 LIFR에 대한 인간 LIF의 결합을 억제할 수 없음을 보여준다.
실시예 7: P36-033 mAb 및 38E10E1C11 mAb는 인간 LIF 단백질에 대한 결합에 대해 GP130과 경쟁한다
재조합 인간 LIF 단백질을 효소 표지 플레이트에 1 μg/mL 농도로 코팅하고, 20 μg/mL 농도의 GP130 단백질(인간 FC와 융합 발현됨)을 첨가하고(50 μL/웰), 항-인간 LIF 항체 P36-033 및 38E10E1C11을 서로 다른 농도로 동시에 별도로 첨가하고(50 μL/웰), 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이와 동시에, 항체를 첨가하고 GP130 단백질을 첨가하지 않은 대조군 웰을 설정하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 4회 세척한 후, HRP-표지된 염소 항-마우스 FC 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 TMB 발색 용액을 10분 동안 첨가하였다. 450 nm에서의 흡광도를 효소 표지 측정기를 사용하여 정량화하고, 데이터를 Origin pro 9 소프트웨어를 사용하여 분석하고 플롯팅하였다. 결과를 도 6에 나타내었다. 결과는 P36-033 및 38E10E1C11이 인간 GP130 단백질에 대한 인간 LIF의 결합을 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 8: 38E10E1C11 mAb의 특이성 검출
인간 LIF, 인간 IL-6, 인간 OSM, 인간 CNTF(Sino biological에서 구입)를 효소 표지 플레이트에 1 μg/mL 농도로 별도로 코팅하고, 항-인간 LIF 항체 38E10E1C11, P36-033 및 5D8을 서로 다른 농도도 별도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 HRP-표지된 염소 항-마우스 FC 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 TMB 발색 용액을 첨가하여 실온에서 10분 동안 발색시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 효소 표지 측정기를 사용하여 정량화하고, 데이터를 Origin pro 9 소프트웨어를 사용하여 분석하고 플롯팅하였다. 결과를 도 7에 나타내었다. 결과는 38E10E1C11 mAb 및 P36-033 mAb는 인간 LIF 단백질에만 결합하고 인간 IL-6, 인간 OSM 및 인간 CNTF에는 결합하지 않은 반면, 5D8 항체는 인간 OSM 및 인간 CNTF 단백질에 결합하였음을 보여준다.
실시예 9: 38E10E1C11 mAb는 인간 LIF 단백질의 웨스턴 블롯 검출에 사용될 수 있다
재조합 인간 LIF 단백질을 도 8에 나타낸 농도로 희석하였다. 3일 동안 배양한 CT26 및 CT26-hLIF 세포의 세포 상청액을 5X SDS-PAGE 로딩 완충액에 첨가하고 10분 동안 끓였다. 10 μL 샘플을 채취하여 SDS-PAGE 전기영동한 후, 전기영동 밴드를 PVDF 멤브레인으로 옮겨 웨스턴 블롯 검출을 하고, 검출에 사용된 1차 항체는 1 μg/mL 농도의 38E10E1C11 항체로, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, TBST 완충액으로 3회 세척하였다. 그런 다음 1:3000 희석된 HRP-표지 염소 항-마우스 2차 항체를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, TBST 완충액으로 3회 세척하였다. 그런 다음 강화 화학발광 용액(Perice)을 첨가하여 인큐베이션하고, Amersham Imager 600 초고감도 다기능 이미저를 사용하여 검출 및 사진촬영을 수행하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 결과는 38E10E1C11 mAb가 인간 LIF 단백질의 웨스턴 블롯 검출에 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 10: 항-인간 LIF 항체 세포 활성 분석
10.1 HCT116 세포에서 STAT3 활성화 억제 검출
HCT116 세포를 분해하고 원심분리한 후, 세포를 재현탁시키고 12-웰 플레이트에 5×105개 세포/웰로 1 mL의 부피로 플레이팅하였다. 그런 다음 세포를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 원래의 배지를 버리고, 100 ng/mL의 재조합 인간 LIF 단백질과 항-LIF 항체를 농도별로 포함하는 세포 배양 배지를 첨가하여 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 동시에 재조합 인간 LIF 단백질을 함유하지 않는 대조군 웰 및 항체 없이 재조합 인간 LIF 단백질만을 함유하는 대조군 웰을 설정하였다. 그런 다음 배지를 제거하고 100 μL 1x 용해액을 12-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 용해물이 있는 튜브를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 취하여 STAT3의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 검출을 수행하였다. 결과를 도 9의 패널 A 및 도 11에 나타내었다. 그 결과, 38E10E1C11 항체 및 P36-033 항체가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 HCT116 세포에서의 STAT3의 인산화를 억제할 수 있음이 밝혀졌다.
10.2 KP4 세포에서 STAT3 활성화 억제 시험을 통한 항-인간 LIF 항체의 활성 검출
KP4 세포를 분해하고 원심분리한 후, 세포를 재현탁시키고 12-웰 플레이트에 5×105개 세포/웰로 1 mL의 부피로 플레이팅하였다. 그런 다음 세포를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 원래의 배지를 폐기하고, 50 ng/mL의 재조합 인간 LIF 단백질과 항-LIF 항체를 농도별로 포함하는 세포 배양 배지를 첨가하여 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 동시에 재조합 인간 LIF 단백질을 함유하지 않는 대조군 웰 및 항체 없이 재조합 인간 LIF 단백질만을 함유하는 대조군 웰을 설정하였다. 그런 다음 배지를 제거하고 100 μL 1x 용해액을 12-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 용해물이 있는 튜브를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 취하여 STAT3의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 검출을 수행하였다. 결과를 도 9의 패널 B에 나타내었으며, 이는 38E10E1C11 항체가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 KP4 세포에서의 STAT3의 인산화를 억제할 수 있음을 보여준다.
10.3 KP4 세포에서 STAT3 활성화 억제 시험을 통한 항-인간 LIF 항체의 활성 검출
KP4 세포를 분해하고 원심분리한 후, 세포를 재현탁시키고 12-웰 플레이트에 5×105개 세포/웰로 1 mL의 부피로 플레이팅하였다. 그런 다음 세포를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 원래의 배지를 폐기하고, 서로 다른 농도의 항-LIF 항체와 CT26-hLIF 세포의 세포 배양 배지를 1:1의 부피비로 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 동시에 CT26의 배양 상청액을 포함하는 대조군 웰을 설정하였다. 그런 다음 배지를 제거하고 100 μL 1x 용해액을 세포에 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 용해물이 있는 튜브를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 취하여 STAT3의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 검출을 수행하였다. 도 10은 38E10E1C11 항체가 CT26-hLIF 세포에 의해 분비되는 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 KP4 세포에서의 STAT3의 인산화를 억제할 수 있음을 보여준다.
10. 4 M1 세포 증식 시험을 통한 LIF 항체 활성 검출
M1 세포를 원심분리하고 RPMI1640 배지로 2회 세척하고, M1 세포를 2×105개 세포/mL의 밀도로 웰당 100μL 세포의 부피로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 모든 웰의 부피가 최종적으로 200 μL에 도달할 때까지 10 ng/mL의 재조합 인간 LIF 단백질 및 서로 다른 농도의 항-LIF 항체를 함유하는 세포 배양 배지를 첨가하고 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 동시에, 인간 LIF 단백질이 없는 대조군 웰을 설정하였다. CCK-8을 첨가하여 세포 증식을 측정하였다. 결과를 도 12에 나타내었으며, 결과는 mAb38E10E1C11 mAb 및 P36-033 mAb 양자 모두가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 M1 세포의 증식의 억제를 역전시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 11: 생체 내 항-인간 LIF 항체의 항-종양 활성의 검출
38E10E1C11 항체는 ELISA 분석에서 마우스 LIF 단백질과 교차 반응하지 않는 것으로 나타났다. 생체 내 활성 평가를 수행하기 위해서는, 인간 LIF 단백질을 과발현하는 CT26 세포주를 구축할 필요가 있었다. 문헌에 따르면, 인간 LIF 단백질은 마우스 세포 표면의 LIFR 및 GP130에 결합하여 다운스트림 신호를 활성화할 수 있다. 따라서, 인간 LIF 단백질을 고도로 발현하는 CT26 세포에서 분비되는 인간 LIF 단백질은 마우스의 면역계를 억제할 수 있고, 항 LIF 단백질은 억제 효과를 완화하여 항-종양 효과를 발휘할 수 있다고 추측하였다.
11.1 인간 LIF 유전자를 과발현하는 CT26 세포주 확립
마우스 결장암 세포주 CT26을 인간 LIF 유전자를 포함하는 구축된 렌티바이러스로 감염시켰다. 48시간 후에 LIF 단백질의 발현을 검출하였다. 한계 희석법으로 세포주를 클로닝하고, 최종 농도가 1 μg/mL인 퓨로마이신 배지를 첨가하여 가압 스크리닝을 하였다. 최종적으로 인간 LIF 단백질을 안정적이고 고도로 발현하는 CT26 세포주를 수득하였다.
11.2 CT26- hLIF BABL /C 피하 이식 모델에 의해 검출된 항-인간 LIF 항체의 항-종양 활성
CT26-hLIF 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하고, 대수 성장기의 세포를 수집하고, PBS에 107개 세포/mL로 재현탁시키고, BABL/c 마우스에 피하 접종하였다. 접종 1일 후, 마우스를 그룹으로 나누어 각각 비히클 대조군, 항-인간 LIF 항체를 투여하고, 투여 농도는 15 mg/kg 체중, 주 2회, 4주 연속 투여하고, 종양 부피를 주 2회 측정하고, 종양 성장 곡선을 그리고, 종양 억제율을 계산하였다. 결과를 도 13에 나타내었다. 결과는 38E10E1C11 mAb가 BABL/c 마우스에서 CT26-hLIF 세포 증식을 억제할 수 있음을 보여준다.
11.3 LIF 단백질 자극에 대한 다양한 췌장암 세포주의 민감도 측정
인간 췌장암 세포주 Panc02.03, KP4, MIA paca2를 각각 106개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하였다. 밤새 배양한 후 배지를 새로운 배지로 교체하고, 50 ng/mL 재조합 인간 LIF 단백질 및 38E10E1C11 항체를 첨가하는 한편, LIF 단백질이 없는 대조군 웰을 설정하였다. 처리 웰 및 대조군 웰을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 배지를 제거하고 200 μL 1x 용해액을 각 웰 당 200 μL로 세포에 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기고, 용해물이 있는 튜브를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 취하여 STAT3의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 검출을 수행하였다. 결과를 도 14에 나타내었다. 결과는 KP4 세포주가 인간 LIF 단백질의 자극에 가장 민감함을 보여준다.
실시예 12: 38E10E1C11 mAb 항체 및 P36-033 mAb의 재조합 발현 및 검증
38E10E1C11 mAb 및 P36-033 mAb의 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 상동 재조합 기술에 의해 진핵생물 발현 벡터 PCDNA3.1+에 구축하였다. Thermo사의 ExpiCHO 발현 시스템에 의해 재조합 항체를 발현시키고, 재조합 항체를 Protein G 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 항체의 내독소(endotoxin) 제거는 Smart-lifesciences 사에서 생산하는 Endotoxin Removal Beads를 사용하여 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 10.2 참조. 도 15는 CHO 세포에 의해 재조합적으로 발현된 38E10E1C11 항체(38E10E1C11R로 표지됨)가 인간 LIF 단백질에 의해 유도된 KP4 세포에서의 STAT3의 인산화를 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 13: 38E10E1C11 항체가 인식하는 에피토프 확인
38E10E1C11 항체(서열번호 41, 43)가 인간 LIF 단백질(서열번호 58) 표면의 선형 에피토프를 인식함을 예비 실험을 통해 확인하였다. 항체는 마우스 LIF 단백질을 인식할 수 없으며 인간 LIF 단백질과 인간 LIFR 단백질의 결합을 차단할 수 있다. 이 세 가지 점에 따라, 다양한 온라인 단백질 선형 에피토프 예측 소프트웨어의 분석과 결합하여, 항체의 인식 에피토프가 LIF 단백질의 160-202 아미노산 서열에 위치하는 것으로 추측하였고, 이에 본 발명자들은 하기 이형(heterozygous) LIF 단백질을 합성하였다. Mut3(서열번호 59)은 인간 LIF 단백질의 182-202 아미노산 서열을 마우스 LIF 단백질의 서열로 대체한 것이고, mut4(서열번호 60)는 인간 LIF 단백질의 166-202 아미노산 서열을 마우스 LIF 단백질의 서열로 대체한 것이다. mut3, mut4 및 전장 인간 LIF 단백질을 함유하는 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시켰다. 배양 3일 후, 293T 세포의 배양 상청액을 채취하여 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 293T 세포의 배양 상청액을 음성 대조군으로 사용하고, 38E10E1C11을 1차 항체로, HRP 표지된 염소 항-마우스 Fab를 2차 항체로 사용하였다. 동시에 M1 세포 증식 실험을 이용하여 하이브리드 단백질의 활성을 검출하고 하이브리드 단백질에 대한 38E10E1C11의 중화 활성을 확인하였다. 대조군 웰의 여러 그룹을 동시에 설정하였는데, 인간 재조합 LIF 단백질(rhLIF, Yiqiao Shenzhou에서 구입, 제품 번호: 14890-HNAH)을 추가한 대조군 웰, rhLIF 및 38E10E1C11을 추가한 대조군 웰, 및 rhLIF 및 LIF 항체를 추가하지 않는 대조군 웰을 설정하였다. 결과는 38E10E1C11 항체가 변성된 전장 LIF 단백질 및 mut3 단백질은 인식할 수 있지만, mut4 단백질은 인식할 수 없음을 보여주었다(도 16의 패널 A). M1 세포 증식 실험은 38E10E1C11 항체가 M1 세포의 증식에 대한 전장 LIF 단백질 및 Mut3 단백질의 억제는 역전시킬 수 있지만, Mut4 단백질의 억제 효과는 역전시킬 수 없음을 보여준다(도 16의 패널 B). 요약하면, 38E10E1C11 항체의 인식 에피토프는 인간 LIF 단백질의 167-181 아미노산 서열, 즉 아미노산 TYGPDTSGKDVFQKK(서열번호 61)에 위치하였다.
실시예 14: 인간화 LIF 항체의 설계 및 발현 정제
마우스 면역화로부터 수득한 모노클로날 항체 38E10E1C11을 인간화하였다. 인간화는 표준 CDR 이식 방법에 의해 수행하였다. 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 38E10E1C11 하이브리도마로부터 중쇄 및 경쇄 영역을 클로닝하고 Sanger 방법을 사용하여 시퀀싱하였다. 그런 다음 인간 중쇄 및 경쇄 가변 서열에 대해 BLAST 검색을 수행하고 인간화를 위한 수용체 프레임워크로 3개 또는 4개의 서열을 선택하였다. 38E10E1C11의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 3개의 상이한 중쇄 수용체 프레임워크(H1-H3) 및 4개의 상이한 경쇄 프레임워크(L1-L4)에 클로닝하는 한편, 38E10E1C11의 HCDR2(돌연변이 전 아미노산 서열은 서열번호 45에 나타나 있음)는 점 돌연변이시켰고(돌연변이된 아미노산 서열은 서열번호 5에 나타나 있음), 중쇄 불변 영역으로 인간 IgG1 이소형을 선택하였고, 경쇄 불변 영역으로 인간 카파 쇄를 선택하였다. 293S 세포를 인간화 항체 중쇄 및 인간화 항체 경쇄의 유전자를 함유하는 발현 벡터로 공동-형질감염시켰다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자 서열, 가변 영역의 아미노산 서열, 전장 유전자 서열 및 전장 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다. 그런 다음 293S 세포에서 12개의 상이한 항체 조합의 발현 수준, 항원 결합 능력 및 열 안정성을 조사하였다. 38E10E1C11 키메라 항체(Chimeric)를 양성 대조군으로 사용하였고, 모든 38E10E1C11 키메라 항체는 후속 분석에서 38E 키메라 항체 또는 38E 키메라(서열번호 52 및 서열번호 50)로 약칭하였다. 배지를 수집하고 그 안의 IgG 발현 수준을 Gator(Octet과 유사)에서 정량화하고 ELISA로 보정하였다. 다양한 조합의 항원 결합 능력을 ELISA로 비교하였다(표 2, 표 3)
효소 결합 면역흡착 분석(ELISA):
각 웰에 100 μL의 0.5 μg/ml 항원을 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 플레이트를 200 μL의 차단(Closure) 완충액(2% 소 혈청 알부민)으로 실온에서 60분 동안 차단하였다. 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 상이한 농도에서 희석된 항-LIF 항체 100 μL를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 1:5000으로 희석된 HRP-표지 염소 항-인간 Fc 2차 항체 100 μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 100 μL의 H2O2-Amplx 발색 용액(Color Development Solution)을 첨가하여 어두운 조건에서 실온에서 10분 동안 발색시켰다. OD 450 값을 효소 마커에 의해 판독하였다. 열처리: 발현 배지를 PCR 기계에서 70℃에서 5분 동안 가열한 다음 실온으로 급속 냉각시켰다. 후속 ELISA 분석은 위와 같이 수행하였다.
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 15: 정제된 IgG 샘플을 사용한 선택된 인간화 후보 항체의 특성화
결합 친화도, 인간화 퍼센트, 항체 발현 수준 및 열 안정성 데이터에 기초하여, 추가 특성화 단계를 위해 다음의 5개의 후보 항체를 선택하였다: H1L1, H1L4, H2L4, H3L2, H3L4, 그리고 5개의 후보 항체를 38E HuH1L1(서열번호 25 및 9), 38E HuH1L4(서열번호 25 및 21), 38E HuH2L4(서열번호 29 및 21), 38E HuH3L2(서열번호 33 및 13), 및 38E HuH3L4 (서열번호 33 및 21)로 번호를 다시 매겼다. 그런 다음 선택된 VH/VL 플라스미드를 293S 세포에 공동 형질감염시키고, 세포 배양 상청액을 수확하고, 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 38E 키메라 항체에 대한 인간화 항체의 특이적 결합 능력을 비교하기 위해 정제된 항체를 사용하여 결합 ELISA 분석을 수행하였다. 본 발명은 또한 이들의 열 안정성과 비특이적 결합을 비교하기 위해 몇 가지 예비 분석을 수행하였다. 결과는 정제된 후보 항체와 38E 키메라 항체가 매우 유사한 항원-결합 특성을 가짐을 보여주었다(도 17A, 17C). 70℃에서 5분 동안 처리한 후, 5개의 모든 인간화 항체는 키메라 항체와 유사한 결합 능력을 나타내었다(도 17B, 17D).
실시예 16: 인간화 후보 항체의 비특이적 결합 평가
LIF-음성 HEK293 세포의 FACS를 항체의 잠재적인 비특이적 결합의 위험을 평가하기 위한 예비 분석에 사용하였다.
HEK293 세포를 트립신으로 분해하고, 1% FBS를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 재현탁시키고, 1.5-2×106개 세포/mL의 세포 밀도로 조정하고, 96-웰 U자형 플레이트에 첨가하였다. 검출하고자 하는 항체의 농도를 20 μg/mL로 조절한 후, 총 8가지 농도에 대해 3배 구배 희석하여 블랭크(blank) 대조군과 음성 대조군(Rituxan)을 설정하였다. 희석된 항체 및 블랭크 대조군을 96-웰 플레이트의 세포에 첨가하고, 100 μL의 항체를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 조심스럽게 버리고, 1% FBS를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 마지막으로 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL로 세포를 재현탁시키고, 유세포 분석을 수행하였다. HEK293 세포의 비특이적 결합 FACS 분석에서, 38E HuH1L1, 38E HuH3L2, 38E HuH3L4, 38E HuH1L4, 38E 키메라 항체 및 음성 대조군(Rituxan)은 HEK293 세포에 대해 유사한 비특이적 결합 친화성을 갖는 반면, 38E HuH2L4는 HEK293 세포에 대해 더 높은 비특이적 결합 친화성을 나타내었다(도 18의 패널 A 및 B).
실시예 17: 항체 순도의 CE-SDS 분석
CE-SDS 분석의 작업 농도는 1 mg/mL이었고, 항체 샘플을 로딩 완충액으로 지정된 농도로 희석하였다.
비환원된 CE-SDS 전기영동 샘플의 준비: 희석된 샘플 용액 95 μL를 취하고, 0.8 M 암모늄 요오도아세테이트 수용액 5 μL 및 내부 참조물(internal reference) 5 μL를 첨가하고, 볼텍싱하여 잘 혼합하였다. 블랭크 대조군 95 μL을 취하고, 0.8 M 암모늄 요오도아세테이트 수용액 5 μL 및 내부 참조물 5 μL을 첨가하고, 볼텍싱하여 잘 혼합하여 비환원 블랭크 대조군으로 하였다. 그런 다음 금속 배스에서 70℃에서 5분간 가열하고, 실온으로 냉각한 후, 6000 rpm에서 1분간 원심분리하였다.
환원된 샘플 용액의 제조: 희석된 샘플 용액 95 μL를 취하고, 5 μL의 2-메르캅토에탄올 용액 및 5 μL의 내부 참조물을 첨가하고, 볼텍싱하여 잘 혼합하였다. 95 μL의 블랭크 대조군을 취하고 5 μL의 2-메르캅토에탄올 용액 및 5 μL의 내부 참조물을 첨가하고, 볼텍싱하여 잘 혼합하여 환원된 블랭크 대조군으로 하였다. 그런 다음 금속 배스에서 70℃에서 15분간 가열하고, 실온으로 냉각한 후, 6000 rpm에서 1분간 원심분리하였다.
샘플 분석: 75 μL의 샘플을 테스트 튜브에 추가하고, 테스트 튜브를 테스트 컵에 넣었다. 테스트 컵을 주입 트레이에 조심스럽게 삽입하고, 환원된 샘플의 주입 시간은 30초, 비환원된 샘플의 주입 시간은 40초, 모세관 온도는 20℃, 샘플 온도는 20℃, 집속(focusing) 전압은 15 KV, 집속 시간은 40분으로 테스트 프로그램을 실행하였고, 214 nm의 파장에서 PDA 검출기로 데이터를 수집하였다. CE 결과를 표 4, 표 5에 나타내었다.
Figure pct00034
Figure pct00035
실시예 18: 시차주사형광 ( DSF )/ 정적광산란 ( SLS ) 기법에 의한 열 안정성 분석
샘플을 분석을 위해 UNcle 시스템(Unchained Labs)에 제출하였다. DSF 및 SLS에 대해 25℃ 내지 95℃의 온도 범위에서 1℃/min으로 모니터링하였다. UNcle은 266 nm와 473 nm에서 SLS를 측정하였다. Tm 및 Tagg는 UNcle 분석 소프트웨어를 사용하여 계산 및 분석하였다.
IgG는 다중의 구조 도메인을 가지고 있으며, 각각은 고유한 용융 온도(Tm)를 가지고 있다. CH2 구조 도메인은 전형적으로 PBS에서 약 70℃의 Tm을 가지며, CH3는 약 80℃의 Tm으로 더 안정적이다. Fab는 더 가변적인 서열로 인해 약 50-85℃의 더 넓은 Tm 범위를 가진다. 따라서, 다양한 분석 기법으로 측정한 Tm 값은 일반적으로 각 구조 도메인의 실제 Tm 값이 아니라 "겉보기" 전이 온도이다. 분명히, 이 DSF 분석에서도 하나 이상의 Tm 값을 생성할 수 있으며, Tm1만이 치료 항체의 열 안정성을 평가하는 데 사용된다. Tagg는 SLS가 응집(aggregation)을 감지하기 시작하는 온도이다. Tagg266은 266 nm에서 SLS를 측정하며, 이는 보다 민감하고 더 작은 응집 입자를 감지하는 데 더 적합하다. Tagg473은 473 nm에서 SLS를 측정하며, 이는 더 큰 입자를 감지하는 데 더 적합하다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 3개의 인간화 후보 항체 모두는 38E 키메라 항체보다 더 높은 용융 온도(Tm1) 및 더 적은 응집 위험을 갖는다.
Figure pct00036
실시예 19: 동적광산란 기법(DLS)을 사용한 항체의 응집 경향 분석
DLS를 UNcle 시스템(Unchained Labs)에서 수행하였다. DLS를 25℃에서 측정하였다. UNcle 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 계산하고 분석하였다. 동적 광산란(DLS)을 사용하여 항체 샘플의 응집을 검출하였다. "모드 직경"은 단백질 입자의 직경을 나타내고, "질량 백분율"은 각 입자 크기 분획의 백분율을 나타낸다. "PDI"는 다분산 지수(polydispersity index)를 지칭하며, 지수가 높을수록 샘플이 더 많이 다분산된 것이다. PDI가 0.25보다 크지 않으면, 샘플을 단분산(mono-disperse)으로 간주할 수 있다. 표 7에 나타난 바와 같이, 4개의 항체 샘플 모두는 주요 "피크"(99% 초과의 질량 분율)를 가지며, 38E HuH3L4는 키메라 항체보다 더 나은 PDI를 가지고, 38E HuH3L2는 키메라 항체와 유사하고, 38E HuH1L1은 키메라 항체보다 더 나쁜 PDI를 가졌다.
Figure pct00037
실시예 20: 항체 친화도 분석
인간 LIF 단백질에 대한 항-LIF 항체의 친화도를 Gator를 사용하여 결정하였다. 먼저, 항-인간 LIF 항체를 PBS로 5 ug/mL로 희석한 다음, 96-웰 플레이트의 두 번째 컬럼의 A-F 웰에 첨가하였다(웰당 200 μL). 인간 LIF 단백질 농도를 PBS로 각각 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 μg/mL로 구배 희석하고, 희석된 LIF 단백질을 96웰 플레이트의 네 번째 컬럼에 있는 웰 A-E 웰에 첨가하고(웰당 100 μL), PBS를 블랭크 대조군으로서 F 웰에 첨가하였다. PBS를 첫 번째 및 세 번째 컬럼의 A-F 웰에 첨가하였다(웰당 200 μL). 96-웰 플레이트를 기기에 넣고 항-인간 Fc 바이오센서를 사용하여 검출하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었고, 이는 3개의 인간화 항체의 친화도가 키메라 항체의 친화도에 가깝다는 것을 보여주었다.
Figure pct00038
실시예 21: 인간화 항체 및 38E10E1C11 항체의 발현 정제
인간화 항체 38E HuH3L2 및 38E HuH3L4의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 마우스 항체의 불변 영역(중쇄 불변 영역은 마우스 IgG1이었고, 경쇄 불변 영역은 카파쇄였음)과 연결하고, PCDNA.3.4 벡터에 클로닝하여, 각각 38E HuH3L2-m(38E HuH3L2-m 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 전장 유전자 서열은 각각 서열번호 36 및 서열번호 38에 제시되어 있고; 38E HuH3L2-m 항체의 중쇄 및 경쇄의 상응하는 전장 아미노산 서열은 각각 서열번호 35 및 서열번호 37에 제시되어 있음) 및 38E HuH3L4-m(중쇄 및 경쇄의 전장 유전자 서열은 각각 서열번호 36 및 서열번호 40에 제시되어 있고, 38E HuH3L4-m 항체의 중쇄 및 경쇄의 상응하는 전장 아미노산 서열은 각각 서열번호 35 및 서열번호 39에 제시되어 있음)으로 명명하였다. 유전자 형질감염 및 항체 발현은 thermo fisher 사의 Expi CHO 발현 키트를 사용하여 수행하였다. 세포 배양 상청액을 수집하고 항체를 단백질 G 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 정제된 항체를 농축하고 Amicon® Ultra 한외여과 튜브를 사용하여 한외여과로 교환하고, 항체를 최종적으로 pH 7.4의 PBS에 용해시켰다. 38E10E1C11 항체도 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다.
실시예 22: 인간화 항- LIF 항체는 인간 LIF 단백질에 대한 결합에 대해 LIFR과 경쟁한다
재조합 인간 LIF 단백질을 효소 표지 플레이트에 1 μg/mL의 농도로 코팅하고, 0.6125 μg/mL 농도의 재조합 인간 LIFR 단백질(인간 Fc와 융합 발현됨, ACRO에서 구입, 품목 번호: LIR-H4252)을 50 μL/웰로 첨가하고, 한편 상이한 농도의 상이한 LIF 항체 38E HuH3L2-m(서열번호 35 및 37), 38E HuH3L4-m(서열번호 35 및 39), 38E10E1C11(서열번호 41 및 43), P36-033(서열번호 54 및 56)을 100 μL/웰로 첨가하였다. 항-CD3 항체를 음성 대조군으로 사용하였다(BioLegend에서 구입, No. 317326). 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고 PBST로 4회 세척하고, HRP-표지된 염소 항-인간 Fc 항체를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 4회 세척하였다. TMB 착색 용액을 첨가하고 실온에서 10분 동안 발색시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 효소 마커로 판독하였다. Origin pro 9 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯팅하였다. 결과를 도 19에 자세히 나타내었다. 결과는 38E10E1C11, 38E HuH3L2-m, 38E HuH3L4-m이 각각 0.074 μg/ml, 0.145 μg/ml 및 0.103 μg/ml의 IC50으로 인간 LIFR에 대한 재조합 인간 LIF의 결합을 억제할 수 있음을 보여주었다. P36-033은 약한 억제 효과가 있었고 음성 대조군 항-CD3 항체는 인간 LIFR에 대한 재조합 인간 LIF의 결합을 억제할 수 없었다.
실시예 23: 인간화 항- LIF 항체는 인간 LIF 단백질에 대한 결합에 대해 GP130과 경쟁하지 않는다
재조합 인간 LIF 단백질을 효소 표지 플레이트에 1 μg/mL의 농도로 코팅하고, 12 μg/mL 농도의 재조합 인간 GP130 단백질(인간 Fc와 융합 발현됨, Yijiao Shenzhou에서 구입, 품목 번호: 10974-H03H)을 50 μL/웰로 첨가하고, 한편 상이한 농도의 LIF 항체 38E HuH3L2-m(서열번호 35 및 37), 38E HuH3L4-m(서열번호 35 및 39) 및 P36-033(서열번호 54 및 56)을 100 μL/웰로 첨가하고, 항-CD28 항체를 음성 대조군으로 사용하였다(BioLegend에서 구입, 품목 번호: 302914). 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고 PBST로 4회 세척하였다. HRP-표지된 염소 항-인간 Fc 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 4회 세척하였다. TMB 착색 용액을 첨가하고 실온에서 10분 동안 발색시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 효소 마커로 판독하였다. Origin pro 9 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯팅하였다. 결과를 도 20에 자세히 나타내었다. 결과는 인간화 항체 38E HuH3L2-m, 38E HuH3L4-m 및 음성 대조군 항체인 항-CD28 항체는 인간 GP130 단백질에 대한 재조합 인간 LIF의 결합을 억제하지 못하고, P36-033은 인간 GP130 단백질에 대한 재조합 인간 LIF의 결합을 억제할 수 있음을 보여주었다.
실시예 24: 인간화 항- LIF 항체의 항원 인식 특이성 검정
인간 LIF, 인간 IL-6, 인간 OSM 및 인간 CNTF(4가지 단백질 모두 Yijiao Shenzhou에서 구입, 품목 번호는 각각 14890-HNAH; 10395-HNAE; 10452-HNAH; 11841-H07E)를 효소 표지 플레이트에 1 μg/mL의 농도로 코팅하고, 상이한 농도의 LIF 항체 38E10E1C11, 38E huH3L2-m, 38E huH3L4-m을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 4회 세척한 후, HRP 표지된 염소 항-마우스 Fab 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 4회 세척한 후, TMB 착색 용액을 첨가하고 상온에서 10분간 발색시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 효소 마커로 판독하였다. Origin pro 9 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯팅하였다. 결과를 도 21에 나타내었고, 결과는 38E10E1C11, 38E huH3L2-m 및 38E huH3L4-m 항체가 인간 LIF 단백질에만 결합하고 인간 IL-6, OSM 및 CNTF에는 결합하지 않음을 보여준다.
실시예 25: 인간화 항- LIF 항체에 의해 인식되는 에피토프의 확인
앞선 실험에서, 본 발명은 38E10E1C11 항체가 LIF 단백질의 선형 에피토프를 인식한다는 것을 발견했으므로, 38E 인간화 항체가 여전히 LIF 단백질의 선형 에피토프를 인식하는지 여부를 먼저 확인해야 할 필요가 있었다. 배양 3일 후 인간 LIF 전장 유전자 서열, Mut3 및 Mut4 단백질 서열로 형질전환된 293T 세포의 상청액을 취하고, 음성 대조군으로 293T 세포 배양 상청액을 취하고 5xSDS-PAGE 로딩 완충액을 첨가하고, 10분 동안 끓였다. 그런 다음 10 μL의 샘플을 취해 SDS-PAGE 전기영동한 다음, 전기영동 밴드를 PVDF 멤브레인으로 옮겨 웨스턴 블롯 검출을 하였다. 검출을 위한 1차 항체는 1 μg/mL 농도의 38E huH3L2 또는 38E huH3L4 항체였으며, 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 PBST 완충액으로 3회 세척하고 1:3000의 희석비로 희석된 HRP-표지된 양 항-인간 Fc 이차 항체를 첨가하고, 2차 항체와 함께 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBST 완충액으로 3회 세척하고, 강화 화학발광 용액(Perice, 품목 번호 34079)을 첨가하고 인큐베이션하였다. Amersham Imager 600 초고감도 다기능 이미저를 사용하여 검출 및 사진촬영을 수행하였다. 결과를 도 22의 패널 A에 나타내었으며, 결과는 인간화 항체 둘 모두가 변성된 인간 LIF 단백질 및 Mut3 단백질을 인식할 수 있지만 Mut4 단백질은 인식할 수 없음을 보여준다. M1 세포 증식 분석에서도 동일한 결과를 얻었으며, 그 결과를 도 22의 패널 B에 상세히 나타내었다. 따라서, 38E huH3L2 및 38E huH3L4 항체가 인식하는 에피토프 서열은 TYGPDTSGKDVFQKK(서열번호 61)인 것으로 확인되었다.
실시예 26: 인간화 항- LIF 항체 활성을 검출하기 위한 KP4 세포의 STAT3 활성화 억제 검정
KP4 세포의 분해 및 원심분리 후, 세포를 재현탁시키고 12-웰 플레이트에 1 mL, 5×105개 세포/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 원래의 배지를 버리고, 50 ng/mL 재조합 인간 LIF 단백질 및 상이한 농도의 항-LIF 인간화 항체를 함유하는 세포 배지를 각각 첨가하였다. 재조합 인간 LIF 단백질이 없는 대조군 웰 및 재조합 인간 LIF 단백질만 있고 항체가 없는 대조군 웰을 설정하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 배지를 제거하고, 1x 세포 용해 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 상청액을 취하여 웨스턴 블롯 검출을 수행하여 STAT3의 인산화를 검출하였다. 결과는 인간화 항체 38E huH3L4 및 38E huH3L2가 LIF 단백질-유도된 STAT3의 인산화를 억제할 수 있음을 보여주었다(도 23).
실시예 27: 인간화 항- LIF 항체의 활성을 검출하기 위한 M1 세포 증식 검정
M1을 원심분리한 후, RPMI1640 배지로 2회 세척하고, 96-웰 플레이트에 2.5×105개 세포/mL의 밀도로 접종하였다. 80 μL의 세포를 각 웰에 접종하고, 4 ng/mL의 재조합 인간 LIF 단백질과 다양한 농도의 항-LIF 항체를 포함하는 배지를 첨가하여 각 웰의 최종 부피가 160 μL이 되도록 하였다. 한편 LIF가 없는 대조군 웰을 설정하고, 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고 CCK-8을 첨가하여 증식을 검출하였다. 결과를 도 24에 자세히 나타내었으며, 결과는 인간화 항체 38E huH3L4-m 및 38E huH3L2-m 둘 모두가 각각 6.52 μg/mL 및 8.93 μg/mL의 EC50으로 인간 LIF 단백질에 의한 M1 세포의 증식 억제를 역전시킬 수 있었다는 것을 보여준다.
실시예 28: LIF 항체에 의한 LIF -유도 STAT3 인산화 억제 효과
100,000개의 KP4 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고; 구배 희석된 LIF 항체를 20-100 ng/ml의 LIF 단백질과 함께 실온에서 0.5-1시간 동안 인큐베이션하여 LIF-Ab 혼합물을 형성하였다. LIF-Ab 혼합물을 세포 웰에 첨가하고 37℃에서 5-30분 동안 자극하였다. P-STAT3(TYR705) KITS(Cisbio) 및 Total-STAT3 KITS(Cisbio) 지침에 따라 P-STAT3 및 Total-STAT3 단백질 발현 수준을 검출하였다. 각 웰에 대하여 도너 및 억셉터의 방출 신호 비율을 다음과 같이 계산하였다: 비율 = 신호 665 nm/신호 620 nm *104. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터 그래프를 생성하고 LIF 항체의 억제율을 계산하였다. 결과는 LIF 항체 38E HuH3L4가 3.415 nM의 IC50으로, 도 25에 나타난 바와 같이, LIF에 의해 유도된 STAT3 인산화에 대하여 인산화 억제 효과를 가짐을 보여주었다.
실시예 29: LIF 항체의 ADCC 활성 검출
LIF는 GP130 및 LIFR에 결합하는 반면, 인간화 LIF 항체는 LIF가 LIFR에 결합하는 것은 차단하지만 LIF가 GP130에 결합하는 것은 차단하지 않는다. 인간화 LIF 항체가 LIF에 의해 매개되는 세포 표면에 결합하여 ADCC가 작동하는지 여부를 검출하였다. 항체 Erbitux(Epiduo®, Merck Serono, 양성 대조군) 및 인간 IgG2(Cat#HG2K, Sino, 음성 대조군)를 ADCC 완충액(RPMI-1640 + 1% FBS)으로 순차적으로 희석하고; 이어서, 38E huH3L4 항체를 LIF 단백질을 함유하는 ADCC 완충액으로 3중 및 8개의 구배로 희석하고, 따로 두었다. DLD-1 세포를 트립신(Cat#25200072, GIBCO)으로 분해하고, 반응이 종료된 후, 세포를 불어내어 원심분리 튜브에 모아 1500 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상청액은 버리고, 세포를 ADCC 완충액으로 재현탁시키고 계수하였다. 세포 농도를 조정하고 따로 두었다. PBMC 세포(Cat#SLB-HP010B, Shanghai SAILYBIO Ltd.)를 소생(resuscitate)시키고, ADCC 완충액 10 mL를 첨가하고, 2000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 버렸다. PBMC 세포를 ADCC 완충액에 재현탁시키고 계수하였다. 세포 농도를 조정하고 따로 보관하였다; 96-웰 U-바닥 세포 배양 플레이트를 꺼내어, 표적 세포 DLD-1 50 μl, 항체 50 μl, 및 PBMC 이펙터 세포 50 μl를 차례로 첨가하였다. PBMC 이펙터 세포와 표적 세포의 비율은 30:1이었다. 반응을 37℃에서 6시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 수행하였다. Cyto Tox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Cat#G1780, Promega)로 LDH를 검출하였으며, 효소 마커를 사용하여 490 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
각 평행 웰의 평균 흡광도 값은, 모든 실험 웰, 표적 세포 LDH 자발적 방출 웰(TCR) 및 이펙터 세포 LDH 자발적 방출 웰(ECR)의 평균 흡광도 값에서 블랭크 배지의 평균 흡광도 값(CMB)을 빼도록 계산하였다. 표적 세포 LDH 최대 방출 웰(TCM)의 평균 흡광도 값에서 부피 보정된 대조군 웰(VCC)의 평균 흡광도 값을 뺐다. 상기 보정된 값을 사용하여 각 농도의 항체에 대한 세포독성(%)을 하기 식에 따라 계산하였다.
세포독성(%) = (A - B - C)/(D - C) × 100%
A: 실험 웰의 보정 후 평균 흡광도 값
B: 보정된 이펙터 세포 LDH 자발적 방출 웰의 평균 흡광도 값
C: 보정된 표적 세포 LDH 자발적 방출 웰의 평균 흡광도 값
D: 표적 세포의 보정된 LDH 최대 방출 구멍의 평균 흡광도 값
도 26에 나타난 바와 같이, 38E huH3L4 항체는 ADCC 활성을 갖지 않았다.
참고문헌:
Figure pct00039
SEQUENCE LISTING <110> JACOBIO PHARMACEUTICALS CO., LTD <120> BINDING MOLECULE SPECIFIC FOR LIF AND USE THEREOF <130> JAB-BX300 <150> PCT/CN2019/108904 <151> 2019-09-29 <150> PCT/CN2020/077049 <151> 2020-02-27 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 2 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 3 Gln His His Tyr Val Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 4 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 5 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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ggagatgacc 1080 aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 agcctgagcc tgagccccgg caag 1344 <210> 64 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 64 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly His Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Thr His Ala Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 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tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420 ctgctgaaca acttctaccc cagggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480 cagagcggca acagccagga gagcgtgacc gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc 600 gaggtgaccc accagggcct gagcagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 66 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Asn Ala Val Ala 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 67 Trp Ala Ser Phe Arg His Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 68 Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 69 Ser Tyr Pro Met Phe 1 5 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 70 Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 71 Pro Ser Ala Arg Tyr Asp Glu Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 72 gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgagcacca gcgtgggcga tcgggtgtcc 60 atcacctgta aggcctccca ggacgtgagc aacgccgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggccagtccc ctcggctgct gatctattgg gcttccttca ggcacaccgg cgtgcccgat 180 cggttcaccg gctccggatc cggcaccgag tataccctga ccatctcccg ggtgcaggcc 240 gaggatctgg ctctgtatta ttgtcagcag cactacaata ccccctacac cttcggcggc 300 ggcaccaggc tggagatcaa g 321 <210> 73 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 73 gaggtgatgc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ctggaggatc tcggaggctg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttctcc tcctatccca tgttctgggt gaggcagacc 120 cccgagaagc ggatggagtg ggtggcctat atctccaatg gcggcgattc cacctattat 180 cctgacaccg tgaagggccg gttcaccgtg agccgggata acgccaagaa taccctgtac 240 ctgcagatga gcagcctgaa gtccgtggac accgctatct actattgcgt gaggccctcc 300 gctcggtacg acgagtggtt cgcctattgg ggccagggca ccctggtgac agtgagcgct 360 <210> 74 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 74 Asp Ile His Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 75 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Thr Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ser Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 76 gacatccaca tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatgtta ctccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa acgggct 327 <210> 77 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 77 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agttatgcca tgtcttgggt tcgccagagt 120 ccggagacga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtaa cacctactct 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagatattat 300 ggttactact ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 78 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 78 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gln Ile Lys Ala Lys Ser Asp Asp Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Cys Trp Glu Trp Asp Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 79 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 79 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly His Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Thr His Ala Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val 115 <210> 80 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 80 caggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggcag cctgaggctg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc cacgcctgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgggccag atcaaggcca agagcgacga ctacgccacc 180 tactacgccg agagcgtgaa gggcaggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcacctgc 300 tgggagtggg acctggactt ctggggccag ggcaccatgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 81 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 81 gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc agccccgtga ccctgggcca gcccgccagc 60 atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg gacagcgacg gccacaccta cctgaactgg 120 ctgcagcaga ggcccggcca gccccccagg ctgctgatct acagcgtgag caacctggag 180 agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcgccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggccac ccacgccccc 300 ccctacacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaaga ggaccgtg 348 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 82 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Asn Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Phe Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 83 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Pro Met Phe Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Met Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Val Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Pro Ser Ala Arg Tyr Asp Glu Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

Claims (121)

  1. 인간 LIF 단백질의 아미노산 서열 TYGPDTSGKDVFQKK(서열번호 61)로 표시되는 에피토프 또는 다른 포유류 종의 상응하는 아미노산 서열의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호 1 또는 66, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (b) 서열번호 2 또는 67, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;
    (c) 서열번호 3 또는 68, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
    (d) 서열번호 4 또는 69, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (e) 서열번호 5, 45, 또는 70, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
    (f) 서열번호 6 또는 71, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3.
  3. 제2항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호 1, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (b) 서열번호 2, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;
    (c) 서열번호 3, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
    (d) 서열번호 4, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (e) 서열번호 5 또는 45, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    (f) 서열번호 6, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    1) (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3;
    2) (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3; 또는
    3) (a) 서열번호 66을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 67을 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 68을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 69를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 70을 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 71을 포함하는 HCDR3.
  5. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3.
  6. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3.
  7. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호 66을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 67을 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 68을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 69를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 70을 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 71을 포함하는 HCDR3.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (i) 서열번호 7, 11, 15, 19, 46, 74 또는 82, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
    (ii) 서열번호 23, 27, 31, 48, 75 또는 83, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (i) 서열번호 7, 11, 15, 19 또는 46, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
    (ii) 서열번호 23, 27, 31 또는 48, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체가
    제8항 또는 제9항의 (i)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    제8항 또는 제9항의 (ii)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는,
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    1) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    2) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    3) 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    4) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    5) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    6) 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    7) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    8) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    9) 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    10) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    11) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    12) 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    13) 서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    14) 서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 또는
    15) 서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 제11항의 1) 내지 15)로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  14. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  15. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  16. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  17. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  18. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  19. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  20. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  21. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  22. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  23. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  24. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  25. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  26. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 75의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  27. 제11항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 83의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서:
    (I) 경쇄는 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39, 50 또는 54, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
    (II) 중쇄는 서열번호 25, 29, 33, 35, 52 또는 56, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는,
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  29. 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서:
    (I) 경쇄는 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39 또는 50, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
    (II) 중쇄는 서열번호 25, 29, 33, 35 또는 52, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는,
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  30. 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    제28항 또는 제29항의 (I)로부터 선택되는 경쇄와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및
    제28항 또는 제29항의 (II)로부터 선택되는 중쇄와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는,
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  31. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    1) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    2) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    3) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    4) 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    5) 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    6) 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    7) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    8) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    9) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    10) 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    11) 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    12) 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    13) 서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    14) 서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    15) 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
    16) 서열번호 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 56의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  32. 제2항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 경쇄 및 중쇄는 각각 제31항의 1) 내지 16)으로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  33. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  34. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  35. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  36. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  37. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  38. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  39. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  40. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  41. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  42. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  43. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  44. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  45. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  46. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  47. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  48. 제31항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열번호 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 56의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
  49. (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 5를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  50. (a) 서열번호 1을 포함하는 LCDR1, (b) 서열번호 2를 포함하는 LCDR2, (c) 서열번호 3을 포함하는 LCDR3, (d) 서열번호 4를 포함하는 HCDR1, (e) 서열번호 45를 포함하는 HCDR2, 및 (f) 서열번호 6을 포함하는 HCDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  51. 서열번호 7로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  52. 서열번호 11로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  53. 서열번호 19로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL), 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체가 IgG인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체가 IgG1, IgG2 또는 IgG4인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된(engineered) 항체, 인간 항체, 이중특이성 항체, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF) 길항제인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단할 수 있는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  59. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, LIF에 대한 결합에 대해 경쟁하거나 교차(cross) 경쟁할 수 있는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 뉴클레오티드 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    (i) 서열번호 7, 11, 15, 19, 46 또는 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
    (ii) 서열번호 23, 27, 31, 48 또는 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    (i) 서열번호 7, 11, 15, 19 또는 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
    (ii) 서열번호 23, 27, 31 또는 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    (i) 서열번호 7, 11, 15, 또는 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자; 및
    (ii) 서열번호 23, 27 또는 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    1) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    2) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    3) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    4) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    5) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    6) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    7) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    8) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    9) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    10) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    11) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    12) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    13) 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    14) 서열번호 74의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 75의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자; 또는
    15) 서열번호 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 8에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 12에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 16에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  68. 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 20에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  69. 제60항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 47에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  70. 제60항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 74의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 76에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  71. 제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 82의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA가 서열번호 72에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  72. 제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA가 서열번호 24에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  73. 제60항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA가 서열번호 28에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  74. 제60항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA가 서열번호 32에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  75. 제60항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA가 서열번호 49에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  76. 제60항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 75의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA가 서열번호 77에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  77. 제60항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 DNA가 서열번호 73에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  78. 제60항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    (I) 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39, 50 또는 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 서열; 및
    (II) 서열번호 25, 29, 33, 35, 52 또는 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 서열.
  79. 제60항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    (I) 서열번호 9, 13, 17, 21, 37, 39 또는 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 서열; 및
    (II) 서열번호 25, 29, 33, 35 또는 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 서열.
  80. 제60항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    (I) 서열번호 9, 13, 17 또는 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 서열; 및
    (II) 서열번호 25, 29 또는 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 서열.
  81. 제60항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 뉴클레오티드 조성물:
    1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    2) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    3) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    4) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    5) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    6) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    7) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    8) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    9) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    10) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    11) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    12) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    13) 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    14) 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자;
    15) 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자; 또는
    16) 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제1 핵산 분자 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 제2 핵산 분자.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 14에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 18에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 22에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 38에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 40에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  87. 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 51에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  88. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 55에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  89. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 26에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  90. 제78항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 30에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  91. 제78항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 34에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  92. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 36에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  93. 제78항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 53에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  94. 제78항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 암호화하는 DNA가 서열번호 57에 나타나 있는 것인 뉴클레오티드 조성물.
  95. 제60항 내지 제94항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 조성물을 포함하는 벡터.
  96. 제95항에 있어서, 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터 또는 바이러스 벡터인 벡터.
  97. 제95항 또는 제96항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  98. 제97항에 있어서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 벡터 형질전환에 의해 수득되는 것인 숙주세포.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포인 숙주세포.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균(escherichia coli), 피치아(pichia) 효모, 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 인간 배아 신장 293 세포인 숙주세포.
  101. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항의 숙주 세포에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 단계 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  102. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  103. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 생물학적 샘플에서 LIF를 검출하기 위한 시약.
  104. 제103항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 LIF 수준을 갖는 것으로 의심되는 임의의 조직인 시약.
  105. 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 제102항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단하는 방법.
  106. LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단하는데 사용되는 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 제102항의 약제학적 조성물의 용도.
  107. LIF의 발현을 억제하고/하거나 LIF의 활성을 차단하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 제102항의 약제학적 조성물.
  108. (i) 대상체의 조직 또는 액체 샘플을 수득하는 단계, (ii) 조직 또는 액체 샘플을 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제103항 또는 제104항의 시약에 노출시키는 단계; 및 (iii) (ii)의 조직 또는 액체 샘플에 대한 LIF 결합을 대조군 샘플에 대한 LIF 결합과 비교하고, 여기서 대조군 샘플과 비교하여 결합된 LIF의 양의 증가는 비정상적 수준의 LIF 생산, 발현 또는 활성화를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 LIF를 검출하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 조직 또는 액체 샘플이 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 LIF 수준을 갖는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함하는 방법.
  110. 치료적 유효량의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 제102항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, LIF와 관련된 질병 또는 상태를 치료하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, LIF와 관련된 질병 또는 상태가 종양인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 종양이 고형 종양인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 고형 종양이 교모세포종(glioblastoma), 폐암, 난소암, 대장암(colorectal cancer), 췌장암 또는 전립선암을 포함하는 방법.
  114. LIF와 관련된 질병 또는 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 제102항의 약제학적 조성물의 용도.
  115. 제114항에 있어서, LIF와 관련된 질병 또는 상태가 종양인 용도.
  116. 제115항에 있어서, 종양이 고형 종양인 용도.
  117. 제116항에 있어서, 고형 종양이 교모세포종, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암 또는 전립선암을 포함하는 용도.
  118. LIF와 관련된 질병 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 제102항의 약제학적 조성물.
  119. 제118항에 있어서, LIF와 관련된 질병 또는 상태가 종양인, 용도.
  120. 제119항에 있어서, 종양이 고형 종양인, 용도.
  121. 제120항에 있어서, 고형 종양이 교모세포종, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암 또는 전립선암을 포함하는, 용도.
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