KR102551365B1 - 항-ror1 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 인간 및 마우스 ROR1을 특이적으로 인식하는 항-ROR1 항체를 개시한다. 본원에 따른 단일클론 항체는 종양을 억제하여 암 치료제로는 물론, 특이적 결합을 통해 ROR1을 발현하는 다양한 암의 검출 및 특정 암으로의 약물 전달 등을 포함하는 암의 표적화 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-ROR1 항체 및 그 용도
항-ROR1 항체 또는 이의 항원결합 단편, 및 그 용도가 제공된다.
ROR(Receptor Receptor Tyrosine Kinase-Like Orphan Receptor)은 RTK (Receptor Tyrosine Kinase) 패밀리의 막관통 단백질로 ROR1과 ROR2가 있다. ROR1과 ROR2는 58%의 아미노산 서열 상동성을 가지고 있으며 두 단백질의 이론상 분자량은 약 104kDa 이나, ROR1의 경우 다수의 N-글리코실화 부위로 인해 분자량이 약 130kDa이다. ROR 패밀리의 세포외 도메인은 Ig, 시스테인-풍부, 및 크링글(kringle) 도메인으로 구성되어 있고, 세포내 도메인은 타이로신 카이나제, Ser/Thr 풍부, 프롤린 풍부 도메인으로 이루어져 있다 (Borcherding et al., 2014, Protein Cell, 5:496, Rebagay et al., 2012, Prontiers in oncology, 2:1). 생물학적 특징의 측면에서, ROR2의 리간드는 Wnt5a이나, ROR1의 리간드는 아직 밝혀지지 않았다. 또한 ROR2의 경우 카이나제 활성이 있는 반면 ROR1은 가-카이나제(pseudokinase)인 것으로 추정된다. ROR1 자체의 인산화는 Met의 활성과 긴밀한 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Gentile et al., 2014. Int J Cancer 15:2305).
ROR1은 배아 및 태아 발생과정에서 발현되어 세포 극성, 세포 이동, 및 신경돌기 성장 등을 조절한다. 발생의 진행에 따라 발현이 점차 감소하며 성체에서는 거의 발현되지 않고, B 세포의 발달과정에서 일시적으로 발현되고, 지방세포에서 약간의 발현만이 보고되고 있다 (Hudecek et al., 2010, Blood 116:4532, Matsuda et al., 2001, Mech. Dev. 105:153).
하지만 다양한 암세포에서 ROR1의 과발현이 관찰됨에 따라 종양태아성 유전자(oncofetal gene)로 분류되었다. 특히 ROR1은 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia)에 과발현 한다는 것이 밝혀지면서 항암 항체 타겟으로 주목을 받기 시작하였다 (Klein et al., 2001, J. Exp. Med 194:1625, Rosenwald et al., 2001, J. Exp. Med 194:1639). 만성 림프구성 백혈병(CLL) 외에도 B세포 백혈병, 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 버킷 림프종, 외투세포림프종(MCL), 급성림프구성백혈병(ALL), 미만성거대B세포림프종(DLBCL), 여포성림프종(FL), 변연부림프종(MZL) 등의 혈액암은 물론 유방암, 신장암, 난소암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 상피 편평세포암, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암 등의 다양한 고형암에서도 과발현되는 것으로 보고되었다. 이와 같은 암에서 ROR1의 발현은 암환자의 좋지 않은 예후와 관련이 있으며, 암 전이에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. ROR1의 발현을 억제한 암세포를 마우스에 주입하면 생존기간이 증가하고, 전이 정도도 낮아지는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2012 Am J Pathol. 181:1903, Zhang et al., 2015, PLoS ONE 7:e31127, Cui et al., 2013, Cancer Res. 73:3649, Baskar et al., 2013, mAbs 4:349, Yamaguchi et al., 2012, Cancer Cell 21:348, Aghebati et al., 2017, Biomedicine Et Pharmacotherapy, Balakrishnan, A. et al., 2016, Clinical Cancer Research, Li et al., 2017, Nature Cell Biology, Bicocca et al.,2012, Cancer Cell 22:656, Daneshmanesh et al., 2008, Int. J. Cancer 123:1190, Dave et al., 2012, Plos One 7: e52655, Fukuda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 105:3047).
이러한 ROR1의 암세포 특이적 발현은 ROR1이 효과적인 암 표적이 될 수 있어, 이를 특이적으로 인식하는 항체의 개발이 필요하다는 것을 나타낸다.
미국 특허 제9,316,646호는 항-ROR1 항체에 관한 것으로 인간 세포외 영역 ROR1을 특이적으로 인식할 수 있는 단클론 항체를 개시한다.
미국 특허 제9,266,952호는 ROR1에 대한 항체 및 그 용도에 관한 것으로, CLL 세포에 특이적으로 결합하여, CLL 사멸을 유도하는 항체를 개시한다.
동일한 ROR1 항원에 대한 항체라도 각 항체의 특성 또는 용도에 따라 다양한 항암항체로 개발이 가능하므로, 이러한 ROR1의 암특이적 발현, 다양한 암에서의 발현을 고려하면, 기존의 항체를 대체 또는 보완할 수 있는 다양한 항체의 개발이 필요하다.
본원은 ROR1을 특이적으로 인식할 수 있는 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원결합 단편을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 분리된 항체, 그 항원결합 단편 및 그 용도를 제공한다. 특히 본원에 따른 항체는 인간 ROR1을 특이적으로 인식하며, 원숭이 및 마우스 ROR1에 대한 교차 반응성을 나타낸다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3의 중쇄 상보성 결정부위 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 경쇄 상보성 결정부위를 포함하며, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 5로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH2는 서열번호 6 내지 13, 및 96으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH3은 서열번호 14 내지 21, 및 97로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고, 상기 CDRL1은 서열번호 22 내지 2로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL2는 서열번호 30 내지 37로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL3은 서열번호 38 내지 42로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있다. CDRH는 중쇄 가변영역에 포함된 CDR을 나타내고, CDRL은 경쇄 가변영역에 포함된 CDR을 나타낸다.
이런 관점에서, 다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하며, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 5에서 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH2는 서열번호 6 내지 13, 및 96에서 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH3은 서열번호 14 내지 21, 및 97에서 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고, 상기 CDRL1은 서열번호 22 내지 29에서 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL2는 서열번호 30 내지 37에서 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL3은 서열번호 38 내지 42에서 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 하기로부터 선택되는 조합일 수 있다: 순서대로, 서열번호 1, 6, 및 14; 서열번호 2, 7, 및 15; 서열번호 1, 8, 및 16; 서열번호 3, 9, 및 17; 서열번호 1, 10, 및 18; 서열번호 4, 11, 및 19; 서열번호 5, 12, 및 20; 서열번호 3, 13, 및 21; 서열번호 2, 96, 및 15; 또는 서열번호 3, 9, 및 97.
다른 구현예에서, 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 하기로부터 선택되는 하나의 조합일 수 있다: 순서대로, 서열번호 22, 30 및 38; 서열번호 23, 31 및 39; 서열번호 24, 32 및 40; 서열번호 25, 33 및 41; 서열번호 26, 34 및 41; 서열번호 27, 35 및 42; 서열번호 28, 36 및 41; 또는 서열번호 29, 37 및 41.
다른 구현예에서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열은 다음 중 어느 하나의 조합이다:
(a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 6, 및 14이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 22, 30 및 38;
(b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 7, 및 15이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31 및 39;
(c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 8, 및 16이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 24, 32 및 40;
(d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 9, 및 17이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 33 및 41;
(e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 10, 및 18이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 26, 34 및 41;
(f) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 4, 11, 및 19이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 27, 35 및 42;
(g) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 5, 12, 및 20이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 28, 36 및 41;
(h) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 13, 및 21이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 29, 37 및 41;
(i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 96, 및 15이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31 및 39; 또는
(j) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 9, 및 97이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 33 및 41.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다: 서열번호 43 내지 50, 98 및 99로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다: 서열번호 51 내지 58로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 및 경쇄 가변영역 조합을 포함할 수 있다: 서열번호 43 및 51; 서열번호 44 및 52; 서열번호 45 및 53; 서열번호 46 및 54; 서열번호 47 및 55; 서열번호 48 및 56; 서열번호 49 및 57; 서열번호 50 및 58; 서열번호 98 및 52; 또는 서열번호 99 및 54.
다른 구현예에서 본원에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 인간화된 항체, 인간 항체(예를 들어, 완전 인간 항체), 또는 항원결합 단편일 수 있고, 원숭이 ROR1 및 마우스 ROR1에 교차반응성을 가질 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합 절편은 비자연적으로 발생; 예를 들어, 합성되거나 재조합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체일 수 있으며, 원숭이 ROR1 및 마우스 ROR1에 교차반응성을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 인간 ROR1, 원숭이 ROR1, 및/또는 마우스 ROR1을 특이적으로 인식할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디, 다이아바디, scAb, dAb, 이가항체, 또는 다가항체를 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 예를 들어, 상기 중쇄 CDR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하고, 및/또는 상기 경쇄 CDR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
다른 구현예에는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 항체 생산을 위한 발현 벡터 또는 CAR-T 세포 (Chimeric Antigen receptor redirected T cells) 또는 CAR-NK (Natural killer) 세포용 벡터를 포함한다.
다른 구현예는 상기 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.
또 다른 구현예는 ROR1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그 항원결합 단편의 제조 방법을 제공하며, 상기 제조 방법은 상기 세포주로부터 상기 항체 또는 그 항원결합 단편을 분리하는 단계를 포함한다.
다른 구현예는 상기 항체 또는 그 항원결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 질병, 예를 들어 암의 치료 및/또는 예방용 조성물이다.
또 다른 구현예는 상기 항체 또는 항원결합 단편을 ROR1 발현 검출이 필요한 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료에서 ROR1의 검출방법을 제공한다. 상기 방법은 접촉시키는 단계 이후에, 상기 항체 또는 항원결합 단편으로 처리된(접촉된) 생물학적 시료에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 인비트로 또는 인비보에서 수행될 수 있다.
다른 구현예는 상기 항체 또는 그 항원결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원결합 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 키트가 사용되는 구체적 목적에 따라서, ROR1 검출용 키트, 또는 암치료용 키트로 제공될 수 있으며, 그 구체적 목적에 따라 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 검출용 키트에는 면역학적 분석을 위한 성분, 예를 들면, 버퍼와 같이 면역학적 분석을 위한 성분이 추가로 포함될 수 있고, 또는 ROR1의 과발현과 관련된 질환, 예를 들면 암의 치료용 키트에는 투여를 위한 기구 및 사용 설명서가 추가로 포함될 수 있다.
상기 항체 또는 항원결합 단편은 (1) 인간, 마우스, 또는 원숭이로부터 유래한 세포 표면에 발현된 ROR1을 특이적으로 인식 또는 결합할 수 있고, 또는 (2) 세포 표면에 발현되지 않는 ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식 또는 결합할 수 있다.
상기 항체 또는 그 항원결합 단편은 암을 억제하는 효능을 나타낸다. 일 예에서, 마우스 이종 종양이식모델에 상기 항체 또는 항원결합 단편을 투여하면 종양의 성장이 유의미하게 억제된다. 이러한 특성은 상기 항체들이 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다. 또한, 세포주에 처리시, ROR1 과발현 암세포주의 자가세포사멸(Apoptosis)을 유도할 수 있으며, 이 또한 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 단일클론 항체들이 암을 억제하는 효능을 보임을 시사한다.
또한, 상기 항체는 마우스 ROR1에 결합능을 나타내는 종간 교차결합능을 가져 약물 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 단일클론 항체 또는 항체를 이용한 다양한 형태의 치료제는 고비용의 원숭이 기반 실험을 진행하기 전 저비용의 마우스 모델에서 초기 결과를 얻음으로써 보다 경제적이고 효율적으로 약물의 개발을 진행할 수 있다. 기존 항체 역시 마우스 ROR1에 대한 결합능이 보고되어 있으나 본원의 단일클론 항체와 비교 시 결합정도가 현저히 떨어짐이 관찰되었다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 단일클론 파아지 항체의 ROR1 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA) 결과이다. 각 항-ROR1 단일클론 항체가 세포외영역 ROR1 항원에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다. 도 1에서, BCMA-Fc는 음성 대조군으로 각 항-ROR1 단일클론 항체가 ROR1 항원에만 특이적으로 결합하고 BCMA 단백질 또는 태그로 사용한 Fc에는 결합하지 않음을 보여준다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 항-ROR1 단일클론 파아지 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과이며, ROR1를 세포 표면에서 발현하는 세포로는 JeKo-1 세포주를 사용하였다. 각 항-ROR1 단일클론 항체가　세포 표면에서 발현되는 ROR1에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다.
도 3a 및 도3b는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 IgG 항체의 인간 ROR1 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA) 결과이다. 각 항체들이 농도의존적으로 인간 ROR1 항원에 결합하는 것을 나타낸다. 상기 결과는 단일클론 파아지 항체를 IgG 형태로 변경한 후에도 ROR1에 대한 결합능을 유지하는 것을 보여준다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 IgG 항체의 마우스 ROR1 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA) 결과이다. 각 항체들이 농도의존적으로 마우스 ROR1 항원에 결합하는 것을 보여준다. 본 실험을 통해 본원의 항-ROR1 항체가 마우스 ROR1에 대한 교차반응성이 있음을 확인하였다. 비교군으로 사용한 2A2 항체는 마우스 ROR1에 교차반응성이 있으나 본원의 항-ROR1 항체 대비 결합 정도가 상대적으로 미약한 것으로 나타났다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과로, CHO-human ROR1 세포주는 인간 ROR1을, CHO-human ROR2는 인간 ROR2를, CHO-mouse ROR1은 마우스 ROR1을 인위적으로 과발현시킨 세포주이다. 각 항체는 세포 표면에서 발현되는 인간 ROR1에 특이적으로 결합하고 패밀리 단백질인 인간 ROR2에는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한 마우스 ROR1을 인위적으로 과발현시킨 세포주에도 결합하는 것을 확인함으로써 본원의 항-ROR1 항체가 마우스 ROR1에 대한 종간 교차반응성이 있음을 확인하였다. 비교군으로 사용한 2A2 항체는 마우스 ROR1에 교차반응성이 있으나 본원의 항-ROR1 항체 대비 결합 정도가 상대적으로 미약한 것으로 나타났다.
도 6은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과로, ROR1 발현 양성 세포주로 JeKo-1 및 Mino 세포주, ROR1 음성 세포주로 MCF7 세포주를 사용하였다. 각 항체들은 세포 표면에서 발현되는 ROR1에 특이적으로 결합하고, ROR1을 발현하지 않는 세포주인 MCF7에서는 결합하지 않는 것으로 나타났다.
도 7은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과이다. 인간 ROR1을 마우스 대장암 세포주인 MC38에 인위적으로 과발현시킨 MC38 human ROR1 세포주를 사용하였다. 각 항체들은 인간 ROR1을 과발현한 세포주에 농도의존적으로　결합하는 것으로 나타났다.
도 8은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포발현 ROR1 항원에 대한 결합능을 다양한 암세포주에서 측정한 결과이다 (FACS). ROR1이 과발현되어있다고 알려져있는 암종인 위암 세포주(AGS, NCI-N87, MKN-28, SNU-1750, SNU-16), 유방암 세포주(HCC1187, MDA-MB-231, MDA-MB-468, HCC70, HCC1143, BT20, HCC1806, HCC1937, BT474, MCF7), 폐암 세포주(H460, A549, NCI-H1975, H1437, Calu-6), 대장암 세포주(HCT116, DLD-1, HT29), 급성림프구성백혈병 세포주(697, Kasumi-2), 외투세포림프종 세포주(Mino, JeKo-1)를 사용하였다. 측정결과 본원의 항-ROR1 항체는 ROR1이 과발현되어 있다고 알려진 암종 유래의 다양한 암세포주에 결합하는 것을 확인하였다.
도 9는 본원의 따른 항-ROR1 항체의 마우스 이종종양이식 모델에서의 암억제 효능을 분석한 결과이다. 각 항-ROR1 항체들은 외투세포림프종 세포주인 JeKo-1 세포주를 이식한 중증면역 부전 마우스(SCID mouse)에서 암의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 투여한 본원의 항-ROR1 항체 5종은 모두 통계적으로 유의한 수준으로 암성장을 억제하였으며, 각 항체 클론별 암억제 정도는 유사하게 나타났다. 체중 측정 결과 음성 대조군인 인간 IgG1 항체 (HuIgG1) 대비 본원의 항-ROR1 항체 투여군에서 체중 증가양상은 유사하게 관찰되었다. 이러한 결과는 본원의 ROR1 항체가 생체내에서 효과적으로 ROR1 과발현 암세포에 결합하여 암 성장을 억제할 수 있으며, 암치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
도 10은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 작용기전을 분석한 결과이다. 항체에 의한 암의 성장 억제는 다양한 기전 예를 들면 자가세포사멸 유도, 암세포 분열 억제, 암혈관형성 억제, 및/또는 면역세포 활성화 등에 의해 나타날 수 있으며, 항체별로 동일 또는 상이한 기전을 나타낼 수 있다. 도 10에서는 가능한 한 가지 기전으로서 세포사멸 여부를 분석하였으며, ROR1을 발현하는 세포주에서 본원에 따른 항-ROR1 항체를 처리한 결과 항체가 다량체를 형성하면서 세포사멸을 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 비교군으로 사용한 2A2 항체는 다량체를 형성하는 경우에도 세포사멸을 유도하지 못하는 것으로 나타났다.
본원은 ROR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 개발을 기초로 한 것이다.
본 항목에서 사용된 제목은 명세서 기재의 편리성을 위한 것일 뿐, 본 발명을 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 과학 및 기술적 용어는 본 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 대로의 의미를 가진다. 나아가 문맥상 특별히 요구되지 않는다면, 단수는 복수를 포함하고, 복수는 단수를 포함한다.
본원에서 특정한 서열번호로 제시되는 모든 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 상기 특정한 서열번호의 서열뿐만 아니라, 항-RO1 항체로서의 특징을 유지하는 한 상기 특정한 서열번호의 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 필수적으로 상기 서열로 구성되거나, 상기 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
정의
본원에서 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 단일 또는 이중가닥의 뉴클레오타이드 폴리머를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이들의 변형된 형태일 수 있다.
본원에서 다르게 명시되지 않으면, 본원에서 언급된 폴리뉴클레오타이드의 왼쪽 말단이 5' 말단이고, 오른쪽 말단은 3' 말단을 나타낸다.
본원에서 "분리된 핵산 분자"는 그 전부 또는 일부가 자연에 존재하는 폴리뉴클레오타이드와 관련성이 없거나, 또는 자연에서 관찰되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 연결되어 있는, 유전체 기원의 DNA 또는 RNA, 또는 합성 기원의 mRNA, cDNA 또는 이들 조합을 의미한다. 본원의 목적하에서, 특정한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자는 온전한(intact) 염색체를 포함하지 않는다. 대신 특정 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자는 그 특정 서열에 부가하여, 최소 수 개의 부가적인 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 상기 특정 핵산 서열의 발현을 위한 조절서열 및/또는 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 용어 "조절서열"은 이에 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현과 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열의 특징은 숙주의 종류에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들면 원핵세포에서 작용할 수 있는 조절서열은 프로모터, 경우에 따라 오포레이터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 진핵세포에서 조절서열은 전사인자가 결합하는 복수 개의 인식부위를 포함하는 프로모터, 전사 인핸서, 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결서열을 포함할 수 있다. 조절서열을 리더서열 및/또는 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.
본원에서 "벡터"는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 숙주세포로 전달하는데, 사용되는 예를 들면, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스를 포함하는 임의의 분자를 의미한다.
본원에서 "발현 벡터"는 숙주세포의 형질전환에 적합하며, 발현 벡터에 작동가능하게 연결되어 목적하는 단백질을 코딩하는 이종 서열의 발현을 조절하는 핵산서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 이러한 발현벡터는 또한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어, 이의 전사, 번역, 그리고 인트론이 존재하는 경우, RNA 스플라이싱을 조절하거나 이에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 "작동가능하게 연결된"은 연결될 핵산 서열들이 적절한 조건하에서 목적하는 기능을 수행할 수 있도록 위치함을 의미한다. 예를 들면 코딩 서열 및 조절 서열을 포함하는 벡터에서 적절한 조건에서 상기 코딩 서열의 전사가 상기 조절서열에 의해 영향을 받으면, 작동가능하게 연결된 것이다.
본원에서 "숙주 세포"는 목적하는 핵산 서열로 형질전환되었거나, 또는 형질전환될 수 있는, 목적 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 용어는 상기 숙주 세포와 형태 및 유전적 구성의 동일성 여부와 상관없이, 목적하는 유전자를 발현하는 한, 상기 숙주 세포의 자손도 포함한다.
본원에서 "형질도입(transduction)"은 통상적으로 박테리오파지에 의한 한 세균에서 다른 세균으로 핵산의 이동을 의미한다. 예를 들면, 복제를 하지 못하는 레트로바이러스를 이용한 진핵 세포로의 핵산의 이동을 포함한다.
본원에서 "전달이입(transfection)"은 세포가 외래 또는 외인성 DNA를 취하는 것을 의미하고, 이 경우 DNA는 세포막을 통해 세포내로 도입된다. 이는 당해 기술 분야에 공지된 방법 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates을 참조할 수 있다.
본원에서 "형질전환(transformation)"은 세포가 새로운 DNA 또는 RNA를 포함하도록 변형된, 세포의 유전적 특징의 변화를 의미한다. 예를 들면, 세포는 전달이입, 형질도입, 또는 기타 기술을 통해 새로운 유전 물질이 도입되어, 유전적 특징이 변해, 형질전환될 수 있다. 형질도입 또는 전달이입을 포함하는 방법 등에 의해 형질전환된 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합되어 존재할 수 있거나, 복제 없이 에피솜 형태, 또는 복제 가능한 플라스미드로로 일시적으로 존재할 수 있다. 형질전환된 DNA가 숙주 세포 분열과 함께 복제될 때, 안정하게 형질전환된 것으로 간주된다.
본원에서 "아미노산"은 당해 기술 분야에서 이해되는 통상의 의미를 포함한다. 20개의 자연-발생 아미노산 및 이들의 약어는 당업계에 통용되는 것에 따른다 (Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Green, eds., Sinauer Associates: Sunderland, Mass. 1991). 아미노산은 전형적인 아미노산은 물론, 전형적인 20개 아미노산의 입체이성질체(D-아미노산), 비-자연 아미노산, 예를 들면, α-,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 및 기타 비-전형적인 아미노산을 포함한다. 비-전형적인 아미노산의 예로는 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산과 이미노산(예를 들면 4-하이드록시프롤린)이 포함된다. 본원에 사용된 폴리펩타이드 표기에서, 당업계에서 일반적으로 통용되는 바와 같이, 서열의 왼쪽은 아미노 말단이고, 오른쪽은 카복시 말단을 나타낸다.
본원에서 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하는 것으로, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 또한 자연적으로 발생 아미노산 잔기의 중합체뿐만 아니라, 이의 유사체 또는 모방체의 아미노산의 중합체를 포함한다. 또한 폴리펩타이드 또는 단백질은 인산화 또는 당화를 위한 탄수화물의 추가 등의 변형을 포함할 수 있다. 또한 폴리펩타이드 또는 단백질은 재조합 또는 자연에서 발견되는 세포에서 생산될 수 있다. 또한 폴리펩타이드 또는 단백질은 야생형 서열, 또는 상기 아미노산 서열의 일부가 결실, 부가 및/또는 치환된 것을 포함한다. 또한 폴리펩타이드 또는 단백질은 항체 예를 들면, 항-ROR1 항체(또는 ROR1 항체로 칭함), ROR1 결합 단백질, 또는 항원 결합 단편 또는 상기 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 포함한다. 또한 "폴리펩타이드 단편"은 전장 단백질과 비교하여 아미노 말단 결실, 카복실 말단 결실 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 단편은 또한 전장 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 단편은 길이가 약 5개 내지 500개 아미노산 예를 들면, 단편은 적어도 길이가 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850개 아미노산 또는 그 이상 일 수 있다. 본원의 목적을 고려하면, 유용한 폴리펩타이드 단편은 항원 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적 기능성 단편이 포함된다. ROR1 결합 항체의 경우에, 이러한 유용한 단편은 중쇄 또는 경쇄의 1개, 2개 또는 3개를 포함하는 CDR 서열, 중쇄 또는 경쇄의 가변영역, 또는 불변영역을 포함하는 항체 사슬의 전부 또는 일부를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 "분리된 폴리펩타이드, 항체 또는 단백질"은 이들과 통상적으로 함께 발견될 수 있는 다른 단백질이 존재하지 않으며, 자연적으로 이들과 결합되어 있는 지질, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 50% 이상이 제거된 것이다. 전형적으로 분리된 단백질, 폴리펩타이드 또는 항체는 소정의 조성물에서, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 이러한 폴리펩타이드는 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 코딩될 수 있다. 특히, 분리된 단백질 폴리펩타이드 또는 항체는 이의 치료적, 진단적, 예방적 연구 또는 기타 용도로의 적용을 방해하는 다른 단백질 또는 다른 폴리펩타이드의 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
본원에서 예를 들면 항원 결합 단편, 단백질, 또는 항체와 같은 폴리펩타이드의 "변이체"는 다른 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기에 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환이 발생한 폴리펩타이드이며, 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 단백질 변이체는 단백질 효소 절단, 인산화 또는 기타 후번역 변형에 의해 변형되었으나, 본원에 개시된 항체의 생물학적 활성 예를 들면 ROR1에 결합 및 특이성을 유지하는 것을 포함한다. 변이체는 본원에 개시된 항체 또는 그 항원 결합단편의 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 동일한 것일 수 있다. 퍼센트 동일성(%) 또는 상동성은 후술하는 바를 참조하여 계산할 수 있다.
일 구현예에서 퍼센트 상동성 또는 동일성은 100×[(동일한 위치)/min(TGA, TGB)]으로 계산될 수 있으며, 상기 식에서 TGA, TGB 는 비교되는 서열 A 및 B의 잔기의 수 및 내부갭 위치의 합이다 (Russell et al., J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994).
본원에서 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 활성 또는 항원선을 실질적으로 영향을 미치지 않는 치환을 의미한다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 예는 하기 표 3에 개시되어 있다.
본원에서 폴리펩타이드의 "유도체"는, 삽입, 결실, 부가 또는 치환 변이체와는 상이한, 다른 화학적 모이어티와의 컨쥬게에션을 통해 하나 이상의 잔기에서 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미한다.
본원에서 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포 등과 관련하여 사용된 용어 "자연에서 발견되는"은 자연적으로 존재하는 물질을 의미한다.
본원에 따른 항체가 인식하는 ROR1 (Receptor Receptor Tyrosine Kinase-Like Orphan Receptor)은 RTK (Receptor Tyrosine Kinase) 패밀리의 막관통 단백질을 지칭한다. 일 구현예에서는 특히 세포외영역을 인식한다. 본원에 따른 항체가 인식하는 ROR1은 세포막에 존재하거나 또는 세포막에 존재하지 않은 상태의 세포외영역 일 수 있다. ROR1의 인간 단백질은 937개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 아미노산 서열은 NCBI Reference Sequence ID: NP_005003.2, 핵산 서열은 NM_005012.3이다. 본원에서 사용된 문맥으로부터 명백하지 않는 한, ROR1은 인간 hROR1을 지칭하나, 본원에 따른 항체는 마우스 ROR1도 특이적으로 결합능을 가진다. 마우스 ROR1 아미노산 서열은 GenBank: BAA75480.1로 표시된다.
본원에서 "동일성"은 두 개 이상의 폴리펩타이드 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 정렬하고 비교하여 결정되는, 두 개 이상 폴리펩타이드 또는 두 개 이상 폴리뉴클레오타이드의 서열 유사성을 의미한다. 이러한 서열간 동일성은 일반적으로 "동일성 퍼센트"로 표시되며, 이는 비교되는 분자 간의 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 비율을 의미하며, 비교되는 분자 중, 가장 작은 크기의 분자를 기초로 계산된다. 핵산 또는 폴리펩타이드를 정렬하여 다 분자간의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법은 다음 문헌을 참조할 수 있다: Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
동일성 퍼센트를 계산할 때, 비교되는 서열은 서열 사이에 최대 매칭을 제공하는 방식으로 정렬되며, 정렬된 서열에는 갭, 매칭 및 미스-매치가 존재할 수 있으며 이는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 알고리즘으로 처리된다. 일 구현예에서 이러한 동일성 퍼센트는 Needlman and Wunsch 알고리즘을 사용하여, 비교되는 서열간의 매치는 최대화하고, 갭의 수는 최소화하는 식으로 두 서열을 정렬하는 GAP 프로그램을 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 이용하여 결정될 수 있다 (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, USA). 컴퓨터 알고리즘 GAP은 비교되는 두 개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에서 이들 간의 매치는 최대화하고, 갭의 수는 최소화하는 식으로 두 서열을 정렬하여 "매칭 구간(span)"을 결정한다. 상기 알고리즘은 또한 갭 개방 페널티(gap opening penalty)[이는 3 x 평균 항(average diagonal)으로 계산되고, 여기서 "평균 항(average diagonal)"은 사용되는 비교 매트릭스(comparison matrix)의 항의 평균이고; "항"은 특정 비교 매트릭스에 의한 각각의 완전한 아미노산 매치에 할당된 스코어 또는 숫자이다] 및 갭 확장 페널티(gap extension penalty)(이는 통상적으로, 갭 개방 페널티의 1/10배이다), 그리고 예를 들면, PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스를 함께 사용한다. 특정 구현예에서, 표준 비교 매트릭스 (PAM 250 비교 매트릭스는 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 참조; BLOSUM 62 비교 매트릭스는 Henikoff et al.,1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 참조)를 사용한다. 일 구현예에서 GAP 프로그램을 사용한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 권장되는 파라미터는 아래와 같다: 알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; 비교 매트릭스: BLOSUM 62(Henikoff et al., 1992, supra); 갭 페널티: 12(말단 갭에 대한 페널티 없음); 갭 길이 페널티: 4; 유사성 문턱값: 0.
특정 파라미터를 사용해서 두 개의 서열을 정렬할 때, 두 개의 서열사이에 유의한 관련성이 없음에도 불구하고, 짧은 서열 영역에서 높은 동일성으로 매칭되는 결과가 도출될 수 있다. 이런 경우, 두 개의 서열이 최소 50개의 연속적 아미노산에 걸쳐 정렬되도록, GAP 프로그램과 같은 사용되는 알고리즘의 파라미터를 수정할 수 있다.
본원에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 목적하는 대상 분자가 우세한 종으로 존재하는 것이다. 즉, 몰 기준에서, 동일한 혼합물 내에서 임의의 기타 다른 개별 종보다 농도가 더 높다는 것을 의미한다. 일구현예에서, 실질적으로 순수한 분자는 조성물에 포함된 모든 고분자 종류의 최소 약 50%(몰 기준), 최소 약 80%, 약 85%, 최소 약 90%, 최소 약 95%, 또는 최소 약 99%로 포함되는 된다. 다른 구현예에서, 목적하는 대상 분자는 공지의 방법을 사용하여 더 이상 오염물이 검출되지 않을 정도까지 실질적으로 균질하게 정제되고, 이에 따라 조성물은 균질한 한 종류의 고분자 물질만을 포함한다.
한 양태에서 본원은 ROR1 단백질을 특이적으로 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 측면에서, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 사용하여, 즉 본원에 기재된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통하여 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법과 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
본원에서 "친화성" 또는 "친화도"는 항체 또는 그 항원 결합단편과 항원 사이의 상호작용의 강도이며, 항원의 크기, 모양 및/또는 전하와 같은 항원의 특징 및 항체 또는 항원결합 단편의 CDR 서열에 의해 결정된다. 이러한 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 하기를 참조할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해리 상수(dissociation constant, KD)가 ≤10-6 M일 때, 항원과 같은 이의 표적에 "특이적으로 결합한다"라고 일컬어진다. 항체는 KD가 ≤1×10-8 M일 때, "높은 친화성"으로 표적에 특이적으로 결합한다.
본원에서 "항원 결합 영역 또는 부위"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 단백질의 부분을 의미한다. 이는 예를 들면, 항원과 상호작용하여, 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 제공하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 일부가 이에 해당한다. 이러한 항원 결합 영역은 전형적으로, 하나 이상의 "상보성 결정 부위"(Complementary Determining Region, or CDR)를 포함한다. 특정 항원 결합 영역은 또한 하나 이상의 "프레임워크(FR)" 영역을 포함한다. CDR은 항원 결합의 특이성과 친화성에 기여하는 아미노산 서열이다. 프레임워크 영역은 이들 CDR의 적절한 형태(conformation)를 유지하는데 도움을 주어 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 촉진할 수 있다.
본원에서 "항체"는 임의의 아이소타입의 온전한(intact) 면역글로불린, 또는 표적 항원에의 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁을 할 수 있는 항원 결합 단편을 의미한다. 예를 들면, 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이적 항체 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 항체는 그 자체로 항원 결합 단백질의 일종이기도 하다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 낙타과 동물에서 자연적으로 발견되는 바와 같이 일부 경우에 항체가 단지 중쇄만을 포함할 수도 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 오직 단일 원(source)로부터 유래될 수 있거나, 또는 키메라일 수 있다, 키메라 항체는 2종류의 상이한 항체로부터 유래된 부분을 포함하며, 아래 보다 상세하게 기술된다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하이브리도마, 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 다른 언급이 없다면, 본원에서 용어 항체는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체는 물론, 이들의 유도체, 변이체, 단편, 및 돌연변이체를 포함하고, 이들의 예는 아래 기술된 바와 같다.
본원에서 "경쇄"는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장의 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인 VL, 및 불변 영역 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 경쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재한다. 경쇄의 종류에는 카파 및 람다 사슬이 포함된다.
본원에서 "중쇄"는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 중쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하고, CH 도메인은 카복시 말단에 존재하며, CH3가 카복시-말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), IgM 및 IgE의 아이소타입을 포함한다.
본원에 사용된, 항체 또는 면역글로불린의 사슬(중쇄 또는 경쇄)의 "항원 결합 단편"은 전장 사슬과 비교하여 일부 아미노산이 결여되었지만, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부를 포함하는 것이다. 이러한 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 또는 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 특정 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다는 측면에서 생물학적으로 활성이 있다고 할 수 있다. 한 양태에서, 이러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 일부 구현예에서, 단쇄 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적 절단하여 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편에는 이로 제한하는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, scFab, dsFv, Fv, scFV, scFV-Fc, 다이아바디, 미니바디, scAb, 및 dAb를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니나, 인간, 마우스, 랫트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하는 임의의 포유동물에서 유래될 수 있다. 본원에 개시된 하나 이상의 CDR과 같은 항체의 기능적인 부분은 제2의 단백질 또는 저분자 화합물과 공유결합으로 연결되어 특정 표적에 대한 표적 치료제로서 사용될 수 있다.
본원에서 "Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이드 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 서로 결합되어 있다.
본원에서 "Fab 단편"은 1개의 경쇄와 가변 영역 및 CH1만을 포함하는 1개 중쇄로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다. scFab은 두 분자의 Fab이 유연한 링커에 의해 연결된 것이다.
본원에서 "Fab' 단편"은 Fab 단편에 추가적으로 중쇄의 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하여, 두 분자의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성되어, F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
본원에서 "F(ab')2 단편"은 앞서 기술한 바와 같이, 2개의 경쇄, 및 가변영역, CH1 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하여, 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 Fab' 단편으로 구성되며, 상기 두 개의 Fab' 단편은 이들 간의 다이설파이드 결합에 의해 서로 회합되어 있다.
본원에서 "Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄의 각 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 포함하지 않는 항체의 단편이다. sdFV는 중쇄 및 경쇄가 이황화결합에 의해 연결된 것이다. scFv는 Fv가 유연한 링커에 의해 연결된 것이다. scFv-Fc는 scFV에 Fc가 연결된 것이다. 미니바디는 scFV에 CH3가 연결된 것이다. 다이아바디는 두분자의 scFV를 포함한다.
본원에서 "단쇄항체"(scAb)는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 유연한 링커에 의해 연결된 중쇄의 하나의 불변영역 또는 경쇄 불변영역을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 단쇄 항체는 예를 들면 미국 특허 제5,260,203호를 참조할 수 있으며, 이는 참조에 의해 본원에 개시된다.
본원에서 "도메인 항체"(dAb)는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 일 구현예에서는 2개 이상의 VH 영역이 펩타이드 링커에 의한 공유결합으로 연결되어, 2가(bivalent)의 도메인 항체를 형성한다. 이러한 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
본원에서 "2가의 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 이러한 2가 항체에 포함된 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖거나, 또는 각각 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체일 수 있다.
본원에서 "다중 특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중 특이적 항체"는 두 개 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.
본원에서 "이특이적", "이중 특이적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이러한 이특이적 항체는 다중 특이적 항원 결합 단백질 또는 다중 특이적 항체의 일종으로, 공지된 다양한 방법 예를 들면 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결과 같은 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553 등을 참조할 수 있다. 이특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 항원 결합 부위가 결합하는 2개의 서로 상이한 에피토프는 동일 또는 상이한 단백질 표적에 위치할 수 있다.
본원에서 용어 "항원" 또는 "면역원"은 예를 들면 항원 결합 단백질(예를 들면, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적인 항원 결합 단편)이 결합할 수 있으며, 동물에서 항원에 결합할 수 있는 항체 생산에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 상이한 항체 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 항원은 ROR1 단백질의 세포외영역이다.
본원에서 "에피토프"는 항원 결합 단백질 또는 항체에 의해 결합되는 또는 이들이 인식하는 분자의 부분으로, 예를 들면, 항체 또는 T-세포 수용체와 같은 항원결합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 에피토프는 연속적 또는 비연속적일 수 있으며, 예를 들면, 폴리펩타이드 서열에서는 서로 연속적이지 않지만, 분자의 측면에서는 구조적(conformational) 에피토프와 같이, 하나의 항원결합 단백질에 의해 결합되나 서로 떨어진 위치의 아미노산 잔기일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 항체 생산에 사용되는 에피토프와 유사한 3차원 구조를 포함하지만, 상기 에피트프에서 발견되는 잔기를 전혀 포함하지 않거나 또는 일부 잔기만을 포함할 수 있다는 측면에서 모방체일 수 있다. 일반적으로 에피토프는 단백질이지만, 핵산과 같은 다른 종류의 물질일 수 있다. 에피토프 결정인자는 예를 들면, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같은 분자에 의해 표면에 형성된 화학적 활성 그룹일 수 있거나 또는 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 고분자의 복합체 내에 존재하는 표적 항원 상의 에피토프를 인식한다.
본원에 "치료제"는 목적하는 치료 효과를 위해 대상체에게 투여되는 분자를 일컫는다. 대상체는 비인간 포유류, 예를 들면 영장류, 또는 인간을 포함한다. 치료제의 예로는 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 핵산, 항체, 또는 저분자 화합물을 포함한다. 다른 측면에서 치료제는 일 구현예에서 본원에 따른 항체, 또는 상기 항체와 결합되어, 암과 같은 관련 질환의 치료제로서 사용될 수 있다.
본원에서 용어 "치료하는"은 예를 들면, 부상, 질환, 또는 질환 증상 또는 상태의 감소, 완화, 경감, 또는 환자가 부상, 질병, 또는 질환의 증상 또는 병적 상태를 보다 잘 견딜 수 있는 상태로 만들어 주는 것, 부상, 질환, 또는 질환의 증상 또는 병적 상태의 악화 속도를 늦추는 것, 또는 정신적 또는 신체적으로 환자의 삶의 질의 향상을 포함하는 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하는, 부상, 질환, 또는 질환의 증상 또는 병적 상태의 경감 또는 치료를 의미한다. 이러한 부상, 질환, 또는 질환의 증상 또는 병적 상태의 치료 또는 개선은 신체검사, 질환과 연관된 각종 지표 검사 및 영상학적 검사 결과를 근거로 판단될 수 있다.
본원에서 "유효량"은 일반적으로, 질환, 특히 ROR1과 연관된 질환으로 인한 증상의 심각성 및/또는 발생 빈도의 감소, 질환, 특히 ROR1과 연관된 질환으로 인한 증상 및/또는 질환 발생의 근본 원인 제거, 또는　질환, 특히 ROR1과 연관된 질환으로 인한 증상 및/또는 근본 원인 발생의 예방, 및/또는 질환, 특히 ROR1과 연관된 질환으로 인한 손상을 개선 또는 교정하기에 충분한 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량"은 질환, 특히 ROR1과 연관된 상태 또는 증상을 치료하거나, 또는 질환, 특히 ROR1과 연관된 상태 또는 증상의 예방, 지체, 또는 그 진행을 역전시킬 만큼 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때, 의도된 대로, 질환, 특히 ROR1과 연관된 질환의 발병 또는 재발, 또는 질환, 특히 ROR1과 연관된 질환 또는 관련된 증상을 예방 또는 지연시키고, 그 발생 가능성을 감소시키는 양이다. 완전한 치료적 또는 예방적 효과는 복용량의 1회 투여에 의해 발생하기보다는 복용량의 수회 투여에 의해 발생할 수 있다. 따라서 치료적 또는 예방적 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 전달될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편
본원은 ROR1 단백질의 세포외영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 개시한다.　본원에 따른 항체는 본원에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 상보성 결정영역 또는 부위(CDR)를 포함하는 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, CDR은 "프레임워크" 영역에 포함되며, 프레임워크는 이러한 CDR(들)이 적절한 항원 결합 특성을 가질 수 있도록 CDR(들)을 배향한다.
본원에 따른 항체는 인간 및 마우스 유래의 ROR1 세포외 도메인 (Extracellular domain)에 특이적으로 결합하며, 분리된 형태의 세포외도메인 또는 세포 표면에서 발현되는 ROR1의 세포외도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 ROR1, 특히 인간 ROR1 및 마우스 ROR1에 결합한다. 본원에 개시된 항체는 인간 및 마우스 유래의, ROR1 세포외 도메인(Extracellular domain) 또는, 세포 표면에서 발현되는 ROR1에 특이적으로 결합할 수 있어, ROR1을 표적으로 하는 암의 표적 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 항체와 항암제를 결합시켜, 특정 암의 치료에 사용될 수 있다. 또한 마우스 ROR1에 결합하므로 on-target tox를 마우스 실험을 통해 확인 가능하고, 마우스 ROR1을 과발현하는 마우스 암세포주를 이용하여 syngenic model을 통한 in vivo efficacy 확인이 가능하여 ROR1과 관련된 다양한 약물개발에 유용하게 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 이중항체, 다중특이적 항체, 다중항체, 미니바디, 도메인 항체, 항체 모방체(또는 합성 항체), 키메라 항체, 또는 항체 융합체(또는 항체 접합체), 및 이의 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않으며 본원에 개시된 다양한 형태의 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 항체의 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디, 다이아바디, scAb 또는 dAb를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 표 2a 및 표 2b에 개시된 가변영역을 포함하는 경쇄만의 또는 중쇄만의 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 항체는 자연에서 발견되는 항체의 전형적인 구조를 가진다. 이러한 항체의 구조적 단위체는, 낙타과 동물이 단일 중쇄로 구성된 항체를 생산하지만, 일반적으로 사량체 폴리펩타이드를 포함하며, 사량체는 상이한 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 한 쌍의 폴리펩타드 사슬체를 두 개 포함한다. 전형적인 항체에서, 상기 한 쌍의 폴리펩타이드 사슬체는 하나의 전장 경쇄(약 25kDa) 및 하나의 전장 중쇄(약 50 내지 70kDa)를 포함한다. 각 사슬은, 특징적인 접힘 패턴을 나타내며, 약 90 내지 110개 아미노산으로 이루어진, 수 개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다. 이러한 도메인은 항체 폴리펩타이드를 구성하고 있는 기본 단위체이다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원을 인식하는 부분인 가변 영역 또는 V 영역으로 지칭되는 부분을 포함한다. 카복시-말단 부분은 아미노-말단 보다 진화적으로 보다 보존되었으며 불변 영역 또는 C 영역으로 지칭되는 부분을 포함한다. 인간 경쇄는 일반적으로 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄로서 분류되고, 이들 각각은 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역을 포함한다. 중쇄는 전형적으로 뮤(μ), 델타(δ), 감마(γ), 알파(α) 또는 엡실론(ε) 쇄로서 분류되고, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 이소타입으로 정의된다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 서브타입을 갖는다. IgM 서브타입은 IgM 및 IgM2를 포함한다. IgA 서브타입은 IgA1 및 IgA2를 포함한다. 인간에서, IgA 및 IgD 이소타입은 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고; IgG 및 IgE 이소타입은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, IgM 이소타입은 5개의 중쇄 및 5개의 경쇄를 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 효과기 기능을 나타내는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인의 수는 이소타입에 따라 달라진다. IgG 중쇄는, 예를 들면, 각각 CH1, CH2 및 CH3으로 공지된 3개의 C 영역 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 항체는 이러한 이소타입 및 서브타입 중의 임의의 하나일 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 따른 항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 서브타입이다. 추가의 구현예에서, 본원의 항체는 IgG1- 또는 IgG2-형이다. 추가의 구현예에서, 본원의 항체는 IgG1-형이다.
본원에 따른 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변영역의 선택은 부분적으로 항체 의존적 세포 매개 세포독성, 항체 의존적 세포 식균작용 및/또는 보체 의존적 세포독성이 요구되는지에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 인간 동종형 IgG1 및 IgG3은 보체 의존적 세포독성을 갖고, 인간 동종형 IgG2 및 IgG4는 이러한 세포독성을 갖지 않는다. 또한, 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개 이펙터 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 따른 항체는 인간 항체이고, 중쇄 불변영역은 IgG1-, IgG2- IgG3- 또는 IgG4-형 일 수 있다. 추가의 구현예에서, 본원의 항체는 IgG1- 또는 IgG2-형이다.
다른 구현예에서, 본원에 따른 항체는 인간 항체이고, 마우스 ROR1을 특이적으로 인식한다.
전장의 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산 길이인 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들면, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press를 참조할 수 있다. 전형적으로 항체의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항원 결합 부위를 형성한다.
면역글로불린 사슬의 가변 영역은 일반적으로 전체적 구조가 동일하며, "상보적 결정부위 또는 영역 또는 도메인" 또는 CDR(Complementary Determining Region)로 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 이어지는 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 중쇄/경쇄 쌍을 구성하는 각 사슬 유래의 가변영역의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 표적 단백질(ROR1)의 특정 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. 자연 발생 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 이러한 요소는 N-말단으로부터 C-말단까지 전형적으로 다음 순서로 포함된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 가변영역에서 이들 각각에 해당하는 아미노산 서열의 위치는 Kabat (Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest), Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방식 (Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225)에 의해 결정될 수 있다. 상기 각 정의에 의해 결정된 CDR은 서로 비교하면, 중첩되거나 하나가 다른 하나를 포함하는 서브세트일 수 있다. 하지만 본원에는 상기 각 방법에 의해 정의되는 모든 CDR이 본원의 범위에 포함된다. 당업자라면 항체의 가변영역 서열이 주어지면, 여기에서 상기 각 정의에 의한 CDR 서열을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
본원의 일 구현예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 포함될 수 있는 CDR 서열은 각각 표 1a 내지 표 1f에 개시된다.
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본원의 일 구현예에서, 상기 경쇄 및 중쇄의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 각각 하기 표 2a 및 표 2b로 개시된다.
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일 구현예에서 상기 표 1a 내지 표 1f에 개시된 개시된 경쇄의 각 가변영역의 CDR과 중쇄의 각 가변영역의 CDR은 자유롭게 조합될 수 있다.
다른 구현예에서 상기 표 2a 및 표 2b에 개시된 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 다양한 형태의 항체의 제조를 위해 자유롭게 조합될 수 있으며, 예를 들면 ScFV와 같은 단쇄 항체, 또는 도메인 항체 또는 전장 항체를 형성할 수 있다.
본원에 개시된 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 온전한 항체의 각각 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위해 목적하는 다양한 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 결합될 수 있다. 또한, 이렇게 불변영역에 결합된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열은 또한 온전한 항체 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다.
본원에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 임의의 가변 영역은 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성, 항체 의존성 세포성 포식작용 및/또는 보체 의존성 세포 독성 등이 필요한지에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 아이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체 의존성 세포 독성을 가지며 인간 아이소타입IgG2 및 IgG4는 세포 독성을 가지지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 강한 세포 매개 효과기 기능을 유도한다. 예를 들면 중쇄 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4를 포함하는 IgG 불변영역에, 경쇄 가변영역은 카파 또는 람다 불변영역과 결합될 수 있다. 상기 불변영역은 목적하는 바에 따라 적절한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들면 인간 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 인간 중쇄 불변영역 IgG1이 사용되며, 이는 서열번호 91의 서열로 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서 경쇄 불변영역은 인간 람다 영역이 사용되며, 이는 서열번호 93으로 나타낼 수 있다.
본원에 개시된 임의의 가변 영역은 불변 영역에 결합되어 중쇄 및 경쇄 서열을 형성할 수 있다. 일 구현예에서 본원에 개시된 중쇄 가변영역은 인간 IgG1 불변영역에 연결될 수 있으며, 이는 서열번호 59 내지 66, 100, 및 101에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 경쇄 가변영역은 인간 람다 불변영역에 연결될 수 있으며, 이는 각각 서열번호 67 내지 74로 나타낼 수 있다. 상기 본원에 따른 경쇄 및 중쇄는 다양한 조합으로 조합되어 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄로 이루어진 온전한 항체를 형성할 수 있다.
하지만 본원에 개시된 가변 영역과 조합될 수 있는 이러한 불변 영역 서열은 예시적인 것이고, 당업자라면, IgG1 중쇄 불변 영역, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 임의의 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 안정성, 발현, 제조 가능성 또는 다른 목적하는 특징 등을 위해 변형된 불변 영역을 포함하는 다른 불변 영역이 사용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본원은 또한 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 실질적 동일성이란 본원은 서열변이가 존재하는 본원에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다. 일 구현예에서 표 2a에 개시된 중쇄 가변영역과 약 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진다. 다른 구현예에서 표 2b에 개시된 경쇄 가변영역과 약 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진다. 예를 들면　본원에 개시된 항체 또는 항원 결합단편의 서열과 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 나타내는 변이체의 경우, 임의의 변이는 CDR 보다는 가변영역의 골격에서 발생된다.
본원은 또한 본원에 개시된 항체 또는 그 부분을 코딩하는 핵산이 개시된다. 상기 핵산은 항체 각 사슬, 또는 상기 항체의 단편, 그 돌연변이, 유도체, 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 단지 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 폴레뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴레큐클레오타이드를 증폭, 규명, 분석 또는 돌연변이 유발에 사용되는 PCR 또는 염기서열분석 프라이머를 포함한다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 이들은, 예를 들면, 길이가 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 2000, 또는 2500개 이상의 폴리뉴클레오타이드일 수 있고/있거나, 하나 이상의 추가의 서열, 예를 들면, 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 보다 큰 핵산, 예를 들면, 벡터의 일부일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 인공 변이체(예, 펩타이드 핵산)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 개시된 항체 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 본원에 개시된 CDR, 상기 CDR을 포함하는 가변영역, 상기 가변영역 및 불변영역을 포함하는 전장 항체를 코딩하는 핵산이다. 아미노산 서열이 결정되면, 핵산서열은 공지의 역전사 프로그램 및 코돈사용빈도(codon usage) 등을 고려하여 용이하게 결정될 수 있다. 인간 IgG1을 코딩하는 중쇄 불변영역의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 92로 표시될 수 있다. 인간 람다를 코딩하는 경쇄 불변영역의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 94 또는 95로 표시될 수 있다. 상기와 같은 불변영역의 핵산서열을 포함하는 전장 중쇄의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 75 내지 82, 102, 및 103에서 선택되는 어느 하나의 서열 (인간 IgG1 불변영역을 포함하는 중쇄), 전장 경쇄의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 83 내지 90에서 선택되는 어느 하나의 서열 (인간 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄)을 들 수 있다.
또한 표 1a 내지 표 1f의 CDR 서열, 및 표 2a 및 표 2b의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열이 포함된다. 이러한 핵산 서열은 상기 개시된 전장 항체를 코딩하는 핵산 서열에 포함되기 때문에, 별도로 기재되지 않으며, 당업자라면, 본원에 개시된 CDR 및 가변 영역의 단백질 서열을 기초로, 이를 코딩하는 핵산 서열을 상기 서열번호 75 내지 90으로부터 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
본원은 또한 본원에 개시된 하나 이상의 핵산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 실질적 동일성이란 핵산의 변이가 아미노산 치환을 수반하지 않는 보존적 치환 또는 아미노산의 변이를 초래하는 경우라도 상기 핵산에 의해 코딩되는 항체 또는 항원결합 단편이 본원에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
항체의 항원 대한 특이성 및 친화도
본원에 따른 항체 또는 항원 결합단편은 특히 ROR1 항원의 ECD에 대한 특이성 및 항체 치료제/진단제로서 사용되기에 적절한 친화도를 가진다. 일 구현예에서, 표 6에 따르면, 응집체에 대한 친화도는 KD <1.0×10-9 M; 또 다른 구현예에서, KD ≤1.0×10-10 M이다. 이러한 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 이 보다 낮은 친화도 예를 들면 친화도가 10-8 M 또는 10-9 M의 항체와 비교하여 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있는 장점이 있다. 이는 항체를 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 보다 간편한 피하주사와 같은 방식으로 투여해도 충분한 효능을 얻을 수 있기 때문에, 임상에서 큰 장점이 있다.
항체의 가변 영역
본원은 또한 상술한 바와 같이 상기 표 2a 및 표 2b에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 중쇄 가변 영역 및 이러한 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 면역학적 기능적 단편, 유도체, 돌연변이 단백질 및 변이체를 포함하는 항체(및 상응하는 핵산 서열)에 관한 것이다. 본원에 따른 중쇄 및 경쇄의 가변영역이 다양하게 조합된 항체는 "VHx/VLy"로 나타낼 수 있으며, 여기서 "x"는 중쇄 가변 영역 서열번호에 상응하고, "y"는 경쇄 가변 영역의 서열번호에 상응한다. 일 구현예에서 본원에 따른 가변영역은 다음과 같은 조합을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다: VH43/VL51, VH43/VL52, VH43/VL53, VH43/VL54, VH43/VL55, VH43/VL56, VH43/VL57, VH43/VL58, VH44/VL51, VH44/VL52, VH44/VL53, VH44/VL54, VH44/VL55, VH44/VL56, VH44/VL57, VH44/VL58, VH45/VL51, VH45/VL52, VH45/VL53, VH45/VL54, VH45/VL55, VH45/VL56, VH45/VL57, VH45/VL58, VH46/VL51, VH46/VL52, VH46/VL53, VH46/VL54, VH46/VL55, VH46/VL56, VH46/VL57, VH46/VL58, VH47/VL51, VH47/VL52, VH47/VL53, VH47/VL54, VH47/VL55, VH47/VL56, VH47/VL57, VH47/VL58, VH48/VL51, VH48/VL52, VH48/VL53, VH48/VL54, VH48/VL55, VH48/VL56, VH48/VL57, VH48/VL58, VH49/VL51, VH49/VL52, VH49/VL53, VH49/VL54, VH49/VL55, VH49/VL56, VH49/VL57, VH49/VL58, VH50/VL51, VH50/VL52, VH50/VL53, VH50/VL54, VH50/VL55, VH50/VL56, VH50/VL57, VH50/VL58, VH98/VL51, VH98/VL52, VH98/VL53, VH98/VL54, VH98/VL55, VH98/VL56, VH98/VL57, VH98/VL58, VH99/VL51, VH99/VL52, VH99/VL53, VH99/VL54, VH99/VL55, VH99/VL56, VH99/VL57, 또는 VH99/VL58.
앞서 언급한 바와 같은 상기 다양한 가변영역의 조합은 온전한 항체 및 scFV 등을 포함하는 다양한 형태의 항체로 사용될 수 있다.
CDR
본원에 개시된 항체는 본원에 따른 하나 이상의 CDR이 그래프트, 삽입 및/또는 연결된 폴리펩타이드이다. 일 구현예에서 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 가질 수 있다. 항체는 따라서, 예를 들면, 하나의 중쇄 CDR1("CDRH1"), 및/또는 하나의 중쇄 CDR2("CDRH2"), 및/또는 하나의 중쇄 CDR3("CDRH3"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR1("CDRL1"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR2("CDRL2"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR3("CDRL3")을 가질 수 있다.
가변영역에서 항체의 상보적 결정부위(CDR) 및 프레임 영역(FR)에 해당하는 아미노산 서열의 위치는 Kabat (Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"), Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방식 (Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225)에 의해 결정될 수 있다. 상기 각 정의에 의해 결정된 CDR은 서로 비교하면, 중첩되거나 하나가 다른 하나를 포함하는 서브세트일 수 있다. 하지만 본원에는 상기 각 방법에 의해 정의되는 모든 CDR이 본원의 범위에 포함된다. 당업자라면 항체의 가변영역 서열이 주어지면, 여기에서 상기 각 정의에 의한 CDR 서열을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄에 포함될 수 있는 CDR은 표 1a 내지 1f (또는 중쇄 CDR1은 서열번호 1 내지 5에서 선택되는 어느 하나, 중쇄 CDR2는 서열번호 6 내지 13, 및 96에서 선택되는 어느 하나, 중쇄 CDR3는 서열번호 14 내지 21, 및 97에서 선택되는 어느 하나로 표시되고, 경쇄 CDR1은 서열번호 22 내지 29에서 선택되는 어느 하나, 경쇄 CDR2는 서열번호 30 내지 37에서 선택되는 어느 하나, 경쇄 CDR3는 서열번호 38 내지 42에서 선택되는 어느 하나에 개시되어 있다.
본원은 또한 표 1a 내지 1f에 개시된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 실질적 동일성이란 본원은 서열 변이가 존재하는 본원에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
자연 발생 항체의 CDR의 구조 및 특성은 앞에 언급한 바와 같다. 간단하게, 전형적인 항체에서 CDR은 항원 결합 및 인식에 관여하는 영역을 구성하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중의 프레임워크 내에 포함된다. 가변 영역은 프레임워크 영역내에 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다 Kabat (Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"), Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방식 (Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225). 그러나, 본원에 개시된 CDR은 전형적인 항체 구조의 항원 결합 도메인을 정의하기 위해 사용되며, 또한 본원에 기재된 바와 같이, 다른 다양한 폴리펩타이드 구조에 포함되어 사용될 수 있다.
당업자라면 항체가 본원에 개시된 하나 이상의 CDR을 포함하는 경우, 개시된 각 CDR은 서로 독립적으로 선택되어 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 독립적으로 선택된 CDR을 갖는 항체가 생성될 수 있다. 또한 조합을 위해 CDR이 선택될 때, 같은 종류의 CDR이 반복적으로 사용되지 않으며, 예를 들면 항체는 일반적으로 두 개의 CDRH2 영역을 포함하여 제조되지 않는다는 것을 당업자라면 알 것이다.
단일클론(모노클로날) 항체
본원에 개시된 항체는 ROR1에 결합하는 단일클론(모노클로날) 항체를 포함한다. 특히 ROR1을 특이적으로 인식하는 인간 단일클론 항체를 포함하며, 인간 및 마우스 ROR1에 대한 교차반응성을 나타낸다.
단일클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면 또한 항원에 대한 다양한 친화성을 갖는 항체와 같은 상이한 특징을 갖는 항체를 제조하는 기술이 또한 공지되어 있다. 이러한 기술은 예를 들면 파지 디스플레이로 불리는 필라멘트 박테리오파지의 표면에 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리를 디스플레이하여 수행되는 사슬 셔플링(chain shuffling)을 들 수 있다. 예들 들면 본원 실시예에 개시된 것을 참고하거나, 추가의 기술은 Marks et al. 1991, J.Mol.Bio. 222:581-597; Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779-783에 기재된 것을 참조할 수 있다.
또한 단일클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 면역화된 형질전환 동물로부터 수확된 비장 세포를 불멸화시킴으로써 생산될 수 있다. 비장 세포는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여, 예를 들면, 이들을 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산함으로써 불멸화시킬 수 있다. 하이브리도마-생산 융합 절차에 사용하기 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비-항체-생산성이고, 높은 융합 효율을 갖고, 그리고 특정 효소가 결여되어 이들이 목적하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 지원하는 특정의 선택 배지 중에서 성장을 할 수 없게 한다. 마우스 융합에 사용하기 위한 적절한 세포주의 예로는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul이 포함되고; 랫트 융합에 사용되는 세포주의 예로는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210이 포함된다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6을 들 수 있다. 일부 경우에, 하이브리도마 세포주는 동물(예를 들면, 인간 면역글로불린 서열을 갖는 형질전환 동물, ROR1 면역원으로 면역화된 동물로부터 비장 세포를 수확하고; 수확된 비장 세포를 골수종 세포주에 융합하여 하이브리도마 세포를 생성하고; 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립하고, ROR1에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 식별함으로써 생산된다.　 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 단일클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 정제할 수 있다.
키메라 항체
항체는 또한 다양한 목적을 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 키메라 항체는 상이한 항체로부터 유래된 폴리펩타이드 단편들이 공유결합으로 연결되어 면역학적으로 기능적인 경쇄, 중쇄 또는 그 단편을 형성하는 항체이다. 일반적으로 키메라 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부분은 특정 종 또는 특정 클래스 또는 서브타입에 속하는 서열이고, 나머지 서열은 다른 종 또는 다른 클래스 또는 서브타입에 속한다. 키메라 항체 제조 방법에 대하여, 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855을 참조할 수 있다. CDR 이식(grafting)은, 예를 들면, 미국 특허 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호를 참조할 수 있다.
일반적으로, 키메라 항체를 제조하는 목적은 항체가 사용되는 생물체에서 발견되는 아미노산의 수를 최대화하는 것이다. 일례는 "CDR-이식(CDR-grafted)" 항체인데, 여기서 상기 항체는 특정한 종, 또는 특정 클래스 또는 서브타입 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하며, 나머지 부분은 다른 종, 또는 다른 클래스 또는 서브타입 항체 유래이다. 예를 들면 인간에 사용하기 위하여, 설치류 항체의 가변 영역 또는 선택된 CDR이 인간 항체 내로 이식되어 인간 항체의 자연적으로 나타나는 가변 영역 또는 CDR을 대체하게 되거나 또는 그 반대일 수 있다.
또한 일 구현예에서, 인간 이외의 종으로부터 유래한 불변 영역은 인간 유래의 가변 영역과 조합된 하이브리드 항체가 사용될 수 있다.
완전 인간 항체
본원에서는 완전 인간 항체가 또한 개시된다. 인간을 항원에 노출시키지 않으면서도 소정의 항원("완전 인간 항체")에 특이적인 완전 인간 항체를 제조할 수 있다.
완전 인간 항체는 또한 파아지-디스플레이 라이브러리(phage-display library)로부터 유래될 수 있다 (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; 그리고 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). 파지 디스플레이 기술은 필라멘트(filamentous) 박테리오파지의 표면 상에서 항체 레퍼토리를 디스플레이하여, 이로부터 목적하는 항원에 결합하는 파지를 선별하는 일종의 면역 선택(immune selection)을 모방한 방법이다. 이러한 한 가지 기술은 본원의 실시예 또는 PCT 공개공보 제WO 99/10494호를 참조할 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 완전 인간 ROR1 항체는 파지 디스플레이 방법을 통해 선별된다. 이러한 기술은 예를 들면 본원의 실시예 또는 PCT 공개공보 제WO 2005/012359호를 참조할 수 있다.
완전 인간 항체를 생성하는 다른 방법은 마우스 체액성 면역계를 "인간화" 하는 것이다. 내인성 Ig 유전자가 비활성화된 마우스에 인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌위를 도입하여, 마우스에서 완전 인간 모노클로날 항체(mAb)를 생성할 수 있다. 완전 인간 항체를 사용하면, 마우스 또는 마우스-유래된 mAb를 인간에 투여함으로써 유발될 수 있는 면역원성 반응 및 알레르기 반응을 최소화할 수 있다. 이러한 완전 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생성이 결핍되어 인간 항체를 생성할 수 있는 형질전환 동물(통상적으로, 마우스)을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 목적을 위한 항원은 전형적으로, 6개 또는 그 이상의 연속적 아미노산을 갖고, 임의로 담체, 예를 들면, 합텐에 접합된다. 예를 들어, 다음을 참조할 수 있다: Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; 그리고 Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. 일례로 이러한 방법에서 형질전환 동물은 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬을 코딩하는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자 좌위가 무력화되고, 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 코딩하는 인간 게놈 DNA를 포함하는 유전자좌(loci) 단편이 마우스 게놈 내로 삽입되어 생성된다. 인간 면역글로불린 유전자좌룰 부분적으로 포함하는 부분적으로 변형된 마우스를 교차 교배하여 온전한 인간 면역글로불린 유전자좌가 도입된 마우스를 생성한다. 상기 동물에 면역원이 투여되면, 상기 면역원에 면역 특이적이지만 가변 영역을 포함한 항체가 뮤린이 아닌 인간 아미노산 서열을 가진다. 이러한 방법은 예를 들면, WO96/33735 및 WO94/02602를 참조한다. 인간 항체를 제조하기 위한 형질전환 마우스에 관련된 방법은 미국 특허 제5,545,807호; 제6,713,610호; 제6,673,986호; 제6,162,963호; 제5,545,807호; 제6,300,129호; 제6,255,458호; 제5,877,397호; 제5,874,299호 및 제5,545,806호; WO91/10741호, 제WO90/04036호, 및 EP 제546073B1호를 참조할 수 있다.
다양한 다른 형태의 항체
본원에 개시된 항체는 또한 상기 본원에 개시된 항체의 변이체이다. 예를 들면, 항원의 일부는 상기 개시된 중쇄 또는 경쇄, 가변 영역 또는 CDR 서열의 하나 이상의 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 활성 또는 항원선을 실질적으로 영향을 미치지 않는 치환을 의미한다.　 일 구현예에서 보존적 아미노산 치환은 하기 아미노산 분류 중에서 동일한 분류에 속하는 다른 잔기로의 치환을 일컫는다. 자연-발생 아미노산은 측쇄 특성에 공통적 특징에 기초하여 다음과 같이 분류될 수 있다: 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: His, Lys, Arg; 5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 보존적 아미노산 치환은 또한 펩타이드 모방체와 같은 비-자연-발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 이러한 잔기는 전형적으로 세포가 아닌, 화학적 합성에 의해 도입된다.
비제한적인 예시적인 보존적 아미노산 치환의 예는 표 3에 나타내나 이로 제한하는 것은 아니다.
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비-보존적 치환은 상기 분류 중에서 다른 분류에 속하는 잔기로 치환을 포함한다. 이러한 치환은 인간 항체와 상동성인 항체의 영역 또는 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다.
이러한 치환을 도입함에 있어서, 일구현예에서 아미노산의 소수성 또는 친수성을 나타내는 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질의 지수 프로필(hydropathic profile)은 각 아미노산에 지수를 지정하고, 이후 폴리펩타이드 따라서 이들 값을 반복적으로 평균함으로써 계산된다. 각 아미노산의 지수는 소수성과 전하 특성을 기초로 다음과 같이 지정된다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 상호작용적인 생물학적 기능을 부여함에 있어서, 지수 프로파일의 중요성은 당업계에 알려진 것이다 (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). 특정 아미노산은 이와 유사한 수치 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다. 일 구현예에서, 지수에 기초한 변화를 수행하는데 있어서, 지수가 ±2 내, ±1 내, 또는 ±0.5 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다.
또한, 유사한 아미노산끼리의 치환, 특히 치환에 의해 생성되는 단백질이 본원에 개시된 것과 같은 면역학적으로 활성이 있는 단백질인 경우에. 친수성을 기초로 해서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 결정되는, 단백질의 최대 로컬 평균 친수성 값이 면역원성 및 항원-결합성과 같은 단백질의 생물학적 특성과 관련성이 있다.
아미노산 잔기의 친수성 값은 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값을 근거로 치환을 하는 경우, 일 구현예에서, 친수성 값이 ±2 내, ±1 내, 또는 ±0.5 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 또한 친수성에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 식별할 수도 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"으로 지칭된다.
당업자라면 공지된 기술을 사용하여 본원에 개시된 폴리펩타이드의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 당업자라면 폴리펩타이드에서 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 영역을 변이체의 표적으로 하여, 활성을 파괴하지 않으면서도 단백질을 변화시킬 수 있는 부위를 찾아낼 수 있을 것이다. 당업자라면 또한 유사한 폴리펩타이드 간에서 보존되는 잔기 및 부분을 식별할 수 있을 것이다. 또한 다른 구현예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 것으로 생각되는 부분도 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서, 또는 폴리펩타이드 구조에 부정적인 영향을 주지 않으면서 보존적 아미노산 치환이 수행될 수 있다.
나아가, 당업자는 유사한 폴리펩타이드에서 활성 또는 구조에 중요한 잔기를 식별하기 위해 구조-기능적 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석을 통해, 한 단백질에서, 이와 유사한 단백질의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 잔기를 찾아, 목적하는 단백질에서 중요한 아미노산 잔기를 예측할 수 있다. 당업자는 이렇게 예측된 중요한 아미노산 잔기를 이와 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환을 할 수 있다.
당업자는 또한, 유사한 폴리펩타이드의 3차원 구조와 이와 연관된 아미노산 서열 분석을 근거로 항체의 3차원 구조와 관련된 아미노산 잔기를 예측할 수 있다. 당업자는 단백질의 표면에 존재할 것으로 예측되는 아미노산 잔기는 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문에 급격한 변화를 도입하지 않는다. 게다가, 당업자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 포함하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 이들 변이체는 이후, 항원에 대한 결합력을 이용하여 스크리닝되어, 어떤 아미노산 치환이 목적에 부합되는 지에 대한 정보를 수득할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여, 당업자라면, 당업자는 치환이 될 수 있는 위치, 회피되어야 할 위치를 용이하게 결정할 수 있다.
또한 단백질의 2차 구조를 근거로 치환되는 위치를 결정할 수 있다. 예를 들면 2차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링(homology modeling)에 기초한다. 예를 들면, 30% 초과의 서열 동일성, 또는 40% 초과의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩타이드 또는 단백질은 유사한 구조적 위상을 가질 수 있다 (Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247). 2차 구조를 예측하는 부가적인 방법에는 "트레딩(threading)"(Jones, 1977, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "프로필 분석"(Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), 및 "진화적 연쇄(evolutionary linkage)"(Holm, 1999, ibid; 및 Brenner, 1997, ibid)가 포함된다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 민감성을 감소, (2) 산화에 대한 민감성을 감소, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경, (4) 항원 결합 친화성을 변경 및/또는, (5) 단백질에 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하도록 변경이 수행된다. 예를 들면, 보존적 치환을 포함하는 단일 또는 복수개의 아미노산 치환은 항체에서, 분자간 접촉에 관여하는 도메인이 아닌, 그 외의 부분에서 치환이 수행될 수 있다. 이러한 구현예에서, 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환 예를 들면, 모 항체의 2차 구조를 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산으로 치환이 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에서 알려진 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조의 예는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; 및 Thornton et al., 1991, Nature 354:105)를 참조할 수 있다.
추가의 바람직한 항체 변이체에는 모 서열 내에서 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나, 또는 시스테인 잔기가 세린과 같은 다른 아미노산으로 치환된 변이체가 포함된다. 시스테인 변이체는 특히 항체가 생물학적 활성을 갖는 구조로 다시 폴딩(folding)되어야 할 때 유용하다. 시스테인 변이체는 모 항체와 비교하여 적은 수의 시스테인 잔기를 가질 수 있고, 짝이 없는 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화시키기 위하여 일반적으로 짝수로 포함된다.
본원에 개시된 중쇄 및 경쇄, 가변 영역 도메인 및 CDR은 ROR1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 표 1a 내지 표 1f에 개시된 CDR 중의 하나 이상은 폴리펩타이드와 같은 분자에 비공유 또는 공유 결합되어, 면역성접착분자로 사용될 수 있다. 이러한 면역접착분자는 CDR이 큰 고분자 내에 통합된 것이거나, CDR이 다른 폴리펩타이드에 연결된 것일 수 있다. 이러한 면역접착분자는 이에 연결된 폴리펩타이드 또는 기타 물질을 목적하는 항원 예를 들면 ROR1 또는 에피토프에 특이적 결합을 가능하게 한다.
본원에 개시된 가변 영역 및 CDR에 기초한 펩타이드 모방체가 또한 제공된다. 이러한 모방체는 펩타이드, 비-펩타이드, 또는 펩타이드와 비-펩타이드의 조합일 수 있으며, 다음을 참조할 수 있다: Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; 및 Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. 한 유용한 폴리펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드 모방체는 원래 폴리펩타이드와 유사한 효과를 가진다. 이러한 화합물은 컴퓨터 분자 모델링(computerized molecular modeling)을 이용하여 개발될 수 있다. 일반적으로, 펩타이드 모방체는 목적하는 생물학적 활성, 예를 들면, 본원에서 ROR1에 특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체에 구조적으로 유사하지만, 하나 이상의 펩타이드 결합이 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 CH2SO-로부터 선택되는 결합으로 대체될 수 있다. 보다 안정적인 단백질의 생산을 위해, 하나 이상의 보존 서열의 잔기를 동일한 유형의 D-아미노산(예를 들면, L-리신 대신에 D-리신)으로 치환할 수 있다. 또한, 펩타이드를 고리화할 수 있는 분자가 가교 형성 시스테인 잔기를 내부에 도입하여 보존적 서열에 구조적으로 제약을 가하는 펩타이드를 생성할 수 있다 (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387).
본원은 또한 본원에 개시된 항체의 유도체를 제공한다. 유도체화된 항체는 항체 또는 그 단편에 목적하는 특성, 예를 들면, 특정 용도에서 증가된 반감기를 제공하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 항체는, 예를 들면, 검출가능(또는 표지화) 잔기(예: 방사성, 비색성, 항원성 또는 효소 분자, 검출가능한 비드(예: 자기 또는 전자밀도(예: 금) 비드), 또는 다른 분자(예: 비오틴 또는 스트렙타비딘)에 결합하는 분자), 치료적 또는 진단적 잔기(예: 방사성, 세포독성, 또는 약학적 활성 잔기), 또는 특별한 용도(예를 들면, 대상체, 예를 들면, 인간 대상체에 투여, 또는 기타 생체내 또는 시험관내 사용)를 위한 항체의 적합성을 증가시키는 분자를 포함할 수 있다. 항체를 유도체화시키는데 사용될 수 있는 분자의 예에는 알부민(예: 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 항체의 알부민-연결된 및 페길화된 유도체는 당해 기술 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 일 구현예에서는 페길화 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 트랜스타이레틴(transthyretin, TTR) 또는 TTR 변이체에 접합되거나, 또는 연결된다. TTR 또는 TTR 변이체는, 예를 들면, 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학물질로 화학적으로 변형될 수 있다.
다른 유도체는, 예를 들면, ROR1 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의해 제조될 수 있는 ROR1 결합 단백질과 다른 단백질 또는 폴리펩타이드의 공유 또는 응집 접합체를 포함한다. 예를 들면, 접합된 펩타이드는 이종 신호(또는 리더) 폴리펩타이드, 예를 들면, 효모 알파-인자 리더, 또는 펩타이드, 예를 들면, 에피토프 태그일 수 있다. ROR1 항체-포함 융합 단백질은 ROR1 결합 단백질(예: 폴리-His)의 정제 또는 식별을 용이하게 하기 위하여 추가된 펩타이드를 포함할 수 있다. ROR1 결합 단백질은 또한 Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; 및 미국 특허 제5,011,912호에 기재된 바와 같은 FLAG 펩타이드에 연결될 수 있다. FLAG 펩타이드는 항원성이 뛰어나, 특정 모노클로날 항체(mAb)에 의해 가역적으로 결합될 수 있는 에피토프로 작용하여, 재조합 단백질의 신속한 확인 및 용이한 정제를 가능하게 한다.
일 구현예에서 ROR1 결합 단백질에 융합된 펩타이드 잔기 사이의 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 결합되는 복수의 ROR1-결합 폴리펩타이드를 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 이러한 결합되는 펩타이드는 펩타이드 링커(스페이서), 또는 올리고머화를 촉진하는 성질을 갖는 류신 지퍼(leucine zipper)와 같은 펩타이드 일 수 있다. 일 구현예에서, 올리고머는 2개 내지 4개의 ROR1 결합 단백질을 포함한다. 올리고머의 ROR1 결합 단백질 잔기는 상기한 바와 같은 임의의 형태, 예를 들면, 변이체 또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 올리고머는 ROR1 결합 활성을 갖는 ROR1 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 올리고머는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩타이드를 사용하여 제조된다. 항체-유래된 폴리펩타이드의 다양한 부위(Fc 도메인 포함)에 융합된 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들면 Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; 및 Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11을 참조할 수 있다.
다른 구현예는 항체의 Fc 영역에 ROR1 결합 단백질이 융합된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 상기 이량체는, 예를 들면, 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 내에서 유전자 융합체를 발현시키고, 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 유사하게 조합할 수 있도록 함으로써 제조될 수 있고, 여기서 사슬간 디설파이드 결합이 Fc 잔기 사이에 형성되어 이량체가 수득된다.
본원에서 사용된 용어 "Fc 폴리펩타이드"는 항체의 Fc 영역으로부터 유래된 폴리펩타이드로 야생형 또는 돌연변이 형태를 포함한다. 이량체화를 촉진하는 힌지 영역을 포함하는 절단된 형태의 폴리펩타이드도 또한 포함된다. Fc 잔기를 포함하는 융합 단백질 및 이로부터 형성된 올리고머는 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피로 용이하게 분리할 수 있는 장점이 있다.
적절한 Fc 폴리펩타이드의 예로는 미국 특허 제5,426,048호 및 제5,262,522호, 제5,457,035호 및 Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001)에 기재된 것을 들 수 있다. 이러한 돌연변이 단백질의 아미노산 서열은 야생형 아미노산 19번 잔기가 Leu에서 Ala로 치환되고, 아미노산 20번 잔기가 Leu에서 Glu로 치환되고, 아미노산 22가 Gly에서 Ala으로 치환되었다. 돌연변이 단백질은 Fc 수용체에 대한 친화성이 감소된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ROR1 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역은 다른 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변영역으로 치환되어 들어갈 수 있다.
표지 및 효과기 그룹
일부 구현예에서, 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 표지(label)를 포함할 수 있다. "표지"는 임의의 검출가능한 물질을 의미한다. 적절한 표지 기의 예에는 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 기(예: FITC, 로다민, 란탄족 형광체), 효소 기(예: 호스래디쉬퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광성 그룹, 바이오티닐 그룹, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프(예를 들면, 류신지퍼 쌍 서열, 2차 항체 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 표지화기는 잠재적인 입체 장해(steric hindrance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암(arm)을 통해 항체에 커플링된다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고 당업자라면 특정 목적을 위해 적절한 표지 및 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
용어 "효과기 그룹"은 항체에 커플링 또는 컨쥬게이션될 수 있는 물질 또는 합성 물질이다. 일 구현예에서 합성 물질은 치료용으로 기능하는 임의의 물질을 의미한다. 일 구현예에서 적절한 치료용 물질의 예는 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)과 같은 치료용 방사선 물질을 포함하나다.　 다른 적절한 예로는 세포독성제 또는 항암제가 포함되며, 예를 들면 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 아우리스타틴(auristatin), 젤다나마이신(geldanamycin), 아우리스타틴(auristatin), 젤다나마이신(geldanamycin), 메이탄신(maytansine), 안트라사이클린(anthracycline) 유도체, 칼리키아마이신(Calicheamicin), 듀오카마이신(Duocarmycin), 캄토테신(Camptothecin), 아마니틴(amanitin), pyrrolobenzodiazepines (PBD) 이량체, 1-(Chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[e]indole (CBI) 이량체, CBI-PBD 이종이량체를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 효과기 그룹은 잠재적인 입체 장해를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체에 커플링된다.
일반적으로, 표지는 검출방법에 따라 분류될 수 있다: a) 방사성 또는 동위원소 표지; b) 자기 표지(예: 자기 입자); c) 산화환원 활성 잔기; d) 광학 염료; 효소 그룹(예로는 호스래디쉬퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); e) 바이오티닐 기; 및 f) 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등). 일부 구현예에서, 표지화 그룹은 잠재적인 입체 장해를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체에 커플링된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서 표지는 발색단, 인광체 및 형광체를 포함하는 광학성 염료가 포함되나, 이로 제한하는 것은 아니다. 형광체는 저분자 형광물질 또는 단백질성 형광물질일 수 있다.
"형광 표지"는 물질이 갖는 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 형광 표지의 예로는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리쓰로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루제이(Cascade BlueJ), 텍사스 레드, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC 레드 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 레드 705, 오레곤 그린, 알렉사-플루오르 염료(알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우 및 R-피코에리쓰린(PE), FITC,), Cy5, Cy5.5, 및 Cy7 등이 포함되지만 이로 제한되는 것은 아니다. 다양한 광학적 염료는 Molecular Probes Handbook, Richard P. Haugland를 참조할 수 있다.
단백질성 형광 표지 물질에는 레닐라(Renilla), 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) 또는 에쿼리아(Aequorea) 종의 GFP를 포함하는 녹색 형광 단백질(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762), 청색 형광 단백질(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998 Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 향상된 황색 형광 단백질(EYFP, Clontech Labs., Inc.), 루시퍼라제(Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시다제(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607)를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
핵산
한 양태에서 본원은 특정 혼성화 조건에서 본원에 개시된 핵산에 교잡되는 핵산에 관한 것이다. 핵산의 혼성화 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6을 참조할 수 있다. 본원에서 엄격한 혼성화 조건은 5x 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)을 포함하는 전세척 용액, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0); 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충제, 6x SSC, 및 55℃의 혼성화 온도(또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예를 들면, 약 50% 포름아미드를 포함하는 용액, 42℃의 혼성화 온도), 및 0.5x SSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건을 사용한다. 엄격한 혼성화 조건은 45℃에서 6x SSC, 그 이후에 68℃에서 0.1x SSC, 0.2% SDS에서 1회 이상의 세척에 의해 혼성화된다. 나아가 당업자는 서열 간에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로 서로 혼성화된 상태를 유지하는데 필요한 적절한 혼성화 조건을 선택할 수 있을 것이다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 주는 기본 파라미터 및 적절한 조건은 예를 들면, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 상기; 및 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 섹션 2.10 및 6.3-6.4를 참조할 수 있다. 이러한 조건은 예를 들면 핵산의 길이 및/또는 염기 조성(A, G, C 및 T (U)의 구성) 등에 기초하여, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 돌연변이 변이체를 또한 포함한다. 핵산 내로 돌연변이에 의해 상기 핵산이 코딩하는 폴리펩타이드(항체 또는 항체 유도체)의 아미노산 서열에서 변화를 유도할 수 있다. 돌연변이는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 방법, 무작위 돌연변이유발(random mutagenesis) 방법이 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 핵산 돌연변이체는 목적하는 특징을 갖는 폴리펩타이드에 대하여 선별된다.
핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 현저하게 변화시키지 않으면서, 돌연변이가 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 비-필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유발하는 뉴클레오티드 치환을 수행할 수 있다. 대안적으로, 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 선택적으로 변화시키는 하나 이상의 돌연변이가 상기 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적으로 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 정량적 변화의 예에는 활성의 증가, 감소 또는 제거가 포함된다. 정성적 변화의 예에는 항체의 항원에 대한 특이성 변화가 포함된다.
또한 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서, 예를 들면 세포내 발현을 위해 코돈 최적화를 위한 변이가 핵산내로 도입될 수 있다. 이 경우, 코돈의 중첩성(degeneracy)으로 인해 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 다수의 핵산이 제조될 수 있다.
본원에서 개시된 임의의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 당해 기술 분야에 널리 알려진 분자 생물학 기술을 사용하여 아미노산 서열이 변경되도록 돌연변이화될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용하기에 적합한 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 예를 들면, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 전장 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 단편 또는 폴리펩타이드의 활성 부분(ROR1 결합 부분)을 코딩하는 단편 핵산과 같은 전장 핵산 서열의 부분을 포함할 수 있다.
핵산 서열을 근거하여 제조된 프라이머 및 프로브는 본원에 개시된 핵산 또는 유사한 핵산, 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 전사체를 검출하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서 이러한 프로브는 본원에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 식별하는데 사용될 수 있다. 프라이머 또는 프로브는 방사성동위원소, 형광성 화합물, 효소, 또는 효소 보조-인자와 같은 표지물질로 표지될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드 또는 그 부분(예를 들면, 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 영역 도메인을 포함하는 단편)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 예에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 (재조합) 발현 벡터 등을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태의 핵산을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 발현에 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이러한 조절 서열은 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 서열에는 많은 종류의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는, 예를 들면, SV40 초기 유전자 인핸서, 라우스 육종 바이러스 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 프로모터;　 또는 특정한 숙주 세포 내에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는, 예를 들면, 조직-특이적 조절 서열(Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), 및 특별한 처리 또는 조건에 반응하여 뉴클레오티드 서열의 유도성 발현을 지시하는, 예를 들면, 포유동물 세포에서 작용하는 메탈로티오닌 프로모터, 및 원핵 생물 및 진핵 생물 시스템 둘 다에서 작용하는 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터)(참조: 상동)이 포함된다. 당업자라면, 형질전환되는 숙주 세포의 종류, 목적하는 단백질의 발현 정도와 같은 요소를 고려하여 적절한 벡터 및 조절서열을 선택할 수 있을 것이다. 선택된 발현 벡터는 숙주 세포 내로 전달되어 본원에 개시된 것과 같은 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의의 원핵세포(예를 들면 E. coli) 또는 진핵세포(예를 들면, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포)일 수 있다. 벡터 DNA는 공지된 형질전환 또는 전달이입 기술을 통해 원핵 또는 진핵세포 내로 도입될 수 있다. 포유동물 세포에서 안정한 전달이입의 경우, 사용되는 발현 벡터의 종류 및 형질 감염 기술에 따라, 적은 수의 세포만이 전달이입에 의해 전달되는 DNA를 그 게놈내로 통합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 전달이입된 세포를 식별하고 선택하기 위하여, 일반적으로 항생제 내성 마커와 같은 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자가 목적하는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커에는 약물, 예를 들면, G418, 하이그로마이신 및 메쏘트리세이트에 대한 내성을 제공하는 것들이 포함된다. 목적하는 핵산이 안정적으로 도입된 세포의 선별은 약물 처리를 통해 생존하는 세포만을 선택함으로써 달성될 수 있다.
치료 방법: 약학적 제형, 투여 경로
항체를 사용한 치료 방법이 또한 제공된다. 일 구현예에서 항체는 환자에 제공된다. 항체는 암세포 표면에 발현되는 인간 ROR1에 결합함으로써, 암세포의 전이를 억제한다. 일 구현예에서 항체는 세포독성제와 결합한 형태로 암세포 표면에 발현되는 인간 ROR1에 결합함으로써, 항체에 결합된 세포독성제를 암세포에 특이적으로 전달하여 암세포의 사멸을 유도한다. 일 구현예에서 항체는 같은 표적 또는 다른 표적에 특이적인 항체와 이중항체등 다중항체의 형태로 암세포 표면에 발현되는 인간 ROR1에 결합함으로써, 다중항체의 암세포에 대한 특이성을 높이거나 암세포와 면역세포등의 다른 종류의 세포간의 연결을 유도하여 암세포의 사멸을 유도한다. 일 구현예에서 항체는 CAR-T등의 세포치료제의 표면에 발현하여 항체가 인간 ROR1에 결합함으로써, 세포치료제를 암세포에 특이적으로 전달하여 암세포의 사멸을 유도한다.
항체의 치료적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물도 또한 제공된다. 또한, 예를 들면, 이러한 약학적 조성물을 투여함으로써 암 환자를 치료하는 방법이 포함된다. 용어 "환자"는 인간 환자를 포함한다.
허용가능한 제형 물질은 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량의 인간 ROR1 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ROR1 항체의 제조
실시예 1-1: 항원
항원으로서는 인간 ROR1의 세포외영역(ECD)의 C-말단에 Fc가 연결된 ROR1 ECD-Fc 형태의 단백질을 사용하였다.
상기 항원의 제조를 위해 구체적으로 ROR1의 세포외도메인을 포함하는 단백질로서 NCBI 참조번호 NP_005003.2로 표시되는 ROR1 아미노산 서열의 1번 아미노산 내지 406번 아미노산에 해당하는 잔기를 이용하였다. 상기 ROR1의 세포외도메인을 코딩하는 유전자는 Origene사의 cDNA를 구매하여 사용하였다(Origene, RC214967). 또한, 추후 ROR1 세포외도메인을 정제하기 위하여 ROR1 세포외도메인을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 인간 IgG1 유래의 Fc 단백질을 코딩하는 유전자를 합성하여 연결하였다(하기 'ROR1-Fc'로 명명). 상기 유전자를 pcDNA3.1 벡터에 도입하여, 포유동물 세포주에서 ROR1-Fc 핵산을 암호화하는 벡터를 확보하였다.
상기 발현벡터를 HEK 293E세포에 일시적으로 트랜스펙션 시켜 DMEM-F12 배지에서 8% CO2, 37℃ 조건에서 배양함으로써 ROR1-Fc 발현하고, 매 72시간 마다 배지를 수집하였으며, 이어 배지를 합하고 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 Fc-ROR1 ECD 단백질을 정제하였다.
실시예 1-2: 파이지 라이브러리 스크리닝을 통한 항체 선별
라이브러리 파아지(Library phage)의 제조
다양한 항원에 대한 결합 다양성을 가진 인간 유래 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리(Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27:225) 유전자를 가진 대장균 2x1010을 2X YT(Amresco, J902-500G), 카베니실린(Duchefa, C0109.0025) 100㎍/㎖, 2% 글루코스(sigma, G7021)를 포함하는 배지에서 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7) 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2X YT [2X YT, 카베니실린, 카나마이신(Duchfa, K0126) 70㎍/㎖, 1 mM IPTG(Duchefa, I1401)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하여 파이지 패킹을 유도하였다. 이어 배양한 세포를 원심분리(6000 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG8000(sigma, P2139)과 3% NaCl(Samchun, S2097)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS(Phosphate buffered saline, Gibco 10010-023)를 첨가하여 현탁한 다음 원심분리(12000rpm, 10분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
파아지 디스플레이(Phage display)를 통한 패닝(panning)
인간 ROR1 단백질과 결합하는 항체를 선별하기 위해 실시예 1-1에서 제조된 ROR1-Fc 단백질을 이용하여 다음과 같이 패닝을 총 3회 진행하였다.
구체적으로 면역시험관(immunotube, maxisorp 444202)에 10㎍/㎖ 농도의 ROR1-Fc와 음성대조군-Fc(BCMA-Fc)를 PBS에 첨가하여 4℃에서 밤새 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 우혈청 알부민(BSA, Bovine serum albumin) 3% 용액을 시험관에 첨가하여 ROR1-Fc가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 BSA 3% 용액에 분산된 1012 CFU의 항체 파지 라이브러리를 대조군 Fc 단백질이 흡착되어 있는 면역시험관에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다(negative selection). 이어 음성대조군 Fc에 비결합된 파지들을 회수하여 ROR1-Fc가 협착된 면역시험관에 결합시켰다. 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 5회~30회 씻어내어 제거하고, 남아있는 항원 특이적 파지항체를 100mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 회수하였다. 회수된 파지를 1M 트리스 버퍼(pH 7.4)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37℃에서 1시간 감염시키고 감염된 대장균을 카베니실린을 포함하는 2X YT 한천배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 4㎖의 2X YT 카베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고 나머지는 다음 실험을 위해 파아지를 제조하였다. 이러한 과정을 총 3라운드 반복하여 ROR1 항원 특이적인 파아지 풀(phage pool)을 증폭 및 농축하였다.
단일클론 파아지 항체 선별(single clone screening)
상기 패닝을 통해 얻은 파아지 풀(phage pool)로부터 ROR1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB-테트라사이클린/카베니실린 한천배지에 상기 파아지 풀을 도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이어 단일 클론을 웰당 400㎕의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 들어간 96 깊은 웰 플레이트에 접종하여 밤새 키운 후, 배양액 10㎕를 새로운 390㎕의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 포함된 96 깊은 웰 플레이트에 넣어 37℃에서 4시간 배양했다. 상기 배양액에 1mM IPTG 되게 넣어 주고 30℃에서 밤새 배양했다. 밤새 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하였다.
이어 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 인간 ROR1-Fc 항원과 결합하는 단일클론 가용성 scFv를 발현하는 클론을 선택하였다(Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. 1sted. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. pp.11.9-11.12). 구체적으로 96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, USA)에 실시예 1-1에서 준비한 재조합 인간 ROR1-Fc 또는 BCMA-Fc를 well당 100ng 넣고, 4℃에서 밤새 코팅하였다. BCMA-Fc는 음성대조군으로 사용한 단백질로 인간 BCMA 단백질의 세포외도메인 영역을 인간 Fc에 연결한 재조합 단백질이다. 3% BSA를 각 웰당 200μL씩 넣어 37℃에서 2시간 블록킹 하였다. 상기 단일클론 파지 상등액은 3% BSA와 1:1로 섞어서 준비하여, 이 혼합액을 100μL씩 상기 웰에 로딩한 뒤 37℃에서 2시간 반응시켰다. PBST 300μL로 5회 세척한 후, 항-HA HRP 결합 항체를 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 세척하였다. TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100μL를 넣어 발색한 후, 1N H2SO4 50μL를 넣어 반응을 정지한 후, 450nm 및 650nm에서에서 흡광도를 측정하여, ROR1 1㎍/mL 코팅했을 때 흡광도 값 (450nm-650nm)이 1.0 이상인 클론을 선별하였다(도 1).
이어 ROR1을 발현하는 세포주에 결합하는 클론은 유세포분석으로 선별하였다. 구체적으로 상기 단일클론 scFv 상등액 100㎕를 ROR1을 과발현하는 암세포주(JeKo-1)와 반응시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 항-HA-FITC 항체(Sigma, H7411)와 4℃에서 30분간 반응한 후 PBS로 2회 세척 후 PBS 200㎕로 현탁하여 FACSCalibur flow cytometer를 이용하여 JeKo-1 세포주에 결합하는 클론을 선별하였다(도 2).
이로부터 재조합 인간 ROR1 단백질 및 ROR1을 발현하는 세포주에 결합하는 10개 항체 클론(AB4, A2F2, A2F3, BA6, CC9, C2E3, DG6, D2B12, A2F2 M1, 및 BA6 M1)을 선별하였으며, 상기 각 항체의 중쇄가변 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 CDR 서열은 다음 표와 같다.
클론 중쇄가변(VH)의 CDR서열 VH
CDR1 CDR2 CDR3
서열 서열
번호 		서열 서열
번호 		서열 서열
번호 		서열
번호
AB4 SYDMS 1 WISPDSGSIYYADSVKG 6 PTGRFDY 14 43
A2F2 DYYMS 2 SISPDGSNTYYADSVKG 7 NLRAFDY 15 44
A2F3 SYDMS 1 WISPGGGSKYYADSVKG 8 VNGRFDY 16 45
BA6 NYDMS 3 AIYHSGSSKYYADSVKG 9 GGNGAWDTGFDY 17 46
CC9 SYDMS 1 GISHGSGNKYYADSVKG 10 RLSLRRRPSYYSDNAMDV 18 47
C2E3 NYAMS 4 SISHNSGSTYYADSVKG 11 FISARKSLGRSYSNGMDV 19 48
DG6 DYDMS 5 VISPDGGSIYYADSVKG 12 DVVECNMNPCSYDNAMDV 20 49
D2B12 NYDMS 3 SISPSSGSSIYYADSVKG 13 APGWCQAPSCYYDNAMDV 21 50
A2F2 M1 DYYMS 2 SISPDASNTYYADSVKG 96 NLRAFDY 15 98
BA6 M1 NYDMS 3 AIYHSGSSKYYADSVKG 9 GGNAAWDTGFDY 97 99
클론 경쇄가변(VH)의 CDR서열 VL
CDR1 CDR2 CDR3
서열 서열
번호 		서열 서열
번호 		서열 서열
번호 		서열
번호
AB4 SGSSSNIGNNNVN 22 YDNKRPS 30 GTWDASLSGYV 38 51
A2F2 SGSSSNIGSNTVY 23 ANSQRPS 31 GSWDYSLSGYV 39 52
A2F3 SGSSSNIGNNNVS 24 ADSHRPS 32 ATWDYSLSGYV 40 53
BA6 SGSSSNIGSNDVS 25 YDNNRPS 33 GAWDDSLSGYV 41 54
CC9 TGSSSNIGNNAVN 26 YDSNRPS 34 GAWDDSLSGYV 41 55
C2E3 TGSSSNIGSNDVT 27 ADSKRPS 35 GTWDYSLSGYV 42 56
DG6 SGSSSNIGSNYVS 28 DDSHRPS 36 GAWDDSLSGYV 41 57
D2B12 SGSSSNIGNNDVS 29 DDSQRPS 37 GAWDDSLSGYV 41 58
A2F2 M1 SGSSSNIGSNTVY 23 ANSQRPS 31 GSWDYSLSGYV 39 52
BA6 M1 SGSSSNIGSNDVS 25 YDNNRPS 33 GAWDDSLSGYV 41 54
상기 가변영역 및 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열은 AB4, A2F2, A2F3, BA6, CC9, C2E3, DG6, D2B12, A2F2 M1, 및 BA6 M1의 순서대로 하기 중쇄 및 경쇄 전장을 코딩하는 핵산서열의 일부로 포함되어 있다: 서열번호 75(중쇄) 및 83(경쇄); 서열번호 76(중쇄) 및 84(경쇄); 서열번호 77(중쇄) 및 85(경쇄); 서열번호 78(중쇄) 및 86(경쇄); 서열번호 79(중쇄) 및 87(경쇄); 서열번호 80(중쇄) 및 88(경쇄); 서열번호 81(중쇄) 및 89(경쇄); 서열번호 82(중쇄) 및 90(경쇄); 서열번호 102(중쇄) 및 84(경쇄); 및 서열번호 103(중쇄) 및 86(경쇄). 상기 핵산 서열에서 불변영역을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 92(중쇄), 및 서열번호 94(경쇄) 또는 95(경쇄) 이다.
실시예 2: 항 ROR1 scFv의 전체 IgG 형태로 변환 및 생산
실시예 2-1: 항 ROR1 scFv의 전체 IgG 형태로의 클로닝
상기 실시예 1에서 확보한, 각 ROR1 특이적 단일클론 파아지 항체의 서열을 전체 IgG(full IgG) 형태로 변환하기 위해, 실시예 1에서 확보한 각 클론의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산을 합성하였다(제노텍, 대한민국). 인간 IgG1 서브타입의 중쇄와 경쇄 불변영역(각각 서열번호 91 및 93) 단백질을 코딩하는 유전자를 합성하여 상기 각 중쇄와 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산과 연결하였다. 각 항체의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 핵산은 각각 pcDNA3.1 기반의 발현 벡터에 클로닝하여 CHO-S 포유동물세포주에서 항체 핵산을 암호화하는 벡터를 확보하였다.
비교군 항체로는 기존 항-ROR1 항체인 2A2(US 9,316,646)의 가변영역에 인간 IgG1을 연결한 키메라 항체를 비교군 항체로 사용하였다.
IgG 형태의 본원에 따른 항체는 AB4, A2F2, A2F3, BA6, CC9, C2E3, DG6, D2B12, A2F2 M1, 및 BA6 M1의 순서대로 하기 중쇄 및 경쇄 전장 서열로 개시된다: 서열번호 59 (중쇄) 및 67 (경쇄); 서열번호 60 (중쇄) 및 68 (경쇄); 서열번호 61 (중쇄) 및 69 (경쇄); 서열번호 62 (중쇄) 및 70 (경쇄); 서열번호 63 (중쇄) 및 71 (경쇄); 서열번호 64 (중쇄) 및 72 (경쇄); 서열번호 65 (중쇄) 및 73 (경쇄); 서열번호 66 (중쇄) 및 74 (경쇄); 서열번호 100 (중쇄) 및 68 (경쇄); 및 서열번호 101 (중쇄) 및 70 (경쇄).
실시예 2-2: 항 ROR1 IgG 항체의 발현
CHO-S 세포를 CD-CHO(Gibco, 10743) 배지에 1.5×106 cells/㎖로 농도를 맞춘 후, 8% CO2, 37℃에서 1일 동안 배양하였다. DNA 트랜스펙션 당일 2.5~3×106 cells/㎖로 자란 세포를 1% DMSO가 포함되어 있는 CD-CHO 배지를 이용하여 2.1×106 cells/㎖의 농도로 준비한 후, 8% CO2, 37℃에서 3 hr 배양하였다. 3000 rpm에서 15 min 원심분리 후, 상등액을 제거한 후, 2.5% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 재현탁 하였다. 이어 실시예 2-1의 중쇄와 경쇄를 발현하는 각 벡터를 각각 배지 ㎖당 1㎍씩 Opti-MEM 배지에 희석하고, PEI(Polysciences, 23966, stock 농도 : 1㎎/㎖)는 배양 배지 ㎖당 8㎍ 희석하였다. 상기 벡터 및 PEI 혼합물을 섞어 상온에서 10 min 동안 정치한 후, 상기와 같이 준비된 세포가 포함된 플라스크에 넣은 후, 5% CO2, 37℃, 100 rpm으로 4 hr 배양한 후, 배양부피와 동일한 부피의 CD-CHO 배지를 넣어준 후, 8% CO2, 37℃, 110 rpm에서 4일 동안 배양하였다.
실시예 2-3: 항 ROR1 IgG 항체의 분리 정제
평형화 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl)을 Mab selectsure(GE healthcare, 5㎖)에 통과시켜 평형시킨 이후, 실시예 3-2의 배양액을 컬럼(Mab selectsure(GE healthcare, 5㎖))에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 50mM Na-citrate(pH 3.4), 100 mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1M Tris-HCl(pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2가 되게 하였다. 완충액을 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하였다.
실시예 3: 항 ROR1 IgG 항체의 ROR1에 대한 결합 특이성 분석
실시예 3-1: 항 ROR1 IgG 항체의 ROR1 항원(세포외영역)에 대한 결합능 분석(ELISA)
상기 실시예 1 및 2에서 제조되고 선별된 각 클론의 IgG 항체의 항원에 대한 특이적 결합능을 하기와 같이 분석하였다.
항-ROR1 항체-항원 결합 친화도는 ELISA-기반 용액 결합시험을 사용하여 평가하였다. 구체적으로 96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)를 4℃에서 16시간 동안 PBS 용액 중의 1㎍/㎖ 농도의 아래 기술한 ROR1 단백질로 코팅하고, 비특이적 결합부위는 3% BSA(bovine serum albumin)로 2시간 동안 차단시켰다. 이때 ROR1 단백질은 인간 ROR1의 경우 실시예 1의 ROR1-Fc 또는 재조합 인간 ROR1-His(Sino Biological, 13968-H08H)을 사용하였다. ELISA에서 사용한 ROR1-His는 위의 문장에 기재한 바와 같이 sino biological사(13968-H08H)의 단백질로 실시예 1의 ROR1-His, 또는 재조합 마우스 ROR1 단백질을 사용하였다(Acrobiosystems, RO1-M5221-100㎍).
이어 96-웰 미세역가 플레이트상에서 실시예 3에서 준비한 항-ROR1 항체를 도 2에 기재된 농도로 미세역가 플레이트 추가한 후 결합능을 다음과 같이 ELISA로 분석하였다. 구체적으로 2시간 항온처리 한 후에, 상기 플레이트를 0.05%의 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5회 세척한 후, HRP-접합된 Fab 다중클로날 항체 시약(Pierce, 31414)을 1:10,000 비율로 희석하여 상기 세척된 미세역가 플레이트에 넣고, 1시간 동안 37℃에서 반응시켜, 플레이트에 결합된 ROR1 항체를 검출하였다. 반응 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 발색시켰다. 효소반응을 0.5mol/L의 황산에 의해서 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm에서 및 650nm에서 흡광도를 측정하였다 (450nm-650nm).
결과는 도 3a, 도 3b 및 도 4에 기재되어 있으며, 본원의 항-ROR1 항체는 인간 ROR1과 마우스 ROR1에 농도 의존적으로 결합함을 확인하였다. 또한 마우스 ROR1 단백질에 대한 교차반응성을 비교하였을 때 본원 ROR1 항체가 비교군으로 사용한 2A2 대조항체 대비 결합력이 우수한 것으로 나타났다.
실시예 3-2: 항 ROR1 IgG 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 특이적 결합능 측정(FACS)
특정 항원에 대한 항체가 치료용 항체 등 생체 내에서 사용되기 위해서는 세포 표면 발현 항원에 결합하는 것이 필수적인 요소이다. 일부 항체의 경우 정제된 항원에는 결합하지만 세포 표면 발현 항원에는 결합하지 않는다. 이런 경우 생체 내로 항체를 투여하여도 항원에 대한 결합이 불가능 하므로 항원을 발현하고 있는 세포에 항체가 결합하지 못하여 치료용 항체 등 생체 내에서의 활성을 보일 수 없다.
이에 본원의 항-ROR1 항체가 세포 표면 발현 ROR1에 결합하는지 여부를 FACS 분석을 통하여 확인하였다.
이 실험을 위하여 ROR1 유전자를 일시적으로(CHO-human ROR1, CHO-human ROR2, CHO-mouse ROR1) 또는 안정적으로(MC38-human ROR1) 트렌스펙션시켜 ROR1 단백질의 발현을 인위적으로 과발현시킨 세포주(각각 도 5 및 도 7) 또는 ROR1을 발현하는 세포주(JeKo-1, Mino)(도 6) 또는 ROR1을 발현하지 않는 세포주(MCF7)(도 6)와 FACSCalibur(BD Biosciences) 기기를 이용하여 항-ROR1 항체와 ROR1의 결합된 정도를 다음과 같이 측정하였다. MCF7는 ROR1을 발현하지 않는 음성대조군이고, CHO-human ROR2는 인간 ROR2를 발현하는 음성대조군이다. JeKo-1, Mino, CHO-human ROR1, CHO-mouse ROR1, MC38-human ROR1은 모두 인간 ROR1 또는 마우스 ROR1을 발현 하는 세포주이다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포수를 계수하여 2×105 cells/200㎕ PBS로 맞춘 뒤, 실시예 3에서 준비된 각 ROR1 단일클론 항체를 10μg/㎖ 또는 10μg/㎖으로부터 5배씩 희석하여 처리 후 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 표지된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0㎎/㎖)를 2㎕/1×105 cells/200㎕ PBS로 현탁하여 4℃에서 1시간 반응하였다. 일시적으로 과발현시킨 인간 ROR1, 인간 ROR2, 마우스 ROR1의 발현 정도의 확인은 상업적으로 판매되는 FACS 분석용 항체(anti-ROR1: R&D Systems, FAB2000G, anti-ROR2: R&D, FAB20641P)를 이용하여 분석하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기를 이용하여 판독하였다. 음성대조군(2nd Ab)은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각각의 ROR1 단일클론항체를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 대조군의 이동된 판독 결과와 비교하였다(Mean Fold Ratio　MFI Ratio: MFI of anti-ROR1 / MFI of 2nd Ab).
결과는 도 5, 도 6 및 도 7에 기재되어 있다. 그 결과 본원의 항-ROR1 항체는 세포에서 원래 발현되는 인간 ROR1(도 6) 및 세포에서 인위적으로 과발현 된 인간 ROR1(도 5, 도 7)의 세포외영역에 특이적으로, 농도의존적인 양상으로 결합함을 확인하였다. 또한 패밀리 단백질인 인간 ROR2에는 결합하지 않고, 마우스 ROR1에 대해서는 종간 교차반응성이 있음을 확인하였다(도 5). 세포표면에 발현하는 마우스 ROR1에 대한 교차반응성을 비교하였을 때 본원의 ROR1 항체가 비교군으로 사용한 항체인 2A2 대비 결합정도가 더 우수함을 확인하였다 (도 5).
실시예 3-3: 항 ROR1 IgG 항체의 다양한 암종에서의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정(FACS)
이어 FACS 분석을 통하여 본원의 항-ROR1 항체가 다양한 종류의 암세포주에서 세포 표면 발현 ROR1에 결합하는지 여부를 확인하였다. ROR1은 다양한 암세포에서 발현하는데 만성 림프구성 백혈병(CLL), B세포 백혈병, 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 버킷 림프종, 외투세포림프종(MCL), 급성림프구성백혈병(ALL), 미만성거대B세포림프종(DLBCL), 여포성림프종(FL), 변연부림프종(MZL) 등의 혈액암은 물론 유방암, 신장암, 난소암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 상피 편평세포암, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암 등의 다양한 고형암에서도 과발현되는 것으로 보고 되어있다.
이 실험을 위하여 다음과 같은 다양한 종류의 암세포주를 사용하였다: AGS (ATCC® CRL-1739™, huamn gastric adenocarcinoma), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822™, human gastric carcinoma), MKN-28 (KCLB 80102, human gastic adenocarcinoma), SNU-1750 (KCLB 01750, human gastric adenocarcinoma), SNU-16 (ATCC® CRL-5974™, human gastric carcinoma), HCC1187 (ATCC® CRL-2322™, huamn breast canccer TNM stage IIA grade 3), MDA-MB-231 ATCC® HTB-26™, human breast cancer), MDA-MB-468 (ATCC® HTB-132™, human breast cancer), HCC70(ATCC® CRL-2315™, human breast cancer TNM stage IIIA, grade 3), HCC1143 (ATCC® CRL-2321™, TNMstageIIA,grade3,primaryductalcarcinoma), BT20 (ATCC® HTB-19™ human breast cancer), HCC1806 (ATCC® CRL-2335™, huamn breast canccer TNM stage IIB grade 2), HCC1937 (ATCC® CRL2336™, TNMstageIIB,grade3, primaryductalcarcinoma), BT474 (ATCC® HTB-20™, ductal carcinoma), MCF7 (ATCC® HTB-22™, breast cancer metastatic site), H460 (ATCC® HTB-177™, large cell lung cancer), A549 (ATCC® CCL-185™, lung carcinoma), NCI-H1975 (ATCC® CRL-5908™, non-small cell lung cancer), H1437 (ATCC® CRL-5872™, stage1,adenocarcinomanon-smallcelllungcancer), Calu-6 (ATCC® HTB-56™, anaplastic lung carcinoma), HCT116 (ATCC® CCL-247™, colorectal carcinoma), DLD-1 (ATCC® CCL-221™, Dukes'type C, colorectal adenocarcinoma), HT29 (ATCC® HTB-38™, colorectal adenocarcinoma), 697 (DSMZ ACC 42, acute myeloblastic leukemia), Kasumi-2 (ATCC® CRL-2724™,　 acute myeloblastic leukemia), Mino (ATCC® CRL-3000™, MantleCellLymphoma), JeKo-1 (ATCC® CRL-3006™, MantleCellLymphoma), 및 Jurkat (ATCC® TIB-152™, acute T cell leukemia). 상기 세포주에 대하여 본원의 항-ROR1 항체를 이용하여 ROR1에 대한 결합을 FACS (FACSCalibur, BD Biosciences)로 분석하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포수를 계수하여 2×105 cells/200㎕ PBS로 맞춘 뒤, 실시예 3에서 준비된 각 ROR1 단일클론 항체중 클론명 C2E3 항체를 10μg/㎖으로 처리 후 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 표지된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0㎎/㎖)를 2㎕/1×105 cells/200㎕ PBS로 현탁하여 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기를 이용하여 판독하였다. 음성대조군은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각 암세포주간 ROR1의 발현정도를 비교하기 위하여 본원의 ROR1 단일클론항체(C2E3)를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 대조군에서 이동된 판독 결과로 나눈 값(Mean Fold Ratio　MFI Ratio: MFI of anti-ROR1 / MFI of 2nd Ab)을 표기하였다.
결과는 도 8에 기재되어 있다. 그 결과 본원의 항-ROR1 항체는 위암, 유방암, 폐암, 대장암, 급성림프구성백혈병(ALL), 및 외투세포림프종(MCL) 유래의 다양한 암세포주에서 발현되는 ROR1에 결합이 확인되었다.
실시예 4: 항 ROR1 IgG 항체의 ROR1에 대한 친화도(Affinity) 측정
바이오센서 트레이 케이스에 96 well black microplate(greiner bio one)를 장착하고 8개 well 각각에 10X KB 또는 D.W로 200㎕을 넣는 다음 Anti Penta His biosensor 또는 AR2G biosensor(ForteBio, USA) 8개를 꽂아서 10분 동안 수화하였다. 분석 시료는 희석할 농도에 맞게 600㎕씩 2배 또는 3배로 희석하였다. 분석 농도는 30 ~ 0.021nM까지 1X KB 또는 10X KB를 사용하여 희석하였다. 항원 고정을 위해서 재조합 인간 ROR1-His(Sino Biological, 13968-H08H)을 1㎍/㎖로 10X KB 또는 Sodium Acetate pH5 버퍼로 희석하였다. 고정화는 로딩단계에서 문턱값 0.3nmat로 고정하였다. Association은 3분~10분, Dissociation은 20분으로 실험 진행하였다. Octet program template에 맞추어서 새로운 96 well black microplate에 준비된 buffer를 순서에 맞게 넣었다. Baseline1으로 사용 되는 10X KB 또는 D.W로 200㎕을 넣었다. Loading 할 항원 ROR1-His 단백질, 1㎍/㎖을 200㎕씩 넣었다. Baseline2로 사용되는 10X KB 또는 1X KB, 200㎕을 넣었다. 희석한 항체 30 ~ 0.021nM, Reference blank에 해당되는 10X KB buffer 또는 1X KB를 각 well에 200㎕씩 넣었다. 실험 plate의 온도는 30℃로 고정하였다. 시료를 모두 넣은 후 기기를 작동시긴 후 실험이 종료하여 Octet Analysis 9.0 software로 결과를 업로드 한 후 1:1 핏팅으로 KD값을 분석하였으며, 결과는 아래 표 6에 기재되어 있다. Octet 분석법을 이용한 KD값 획득을 통해 항-ROR1 항체가 ROR1 항원에 대한 강한 결합력을 가짐을 확인하였다.
Figure 112020139884537-pct00010
실시예 5: 항 ROR1 IgG 항체의 마우스 이종종양이식 모델에서의 암 성장 억제 효능 분석
중증면역 부전 마우스(The severe combined immunodeficiency mouse, SCID)에 ROR-1을 발현하는 인간 외투세포림프종인 JeKo-1 세포주를 1×107 cells/head 이식하여 인간 암 이식 종양 마우스를 제작했다. 이식후 종양 크기가 평균 170 mm3 에 도달하였을 때 (Day 1) 군분리를 실시하고 항 ROR-1 항체 5종을 10㎎/㎏씩 주 2회, 총 5회 1㎖ 실린지를 이용하여 마우스 복강내로 투여했다 (Day 1, 4, 7, 10 및 14). 음성대조군은 항 ROR-1 항체의 구조와 유사한 인간 IgG1(InVivoPlus human IgG1 isotype control, BioXCell, BP0297)을 10㎎/㎏씩 주 2회, 총 5회 복강내로 투여하였다. 마우스에 이식된 종양크기 및 체중은 최초 투여(Day 1) 직전에 측정되고, 그 후 각 투여일의 투여 직전 및 최후 투여 후 2일 후(Day 16)에 측정하였다.
결과는 도 9a 및 도 9b에 기재되어 있다. 본원에 따른 항 ROR-1 항체는 암의 성장을 억제하였으며, 음성 대조군인 인간 IgG1 항체(HuIgG1) 대비 본원에 따른 암의 성장억제 효과(% Tumor Growth Inhibition, %TGI)는 실험종료일인 Day 16을 기준으로 C2E3 36.0%, A2F2 28.9%, AB4 36.1%, BA6 31.7%, CC9 29.4% 인 것으로 나타났다. 본원에 따른 항-ROR1 항체는 HuIgG 투여군 대비 통계학적 유의성 있는 차이를 갖는 것으로 나타났다(일원배치 분산분석, P value < 0.05) (도 9a). 체중 측정 결과(도 9b) 투여군간의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 실시예 3-1과 3-2에 기재된 바와 같이 본원의 항-ROR1 항체는 마우스 ROR1 항원에 교차반응성을 가진다. 그러므로 투여한 본원의 항-ROR1 항체는 이종이식한 인간 외투세포림프종인 JeKo-1 세포주가 발현하는 인간 ROR1과 함께 마우스가 자체적으로 발현하는 마우스 ROR1에도 결합할 수 있다. 체중 측정 결과 음성 대조군(HuIgG1)과 본원의 항-ROR1 항체 간에 체중 증가양상이 유사하였다. 이는 본원의 항-ROR1 항체 투여에 의해 독성을 유도하지 않음을 의미한다고 할 수 있다. 상기 결과는 본원에 따른 항체가 암치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
마우스 이종종양이식 모델에서는 본원의 ROR1 항체 5종 모두 암의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이들 중 일부 항체(C2E3, AB4)는 하기 실시예 6 및 도 10에 기재된 바와 같이 anti-human Fc 항체에 의해 다량체화 될 때 ROR1 과발현 암세포주의 자가세포 사멸을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 그러나 암의 저해기전은 자가세포사멸 유도, 암세포 분열 및 성장 억제, 암혈관형성 억제, 면역세포 활성화 등 다양한 기전을 통해 가능하기 때문에, 후술하는 도 10의 결과는 본원에 따른 항-ROR1 항체들이 각 항체별로 상이한 작용기작에 의해 생체내에서 암성장을 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 6: 항 ROR1 IgG 항체의 자가세포사멸 유도능 분석
실시예 5에서와 같은 종양 억제능을 나타내는 본원에 따른 항체의 가능한 기전을 분석하기 위해, 세포사멸 유도능을 분석하였다.
이를 위해 ROR1 고발현 세포주인 JeKo-1을 원심분리하여 혈청이 포함된 배지를 제거하고, PBS를 이용하여 1회 세척한 후, 6 well plate에 각 well당 5×106개의 세포를 혈청이 없는 RPMI1640 배지를 이용하여 seeding 하였다. 본원의 항-ROR1 항체 100㎍/㎖과 anti-human Fc 항체(Thermo Fisher, 31125) 300㎍/㎖을 1:1로 동량 tube에 넣어 준 후, 상온에서 10분간 반응시켜, anti-human Fc 항체에 의해 항-ROR1 항체가 다량체를(cross-linking) 이루게 하였다. 1.5㎖의 배지가 들어있는 각 well에 상기 혼합물을 150㎕ 넣어 최종 항체 처리양이 ROR1의 항체의 경우 10㎍/㎖, anti-human Fc 항체는 30㎍/㎖이 되도록 한 후, 5% CO2, 37℃ 조건에서 24 hr 배양하여 반응시켰다.
이어 ROR1 항체의 단독처리 및 다량체를 이룬 항-ROR1 항체가 자가세포 사멸능이 있는지 확인하기 위해 각 well의 세포를 수거하여 PBS로 1회 세척하였다. 이후, 자가세포사멸의 표지인 Annexin V와 세포사멸 표지인 PI를 각 군에 반응시켜 염색된 정도를 FACS 분석을 통해 확인하였다.
결과는 도 10에 기재되어있다. 실험 결과 항-ROR1 항체 단독 처리에 의해서는 자가세포사멸이 관찰되지 않았으나, anti-human Fc 항체에 의해 다량체를 이룬 일부 항-ROR1 항체 클론(C2E3, AB4)의 경우 대조군에 비해 Annexin V와 PI의 염색정도가 증가함을 확인하였으며, 특히 자가세포사멸능의 표지인 Annexin V의 염색정도의 경우 대조군에 비해 C2E3 클론은 23%, AB4 클론은 10% 증가함을 확인하였다. 이와 같은 자가세포사멸능이 ROR1에 의한 특이적 반응인지 확인하기 위해, ROR1 미발현 세포주인 U266에 C2E3 클론을 이용하여 상기와 같은 방법으로 Annexin V와 PI 염색정도를 확인하였고, ROR1 미발현 세포주인 U266에는 자가세포사멸능이 유도되지 못함을 확인하여, 다량체를 이룬 일 항-ROR1의 항체에 의한 자가세포사멸능이 ROR1을 통한 특이적 반응임을 증명하였다. 항체는 생체 내에서 Fc 영역을 통해 Fc 감마 수용체와 결합하면서 다량체를 이룰 수 있으므로 anti-human Fc 항체를 이용한 항-ROR1 항체의 다량체 형성은 생체 내 현상을 유사하게 만든 조건이라 할 수 있다. 상기 분석결과는 일 기전으로, 본원에 따른 항-ROR1 항체에 의해 ROR1을 과발현 하는 암세포주에서 자가세포사멸이 유도될 수 있음을 의미한다.
참고로 ROR1 항체의 다량체화에 의한 암세포주의 자가세포사멸 유도는 모든 종류의 ROR1 항체에서 나타나는 현상은 아니다. 예로 본원의 ROR1 항체 중 BA6 클론 및 비교군으로 사용한 항체인 2A2는 anti-human Fc 항체에 의해 다량체화를 이루어도 ROR1 과발현 암세포주의 자가세포사멸을 유도하지 않았다. 이는 본원에 따른 ROR1 항체들이 서로 상이한 작용기작에 의해 암세포 억제능을 가짐을 의미한다. 이러한 차이는 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만 각 ROR1 항체들이 결합하는 에피토프의 상이성에 기인할 수 있다.
<110> ABL Bio Inc. <120> ANTI-ROR1 ANTIBODY AND ITS USE THEREOF <130> OPP20191633KR <150> KR 10-2018-0058336 <151> 2018-05-23 <150> PCT/KR2018/005854 <151> 2018-05-23 <160> 103 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR1 <400> 1 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR1 <400> 2 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR1 <400> 3 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR1 <400> 4 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR1 <400> 5 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR2 <400> 6 Trp Ile Ser Pro Asp Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly 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105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain <400> 100 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 101 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain <400> 101 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Ala Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 102 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain coding gene <400> 102 gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc gactactaca tgtcctgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctcccccg acgcctccaa cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagaacctg 300 cgggccttcg actactgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgtcctccgc ctccaccaag 360 ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 720 ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga ggtgacttgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggagc agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagccccggg agccccaggt gtacaccctg cccccctccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtccc ccggcaag 1338 <210> 103 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain coding gene <400> 103 gaggtgcagc tgctggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacgaca tgtcctgggt gcggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccgcc atctaccact ccggctcctc caagtactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggggcggc 300 aacgccgcct gggacaccgg cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 360 tccgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc cctcctccaa gtccacctcc 420 ggcggcaccg ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 tcctggaact ccggcgccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagtcc 540 tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct cctcctccct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 720 ggcccctccg tgttcctgtt ccctcctaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780 cccgaggtga cttgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accccgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 900 aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 1020 tccaaggcca agggccagcc ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta cccctccgac 1140 atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtccct gtcccccggc aag 1353

Claims (20)

  1. ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편으로,
    상기 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 중쇄 상보성 결정부위 및 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 경쇄 상보성 결정부위를 포함하며,
    상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열은 다음 중 어느 하나의 조합인, ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편:
    (a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 6, 및 14이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 22, 30 및 38;
    (b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 7, 및 15이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31 및 39;
    (c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 8, 및 16이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 24, 32 및 40;
    (d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 9, 및 17이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 33 및 41;
    (e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 10, 및 18이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 26, 34 및 41;
    (f) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 4, 11, 및 19이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 27, 35 및 42;
    (g) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 5, 12, 및 20이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 28, 36 및 41;
    (h) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 13, 및 21이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 29, 37 및 41;
    (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 96, 및 15이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31, 및 39; 또는
    (j) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 9, 및 97이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 33, 및 41.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원결합 단편은,
    하기 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 조합을 포함하는, ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편:
    서열번호 43 및 51; 서열번호 44 및 52; 서열번호 45 및 53; 서열번호 46 및 54; 서열번호 47 및 55; 서열번호 48 및 56; 서열번호 49 및 57; 서열번호 50 및 58; 서열번호 98 및 52; 또는 서열번호 99 및 54.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원결합 단편은,
    하기 서열로 표시되는 중쇄 및 경쇄 조합을 포함하는, ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편:
    서열번호 59 및 67; 서열번호 60 및 68; 서열번호 61 및 69; 서열번호 62 및 70; 서열번호 63 및 71; 서열번호 64 및 72; 서열번호 65 및 73; 서열번호 66 및 74; 서열번호 100 및 68; 또는 서열번호 101 및 70.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원결합 단편은 단일클론 항체인,
    ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형인,
    ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ROR1은 인간, 원숭이, 또는 마우스 ROR1인,
    ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디, 다이아바디, scAb, 이가항체 또는 다가항체인,
    ROR1의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 항원결합 단편.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, ROR1의 과발현과 관련된 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물로서,
    상기 ROR1의 과발현과 관련된 질병은 암인, 약학 조성물.
  16. 삭제
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편을 포함하는, 생물학적 샘플에서 ROR1의 검출용 조성물.
  18. 삭제
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편을 포함하는 ROR1의 과발현과 관련된 질병의 진단용 조성물로서, 상기 ROR1의 과발현과 관련된 질병은 암인, 조성물.
  20. 삭제
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