KR20220158181A - Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도 - Google Patents

Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220158181A
KR20220158181A KR1020210065657A KR20210065657A KR20220158181A KR 20220158181 A KR20220158181 A KR 20220158181A KR 1020210065657 A KR1020210065657 A KR 1020210065657A KR 20210065657 A KR20210065657 A KR 20210065657A KR 20220158181 A KR20220158181 A KR 20220158181A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
val
leu
thr
Prior art date
Application number
KR1020210065657A
Other languages
English (en)
Inventor
박윤희
송호영
류현민
정철웅
김주희
권정아
이보라
유병민
이수연
정진원
Original Assignee
주식회사 레고켐 바이오사이언스
에이비엘바이오 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 레고켐 바이오사이언스, 에이비엘바이오 주식회사 filed Critical 주식회사 레고켐 바이오사이언스
Priority to KR1020210065657A priority Critical patent/KR20220158181A/ko
Priority to PCT/KR2022/007260 priority patent/WO2022245186A1/ko
Priority to TW111119008A priority patent/TW202313122A/zh
Publication of KR20220158181A publication Critical patent/KR20220158181A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/473—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. acridines, phenanthridines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/20—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/23—Heterocyclic radicals containing two or more heterocyclic rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, not provided for in groups C07H19/14 - C07H19/22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Abstract

본 발명은 ROR1 및 B7-H3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 ROR1 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 질환, 더 상세하게는 암 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 상기 항체-약물 접합체의 용도에 관한 것이다.

Description

ROR1 및 B7-H3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도{ROR1 and B7-H3 binding antibody-drug conjugate and use thereof}
본 발명은 ROR1 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ROR1 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 그 용도에 관한 것이다.
ROR1은 배아 및 태아 발생과정에서 발현되어 세포 극성, 세포 이동, 및 신경돌기 성장 등을 조절한다. 다양한 암세포에서 ROR1의 과발현이 관찰됨에 따라 종양태아성 유전자(oncofetal gene)로 분류되었다. 특히 ROR1은 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia)에서 과발현되는 것이 밝혀졌다. 만성 림프구성 백혈병(CLL) 외에도 B세포 백혈병, 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 버킷 림프종, 외투세포림프종(MCL), 급성림프구성백혈병(ALL), 미만성거대B세포림프종(DLBCL), 여포성림프종(FL), 변연부림프종(MZL) 등의 혈액암은 물론 유방암, 신장암, 난소암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 상피 편평세포암, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암 등의 다양한 고형암에서도 과발현되는 것으로 보고되었다. 이와 같은 암에서 ROR1의 발현은 암환자의 좋지 않은 예후와 관련이 있으며, 암 전이에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
B7-H3(CD276)는 B7 패밀리의 일원으로 세포외영역, 막통과영역 및 세포내영 역을 포함하는 막관통 단백질이다. B7-H3의 2개 세포외영역은 엑손 중복으로 인해 면역글로불린 가변 도메인과 면역글로불린 불변 도메인의 단일쌍(2Ig B7-H3) 또는 2개의 동일한 쌍(4Ig B7-H3)으로 구성된다. B7-H3 단백질은 정상조직에서 T 세포, 자연 살해 세포 (NK cell, natural killer cell) 및 항원제시세포(APC, antigen presenting cell)에서 항상 발현하는 것은 아니지만 그 발현이 유도될 수 있다. B7-1과 B7-2의 발현이 주로 항원제시세포와 같은 면역세포에만 국한되어 있음에도 불구하고 B7-H3 단백질은 골아 세포, 섬유아세포, 섬유 모세포 유사 활막 세포 및 상피 세포뿐만 아니라 사람의 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반 및 림프관 기관 등에서도 발현된다. 이 넓은 발현 양상은 특히 말초 조직에서 B7-H3의 보다 다양한 면역학적 및 비-면역 기능을 암시한다.
최근 B7-H3 발현은 비소세포폐암, 신장 세포암, 신경 모세포종, 대장암, 췌장암, 위암, 폐암, 전립선암, 자궁내막암, 간세포암, 유방암, 자궁경부암, 골육종, 구강암, 방광암, 신경교종, 흑색종 등 다양한 고형암에서 확인되며, 급성 백혈병 다발성 골수종, 여러 종류의 림프종과 같은 혈액암에서도 발현되는 것으로 보고 되어 있다(Zhimeng Yea, Zhuojun Zhengb et al, Cell Physiol Biochem(2016), Elodie Picarda, Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang, clinical cancer research(2016), Wei Zhang, Yanfang Wang, Jing Wang et al,international journal of oncology(2015)).
한편, 항체의 표적 특이성 때문에 항체를 이용한 다양한 치료 방법이 개발되고 있으며, 항체를 포함하는 다양한 형태의 의약, 예를 들어 항체-약물 접합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC) 등이 개발되고 있다. 이에, 항체 또는 항체-약물 접합체에 대하여 생체 내 안정성을 증가시키고, 치료 효과를 극대화하는 방법이 계속적으로 연구되고 있다.
이 중 ADC는 일반적으로 천연 항체에 비해서 생체 내 안정성이 낮은 단점이 있으나, 천연 항체가 가진 단점인 낮은 치료 효과를 약물과의 결합을 통하여 개선하고자 개발되었다. 표적 특이적 항체에 싸이토톡신 등 특정 약효를 가지는 약물이 다양하게 결합한 형태로 개발되고 있으며, 암세포 특이적 항체에 약물을 결합시켜 암세포 사멸을 유도할 수 있는 항체-약물 결합체가 상용화된 바 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 ROR1 및 B7-H3에 동시에 결합하는 이중특이항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 우수한 결합력을 나타내는 항-ROR1xB7-H3 이중특이항체를 개발하였고, 상기 이중특이항체에 혈장 내에서 보다 안정하고 체내 순환시에도 안정적이며 약물이 암세포 내에서 쉽게 방출되어 약효를 나타낼 수 있는 효과적인 자기-희생기(self-immolative group)을 포함하는 링커를 적용하여, 암의 예방 및/또는 치료에 효과적인 ROR1 및 B7-H3 이중특이항체-약물 접합체를 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체-약물 접합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 I의 구조를 갖는 접합체를 제공한다:
[일반식 I]
Ab - (X)y,
여기에서,
Ab는 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 X는 독립적으로 하나 이상의 활성제 및 링커를 포함하는 화학적 잔기이며,
상기 링커는 항체와 활성제를 연결하고, 및
상기 y는 1 내지 20의 정수이다.
또한, 본 발명은 상기 접합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항체-약물 접합체는 ROR1 및 B7-H3에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편를 포함하여 ROR1 및 B7-H3 각각에 결합하는 단독항체에 비해 ROR1 또는 B7-H3 과발현 세포에서 우수한 세포 결합력을 나타내고, 향상된 항체매개 세포독성(ADCC, antibody-derived cell cytotoxicity)을 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체는 혈장 내에서 보다 안정하고 체내 순환시에도 안정적이며, 약물 및/또는 톡신이 표적 세포 내에서 쉽게 방출되어 약효를 극대화할 수 있는 자가-희생기를 포함하는 링커 기술을 포함하여 표적 세포에서 약물 및/또는 톡신이 약효를 효과적으로 발휘한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 단일클론 파아지항체의 ROR1 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA) 결과이다. 각 항-ROR1 단일클론 항체가 세포외영역 ROR1 항원에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸다. 도 1에서 BCMA-Fc는 음성 대조군으로 각 항-ROR1 단일클론 항체가 ROR1 항원에만 특이적으로 결합하고 BCMA 단백질 또는 태그로 사용한 Fc에는 결합하지 않음을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-ROR1 단일클론 파아지 항체의 세포 표면발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과이며, ROR1을 세포 표면에서 발현하는 세포로는 JeKo-1 세포주를 사용하였다. 각 항-ROR1 단일클론 항체가 세포 표면에서 발현되는 ROR1에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 IgG 항체의 인간 ROR1 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA) 결과이다. 각 항체들이 농도의존적으로 인간 ROR1 항원에 결합하는 것을 나타낸다. 상기 결과는 단일클론 파아지 항체를 IgG 형태로 변경한 후에도 ROR1에 대한 결합능을 유지하는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 IgG 항체의 마우스 ROR1 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA) 결과이다. 각 항체들이 농도의존적으로 마우스 ROR1 항원에 결합하는 것을 나타낸다. 본 실험을 통해 본 발명의 항-ROR1 항체가 마우스 ROR1에 대한 교차반응성이 있음을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과로, CHO-human ROR1 세포주는 인간 ROR1을, CHO-human ROR2는 인간 ROR2를, CHO-mouse ROR1은 마우스 ROR1을 인위적으로 과발현시킨 세포주이다. 각 항체는 세포 표면에서 발현되는 인간 ROR1에 특이적으로 결합하고 패밀리 단백질인 인간 ROR2에는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 마우스 ROR1을 인위적으로 과발현시킨 세포주에도 결합하는 것을 확인함으로써 본 발명의 항-ROR1 항체가 마우스 ROR1에 대한 종간 교차반응성이 있음을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과로, ROR1 발현 양성 세포주로 JeKo-1 및 Mino 세포주, ROR1 음성 세포주로 MCF7 세포주를 사용하였다. 각 항체들은 세포 표면에서 발현되는 ROR1에 특이적으로 결합하고, ROR1을 발현하지 않는 세포주인 MCF7에서는 결합하지 않는 것으로 나타났다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정 (FACS) 결과이다. 인간 ROR1을 마우스 대장암 세포주인 MC38에 인위적으로 과발현시킨 MC38 human ROR1 세포주를 사용하였다. 각 항체들은 인간 ROR1을 과발현한 세포주에 농도의존적으로 결합하는 것으로 나타났다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-ROR1 항체의 세포발현 ROR1 항원에 대한 결합능을 다양한 암세포주에서 측정한 결과이다(FACS).
도 9는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 B7-H3 단백질의 세포외영역(ECD, Extra Cellular Domain)에 대한 결합능 분석(ELISA) 결과이다. 본 발명의 항 B7-H3 항체는 농도 의존적으로 인간 B7-H3 단백질의 세포외영역에 결합하는 것으로 나타났다.
도 10은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 B7 패밀리에 속하는 다른 단백질들의 ECD에 대한 결합능 분석(ELISA) 결과이다. 각 항체들은 B7 패밀리에 속하는 다른 단백질에는 결합하지 않고, B7-H3 단백질만을 특이적으로 인식하는 것으로 나타났다.
도 11은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 종간 교차 반응성을 ELISA로 분석한 결과이다. 각 항체들은 농도 의존적으로 원숭이(cynomolgus) B7-H3와 마우스 B7-H3에 결합하는 것으로 나타났다.
도 12는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 다양한 항 B7-H3 항체의 마우스 B7-H3 단백질에 대한 결합력 정도를 ELISA로 비교한 결과이다. 본원에 따른 항체의 마우스 B7-H3에 대한 결합정도는 상이하나, 모두 농도 의존적으로 마우스 B7-H3 단백질에 결합하는 것으로 나타났다.
도 13은 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정(FACS) 결과이다. 본원의 항 B7-H3 항체들은 B7-H3를 과발현하는 세포주인 MCF-7에만 특이적으로 결합하고 B7-H3를 발현하지 않는 세포주인 Jurkat에는 결합하지 않는 것으로 나타났다.
도 14는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능을 항체 농도별로 측정한(FACS) 결과이다. 각 항체들은 B7-H3를 발현하는 암세포주에 농도 의존적으로 결합하는 것으로 나타났다.
도 15는 본원에 따른 항 B7-H3 항체의 마우스 유래 암세포주(CT26, B16F10, 및 TC-1)에 대한 결합능을 측정한(FACS) 결과이다. 각 B7-H3 단일클론 항체들은 마우스 유래 암세포주의 표면에서 발현하는 B7-H3도 특이적으로 인식하는 것으로 나타났다.
도 16a는 B7-H3와 ROR1을 과발현하는 세포주에(CHO-huROR1-huB7H3) 단독항체와 이중항체의 세포결합력을 FACS로 측정한 그래프이다.
도 16b는 ROR1을 과발현하는 세포주에서(CHO-huROR1) 단독항체와 이중항체의 세포결합력을 FACS로 측정한 그래프이다.
도 16c는 B7-H3를 과발현하는 세포주에서(MC38-huB7H3) 단독항체와 이중항체의 세포결합력을 FACS로 측정한 그래프이다.
도 17a는 B7-H3와 ROR1을 과발현하는 세포주에서(CHO-huROR1-huB7H3) 단일 항체와 이중항체의 ADCC를 측정한 그래프이다.
도 17b는 B7-H3와 ROR1을 과발현하는 세포주에서(CHO-huROR1-huB7H3) 단일 항체와 이중항체의 ADCC를 측정한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 하기 일반식 I의 구조를 갖는 접합체를 제공한다:
[일반식 I]
Ab - (X)y,
상기 식에서,
Ab는 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 X는 독립적으로 하나 이상의 활성제 및 링커를 포함하는 화학적 잔기이며,
상기 링커는 항체와 활성제를 연결하고, 및
상기 y는 1 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ROR1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 도메인은 다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1; 서열번호 4 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2; 서열번호 8 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 11 내지 13으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 LCDR1; 서열번호 14 내지 16으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2; 서열번호 17 내지 19로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
보다 구체적으로, 상기 제1 도메인은 다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3; 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제2 도메인은 다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1; 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2; 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 도메인은 다음의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 20 내지 23, 37, 42, 47, 52로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 24 내지 26, 38, 43, 48, 53로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역.
보다 구체적으로 상기 제1 도메인은 다음의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 21의 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 경쇄 가변영역;
서열번호 22의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역;
서열번호 23의 중쇄 가변영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변영역;
서열번호 37의 중쇄 가변영역 및 서열번호 38의 경쇄 가변영역;
서열번호 42의 중쇄 가변영역 및 서열번호 43의 경쇄 가변영역;
서열번호 47의 중쇄 가변영역 및 서열번호 48의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 52의 중쇄 가변영역 및 서열번호 53의 경쇄 가변영역.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제2 도메인은 다음의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 63 또는 83의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 64 또는 84의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 제2 도메인은 다음의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
서열번호 63의 중쇄 가변영역 및 서열번호 64의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 83의 중쇄 가변영역 및 서열번호 84의 경쇄 가변영역.
본 발명에서 “링커”는 활성제를 리간드에 공유결합시키는 화합물을 말한다.
본 발명에 기재된 링커는 절단성, 비절단성, 친수성 또는 소수성 일 수 있다.
절단성 링커는 세포 내 조건들 하에서 절단 가능하여 상기 링커의 절단으로 세포 내 환경에서 항체 구조물-활성제 접합체로부터 활성제를 방출한다.
절단성 링커는 세포 내 환경(예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 또는 카베올레아 (caveolea) 내)에 존재하는 절단제에 의해 절단 가능하다. 절단성 링커는, 예컨대, 리소좀의 또는 엔도좀의 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커(peptidyl linker)일 수 있다. 일반적으로, 상기 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제들은 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 디펩타이드 약물 유도체들 가수분해하여 표적 세포들 내에서 활성 약물을 방출하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 참조). 항원 발현 세포들 내에 존재하는 효소들에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커들이 가장 일반적이다. 예를 들어, 암 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커가 사용될 수 있다(예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커). 다른 이러한 링커들은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,345에서 설명된다. 또한, 세포 내 프로테아제에 의해 절단 가능한 상기 펩티딜 링커는 예를 들어, Val-Cit 링커, Phe-Lys 링커(예를 들어, Val-Cit 링커를 이용한 독소루비신의 합성을 설명하는 미국 등록 특허 제6,214,345호 참조) 또는 Val-Ala 링커일 수 있다. Val-Cit 링커 또는 Val-Ala 링커는 펜타플루오로페닐 그룹을 함유할 수 있고, 숙신이미드 그룹 또는 말레이미드 그룹을 함유할 수 있다. 또는, PABA 그룹 및 펜타플루오로페닐 그룹을 함유할 수 있고, 4-아미노벤조산(4-Aminobenzoic acid, PABA) 그룹 및 말레이미드 그룹을 함유할 수 있으며, PABA 그룹 및 숙신이미드 그룹을 함유할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "세포 내 절단된(intracellularly cleaved)" 및 "세포 내 절단(intracellular cleavage)"은 항체 구조물-활성제 접합체에 대한 세포 내부의 대사 과정 또는 반응을 지칭하며, 이로써 활성제 (B) 및 항체 구조물 (Ab) 사이의 공유 부착, 예를 들어, 링커가 파괴되어 유리 약물 또는 세포 내 항체로부터 분리된 접합체의 다른 대사 산물이 야기된다.
또한, 절단성 링커는 pH-민감, 즉, 특정 pH 값에서 쉽게 가수분해 될 수 있다. 일반적으로, 상기 pH-민감성 링커는 산성 조건들에서 가수분해될 수 있다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산-불안정성 링커(예를 들어, 하이드라존(hydrazone), 세미카르바존(semicarbazone), 티오세미카르바존 (thiosemicarbazone), 시스-아코니틱 아미드(cis-aconitic amide), 오쏘에스테르(orthoester), 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 등록 특허 제5,122,368호; 제5,824,805호; 제5,622,929호; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661 참조). 이러한 링커들은 혈액과 같은 중성 pH 조건들에서 비교적 안정적이지만 리소좀의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 가수분해성 링커의 예로는 티오에테르 링커(예를 들어, 아실하이드라존 결합을 통해 치료제에 부착된 티오에테르와 같은(예를 들어, 미국 등록 특허 제5,622,929호 참조)를 들 수 있다.
또한, 링커는 환원 조건들 하에서 절단 가능하다(예를 들어, 디설파이드 링커). 예를 들어, SATA (N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-티오)톨루엔)-, SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함하는 다양한 디설파이드 링커들이 공지되어 있다 (예를 들어, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; 미국 등록 특허 제4,880,935호 참조).
또한, 링커는 말로네이트 링커(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 3'-N-아미드 유사체(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12), 베타-글루쿠로나이드(β-Glucuronide) 링커(Jeffery et al., 2006, Bioconjug Chem. 17(3):832-40), 또는 베타-갈락토사이드(β-galactoside) 링커(Kolodych et al., 2017, Eur J Med Chem. Dec 15;142:376-382)일 수 있다.
비절단성 링커는 말레이미도카프로일 링커일 수 있다. 말레이미도카프로일 링커는 N-말레이미도메틸사이클로헥산-1-카복실레이트를 포함할 수 있다. 말레이미도카프로일 링커는 숙신이미드 그룹을 함유할 수 있다. 말레이미도카프로일 링커는 펜타플루오로페닐 그룹을 함유할 수 있다. 링커는 말레이미드 그룹과 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 조합일 수 있다. 링커는 말레이미도카프로일 그룹과 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 조합일 수 있다. 링커는 말레이미드-PEG4 링커일 수 있다. 링커는 숙신이미드 그룹을 함유하는 말레이미도카프로일 링커 및 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자의 조합일 수 있다. 링커는 펜타플루오로페닐 그룹 및 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 함유하는 말레이미도카프로일 링커의 조합일 수 있다. 링커는 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된 말레이미드를 함유할 수 있으며, 여기서 폴리에틸렌 글리콜은 더 많은 링커 가요성을 허용하거나 링커를 길게 사용할 수 있다. 링커는 (말레이미도카프로일)-(발린-시트룰린)-(파라-아미노벤질옥시카보닐) 링커일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 링커는 절단성 링커일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 링커는 프로테아제 절단성 링커, 산-절단성 링커, 디설파이드 링커, 자기-희생기 링커(self-immolative linker) 또는 자기-안정화 링커(self-stabilizing linker), 말로네이트 링커, 말레이미도벤조일 링커, 3'-N-아미드 유사체, 베타-글루쿠로나이드(β-Glucuronide) 링커, 또는 베타-갈락토사이드(β-galactoside) 링커일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 프로테아제 절단성 링커는 티올반응성 스페이서(thiolreactive spacer) 또는 디펩타이드를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 프로테아제 절단성 링커는 티올반응성 말레이미도카프로일 스페이서, 발린-시트룰린 디펩타이드 또는 p-아미노-벤질옥시카보닐 스페이서를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 링커는 일반식 Ⅱ의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[일반식 Ⅱ]
Figure pat00001
상기 식에서,
* 표시는 활성제와 연결되는 부위를 나타내며;
G는 글루쿠론산 모이어티(glucuronic acid moiety) 또는
Figure pat00002
이고, 상기 R3은 수소 또는 카복실 보호기이며, 상기 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬 또는 C3-8 사이클로알킬이며;
W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO2NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- 또는 -PO2NR'-이고, 상기 C, S 또는 P는 직접적으로 페닐링(phenyl ring)에 결합하며, 상기 R' 및 R''는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 다이- C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴 또는 C6-20아릴인 화합물이고;
Z는 독립적으로 C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로이며;
n은 0 내지 3의 정수이고;
L은 제1 유닛 및 제2 유닛으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유닛, 또는 이들 유닛의 조합이고,
여기에서 제2 유닛은 W와 Rz를, W와 제1 유닛을, 또는 제1 유닛과 제1 유닛을 연결하고, 여기에서 제1 유닛은 제2 유닛과 W를, 또는 제2 유닛과 또 다른 제2 유닛을 연결하며,
제2 유닛은
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
, -(CH2CH2V)t-, -(CH2)t(V(CH2)u)v-, 또는 이들의 조합이고,
여기에서 L1은 단일결합 또는 C2-30알케닐이며, R11은 H 또는 C1-10알킬이고, L2는 C2-30알케닐이며;
여기에서, t는 0 내지 10의 정수이고, u는 0 내지 12의 정수이며, v는 1 내지 20의 정수이고, V는 단일결합, -O-, 또는 -S-이며,
제1 유닛은 C2-100알케닐, 친수성(hydrophilic) 아미노산, -C(=O)-, -C(=O)NRv-, -C(=O)O-, -(CH2)n1-NHC(=O)-(CH2)n2-, -(CH2)n3-C(=O)NH-(CH2)n4-, -(CH2)n1-NHC(=O)-(CH2)n2-C(=O)-, -(CH2)n3-C(=O)NH-(CH2)n4-C(=O)-, -S(=O)2NRv-, -P(=O)RwNRv-, -S(=O)NRv-, 및 -P(=O)2NRv- 로 구성된 군으로부터 선택되고,
여기에서, 제1 유닛이 C2-100알케닐인 경우, 알케닐의 탄소 원자는 하나 또는 그 이상의 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 헤테로원자로 치환될 수 있으며, 알케닐은 하나 또는 그 이상의 C1-20알킬로 더 치환될 수 있으며,
여기에서, Rv 및 Rw는 각각 독립적으로 H, C1-8알킬, C3-8사이클로알킬, C1-8알콕시, C1-8알킬티오, 모노- 또는 다이-C1-8알킬아미노, C3-20헤테로아릴 또는 C5-20아릴이며,
n1, n2, n3 및 n4는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고,
Rz는 -O-NH2, -NH2, N3, 치환되거나 비치환된 C1-12알킬, C1-12 알키닐, C1-3알콕시, 치환되거나 비치환된 3 내지 20-원 헤테로아릴, 3 내지 20-원 헤테로사이클릴, 치환되거나 비치환된 C5-20아릴, 또는
Figure pat00007
이고,
여기에서, Rz′은 N 또는 CH이며,
여기에서 치환되는 경우, 하나 이상의 수소원자가 각각 독립적으로 OH, =O, 할로, C1-6알킬, C1-6알콕시, C2-6알케닐, 옥시, 카르복시, C1-6알콕시카르보닐, C1-6알킬카르보닐, 포르밀, C3-8아릴, C5-12아릴옥시, C5-12아릴카르보닐 또는 C3-6헤테로아릴로 치환된다.
본 발명에서, Rz는 Ab, 아미노산 모티프 또는 프레닐화된 아미노산 모티프와 결합할 수 있다. 여기에서, Rz가 결합시, 구조가 유지되거나 탈락 또는 변형될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 링커는 하기 일반식 IIa의 구조를 갖는 것일 수 있다:
[일반식 IIa]
Figure pat00008
상기 식에서,
G는 당(sugar), 당산(sugar acid), 또는 당 유도체(sugar derivatives)이고,
W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -S(O)2NR'-, -P(O)R''NR'-, -S(O)NR'-, 또는 -PO2NR'-이며,
C(O), S, 또는 P가 페닐링(phenyl ring)과 바로 연결되는 경우, R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 디-C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴, 또는 C6-20 아릴이고,
Z는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 니트로이며,
n은 0 내지 3의 정수이고,
m은 0 또는 1이며,
Rz는 -O-NH2, -NH2, N3, 치환되거나 비치환된 C1-12알킬, C1-12 알키닐, C1-3알콕시, 치환되거나 비치환된 3 내지 20-원 헤테로아릴, 3 내지 20-원 헤테로사이클릴, 치환되거나 비치환된 C5-20아릴, 또는
Figure pat00009
이고,
여기에서, Rz′은 N 또는 CH이며,
여기에서 치환되는 경우, 하나 이상의 수소원자가 각각 독립적으로 OH, =O, 할로, C1-6알킬, C1-6알콕시, C2-6알케닐, 옥시, 카르복시, C1-6알콕시카르보닐, C1-6알킬카르보닐, 포르밀, C3-8아릴, C5-12아릴옥시, C5-12아릴카르보닐 또는 C3-6헤테로아릴로 치환되며;
L은 부존재하거나, 또는
최소 하나의 제1 유닛 및 최소 하나의 제2 유닛을 함유하고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬 또는 C3-8 사이클로알킬이거나, 또는
R1 및 R2는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-8 사이클로알킬 환을 형성하며,
상기 식에서 * 표시는 활성제와 연결되는 부위를 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 당 또는 당산은 모노사카라이드이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 G는 글루쿠론산 모이어티(glucuronic acid moiety) 또는 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이다:
[화학식 I]
Figure pat00010
여기에서,
R3는 수소 또는 카르복실 보호기이고,
각 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 R3는 수소이고, 각 R4는 수소이다.
또한, 상기 R1 및 R2는 각각 수소이다.
또한, 상기 Z는 각각 독립적으로 C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 니트로이다.
또한, 상기 W는 -C(O)-, -C(O)NR'- 또는 -C(O)O-이고, 보다 구체적으로 상기 W는 -C(O)NR'-이며, 여기에서 C(O)가 페닐링과 연결되고, NR'은 L에 결합된다.
또한, 상기 n은 0, 1, 2 또는 3이고, 보다 구체적으로 0, 1 또는 2이며, 보다 더 구체적으로 0이다.
보다 구체적으로, 상기 G는 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이고:
[화학식 I]
Figure pat00011
여기에서,
R3는 수소 또는 카르복실 보호기이고,
각 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이며,
W는 -C(O)NR'-이고, 여기에서 C(O)가 페닐링과 연결되며 NR'은 L에 결합하며, 각 Z는 C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 니트로이며, n은 0이고, m은 1이며, R1 및 R2는 각각 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제1 유닛은 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌이고, 여기에서 알킬렌의 탄소 원자는, N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자로 치환될 수 있으며, 알킬렌은 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 하나 이상의 알킬로 더 치환될 수 있다.
구체적으로, 최소 하나의 제1 유닛은 C1-50 알킬렌 또는 1-50 원자 헤테로알킬렌이고, 하기 중 하나 이상을 만족할 수 있다:
(i) 하나 이상의 불포화 결합을 포함하고;
(ii) 제1 유닛 내의 2 개의 원자가 치환체와 같은 2가 치환체로 치환되고; 이는 헤테로아릴렌(heteroarylene)을 완성시키며
(iii) 제1 유닛은 1 내지 50 원자 헤테로알킬렌이고;
(iv) 상기 알킬렌은 하나 이상의 C1-20 알킬로 치환된다.
또한, 상기 최소 하나의 제1 유닛은 질소 함유 1-50 원자 헤테로알킬렌이고, 링커는 친수성 아미노산의 2 이상의 원자를 포함하며, 상기 질소는 친수성 아미노산의 카르보닐과 펩타이드 결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 제1 유닛은 C2-50 알킬렌, C2-50 헤테로알킬렌, 친수성 아미노산, -C(O)-, -C(O)NR''-, -C(O)O-, -(CH2)s-NHC(O)-(CH2)t-, -(CH2)u-C(O)NH-(CH2)v-, -(CH2)s-NHC(O)-(CH2)t-C(O)-, -(CH2)u-C(O)NH-(CH2)v-C(O)-, -S(O)2NR''-, -P(O)R'''NR''-, -S(O)NR''-, 또는 -PO2NR''- 이고,
여기에서, R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소, C1-8알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 디-C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴 또는 C5-20 아릴이며, s, t, u 및 v는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제1 유닛은 친수성 아미노산(hydrophilic amino acid)이다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 리신, 오르니틴, 프롤린, 세린, 또는 트레오닌일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 수용액에서 중성 pH에서 전하를 갖는 잔기를 갖는 측쇄를 포함하는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 아스파테이트 또는 글루타메이트이다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 오르니틴 또는 리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 아르기닌이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제1 유닛은 -C(O)-, -C(O)NR''-, -C(O)O-, -S(O)2NR''-, -P(O)R'''NR''-, -S(O)NR''-, 또는 -PO2NR''-이고, R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 디-C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴, 또는 C6-20 아릴이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제1 유닛은 -C(O)NR''-, -(CH2)s-NHC(O)-(CH2)t-, -(CH2)u-C(O)NH-(CH2)v-, -(CH2)s-NHC(O)-(CH2)t-C(O)-, 또는 -(CH2)u-C(O)NH-(CH2)v-C(O)-이고, 여기에서, R''은 수소, C1-5 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-5 알콕시, C3-20 헤테로아릴, 또는 C6-20 아릴이며, s, t u 및 v는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제1 유닛은 -C(O)NR'- 이고, R'은 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제2 유닛은 일반식 VIII 또는 일반식 IX로 표시된다:
[일반식 VIII]
-(CH2)r(V(CH2)p)q-
[일반식 IX]
-(CH2CH2X)w-
상기 V는 단일결합, -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2- 또는 -SO2NR25-이고;
X는 -O-, C1-C8 알킬렌 또는 -NR21-이며;
R21 내지 R25는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알킬 C6-20 아릴 또는 C1-6 알킬 C3-20 헤테로아릴이고;
r은 0 내지 10의 정수이며;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 1 내지 20의 정수이며; 및
w는 1 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, q는 4 내지 20일 수 있고, 보다 구체적으로 6 내지 20일 수 있다. 또한, q는 2 내지 12일 수 있고, 보다 구체적으로 2, 5, 또는 11일 수 있다. 또한, r은 2일 수 있다. 또한, p는 2일 수 있다. 또한, V는 -O-일 수 있다.
보다 구체적으로, r은 2이고, p는 2이며, q는 2, 5 또는 11이고, V는 -O-일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, X는 -O-일 수 있다. 또한, w는 6 내지 20의 정수일 수 있다.
보다 구체적으로, X는 -O-이고, w는 6 내지 20일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제2 유닛은 최소 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛이고,
Figure pat00012
또는
Figure pat00013
의 구조를 가지며, 여기서 n은 1 내지 12이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제2 유닛은 1 내지 12 -OCH2CH2-유닛, 또는 3 내지 12 -OCH2CH2-유닛, 또는 5 내지 12 -OCH2CH2-유닛, 또는 6 내지 12 -OCH2CH2-유닛, 또는 3 -OCH2CH2-유닛이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 제2 유닛은 -(CH2CH2X)w-이고,
여기에서 X는 단일 결합, -O-, C1-8 알킬렌, 또는 -NR21-이고;
R21은 수소, C1-6 알킬, C1-6 알킬-C6-20아릴, 또는 C1-6알킬-C3-20 헤테로아릴이며, w는 1 내지 20의 정수이고, 구체적으로는 1, 3, 6, 또는 12이다.
본 발명의 일 양태에서 X는 -O-이고, w는 6 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 링커는 1,3-양극성고리 첨가반응(1,3-dipolar cycloaddition reactions), 헤테로-디엘스 반응(hetero-Diels-Alder reactions), 친핵성 치환(nucleophilic substitution) 반응, 비-알돌형 카르보닐 반응(non-aldol type carbonyl reactions), 탄소-탄소 다중 결합 첨가(addition to carbon-carbon multiple bond), 산화 반응(osidation reactions) 또는 클릭 반응(click reactions)에 의해 형성된 제3 유닛을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 링커는 제3 유닛에 의해 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은 알키닐기 및 아자이드 사이의 반응, 또는 알데하이드 또는 케톤기 및 하이드라진 또는 알콕시아민 사이의 반응에 의해 형성된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 Rz는 -O-NH2, -NH2, N3, -OCH3, -OCH2CH3, -O(CH2)2CH3, 또는
Figure pat00014
일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, Rz는
Figure pat00015
를 포함한다. 또한, 상기 구조에서 알키닐 및 아자이드 사이의 반응, 상세하게는 클릭 반응에 의해 제3 유닛을 형성할 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, Rz는
Figure pat00016
를 포함하고, 상기 구조를 통해 제3 유닛을 형성하며, 제3 유닛은
Figure pat00017
를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은,
Figure pat00018
,
Figure pat00019
,
Figure pat00020
또는
Figure pat00021
을 포함하고,
여기에서,
L1은 단일 결합 또는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이고,
R11은 수소 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬이며, 구체적으로 메틸이고,
L2는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
본 발명의 일 양태에서, L1은 단일 결합, 또는 11개의 탄소원자를 갖는 알킬렌, 또는 12개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은
Figure pat00022
또는
Figure pat00023
을 포함하고,
상기 V는 단일 결합 , -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2-, 또는 -SO2NR25-이며;
R21 내지 R25는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알킬 C6-20 아릴, 또는 C1-6 알킬 C3-20 헤테로아릴이고;
r은 1 내지 10의 정수이며;
p는 0 내지 10의 정수이고;
q는 1 내지 20의 정수이며; 및
L1은 단일결합이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 r은 2 또는 3일 수 있다. 또한, p는 1 또는 2일 수 있다. 또한, q는 1 내지 6일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제3 유닛에서 r은 2 또는 3; p는 1 또는 2; q는 1 내지 6일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 제3 유닛을 더 포함하는 링커는
Figure pat00024
,
Figure pat00025
,
Figure pat00026
또는
Figure pat00027
일 수 있고, 여기에서 물결표시는 Ab와 연결되는 부위, * 표시는 활성제와 연결되는 부위를 나타내며, n은 0 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은
Figure pat00028
또는
Figure pat00029
이다.
본 발명의 일 양태에서, Ab는
Figure pat00030
의 구조를 갖는 최소 하나 이상의 이소프레닐 유닛을 추가로 함유할 수 있으며, 여기에서 n은 최소 2 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 이소프레닐 유닛은 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 기질 또는 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 생성물이다.
본 발명의 일 양태에서, Ab의 이소프레닐 유닛은 티오에테르 결합에 의해 Ab와 공유결합하며, 티오에테르 결합은 Ab의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Ab는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하고, 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Ab는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하고, 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CXX, CXC, XCXC, XXCC, 및 CYYX로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열이고, 여기에서 C는 시스테인을 나타내며; Y는 각 경우 독립적으로 지방족 아미노산을 나타내고; X는 각 경우 독립적으로 글루타민, 글루타메이트, 세린, 시스테인, 메티오닌, 알라닌, 또는 루신을 나타내고; 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고, Y는 각 경우 독립적으로 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌 또는 발린이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CVIM 또는 CVLL 서열이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 10개의 아미노산 중 하나 이상이 글리신, 아르기닌, 아스파르트산 및 세린으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 7개의 아미노산 중 적어도 하나는 글리신이다. 또는, 아미노산 모티프에 선행하는 7개의 아미노산 중 3개 이상이 글리신, 아르기닌, 아스파르트산 및 세린으로부터 각각 독립적으로 선택된다. 또는, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 10개의 아미노산이 글리신, 구체적으로는 아미노산 모티프에 선행하는 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산은 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, Ab는 GGGGGGGCVIM의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, L은 Ab에 공유 결합가능한 하나 이상의 분지형 링커를 포함하고,
i) 각각의 분지형 링커는 주링커(PL)에 의해 Ab에 공유 결합가능한 제1 유닛 또는 제3 유닛을 포함하고;
ii) 각각의 분지형 링커는 제 1 활성제를 제1 유닛에 결합시키고, 제2 링커 (SL) 및 절단기(CG)를 포함하는 제1 분지(B1)를 포함하며; 및
iii) 각각의 분지형 링커는 a) 제 2 활성제가 제2 링커 (SL) 및 절단기 (CG)에 의해 제1 유닛에 공유 결합 된 제2 분지 (B2); 또는 b) 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 제1 유닛에 공유 결합되어 있는 제2 분지를 포함하고,
상기 각각의 절단기는 항원 특이적 결합 모이어티-활성제 접합체로부터 활성제를 방출하기 위해 가수분해되는 것일 수 있다.
또한, 주링커(PL)는 Ab 또는 Ab의 일부구조에 직접 결합될 수 있는 말단기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 분지형 링커는
Figure pat00031
,
Figure pat00032
,
Figure pat00033
또는
Figure pat00034
이고,
상기 L2, L3, L4 는 각각 독립적으로 직접 결합 또는 -CnH2n-이며, 상기 n은 1 내지 30의 정수이고,
상기 G1, G2, G3은 독립적으로 직접 결합,
Figure pat00035
,
Figure pat00036
,
Figure pat00037
또는
Figure pat00038
이며,
상기 R30은 수소 또는 C1-30 알킬이고,
R40은 직접 결합 또는 C1-10 알킬이다.
보다 구체적으로, 분지형 링커는
Figure pat00039
를 포함하고,
상기 B 및 B'는 동일하거나 상이할 수 있는 활성제를 나타내거나
상기 B 및 B' 중 하나는 활성제이고, 나머지 하나는 톡신(toxin)이고;
n은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내며;
f는 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내고; 및
L은 Ab에 결합 가능한 말단기를 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 n은 1 내지 20의 정수, 보다 구체적으로 1 내지 10의 정수, 또는 4 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 식에서 L은 옥심을 포함하고, 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛은 옥심을 활성제에 공유 결합시킨다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 절단기는 표적 세포 내에서 절단될 수 있고, 하나 이상의 활성제를 방출시킬 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, Ab에 공유 결합가능한 하나 이상의 분지형 링커를 포함하며; 및 분지형 링커에 공유 결합 된 2개 이상의 활성제를 포함한다.
구체적으로, 1개의 분지형 링커는 Ab와 결합되는 것일 수 있다.
또한, 2 이상의 분지형 링커가 Ab와 결합되고, 각각의 분지형 링커가 2개 이상의 활성제와 결합하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 3개의 분지형 링커가 Ab와 결합되는 것일 수 있다. 또는 4개의 분지형 링커가 Ab와 결합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 각각의 분지형 링커는 2개 이상의 동일 또는 상이한 활성제와 결합될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 각각의 활성제는 절단 가능한 결합에 의해 분지형 링커에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 각각의 분지형 링커는 분지형 유닛을 포함하고, 각각의 활성제는 2차 링커를 통해 분지형 유닛에 결합하고, 상기 분지형 유닛 1차 링커에 의해 Ab에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 분지형 유닛은 질소 원자일 수 있다. 또는, 상기 분지형 유닛은 아미드이고, 1차 링커 또는 2차 링커는 아미드의 카르보닐을 포함할 수 있다. 또는, 상기 분지형 유닛은 라이신 유닛일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서, 링커는,
(a) 하나 이상의 제1 유닛; (b) 하나 이상의 제2 유닛; 및 (c) 하나 이상의 제4 유닛을 함유하는 것일 수 있다.
여기에서 제2 유닛은 제4 유닛과 제1 유닛을 연결하고,
여기에서 하나 이상의 제4 유닛은 하나 이상의 활성제를 방출할 수 있으며,
여기에서 제1 유닛은 제2 유닛과 제4 유닛, 또는 제2 유닛을 또 다른 제2 유닛과 연결하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태에서, 링커는 제3 유닛을 더 함유할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 제4 유닛은 다음 일반식 IIb의 구조를 갖는다:
[일반식 IIb]
Figure pat00040
상기 식에서,
G는 당(sugar), 당산(sugar acid), 또는 당 유도체(sugar derivatives)이고,
W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -S(O)2NR'-, -P(O)R''NR'-, -S(O)NR'-, 또는 -PO2NR'-이고,
C(O), S, 또는 P가 페닐환과 바로 연결되는 경우, R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 디-C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴, 또는 C6-20 아릴이며, W는 제2 유닛 또는 제1 유닛과 연결되고,
각 Z는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 니트로이고,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬 또는 C3-8 사이클로알킬이거나, 또는
R1 및 R2는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-8 사이클로알킬링을 형성한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 당 또는 당산은 모노사카라이드이다.
본 발명의 일 양태에서, G는 하기 화학식 I 구조의 화합물이다:
[화학식 I]
Figure pat00041
여기에서,
R3는 수소 또는 카르복실 보호기이고,
각 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이다.
본 발명의 일 양태에서, R3는 수소이고, 각 R4는 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, W는 -C(O)NR'-이고, 여기에서 C(O)가 페닐환과 연결되며, NR'은 제2 유닛과 연결된다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, R1 및 R2는 각각 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, 제2 유닛은 -(CH2)r(V(CH2)p)q-, -((CH2)pV)q-, -(CH2)r(V(CH2)p)qY-, -((CH2)pV)q(CH2)r-, -Y((CH2)pV)q- 또는 -(CH2)r(V(CH2)p)qYCH2-로 나타내지며,
여기에서,
r은 0 내지 10의 정수이고;
p는 1 내지 10의 정수이며;
q는 1 내지 20의 정수이고,
V 및 Y는 각각 독립적으로 단일결합, -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2-, 또는 -SO2NR25-이고,
R21 내지 R25는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알킬-C6-20 아릴 또는 C1-6 알킬-C3-20 헤테로아릴이다.
본 발명의 일 양태에서, r은 2이다.
본 발명의 일 양태에서, p는 2이다.
본 발명의 일 양태에서, q는 6 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, q는 2, 5, 또는 11이다.
본 발명의 일 양태에서, V 및 Y는 각각 독립적으로 -O-이다.
본 발명의 일 양태에서, 분지형 링커는,
Figure pat00042
,
Figure pat00043
,
Figure pat00044
,
Figure pat00045
,
Figure pat00046
,
Figure pat00047
또는
Figure pat00048
를 포함하고,
여기에서,
L1, L2, 및 L3는 각각 독립적으로 직접 결합(direct bond) 또는 -CnH2n- 이고,
여기에서 n은 1 내지 30의 정수이며,
여기에서,
G1, G2, G3는 각각 독립적으로 직접 결합,
Figure pat00049
,
Figure pat00050
,
Figure pat00051
또는
Figure pat00052
이고,
여기에서 R3는 수소 또는 C1-30알킬이며,
여기에서 R4는 수소 또는 -L4-COOR5이고, 여기에서 L4는 직접 결합 또는 -CnH2n- 이고 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이며, R5는 수소 또는 C1-30 알킬이다.
본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은
Figure pat00053
,
Figure pat00054
,
Figure pat00055
또는
Figure pat00056
을 포함하고,
여기에서 L1은 직접 결합 또는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이고,
R11은 수소 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬이며, 구체적으로 메틸이고,
L2는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이고,
여기에서 제3 유닛은 제2 유닛과 Ab를 연결한다.
본 발명의 일 양태에서, L1은 12개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
본 발명의 일 양태에서, R11은 메틸이다.
본 발명의 일 양태에서, L2는 11개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은
Figure pat00057
또는
Figure pat00058
이다.
본 발명의 일 양태에서, 제3 유닛은 티오에테르 결합에 의해 Ab와 공유결합하며, 티오에테르 결합은 Ab의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Ab는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하고, 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CXX, CXC, XCXC, XXCC, 및 CYYX로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열이고, 여기에서 C는 시스테인을 나타내며; Y는 각 경우 독립적으로 지방족 아미노산을 나타내고; X는 각 경우 독립적으로 글루타민, 글루타메이트, 세린, 시스테인, 메티오닌, 알라닌, 또는 루신을 나타내고; 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고, Y는 각 경우 독립적으로 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌 또는 발린이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CVIM 또는 CVLL 서열이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 7개의 아미노산 중 적어도 하나는 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 7개의 아미노산 중 3개 이상이 글리신, 아르기닌, 아스파르트산 및 세린으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 10개의 아미노산이 글리신, 구체적으로는 아미노산 모티프에 선행하는 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산은 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, Ab는 GGGGGGGCVIM의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, L은 Ab에 공유 결합가능한 하나 이상의 분지형 링커를 포함하고,
i) 각각의 분지형 링커는 제1 링커(PL)에 의해 Ab에 공유 결합가능한 제5 유닛을 포함하고;
ii) 각각의 분지형 링커는 제1 활성제가 제2 링커 (SL) 및 절단 그룹(CG)에 의해 제5 유닛에 공유 결합된 제1 분지(B1)를 포함하며; 및
iii) 각각의 분지형 링커는 a) 제2 활성제가 제2 링커 (SL) 및 절단 그룹(CG)에 의해 제5 유닛에 공유 결합된 제2 분지 (B2); 또는 b) 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 제5 유닛에 공유 결합된 있는 제2 분지(B2)를 더 포함하고,
상기 각각의 절단 그룹은 항체 구조물-활성제 접합체부터 활성제를 방출하기 위해 가수분해되는 것일 수 있다.
또한, 제1 링커(PL)는 Ab 또는 Ab의 일부구조에 직접 결합될 수 있는 말단기를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, i) 분지된 링커는 제1 링커(PL)에 의해 반응성 모이어티에 공유 결합된 제5 유닛(BR)을 포함하고;
ii) 제5 유닛은 제1 분지(B1)에 공유 결합되고, 제2 링커(SL) 및 절단 그룹(CG)에 공유 결합된 제1 활성제를 포함하며;
iii) 제5 유닛은 제2 분지(B2)와 공유 결합되고, a) 제2 링커(SL) 및 절단 그룹(CG)과 공유 결합된 제2 활성제 또는 b) 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하며, 여기에서 각 절단 그룹은 가수분해되어 활성제를 방출시킬 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 절단 그룹은 상기 화학식 II와 같다.
본 발명에서, 제2링커(예를 들어, 활성제를 제5 유닛과 연결하는 것)은 1,3-쌍극 부가환화 반응(1,3-dipolar cycloaddition reaction), 헤테로-디엘스-엘더 반응(hetero-Diels-Alder reaction), 친핵성 치환 반응(nucleophilic substitution reaction), 비-알돌형 카보닐 반응(non-aldol type carbonyl reaction), 탄소-탄소 다중 결합에의 첨가(addition to a carbon-carbon multiple bond), 산화 반응(oxidation reaction) 또는 클릭 반응(click reaction)에 의하여 형성된 제1 유닛 또는 제3 유닛을 포함할 수 있다. 여기에서, 제1 유닛 또는 제3 유닛은 상기와 같이 아세틸렌과 아자이드와의 반응, 또는 비-알돌형 카보닐 반응, 예컨대 알데하이드 또는 케톤 그룹과 하이드라진 또는 알콕시아민과의 반응으로 형성될 수 있으며, 이는 활성제 및/또는 절단 그룹과 제1 유닛을 마일드 커플링(mild coupling)하도록 해준다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제5 유닛은
Figure pat00059
,
Figure pat00060
,
Figure pat00061
,
Figure pat00062
,
Figure pat00063
또는
Figure pat00064
이고,
상기 L2, L3, L4 는 각각 독립적으로 직접 결합 또는 -CnH2n-이며, 상기 n은 1 내지 30의 정수이고,
상기 G1, G2, G3은 독립적으로 직접 결합,
Figure pat00065
,
Figure pat00066
,
Figure pat00067
또는
Figure pat00068
이며,
상기 R30은 수소 또는 C1-30 알킬이고,
상기 R40은 수소, C1-10 알킬 또는 -L5-COOR50이며, 여기에서 L5는 직접 결합 또는 -CnH2n-이고,
여기에서 n은 1 내지 10의 정수이고, R50은 수소 또는 C1-30 알킬이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 제5 유닛을 포함하는 분지형 링커는
Figure pat00069
를 포함하고,
상기 B 및 B'는 동일하거나 상이할 수 있는 활성제를 나타내거나
상기 B 및 B' 중 하나는 활성제이고, 나머지 하나는 톡신(toxin)이고;
n은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내며;
f는 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내고; 및
L은 Ab에 대해 결합가능한 말단기를 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 L은 적어도 하나의 제5 유닛 및 제1 링커(PL)을 포함하는 링커이다.
본 발명의 일 양태에서, 항체-약물 접합체의 제1 링커는 1 내지 100개, 바람직하게는 1 내지 50개의 탄소원자를 갖는 알킬렌을 포함하고, 또는:
알킬렌은 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하고;
알킬렌은 적어도 하나의 헤테로아릴렌을 포함하며;
알킬렌의 탄소원자는 질소(N), 산소(O), 및 황(S)으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자에 의해 대체되고; 또는
알킬렌은 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 하나 이상의 알킬로 더욱 치환된다.
본 발명의 일 양태에서, 항체-활성제의 분지형 링커는 수용액 중의 중성 pH에서 전하를 갖는 모이어티를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산, 바람직하게는 아르기닌, 아스파테이트, 글루타메이트, 리신 또는 오르니틴을 포함한다. 아미노산은 분지된 링커의 어느 곳에도 위치될 수 있다. 예를 들면, 분지형 링커의 옥심을 분지형 링커의 폴리에틸렌 글리콜 유닛에 공유 결합시킬 수 있다. 택일적으로 또는 부가적으로, 이러한 아미노산은 제2 링커에, 임의로 각각의 제2 링커 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제5 유닛을 포함하는 분지형 링커는
Figure pat00070
일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 활성제는 각각 독립적으로 화학요법제, 면역조절요법제 및 톡신으로부터 선택된다.
또한, 활성제는 면역 조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항기생충제 또는 이들의 조합일 수 있고, 하기 나열된 활성제 중 선택적으로 사용할 수 있다:
(a) 엘로티닙(erlotinib), 보르테조밉(bortezomib), 풀베스트란트(fulvestrant), 수텐트(sutent), 레트로졸(letrozole), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 루코보린(leucovorin), 라파마이신(rapamycin), 라파티닙(lapatinib), 로나파르닙(lonafarnib), 소라페닙(sorafenib), 제피티닙(gefitinib), AG1478, AG1571, 티오테파(thiotepa), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan), 피포술판(piposulfan), 벤조도파(benzodopa), 카르보콘(carboquone), 메츄도파(meturedopa), 유레도파(uredopa), 에틸렌이민(ethylenimine), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethiylenethiophosphoramide), 트리메틸롤로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신(bullatacin), 불라타시논(bullatacinone), 캄토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), CC-1065, 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin), 비젤레신(bizelesin), 크립토피신 1(cryptophycin 1), 크립토피신 8(cryptophycin 8), 돌라스타틴(dolastatin), 듀오카마이신(duocarmycin), KW-2189, CB1-TM1, 엘루테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕티인(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard), 카르무스틴(carmustine), 클로로코토신(chlorozotocin), 포테쿠스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimnustine), 칼리키아미신(calicheamicin), 칼리키아미신 감마 1(calicheamicin gamma 1), 칼리키아미신 오메가 1(calicheamicin omega 1), 디네미신(dynemicin), 디네미신 A(dynemicin A), 클로드로네이트(clodronate), 에스페르아미신(esperamicin), 네오카르지노스타틴크로모포어(neocarzinostatin chromophore), 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 안트르마이신(antrmycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르니노마이신(carninomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루부신(detorubucin), 6-디아조-5-옥소-L-노르루신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피롤리노-독소루비신(2-pyrrolino-doxorubucin), 리포소말 독소루비신(liposomal doxorubicin), 데옥시독소루비신(deoxydoxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토미그린(streptomigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 5-플루오로우라신(5-fluorouracil), 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티구아닌(thiguanine), 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자유리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시유리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone), 프로피오네이트(propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스테인(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토테인(mitotane), 트릴로스테인(trilostane), 폴린산(folinic acid), 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드 글리코사이드(aldophosphamide glycoside), 아미노레불린산(aminolevulinic acid), 에닐우라실(eniluracil), 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 엘립티니움 아세테이트(elliptinium acetate), 에토글루시드(etoglucid), 갈리움 나이트레이트(gallium nitrate), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 렌티난(lentinan), 로니다이닌(lonidainine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocins), 미토구아존(mitoguazone), 미토잔트론(mitoxantrone), 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피라루비신(pirarubicin), 로소잔트론(losoxantrone), 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide), 프로카르바진(procarbazine), 폴리사카라이드-k(polysaccharidek), 라족세인(razoxane), 리조신(rhizoxin), 시조피란(sizofiran), 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민(2,2',2''-trichlorotriethylamine), T-2 톡신, 베라큐린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A), 안구이딘(anguidine), 우레탄(urethane), 빈데신(vindesine), 다카르바진(dacarbazine), 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨(mitobronitol), 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 아라비노사이드(arabinoside), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 티오테파(thiotepa), 파클리탁셀(paclitaxel), 파클리탁셀, 파클리탁셀의 알부민-엔지니어드 나노파티클(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel), 도세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈, 6-티오구아닌, 머캅토퓨린, 시스플라틴, 카보플라틴(carboplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 플래티늄(platinum), 에토포사이드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 미톡산트론(mitoxantrone), 빈크리스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 노반트론(novantrone), 테니포사이드(teniposide), 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신(daunomycin), 아미노프테린(aminopterin), 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), CPT-11, 토포이소머라아제 저해제 RFS 2000, 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine), 레티노산(retinoic acid), 카페시타빈(capecitabine), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 산;
(b) 모노카인(monokine), 림포카인(lympokine), 폴리펩타이드 호르몬(traditional polypeptide hormone), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 티록신(thyroxine), 릴렉신(relaxin), 프로릴렉신(prorelaxin), 당단백 호르몬(glycoprotein hormone), 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone), 갑상샘자극호르몬(thyroid stimulating hormone), 황체형성호르몬(luteinizing hormone), 간 성장인자 섬유모세포성장인자(hepatic growth factor fibroblast growth factor), 프롤락틴(prolactin), 태반성 락토젠(placental lactogen), 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 종양괴사인자-α, 종양괴사인자-β, 뮐러관 억제물질(mullerian inhibiting substance), 마우스 고나도트로핀-연관 펩타이드(mouse gonadotropin associated peptide), 인히빈(inhibin), 액티빈(activin), 혈관내피증식인자(vascular endothelial growth factor), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 골유도 인자(osteoinductive factor), 인터페론, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 콜로니자극인자(colony stimulating factor, CSF), 마크로파지-CSF, 과립구-마크로파지-CSF(granulocyte-macrophage-CSF), 과립구-CSF, 인터루킨(IL), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 폴리펩타이드 인자, LIF, 키트 리간드(kit ligand), 또는 이들의 배합물;
(c) 디프테리아 톡신, 보툴리눔 톡신, 테타누스 톡신, 디센터리 톡신, 콜레라 톡신, 아마니틴, α-아마니틴, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 유도체, 인돌리노벤조디아제핀, 피리디노벤조디아제핀, 테트로도톡신, 브레베톡신(brevetoxin), 시구아톡신(ciguatoxin), 리신(ricin), AM 톡신, 오리스타틴(auristatin), 투불리신(tubulysin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아마이신(calicheamycin), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), SG2285, 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 유사체(dolastatin analog), 오리스타틴(auristatin), 크립토피신(cryptophycin), 캄토테신(camptothecin), 리족신(rhizoxin), 리족신 유도체(rhizoxin derivatives), CC-1065, CC-1065 유사체 또는 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin), 에네다인 항생제(enediyne antibiotic), 에스페라마이신(esperamicin), 에포틸론(epothilone), 톡소이드(toxoid), 또는 이들의 배합물;
(d) 친화성 리간드(affinity ligand), 여기에서 친화성 리간드는 기질, 저해제, 활성화제, 신경전달물질, 방사성 동위원소, 또는 이들의 배합물;
(e) 방사능표지(radioactive label), 32P, 35S, 형광다이, 전자밀도 반응제(electron dense reagent), 효소, 비오틴, 스트렙타비딘(streptavidin), 디옥시제닌(dioxigenin), 햅텐(hapten), 면역성 단백질(immunogenic protein), 타겟에 컴플러멘터리한 서열을 갖는 핵산 분자(nucleic acid molecule with a sequence complementary to a target) 또는 이들의 배합물;
(f) 카이네이즈 억제제(kinase inhibitor), 성장인자 억제제(growth factor inhibitor, 예컨대 EGFR, PDGF 또는 VEGF 억제제), 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitors), CRAC 억제제, PARP1 길항제(antagonist), PPARγ 작용제(agonist), Kv1.3 길항제, PP2A 작용제, MYD88 억제제, BCL-2 억제제, 아데노신 A2A 수용체(Adenosine A2A receptor (A2ar)) 작용제, TLR 작용제, TLR7/8 작용제, TLR4 작용제, TLR9 작용제, Kca3.1(calcium-activated potassium channel) 작용제, TGF-R1 억제제, TGF-R2 억제제, GLI1 억제제, TNKS 길항제, TNIK 길항제, 이미드(imide), VDR(vitamin D receptor) 길항제, STING 작용제 및 IDO1(Indoleamine 2,3-dioxygenase1) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역조절 화합물(immunomodulatory compound), 항-암제(anticancer agent), 항-바이러스제(anti-viral agent), 항-박테리아제(anti-bacterial agent), 항-곰팡이제(anti-fungal agent), 및 항-기생충제(anti-parasitic agent), 또는 이들의 배합물;
(g) 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 또는 토레미펜(toremifene);
(h) 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 메제스톨 아세테이트(megestrol acetate), 엑스메스탄(exemestane), 레트로졸(letrozole)Ehsms 아나스트로졸(anastrozole)
(i) 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 리우프롤라이드(leuprolide), 고세렐린(goserelin), 또는 트록사시타빈(troxacitabine);
(j) 아로마타아제 저해제;
(k) 단백질 키나아제 저해제;
(l) 리피드 키나아제 저해제;
(m) 안티센스 올리고뉴클레오티드;
(n) 리보자임;
(o) 백신; 및
(p) 항-맥관형성제(anti-angiogenic agent)
본 발명의 일 양태에서, 활성제는
Figure pat00071
,
Figure pat00072
,
Figure pat00073
,
Figure pat00074
,
Figure pat00075
,
Figure pat00076
,
Figure pat00077
,
Figure pat00078
,
Figure pat00079
,
Figure pat00080
,
Figure pat00081
,
Figure pat00082
,
Figure pat00083
,
Figure pat00084
,
Figure pat00085
, 또는
Figure pat00086
이고,
여기에서 y는 1 내지 10의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 활성제로 피롤로벤조디아제핀 이량체 전구체가 제공된다. 본 발명에 따른 전구체 형태로 투여하는 경우, 혈중 노출 시 추가적인 반응에 의해 유효한 약물로 전환되어야 할 필요가 있기 때문에 예상치 못한 링커의 분해 시에 생길 수 있는 부작용의 발생가능성을 미연에 방지할 수 있고, 정상세포에 대한 독성이 감소하며, 약물이 보다 안정적이라는 점에서 기존 PBD 약물에 비해 유리한 점이 있다.
본 발명의 일 양태에서, X는
Figure pat00087
,
Figure pat00088
,
Figure pat00089
,
Figure pat00090
,
Figure pat00091
,
Figure pat00092
,
Figure pat00093
,
Figure pat00094
,
Figure pat00095
,
Figure pat00096
,
Figure pat00097
,
Figure pat00098
,
Figure pat00099
,
Figure pat00100
,
Figure pat00101
,
Figure pat00102
,
Figure pat00103
,
Figure pat00104
,
Figure pat00105
,
Figure pat00106
,
Figure pat00107
,
Figure pat00108
,
Figure pat00109
,
Figure pat00110
,
Figure pat00111
및
Figure pat00112
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 접합체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 상기 기재된 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암을 치료하기 위한 유효량의 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 갖는 대상체에서의 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 1종 이상의 치료적 공동-작용제(therapeutic co-agent); 및 약학적으로 허용되는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 치료적 공동-작용제는 암에 대한 예방, 개선 또는 치료효과를 나타내는 작용제, 또는 암 치료제 투약 시 나타나는 부작용의 발현을 감소시킬 수 있는 작용제, 또는 면역력 증진 효과를 나타내는 작용제 등일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니고, 활성제와 함께 배합제의 형태로 적용하였을 때 치료적으로 유용한 효과를 나타내고/거나, 활성제의 안정성을 보다 향상시키고/거나, 활성제 투여 시 나타날 수 있는 부작용을 감소시키고/거나, 면역력의 증진을 통해 치료효과를 극대화할 수 있는 효과를 나타내는 제제라면 어떤 것이든 배합하여 적용할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 혈액암, 폐암, 비소세포성 폐암, 위장관암, 대장암, 결장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 피부암, 방광암, 췌장암, 신경모세포종, 상피편평세포암, 갑상선암, 두경부암, 부신암, 구강암, 골수종, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 육종 및 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 활성제가 치료효과를 나타낼 수 있는 암종이라면 모두 적용이 가능하다.
[정의]
본 명세서에서는 또한 하기 정의가 적용된다:
본 명세서에서 "접합체(conjugate)"는 세포독성 화합물의 하나 이상의 분자에 공유결합되는 세포 결합제를 말한다. 여기서, "세포 결합제"는 생물학적 타깃에 대한 친화도를 갖는 분자로서, 예를 들어 리간드, 단백질, 항체, 구체적으로 모노클로날 항체, 단백질 또는 항체 단편, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 올리고사카라이드일 수 있으며, 결합제는 생물학적 활성 화합물을 생물학적 타깃으로 유도하는 기능을 한다. 본 발명의 일 양태에서, 접합체는 세포 표면 항원을 통해 암 세포를 표적화하도록 설계될 수 있다. 항원은 비정상적인 세포 타입에서 과다 발현되거나 또는 발현되는 세포 표면 항원일 수 있다. 구체적으로, 표적 항원은 증식성 세포(예컨대 암 세포) 상에서만 발현되는 것일 수 있다. 표적 항원은 통상 증식성 조직 및 정상 조직 사이의 상이한 발현에 기초하여 선택될 수 있다.
본 명세서에서, "항체(antibody)"는 ROR1 및 B7-H3 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 항-ROR1 항체, 항-B7-H3 항체, 또는 ROR1 및 B7-H3 단백질에 모두 결합하는 이중특이적 항체 (이중항체)를 의미한다. 본 발명의 범위에는 ROR1 및 B7-H3 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐만 아니라, 완전한 항체의 일부, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편 및 이들의 조합도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 상기 항체들의 에피토프-결합 단편, 상기 항체들의 일부 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 발명에서 사용된 항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 프레임워크 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"프레임워크(FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체로, 항체 단편이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)에서 VH 및 VL 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 ROR1 및 B7-H3 단백질 각각을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
이중특이적 항체는 하나 이상의 타겟에 결합능 또는 길항능을 가지는 항체를 의미하며, 2개의 서로 다른 타겟에 대한 결합능 또는 길항능을 가지는 항체가 결합된 형태 또는 한 타겟에 대한 결합능을 가지는 항체와 다른 타겟에 대한 길항능을 가지는 물질이 결합되어 있는 항체를 의미한다.
다중특이적 항체는 적어도 3 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. 다중특이적(multi-specific) 항체는 삼중특이적(Tri-specific) 이상의 항체, 예를 들어 삼중특이적(Tri-specific) 항체, 사중특이적(Tetra-specific) 항체 또는 그 이상의 타겟을 표적하는 항체를 포함할 수 있다.
이중특이적 또는 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우 두 개 이상의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 가능성이 있다. 또한 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 이론적으로 동일한 시간 및 공간에서의 두 개 이상의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다. 다만 단독항체를 이중항체로 제조시 위와 같은 이론적인 효과가 실제로 나타날지, 예상치 못한 부작용이 없는지, 그리고 단독항체의 조합과 대비하여 상승적 효과나 불리한 효과가 나타날지 여부는 실제로 제조하여 보기 전에는 쉽게 예측할 수 없다.
이중특이적 또는 다중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개 이상의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개 이상의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 heterodimeric 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 tendem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.
Fab을 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 수득할 수 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 constant 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조할 수 있다.
매우 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들면, 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 항체로 개발될 수 있다. 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 항체는 각각 2개 이상의 결합 도메인, 3개 이상의 결합 도메인 또는 4개 이상의 결합 도메인이 항체 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 이중 특이적 항체는 IgG 완전한 항체 또는 이의 단편 형태 예를 들어 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2의 형태로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "치료제"는 암 세포 또는 활성화된 면역 세포에 세포독성, 세포증식억제 및/또는 면역조절 효과를 행사하는 작용제이다. 치료제의 예는 세포독성제, 화학요법제, 세포증식억제제 및 면역조절제를 포함한다.
본 명세서에서 "화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다.
본 명세서에서 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물, 특히 포유동물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 인간 대상체를 들 수 있으며, 예컨대 본 명세서에 기재된 장애, 보다 구체적으로는 암을 갖는 인간 환자 또는 정상 대상체를 포함하는 개념이다. "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 비-포유동물(예를 들어, 닭, 양서류, 파충류) 및 포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 가축 및/또는 농업에 유용한 동물(예를 들어, 양, 개, 고양이, 소, 돼지 등) 및 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그 등)를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 환자이다.
본 명세서에서 "치료" 또는 "치료한다"는 치료적 처치 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 질환을 갖는 대상체, 및 질환을 갖기 쉬운 대상체 또는 질환이 예방되어야 할 대상체를 포함한다. 따라서, 질환 또는 치료를 필요로 하는 대상체에 관하여 사용되는 경우, 상기 용어는 미처리 대상체에 비하여, 질환 진행의 저지 또는 둔화, 증상의 예방, 질환 및/또는 증상 중증도의 감소 또는 질환 기간의 감소를 포함하나 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에서, "투여" 또는 "투여하는"은 요망되는 효과를 달성하기 위하여 임의의 적절한 경로에 의해 화합물 또는 화합물들을 제공하고/거나 접촉시키고/거나 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 경구, 설하, 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내 또는 두개내 주사), 경피, 국소, 협측, 직장, 질, 비강, 안과적, 흡입 및 이식물을 통한 투여를 포함할 수 있지만, 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 "비치환되거나 치환된"은 비치환될 수 있거나 또는 치환될 수 있는 모기(parent group)를, "치환된"은 1 이상의 치환기를 갖는 모기(parent group)를, 치환기는 모기(parent group)에 공유결합되거나 모기(parent group)에 융합된 화학적 부분을 의미한다.
본 명세서에서 "할로"는 플루오린, 클로라인, 브로마인, 요오드 등을 말한다.
본 명세서에서 "알킬"은 지방족 또는 지환족, 포화 또는 불포화(불포화, 완전 불포화) 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분으로서, 포화 알킬의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 등을, 포화 직쇄형 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸(아밀), n-헥실, n-헵틸 등, 포화 분지쇄형 알킬의 예로는 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 "알콕시"는 -OR[여기서, R은 알킬기]을 의미하며, 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 "아릴"은 고리 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분을 의미한다.
본 명세서에서 "알케닐"은 1 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬로서, 불포화 알케닐기의 예로는 에테닐(비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐(-CH=CH-CH3), 2-프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 "알키닐"은 1 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬기로서, 불포화 알키닐기의 예는 에티닐 및 2-프로피닐 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 "카르복시"는 -C(=O)OH를 말한다.
본 명세서에서 "포르밀"은 -C(=O)H를 말한다.
본 명세서에서 "아릴"은 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 모이어티에 관한 것이다. 예를 들어 "C5-7아릴"은 모이어티가 5 내지 7 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 모이어티를 의미하고,"C5-10아릴"은 모이어티가 5 내지 10 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 모이어티를 의미한다. 여기에서 접두사(C5-7, C5-10 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이 고리원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어 "C5-6아릴"은 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는 아릴기에 관한 것이다. 여기에서, 고리 원자는 "카르보아릴기"에서와 같이 모두 탄소 원자일 수 있다. 카르보아릴기의 예는 벤젠, 나프탈렌, 아줄렌, 안트라센, 페난트렌, 나프타센 및 피렌으로부터 유도된 것들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 적어도 하나가 방향족 고리인 융합 고리를 포함하는 아릴기의 예는 인단, 인덴, 이소인덴, 테트랄린, 아세나프텐, 플루오렌, 페날렌, 아세페난트렌 및 아세안트렌으로부터 유도된 기를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 또는, 고리 원자는 "헤테로아릴기"에서와 같이 하나 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "헤테로아릴"은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 아릴로서, 예로는 피리딘, 피리미딘, 벤조티오펜, 푸릴, 디옥살라닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐 등, 보다 구체적으로 벤조푸란, 이소벤조푸란, 인돌, 이소인돌, 인돌리진, 인돌린, 이소인돌린, 푸린(아데닌 또는 구아닌), 벤즈이미다졸, 인다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈이속사졸, 벤조디옥솔, 벤조푸란, 벤조트리아졸, 벤조티오푸란, 벤조티아졸, 벤조티아디아졸로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C9, 크로멘, 이소크로멘, 크로만, 이소크로만, 벤조디옥산, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴놀리진, 벤족사진, 벤조디아진, 피리도피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 프테리딘으로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C10, 벤조디아제핀으로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C11, 카르바졸, 디벤조푸란, 디벤조티오펜, 카르볼린, 페리미딘, 피리도인돌로부터 유도된 3개의 융합고리를 갖는 C13, 아크리딘, 크산텐, 티오크산텐, 옥산트렌, 페녹사티인, 페나진, 페녹사진, 페노티아진, 티안트렌, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진으로부터 유도된 3개의 융합고리를 갖는 C14를 들 수 있다.
본 명세서에서, "사이클로알킬"은 시클릴기인 알킬기이고, 고리(cyclic) 탄화수소 화합물의 지환족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 사이클로알킬기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다:
포화 단일고리 탄화수소 화합물: 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 사이클로헵탄, 메틸사이클로프로판, 디메틸사이클로프로판, 메틸사이클로부탄, 디메틸사이클로부탄, 메틸사이클로펜탄, 디메틸사이클로펜탄 및 메틸사이클로헥산;
불포화 단일고리 탄화수소 화합물: 사이클로프로펜, 사이클로부텐, 사이클로펜텐, 사이클로헥센, 메틸사이클로프로펜, 디메틸사이클로프로펜, 메틸사이클로부텐, 디메틸사이클로부텐, 메틸사이클로펜텐, 디메틸사이클로펜텐 및 메틸사이클로헥센; 및
포화 헤테로사이클릭 탄화수소 화합물: 노르카란, 노르피난, 노르보르난.
본 명세서에서, "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 화합물의 고리원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다.
본 명세서에서 접두사(예를 들어 C1-12, C3-8 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어 본 명세서에서 "C3-6헤테로사이클릴"은 3 내지 6개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릴기에 관한 것이다.
단일고리 헤테로사이클릴기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다:
N1: 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피롤린, 2H- 또는 3H-피롤, 피페리딘, 디하이드로피리딘, 테트라하이드로피리딘, 아제핀;
N2: 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 이미다졸린, 피라졸린, 피페라진;
O1: 옥시란, 옥세탄, 옥솔란, 옥솔, 옥산, 디하이드로피란, 피란, 옥세핀;
O2: 디옥솔란, 디옥산 및 디옥세판;
O3: 트리옥산;
N1O1: 테트라하이드로옥사졸, 디하이드로옥사졸, 테트라하이드로이속사졸, 디하이드로이속사졸, 모르폴린, 테트라하이드로옥사진, 디하이드로옥사진, 옥사진
S1: 티이란, 티에탄, 티올란, 티안, 티에판;
N1S1: 티아졸린, 티아졸리딘, 티오모르폴린;
N2O1: 옥사디아진;
O1S1: 옥사티올, 옥사티안; 및
N1O1S1: 옥사티아진.
본 명세서에서 "전구체(prodrug)"는 생체내 생리학적 조건 하(예를 들어 효소 산화(enzymatic oxidation), 환원(reduction) 및/또는 가수분해 등)에서 효소, 위산의 작용에 의해 피롤로벤조다이아제핀 약물로 직접적으로 또는 간접적으로 변환할 수 있는 화합물을 말한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용되는 염"으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 사용할 수 있고, 상기 유리산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있다.
상기 유기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
예컨대, 화합물이 음이온이거나 또는 음이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -COOH는 -COO-일 수 있음), 적절한 양이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 양이온의 예는 알칼리 금속 이온, 예컨대 Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+ 및 다른 양이온, 예컨대 Al3+을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예컨대 NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 하기로부터 유도된 것들이다: 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민 뿐 아니라, 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
화합물이 양이온이거나 또는 양이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -NH2는 -NH3 +일 수 있음), 적절한 음이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 음이온의 예는 하기 무기 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산 등을 예로 들 수 있다.
적절한 유기 음이온의 예는 하기 유기산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다: 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캠퍼설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루쳅톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 히드록시말레산, 히드록시나프탈렌 카르복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 점액산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산 및 발레르산 등을 예로 들 수 있다. 적절한 중합체 유기 음이온의 예는 하기 중합체 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 타닌산, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 예로 들 수 있다.
본 명세서에서 "용매화물(solvate)"은 본 발명에 따른 화합물과 용매 분자(solvent molecules) 사이의 분자 복합체(molecular complex)를 말하며, 용매화물의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 에틸 아세테이트, 아세트산, 에탄올아민 또는 이의 혼합용매와 결합한 본 발명에 따른 화합물을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
활성 화합물의 상당하는 용매화물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 또는 바람직할 수 있다. 용어 "용매화물"은 본 명세서에서 용질(예컨대 활성 화합물, 활성 화합물의 염) 및 용매의 착체를 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다. 용매가 물인 경우, 용매화물을 편리하게 수화물, 예컨대 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등으로 지칭할 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적으로 서서히 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집물 등을 포함할 수 있으며, 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 주사제, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사 등을 위해, 활성 성분은 무발열성(pyrogen-free)이고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구 투여용의, 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는 예를 들어 염화나트륨 수용액, 링거액, 락테이트 링거액 등과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적절한 용액을 제조할 수 있으며, 보존제, 안정화제, 완충제, 산화 방지제 또는 기타 다른 첨가제로 필요한 경우 포함될 수 있다. 주사에 적합한 고체 형태는 또한 에멀젼으로서 또는 리포솜에 캡슐화된 폴리펩티드의 형태로 제조될 수 있다.
본 명세서에 사용된 어구 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적 치료 결과를 달성하는데 (투여량 및 투여 기간 및 수단에 대해) 필요한 양을 지칭한다. 유효량은 적어도 대상체에게 치료 이익을 부여하는데 필요한 활성제의 최소량이며, 독성량 미만이다. 예를 들어 투여량은 환자 당 약 100 ng 내지 약 100 mg/kg 범위로, 보다 전형적으로 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위로 투여할 수 있다. 활성 화합물이 염, 에스테르, 아미드, 전구체약물(prodrug) 등인 경우에 투여양은 모 화합물을 기준으로 계산되므로, 사용되는 실제 중량은 비례하여 증가된다. 본 발명에 따른 피롤로벤조디아제핀 화합물은 단위 제형(dosage form)당 활성 성분 0.1 mg 내지 3000 mg, 1 mg 내지 2000 mg, 10 mg 내지 1000 mg을 포함하도록 제형화될 수 있으나 이로 한정되지 않는다. 활성 성분은 약 0.05 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 50 μM, 5 μM 내지 30 μM의 활성 화합물의 피크 플라즈마 농도를 얻도록 투여될 수 있다. 예를 들어 임의로 식염수내에서 활성 성분 0.1 w/v% 내지 5 w/v% 용액의 정맥 주사에 의해 투여될 수 있다.
약학적 조성물에서 활성 화합물의 농도는 약물의 흡수, 불활성화 및 배출율 및 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 다른 인자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 증상/질환의 심각도에 따라 달라질 수 있다. 또한 어떤 특정 환자에 대한 투여량 및 투여요법은 환자의 증상/질환의 정도, 필요성, 나이, 약물에 대한 반응성 등을 종합적으로 고려하여 투여 감독자의 직업적 판단에 따라 조정될 수 있으며, 본 발명에서 제시된 농도 범위는 단지 일예이며 청구된 조성물의 실시양태를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다. 또한 활성 성분은 1회 투여될 수 있거나, 보다 적은 투여량을 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이고, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하려는 의도를 갖는 것은 아니다.
실시예 1. 항-ROR1 항체의 준비
1. ROR1 항체의 제조
(1) 항원
항원으로서는 인간 ROR1의 세포외영역(ECD)의 C-말단에 Fc가 연결된 ROR1 ECD-Fc 형태의 단백질을 사용하였다.
상기 항원의 제조를 위해 구체적으로 ROR1의 세포외도메인을 포함하는 단백질로서 NCBI 참조번호 NP_0050032로 표시되는 ROR1 아미노산 서열의 1번 아미노산 내지 406번 아미노산에 해당하는 잔기를 이용하였다. 상기 ROR1의 세포외 도메인을 코딩하는 유전자는 Origene사의 cDNA를 구매하여 사용하였다(Origene, RC214967) 또한, 추후 ROR1 세포외도메인을 정제하기 위하여 ROR1 세포외도메인을 코딩하는 유전자의 3'말단에는 인간 IgG1 유래의 Fc 단백질을 코딩하는 유전자를 합성하여 연결하였다(하기 'ROR1-Fc'로 명명) 상기 유전자를 pcDNA3.1 벡터에 도입하여, 포유동물 세포주에서 ROR1-Fc 핵산을 암호화하는 벡터를 확보하였다.
상기 발현벡터를 HEK 293E세포에 일시적으로 트랜스펙션 시켜 DMEM/F-12 배지에서 8% CO2, 37℃조건에서 배양함으로써 ROR1-Fc 발현하고, 매 72시간 마다 배지를 수집하였으며, 이어 배지를 합하고 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 Fc-ROR1 ECD 단백질을 정제하였다.
(2) 파이지 라이브러리 스크리닝을 통한 항체 선별
라이브러리 파아지(Library phage)의 제조
다양한 항원에 대한 결합 다양성을 가진 인간 유래 scFv(single chain variable fragment) 라이브러리(Yang et al, 2009 Mol Cells 27:225) 유전자를 가진 대장균 2×1010을 2X YT(Amresco, J902-500G), 카베니실린(Duchefa, C01090025) 100 ㎍/㎖, 2% 글루코스(sigma, G7021)를 포함하는 배지에서 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7) 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2X YT [2X YT, 카베니실린, 카나마이신(Duchfa, K0126) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(Duchefa, I1401)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하여 파이지 패킹을 유도하였다. 이어 배양한 세포를 원심분리(6000 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG8000(sigma, P2139)과 3% NaCl(Samchun, S2097)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS(Phosphate buffered saline, Gibco 10010-023)를 첨가하여 현탁한 다음 원심분리(12000rpm, 10분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
파아지 디스플레이(Phage display)를 통한 패닝(panning)
인간 ROR1 단백질과 결합하는 항체를 선별하기 위해 실시예 1.1.(1)에서 제조된 ROR1-Fc 단백질을 이용하여 다음과 같이 패닝을 총 3회 진행하였다.
구체적으로 면역시험관(immunotube, maxisorp 444202)에 10 ㎍/㎖ 농도의 ROR1-Fc와 음성대조군-Fc(BCMA-Fc)를 PBS에 첨가하여 4℃에서 밤새 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 우혈청 알부민(BSA, Bovine serum albumin) 3% 용액을 시험관에 첨가하여 ROR1-Fc가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 BSA 3% 용액에 분산된 1012 CFU의 항체 파지 라이브러리를 대조군 Fc 단백질이 흡착되어 있는 면역시험관에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다(negative selection). 이어 음성대조군 Fc에 비결합된 파지들을 회수하여 ROR1-Fc가 협착된 면역시험관에 결합시켰다. 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 5회~30회 씻어내어 제거하고, 남아있는 항원 특이적 파지항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 회수하였다. 회수된 파지를 1M 트리스 버퍼(pH 7.4)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37℃에서 1시간 감염시키고 감염된 대장균을 카베니실린을 포함하는 2X YT 한천배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 4 ㎖의 2X YT 카베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고 나머지는 다음 실험을 위해 파아지를 제조하였다. 이러한 과정을 총 3라운드 반복하여 ROR1 항원 특이적인 파아지 풀(phage pool)을 증폭 및 농축하였다.
단일클론 파아지 항체 선별(single clone screening)
상기 패닝을 통해 얻은 파아지 풀(phage pool)로부터 ROR1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB-테트라사이클린/카베니실린 한천배지에 상기 파아지 풀을 도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이어 단일 클론을 웰당 400 ㎕의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 들어간 96 깊은 웰 플레이트에 접종하여 밤새 키운 후, 배양액 10 ㎕를 새로운 390 ㎕의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 포함된 96 깊은 웰 플레이트에 넣어 37℃에서 4시간 배양했다. 상기 배양액에 1 mM IPTG 되게 넣어 주고 30℃에서 밤새 배양했다. 밤새 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하였다.
이어 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 인간 ROR1-Fc 항원과 결합하는 단일클론 가용성 scFv를 발현하는 클론을 선택하였다(Steinberger Rader and Barbas III 2000 Phage display vectors In: Phage Display Laboratory Manual 1sted ColdSpringHarborLaboratoryPress NY USA pp119-1112). 구체적으로 96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, USA)에 실시예 1.1.(1)에서 준비한 재조합 인간 ROR1-Fc 또는 BCMA-Fc를 well당 100 ng 넣고, 4℃에서 밤새 코팅하였다. BCMA-Fc는 음성대조군으로 사용한 단백질로 인간 BCMA 단백질의 세포외도메인 영역을 인간 Fc에 연결한 재조합 단백질이다. 3% BSA를 각 웰당 200 μL씩 넣어 37℃에서 2시간 블록킹 하였다. 상기 단일클론 파지 상등액은 3% BSA와 1:1로 섞어서 준비하여, 이 혼합액을 100 μL씩 상기 웰에 로딩한 뒤 37℃에서 2시간 반응시켰다. PBST 300 μL로 5회 세척한 후, 항-HA HRP 결합 항체를 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 세척하였다. TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 μL를 넣어 발색한 후, 1N H2SO4 50 μL를 넣어 반응을 정지한 후, 450 nm 및 650 nm에서 흡광도를 측정하여, ROR1 1 ㎍/mL 코팅했을 때 흡광도 값이 450 nm 및 650 nm에서 10 이상인 클론을 선별하였다(도 1).
이어 ROR1을 발현하는 세포주에 결합하는 클론은 유세포분석으로 선별하였다. 구체적으로 상기 단일 클론 scFv 상등액 100 ㎕를 ROR1을 과발현하는 암세포주(JeKo-1)와 반응시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 항-HA-FITC 항체(Sigma, H7411)와 4℃에서 30분간 반응한 후 PBS로 2회 세척 후 PBS 200 ㎕로 현탁하여 FACSCalibur flow cytometer(BD Bioscience)를 이용하여 JeKo-1 세포주에 결합하는 클론을 선별하였다(도 2).
이로부터 재조합 인간 ROR1 단백질 및 ROR1을 발현하는 세포주에 결합하는 항체 클론들(A2F2, BA6, C2E3)을 선별하였으며, A2F2 클론에 번역후 변형 (PTM) 방지를 위한 점돌연변이를 도입한 변이체인 A2F2M1도 제작하였다. 상기 각 항체의 scFv 형태의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 CDR 서열은 다음 표 1a 및 표 1b와 같다.
[표 1]
Figure pat00113
Figure pat00114
상기 가변영역 및 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열은 C2E3, A2F2, A2F2 M1 및 BA6의 순서대로 하기 중쇄 및 경쇄 전장을 코딩하는 핵산서열의 일부로 포함되어 있다: 서열번호 27(중쇄) 및 28(경쇄); 서열번호 29(중쇄) 및 30(경쇄); 서열번호 31(중쇄) 및 30(경쇄); 서열번호 33(중쇄) 및 34(경쇄)이다.
2. 항-ROR1 scFv의 전체 IgG 형태로 변환 및 생산
(1) 항-ROR1 scFv의 전체 IgG 형태로의 클로닝
상기 실시예 1.1.에서 확보한, 각 ROR1 특이적 단일클론 파아지 항체의 서열을 전체 IgG(full IgG) 형태로 변환하기 위해, 실시예 1.1.에서 확보한 각 클론의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산을 합성하였다(제노텍, 대한민국) 인간 IgG1 서브타입의 중쇄(서열번호 34)와 경쇄 불변영역(서열번호 35 또는 36) 단백질을 코딩하는 유전자를 합성하여 상기 각 중쇄와 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산과 연결하였다. 각 항체의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 핵산은 각각 pcDNA3.1 기반의 발현 벡터에 클로닝하여 CHO-S 포유동물세포주에서 항체 핵산을 암호화하는 벡터를 확보하였다.
비교군 항체로는 기존 항-ROR1 항체인 2A2(US 9,316,646)의 가변영역에 인간 IgG1을 연결한 키메라 항체를 비교군 항체로 사용하였다.
IgG 형태의 본 발명에 따른 항-ROR1 항체 (C2E3, A2F2, A2F2M1, BA6)의 가변 중쇄 (VH), 가변 경쇄 (VL), 중쇄 전장 (Heavy chain) 및 경쇄 전장 (Light chain) 서열은 아래 표 2a 내지 2d 와 같다. IgG 형태의 항-ROR1 항체가 ADC에 사용되는 경우, 약물의 결합을 위해 경쇄의 불변 영역에 K149C와 같은 돌연변이가 도입될 수 있으며, 그러한 돌연변이가 도입된 경쇄 서열 역시 아래 표에 나타나 있다.
[표 2]
Figure pat00115
Figure pat00116
Figure pat00117
Figure pat00118
(2) 항-ROR1 IgG 항체의 발현
CHO-S 세포를 CD-CHO(Gibco, 10743) 배지에 1.5×106 cells/ml로 농도를 맞춘 후, 8% CO2, 37℃에서 1일 동안 배양하였다. DNA 트랜스펙션 당일 2.5~3×106 cells/ml로 자란 세포를 1% DMSO가 포함되어 있는 CD-CHO 배지를 이용하여 2.1×106 cells/ml의 농도로 준비한 후, 8% CO2, 37℃에서 3 hr 배양하였다. 3000 rpm에서 15 min 원심분리 후, 상등액을 제거한 후, 25% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 재현탁 하였다. 이어 실시예 1.2.(1)의 중쇄와 경쇄를 발현하는 각 벡터를 각각 배지 ml당 1 ㎍씩 Opti-MEM 배지에 희석하고, PEI(Polysciences, 23966, stock 농도: 1 mg/ml)는 배양 배지 ml당 8 ㎍ 희석하였다. 상기 벡터 및 PEI 혼합물을 섞어 상온에서 10 min 동안 정치한 후, 상기와 같이 준비된 세포가 포함된 플라스크에 넣은 후, 5% CO2, 37℃, 100 rpm으로 4 hr 배양한 후, 배양부피와 동일한 부피의 CD-CHO 배지를 넣어준 후, 8% CO2, 37℃, 110 rpm에서 4일 동안 배양하였다.
(3) 항-ROR1 IgG 항체의 분리 정제
평형화 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl)을 Mab selectsure(GE healthcare, 5mL)에 통과시켜 평형시킨 이후, 실시예 1.3.(2)의 배양액을 컬럼(Mab selectsure(GE healthcare, 5 mL))에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 50 mM Na-citrate(pH 3.4), 100 mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1 M Tris-HCl(pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2가 되게 하였다. 완충액을 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하였다.
3. 항-ROR1 IgG 항체의 ROR1에 대한 결합 특이성 분석
(1) 항-ROR1 IgG 항체의 ROR1 항원(세포외 영역)에 대한 결합능 분석(ELISA)
상기 실시예 1.2.에서 제조된, 실시예 1.2.에서 선별된 각 클론의 IgG 항체의 항원에 대한 특이적 결합능을 하기와 같이 분석하였다.
항-ROR1 항체-항원 결합 친화도는 ELISA-기반 용액 결합시험을 사용하여 평가하였다. 구체적으로 96-웰 미세역가 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)를 4℃에서 16시간 동안 PBS 용액 중의 1 ㎍/㎖ 농도의 아래 기술한 ROR1 단백질로 코팅하고, 비특이적 결합부위는 3% BSA(bovine serum albumin)로 2시간 동안 차단시켰다. 이때 ROR1 단백질은 인간 ROR1의 경우 실시예 1.1.의 ROR1-Fc 또는 재조합 인간 ROR1-His(Sino Biological, 13968-H08H)을 사용하였다. ELISA에서 사용한 ROR1-His는 위의 문장에 기재한 바와 같이 sino biological사(13968-H08H)의 단백질로 실시예 1.1.의 ROR1-His, 또는 재조합 마우스 ROR1 단백질을 사용하였다(Acrobiosystems, RO1-M5221-100㎍).
이어 96-웰 미세역가 플레이트상에서 실시예 1.3.에서 준비한 항-ROR1 항체를 도 2에 기재된 농도로 미세역가 플레이트 추가한 후 결합능을 다음과 같이 ELISA로 분석하였다. 구체적으로 2시간 항온처리 한 후에, 상기 플레이트를 0.05%의 트윈 20(tween 20)을 포함하는 PBS로 5회 세척한 후, HRP-접합된 Fab 다중클로날 항체 시약(Pierce, 31414)을 1:10,000 비율로 희석하여 상기 세척된 미세역가플레이트에 넣고, 1시간 동안 37℃에서 반응시켜, 플레이트에 결합된 ROR1 항체를 검출하였다. 반응 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 발색시켰다. 효소반응을 0.5 mol/L의 황산에 의해서 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450 nm 및 650 nm에서 흡광도를 측정하였다(450 nm - 650 nm).
여러 항-ROR1 항체 클론들과 함께 ROR1에 대한 결합 특이성을 분석한 결과는 도 3a 및 도 3b, 및 도 4에 기재되어 있다. 이로부터 본 발명의 항-ROR1 항체는 인간 ROR1과 마우스 ROR1에 농도 의존적으로 결합함을 확인하였으며, 번역후 변형 (PTM) 방지를 위해 A2F2에 점돌연변이를 도입한 A2F2M1 클론이 모클론과 동일한 결합력을 가진다는 사실도 확인하였다. 또한 마우스 ROR1 단백질에 대한 교차반응성을 비교하였을 때 본 발명 ROR1 항체가 비교군으로 사용한 2A2 대조항체 대비 결합력이 우수한 것으로 나타났다 (도 4).
(2) 항-ROR1 IgG 항체의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 특이적 결합능 측정(FACS)
특정 항원에 대한 항체가 치료용 항체 등 생체 내에서 사용되기 위해서는 세포 표면 발현 항원에 결합하는 것이 필수적인 요소이다. 일부 항체의 경우 정제된 항원에는 결합하지만 세포 표면 발현 항원에는 결합하지 않는다. 이런 경우 생체 내로 항체를 투여하여도 항원에 대한 결합이 불가능 하므로 항원을 발현하고 있는 세포에 항체가 결합하지 못하여 치료용 항체 등 생체 내에서의 활성을 보일 수 없다.
이에 본 발명의 항-ROR1 항체가 세포 표면 발현 ROR1에 결합하는지 여부를 FACS 분석을 통하여 확인하였다.
이 실험을 위하여 ROR1 유전자를 일시적으로(CHO-human ROR1, CHO-human ROR2, CHO-mouse ROR1) 또는 안정적으로(MC38-human ROR1) 트렌스펙션시켜 ROR1 단백질의 발현을 인위적으로 과발현시킨 세포주(각각 도 5 및 도 7) 또는 ROR1을 발현하는 세포주(JeKo-1, Mino)(도 6) 또는 ROR1을 발현하지 않는 세포주(MCF7)(도 6)와 FACSCalibur(BD Biosciences) 기기를 이용하여 항-ROR1 항체와 ROR1의 결합된 정도를 다음과 같이 측정하였다. MCF7는 ROR1을 발현하지 않는 음성대조군이고, CHO-human ROR2는 인간 ROR2를 발현하는 음성대조군이다. JeKo-1, Mino, CHO-human ROR1, CHO-mouse ROR1, MC38-human ROR1은 모두 인간 ROR1 또는 마우스 ROR1을 발현 하는 세포주이다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포수를 계수하여 2×105 cells/200 ㎕ PBS로 맞춘 뒤, 실시예 1.3.에서 준비된 각 ROR1 단일클론항체를 10 μg/mL 또는 10 μg/mL으로부터 5배씩 희석하여 처리 후 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 표지된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도:20 mg/ml)를 2 ㎕/1×105 cells/200㎕ PBS로 현탁하여 4℃에서 1시간 반응하였다. 일시적으로 과발현시킨 인간 ROR1, 인간 ROR2, 마우스 ROR1의 발현 정도의 확인은 상업적으로 판매되는 FACS 분석용 항체(anti-ROR1 : R&D Systems, FAB2000G, anti-ROR2 : R&D, FAB20641P)를 이용하여 분석하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기를 이용하여 판독하였다. 음성대조군(2nd Ab)은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각각의 ROR1 단일클론항체를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 대조군의 이동된 판독 결과와 비교하였다(MFI Ratio:MFI of anti-ROR1 / MFI of 2nd Ab).
결과는 도 5, 도 6 및 도 7에 기재되어 있다. 그 결과 본 발명의 항-ROR1 항체는 세포에서 원래 발현되는 인간 ROR1(도 6) 및 세포에서 인위적으로 과발현 된 인간 ROR1(도 5, 도 7)의 세포외영역에 특이적으로, 농도의존적인 양상으로 결합함을 확인하였다. 또한 패밀리 단백질인 인간 ROR2에는 결합하지 않고, 마우스 ROR1에 대해서는 종간 교차반응성이 있음을 확인하였다(도 5). 세포표면에 발현하는 마우스 ROR1에 대한 교차반응성을 비교하였을 때 본 발명의 ROR1 항체가 비교군으로 사용한 항체인 2A2 대비 결합정도가 더 우수함을 확인하였다 (도 5).
(3) 항-ROR1 IgG 항체의 다양한 암종에서의 세포 표면 발현 ROR1 항원에 대한 결합능 측정(FACS)
이어 FACS 분석을 통하여 본 발명의 항-ROR1 항체가 다양한 종류의 암세포주에서 세포 표면 발현 ROR1에 결합하는지 여부를 확인하였다. ROR1은 다양한 암세포에서 발현하는데 만성 림프구성 백혈병(CLL), B세포 백혈병, 림프종, 급성골수성 백혈병(AML), 버킷 림프종, 외투세포림프종(MCL), 급성림프구성백혈병(ALL), 미만성거대B세포림프종(DLBCL), 여포성림프종(FL), 변연부림프종(MZL) 등의 혈액암은 물론 유방암, 신장암, 난소암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 상피 편평세포암, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암 등의 다양한 고형암에서도 과발현되는 것으로 보고 되어있다.
이 실험을 위하여 다음과 같은 다양한 종류의 암세포주를 사용하였다: AGS (ATCC CRL-1739TM, huamn gastric adenocarcinoma), NCI-N87 (ATCC CRL-5822TM, human gastric carcinoma), MKN-28 (KCLB 80102, human gastric adenocarcinoma), SNU-1750 (KCLB 01750, human gastric adenocarcinoma), SNU-16 (ATCC CRL5974TM, human gastric carcinoma), HCC1187 (ATCC CRL-2322TM, huamn breast canccer TNM stage IIA grade 3), MDA-MB-231 ATCC HTB-26TM, human breast cancer), MDA-MB-468 (ATCC HTB-132TM, human breast cancer), HCC70 (ATCC CRL2315TM, human breast cancer TNM stage IIIA, grade 3), HCC1143 (ATCC CRL-2321TM, TNMstageIIA, grade3, primary ductal carcinoma), BT20(ATCC HTB-19TM human breast cancer), HCC1806 (ATCC CRL-2335TM, huamn breast canccer TNM stage IIB grade 2), HCC1937 (ATCC CRL2336TM, TNMstageIIB, grade3, primary ductal carcinoma), BT474 (ATCC HTB-20TM, ductal carcinoma), MCF7 (ATCC HTB-22TM, breast cancer metastatic site), H460 (ATCC HTB-177TM, large cell lung cancer), A549 (ATCC CCL-185TM, lung carcinoma), NCI-H1975 (ATCC CRL-5908TM, non-small cell lung cancer), H1437 (ATCC CRL5872TM, stage1,adenocarcinomanonsmallcelllungcancer), Calu-6(ATCC HTB-56TM, anaplastic lung carcinoma), HCT116 (ATCC CCL-247TM, colorectal carcinoma), DLD-1 (ATCC CCL-221TM, Dukes' type C, colorectal adenocarcinoma), HT29 (ATCC HTB-38TM, colorectal adenocarcinoma), 697 (DSMZACC 42, acute myeloblastic leukemia), Kasumi-2 (ATCC CRL-2724TM, acute myeloblastic leukemia), Mino (ATCC CRL3000TM, Mantle Cell Lymphoma), JeKo-1(ATCC CRL3006TM, Mantle Cell Lymphoma), Jurkat (ATCC TIB-152TM, acute Tcell leukemia). 상기 세포주에 대하여 본 발명의 항-ROR1 항체를 이용하여 ROR1에 대한 결합을 FACS (FACSCalibur, BD Biosciences)로 분석하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포를 계수하여 2×105 cells/200 ㎕ PBS로 맞춘 뒤, 실시예 1.3.에서 준비된 각 ROR1 단일클론 항체중 클론명 C2E3 항체를 10 μg/mL으로 처리 후 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 표지된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 20 mg/ml)를 2 ㎕/1×105 cells/200 ㎕ PBS로 현탁하여 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기를 이용하여 판독하였다. 음성대조군은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각 암세포주간 ROR1의 발현정도를 비교하기 위하여 본 발명의 ROR1 단일클론항체(C2E3)를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 대조군에서 이동된 판독 결과로 나눈 값(MFI Ratio : MFI of anti-ROR1 / MFI of 2nd Ab)을 표기하였다.
결과는 도 8에 기재되어 있다. 그 결과 본 발명의 항-ROR1 항체는 위암, 유방암, 폐암, 대장암, 급성림프구성백혈병(ALL), 및 외투세포림프종(MCL)유래의 다양한 암세포주에서 발현되는 ROR1에 결합이 확인되었다.
실시예 2. 항-B7-H3 항체의 준비
1. 항체의 제조
(1) 항원의 제조
항 B7-H3 항체 제조를 위한 파지 디스플레이 수행에 사용되는 항원을 구매하여 사용하였다. 인간 B7-H3의 경우 NP_001019907.1의 아미노산 서열 1번에서 461번을 포함하며 C 말단에 히스티딘-태그(His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질(2318-B3/CF, R&D Systems) 사용하였다.
하기 실시예의 ELISA 분석, SPR 분석 또는 T 세포 활성 분석에 사용되는 항원을 다음과 같이 구매하여 사용하였다. 인간 B7-H3의 경우 NP_001019907.1의 아미노산 서열 1번에서 461번을 포함하며 C 말단에 히스티딘-태그(His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질(Sino Biological, 11188-H08H)과 C 말단에 인간 IgG1의 Fc 부분이 결합되어 있는 단백질(Sino Biological, 11188-H02H)을 사용하였다.
(2) 파이지 라이브러리 스크리닝을 통한 항체 선별 제조
라이브러리 파아지(Library phage)의 제조
다양한 항원에 대한 결합 가능성을 가지는 인간 유래 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리(Mol. Cells OT, 225-235, February 28, 2009) 유전자를 가진 대장균을 2X YT(Amresco, J902-500G), 암피실린(Ampicilin)이 100 ㎍/㎖, 2% 글루코스(sigma, G7021)를 포함하는 배지에 2×1010 개를 접종하여 37℃에서 2시간에서 3시간 동안 배양하여 OD600 값이 0.5에서 0.7이 되도록 하였다. 배양한 대장균을 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시킨 후, 2X YT [2X YT, 암피실린(Ampicilin) 100 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(Duchefa, I1401)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하여 파이지 패킹을 유도하였다. 이어 배양한 세포를 4℃, 4500 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리한 후, 상등액에 4% PEG 8000(sigma, P2139)과 3% NaCl(Samchun, S2097)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음 위에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 4℃, 8000 rpm 조건으로 원심분리 한 후, 상등액은 버리고 세포 펠렛에 PBS(Phosphate buffered saline, Gibco 10010-023)를 첨가하여 현탁하였다.
현탁액을 4℃, 1200 rpm 조건으로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 새 튜브로 옮겨 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.
파아지 디스플레이(Phage display)를 통한 패닝(panning)
인간 B7-H3 단백질과 결합하는 항체를 선별하기 위해 실시예 2.1.(1)의 히스티딘-태그(His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질을 이용하여 다음과 같이 패닝을 총 3회 진행하였다.
구체적으로 면역시험관(immunotube, maxisorp 444202)에 2 ㎍/㎖ 농도의 재조합 인간 B7-H3 단백질을 1㎖ 첨가하여 37℃, 200rpm 조건에서 1시간 반응시켜 시험관 표면에 단백질을 흡착시켰다. 이어 상등액을 제거하고 탈지유(Skim milk)가 3% 포함된 용액을 시험관에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 통해 재조합 인간 B7-H3 단백질이 흡착되지 않은 면역시험관 표면에 Skim milk를 흡착시켜 비특이적 결합을 차단하였다. 이어 상등액을 제거한 후, 실시예 2.1.(2)에서 준비한 파지 라이브러리의 1012 CFU를 3% Skim milk가 포함된 용액에 섞어 상기 면역시험에 넣고 37℃, 150 rpm조건에서 1시간 반응시켜 인간 B7-H3 단백질 특이적인 파지가 항원에 결합하도록 하였다.
이어 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 3회 씻어내어 제거하고, 남아있는 항원 특이적 파지 항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 1 ㎖ 넣어 회수하였다. 트리에틸아민 용액의 pH가 낮기 때문에 회수된 파지를 1 M Tris 완충액(pH 7.4)으로 중화시킨 후, OD600에서 0.8~1로 키운 ER2537 대장균에 37℃, 120 rpm 조건에서 1시간 30분 동안 감염시켰다. 배양액을 4℃, 4500 rpm 조건으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 가라앉은 세포를 감염된 대장균을 암피실린(Ampicilin)을 포함하는 2X YT 한천배지에 도말하여 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 모두 긁어 5 ㎖의 2X YT 암피실린 배양액에 현탁하고 50% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고 나머지는 다음 실험을 위해 파아지를 제조하였다. 배양된 대장균 20 ㎕를 암피실린이 포함된 2X TB에 접종하여 키운 후 헬퍼 파아지 감염시키고 실시예 2.2.(1)과 2.2.(2)를 2번 더 반복하여 인간 B7-H3 단백질 특이적인 파아지 풀(phage pool)을 증폭 및 농축하였다.
단일클론 파아지 항체 선별(single clone screening)
상기 패닝을 통해 얻은 파아지 풀 (phage pool)로부터 인간 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB-암피실린 한천배지에 상기 파아지 풀을 도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이어 단일 클론을 웰당 200 ㎕의 super broth(SB)배지가 들어간 96 깊은 웰 플레이트에 접종하여 37℃에서 4시간 배양하여 키운 후, 일부를 다른 플레이트에 옮겨 Cell stock을 만들었다. 남아 있는 세포 배양액에 1 mM IPTG 되게 넣어 주고 30℃에서 16시간 동안 배양하여 scFv의 생산을 유도하였다. 배양한 배양액을 4℃, 6000 rpm 조건으로 20분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 세포만을 얻은 후 TES 용액을 이용하여 세포를 용해시킨 후에 다시 원심분리하여 상등액만 얻어서 사용하였다.
이어 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 B7-H3-His 항원(2318-B3/CF,R&D Systems)과 결합하는 단일클론 가용성 scFv를 발현하는 클론을 선택하였다(Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. 1sted. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. pp.11.9-11.12). 구체적으로 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY, USA)에 실시예 2.1.(1)에서 준비한 재조합 인간 B7-H3-his 단백질을 PBS에 희석하여 웰당 100 ng 넣고, 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 다음날 플레이트에 단백질을 PBST(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)로 씻어준 후, 비특이적인 결합을 방지하기 위해 3% BSA이 포함된 PBS 완충용액을 웰당 200 ㎕을 넣고 37℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이어 PBST로 다시 씻어 준 후 미리 원심분리하여 준비한 파지가 포함된 상등액을 각 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어준 후 인간 B7-H3에 결합된 파지를 검출하기 위해 항-HA HRP(Horseradish peroxidase)결합 항체(Roche, 12 013 819 001)를 1% BSA가 포함된 PBS에 1:5000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어 준 후 TMB (Tetramethylbenzidine, Thermo, 34028) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1N H2SO4 를 50 ㎖ 넣어 반응을 종료하였다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 값이 1.0 이상인 클론을 선별하였다.
이로부터 재조합 인간 B7-H3 단백질에 결합하는 항체 클론 B5를 선별하였으며, B5 클론의 중쇄 가변 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 CDR 서열은 다음 표와 같다.
[표 3]
Figure pat00119
Figure pat00120
상기 B5 가변영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 85(중쇄) 및 86(경쇄)에 포함되어 있다.
2. 항 B7-H3 scFv의 전체 IgG 형태로 변환 및 생산
(1) 항 B7-H3 scFv의 전체 IgG 형태로의 클로닝
상기 실시예 2.1.에서 확보한, 각 인간 B7-H3 특이적 단일클론 파아지 항체의 서열을 전체 IgG(full IgG) 형태로 변환하기 위해, 실시예 2.1.에서 확보한 각 클론의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산을 합성하였다(제노텍, 대한민국). 인간 IgG1 서브타입의 중쇄 (서열번호 65)와 경쇄 불변영역(서열번호 66 또는 67) 단백질을 코딩하는 유전자 (서열번호 68 및 69)를 합성하여 상기 각 중쇄와 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산과 연결하였다. 각 항체의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 핵산은 각각 pcDNA3.1 기반의 발현 벡터에 클로닝하여 CHO-S 등의 포유동물세포주에서 항체 핵산을 암호화하는 벡터를 확보하였다. 또한 기존 항 B7-H3 항체인 Enoblituzumab를 비교군 항체로 사용하기 위해 항체의 가변영역 서열을 특허(US 8,802,091)에서 확보하여 유전자를 확보하였고 상술한 방법과 동일하게 클로닝하여 84D로 명명하여 사용하였다.
IgG 형태의 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체 (B5)의 가변 중쇄 (VH), 가변 경쇄 (VL), 중쇄 전장 (Heavy chain) 및 경쇄 전장 (Light chain) 서열은 아래 표 4와 같다. IgG 형태의 항 B7-H3 항체가 ADC에 사용되는 경우, 약물의 결합을 위해 경쇄의 불변 영역에 K149C와 같은 돌연변이가 도입될 수 있으며, 그러한 돌연변이가 도입된 경쇄 서열 역시 아래 표에 나타나 있다.
[표 4]
Figure pat00121
(2) 항 B7-H3 항체의 발현
항 B7-H3 항체의 발현은 Thermo사에서 개발한 ExpiCHO-STM(Thermo Fisher, A29127) 세포를 이용하였고, 항체의 발현은 제조사의 ExpiCHOTM Expression System Kit(Thermo Fisher, A29133) 프로토콜에 준수하여 수행하였다.
제조방법을 간단히 설명하면, ExpiCHO-S 세포를 8% CO2, 37℃조건의 진탕배양기(shaking incubator)에서 120 rpm 조건으로 배양하였다.
트랜스펙션(Transfection) 당일 ExpiCHO-S 세포를 6×106 cells/㎖의 세포 농도로 ExpiCHOTM Expression Medium(Thermo Fisher, A2910001)을 첨가하여 희석하여 준비하였다.
이어 실시예 2.2.(1)의 중쇄와 경쇄를 발현하는 각 벡터를 각각 배지 ㎖당 1㎍씩 OptiPROTM SFM 배지(Thermo Fisher, 12309050)에 희석하고, ExpiCHO Expression system에 포함되어 있는 ExpiFectamineTMCHO를 ㎖당 3.2 ㎕를 OptiPROTM SFM 배지 희석하였다. 상기 벡터 및 ExpiFectamineTMCHO 혼합물을 서로 섞어 상온에서 5분 동안 반응시킨 후, 준비된 세포에 혼합물을 넣어 8% CO2, 37℃, 120 rpm 조건으로 20시간 배양하였다. 20시간 후에 ExpiCHOTM Expression System Kit(Thermo Fisher, A29133)에 포함되어 있는 Enhencer1, ExpiCHOTM Feed를 각각 ㎖당 2.2 ㎕, 240 ㎕를 세포에 첨가한 후 8% CO2, 37℃, 120 rpm 조건으로 7일에서 10일정도 배양하였다.
배양이 끝난 후 세포배양액을 4℃, 6000 rpm 조건으로 30분간 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 냉장보관하였다.
(3) 항 B7-H3 항체의 분리 정제
평형화 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl)을 Mab selectsure(GE healthcare, 5 ㎖)에 통과시켜 평형시킨 이후, 실시예 2.2.(2)의 배양액을 컬럼(Mab selectsure(GE healthcare, 5 ㎖))에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 50 mM Na-citrate(pH 3.4), 100 mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1 M Tris-HCl(pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2가 되게 하였다. 완충액을 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하였다.
3. 항 B7-H3 IgG 항체의 B7-H3 에 대한 결합 특이성 분석
(1) 항 B7-H3 IgG 항체의 재조합 B7-H3 항원에 대한 결합능 분석 (ELISA)
상기 실시예 2.2.에서 제조된, 실시예 2.1.에서 선별된 항 B7-H3 IgG 항체의 B7-H3 항원에 대한 특이적 결합능을 확인하기 위해 ELISA 기반 용액 결합 시험을 사용하여 분석하였다.
구체적으로 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 재조합 인간 B7-H3 단백질을 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어 준 후, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 사용한 재조합 인간 B7-H3 단백질은 실시예 2.1.에서 분석용으로 구매한 제품을 사용하였다.
이어 단백질을 제거하고 PBST로 씻어 준 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ㎕ 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 비 특이적인 결합을 차단시켰다. 이어 96-웰 플레이트상에서 실시예 2.2.에서 준비한 항 B7-H3 항체를 10 ㎍/㎖을 기준으로 일정 비율로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕ 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어 준 후 인간 B7-H3에 결합된 항체를 검출하기 위해 HRP-접합 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 우 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1 N H2SO4를 50 ㎕ 넣어 반응을 종료하고 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450 nm과 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 9에 기재되어 있다. ELISA 방법을 이용한 결합능 측정 결과 본 발명의 항 B7-H3 항체는 인간 B7-H3의 세포외영역에 농도 의존적으로 결합함을 확인하였다.
(2) 항 B7-H3 항체의 B7 패밀리의 다른 단백질들에 결합능 분석
B7 패밀리 단백질은 서로 20~40%의 아미노산 동일성을 가지고 있으며 면역글로불린 도메인의 반복성과 같이 구조적 관련성을 가진다. 그래서 다른 B7 패밀리 단백질이 아닌 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는지 아래와 같이 분석하였다.
면역 특이 결합성 확인을 위해 구조적 유사성을 가지는 B7 패밀리 구성 단백질: B7-1(Sino Biological, Cat #: 10698-H08H), B7-2(Sino Biological, Cat #: 10699-H08H), B7-DC(Sino Biological, Cat #: 10292-H08H), B7-H1(Sino Biological, Cat #: 10084-H08H), B7-H2(Sino Biological, Cat #: 11559-H08H), B7-H4(Sino Biological, Cat #: 10738-H08H), B7-H5(Sino Biological, Cat #: 13482-H08H), B7-H6(Sino Biological, Cat #: 16140-H08H), B7-H7(Sino Biological, Cat #: 16139-H02H)은 구매하여 사용하였다.
구체적으로 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 재조합 인간 B7 패밀리 단백질을 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어준 후, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 사용한 재조합 단백질은 실시예 2.1.1.에서 분석용으로 구매한 제품을 사용하였다.
이어 단백질을 제거하고 PBST로 씻어준 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ㎕ 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 비 특이적인 결합을 차단시켰다. 이어 96-웰 플레이트상에서 실시예 2.2.에서 준비한 항 B7-H3 항체를 10 ㎍/㎖으로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕ 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어 준 후 항원에 결합된 항체를 검출하기 위해 HRP-접합 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 우 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다.
다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1N H2SO4를 50 ㎕ 넣어 반응을 종료하고 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450 nm 및 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 10에 기재되어 있다. ELISA 법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 B7 패밀리 단백질이 아닌 B7-H3에만 특이적으로 결합함을 확인하였다.
(3) 항 B7-H3 항체의 인간, 원숭이, 및 마우스 B7-H3 항원에 대한 종간 교차 반응성 분석
인간에 대한 임상 진행 이전에 항 B7-H3 항체의 항체 효능 및 면역 조절기 활성을 평가하기 위해서는 설치류 또는 영장류 모델에서의 평가가 중요하다. 인간 B7-H3의 서열은 원숭이와 마우스에서 90% 이상 상동성을 공유하고 있다. 실시예 2.2.에서 제조된 본원의 항 B7-H3 항체의 마우스 또는 원숭이 B7-H3에 대한 교차 반응성을 다음과 같이 ELISA 분석법을 통해 분석하였다.
종간 교차반응성을 확인하기 위해 C 말단에 히스티딘 태그(His tag)이 결합된 재조합 마우스 B7-H3 단백질(Sino Biological, Cat #: 50973-M08H)와 C 말단에 인간 IgG1의 Fc 부분이 결합되어 있는 재조합 원숭이 B7-H3 단백질(Sino Biological, Cat #: 90806-C02H) 항원을 구매하여 사용하였다.
96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 재조합 인간 B7-H3, 마우스 B7-H3, 원숭이 B7-H3 단백질을 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어준 후, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 사용한 재조합 단백질은 실시예 2.1.에서 분석용으로 구매한 제품을 사용하였다.
이어 단백질을 제거하고 PBST로 씻어 준 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ㎕ 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적인 결합을 차단시켰다. 이어 96-웰 플레이트상에서 실시예 2.2.에서 준비한 항 B7-H3 항체를 10 ㎍/㎖부터 일정 비율로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕ 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어준 후 인간 B7-H3, 원숭이 B7-H3, 마우스 B7-H3에 결합한 항체를 검출하기 위해 HRP-접합 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 우 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1 N H2SO4를 50 ㎕ 넣어 반응을 종료하고 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450 nm 및 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 11과 도 12에 기재되어 있다. ELISA 법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 본원의 항 B7-H3 항체는 인간과 원숭이의 B7-H3에 대한 결합 정도는 유사하게 나타났으나 마우스 B7-H3에 대한 결합 정도는 상대적으로 낮았다(도 11). 각 항체 클론별 마우스 B7-H3에 대한 결합정도는 상이였으며, 비교항체로 사용한 84D 항체는 마우스 B7-H3 단백질에 결합하지 않는 것으로 관찰되었다(도 12).
(4) 항 B7-H3 항체의 세포표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정
이어 FACS 분석을 통하여 실시예 2.2.에서 제조된 본원의 항 B7-H3 항체가 세포 표면에서 발현되는 인간 B7-H3에 결합하는 능력을 측정하였다. 특정 항원에 대한 항체가 치료용 항체 등 생체 내에서 사용되기 위해서는 세포 표면 발현 항원에 결합하는 것이 필수적인 요소이다. 일부 항체의 경우 정제된 항원에는 결합하지만 세포 표면 발현 항원에는 결합하지 않는다. 이런 경우 생체내로 항체를 투여하여도 항원에 대한 결합이 불가능 하므로 항원을 발현하고 있는 세포에 항체가 결합하지 못하여 치료용 항체 등 생체 내에서의 활성을 보일 수 없다. 이에 본원의 항 B7-H3 항체가 세포 표면 발현 B7-H3에 결합하는지 여부를 FACS 분석을 통하여 확인하였다.
실험을 위하여 인간 B7-H3를 발현하는 암세포주인 MCF-7(Human breast adenocarcinoma cell line, ATCC® HTB-22TM), DLD1(colorectal adenocarcinoma cell lines, ATCC® CCL-221TM), HCC1954(TNM stage IIA, grade 3, ductal carcinoma, ATCC® CRL-2338TM), 및 HCT116(colon cancer cell, ATCC® CCL-247TM) 및 인간 B7-H3를 발현하지 않는 암세포주인 Jurkat(acute T cell leukemia, ATCC® TIB-152TM)을 이용하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS 버퍼로 세척한 후, 세포수를 계수하여 웰당 2×105 cells로 맞춰 200 ㎕ PBS 넣어 준비한다. 실시예 2.2.의 항 B7-H3 항체 및 비교군 항체(84D) 각각을 1% BSA가 포함된 PBS에 10 ㎍/㎖ 농도 또는 10 ㎍/㎖ 농도부터 일정 비율로 희석하여 미리 준비해둔 세포와 혼합하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척 후, FITC 표지된 항-human Fc FITC(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0 mg/㎖를 1:500으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 음성 대조군은 FITC 표지된 항-human Fc FITC만 처리하였다. 다시 PBS 버퍼를 이용해 2회 세척 후, FACSCalibur 기기를 이용하여 항-BCMA IgG가 결합된 정도를 측정하였다.
각각의 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 인간 B7-H3-단일클론항체-FITC 결합에 의한 이동된 판독 결과를 음성 대조군 결합과 비교하였다. 결과는 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 음성대조군에서 이동된 판독 결과로 나눈 값(MFI)으로 표기하였으며, 도 13 및 도 14에 기재되어 있다. FACS법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 세포표면에 발현하는 인간 B7-H3에 특이적으로 그리고 농도 의존적인 양상으로 결합함을 확인하였다.
(5) 항-B7-H3 IgG 항체의 다양한 암종에서의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정
이어 FACS 분석을 통하여 본원의 항 B7-H3 항체가 다양한 종류의 암세포주에서 세포 표면 발현 B7-H3에 결합하는 지 여부를 확인하였다. B7-H3는 다양한 암세포에서 발현하는데 비소 세포 폐암(Non-small cell lung cancer), 신장 세포 암(Renal cell carcinoma), 신경 모세포종(Neuroblastoma), 대장암(Colorectal cancer), 췌장암(Pancreatic cancer), 위암(Gastric cancer), 폐암(Lung cancer), 전립선 암(Prostate cancer), 자궁 내막 암(Endometrial cancer), 간세포 암(Hepatocellular carcinoma), 폐암(Lung cancer), 유방암(Breast cancer), 자궁경부암(Cervical cancer), 골육종(Osteosarcoma), 구강암(Oral carcinoma), 방광암(Bladder cancer), 신경 교종(Glioma), 흑색 종(Melanoma) 등 다양한 고형암에서 확인되며 급성 백혈병(Acute leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 여러 종류의 림프종(lymphoma)와 같은 혈액종에서도 발현되는 것으로 보고 되어있다.
이 실험을 위하여 다양한 종류의 암세포 A2780(human ovarian cancer, ECACC,93112519), SKOV-3(human ovarian adenocarcinoma, ATCC® HTB-77TM), OVCAR-3(human ovarian adenocarcinoma, ATCC® HTB-161TM), HCT116(colon cancer cell, ThermoFIshcer Sci), HT29(olorectal adenocarcinoma,ATCC® HTB-38TM), DLD-1(colorectal adenocarcinoma cell lines, ATCC® CCL-221TM), Calu-6(Non-small-cell lung carcinoma, ATCC® HTB-56TM), HCC1954(TNM stage IIA, grade 3, ductal carcinoma, ATCC® CRL-2338TM), HCC1187(TNM stage IIA,ATCC® CLC-2322TM), 신장암 세포주 786-0(renal cell adenocarcinoma, ATCC® CRL-1932TM), A498(kidney carcinoma, ATCC® HTB-44TM), Panc-1(pancreas epithelioid carcinoma, ATCC® CRL-1469TM), NCI-N87(gastric carcinoma, TCC® CRL-5822TM), HeLa(cervix adenocarcinoma, ATCC® CCL-2TM), JeKo-1(Lymphoma, ATCC® CRL-3006TM)와 FACSCalibur(BD Biosciences) 기기를 이용하여 항 B7-H3 항체와 B7-H3의 결합된 정도를 다음과 같이 측정하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포수를 계수하여 2×105 cells/200 ㎕ PBS로 맞춘 뒤, 실시예 2.2.에서 준비된 각 B7-H3 단일클론 항체를 10 ㎍/㎖으로 처리 후 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 표지된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0 mg/㎖)를 1:500으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기를 이용하여 판독하였다. 음성대조군은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각 암세포주간 B7-H3의 발현정도를 비교하기 위하여 각 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 음성대조군에서 이동된 판독 결과로 나눈 값(MFI)을 표기하였다. 결과는 표 5에 기재되어 있다.
[표 5]
Figure pat00122
FACS법을 이용한 결합능 측정 결과 본원의 항 B7-H3 항체는 난소암, 대장암, 비소세포폐암, 유방암, 신장암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 림프종 유래의 다양한 암세포주에서 결합이 확인되었다. 또한 본원의 항 B7-H3 항체는 비교군으로 사용한 항체인 84D와 비교하여 동일한 농도에서 더 높은 결합력을 나타내어 세포 표면 발현 B7-H3에 대한 결합정도가 더 우수함을 확인하였다.
(6) 항 B7-H3 항체의 마우스유래 암세포의 마우스 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정(FACS)
이어 FACS 분석을 통하여 본원의 항 B7-H3 항체가 세포 표면 발현 마우스 B7-H3에 결합하는 능력을 측정하였다. 실시예 2.3.(3)에서 본원의 항 B7-H3 항체가 인간 B7-H3와 마우스 B7-H3 재조합 단백질에 모두 결합함을 ELISA 법을 통하여 확인하였다. 본원의 항 B7-H3 항체가 마우스 암세포주의 세포 표면에 발현하는 마우스 B7-H3에 결합하는지 여부를 확인하기 위하여 마우스 유래 암세포주인 CT26 (Mus mesculus colon carcinoma, ATCC® CRL-2638TM), B16F10(Mus musculus skin melanoma, ATCC® CRL-6475TM), TC-1(Mus musculus Lung tumor, ATCC® CRL-2493TM)세포주를 사용하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS 버퍼로 세척한 후, 세포수를 계수하여 웰당 2×105 cells로 맞춰 200 ㎕ PBS 넣어 준비한다. 실시예 2.2.의 항 B7-H3 항체 및 비교 항체(84D) 각각을 1% BSA가 포함된 PBS에 10 ㎍/㎖ 농도 또는 10 ㎍/㎖농도로 희석하여 미리 준비해둔 세포와 혼합하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척 후, FITC 표지된 항-human Fc FITC(Sigma, F9512)를 1:500으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 대조군은 FITC 표지된 항-human Fc FITC만 처리하였다. 다시 PBS 버퍼를 이용해 2회 세척 후, FACSCalibur 기기를 이용하여 항-B7-H3 IgG가 결합된 정도를 측정하였다.
각각의 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 인간 B7-H3-단일클론항체-FITC 결합에 의한 이동된 판독 결과를 대조군 결합과 비교하였다. 결과는 도 15에 기재되어 있다. FACS법을 이용한 결합능 측정 결과 본원의 항 B7-H3 항체들은 세포표면에 발현하는 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 3. 이중 항체의 설계 및 제조
1. 항-ROR1/B7-H3 이중항체의 발현 벡터의 클로닝
이중항체는 다음의 방법으로 구성하여 아미노산 서열을 디자인하였다:
IgG-linker-scFv 혹은 IgG-linker-VL-connector-VH.
IgG는 anti-ROR1 항체 혹은 anti-B7-H3 항체이며 IgG1 서브타입 (subtype)으로 구성하였다.
Linker는 IgG1의 CH3 도메인의 C-말단에 바로 연결되는 (G4S)3 [(GGGGS)3]의 서열로 구성하였다.
scFv는 anti-ROR1 항체 혹은 anti-B7-H3 항체를 구성하는 VH, VL 도메인을 connector라 부르는 서열로 연결하여 single chain Fv로 구성하였다. Connector는 (G4S)4 [(GGGGS)4]로 구성되는 20개 길이의 아미노산이며 구성에 따라 VH-connector-VL순으로 VH 도메인이 N-말단에 위치하거나 VL-connector-VH 순으로 VL 도메인이 N-말단에 위치하도록 구성하였다 (표 6).
[표 6]
Figure pat00123
이중항체의 중쇄는 위에 기술한 대로 IgG 중쇄의 C-말단에 scFv를 연결한 구성으로 디자인하였고, 경쇄는 VL-CL의 일반적인 구성으로 디자인하였으며, 약물 접합을 위해 Kabat 149번이나 Kabat 205번 잔기를 시스테인으로 치환한 구성도 추가로 디자인하였다.
scFv는 생체내 안정성을 위해 VH 도메인의 Kabat 44번에 해당하는 잔기와 VL 도메인의 Kabat 100번에 해당되는 잔기 (각각 프레임워크 내 위치)를 시스테인으로 치환하여 intrachain disulfide bond가 형성되도록 하였다.
디자인한 서열은 코돈 최적화를 통해 해당 아미노산을 코딩하는 염기서열을 도출하였고, 유전자합성을 통해 dsDNA를 제작하였다. 제작한 유전자 단편은 제한효소를 사용하거나 HIFI assembly 기법을 이용하여 pcDNA3.4 벡터에 클로닝 하였다.
위에 기술한 시스테인 돌연변이는 DNA 합성시 반영을 하거나 NEB사의 Q5 mutagenesis kit를 이용하여 염기서열을 변경하였다. 또한 A2F2의 경우 번역 후 변형 (post-translational modification)의 방지를 위해 HCDR2 내의 G를 A로 변경한 A2F2M1을 추가로 제작하였다.
제조된 이중항체의 명칭은 사용된 항-ROR1 항체 및 항-B7-H3 항체 클론명을 이용하여 "항-ROR1 항체x항-B7-H3 항체" 또는 "항-ROR1 항체y항-B7-H3 항체"로 표기하였다.
본 실시예에 따라 설계되고 제조된 이중항체의 예시는 아래 표 7a 내지 7h에 나타나 있다.
[표 7]
Figure pat00124
Figure pat00125
Figure pat00126
Figure pat00127
Figure pat00128
Figure pat00129
Figure pat00130
Figure pat00131
Figure pat00132
Figure pat00133
Figure pat00134
Figure pat00135
Figure pat00136
Figure pat00137
Figure pat00138
Figure pat00139
2. 항-ROR1/B7-H3 이중항체의 발현, 정제 및 분석
(1) 이중항체의 발현 및 정제
클로닝된 이중항체는 ExpiCHO 시스템을 이용하여 임시 발현하였으며 제조사의 프로토콜을 따랐다. 항체가 발현된 배양액은 원심분리와 필터를 사용하여 부유물을 제거하였고 MabselectureSure 레진을 이용한 친화크로마토그래피와 Superdex200 레진을 이용한 크기배제크로마토그래피를 이용하여 항체를 정제하였다. 정제한 항체의 순도는 TSKgel SuperSW3000을 이용한 HPLC로 분석하였으며 그 순도는 95% 이상이었다.
(2) 단일항원을 이용한 ELISA-기반 용액 결합시험 (Single antigen capture ELISA, SACE)
96-웰 미세역가 플레이트(NUNC, 446612)를 4℃에서 16시간 동안 PBS 용액 중의 1 μg/ml 농도의 재조합 인간 ROR1 단백질(Sino biological, 13968-H08H) 또는 재조합 인간 B7-H3(Sino biological, 11188-H08H)로 코팅하고, 비특이적 결합은 1% BSA(Bovine Serum Albumin)로 37℃에서 2시간 동안 차단시켰다. 비특이적 결합의 차단 후, 96-웰 미세역가 플레이트에 담긴 내용물을 털어내고 농도에 맞게 희석한 항-ROR1 또는 항-B7-H3 항체를 넣어준 후 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 시킨 후 1XPBST로 5회 세척하였다. HRP(horseradish peroxidase)가 접합된 항-인간 Fab 특이적 염소 다중클론 항체 시약을 희석하여 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 해주고, 96-웰 미세역가 플레이트를 1XPBST로 5회 세척하였다. TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 발색을 진행하고, 0.5 M 황산(삼전순약, S1410)을 이용하여 발색반응을 멈춘 후 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(3) 이중항원을 이용한 ELISA-기반 용액 결합시험 (Dual antigen capture ELISA, DACE)
96-웰 미세역가 플레이트(NUNC, 446612)를 4℃에서 16시간 동안 PBS 용액 중의 1 μg/ml 농도의 재조합 인간 B7-H3 단백질(Sinobiological, 11188-H02H)로 코팅하고, 비특이적 결합은 1% BSA(Bovine Serum Albumin)로 37℃에서 2시간 동안 차단시켰다. 비특이적 결합의 차단 후, 96-웰 미세역가 플레이트에 담긴 내용물을 털어내고, 농도에 맞게 희석한 항-ROR1/B7-H3 항체를 웰에 넣어준 후 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 1XPBST로 5회 세척하였다. 다음으로 1 μg/ml 농도의 재조합 인간 ROR1 단백질(Sino biological, 13968-H08H)을 넣어주고 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션 시킨 후 5회 세척하였다. HRP가 접합된 재조합 His-tag 특이적 쥐 단일클론 항체 시약(Sigma, 11965085001)을 희석하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 해주고, 96-웰 미세역가 플레이트를 1XPBST로 5회 세척하였다. TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 발색을 진행하고, 0.5 M 황산(삼전순약, S1410)을 이용하여 발색반응을 멈춘 후 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(4) 유세포분석시험 (FACS)
Calu-3 세포주는 비특이적 결합의 차단을 위해 1% BSA(Bovine Serum Albumin)로 2회 세척해 준비하였다. 항-B7-H3 및 항-ROR1 항체를 100 nM부터 4배씩 희석하여 처리해 준 후 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션 시키고, 1% BSA로 2회 세척하였다. 항-인간 Fc FITC(Sigma, F9512)를 1:500으로 희석하여 다시 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후 1% BSA로 2회 세척하였다. 세척이 완료된 세포는 1XPBS(pH7.4) 150 로 잘 풀어주고 FACSCalibur(BD Bioscience) 기기를 이용하여 세포의 평균 형광 광도를 측정하는데 이용하였다.
실시예 4. 단독항체와 이중항체의 세포 결합력 비교평가
항-ROR1/B7-H3 이중항체의 세포결합력을 평가하기 위하여, 항-ROR1 단독항체 클론인 A2F2, C2E3 및 BA6와 항-B7-H3 단독항체 클론인 B5를 다양하게 조합하여 실시예 3에 기재된 방법에 따라 이중항체를 제조하였고, ROR1과 B7-H3를 동시에 발현하는 세포들을 사용하여 이중항체의 세포 결합력을 단독항체와 비교평가하였다.
세포 결합력 비교를 위한 세포주로서, ROR1과 B7-H3 유전자를 안정적으로 형질전환(transfection)시켜 ROR1 및 B7-H3 단백질의 발현을 인위적으로 과발현 시킨 CHO-huROR1-huB7H3 세포주를 사용했고 BD LSR Fortessa X-20(BD Biosciences) 기기를 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 과발현 세포주를 해리시키고 PBS로 세척한 후 세포수를 계수하여 V-바닥 96-웰 플레이트(96 Well Plate-RV, Bioneer, 910D09)에 웰 당 20,000개의 세포를 분주하였다. 1% BSA 용액에 100 nM부터 4배씩 희석한 항체를 원심분리한 세포에 웰 당 100 μL씩 주입한 후, 4℃에서 1시간 동안 반응하였다. 1시간 후, 세포를 동일한 버퍼로 2번 세척한 뒤, FITC 표지된 불변 영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG-FITC antibody produced in goat, Sigma, F9512)를 1% BSA에 500배 희석하여 100 μL씩 주입하고 4℃에서 1시간 동안 반응하였다. 반응 후, 세포를 동일한 버퍼에 2번 세척하고 PBS 100 μL에 재현탁시켜 FACS 기기를 이용해 유동 세포 분석을 수행하였다. 측정 당 1만개의 세포가 검출되었고, FlowJo 소프트웨어로 데이터를 분석했다. 그래프의 FOI(Fold of induction) 값은 항체를 처리한 실험군의 MFI(Mean fluorescence intensity)를 이차항체만 처리한 대조군의 MFI 값으로 나누어 표기하였다.
도 16a는 항-ROR1 항체 클론인 A2F2, C2E3 또는 BA6를 항-B7-H3 항체 클론인 B5와 조합하여 각각 제조하되 이중항체 내에서의 항-ROR1 항체와 항-B7-H3 항체의 위치 (IgG form 및 scFv form)를 달리한 이중항체들의 ROR1/B7-H3 과발현 세포주에 대한 결합을 보여주고 있다. 실험에 사용된 모든 이중항체가 단독항체에 비해 더 높은 수준으로 세포에 결합할 수 있음을 보여주고 있다.
도 16b 및 도 16c는 각각 ROR1 단독 과발현 세포주 혹은 B7-H3 단독 과발현 세포주에 대한 이중항체의 결합력을 보여주고 있다. 시험된 이중항체들은 모두 ROR1 또는 B7-H3 과발현 세포주에 대해서 단독항체들에 대해 우수하거나 동등 이상의 결합력을 나타내었다. 이로부터 본 발명의 이중항체들이 더욱 우수한 결합력을 보이는 것은 단순히 2종의 항원을 동시에 타겟하기 때문만이 아니라 이중항체 자체가 우수한 물성을 가지기 때문임을 확인할 수 있었다. 또한, 이와 같이 향상된 결합능은 단일 표적(항원) 발현 세포와 대비하여 두 개의 표적(항원)이 동시에 발현하는 세포에 대한 선택성을 보여주는 것으로 해석할 수 있어, 종양치료법 고안에 있어 중요한 요소인 선택성에 의한 독성 감소, 효력증가라는 목표에 부합하는 특징이 될 수 있을 것이다.
실시예 5. 단독항체와 이중항체의 항체매개 세포독성 (ADCC, Antibody-derived cell cytotoxicity) 확인
이중항체의 향상된 결합능과 선택능이 약리적 효과의 개선으로 실제로 이어지는지 평가하기 위해, 이중항체와 각각의 단독항체의 ADCC 유도 능력을 비교평가하였다.
프로메가의 ADCC Bioassay Effector Cell (G7102)을 사용하여 표적세포에의 항체결합에 따른 작용세포에서의 FcgRIIIA에 의한 신호 유도능을 평가하였다. 구체적으로, ROR1 및 B7-H3을 모두 과발현하는 CHO-huROR1-huB7H3 세포주를 96-웰 백색 편평 바닥 플레이트(96-well Solid White Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Corning, 3917)에 웰 당 15,000개 세포를 분주하여 20-24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 배양 후, 웰 플레이트에서 배지를 제거하고 25 μL의 0.5% low IgG를 첨가한 RPMI 배지 버퍼와 360 nM(최종 농도는 120 nM)부터 4배씩 희석하여 준비한 항체 25 μL를 첨가하였다. 권장 조건 하에서 배양한 효과기 세포 (ADCC Bioassay effector cells, Promega, G7102)를 표적세포와 항체가 포함된 웰에 웰 당 150,000개씩 25 μL 부피로 첨가하여 배양기에서 16-24 시간을 배양하였다. 배양 후, 96-웰 플레이트를 배양기에서 꺼내 상온에 15분 정도 두고, 75 μL의 Bio-GloTM 버퍼 (Promega, G7940)를 각 웰(1:1 부피비)에 첨가하였다. 발광 플레이트 리더(PHERAstar FS, BMG LABTECH)를 사용하여 발광을 측정하였다. 그래프의 FOI 값은 항체를 처리한 실험군의 발광신호를 항체를 처리하지 않은 대조군의 신호로 나누어 표기하였다.
그 결과, 본 발명의 이중항체는 단독항체에 향상된 ADCC 신호유도능을 가진다는 사실을 확인하였다 (도 17a 및 도 17b). 즉, ROR1/B7-H3 과발현 세포주에서 A2F2xB5 항체 및 BA6yB5항체는 상응하는 단독항체(B5, BA6, A2F2)에 비해 더 큰 폭으로 ADCC 신호를 유도하였다. 특히, B5 항체 대비 A2F2xB5 항체는 IC50 가 약 6.7배 감소하였음을 확인하였다 (표 8).
[표 8]
Figure pat00140
실시예 6. ADC의 제조
1. 화합물 1과 2의 제조
Figure pat00141
,
Figure pat00142
상기 화합물 1과 2는 대한민국 공개특허 제10-2018-0110645호에 기재된 방법으로 제조하였다.
2. 화합물 3의 제조
Figure pat00143
상기 화합물 3은 국제 공개특허 제WO2017-089895호에 기재된 방법으로 제조하였다. 상기 화합물에서 MMAE의 구조는 다음과 같다:
Figure pat00144
3. ADC의 제조
ADC의 제조는 다음의 두 단계를 거쳐 제조되었으며, 공통적으로 사용한 LCB14-0512 및 LCB14-0606은 대한민국 공개특허 제10-2014-0035393호에 기재된 방법으로 제조하였다. LCB14-0512와 LCB14-0606의 구조식은 다음과 같다:
Figure pat00145
1단계 : 프레닐화 항체의 제조
항체의 프레닐레이션 (prenylation) 반응은 24 μM 항체, 200 nM FTase와 0.100 mM 혹은 0.250 mM isoprenoid (LCB14-0512 혹은 0606)를 포함하는 완충용액 {50 mM Tris-HCl, (pH 7.4), 5 mM MgCl2, 10 μM ZnCl2, 0.250 mM DTT}의 반응 혼합물을 이용하였다. 30 ℃에서 4 시간 혹은 16 시간 반응 후 프레닐레이션된 항체는 PBS 완충용액으로 평형화된 G25 Sepharose 컬럼 (AKTA purifier, GE healthcare)으로 제염시켰다.
2단계 : 약물 컨쥬게이선 반응
옥심 결합반응을 이용한 ADC는 100 mM 아세트산 나트륨 (NaOAc) 완충용액 (pH 5.2), 10% DMSO, 24 μM 프레닐레이션된 항체와 240 μM 링커-약물을 섞어서 반응 혼합물을 제조하고 30℃에서 약하게 교반하였다. 6 시간 또는 24 시간 반응 후에 G25 Sepharose 컬럼으로 과량의 저분자 화합물을 제거하고 단백질 분획은 수집하여 농축하였다.
Copper-free 클릭 (click) 결합반응을 이용한 ADC는 PBS 완충용액 (pH 7.4), 1% DMSO, 24 μM 프레닐레이션 항체와 120 μM 링커-약물을 섞어서 반응 혼합물을 제조하고 25℃에서 6 시간 반응 후에 azide functional group을 첨가하여 반응을 종료하였다. G25 Sepharose 컬럼으로 과량의 저분자 화합물을 제거하고 단백질 분획은 수집하여 농축하였다.
[표 9] ADC 제조 목록
Figure pat00146
4. in vitro 효능 평가
상기 실시예 6.3에서 제조한 ADC (표 9)의 다양한 암세포주에 대한 세포증식억제 활성을 측정하였다. 이를 위해 시판 중인 인간암세포주 (Calu-3, Calu-6, HCC1954, NCI-N87 및 MDA-MB-231)와 인간 ROR1과 B7H3를 과발현하는 CHO 세포주 (CHO-ROR1-B7H3), ROR1만을 과발현하는 CHO 세포주(CHO-ROR1) 및 B7H3를 과발현하는 mouse 세포주 (MC38-B7H3)를 사용하였다. 96-웰 플레이트에 각 암세포주를 웰(well)당 4,000~5,000개씩 접종(seeding)하여 24시간 동안 배양한 뒤에 ADC를 0.0015~10.0 nM (3배 연속 희석) 농도로 처리하였다. 120시간 뒤에 살아있는 세포수를 WST-8 (Dojindo molecular technology inc.) kit를 사용하여 평가하였다. 세포의 대상 활동에 의해 환원된 물질의 양에 의한 흡광도와 ADC 농도간 반응곡선을 4PL 커브 피팅을로 50%의 세포사멸을 보이는 IC50 값 (pM)을 도출하였다.
결과는 하기 표 10 및 표 11에 나타내었다.
대조물질로 사용한 B7H3 단독항체 ADC인 ADC1이 암세포에서 세포 증식 억제능이 매우 뛰어났으며, 또 다른 대조 물질인 ROR1 단독항체 ADC인 ADC2와 ADC3은 ADC1에 비해 현저히 낮은 세포 증식 억제 활성을 보였다. 그러나 anti-ROR1xB7H3 이중항체로 제조한 ADC4, ADC5, ADC6 및 ADC7은 ROR1과 B7H3 항원이 모두 발현하는 암세포주에서 B7H3 단독항체 ADC인 ADC1보다는 약하나, ROR1 단독항체 ADC인 ADC2 및 ADC3보다 현저히 증가한 세포 독성을 보였다. 또한 이중항체 ADC들, 즉, ADC4, ADC5, ADC6 및 ADC7은 대조물질 ADC1과 ADC2, 혹은 ADC1과 ADC3을 1:1로 혼합하여 처리한 단독항체 ADC의 병용 투여군보다 낮은 세포 증식 억제 활성을 보였으나, 이는 ADC의 DAR 차이에 기인한 것으로 추정한다. 실험에 사용한 대조물질용 단독항체 ADC는 모두 DAR2이나, 이중항체 ADC는 DAR1이다.
또한 ROR1 항원과 B7H3 항원을 과발현 시킨 세포주와 각각의 항원을 하나만 과발현 시킨 세포주에서의 세포 증식 억제 활성을 확인하고 이 값을 이용하여 치료계수 (TI; therapeutic index)를 도출하였다. 이중항체 ADC들은 두가지 항체를 모두 발현하는 세포주에서는 DAR1임에도 단독항체 ADC들과 유사한 세포 증식 억제 활성을 나타냈으며, ROR1 과발현 세포주에서는 B7H3 단독항체보다 효능이 현저히 개선되었으며 B7H3 과발현 세포주에서는 ROR1 단독항체보다 효능이 현저히 개선됨을 확인하였다. 각각의 IC50를 기반으로 TI를 비교하였을 때, 이중항체 ADC들이 모두 DAR1임에도 불구하고 14배에서 43배 증가하였다. 이러한 결과는 이중항체 ADC가 단독항체에 비해 효능과 독성 측면에서 우수한 조합으로 기대된다.
선행 실험에서 ROR1 단독항체 ADC의 경우 여러 암세포에서 다른 종양 특이적인 항원들에 비해 발현이 낮아서 효능이 미미한 사례가 다수 확인되었으며, B7H3 단독항체 ADC는 다양한 암세포에서 발현이 높아 효능이 우수 하나 정상세포에서도 발현이 확인되어, 동물 실험에서 MTD (Maximum Tolerated Dose; 최대허용용량)가 매우 낮은 것으로 확인됨에 따라 B7H3를 타겟으로 하는 ADC, 특히, 상대적으로 세포독성이 강한 약물을 탑재한 ADC의 경우, 암세포에 대한 증식 억제 활성을 높이는 것보다는 정상 세포에 대한 독성을 낮추는 것이 더 중요한 과제임을 알 수 있다. 본 발명에 의해 제조된 이중항체 ADC는 ROR1 단독항체보다 세포 증식 억제 활성을 증가시키고 B7H3 유래 세포 독성을 낮출 수 있는 조합으로 기대된다.
[표 10] ADC의 효능 평가 (1)
Figure pat00147
[표 11] ADCdml 효능평가 (2)
Figure pat00148
이상으로 본 발명에 대한 내용을 상세히 기술하였는 바, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 일 예이며, 이에 의해 본 발명의 청구범위가 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> ABL Bio Inc. Legochem Biosciences, Inc. <120> ROR1 and B7-H3 binding antibody-drug conjugate and use thereof <130> KP2160232-LEGC <160> 88 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 2 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 3 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 4 Ser Ile Ser His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 5 Ser Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 6 Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 7 Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 8 Phe Ile Ser Ala Arg Lys Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Ser Asn Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 9 Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 10 Gly Gly Asn Gly Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 11 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 12 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 13 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 14 Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 15 Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 16 Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 17 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 18 Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 19 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 20 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Ile Ser Ala Arg Lys Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Ser Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 21 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Gly Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 24 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 25 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 25 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 26 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 26 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 27 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH coding Sequence <400> 27 gaggtgcagc tgctggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgtcctcc atctcccaca actccggctc cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagttcatc 300 tccgcccgga agtccctggg ccggtcctac tccaacggca tggacgtgtg gggccagggc 360 accctggtga ccgtgtcctc cgcctccacc aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc 420 tcctccaagt ccacctccgg cggcaccgcc gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc 480 cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactcc ggcgccctga cctccggcgt gcacaccttc 540 cccgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccctcc 600 tcctccctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag 660 gtggacaaga aggtggagcc caagtcctgc gacaagaccc acacctgccc tccctgcccc 720 gcccccgagc tgctgggcgg cccctccgtg ttcctgttcc ctcctaagcc caaggacacc 780 ctgatgatct cccggacccc cgaggtgact tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac 840 cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag 900 ccccgggagg agcagtacaa ctccacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 960 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgcc 1020 cccatcgaga agaccatctc caaggccaag ggccagcccc gggagcccca ggtgtacacc 1080 ctgcccccct cccgggagga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 1140 ggcttctacc cctccgacat cgccgtggag tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac 1200 tacaagacca ccccccccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctgta ctccaagctg 1260 accgtggaca agtcccggtg gcagcagggc aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag 1320 gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgtccctgt cccccggcaa g 1371 <210> 28 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL coding Sequence <400> 28 cagtccgtgc tgacccagcc cccctccgcc tccggcaccc ccggccagcg ggtgaccatc 60 tcctgcaccg gctcctcctc caacatcggc tccaacgacg tgacctggta ccagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac gccgactcca agcggccctc cggcgtgccc 180 gaccggttct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggcctgcgg 240 tccgaggacg aggccgacta ctactgcggc acctgggact actccctgtc cggctacgtg 300 ttcggcggcg gcaccaagct gaccgtgctg ggccagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcc 648 <210> 29 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH coding Sequence <400> 29 gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc gactactaca tgtcctgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctcccccg acggctccaa cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagaacctg 300 cgggccttcg actactgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgtcctccgc ctccaccaag 360 ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 720 ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga ggtgacttgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggagc agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagccccggg agccccaggt gtacaccctg cccccctccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtccc ccggcaag 1338 <210> 30 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL coding Sequence <400> 30 cagtctgtgc tgacccagcc tccccctgct tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcctgctccg gctcctcctc caacatcggc tccaacaccg tgtactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac gccaactccc agcggccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggcctgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcggc tcctgggact actccctgtc cggctacgtg 300 ttcggcggag gcaccaagct gaccgtgctg ggccagccta aggccgctcc ctccgtgacc 360 ctgttccccc catcctccga ggaactgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 420 tccgacttct accctggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagctc tcctgtgaag 480 gccggcgtgg aaaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctacagctg ccaggtcaca 600 cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtg gcccctgccg agtgctcc 648 <210> 31 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH coding Sequence <400> 31 gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc gactactaca tgtcctgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctcccccg acgcctccaa cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagaacctg 300 cgggccttcg actactgggg ccagggcaca ctggtgaccg tgtcctccgc ctccaccaag 360 ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 720 ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga ggtgacttgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggagc agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagccccggg agccccaggt gtacaccctg cccccctccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtccc ccggcaag 1338 <210> 32 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH coding Sequence <400> 32 gaggtgcagc tgctggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacgaca tgtcctgggt gcggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccgcc atctaccact ccggctcctc caagtactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggggcggc 300 aacggcgcct gggacaccgg cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 360 tccgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc cctcctccaa gtccacctcc 420 ggcggcaccg ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 tcctggaact ccggcgccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagtcc 540 tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct cctcctccct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 720 ggcccctccg tgttcctgtt ccctcctaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780 cccgaggtga cttgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accccgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 900 aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 1020 tccaaggcca agggccagcc ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta cccctccgac 1140 atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtccct gtcccccggc aag 1353 <210> 33 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL coding Sequence <400> 33 cagtccgtgc tgacccagcc cccctccgcc tccggcaccc ccggccagcg ggtgaccatc 60 tcctgctccg gctcctcctc caacatcggc tccaacgacg tgtcctggta ccagcagctg 120 cccggcaccg cccccaagct gctgatctac tacgacaaca accggccctc cggcgtgccc 180 gaccggttct ccggctccaa gtccggcacc tccgcctccc tggccatctc cggcctgcgg 240 tccgaggacg aggccgacta ctactgcggc gcctgggacg actccctgtc cggctacgtg 300 ttcggcggcg gcaccaagct gaccgtgctg ggccagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcc 648 <210> 34 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Constant Region <400> 34 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Constant Region <400> 35 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 36 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Constant Region <400> 36 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 37 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Ile Ser Ala Arg Lys Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Ser Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 38 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 38 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 39 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC <400> 39 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Ile Ser Ala Arg Lys Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Ser Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 40 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 40 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 41 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 41 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 42 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 43 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 44 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC <400> 44 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 45 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 45 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 46 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 46 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 47 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 47 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 49 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC <400> 49 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 50 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 50 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 51 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 51 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 52 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 52 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Gly Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 53 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 54 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC <400> 54 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Gly Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 55 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 55 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 56 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 56 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 57 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 58 Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 59 Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr 1 5 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 60 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 61 Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 62 Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu Asn Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 63 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 63 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 64 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 65 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Constant Region <400> 65 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 66 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Constant Region <400> 66 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 67 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Constant Region <400> 67 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 68 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Constant Region Coding Sequence <400> 68 gcttctacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggt 60 ggaaccgctg ctctgggctg cctggtcaag gattactttc ctgagcctgt gaccgtgtct 120 tggaactccg gtgctctgac atctggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtcctct 180 ggcctgtact ctctgtcctc tgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 300 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcca ccatgtcctg ctccagaact gctcggcggt 360 ccctccgttt tcctgtttcc acctaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 420 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 480 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 540 tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 600 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatctcc 660 aaggctaagg gccagcctcg ggaacctcaa gtgtacacct tgccaccttc cagagaagag 720 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ttccgatatc 780 gccgtggaat gggagtctaa cggccagcca gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 840 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtctcggtgg 900 cagcagggca acgtgttctc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960 cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa tga 993 <210> 69 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Constant Region Coding Sequence <400> 69 caacctaagg ccgctcctag cgtgaccctg tttcctccat cttctgagga actgcaggcc 60 aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctct gacttttacc ctggcgctgt gaccgtggcc 120 tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag 180 tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcttgcca agtgacccat gagggctcca ccgtggaaaa gacagtggcc 300 cctgctgagt gctcttga 318 <210> 70 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length heavy chain <400> 70 gaagttcagc tgttggaatc tggcggcgga ttggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctctggctt caccttctcc gactacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtcctcc atctcttccg gctccggctc tatctactac 180 gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagaatctg 300 atccctctgg actattgggg ccagggcaca ctggttaccg tgtcctctgc ttctaccaag 360 ggaccctctg tgttccctct ggctccttcc agcaagtcta cctctggtgg aaccgctgct 420 ctgggctgcc tggtcaagga ttactttcct gagcctgtga ccgtgtcttg gaactccggt 480 gctctgacat ctggcgtgca cacctttcca gctgtgctgc agtcctctgg cctgtactct 540 ctgtcctctg tcgtgaccgt gccttctagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagaagg tggaacccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgtccacc atgtcctgct ccagaactgc tcggcggtcc ctccgttttc 720 ctgtttccac ctaagcctaa ggacaccctg atgatctctc ggacccctga agtgacctgc 780 gtggtggtgg atgtgtctca cgaggatccc gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 840 gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctacaga 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct atcgaaaaga ccatctccaa ggctaagggc 1020 cagcctcggg aacctcaagt gtacaccttg ccaccttcca gagaagagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct cgtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg 1140 gagtctaacg gccagccaga gaacaactac aagacaaccc ctcctgtgct ggactccgac 1200 ggctcattct tcctgtactc caagctgaca gtggacaagt ctcggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gttctgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tctctgtccc ctggcaaatg a 1341 <210> 71 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length light chain <400> 71 cagtctgttc tgactcagcc tccttctgct tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgttccg gctcctcctc caacatcggc tctaacgccg tgtcctggta tcagcagttg 120 cctggcacag cccctaagct gctgatctac tacaactctc acagaccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ctggctctaa gtctggcacc tccgccagcc tggctatctc tggactgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcggc tcttgggatg cctctctgaa cgcttatgtg 300 ttcggcggag gcaccaagct gacagtgttg ggacaaccta aggccgctcc tagcgtgacc 360 ctgtttcctc catcttctga ggaactgcag gccaacaagg ctaccctcgt gtgcctgatc 420 tctgactttt accctggcgc tgtgaccgtg gcctggaagg ctgatagttc tcctgtgaag 480 gccggcgtgg aaaccaccac accttccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 540 tacctgtctc tgacccctga acagtggaag tcccaccggt cctactcttg ccaagtgacc 600 catgagggct ccaccgtgga aaagacagtg gcccctgctg agtgctcttg a 651 <210> 72 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B5-HC <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Glu 435 440 445 Gln Ile Asp Asn 450 <210> 73 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B5 LC <400> 73 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Ser Glu Gln Ile Asp Asn 210 215 220 <210> 74 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B5_K149C LC <400> 74 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Cys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Ser Glu Gln Ile Asp Asn 210 215 220 <210> 75 <211> 718 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 75 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Ile Ser Ala Arg Lys Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Ser Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 465 470 475 480 Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly 485 490 495 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu 500 505 510 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro 515 520 525 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala 530 535 540 Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 545 550 555 560 Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly 565 570 575 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 595 600 605 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 610 615 620 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg 625 630 635 640 Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Gly 645 650 655 Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 660 665 670 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 675 680 685 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Leu Ile Pro 690 695 700 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 76 <211> 718 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 76 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 450 455 460 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 465 470 475 480 Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Thr 485 490 495 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 500 505 510 Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 515 520 525 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 530 535 540 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr 545 550 555 560 Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 610 615 620 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser 625 630 635 640 Ser Ile Ser His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 645 650 655 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 660 665 670 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 675 680 685 Lys Phe Ile Ser Ala Arg Lys Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Ser Asn Gly 690 695 700 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 77 <211> 712 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 77 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Gly Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro 465 470 475 480 Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly 485 490 495 Ser Asn Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys 500 505 510 Leu Leu Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg 515 520 525 Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly 530 535 540 Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala 545 550 555 560 Ser Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 595 600 605 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 610 615 620 Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys 625 630 635 640 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr 645 650 655 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 660 665 670 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 675 680 685 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 690 695 700 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 <210> 78 <211> 712 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 78 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 450 455 460 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 465 470 475 480 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Ser 485 490 495 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr 500 505 510 Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 515 520 525 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 530 535 540 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr 545 550 555 560 Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp 610 615 620 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser 625 630 635 640 Ala Ile Tyr His Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 645 650 655 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 660 665 670 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 675 680 685 Arg Gly Gly Asn Gly Ala Trp Asp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 690 695 700 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 <210> 79 <211> 707 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 79 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 450 455 460 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 465 470 475 480 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser 485 490 495 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr 500 505 510 Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 515 520 525 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 530 535 540 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala 610 615 620 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser 625 630 635 640 Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 645 650 655 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 660 665 670 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 675 680 685 Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 690 695 700 Val Ser Ser 705 <210> 80 <211> 707 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 80 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 450 455 460 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 465 470 475 480 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Tyr 485 490 495 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 500 505 510 Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 515 520 525 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 530 535 540 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr 545 550 555 560 Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 610 615 620 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser 625 630 635 640 Ser Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 645 650 655 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 660 665 670 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 675 680 685 Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 690 695 700 Val Ser Ser 705 <210> 81 <211> 707 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 81 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 450 455 460 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 465 470 475 480 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser 485 490 495 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr 500 505 510 Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 515 520 525 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 530 535 540 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala 610 615 620 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser 625 630 635 640 Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 645 650 655 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 660 665 670 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 675 680 685 Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 690 695 700 Val Ser Ser 705 <210> 82 <211> 707 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsAb <400> 82 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val 450 455 460 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 465 470 475 480 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Tyr 485 490 495 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 500 505 510 Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 515 520 525 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 530 535 540 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr 545 550 555 560 Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 595 600 605 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 610 615 620 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser 625 630 635 640 Ser Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 645 650 655 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 660 665 670 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 675 680 685 Lys Asn Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 690 695 700 Val Ser Ser 705 <210> 83 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 83 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ile Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 84 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 85 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding VH <400> 85 gaagttcagc tgttggaatc tggcggcgga ttggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctctggctt caccttctcc gactacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgtcctcc atctcttccg gctccggctc tatctactac 180 gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagaatctg 300 atccctctgg actattgggg ccagggcaca ctggttaccg tgtcctctgc ttctaccaag 360 ggaccctctg tgttccctct ggctccttcc agcaagtcta cctctggtgg aaccgctgct 420 ctgggctgcc tggtcaagga ttactttcct gagcctgtga ccgtgtcttg gaactccggt 480 gctctgacat ctggcgtgca cacctttcca gctgtgctgc agtcctctgg cctgtactct 540 ctgtcctctg tcgtgaccgt gccttctagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagaagg tggaacccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgtccacc atgtcctgct ccagaactgc tcggcggtcc ctccgttttc 720 ctgtttccac ctaagcctaa ggacaccctg atgatctctc ggacccctga agtgacctgc 780 gtggtggtgg atgtgtctca cgaggatccc gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 840 gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctacaga 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct atcgaaaaga ccatctccaa ggctaagggc 1020 cagcctcggg aacctcaagt gtacaccttg ccaccttcca gagaagagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct cgtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg 1140 gagtctaacg gccagccaga gaacaactac aagacaaccc ctcctgtgct ggactccgac 1200 ggctcattct tcctgtactc caagctgaca gtggacaagt ctcggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gttctgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tctctgtccc ctggcaaatg a 1341 <210> 86 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding VL <400> 86 cagtctgttc tgactcagcc tccttctgct tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgttccg gctcctcctc caacatcggc tctaacgccg tgtcctggta tcagcagttg 120 cctggcacag cccctaagct gctgatctac tacaactctc acagaccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ctggctctaa gtctggcacc tccgccagcc tggctatctc tggactgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcggc tcttgggatg cctctctgaa cgcttatgtg 300 ttcggcggag gcaccaagct gacagtgttg ggacaaccta aggccgctcc tagcgtgacc 360 ctgtttcctc catcttctga ggaactgcag gccaacaagg ctaccctcgt gtgcctgatc 420 tctgactttt accctggcgc tgtgaccgtg gcctggaagg ctgatagttc tcctgtgaag 480 gccggcgtgg aaaccaccac accttccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 540 tacctgtctc tgacccctga acagtggaag tcccaccggt cctactcttg ccaagtgacc 600 catgagggct ccaccgtgga aaagacagtg gcccctgctg agtgctcttg a 651 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 87 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 88 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 88 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (81)

  1. 일반식 I의 구조를 갖는 접합체:
    [일반식 I]
    Ab - (X)y,
    상기 식에서,
    Ab는 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
    상기 X는 독립적으로 하나 이상의 활성제 및 링커를 포함하는 화학적 잔기이며,
    상기 링커는 항체와 활성제를 연결하고, 및
    상기 y는 1 내지 20의 정수이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ROR1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 것인, 접합체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 제1 도메인은
    서열번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1; 서열번호 4 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2; 서열번호 8 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 11 내지 13으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 LCDR1; 서열번호 14 내지 16으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2; 서열번호 17 내지 19로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고,
    상기 제 2 도메인은
    서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1; 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2; 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 접합체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 제1 도메인은
    서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR2, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3; 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR2, 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 접합체.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 제1 도메인은
    서열번호 20 내지 23, 37, 42, 47, 52로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 24 내지 26, 38, 43, 48, 53으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고,
    상기 제2 도메인은
    서열번호 63 또는 83의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 64 또는 84의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 접합체.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 제1 도메인 또는 제2 도메인은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커를 통해 연결되는 것인, 접합체.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 제1 도메인 또는 제2 도메인은 Fc 영역을 더 포함하는 것인, 접합체.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ROR1 및 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 항체, 단쇄 항체, 단쇄 Fv (scFv), Fab, F(ab') 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 접합체.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 링커는 일반식 Ⅱ의 구조를 갖는 것인, 접합체:
    [일반식 Ⅱ]
    Figure pat00149

    상기 식에서,
    * 표시는 활성제와 연결되는 부위를 나타내며;
    G는 글루쿠론산 모이어티(glucuronic acid moiety) 또는
    Figure pat00150
    이고, 상기 R3은 수소 또는 카복실 보호기이며, 상기 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬 또는 C3-8 사이클로알킬이며;
    W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO2NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- 또는 -PO2NR'-이고, 상기 C, S 또는 P는 직접적으로 페닐링(phenyl ring)에 결합하며, 상기 R' 및 R''는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 다이- C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴 또는 C6-20아릴인 화합물이고;
    Z는 독립적으로 C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로이며;
    n은 0 내지 3의 정수이고;
    L은 제1 유닛 및 제2 유닛으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유닛, 또는 이들 유닛의 조합이고,
    여기에서 제2 유닛은 W와 Rz를, W와 제1 유닛을, 또는 제1 유닛과 또 다른 제1 유닛을 연결하고, 여기에서 제1 유닛은 제2 유닛과 W를, 또는 제2 유닛과 또 다른 제2 유닛을 연결하며,
    제2 유닛은
    Figure pat00151
    ,
    Figure pat00152
    ,
    Figure pat00153
    ,
    Figure pat00154
    , -(CH2CH2V)t-, -(CH2)t(V(CH2)u)v-, 또는 이들의 조합이고,
    여기에서 L1은 단일결합 또는 C2-30알케닐이며, R11은 H 또는 C1-10알킬이고, L2는 C2-30알케닐이며;
    여기에서, t는 0 내지 10의 정수이고, u는 0 내지 12의 정수이며, v는 1 내지 20의 정수이고, V는 단일결합, -O-, 또는 -S-이며,
    제1 유닛은 C2-100알케닐, 친수성(hydrophilic) 아미노산, -C(=O)-, -C(=O)NRv-, -C(=O)O-, -(CH2)n1-NHC(=O)-(CH2)n2-, -(CH2)n3-C(=O)NH-(CH2)n4-, -(CH2)n1-NHC(=O)-(CH2)n2-C(=O)-, -(CH2)n3-C(=O)NH-(CH2)n4-C(=O)-, -S(=O)2NRv-, -P(=O)RwNRv-, -S(=O)NRv-, 및 -P(=O)2NRv- 로 구성된 군으로부터 선택되고,
    여기에서, 제1 유닛이 C2-100알케닐인 경우, 알케닐의 탄소 원자는 하나 또는 그 이상의 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 헤테로원자로 치환될 수 있으며, 알케닐은 하나 또는 그 이상의 C1-20알킬로 더 치환될 수 있으며,
    여기에서, Rv 및 Rw는 각각 독립적으로 H, C1-8알킬, C3-8사이클로알킬, C1-8알콕시, C1-8알킬티오, 모노- 또는 다이-C1-8알킬아미노, C3-20헤테로아릴 또는 C5-20아릴이며,
    n1, n2, n3 및 n4는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고,
    Rz는 -O-NH2, -NH2, N3, 치환되거나 비치환된 C1-12알킬, C1-12 알키닐, C1-3알콕시, 치환되거나 비치환된 3 내지 20-원 헤테로아릴, 3 내지 20-원 헤테로사이클릴, 치환되거나 비치환된 C5-20아릴, 또는
    Figure pat00155
    이고,
    여기에서, Rz′은 N 또는 CH이며,
    여기에서 치환되는 경우, 하나 이상의 수소원자가 각각 독립적으로 OH, =O, 할로, C1-6알킬, C1-6알콕시, C2-6알케닐, 옥시, 카르복시, C1-6알콕시카르보닐, C1-6알킬카르보닐, 포르밀, C3-8아릴, C5-12아릴옥시, C5-12아릴카르보닐 또는 C3-6헤테로아릴로 치환된다.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 G는
    Figure pat00156
    이고, 상기 R3은 수소 또는 카복실 보호기이며, 상기 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기인 것인, 접합체.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 R3은 수소이고, 상기 각각의 R4는 수소인 것인, 접합체.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 수소인 것인, 접합체.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 Z는 독립적으로 C1-8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로인 것인, 접합체.
  14. 제 9항에 있어서, 상기 n은 0인 것인, 접합체.
  15. 제 9항에 있어서, 상기 W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO2NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- 또는 -PO2NR'-이고, 상기 C, S 또는 P는 직접적으로 페닐링(phenyl ring)에 결합하며, 상기 R' 및 R''는 각각 독립적으로 수소, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, 모노- 또는 다이- C1-8 알킬아미노, C3-20 헤테로아릴 또는 C6-20아릴인 것인, 접합체.
  16. 제 9항에 있어서, 상기 W는 -C(O)-, -C(O)NR'- 또는 -C(O)O-인 것인, 접합체.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 W는 -C(O)NR'-이고, 상기 -C(O)-는 페닐링에 결합하며, NR'은 L에 결합하는 것인, 접합체.
  18. 제 9항에 있어서, 상기 G는
    Figure pat00157
    이고,
    W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 C(O)는 페닐링에 결합하고, NR'은 L에 결합하며, R1 및 R2는 수소인 것인, 접합체.
  19. 제 9항에 있어서, 상기 L은 C1-50 알킬렌 또는 1-50 원자 헤테로알킬렌이며, 하기 중 하나 이상을 만족하는 것인, 접합체:
    (i) L은 하나 이상의 불포화 결합을 포함하고;
    (ii) L 내의 2개의 원자가 치환체와 같은 2가 치환체로 치환되고; 이는 헤테로아릴렌(heteroarylene)을 완성시키며
    (iii) L은 1 내지 50 원자 헤테로알킬렌이고; 및
    (iv) 상기 알킬렌은 하나 이상의 C1-20 알킬로 치환된다.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 L은 질소 함유 1-50 원자 헤테로 알킬렌이고, 상기 링커는 친수성 아미노산의 2 이상의 원자를 포함하며, 상기 질소는 친수성 아미노산의 카르보닐과 펩타이드 결합을 형성하는 것인, 접합체.
  21. 제 9항에 있어서, 상기 W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 W의 질소는 친수성 아미노산의 질소 원자인 것인, 접합체.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 프롤린, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 접합체.
  23. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 수용액에서 중성 pH에서 전하를 나타내는 모이어티(moiety)를 갖는 측쇄를 포함하는 아미노산인 것인, 접합체.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 아스파테이트, 글루타메이트, 오르니틴, 라이신 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 접합체.
  25. 제 9항에 있어서, 상기 W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 W의 질소는 펩타이드의 N-말단 아미노산의 질소 원자인 것인, 접합체.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 펩타이드는 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 것인, 접합체.
  27. 제 9항에 있어서, 상기 Ab는 최소 하나 이상의 이소프레닐 유닛을 추가로 함유하고, Ab의 이소프레닐 유닛은 티오에테르 결합에 의해 Ab와 공유 결합하고, 상기 티오에테르 결합은 Ab의 시스테인의 황원자를 포함하는 것인, 접합체.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 Ab는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 Ab의 C-말단에 아미노산 모티프를 포함하고, 상기 티오에테르 결합은 상기 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함하는 것인, 접합체.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고,
    C가 시스테인이고,
    Y가 지방족 아미노산이고,
    X가 글루타민, 글루타메이트, 세린, 시스테인, 메티오닌, 알라닌 및 루신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며; 및
    상기 티오에테르 결합은 상기 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함하는 것인, 접합체.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고,
    Y가 알라닌, 이소루이신, 류신, 메티오닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 접합체.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 아미노산 모티프는 CVIM 또는 CVLL 서열인 것인, 접합체.
  32. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 모티프에 선행하는 7 개의 아미노산 중 적어도 하나가 글리신인 것인, 접합체.
  33. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 모티프에 선행하는 7 개의 아미노산 중 적어도 세 개가 글리신, 프롤린, 아스파르트산, 아르기닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 접합체.
  34. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 모티프에 선행하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산은 각각 글리신인 것인, 접합체.
  35. 제 9항에 있어서, 상기 Ab는 아미노산 서열 GGGGGGGCVIM을 포함하는 것인, 접합체.
  36. 제 9항에 있어서, 상기 Ab는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 하기 일반식 Ⅲ의 이소프레닐 유도체 유닛을 적어도 하나 이상 포함하는 것인, 접합체:
    [일반식 Ⅲ]
    Figure pat00158
    .
  37. 제 9항에 있어서, 상기 L은 일반식 VIII 또는 일반식 IX로 표시되는 제2 유닛을 포함하는 것인, 접합체:
    [일반식 VIII]
    -(CH2)r(V(CH2)p)q-
    [일반식 IX]
    -(CH2CH2X)w-
    상기 V는 단일결합, -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2- 또는 -SO2NR25-이고;
    X는 -O-, C1-8 알킬렌 또는 -NR21-이며;
    R21 내지 R25는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알킬-C6-20 아릴 또는 C1-6 알킬-C3-20 헤테로아릴이고;
    r은 0 내지 10의 정수이며;
    p는 0 내지 10의 정수이고;
    q는 1 내지 20의 정수이며; 및
    w는 1 내지 20의 정수이다.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 q는 4 내지 20의 정수인 것인, 접합체.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 q는 2 내지 12의 정수인 것인, 접합체.
  40. 제 37항에 있어서, 상기 q는 2, 5 또는 11의 정수인 것인, 접합체.
  41. 제 37항에 있어서, 상기 r은 2의 정수인 것인, 접합체.
  42. 제 37항에 있어서, 상기 p은 2의 정수인 것인, 접합체.
  43. 제 37항에 있어서, 상기 V는 -O-인 것인, 접합체.
  44. 제 37항에 있어서, 상기 X는 -O-인 것인, 접합체.
  45. 제 37항에 있어서, 상기 w는 6 내지 20의 정수인 것인, 접합체.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 L은
    Figure pat00159
    또는
    Figure pat00160
    로 표시되는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는 것인, 접합체.
  47. 제 45항에 있어서, 상기 L은 1 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것인, 접합체.
  48. 제 45항에 있어서, 상기 L은 3 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것인, 접합체.
  49. 제 45항에 있어서, 상기 L은 5 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것인, 접합체.
  50. 제 45항에 있어서, 상기 L은 6 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것인, 접합체.
  51. 제 45항에 있어서, 상기 L은 3 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것인, 접합체.
  52. 제 9항에 있어서, 상기 L은
    Figure pat00161
    를 포함하는 것인, 접합체.
  53. 제 9항에 있어서, 상기 이소프레노이드 트랜스퍼라제는 파네실 단백질 트랜스퍼라아제(FTase) 또는 게라닐게라닐 트랜스퍼라제(GGTase)인 것인, 접합체.
  54. 제 9항에 있어서, 상기 L은 Ab에 공유 결합가능한 하나 이상의 분지형 링커를 포함하고,
    i) 각각의 분지형 링커는 주링커(PL)에 의해 Ab에 공유 결합가능한 제1 유닛을 포함하고;
    ii) 각각의 분지형 링커는 제1 활성제를 제1 유닛에 결합시키고, 제2 링커 (SL) 및 절단기(CG)를 포함하는 제1 분지(B1)를 포함하며; 및
    iii) 각각의 분지형 링커는 a) 제2 활성제가 제2 링커 (SL) 및 절단기 (CG)에 의해 제1 유닛에 공유 결합 된 제2 분지 (B2); 또는 b) 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(moiety)가 제1 유닛에 공유 결합되어 있는 제2 분지를 포함하고,
    상기 각각의 절단기는 접합체로부터 활성제를 방출하기 위해 가수분해되는 것인, 접합체.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 분지형 링커는
    Figure pat00162
    ,
    Figure pat00163
    ,
    Figure pat00164
    또는
    Figure pat00165
    를 포함하고,
    상기 L2, L3, L4 는 각각 독립적으로 직접 결합 또는 -CnH2n-이며, 상기 n은 1 내지 30의 정수이고,
    상기 G1, G2, G3은 독립적으로 직접 결합,
    Figure pat00166
    ,
    Figure pat00167
    ,
    Figure pat00168
    또는
    Figure pat00169
    이며,
    상기 R30은 수소 또는 C1-30 알킬; 및
    상기 R40은 직접 결합 또는 C1-10 알킬렌인 것인, 접합체.
  56. 제 55항에 있어서,
    Figure pat00170
    를 포함하고,
    상기 B 및 B'는 동일하거나 상이할 수 있는 활성제를 나타내거나,
    상기 B 및 B' 중 하나는 활성제이고, 나머지 하나는 톡신(toxin)이고;
    n은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내며;
    f는 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내고; 및
    L은 Ab에 대해 결합가능한 말단기를 나타내는 것인, 접합체.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 n은 1 내지 10의 정수인 것인, 접합체.
  58. 제 56항에 있어서, 상기 n은 4 내지 20의 정수인 것인, 접합체.
  59. 제 54항에 있어서, 상기 절단기는 표적 세포 내에서 절단될 수 있는 것인, 접합체.
  60. 제 54항에 있어서, 상기 절단기는 하나 이상의 활성제를 방출시킬 수 있는 것인, 접합체.
  61. 제 54항에 있어서, 상기 접합체는 Ab에 공유 결합가능한 하나 이상의 분지형 링커를 포함하며; 및 분지형 링커에 공유 결합된 2개 이상의 활성제를 포함하는 것인, 접합체.
  62. 제 61항에 있어서, Ab와 결합가능한 2개 이상의 분지형 링커를 포함하고, 각각의 분지형 링커가 2개 이상의 활성제와 결합하는 것인, 접합체.
  63. 제 62항에 있어서, Ab와 결합가능한 3개 또는 4개의 분지형 링커를 포함하는 것인, 접합체.
  64. 제 61항에 있어서, 1개의 분지형 링커가 Ab와 결합가능한 것인, 접합체.
  65. 제 61항에 있어서, 각각의 분지형 링커는 두 개의 활성제와 결합되는 것인, 접합체.
  66. 제 61항에 있어서, 상기 접합체는 2개 이상의 상이한 활성제를 포함하는 것인, 접합체.
  67. 제 66항에 있어서, 하나 이상의 분지형 링커는 2개 이상의 활성제와 결합되는 것인, 접합체.
  68. 제 61항에 있어서, 각각의 활성제는 절단 가능한 결합에 의해 분지형 링커에 결합되는 것인, 접합체.
  69. 제 61항에 있어서, 각각의 분지형 링커는 제5 유닛을 포함하고, 각각의 활성제는 2차 링커를 통해 제5 유닛에 결합하고, 상기 제5 유닛은 1차 링커에 의해 항체에 결합되는 것인, 접합체.
  70. 제 69항에 있어서, 상기 제5 유닛은 질소 원자인 것인, 접합체.
  71. 제 69항에 있어서, 상기 제5 유닛은 아미드이고, 1차 링커는 아미드의 카르보닐을 포함하는 것인, 접합체.
  72. 제 69항에 있어서, 상기 제5 유닛은 아미드이고, 2차 링커는 아미드의 카르보닐을 포함하는 것인, 접합체.
  73. 제 69항에 있어서, 상기 제5 유닛은 라이신 유닛인 것인, 접합체.
  74. 제 1항에 있어서, 상기 활성제는 화학요법제, 면역조절요법제 또는 톡신인 것인, 접합체.
  75. 제 74항에 있어서, 상기 활성제는 면역 조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항기생충제 또는 이들의 조합인 것인, 접합체.
  76. 제 74항에 있어서, 상기 활성제는 하기로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 접합체:
    (a) 엘로티닙(erlotinib), 보르테조밉(bortezomib), 풀베스트란트(fulvestrant), 수텐트(sutent), 레트로졸(letrozole), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 루코보린(leucovorin), 라파마이신(rapamycin), 라파티닙(lapatinib), 로나파르닙(lonafarnib), 소라페닙(sorafenib), 제피티닙(gefitinib), AG1478, AG1571, 티오테파(thiotepa), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan), 피포술판(piposulfan), 벤조도파(benzodopa), 카르보콘(carboquone), 메츄도파(meturedopa), 유레도파(uredopa), 에틸렌이민(ethylenimine), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethiylenethiophosphoramide), 트리메틸롤로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신(bullatacin), 불라타시논(bullatacinone), 캄토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), CC-1065, 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin), 비젤레신(bizelesin), 크립토피신 1(cryptophycin 1), 크립토피신 8(cryptophycin 8), 돌라스타틴(dolastatin), 듀오카마이신(duocarmycin), KW-2189, CB1-TM1, 엘루테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕티인(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard), 카르무스틴(carmustine), 클로로코토신(chlorozotocin), 포테쿠스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimnustine), 칼리키아미신(calicheamicin), 칼리키아미신 감마 1(calicheamicin gamma 1), 칼리키아미신 오메가 1(calicheamicin omega 1), 디네미신(dynemicin), 디네미신 A(dynemicin A), 클로드로네이트(clodronate), 에스페르아미신(esperamicin), 네오카르지노스타틴크로모포어(neocarzinostatin chromophore), 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 안트르마이신(antrmycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르니노마이신(carninomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루부신(detorubucin), 6-디아조-5-옥소-L-노르루신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피롤리노-독소루비신(2-pyrrolino-doxorubucin), 리포소말 독소루비신(liposomal doxorubicin), 데옥시독소루비신(deoxydoxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토미그린(streptomigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 5-플루오로우라신(5-fluorouracil), 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티구아닌(thiguanine), 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자유리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시유리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone),프로피오네이트(propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스테인(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토테인(mitotane), 트릴로스테인(trilostane), 폴린산(folinic acid), 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드 글리코사이드(aldophosphamide glycoside), 아미노레불린산(aminolevulinic acid), 에닐우라실(eniluracil), 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 엘립티니움 아세테이트(elliptinium acetate), 에토글루시드(etoglucid), 갈리움 나이트레이트(gallium nitrate), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 렌티난(lentinan), 로니다이닌(lonidainine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocins), 미토구아존(mitoguazone), 미토잔트론(mitoxantrone), 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피라루비신(pirarubicin), 로소잔트론(losoxantrone), 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide), 프로카르바진(procarbazine), 폴리사카라이드-k(polysaccharidek), 라족세인(razoxane), 리조신(rhizoxin), 시조피란(sizofiran), 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone),2,2',2''-트리클로로트리에틸아민(2,2',2''-trichlorotriethylamine), T-2 톡신, 베라큐린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A), 안구이딘(anguidine), 우레탄(urethane), 빈데신(vindesine), 다카르바진(dacarbazine), 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨(mitobronitol), 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 아라비노사이드(arabinoside), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 티오테파(thiotepa), 파클리탁셀(paclitaxel), 파클리탁셀, 파클리탁셀의 알부민-엔지니어드 나노파티클(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel), 도세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈, 6-티오구아닌, 머캅토퓨린, 시스플라틴, 카보플라틴(carboplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 플래티늄(platinum), 에토포사이드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 미톡산트론(mitoxantrone), 빈크리스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 노반트론(novantrone), 테니포사이드(teniposide), 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신(daunomycin), 아미노프테린(aminopterin), 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), CPT-11, 토포이소머라아제 저해제 RFS 2000, 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine), 레티노산(retinoic acid), 카페시타빈(capecitabine), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 산;
    (b) 모노카인(monokine), 림포카인(lympokine), 폴리펩타이드 호르몬(traditional polypeptide hormone), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 티록신(thyroxine), 릴렉신(relaxin), 프로릴렉신(prorelaxin), 당단백 호르몬(glycoprotein hormone), 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone), 갑상샘자극호르몬(thyroid stimulating hormone), 황체형성호르몬(luteinizing hormone), 간 성장인자 섬유모세포성장인자(hepatic growth factor fibroblast growth factor), 프롤락틴(prolactin), 태반성 락토젠(placental lactogen), 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 종양괴사인자-α, 종양괴사인자-β, 뮐러관 억제물질(mullerian inhibiting substance), 마우스 고나도트로핀-연관 펩타이드(mouse gonadotropin associated peptide), 인히빈(inhibin), 액티빈(activin), 혈관내피증식인자(vascular endothelial growth factor), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 골유도 인자(osteoinductive factor), 인터페론, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 콜로니자극인자(colony stimulating factor, CSF), 마크로파지-CSF, 과립구-마크로파지-CSF(granulocyte-macrophage-CSF), 과립구-CSF, 인터루킨(IL), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 폴리펩타이드 인자, LIF, 키트 리간드(kit ligand), 또는 이들의 배합물;
    (c) 디프테리아 톡신, 보툴리눔 톡신, 테타누스 톡신, 디센터리 톡신, 콜레라 톡신, 아마니틴, α-아마니틴, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 유도체, 인돌리노벤조디아제핀, 피리디노벤조디아제핀, 테트로도톡신, 브레베톡신(brevetoxin), 시구아톡신(ciguatoxin), 리신(ricin), AM 톡신, 오리스타틴(auristatin), 투불리신(tubulysin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아마이신(calicheamycin), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), SG2285, 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 유사체(dolastatin analog), 크립토피신(cryptophycin), 캄토테신(camptothecin), 리족신(rhizoxin), 리족신 유도체(rhizoxin derivatives), CC-1065, CC-1065 유사체 또는 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin), 에네다인 항생제(enediyne antibiotic), 에스페라마이신(esperamicin), 에포틸론(epothilone), 톡소이드(toxoid), 또는 이들의 배합물;
    (d) 친화성 리간드(affinity ligand), 여기에서 친화성 리간드는 기질, 저해제, 활성화제, 신경전달물질, 방사성 동위원소, 또는 이들의 배합물;
    (e) 방사능표지(radioactive label), 32P, 35S, 형광다이, 전자밀도 반응제(electron dense reagent), 효소, 비오틴, 스트렙타비딘(streptavidin), 디옥시제닌(dioxigenin), 햅텐(hapten), 면역성 단백질(immunogenic protein), 타겟에 컴플러멘터리한 서열을 갖는 핵산 분자(nucleic acid molecule with a sequence complementary to a target) 또는 이들의 배합물;
    (f) 카이네이즈 억제제(kinase inhibitor), 성장인자 억제제(growth factor inhibitor, 예컨대 EGFR, PDGF 또는 VEGF 억제제), 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitors), CRAC 억제제, PARP1 길항제(antagonist), PPARγ 작용제(agonist), Kv1.3 길항제, PP2A 작용제, MYD88 억제제, BCL-2 억제제, 아데노신 A2A 수용체(Adenosine A2A receptor (A2ar)) 작용제, TLR 작용제, TLR7/8 작용제, TLR4 작용제, TLR9 작용제, Kca3.1(calcium-activated potassium channel) 작용제, TGF-R1 억제제, TGF-R2 억제제, GLI1 억제제, TNKS 길항제, TNIK 길항제, 이미드(imide), VDR(vitamin D receptor) 길항제, STING 작용제 및 IDO1(Indoleamine 2,3-dioxygenase1) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역 조절 화합물(immunomodulatory compound), 항-암제(anticancer agent), 항-바이러스제(anti-viral agent), 항-박테리아제(anti-bacterial agent), 항-곰팡이제(anti-fungal agent), 및 항-기생충제(anti-parasitic agent), 또는 이들의 배합물;
    (g) 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 또는 토레미펜(toremifene);
    (h) 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 메제스톨 아세테이트(megestrol acetate), 엑스메스탄(exemestane), 레트로졸(letrozole), 또는 아나스트로졸(anastrozole)
    (i) 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 리우프롤라이드(leuprolide), 고세렐린(goserelin), 또는 트록사시타빈(troxacitabine);
    (j) 아로마타아제 저해제;
    (k) 단백질 키나아제 저해제;
    (l) 리피드 키나아제 저해제;
    (m) 안티센스 올리고뉴클레오티드;
    (n) 리보자임;
    (o) 백신; 및
    (p) 항-맥관형성제(anti-angiogenic agent).
  77. 제 1항에 있어서, 상기 X는
    Figure pat00171
    ,
    Figure pat00172
    ,
    Figure pat00173
    ,
    Figure pat00174
    ,
    Figure pat00175
    ,
    Figure pat00176
    ,
    Figure pat00177
    ,
    Figure pat00178
    ,
    Figure pat00179
    ,
    Figure pat00180
    ,
    Figure pat00181
    ,
    Figure pat00182
    ,
    Figure pat00183
    ,
    Figure pat00184
    ,
    Figure pat00185
    ,
    Figure pat00186
    ,
    Figure pat00187
    ,
    Figure pat00188
    ,
    Figure pat00189
    ,
    Figure pat00190
    ,
    Figure pat00191
    ,
    Figure pat00192
    ,
    Figure pat00193
    ,
    Figure pat00194
    ,
    Figure pat00195
    및
    Figure pat00196
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 접합체.
  78. 제 1항에 있어서, 상기 활성제는
    Figure pat00197
    ,
    Figure pat00198
    ,
    Figure pat00199
    ,
    Figure pat00200
    ,
    Figure pat00201
    ,
    Figure pat00202
    ,
    Figure pat00203
    ,
    Figure pat00204
    ,
    Figure pat00205
    ,
    Figure pat00206
    ,
    Figure pat00207
    ,
    Figure pat00208
    ,
    Figure pat00209
    ,
    Figure pat00210
    ,
    Figure pat00211
    및
    Figure pat00212
    으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기에서 y는 1 내지 10의 정수인 것인, 접합체.
  79. 제 1항의 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  80. 제 79항에 있어서, 추가적으로 약학적으로 유효한 양의 화학 치료제(chemotherapeutic agent)를 포함하는, 약학적 조성물.
  81. 제 79항에 있어서, 상기 암은 혈액암, 폐암, 비소세포성 폐암, 위장관암, 대장암, 결장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 피부암, 방광암, 췌장암, 신경모세포종, 상피편평세포암, 갑상선암, 두경부암, 부신암, 구강암, 골수종, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 육종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
KR1020210065657A 2021-05-21 2021-05-21 Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도 KR20220158181A (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210065657A KR20220158181A (ko) 2021-05-21 2021-05-21 Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도
PCT/KR2022/007260 WO2022245186A1 (ko) 2021-05-21 2022-05-20 Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도
TW111119008A TW202313122A (zh) 2021-05-21 2022-05-20 與ｒｏｒ１和ｂ７－ｈ３結合抗體－藥物偶聯物及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210065657A KR20220158181A (ko) 2021-05-21 2021-05-21 Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220158181A true KR20220158181A (ko) 2022-11-30

Family

ID=84140712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210065657A KR20220158181A (ko) 2021-05-21 2021-05-21 Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR20220158181A (ko)
TW (1) TW202313122A (ko)
WO (1) WO2022245186A1 (ko)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109563167A (zh) * 2016-06-08 2019-04-02 艾伯维公司 抗b7-h3抗体和抗体药物偶联物
NZ752394A (en) * 2016-11-14 2021-07-30 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers
WO2019225777A1 (ko) * 2018-05-23 2019-11-28 에이비엘바이오 주식회사 항-ror1 항체 및 그 용도
KR20210028544A (ko) * 2019-09-04 2021-03-12 주식회사 레고켐 바이오사이언스 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022245186A1 (ko) 2022-11-24
TW202313122A (zh) 2023-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7064629B2 (ja) 抗ｃｄｈ６抗体及び抗ｃｄｈ６抗体－薬物コンジュゲート
CA2990572C (en) Method for selectively manufacturing antibody-drug conjugate
RU2705367C2 (ru) Конъюгат анти-trop2 антитело-лекарственное средство
KR20210028544A (ko) 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
TWI662968B (zh) 配體－細胞毒性藥物偶聯物、其製備方法及其應用
SA110310795B1 (ar) جزيئات أجسام مضادة لـ gcc وتركيبات وطرق ذات صلة
JP2021530436A (ja) Ａｘｌを標的とする抗体および抗体−薬物複合体ならびにその製造方法と使用
KR102503143B1 (ko) 인간 dlk1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
CN113195541A (zh) 针对pmel17的抗体及其缀合物
CA3231632A1 (en) Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
KR20220136267A (ko) 인간 cldn18.2에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
JP2016511257A (ja) 癌の治療における抗ｇｃｃ抗体−薬物複合体及びｄｎａ損傷剤の投与
KR20220158181A (ko) Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체-약물 접합체 및 그 용도
KR20210028556A (ko) 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
RU2801630C2 (ru) Коньюгаты антитело-лекарственное средство, включающие антитело против человеческого dlk1, и их применение
KR20210063070A (ko) 항-b7-h3 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 이의 용도
KR20230143869A (ko) 인간 trop2에 대한 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 이의 용도
TW202408591A (zh) 包含抗人類ror1抗體之抗體-藥物結合物及其用途
TW202408589A (zh) 抗ror1抗體及抗體結合物、包含抗ror1抗體或抗體結合物之組合物，及製造及使用抗ror1抗體及抗體結合物之方法

Legal Events

Date Code Title Description
WITB Written withdrawal of application