KR20210063070A - 항-b7-h3 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

항-b7-h3 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 이의 용도 Download PDF

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정진원
김주희
박영돈
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홍영은
염동훈
안진형
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Abstract

본 발명은 B7-H3를 타겟팅하는 신규한 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC), 이들 ADC의 활성 대사물, 이들 ADC의 제조방법, 병의 치료 및/또는 예방을 위한 이들 ADC의 용도, 및 또한 병, 더 상세하게는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환 예컨대, 암 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제를 생산하기 위한 이들 ADC의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로, B7-H3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

항-B7-H3 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 및 이의 용도{Antibody-drug conjugate comprising anti-B7-H3 antibody and its use}
본 발명은 B7-H3을 타겟팅하는 신규한 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC), 이들 ADC의 활성 대사물, 이들 ADC의 제조방법, 병의 치료 및/또는 예방을 위한 이들 ADC의 용도, 및 또한 병, 더 상세하게는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환 예컨대, 암 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제를 생산하기 위한 이들 ADC의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로, B7-H3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
암(cancer)은 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로 인한 질환을 말하며, 다양한 조직에서 조절되지 않는 세포 성장의 결과이다. 초기 단계 종양은 수술 및 방사선치료 조치에 의해 제거될 수 있으며, 전이된 종양의 경우 일반적으로 화학요법제에 의해 완화치료를 하게 된다.
비경구로 투여되는 대다수 화학요법제는 전신 투여의 결과로서 원치 않는 부작용 및 심지어 독성이라는 심각한 효과를 유도할 수 있으며, 따라서 종양 세포 또는 바로 인접한 조직에서 이들 화학요법제의 개선되었으면서도 선택적인 적용을 통해 약효 증가 및 독성/부작용의 최소화를 동시에 이루기 위한 신규한 화학 요법제의 개발에 초점이 맞추어져 왔다.
항체-약물 접합체(ADC, antibody-drug conjugate)는 항원과 결합하는 항체에 독소 또는 약물을 결합시킨 후 세포 내부에서 독성물질을 방출하면서 암세포 등을 사멸에 이르게 하는 표적지향성 신기술이다. 건강한 세포에는 최소한으로 영향을 주면서 약물을 타겟 암세포에 정확하게 전달하고, 특정한 조건하에서만 방출되도록 해주기 때문에 항체 치료제 자체보다 효능이 우수하고 기존의 항암제들에 비해 부작용의 위험성을 크게 낮출 수 있는 기술이다.
이러한 항체-약물 접합체의 기본 구조는 "항체-링커-저분자 약물(독소)"로 구성되어 있다. 여기서 링커는 단순히 항체와 약물을 연결시켜 주는 기능적인 역할뿐 아니라, 체내 순환시 안정하게 타겟 세포까지 도달 후 항체-약물 접합체가 세포 내로 들어가 항체-약물간 해리현상(예, 효소에 의한 가수분해에 의한 결과)에 의해 약물이 잘 떨어지면서 타겟 암세포에 약효를 나타내도록 해야 한다. 즉 링커의 안정성에 따라 항체-약물 접합체의 효능 및 전신독성(systemic toxicity) 등의 안전성 면에서 링커는 매우 중요한 역할을 한다(Discovery Medicine 2010, 10(53): 329-39) 85-8 2018-08-14).
본 발명의 발명자는 혈장 내에서 보다 안정하고 체내 순환시에도 안정적이며 약물이 암세포 내에서 쉽게 방출되어 약효를 나타낼 수 있는 효과적인 자가-희생 기(self-immolative group)을 포함하는 링커를 개발하여 이에 대해 특허를 확보한바 있다(한국등록특허 제1,628,872호 등). 한편 암 치료를 위한 단일클론 항체의 사용은 상당한 성공을 거두고 있다. 단일클론 항체는 종양 조직 및 종양 세포의 표적-지향된 어드레싱(addressing)에 적당하다. 항체-약물 접합체들은 림프종과 고형암 치료를 위해 강력하고 새로운 치료의 옵션이 되었으며, 최근 들어 면역 조절 항체들도 임상에서 상당한 성공을 거두고 있다. 치료 항체들의 개발은 암 혈청학, 단백질 엔지니어링 기술과 그 작용, 저항성의 기작들 및 면역 시스템과 암세포들 간의 상호 작용에 대한 깊은 이해를 바탕으로 한다.
이와 관련하여, B7-H3을 항원으로 삼는 항체에 대한 연구가 진행되고 있다.
B7-H3(CD276)는 B7 패밀리의 일원으로 세포외영역, 막통과영역 및 세포내영 역을 포함하는 막관통 단백질이다. B7-H3는 2개의 세포외영역은 엑손 중복으로 인해 면역글로불린 가변 도메인과 면역글로불린 불변 도메인의 단일쌍(2Ig B7-H3)또는 2개의 동일한 쌍(4Ig B7-H3)로 구성된다. 이 두 가지의 형태의 기능적 차이는 확인되지 않았다. B7-H3의 세포 내 도메인은 짧으며 알려진 모티브는 없다(Chapoval AI, Ni J, Lau JS, Wilcox RA, Flies DB, Liu D, et al. Natlmmunol 2001;2:269-74.).
B7-H3 단백질은 정상조직에서 T 세포, 자연 살해 세포 (NK cell, natural killer cell) 및 항원제시세포(APC, antigen presenting cell)에서 항상 발현하는 것은 아니지만 그 발현이 유도될 수 있다. B7-H1 과 B7-H2의 발현이 주로 항원제시세포와 같은 면역세포에만 국한되어 있음에도 불구하고 B7-H3 단백질은 골아 세포, 섬유아세포, 섬유 모세포 유사 활막 세포 및 상피 세포뿐만 아니라 사람의 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반 및 림프관 기관 등에서도 발현된다. 이 넓은 발현 양상은 특히 말초 조직에서 B7-H3의 보다 다양한 면역학적 및 비-면역 기능을 암시한다.
최근 B7-H3 발현은 비소세포폐암, 신장 세포암, 신경 모세포종, 대장암, 췌장암, 위암, 폐암, 전립선암, 자궁내막암, 간세포암, 유방암, 자궁경부암, 골육종, 구강암, 방광암, 신경교종, 흑색종 등 다양한 고형암에서 확인되며, 급성 백혈병 다발성 골수종, 여러 종류의 림프종과 같은 혈액암에서도 발현되는 것으로 보고 되어 있다(Zhimeng Yea, Zhuojun Zhengb et al, Cell Physiol Biochem(2016), Elodie Picarda,Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang, clinical cancer research(2016), Wei Zhang, Yanfang Wang, Jing Wang et al, international journal of oncology(2015)).
B7-H3는 다양한 암종에서 과발현하지만 정상조직에서의 발현은 매우 낮다. 많은 연구에서 대다수의 암 유형에서 B7-H3의 비정상적인 발현이 나타나며, 세포질 또는 암세포의 핵 내에서뿐만 아니라 종양 관련 혈관계에서도 발견되는 것으로 나타났다. 종양의 크기, 전이, 암 병기, 생존율 및 재발률 등 다양한 임상 병리학적 지표를 평가했을 때, B7-H3의 과발현은 나쁜 예후 및 나쁜 임상 결과와 상관관계가 있다. 전립선암 환자를 대상으로 한 연구에 따르면 B7-H3 발현이 강한 종양세포 환자는 수술 당시의 질병 전파 위험, 임상 암 재발 및 암 관련 사망 위험이 유의하게 높았다. 폐암에 대한 B7-H3의 발현은 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)의 감소와 림프절 전이와 관련이 있으며 면역 회피 및 종양 형성에 B7-H3의 역할을 암시한다(Elodie Picarda,Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang, Clin Cancer Res, 2017 Jul 12;22).
B7-H3는 종양 면역을 조절하는 역할 외에도 종양 공격성을 조절하는 비 면역 기능을 가지고 있다. 그것은 Jak2/Stat3/MMP-9 신호 전달 경로를 통해 다양한 암세포의 피브로넥틴으로 이동, 침입 및 부탁을 조절하는 것으로 나타났다(Elodie Picarda, Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang, Clin Cancer Res, 2017 Jul 12;22). 종양 관련 항원인 B7-H3는 siRNA에 의한 B7-H3 하향조절을 통해 파이브로넥틴에 대한 세포 부착을 감소시키고 흑색종과 유방암 세포에서 이동과 침윤을 70% 이상 감소시켰다(Chen YW, Tekle C, Fodstad O, Curr Cancer Drug Targets 2008;8). 이런 결과들은 B7-H3가 암치료에 유용한 표적이 될 수 있음을 시사한다.
B7-H3는 면역관문 리간드에 속하는 단백질이다. 면역관문 단백질은 인체 내의 면역세포들이 잘못된 이상 행동을 하지 못하게 조절하는 역할을 한다. 면역관문 단백질이 암세포에 과발현하는 경우 면역세포는 암세포가 보내는 비정상 신호를 정상신호로 받아들여 암세포를 건강한 세포로 인지하게 된다. 면역관문억제제는 이런 암세포의 비정상신호를 차단하여 환자 자신의 면역 기능으로 암을 치료하게 하는 면역 항암 치료제이다. 면역관문억제제는 기존의 항암 치료제에 비하여 부작용이 적고 뛰어난 항암효과로 각광받고 있다. 면역관문 리간드 중 하나인 B7-H3는 T 세포 표면의 B7-H3 수용체와 결합하여 T 세포의 면역반응 억제를 유도하나 아직까지 B7-H3가 결합하는 수용체가 무엇인지는 밝혀지지 않았다.
이러한 면역관문 리간드를 차단할 수 있는 항체는 면역관문 리간드와 면역 관문 수용체 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 중화시켜 면역 관문을 억제시킴으로써 저하되어 있던 면역세포의 활성을 재활성화시켜 면역 항암 치료 효과를 나타낸다. B7-H3와 결합하는 수용체가 아직 밝혀지지 않았지만, B7-H3와 결합하는 항 B7-H3 항체는 면역관문 수용체와 B7-H3 간의 결합을 차단함으로써 이러한 면역관문을 억제시킴으로써 저하되어 있던 면역세포의 활성을 재활성화시켜 면역 항암치료 효과를 나타낼 수 있다. 즉, B7-H3 수용체와의 결합을 차단하는 항 B7-H3 단클론 항체는 항암 치료 효과를 기대할 수 있다(Elodie Picarda, Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang, Clin Cancer Res, 2017 Jul 12;22). 미국특허 8,802,091 및 9,371,395는 B7-H3에 대한 항체를 개시한다.
동일한 B7-H3 항원에 대한 항체라도 각 항체의 특성 또는 용도에 따라 다양한 항암항체로 개발이 가능하므로, 이러한 B7-H3의 암특이적 발현, 다양한 암에서의 발현 및 면역관문 리간드로써의 기능을 고려하면, 기존의 항체를 보완 또는 대체할 수 있는 다양한 항체의 개발이 필요하다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명의 발명자는 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 노력한 결과 B7-H3에 우수한 결합력을 나타내는 항-B7-H3 항체를 개발하였으며, 항체의 효과를 더욱 강화하기 위하여 혈장 내에서 보다 안정하고 체내 순환시에도 안정적이며 약물이 암세포 내에서 쉽게 방출되어 약효를 나타낼 수 있는 효과적인 자가-희생기(self-immolative group)을 포함하는 링커를 상기 항-B7-H3 항체에 적용하여, 암 질환의 치료 및/또는 예방에 효과적인 B7-H3을 타겟팅하는 신규한 항체-약물 접합체(ADC)를 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 B7-H3을 타겟팅하는 신규한 항체-약물 접합체 또는 이의 염, 용매화물을 제공하고자 한다.
본 발명은 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이에 결합하는 약물을 포함하는 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 혈장 내에서 보다 안정하고 체내 순환시에도 안정적이며, 약물이 암세포 내에서 쉽게 방출되어 약효를 극대화할 수 있는 자가-희생기를 포함하는 링커 기술을 접목시켜, 약물 및/또는 톡신이 표적 세포에 안정적으로 도달하여 약효를 효과적으로 발휘하면서도 독성을 크게 낮출 수 있는, 항체-링커-약물(톡신) 시스템을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태에서 본 발명은 일반식 I의 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물을 제공한다.
[일반식 I]
Ab - (X)y
상기 식에서,
Ab는 B7-H3를 특이적으로 인식하는 분리된 항체 또는 그 항원결합 단편이고, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보성 결정부위; 및 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보성 결정부위를 포함하며,
상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 4로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH2는 서열번호 5 내지 9로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH3은 서열번호 10 내지 14로부터 선택되는 어느 하나이고,
상기 CDRL1은 서열번호 15 내지 19로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL2는 서열번호 20 내지 24로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL3은 서열번호 25 내지 29로부터 선택되는 어느 하나이며,
상기 X는 독립적으로 하나 이상의 활성제 및 링커를 포함하는 화학적 잔기이며, 및
상기 링커는 항체와 활성제를 연결하고,
상기 y는 1 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서 본 발명에 따른 항체는 세포외영역을 특이적으로 인식한다. 특히, 본 발명에 따른 항체는 인간 B7-H3를 특이적으로 인식하며, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 대한 교차 반응성을 나타낸다.
본 발명의 범위에는 B7-H3에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보성 결정부위 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보성 결정부위를 포함하는 폴리펩타이드로, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 4로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH2는 서열번호 5 내지 9로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH3은 서열번호 10 내지 14로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 CDRL1은 서열번호 15 내지 19로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL2는 서열번호 20 내지 24로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL3은 서열번호 25 내지 29로부터 선택된다. CDRH는 중쇄 가변영역에 포함된 CDR을 나타내고, CDRL은 경쇄 가변영역에 포함된 CDR을 나타낸다.
이런 관점에서, 다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하며, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 4로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH2는 서열번호 5 내지 9로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH3은 서열번호 10 내지 14로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 CDRL1은 서열번호 15 내지 19로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL2는 서열번호 20 내지 24로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL3은 서열번호 25 내지 29로부터 선택된다.
다른 구현예에서 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 하기로부터 선택되는 하나의 조합이다: 각각 서열번호 1, 5, 및 10; 서열번호 2, 6, 및 11; 서열번호 3, 7, 및 12; 서열번호 1, 8, 및 13; 또는 서열번호 4, 9, 및 14.
다른 구현예에서 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 하기로부터 선택되는 하나의 조합이다: 각각 서열번호 15, 20 및 25; 서열번호 16, 21 및 26; 서열번호 17, 22 및 27; 서열번호 18, 23 및 28; 또는 서열번호 19, 24 및 29.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보성 결정부위 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보성 결정부위를 포함하는 폴리펩타이드로, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 다음 중 어 느 하나의 조합: (a) 각각 서열번호 1, 5, 및 10; (b) 각각 서열번호 2, 6, 및 11; (c) 각각 서열번호 3, 7, 및 12; (d) 각각 서열번호 1, 8, 및 13, 또는 (e) 각각 서열번호 4, 9, 및 14; 이고, 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 다음 중 어느 하나의 조합:
(f) 각각 서열번호 15, 20 및 25; (g) 각각 서열번호 16, 21 및 26; (h) 각각 서열번호 17, 22 및 27; (i) 각각 서열번호 18, 23 및 28; 또는 (j) 각각 서열번호 19, 24 및 29이다. 상기 중쇄 가변영역 유래의 CDR의 어느 하나의 조합과 상기 경쇄 가변영역의 CDR의 어느 하나의 조합은 서로 자유롭게 조합될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열은 다음 중 어느 하나의 조합이다:
(a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 5, 및 10, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 15, 20 및 25;
(b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 6, 및 11, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 16, 21 및 26;
(c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 7, 및 12, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 22 및 27;
(d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 8, 및 13, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 23 및 28; 또는
(e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 4, 9, 및 14, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 19, 24 및 29.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함한다: 서열번호 30 내지 34로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열; 상기 서열번호 30 내지 34로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는 상기 서열번호 30 내지 34로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함한다: 서열번호 35 내지 39로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열; 상기 서열번호 35 내지 39로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는 상기 서열번호 35 내지 39로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
상기 각 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은 서로 조합될 수 있다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 및 경쇄 가변영역 조합을 포함한다: 서열번호 30 및 35; 서열번호 31 및 36; 서열번호 32 및 37; 서열번호 33 및 38; 또는 서열번호 34 및 39 또는 상기 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상; 또는 상기 각 서열은 상기 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체는 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형이다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 서열번호 60으로 표시되는 인간 IgG 중쇄 불변영역 및/또는 서열번호 64로 표시되는 인간 람다 경쇄 불변영역을 제공한다. 예를 들면 서열번호 60의 중쇄 불변영역을 포함하는 중쇄는 서열번호 40 내지 44로 표시된다. 예를 들면 서열번호 64의 경쇄 불변영역을 포함하는 경쇄는 서열번호 45 내지 49로 표시 된다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열의 중쇄 및 경쇄 조합을 포함한다: 서열번호 40 및 45; 서열번호 41 및 46; 서열번호 42 및 47; 서열번호 43 및 48; 또는 서열번호 44 및 49; 또는 상기 각 서열은 상기 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 인간 항체, 완전 인간 항체 또는 항원결합 단편이고, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 교차반응성을 가진다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체는 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체이고, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 교차반응성을 가진다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편을 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3를 특이적으로 인식한다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디, 다이아바디, scAb, dAb 또는 이가항체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 상기 B7-H3 항원에 부가하여 하나 이상의 항원에 대한 특이성을 갖는다. 일 구현예에서 하나 이상의 항원은 B7-H3와 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들면 암 항원을 포함하며, 항원이 상이한 경우 항체는 이중특이성을 가질 수 있다. 당업자라면 이중특이항체의 구체적 목적에 따라 본원 명세서에 기재된 사항을 참조하여 적절한 암 항원을 선택할 수 있을 것이다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 B7-H3 면역관문을 억제 또는 차단하여, B7-H3 면역관문에 의해 활성이 저하 또는 억제된 T 세포를 다시 활성화시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편은 이와 같은 B7-H3 면역관문 억제를 통해, B7-H3 면역관문에 의해 억제된 T 세포 재활성화 및 상기 재활성화가 필요한 다양한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 개시된 CDR를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 개시된 중쇄 또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.
또 다른 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 개시된 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 개시된 전장 중쇄를 코딩하는 서열번호 50 내지 54 중 어느 하나로 표시된다.
다른 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 개시된 전장 경쇄를 코딩하는 서열번호 55 내지 59 중 어느 하나로 표시 된다.
본 발명에 따른 CDR 및 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 전장 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산서열로부터, 본 발명에 개시된 CDR 및 가변영역의 아미노산 서열을 기초로 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
예를 들면 본 발명에서 일 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 50의 1번 내지 348번 염기, 서열번호 51의 1번 내지 348번 염기, 서열번호 52의 1번 내지 348번 염기, 서열번호 53의 1번 내지 363번 염기, 또는 서열번호 54의 1번 내지 348번 염기이다.
예를 들면 본 발명에서 다른 구현예에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 55의 1번 내지 333번 염기, 서열번호 56의 1번 내지 333번 염기, 서열번호 57의 1번 내지 333번 염기, 서열번호 58의 1번 내지 333번 염기, 서열번호 59의 1번 내지 333번 염기이다.
다른 양태에서는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 벡터는 항체 생산을 위한 발현 벡터 또는 CAR-T 세포(Chimeric Antigen receptor redirected T cells) 또는 CAR-NK(Natural Killer) 세포용 벡터를 포함한다.
다른 양태에서 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 상기 세포주로부터 항체 또는 그 항원결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, B7-H3에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그 항원결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, Linker는 하기 화학식 (IIa)의 구조를 갖는다:
[화학식 (IIa)]
Figure pat00001
상기 식에서,
G는 당(sugar), 당산(sugar acid), 또는 당 유도체(sugar derivatives)이고,
W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -S(O)2NR'-, -P(O)R''NR'-, -S(O)NR'-, 또는 -PO2NR'-이고,
C(O), S, 또는 P가 페닐환과 바로 연결되는 경우, R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C1-C8)알콕시, (C1-C8)알킬티오, 모노- 또는 디-(C1-C8)알킬아미노, (C3-C20)헤테로아릴, 또는 (C6-C20)아릴이며,
각 Z는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로이고,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
L은 부존재하거나, 또는
최소 하나의 브랜칭 유닛(branching unit, BR) 및 최소 하나의 커넥션 유닛(connection unit)을 함유하며,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)사이클로알킬이거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 (C3-C8)사이클로알킬 환을 형성하며,
상기 식에서 물결표시는 항체 또는 이의 항원결합 단편과 연결되는 부위, * 표시는 약물 또는 톡신과 연결되는 부위를 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 당 또는 당산은 모노사카라이드이다.
본 발명의 일 양태에서, G는 하기 화학식 (IIIa) 구조의 화합물이다:
[화학식 (IIIa)]
Figure pat00002
여기에서,
R3는 수소 또는 카르복실 보호기이고,
각 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이다.
본 발명의 일 양태에서, R3는 수소이고, 각 R4는 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, W는 -C(O)NR'-이고, 여기에서 C(O)가 페닐환과 연결되며, NR'은 L과 연결된다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 수소이고, n은 3이다.
본 발명의 일 양태에서, R1 및 R2는 각각 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, G는 하기 화학식 (IIIa) 구조의 화합물이고:
[화학식 (IIIa)]
Figure pat00003
여기에서,
R3는 수소 또는 카르복실 보호기이고,
각 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이며,
W는 -C(O)NR'-이고, 여기에서 C(O)가 페닐환과 연결되며 NR'은 L과 연결되고, 각 Z는 수소이며, n은 3이고, m은 1이며, R1 및 R2는 각각 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 브랜칭 유닛은 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌이고, 여기에서 알킬렌의 탄소 원자는, N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자로 치환될 수 있으며, 알킬렌은 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 하나 이상의 알킬로 더 치환될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 브랜칭 유닛은 친수성 아미노산(hydrophilic amino acid)이다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 리신, 오르니틴, 프롤린, 세린, 또는 트레오닌일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 수용액에서 중성 pH에서 전하를 갖는 잔기를 갖는 측쇄를 포함하는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 아스파테이트 또는 글루타메이트이다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 오르니틴 또는 리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 친수성 아미노산은 아르기닌이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 브랜칭 유닛은 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -S(O)2NR'-, -P(O)R''NR'-, -S(O)NR'-, 또는 -PO2NR'-이고, R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C1-C8)알콕시, (C1-C8)알킬티오, 모노- 또는 디-(C1-C8)알킬아미노, (C3-C20)헤테로아릴, 또는 (C6-C20)아릴이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 브랜칭 유닛은 -C(O)NR'-이고, R'은 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 커넥션 유닛은 -(CH2)r(V(CH2)p)q- 이고, 여기에서 r은 0 내지 10의 정수이며, p은 0 내지 12의 정수이고, q는 1 내지 20의 정수이며, V는 단일결합, -O- 또는 -S-이다.
본 발명의 일 양태에서, r은 2이다.
본 발명의 일 양태에서, p은 2이다.
본 발명의 일 양태에서, q는 6 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, r은 2이고, p은 2이며, q는 2, 4, 5 또는 11이고, V는 -O-이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 커넥션 유닛은 최소 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛이고,
Figure pat00004
또는
Figure pat00005
의 구조를 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 커넥션 유닛은 1 내지 12 -OCH2CH2-유닛, 또는 5 내지 12 -OCH2CH2-유닛, 또는 6 내지 12 -OCH2CH2-유닛이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 커넥션 유닛은 -(CH2CH2X)w-이고,
여기에서 X는 단일 결합, -O-, (C1-C8)알킬렌, 또는 -NR21-이고;
R21은 수소, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬(C6-C20)아릴, 또는 (C1-C6)알킬 (C3-C20)헤테로아릴이며,
w는 1 내지 20의 정수이고, 구체적으로는 1, 3, 6, 또는 12이다.
본 발명의 일 양태에서 X는 -O-이고, w는 6 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, Linker는 1,3-dipolar cycloaddition 반응, hetero-Diels-Alder 반응, 친핵성 치환(nucleophilic substitution) 반응, 비-알돌형 카르보닐 반응, 탄소-탄소 다중 결합 첨가(addition to carbon-carbon multiple bond), 산화 반응 또는 클릭 반응에 의해 형성된 바인딩 유닛을 추가로 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 바인딩 유닛은 아세틸렌 및 아자이드 사이의 반응, 또는 알데하이드 또는 케톤기 및 하이드라진 또는 알콕시아민 사이의 반응에 의해 형성된다.
본 발명의 일 양태에서, 바인딩 유닛은,
Figure pat00006
이고,
여기에서,
L1은 단일 결합 또는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이고,
R11은 수소 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬이며, 구체적으로 메틸이고,
L2는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
본 발명의 일 양태에서, Linker는
Figure pat00007
의 구조를 갖는 최소 하나 이상의 이소프레닐 유닛을 추가로 함유할 수 있으며, 여기에서 n은 최소 2 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 최소 하나의 이소프레닐 유닛은 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 기질 또는 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 생성물이다.
본 발명의 일 양태에서, Linker의 이소프레닐 유닛은 티오에테르 결합에 의해 항체와 공유결합하며, 티오에테르 결합은 항체의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 항체는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하고, 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, B7-H3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하고, 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CXX, CXC, XCXC, XXCC, 및 CYYX로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열이고, 여기에서 C는 시스테인을 나타내며; Y는 각 경우 독립적으로 지방족 아미노산을 나타내고; X는 각 경우 독립적으로 글루타민, 글루타메이트, 세린, 시스테인, 메티오닌, 알라닌, 또는 루신을 나타내고; 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고, Y는 각 경우 독립적으로 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌 또는 발린이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CVIM 또는 CVLL 서열이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20개의 아미노산 중 적어도 하나는 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20개의 아미노산 중 1개 이상이 글리신, 아르기닌, 아스파르트산 및 세린으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20개의 아미노산이 글리신, 구체적으로는 아미노산 모티프에 선행하는 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산은 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 항체는 GGGGGGGCVIM의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서, Linker는,
(a) 하나 이상의 브랜칭 유닛; (b) 하나 이상의 커넥션 유닛; (c)하나 이상의 바인딩 유닛(binding unit, BU); 및 (d) 하나 이상의 트리거 유닛(trigger unit, TU)을 함유하는 것일 수 있다.
여기에서 커넥션 유닛은 트리거 유닛과 바인딩 유닛, 트리거 유닛과 브랜칭 유닛 또는 브랜칭 유닛과 바인딩 유닛을 연결하고,
여기에서 하나 이상의 트리거 유닛은 하나 이상의 약물 또는 톡신을 방출할 수 있으며,
여기에서 브랜칭 유닛은 커넥션 유닛과 트리거 유닛, 또는 커넥션 유닛을 또 다른 커넥션 유닛과 연결하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 트리거 유닛은 다음 화학식 (IIb)의 구조를 갖는다:
[화학식 (IIb)]
Figure pat00008
상기 식에서,
G는 당(sugar), 당산(sugar acid), 또는 당 유도체(sugar derivatives)이고,
W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -S(O)2NR'-, -P(O)R''NR'-, -S(O)NR'-, 또는 -PO2NR'-이고,
C(O), S, 또는 P가 페닐환과 바로 연결되는 경우, R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, (C1-C8)알콕시, (C1-C8)알킬티오, 모노- 또는 디-(C1-C8)알킬아미노, (C3-C20)헤테로아릴, 또는 (C6-C20)아릴이며, W는 커넥션 유닛 또는 브랜칭 유닛과 연결되고,
각 Z는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로이고,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)사이클로알킬이거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 (C3-C8)사이클로알킬 환을 형성한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 당 또는 당산은 모노사카라이드이다.
본 발명의 일 양태에서, G는 하기 화학식 (IIIa) 구조의 화합물이다:
[화학식 (IIIa)]
Figure pat00009
여기에서,
R3는 수소 또는 카르복실 보호기이고,
각 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이다.
본 발명의 일 양태에서, R3는 수소이고, 각 R4는 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, W는 -C(O)NR'-이고, 여기에서 C(O)가 페닐환과 연결되며, NR'은 커넥션 유닛과 연결된다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, R1 및 R2는 각각 수소이다.
본 발명의 일 양태에서, 커넥션 유닛은 -(CH2)r(V(CH2)p)q-, -((CH2)pV)q-, -(CH2)r(V(CH2)p)qY-, -((CH2)pV)q(CH2)r-, -Y((CH2)pV)q- 또는 -(CH2)r(V(CH2)p)qYCH2-로 나타내지며,
여기에서,
r은 0 내지 10의 정수이고;
p는 1 내지 10의 정수이며;
q는 1 내지 20의 정수이고,
V 및 Y는 각각 독립적으로 단일결합, -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2-, 또는 -SO2NR25-이고,
R21 내지 R25는 각각 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬(C6-C20)아릴 또는 (C1-C6)알킬(C3-C20)헤테로아릴이다.
본 발명의 일 양태에서, r은 2이다.
본 발명의 일 양태에서, p는 2이다.
본 발명의 일 양태에서, q는 6 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, q는 2, 5, 또는 11이다.
본 발명의 일 양태에서, V 및 Y는 각각 독립적으로 -O-이다.
본 발명의 일 양태에서, 브랜칭 유닛은,
Figure pat00010
이고,
여기에서,
L1, L2, 및 L3는 각각 독립적으로 직접 결합(direct bond) 또는 -CnH2n- 이고,
여기에서 n은 1 내지 30의 정수이며,
여기에서, G1, G2, G3는 각각 독립적으로 직접 결합,
Figure pat00011
이고,
여기에서 R3는 수소 또는 C1-C30알킬이며,
여기에서 R4는 수소 또는 -L4-COOR5이고, 여기에서 L4는 직접 결합 또는 -CnH2n- 이고 여기에서 n은 1 내지 10의 정수이며, R5는 수소 또는 C1-C30 알킬이다.
본 발명의 일 양태에서, 브랜칭 유닛은
Figure pat00012
이고,
여기에서 L1은 직접 결합 또는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이고,
R11은 수소 또는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬이며, 구체적으로 메틸이고,
L2는 1 내지 30개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이고,
여기에서 브랜칭 유닛은 커넥션 유닛과 항체를 연결한다.
본 발명의 일 양태에서, L1은 12개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
본 발명의 일 양태에서, R11은 메틸이다.
본 발명의 일 양태에서, L2는 11개의 탄소원자를 갖는 알킬렌이다.
본 발명의 일 양태에서, 바인딩 유닛은 티오에테르 결합에 의해 항체와 공유결합하며, 티오에테르 결합은 항체의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 항체는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하고, 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CXX, CXC, XCXC, XXCC, 및 CYYX로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열이고, 여기에서 C는 시스테인을 나타내며; Y는 각 경우 독립적으로 지방족 아미노산을 나타내고; X는 각 경우 독립적으로 글루타민, 글루타메이트, 세린, 시스테인, 메티오닌, 알라닌, 또는 루신을 나타내고; 티오에테르 결합은 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고, Y는 각 경우 독립적으로 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌 또는 발린이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프는 CVIM 또는 CVLL 서열이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20개의 아미노산 중 적어도 하나는 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20개의 아미노산 중 1개 이상이 글리신, 아르기닌, 아스파르트산 및 세린으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20개의 아미노산이 글리신, 구체적으로는 아미노산 모티프에 선행하는 최소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산은 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 항체는 GGGGGGGCVIM의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 활성제는 화학요법제 또는 톡신일 수 있다.
또한, 활성제는 면역 조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항기생충제 또는 이들의 조합일 수 있고, 하기 나열된 활성제 중 선택적으로 사용할 수 있다:
(a) 엘로티닙(erlotinib), 보르테조밉(bortezomib), 풀베스트란트(fulvestrant), 수텐트(sutent), 레트로졸(letrozole), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 루코보린(leucovorin), 라파마이신(rapamycin), 라파티닙(lapatinib), 로나파르닙(lonafarnib), 소라페닙(sorafenib), 제피티닙(gefitinib), AG1478, AG1571, 티오테파(thiotepa), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan), 피포술판(piposulfan), 벤조도파(benzodopa), 카르보콘(carboquone), 메츄도파(meturedopa), 유레도파(uredopa), 에틸렌이민(ethylenimine), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethiylenethiophosphoramide), 트리메틸롤로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신(bullatacin), 불라타시논(bullatacinone), 캄토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), CC-1065, 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin), 비젤레신(bizelesin), 크립토피신 1(cryptophycin 1), 크립토피신 8(cryptophycin 8), 돌라스타틴(dolastatin), 듀오카마이신(duocarmycin), KW-2189, CB1-TM1, 엘루테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕티인(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard), 카르무스틴(carmustine), 클로로코토신(chlorozotocin), 포테쿠스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimnustine), 칼리키아미신(calicheamicin), 칼리키아미신 감마 1(calicheamicin gamma 1), 칼리키아미신 오메가 1(calicheamicin omega 1), 디네미신(dynemicin), 디네미신 A(dynemicin A), 클로드로네이트(clodronate), 에스페르아미신(esperamicin), 네오카르지노스타틴크로모포어(neocarzinostatin chromophore), 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 안트르마이신(antrmycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르니노마이신(carninomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루부신(detorubucin), 6-디아조-5-옥소-L-노르루신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피롤리노-독소루비신(2-pyrrolino-doxorubucin), 리포소말 독소루비신(liposomal doxorubicin), 데옥시독소루비신(deoxydoxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토미그린(streptomigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 5-플루오로우라신(5-fluorouracil), 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티구아닌(thiguanine), 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자유리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시유리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone), 프로피오네이트(propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스테인(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토테인(mitotane), 트릴로스테인(trilostane), 폴린산(folinic acid), 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드 글리코사이드(aldophosphamide glycoside), 아미노레불린산(aminolevulinic acid), 에닐우라실(eniluracil), 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 엘립티니움 아세테이트(elliptinium acetate), 에토글루시드(etoglucid), 갈리움 나이트레이트(gallium nitrate), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 렌티난(lentinan), 로니다이닌(lonidainine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocins), 미토구아존(mitoguazone), 미토잔트론(mitoxantrone), 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피라루비신(pirarubicin), 로소잔트론(losoxantrone), 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide), 프로카르바진(procarbazine), 폴리사카라이드-k(polysaccharidek), 라족세인(razoxane), 리조신(rhizoxin), 시조피란(sizofiran), 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민(2,2',2''-trichlorotriethylamine), T-2 톡신, 베라큐린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A), 안구이딘(anguidine), 우레탄(urethane), 빈데신(vindesine), 다카르바진(dacarbazine), 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨(mitobronitol), 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 아라비노사이드(arabinoside), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 티오테파(thiotepa), 파클리탁셀(paclitaxel), 파클리탁셀, 파클리탁셀의 알부민-엔지니어드 나노파티클(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel), 도세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈, 6-티오구아닌, 머캅토퓨린, 시스플라틴, 카보플라틴(carboplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 플래티늄(platinum), 에토포사이드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 미톡산트론(mitoxantrone), 빈크리스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 노반트론(novantrone), 테니포사이드(teniposide), 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신(daunomycin), 아미노프테린(aminopterin), 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), CPT-11, 토포이소머라아제 저해제 RFS 2000, 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine), 레티노산(retinoic acid), 카페시타빈(capecitabine), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 산;
(b) 모노카인(monokine), 림포카인(lympokine), 폴리펩타이드 호르몬(traditional polypeptide hormone), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 티록신(thyroxine), 릴렉신(relaxin), 프로릴렉신(prorelaxin), 당단백 호르몬(glycoprotein hormone), 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone), 갑상샘자극호르몬(thyroid stimulating hormone), 황체형성호르몬(luteinizing hormone), 간 성장인자 섬유모세포성장인자(hepatic growth factor fibroblast growth factor), 프롤락틴(prolactin), 태반성 락토젠(placental lactogen), 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 종양괴사인자-α, 종양괴사인자-β, 뮐러관 억제물질(mullerian inhibiting substance), 마우스 고나도트로핀-연관 펩타이드(mouse gonadotropin associated peptide), 인히빈(inhibin), 액티빈(activin), 혈관내피증식인자(vascular endothelial growth factor), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 골유도 인자(osteoinductive factor), 인터페론, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 콜로니자극인자(colony stimulating factor, CSF), 마크로파지-CSF, 과립구-마크로파지-CSF(granulocyte-macrophage-CSF), 과립구-CSF, 인터루킨(IL), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 폴리펩타이드 인자, LIF, 키트 리간드(kit ligand), 또는 이들의 배합물;
(c) 디프테리아 톡신, 보툴리눔 톡신, 테타누스 톡신, 디센터리 톡신, 콜레라 톡신, 아마니틴, α-아마니틴, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 유도체, 인돌리노벤조디아제핀, 피리디노벤조디아제핀, 테트로도톡신, 브레베톡신(brevetoxin), 시구아톡신(ciguatoxin), 리신(ricin), AM 톡신, 오리스타틴(auristatin), 투불리신(tubulysin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아마이신(calicheamycin), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), SG2285, 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 유사체(dolastatin analog), 오리스타틴(auristatin), 크립토피신(cryptophycin), 캄토테신(camptothecin), 리족신(rhizoxin), 리족신 유도체(rhizoxin derivatives), CC-1065, CC-1065, 유사체 또는 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin), 에네다인 항생제(enediyne antibiotic), 에스페라마이신(esperamicin), 에포틸론(epothilone), 톡소이드(toxoid), 또는 이들의 배합물;
(d) 친화성 리간드(affinity ligand), 여기에서 친화성 리간드는 기질, 저해제, 활성화제, 신경전달물질, 방사성 동위원소, 또는 이들의 배합물;
(e) 방사능표지(radioactive label), 32P, 35S, 형광다이, 전자밀도 반응제(electron dense reagent), 효소, 비오틴, 스트렙타비딘(streptavidin), 디옥시제닌(dioxigenin), 햅텐(hapten), 면역성 단백질(immunogenic protein), 타겟에 컴플러멘터리한 서열을 갖는 핵산 분자(nucleic acid molecule with a sequence complementary to a target) 또는 이들의 배합물;
(f) 면역조절 화합물(immunomodulatory compound), 항-암제(anticancer agent), 항-바이러스제(anti-viral agent), 항-박테리아제(anti-bacterial agent), 항-곰팡이제(anti-fungal agent), 및 항-기생충제(anti-parasitic agent), 또는 이들의 배합물;
(g) 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 또는 토레미펜(toremifene);
(h) 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 메제스톨 아세테이트(megestrol acetate), 엑스메스탄(exemestane), 레트로졸(letrozole)Ehsms 아나스트로졸(anastrozole)
(i) 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 리우프롤라이드(leuprolide), 고세렐린(goserelin), 또는 트록사시타빈(troxacitabine);
(j) 아로마타아제 저해제;
(k) 단백질 키나아제 저해제;
(l) 리피드 키나아제 저해제;
(m) 안티센스 올리고뉴클레오티드;
(n) 리보자임;
(o) 백신; 및
(p) 항-맥관형성제(anti-angiogenic agent)
다른 일 양태에서 본 발명은 다음 일반식 Ia의 항체-약물 접합체를 제공한다:
[일반식 Ia]
Ab-(Linker-D)n
상기 식에서,
Ab는 항-B7-H3 항체이고,
Linker는 링커이며,
D는 활성제로 피롤로벤조디아제핀 이량체이고,
상기 피롤로벤조디아제핀 이량체의 N10 또는 N10' 위치를 통해 링커와 항체가 연결된다.
피롤로벤조디아제핀 이량체의 N10 및 N10' 위치에 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -S(O)O-*, -C(O)-*, -C(O)NR-*, -S(O)2NR-*, -(P(O)R')NR-*, -S(O)NR-*, 및 -PO2NR-*기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나가 부착되며,
RX 및 RX'는 독립적으로 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴 또는 모노- 또는 디(di)-C1-8 알킬아미노로부터 선택되며;
여기에서 *은 링커가 부착되는 부분이고,
여기에서, R 및 R'은 각각 독립적으로 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, 치환되거나 비치환된 C1-8알킬, 치환되거나 비치환된 C3-8사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 C1-8알콕시, 치환되거나 비치환된 C1-8알킬티오, 치환되거나 비치환된 C3-20헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 C5-20아릴 또는 모노- 또는 다이-C1-8알킬아미노이고,
여기에서 C1-8알킬, C3-8사이클로알킬, C1-8알콕시, C1-8알킬티오, C3-20헤테로아릴, C5-20아릴이 치환되는 경우, H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NNH2, 할로, C1-6알킬, C1-6알콕시 및 C6-12아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치환기로 치환되는,
피롤로벤조디아제핀 이량체 전구체(pyrrolobenzodiazepine dimer prodrug), 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 활성제로 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 피롤로벤조디아제핀 이량체의 N10 위치에서 X 또는 N10' 위치에서 X'로 치환되고, 여기서 X 또는 X'는 피롤로벤조디아제핀 다이머를 링커에 연결하며;
X 및 X'는 각각 독립적으로 -C(O)O*, -S(O)O-*, -C(O)-*, -C(O)NRX-*, -S(O)2NRX-*, -P(O)R'NRX-*, -S(O)NRX-*, 또는 -PO2NRX-*로부터 선택되고;
RX 및 RX'는 독립적으로 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴 또는 모노- 또는 디(di)-C1-8 알킬아미노로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 피롤로벤조디아제핀 이량체 전구체가 제공된다. 본 발명에 따른 전구체 형태로 투여하는 경우, 혈중 노출 시 추가적인 반응에 의해 유효한 약물로 전환되어야 할 필요가 있기 때문에 예상치 못한 링커의 분해 시에 생길 수 있는 부작용의 발생가능성을 미연에 방지할 수 있고, 정상세포에 대한 독성이 감소하며, 약물이 보다 안정적이라는 점에서 기존 PBD 약물에 비해 유리한 점이 있다.
또한 항체-약물 접합체 제조 시, 기존 방법으로 제조한 항체-약물 접합체의 경우 불순물의 함량이 높고 노출된 이민 그룹이 뉴클레오필(nucleophile)의 공격을 받아 원치 않는 구조의 약물이 생성될 우려가 있는 반면, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 항체-약물 접합체는 순도가 높아 분리가 용이하다는 장점이 있고, 기존 PBD 또는 PBD 이량체에 비하여 물성이 보다 향상되는 것으로 나타났다.
본 발명의 일 양태에서, 피롤로벤조디아제핀 이량체 전구체는 하기 일반식 X 또는 일반식 XI 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 피롤로벤조디아제핀 이량체 전구체, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[일반식 X]
Figure pat00013
,
[일반식 XI]
Figure pat00014
상기 식에서,
상기 점선은 C1과 C2 사이, C2와 C3 사이, C'1과 C'2 사이, 또는 C'2과 C'3 사이의 이중 결합의 선택적 존재를 나타내며;
RX1 및 RX1'는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, ORm, =CH-Rm'
=C(Rm')2, O-SO2-Rm, CO2Rm, CORm, 할로 및 디할로로부터 선택되고;
Rm'는 Rm, CO2Rm, CORm, CHO, CO2H, 및 할로로부터 선택되며,
각각의 Rm는 독립적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
RX2, RX2' RX3, RX3', RX5, 및 RX5'는 독립적으로 H, Rm, OH, ORm, SH, SRm, NH2, NHRm, NRm 2, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
RX4 및 RX4'는 독립적으로 H, Rm, OH, ORm, SH, SRm, NH2, NHRm, NRm 2, NO2, Me3Sn, 할로, C1-6 알킬 C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-12 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -CN, -NCO, -ORn, -OC(O)Rn, -OC(O)NRnRn', -OS(O)Rn, -OS(O)2Rn, -SRn, -S(O)Rn, -S(O)2Rn, -S(O)NRnRn', -S(O)2NRnRn', -OS(O)NRnRn', -OS(O)2NRnRn', -NRnRn', -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)ORo, -NRnC(O)NRoRo', -NRnS(O)Ro, -NRnS(O)2Ro, -NRnS(O)NRoRo', -NRnS(O)2NRoRo', -C(O)Rn, -C(O)ORn 및 -C(O)NRnRn'로 부터 선택되고;
X 및 X'는 독립적으로 -C(O)O*, -S(O)O-*, -C(O)-*, -C(O)NRX-*, -S(O)2NRX-*, -P(O)R'NRX-*, -S(O)NRX-*, 또는 -PO2NRX-*로부터 선택되며;
RX 및 RX'는 독립적으로 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴 또는 모노- 또는 디(di)-C1-8 알킬아미노로 부터 선택되며;
Y 및 Y'는 독립적으로 O, S, 및 N(H)으로 부터 선택되고;
RX6는 독립적으로 C3-12 알킬렌, C3-12 알케닐렌, 또는 C3-12 헤테로알킬렌으로 부터 선택되며;
RX7 및 RX7' 는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로 알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORr, -OC(O)Rr, -OC(O)NRrRr', -OS(O)Rr, -OS(O)2Rr, -SRr, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, -S(O)NRrRr', -S(O)2NRrRr', -OS(O)NRrRr', -OS(O)2NRrRr', -NRrRr', -NRrC(O)Rs, -NRrC(O)ORs, -NRrC(O)NRsRs', -NRrS(O)Rs, -NRrS(O)2Rs, -NRrS(O)NRsRs', -NRrS(O)2NRsRs, -C(O)Rr, -C(O)ORs 또는 -C(O)NRrRr'으로 부터 선택되고;
각각의 Rr, Rr', Rs, 및 Rs' 은 독립적으로 H, C1-7 알킬, C2-7 알케닐, C2-7 알키닐, C3-13 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로 부터 선택되며;
각 RX8 및 RX8'는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 헤테로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -S(O)Rm, -S(O)2Rm, -S(O)NRmRm', -S(O)2NRmRm', -NRmRm', -NRmC(O)Rm, -NRmC(O)ORn, -NRmC(O)NRnRn', -NRmS(O)Rn, -NRmS(O)2Rn, -NRmS(O)NRnRn', -NRmS(O)2NRnRn', -C(O)Rm, -C(O)ORm 및 -C(O)NRmRm'로 부터 선택되고;
Za 는 ORX12a, NRX12aRX12a, 또는 SRX12a로 부터 선택되며;
Zb 는 ORX13a, NRX13aRX13a, 또는 SRX13a로 부터 선택되고;
Za'는 ORX12a, NRX12aRX12a, 또는 SRX12a로 부터 선택되며;
Zb'는 ORX13a', NRX13'RX13a' 또는 SRX13a'로 부터 선택되고;
각 RX12a, RX12a', RX13a' 및 RX13a'는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -C(O)RX15a, -C(O)ORX15a 및 -C(O)NRX15aRX15a'로 부터 선택되고; 및
각각의 RX15a 및 RX15a' 는 독립적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로부터 선택되며;
상기 RX13a 및 RX14a 는 이들이 부착된 원자와 함께 임의적으로 결합하여 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 3 내지 7-원 헤테로아릴을 형성하고, 및 RX13a' 및 RX14a'이들이 부착된 원자와 함께 임의적으로 결합하여 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 3 내지 7-원 헤테로 아릴을 형성하며; 및
상기 각각의 Rn, Rn', Ro, Ro', Rp, 및 Rp' 는 독립적으로 H, C1-7 알킬, C2-7 알케닐, C2-7 알키닐, C3-13 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로부터 선택된다.
또한, 상기 Rm는 독립적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 Rm는 추가적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴로 치환된다.
또한, 상기 RX4 및 RX4'는 독립적으로 H, Rm, OH, ORm, SH, SRm, NH2, NHRm, NRmRm', NO2, Me3Sn, 할로, C1-6 알킬 C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-12 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -CN, -NCO, -ORn, -OC(O)Rn, -OC(O)NRnRn', -OS(O)Rn, -OS(O)2Rn, -SRn, -S(O)Rn, -S(O)2Rn, -S(O)NRnRn', -S(O)2NRnRn', -OS(O)NRnRn', -OS(O)2NRnRn', -NRnRn', -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)ORo, -NRnC(O)NRoRo', -NRnS(O)Ro, -NRnS(O)2Ro, -NRnS(O)NRoRo', -NRnS(O)2NRoRo', -C(O)Rn, -C(O)ORn 및 -C(O)NRnRn'로 부터 선택되고,
상기 RX4 또는 RX4'는 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-12 아릴 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴이고, 추가적으로 하나 이상의 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORp, -OC(O)Rp, -OC(O)NRpRp', -OS(O)Rp, -OS(O)2Rp, -SRp, -S(O)Rp, -S(O)2Rp, -S(O)NRpRp', -S(O)2NRpRp', -OS(O)NRpRp', -OS(O)2NRpRp', -NRpRp', -NRpC(O)Rq, -NRpC(O)ORq, -NRpC(O)NRqRq', -NRpS(O)Rq, -NRpS(O)2Rq, -NRpS(O)NRqRq', -NRpS(O)2NRqRq', -C(O)Rp, -C(O)ORp 또는 -C(O)NRpRp로 치환된다.
또한, 상기 RX7 및 RX7' 는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORr, -OC(O)Rr, -OC(O)NRrRr', -OS(O)Rr, -OS(O)2Rr, -SRr, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, -S(O)NRrRr', -S(O)2NRrRr', -OS(O)NRrRr', -OS(O)2NRrRr', -NRrRr', -NRrC(O)Rs, -NRrC(O)ORs, -NRrC(O)NRsRs', -NRrS(O)Rs, -NRrS(O)2Rs, -NRrS(O)NRsRs', -NRrS(O)2NRsRs, -C(O)Rr, -C(O)ORs 또는 -C(O)NRrRr'으로부터 선택되고,
상기 RX7 또는 RX7' 는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴이고, 추가적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORt, -OC(O)Rt, -OC(O)NRtRt', -OS(O)Rt, -OS(O)2Rt, -SRt, -S(O)Rt, -S(O)2Rt, -S(O)NRtRt', -S(O)2NRtRt', -OS(O)NRtRt', -OS(O)2NRtRt', -NRtRt', -NRtC(O)Ru, -NRtC(O)ORu, -NRtC(O)NRuRu', -NRtS(O)Ru, -NRtS(O)2Ru, -NRtS(O)NRuRu', -NRtS(O)2NRuRu', -C(O)Rt, -C(O)ORt 또는 -C(O)NRtRt'로 치환되며,
상기 Rr, Rr', Rs, Rs', Rt, Rt', Ru 및 Ru'는 독립적으로 H, C1-7 알킬, C2-7 알케닐, C2-7 알키닐, C3-13 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로부터 선택된다.
또한, 상기 RX1 및 RX1' 는 독립적으로 Rm 으로부터 선택되고; 및
Rm은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C5-7 아릴 및 C3-6 헤테로아릴로부터 선택된다.
또한, 상기 RX2 , RX2', RX3, RX3', RX5, 및 RX5'은 독립적으로 H 또는 OH로부터 선택된다.
또한, RX4 및 RX4' 는 독립적으로 Rm으로부터 선택되고; 및
Rm 은 C1-6 알콕시이다.
또한, 상기 RX4 및 RX4' 는 독립적으로 메톡시, 에톡시 및 부톡시로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
또한, 상기 Y 및 Y'는 O이다.
또한, 상기 RX6 는 C3-12 알킬렌, C3-12 알케닐렌 또는 C3-12 헤테로알킬렌이고, 상기 RX6은 -NH2, -NHRm, -NHC(O)Rm, -NHC(O)CH2-[OCH2CH2]n-RXX, 또는 -[CH2CH2O]n-RXX치환되고;
상기 RXX는 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴 또는 모노- 또는 디-C1-8 알킬 아미노; 및
n은 1 내지 6의 정수이다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 활성제는 일반식 XII 또는 일반식 XIII로 기재되는 피롤로벤조디아제핀 이량체이다:
[일반식 XII]
Figure pat00015
[일반식 XIII]
Figure pat00016
상기 Xa 및 Xa'는 독립적으로 결합 또는 C1-6 알킬렌으로부터 선택되고;
ZX' 및 ZX 는 독립적으로 수소, C1-8 알킬, 할로겐, 시아노, 나이트로,
Figure pat00017
,
Figure pat00018
또는 -(CH2)m-OCH3로부터 선택되며;
각각의 R80, R90 및 R100 는 수소, C1-8 알킬, C2-6 알케닐, 및 C1-6 알콕시로부터 선택되고; 및
m은 0 내지 12의 정수임.
상기 ZX' 및 ZX 는 독립적으로 수소,
Figure pat00019
,
Figure pat00020
및 -(CH2)m-OCH3로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나이고,
상기 각각의 R80, R90 및 R100 는 수소, C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
m은 1 내지 6의 정수이고,
상기 활성제는
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
Figure pat00036
Figure pat00037
Figure pat00038
Figure pat00039
Figure pat00040
Figure pat00041
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
,
Figure pat00046
,
Figure pat00047
,
Figure pat00048
및
Figure pat00049
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
다른 양태에서 본 발명은 또한 B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 및 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
여기서 B7-H3의 과발현과 관련된 질환은 암을 들 수 있고, 암의 예로는 유방암, 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신경 모세포종, 간세포암, 자궁경부암, 골육종, 구강암, 방광암, 신경교종, 비소세포폐암, 췌장암, 위암, 난소암, 대장암, 방광암, 흑생종, 자궁내막암, 두경부암, 요로상피암 또는 구상피 세포암을 포함하는 고형암; 또는 급성 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함하는 혈액암을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서 상기 조성물은 B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용된다.
또한, 본 발명의 일 앙태에서 약학적으로 유효한 양의 화학 치료제(chemotherapeutic agent), 예를 들어 1종 이상의 치료적 공동-작용제(therapeutic co-agent); 및 약학적으로 허용되는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 치료적 공동-작용제는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료효과를 나타내는 작용제, 또는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환 치료제 투약 시 나타나는 부작용의 발현을 감소시킬 수 있는 작용제, 또는 면역력 증진 효과를 나타내는 작용제 등일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니고, 예를 들어 피롤로벤조디아제핀과 함께 배합제의 형태로 적용하였을 때 치료적으로 유용한 효과를 나타내고/거나, 피롤로벤조디아제핀의 안정성을 보다 향상시키고/거나, 피롤로벤조디아제핀 투여 시 나타날 수 있는 부작용을 감소시키고/거나, 면역력의 증진을 통해 치료효과를 극대화할 수 있는 효과를 나타내는 제제라면 어떤 것이든 배합하여 적용할 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 앙태에서 PD-1(Programmed cell death protein 1), PD-L1(Programmed Death Ligand 1), CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3), CD28(Cluster of Differentiation 28), CD122, 4-1BB(또는 CD137), TIM3(T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3), OX-40(또는 CD 134), OX40L(또는 CD252)), CD40, CD40L(또는 CD 154), LIGHT(또는 tumor necrosis factor superfamily member 14 (TNFSF14)), ICOS(Inducible T-cell costimulator 또는 CD278), ICOSL(또는 CD275), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(또는 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18), TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), CD27, VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation), B7-H3(또는 CD276), B7-H4(또는 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1), HEVM(Herpes Virus Entry Mediator)또는 BTLA(B and T Lymphocyte Attenuator), CD47(또는 integrin associated protein (IAP)) 또는 CD73(또는 5'-nucleotidase (5'-NT)) 에 특이적으로 결합하여 항암 면역 반응을 나타내는 하나 이상의 항체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서 본 발명은 B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 치료 방법으로, 본 발명에 따른 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물, 또는 이를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 상기 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학적 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법이 제공된다.
본 발명에 따른 접합체는 대상체의 목표 위치에 활성제, 보다 구체적으로 피롤로벤조디아제핀을 제공하는데 사용하기에 적합하다. 본 발명에 따른 접합체는 링커 부분을 전혀 보유하지 않는 활성 피롤로벤조디아제핀을 방출시키며, 피롤로벤조디아제핀 화합물의 반응성에 영향을 줄 수 있는 것은 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 항체-약물 접합체는 본 발명에 따른 항체를 포함함으로써, B7-H3 발현 세포에 약물을 효과적이면서도 특이적 및 선택적으로 전달할 수 있고, 항체에 약물이 안정적으로 결합되어 생체내 안정성을 유지하면서 목적하는 세포독성을 나타낼 수 있도록 하며, 특히 혈장 내에서 보다 안정하고 체내 순환시에도 안정적이며, 약물이 암세포 내에서 쉽게 방출되어 약효를 극대화할 수 있는 자가-희생기를 포함하는 링커 기술을 접목시킴으로써, 약물 및/또는 톡신이 표적 세포에 안정적으로 도달하여 약효를 효과적으로 발휘하면서도 독성을 크게 낮출 수 있는, 약물-링커-리간드 시스템을 제공하는 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 B7-H3 단백질의 세포외영역(ECD, Extra Cellular Domain)에 대한 결합능 분석(ELISA) 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 B7 패밀리에 속하는 다른 단백질들의 ECD에 대한 결합능 분석(ELISA) 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 종간 교차 반응성을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 다양한 항 B7-H3 항체의 마우스 B7-H3 단백질에 대한 결합력 정도를 ELISA로 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정(FACS) 결과로, MCF-7 세포주는 B7-H3를 과발현하는 세포주이고, Jurkat은 B7-H3를 발현하지 않는 세포주이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능을 항체 농도별로 측정한(FACS) 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체의 마우스 유래 암세포주(CT26, B16F10, 및 TC-1)에 대한 결합능을 측정한(FACS) 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체의 항체 의존성 세포독성(ADCC) 유도능 측정 결과이다.
도 9a는 B7-H3 단백질에 의한 T 세포 활성 억제 및 이로 인한 인터페론 감마의 생성 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 9b는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체가 B7-H3 면역관문을 억제 또는 차단하여, 도 9a에서와 같은 B7-H3 면역관문에 의해 활성이 억제된 T 세포를 재활성화시킬 수 있음을 인터페론 감마의 생성능으로 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체를 항암 면역항체의 한 종류로 면역관문억제제인 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L1 항체 또는 면역보조자극 분자의 활성화제로 작용할 수 있는 항 4-1BB 항체와 함께 사용하였을 때 T 세포 활성화에 대한 영향을 인터페론 감마 생성량으로 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체를 마우스 B7-H3 양성 암세포주인 CT26를 이식한 동계종양이식모델에서 항암 면역항체의 한 종류로, 면역관문 억제를 통해 작용하는 항 PD-1 항체와 병용투여 시 종양 성장이 억제되고, 생존률이 향상됨을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항 B7-H3 항체를 마우스 B7-H3 양성 암세포주인 CT26를 이식한 동계종양이식모델에서의 항암 면역항체인 항 PD-1 항체와 병용투여 시 종양으로 유입된 종양 침윤 림프구를 분석한 결과이다.
도 13a는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항-B7-H3 항체-PBD 컨쥬게이트(B5-CaaX-PBD, B5-CaaX-PBD2) 또는 항-B7-H3 항체-MMAE 컨쥬게이트(B5-CaaX-MMAE)의 Calu-3 폐암 세포주 이식 마우스 모델에서의 체중 변화를 분석한 결과이고, 도 13b는 상기 마우스 모델에서의 암억제 효능을 분석한 결과이다.
본 발명은 B7-H3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 개발을 근거로 한 것이다.
본 항목에서 사용된 제목은 명세서 기재의 편리성을 위한 것일 뿐, 본 발명을 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에서 사용된 과학 및 기술적 용어는 본 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 대로의 의미를 가진다. 나아가 문맥상 특별히 요구되지 않는다면, 단수는 복수를 포함하고, 복수는 단수를 포함한다.
[정의]
본 명세서에서 하기 정의가 적용된다:
본 발명에서 "접합체(conjugates)"는 세포독성 화합물의 하나 이상의 분자에 공유결합되는 세포 결합제를 말한다. 여기서, "세포 결합제"는 생물학적 타깃에 대한 친화도를 갖는 분자로서, 예를 들어 리간드, 단백질, 항체, 구체적으로 모노클로날 항체, 단백질 또는 항체 단편, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 올리고사카라이드일 수 있으며, 결합제는 생물학적 활성 화합물을 생물학적 타깃으로 유도하는 기능을 한다. 본 발명의 일 양태에서, 접합체는 세포 표면 항원을 통해 종양 세포를 표적화하도록 설계될 수 있다. 항원은 비정상적인 세포 타입에서 과다발현되거나 또는 발현되는 세포 표면 항원일 수 있다. 구체적으로, 표적 항원은 증식성 세포(예컨대 종양 세포) 상에서만 발현되는 것일 수 있다. 표적 항원은 통상 증식성 조직 및 정상 조직 사이의 상이한 발현에 기초하여 선택될 수 있다. 본 발명에서 리간드는 링커에 결합된다.
본 발명에서 "분리된 폴리펩타이드, 항체 또는 단백질"은 이들과 통상적으로 함께 발견될 수 있는 다른 단백질이 존재하지 않으며, 자연적으로 이들과 결합되어 있는 지질, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 50% 이상이 제거된 것이다. 전형적으로 분리된 단백질, 폴리펩타이드 또는 항체는 소정의 조성물에서, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 이러한 폴리펩타이드는 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 코딩될 수 있다. 특히, 분리된 단백질 폴리펩타이드 또는 항체는 이의 치료적, 진단적, 예방적 연구 또는 기타 용도로의 적용을 방해하는 다른 단백질 또는 다른 폴리펩타이드의 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
본 발명에서 예를 들면 항원 결합 단편, 단백질, 또는 항체와 같은 폴리펩타이드의 "변이체"는 다른 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기에 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환이 발생한 폴리펩타이드이며, 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 단백질 변이체는 단백질 효소 절단, 인산화 또는 기타 후번역 변형에 의해 변형되었으나, 본 발명에 개시된 항체의 생물학적 활성 예를 들면 B7-H3에 결합 및 특이성을 유지하는 것을 포함한다. 변이체는 본 발명에 개시된 항체 또는 그 항원 결합단편의 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 동일한 것일 수 있다. 퍼센트 동일성(%) 또는 상동성은 후술하는 바를 참조하여 계산할 수 있다.
일 구현예에서 퍼센트 상동성 또는 동일성은 100Х[(동일한 위치)/min(TGA, TGB)]으로 계산될 수 있으며, 상기 식에서 TGA, TGB 는 비교되는 서열 A 및 B의 잔기의 수 및 내부갭 위치의 합이다 (Russell et al., J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994).
본 발명에서 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 활성 또는 항원선을 실질적으로 영향을 미치지 않는 치환을 의미한다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 예는 하기 표 3에 개시되어 있다.
본 발명에서 폴리펩타이드의 "유도체"는, 삽입, 결실, 부가 또는 치환 변이체와는 상이한, 다른 화학적 모이어티와의 컨쥬게에션을 통해 하나 이상의 잔기에서 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포 등과 관련하여 사용된 용어 "자연에서 발견되는"은 자연적으로 존재하는 물질을 의미한다.
본 발명에 따른 항체가 인식하는 B7-H3(B7 Homolog 3, CD276)는 면역글로불린(Ig) 슈퍼 패밀리에 속하는 B7 패밀리의 막관통 단백질로 세포외영역, 막관통영 역 및 세포내영역을 포함한다. 본 발명에 따른 항체가 인식하는 B7-H3은 세포막에 존재하거나 또는 세포막에 존재하지 않은 상태의 세포외영역이다. B7-H3의 인간 단백질은 534개의 아미노산으로 구성되어 있으며, NCBI Reference Sequence: NP_001019907.1 로 개시되어 있다. 본 발명에서 사용된 문맥으로부터 명백하지 않는 한, B7-H3는 인간 B7-H3를 지칭하나, 본 발명에 따른 항체는 원숭이 및 마우스 B7-H3도 특이적으로 결합능을 가진다. 원숭이 B7-H3 단백질은 534개의 아미노산으로 구성되어 있으며 NCBI Reference Sequence: XP_005560056.1 로 개시되어 있다. 마우스 B7-H3는 316개의 아미노산으로 구성되어 있으며 NCBI Reference Sequence: NP_598744.1 로 개시되어 있다.
본 발명에서 "동일성"은 두 개 이상의 폴리펩타이드 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 정렬하고 비교하여 결정되는, 두 개 이상 폴리펩타이드 또는 두 개 이상 폴리뉴클레오타이드의 서열 유사성을 의미한다. 이러한 서열간 동일성은 일반적으로 "동일성 퍼센트"로 표시되며, 이는 비교되는 분자 간의 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 비율을 의미하며, 비교되는 분자 중, 가장 작은 크기의 분자를 기초로 계산된다. 핵산 또는 폴리펩타이드를 정렬하여 다 분자간의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에서 "친화성" 또는 "친화도"는 항체 또는 그 항원 결합단편과 항원 사이의 상호작용의 강도이며, 항원의 크기, 모양 및/또는 전하와 같은 항원의 특징 및 항체 또는 항원결합 단편의 CDR 서열에 의해 결정된다. 이러한 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 하기를 참조할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해리 상수(dissociation constant, KD)가 ≤10-6 M일 때, 항원과 같은 이의 표적에 "특이적으로 결합한다"라고 일컬어진다. 항체는 KD가 ≤1x 10-8 M일 때, "높은 친화성"으로 표적에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 사용된, 항체 또는 면역글로불린의 사슬(중쇄 또는 경쇄)의 "항원 결합 단편"은 전장 사슬과 비교하여 일부 아미노산이 결여되었지만, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부를 포함하는 것이다. 이러한 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 또는 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 특정 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다는 측면에서 생물학적으로 활성이 있다고 할 수 있다. 한 양태에서, 이러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 일부 구현예에서, 단쇄 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적 절단하여 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편에는 이로 제한하는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, scFab, dsFv, Fv, scFV, scFV-Fc, 다이아바디, 미니바디, scAb, 및 dAb를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니나, 인간, 마우스, 랫트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하는 임의의 포유동물에서 유래될 수 있다. 본 발명에 개시된 하나 이상의 CDR과 같은 항체의 기능적인 부분은 제2의 단백질 또는 저분자 화합물과 공유결합으로 연결되어 특정 표적에 대한 표적 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 "Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이드 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 서로 결합되어 있다.
본 발명에서 "Fab 단편"은 1개의 경쇄와 가변영역 및 CH1만을 포함하는 1개 중쇄로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다. scFab은 두 분자의 Fab이 유연한 링커에 의해 연결된 것이다.
본 발명에서 "Fab' 단편"은 Fab 단편에 추가적으로 중쇄의 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하여, 두 분자의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성되어, F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
본 발명에서 "F(ab')2 단편"은 앞서 기술한 바와 같이, 2개의 경쇄, 및 가변영역, CH1 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 불변영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하여, 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 Fab' 단편으로 구성되며, 상기 두 개의 Fab' 단편은 이들 간의 다이설파이드 결합에 의해 서로 회합되어 있다.
본 발명에서 "Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄의 각 가변영역을 포함하지만 불변영역은 포함하지 않는 항체의 단편이다. scFV는 중쇄 및 경쇄가 이황화결합에 의해 연결된 것이다. scFv는 Fv가 유연한 링커에 의해 연결된 것이다. scFv-Fc는 scFV에 Fc가 연결된 것이다. 미니바디는 scFV에 CH3가 연결된 것이다. 다이아바디는 두분자의 scFV를 포함한다.
본 발명에서 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "단쇄항체"(scAb)는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 유연한 링커에 의해 연결된 중쇄의 하나의 불변영역 또는 경쇄 불변영역을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 단쇄 항체는 예를 들면 미국 특허 제5,260,203호를 참조할 수 있으며, 이는 참조에 의해 본 발명에 개시된다.
본 발명에서 "도메인 항체"(dAb)는 중쇄의 가변영역 또는 경쇄의 가변영역만을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 일 구현예에서는 2개 이상의 VH 영역이 펩타이드 링커에 의한 공유결합으로 연결되어, 2가(bivalent)의 도메인 항체를 형성한다. 이러한 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
본 발명에서 "상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에서 "골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
본 발명에서 "2가의 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 이러한 2가 항체에 포함된 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖거나, 또는 각각 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체일 수 있다.
본 발명에서 "다중 특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중 특이적 항체"는 두 개 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.
본 발명에서 "링커"는 세포독성 화합물을 리간드에 공유결합시키는 화합물을 말한다. 본 발명의 일 양태에서, 링커로는 PCT/US2016/063564호 및 PCT/US2016/063595호에 개시된 링커를 사용할 수 있다.
본 발명에서 "비치환되거나 치환된"은 비치환될 수 있거나 또는 치환될 수 있는 모기(parent group)를, "치환된"은 1 이상의 치환기를 갖는 모기(parent group)를, 치환기는 모기(parent group)에 공유결합되거나 모기(parent group)에 융합된 화학적 부분을 의미한다.
본 발명에서 "할로"는 플루오린, 클로라인, 브로마인, 요오드 등을 말한다.
본 발명에서 "알킬"은 지방족 또는 지환족, 포화 또는 불포화(불포화, 완전 불포화) 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분으로서, 포화 알킬의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 등을, 포화 직쇄형 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸(아밀), n-헥실, n-헵틸 등, 포화 분지쇄형 알킬의 예로는 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "알콕시"는 -OR[여기서, R은 알킬기]을 의미하며, 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "아릴"은 고리 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분을 의미한다.
본 발명에서 "알케닐"은 1 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬로서, 불포화 알케닐기의 예로는 에테닐(비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐(-CH=CHCH3), 2-프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "알키닐"은 1 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬기로서, 불포화 알키닐기의 예는 에티닐 및 2-프로피닐 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "카르복시"는 -C(=O)OH를 말한다.
본 발명에서 "포르밀"은 -C(=O)H를 말한다.
본 발명에서 "아릴"은 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 모이어티에 관한 것이다. 예를 들어 "C5-7아릴"은 모이어티가 5 내지 7 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 모이어티를 의미하고,"C5-10 아릴"은 모이어티가 5 내지 10 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 모이어티를 의미한다. 여기에서 접두사(C5-7, C5-10 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이 고리원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어 "C5-6아릴"은 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는 아릴기에 관한 것이다. 여기에서, 고리 원자는 "카르보아릴기"에서와 같이 모두 탄소 원자일 수 있다. 카르보아릴기의 예는 벤젠, 나프탈렌, 아줄렌, 안트라센, 페난트렌, 나프타센 및 피렌으로부터 유도된 것들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 적어도 하나가 방향족 고리인 융합 고리를 포함하는 아릴기의 예는 인단, 인덴, 이소인덴, 테트랄린, 아세나프텐, 플루오렌, 페날렌, 아세페난트렌 및 아세안트렌으로부터 유도된 기를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 또는, 고리 원자는 "헤테로아릴기"에서와 같이 하나 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "헤테로아릴"은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 아릴로서, 예로는 피리딘, 피리미딘, 벤조티오펜, 푸릴, 디옥살라닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐 등, 보다 구체적으로 벤조푸란, 이소벤조푸란, 인돌, 이소인돌, 인돌리진, 인돌린, 이소인돌린, 푸린(아데닌 또는 구아닌), 벤즈이미다졸, 인다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈이속사졸, 벤조디옥솔, 벤조푸란, 벤조트리아졸, 벤조티오푸란, 벤조티아졸, 벤조티아디아졸로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C9, 크로멘, 이소크로멘, 크로만, 이소크로만, 벤조디옥산, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴놀리진, 벤족사진, 벤조디아진, 피리도피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 프테리딘으로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C10, 벤조디아제핀으로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C11, 카르바졸, 디벤조푸란, 디벤조티오펜, 카르볼린, 페리미딘, 피리도인돌로부터 유도된 3개의 융합고리를 갖는 C13, 아크리딘, 크산텐, 티오크산텐, 옥산트렌, 페녹사티인, 페나진, 페녹사진, 페노티아진, 티안트렌, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진으로부터 유도된 3개의 융합고리를 갖는 C14를 들 수 있다.
본 발명에서 "사이클로알킬"은 시클릴기인 알킬기이고, 고리(cyclic) 탄화수소 화합물의 지환족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 사이클로알킬기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다:
포화 단일고리 탄화수소 화합물: 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 사이클로헵탄, 메틸사이클로프로판, 디메틸사이클로프로판, 메틸사이클로부탄, 디메틸사이클로부탄, 메틸사이클로펜탄, 디메틸사이클로펜탄 및 메틸사이클로헥산;
불포화 단일고리 탄화수소 화합물: 사이클로프로펜, 사이클로부텐, 사이클로펜텐, 사이클로헥센, 메틸사이클로프로펜, 디메틸사이클로프로펜, 메틸사이클로부텐, 디메틸사이클로부텐, 메틸사이클로펜텐, 디메틸사이클로펜텐 및 메틸사이클로헥센; 및 포화 헤테로사이클릭 탄화수소 화합물: 노르카란, 노르피난, 노르보르난.
본 발명에서 "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 화합물의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다.
본 발명에서 접두사(예를 들어 C1-12, C3-8 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어 본 명세서에서 사용된 용어 "C3-6헤테로사이클릴"은 3 내지 6개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릴기에 관한 것이다.
단일고리 헤테로사이클릴기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다:
N1: 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피롤린, 2H- 또는 3H-피롤, 피페리딘, 디하이드로피리딘, 테트라하이드로피리딘, 아제핀;
N2: 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 이미다졸린, 피라졸린, 피페라진;
O1: 옥시란, 옥세탄, 옥솔란, 옥솔, 옥산, 디하이드로피란, 피란, 옥세핀;
O2: 디옥솔란, 디옥산 및 디옥세판;
O3: 트리옥산;
N1O1: 테트라하이드로옥사졸, 디하이드로옥사졸, 테트라하이드로이속사졸, 디하이드로이속사졸, 모르폴린, 테트라하이드로옥사진, 디하이드로옥사진, 옥사진
S1: 티이란, 티에탄, 티올란, 티안, 티에판;
N1S1: 티아졸린, 티아졸리딘, 티오모르폴린;
N2O1: 옥사디아진;
O1S1: 옥사티올, 옥사티안; 및
N1O1S1: 옥사티아진.
본 발명에서 "전구체(prodrug)"는 생체내 생리학적 조건 하(예를 들어 효소 산화(enzymatic oxidation), 환원(reduction) 및/또는 가수분해 등)에서 효소, 위산의 작용에 의해 피롤로벤조다이아제핀 약물로 직접적으로 또는 간접적으로 변환할 수 있는 화합물을 말한다.
본 발명에서 "약학적으로 허용되는 염"으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 사용할 수 있고, 상기 유리 산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있다.
상기 유기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
예컨대, 화합물이 음이온이거나 또는 음이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -COOH는 -COO-일 수 있음), 적절한 양이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 양이온의 예는 알칼리 금속 이온, 예컨대 Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+ 및 다른 양이온, 예컨대 Al3+을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예컨대 NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 하기로부터 유도된 것들이다: 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민 뿐 아니라, 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4+이다.
화합물이 양이온이거나 또는 양이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -NH2는 -NH3 +일 수 있음), 적절한 음이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 음이온의 예는 하기 무기 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산 등을 예로 들 수 있다.
적절한 유기 음이온의 예는 하기 유기산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다: 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캠퍼설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루쳅톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 히드록시말레산, 히드록시나프탈렌 카르복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 점액산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산 및 발레르산 등을 예로 들 수 있다. 적절한 중합체 유기 음이온의 예는 하기 중합체 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 타닌산, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에서 "용매화물(solvate)"은 본 발명에 따른 화합물과 용매 분자(solvent molecules) 사이의 분자 복합체(molecular complex)를 말하며, 용매화물의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 에틸 아세테이트, 아세트산, 에탄올아민 또는 이의 혼합용매와 결합한 본 발명에 따른 화합물을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
활성 화합물의 상당하는 용매화물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 또는 바람직할 수 있다. 용어 "용매화물"은 본 명세서에서 용질(예컨대 활성 화합물, 활성 화합물의 염) 및 용매의 착체를 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다. 용매가 물인 경우, 용매화물을 편리하게 수화물, 예컨대 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등으로 지칭할 수 있다.
본 발명에서 사용된 어구 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적 치료결과를 달성하는데 (투여량 및 투여 기간 및 수단에 대해) 필요한 양을 지칭한다. 유효량은 적어도 대상체에게 치료 이익을 부여하는데 필요한 활성제의 최소량이며, 독성량 미만이다. 예를 들어 투여량은 환자 당 약 100 ng 내지 약 100 mg/kg 범위로, 보다 전형적으로 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위로 투여할 수 있다. 활성 화합물이 염, 에스테르, 아미드, 전구체약물(prodrug) 등인 경우에 투여양은 모화합물을 기준으로 계산되므로, 사용되는 실제 중량은 비례하여 증가된다. 본 발명에 따른 피롤로벤조디아제핀 화합물은 단위 제형(dosage form)당 활성 성분 0.1 mg 내지 3000 mg, 1 mg 내지 2000 mg, 10 mg 내지 1000 mg을 포함하도록 제형화될 수 있으나 이로 한정되지 않는다. 활성 성분은 약 0.05 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 50 μM, 5 μM 내지 30 μM의 활성 화합물의 피크 플라즈마 농도를 얻도록 투여될 수 있다. 예를 들어 임의로 식염수내에서 활성 성분 0.1 w/v% 내지 5 w/v% 용액의 정맥 주사에 의해 투여될 수 있다.
약학 조성물에서 활성 화합물의 농도는 약물의 흡수, 불활성화 및 배출율 및 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 다른 인자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 증상/질환의 심각도에 따라 달라질 수 있다. 또한 어떤 특정 환자에 대한 투여량 및 투여요법은 환자의 증상/질환의 정도, 필요성, 나이, 약물에 대한 반응성 등을 종합적으로 고려하여 투여 감독자의 직업적 판단에 따라 조정될 수 있으며, 본 발명에서 제시된 농도 범위는 단지 일 예이며 청구된 조성물의 실시양태를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다. 또한 활성 성분은 1회 투여될 수 있거나, 보다 적은 투여량을 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
항체 또는 항원 결합 단편
본 발명은 B7-H3 단백질의 세포외영역을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편을 개시한다. 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합단편은 마우스 및 원숭이 B7-H3 단백질의 세포외영역에 교차반응성을 나타낸다.
본 발명 따른 항체는 본 발명에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 상보성 결정영역 또는 부위(CDR)를 포함하는 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, CDR은 "프레임워크" 영역에 포함되며, 프레임워크는 이러한 CDR(들)이 적절한 항원 결합 특성을 가질 수 있도록 CDR(들)을 배향한다.
본 발명에 따른 항체는 인간, 원숭이 및 마우스 유래의 B7-H3 세포외도메 인(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하며, 분리된 형태의 세포외도메인 또는 세포 표면에서 발현되는 B7-H3의 세포외도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에 개시된 항체는 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 결합할 수 있다. 본 발명에 개시된 항체는 인간, 원숭이 및 마우스 유래의, 세포막에 존재하거나 또는 세포막에 존재하지 않은 상태의 B7-H3 세포외도메인에 특이적으로 결합할 수 있어, B7-H3을 표적으로 하는 암의 표적 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에 따른 항체 자체로, 또는 다른 항암 면역항체와 조합으로, 또는 본 발명에 따른 항체와 항암제와 같은 다른 치료제를 결합시켜, 특정 암의 치료에 사용될 수 있다. 또한 원숭이 및 마우스 B7-H3에 결합하므로 on-target tox를 마우스 실험을 통해 확인 가능하고, 마우스 B7-H3을 과발현하는 마우스 암세포주를 이용하여 syngenic model을 통한 in vivo efficacy 확인이 가능하여 B7-H3과 관련된 다양한 약물개발에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 개시된 항체는 B7-H3 단백질에 의해 유도되는 T 세포 활성의 억제를 중화시켜 T 세포의 활성화를 유도할 수 있어, 면역 활성화를 통한 암의 치료에 유용하게 사용 될 수 있다.
아울러 본 발명에 개시된 항체는 항체 의존적 세포독성 효과를 나타내어 세포사멸을 통한 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 이중항체, 다중특이적 항체, 다중항체, 미니바디, 도메인 항체, 항체 모방체(또는 합성 항체), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(또는 항체 접합체), 및 이의 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않으며 본 발명에 개시된 다양한 형태의 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 개시된 항체의 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니 바디, 다이아바디, scAb 또는 dAb를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 항체는 표 2a 및 표 2b에 개시된 가변영역을 포함하는 경쇄만의 또는 중쇄만의 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다.
본 발명에 개시된 일 항체는 본 발명에 개시된 다른 항체와 특정 영역 또는 서열을 공유한다. 일 구현예에서는 항체 또는 항원결합단편의 불변영역을 공유할 수 있다. 다른 구현예에서는 Fc 영역을 공유할 수 있다. 또 다른 구현예에서는 가변영역의 프레임을 공유할 수 있다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 항체는 자연에서 발견되는 항체의 전형적인 구조를 가진다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 서브타입이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgGl-또는 IgG2-형이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgGl-형이다.
본 발명에 따른 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 인간 불변영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변영역의 선택은 부분적으로 항체 의존적 세포 매개 세포독성, 항체 의존적 세포 식균작용 및/또는 보체 의존적 세포독성이 요구되는지에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 인간 동종형 IgGl 및 IgG3은 보체 의존적 세포독성을 갖고, 인간 동종형 IgG2 및 IgG4는 이러한 세포독성을 갖지 않는다. 또한, 인간 IgGl 및 IgG3은 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개 이펙터 기능을 유도한다. 경쇄 불변영역은 람다 또는 카파일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명에 제공된 항체는 인간 항체이고, 중쇄 불변영역은 IgGl-, IgG2- IgG3- 또는 IgG4-형일 수 있다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgGl-또는 IgG2-형이다.
다른 구현예에서, 본 발명에 제공된 항체는 인간 항체이고, 마우스 및 원숭이에 대하여 교차반응성을 가진다.
전장의 경쇄 및 중쇄에서, 가변영역 및 불변영역은 약 12개 이상의 아미노산 길이인 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들면, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press를 참조할 수 있다. 전형적으로 항체의 경쇄/중쇄 쌍의 가변영역이 항원 결합부위를 형성한다.
면역글로불린 사슬의 가변영역은 일반적으로 전체적 구조가 동일하며, "상보적 결정부위 또는 영역 또는 도메인" 또는 CDR(Complementary Determining Region)로 지칭되는 3개의 초가변영역에 의해 이어지는 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 중쇄/경쇄 쌍을 구성하는 각 사슬 유래의 가변영역의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 표적 단백질의 특정 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. 자연 발생 경쇄 및 중쇄 가변영역의 이러한 요소는 N-말단으로부터 C-말단까지 전형적으로 다음 순서로 포함된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 가변영역에서 이들 각각에 해당하는 아미노산 서열의 위치는 Kabat(Kabat et al.,(1983) U.S. Dept, of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"), Chothia(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방식(Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225)에 의해 결정될 수 있다. 상기 각 정의에 의해 결정된 CDR은 서로 비교하면, 중첩되거나 하나가 다른 하나를 포함하는 서브세트일 수 있다. 하지만 본 발명에는 상기 각 방법에 의해 정의되는 모든 CDR이 본 발명의 범위에 포함된다. 당업자라면 항체의 가변영역 서열이 주어지면, 여기에서 상기 각 정의에 의한 CDR 서열을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역에 포함될 수 있는 CDR 서열은 각각 표 la 내지 표 1f에 개시된다.
[표 la]
Figure pat00050
[표 lb]
Figure pat00051
[표 lc]
Figure pat00052
[표 ld]
Figure pat00053
[표 le]
Figure pat00054
[표 lf]
Figure pat00055
본 발명의 일 구현예에서, 상기 경쇄 및 중쇄의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 각각 하기 표 2a 및 표 2b로 개시된다.
[표 2a]
Figure pat00056
[표 2b]
Figure pat00057
일 구현예에서 상기 표 la 내지 표 1f에 개시된 경쇄의 각 가변영역의 CDR과 중쇄의 각 가변영역의 CDR은 자유롭게 조합될 수 있다.
다른 구현예에서 상기 표 2a 및 표 2b에 개시된 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 다양한 형태의 항체의 제조를 위해 자유롭게 조합될 수 있으며, 예를 들면 scFV와 같은 단쇄 항체, 또는 도메인 항체를 형성할 수 있다.
본 발명에 개시된 각각의 중쇄 및 경쇄 가변영역은 온전한 항체의 각각 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위해 목적하는 다양한 중쇄 및 경쇄 불변영역에 결합될 수 있다. 또한, 이렇게 불변영역에 결합된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열은 또한 온전한 항체 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 임의의 가변영역은 불변영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변영역은 항체 의존성 세포 매개 세포독성, 항체 의존성 세포성 포식작용 및/또는 보체 의존성 세포독성 등이 필요한지에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 아이소타입 IgGl 및 IgG3은 보체 의존성 세포독성을 가지며 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 세포독성을 가지지 않는다. 인간 IgGl 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 강한 세포 매개 효과기 기능을 유도한다. 예를 들면 중쇄 가변영역은 IgG1, lgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4를 포함하는 IgG 불변영역에, 경쇄 가변영역은 카파 또는 람다 불변영역과 결합될 수 있다. 상기 불변영역은 목적하는 바에 따라 적절한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들면 인간 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 인간 중쇄 불변영역 IgGl이 사용되며, 이는 서열번호 60의 서열로 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서 경쇄 불변영역은 인간 람다 영역이 사용되며, 이는 서열번호 64로 나타낼 수 있다.
본 발명에 개시된 임의의 가변영역은 불변영역에 결합되어 중쇄 및 경쇄 서열을 형성할 수 있다. 일 구현예에서 본 발명에 개시된 중쇄 가변영역은 인간 IgGl 불변영역에 연결될 수 있으며, 이를 포함하는 중쇄는 서열번호 40 내지 44로 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 개시된 경쇄 가변영역은 인간 람다 불변영역에 연결될 수 있으며, 이를 포함하는 경쇄는 서열번호 45 내지 49로 나타낼 수 있다. 상기 본 발명에 따른 경쇄 및 중쇄는 다양한 조합으로 조합되어 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄로 이루어진 온전한 항체를 형성할 수 있다.
하지만 본 발명에 개시된 가변영역과 조합될 수 있는 이러한 불변영역 서열은 예시적인 것이고, 당업자라면, IgGl 중쇄 불변영역, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변영역, 임의의 카파 또는 람다 경쇄 불변영역, 안정성, 발현, 제조 가능성 또는 다른 목적하는 특징 등을 위해 변형된 불변영역을 포함하는 다른 불변영역이 사용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 실질적 동일성이란 본 발명은 서열변이가 존재하는 본 발명에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다. 일 구현예에서 표 2a에 개시된 중쇄 가변영역과 약 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진다. 다른 구현예에서 표 2b에 개시된 경쇄 가변영역과 약 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진다. 예를 들면 본 발명에 개시된 항체 또는 항원 결합단편의 서열과 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 나타내는 변이체의 경우, 임의의 변이는 CDR 보다는 가변영역의 골격에서 발생된다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 항체 또는 그 부분을 코딩하는 핵산이 개시된다. 상기 핵산은 항체 각 사슬, 또는 상기 항체의 단편, 그 돌연변이, 유도체, 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 또는 중쇄 가변영역 또는 단지 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 폴레뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭, 규명, 분석 또는 돌연변이 유발에 사용되는 PCR 또는 염기서열분석 프라이머를 포함한다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 이들은, 예를 들면, 길이가 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 2000, 또는 2500개 이상의 폴리뉴클레오타이드일 수 있고/있거나, 하나 이상의 추가의 서열, 예를 들면, 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 보다 큰 핵산, 예를 들면, 벡터의 일부일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 인공 변이체(예, 펩타이드 핵산)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서 본 발명에 개시된 항체 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 본 발명에 개시된 CDR, 상기 CDR을 포함하는 가변영역, 상기 가변영역 및 불변영역을 포함하는 전장 항체를 코딩하는 핵산이다. 아미노산 서열이 결정되면, 핵산서열은 공지의 역전사 프로그램 및 코돈사용빈도(codon usage) 등을 고려하여 용이하게 결정될 수 있다. 인간 IgGl을 코딩하는 중쇄 불변영역의 예시적인 핵산서열은 서열번호 61 내지 63으로 표시될 수 있다. 인간 람다를 코딩하는 경쇄 불변영역의 예시 적인 핵산서열은 서열번호 65 내지 67로 표시될 수 있다. 상기와 같은 불변영역의 핵산서열을 포함하는 전장 중쇄의 예시적인 핵산서열은 서열번호 50 내지 54(인간 IgGl 불변영역을 포함하는 중쇄), 전장 경쇄의 예시적인 핵산서열은 서열번호 55 내지 59(인간 람다 불변영역을 포함하는 경쇄)를 들 수 있다.
또한 표 la 내지 표 1f의 CDR 서열, 및 표 2a 및 표 2b 의 가변영역을 코딩하는 핵산서열이 포함된다. 이러한 핵산서열은 상기 개시된 전장 항체를 코딩하는 핵산서열에 포함되기 때문에, 별도로 기재되지 않으며, 당업자라면, 본 발명에 개시된 CDR 및 가변영역의 단백질서열을 기초로, 이를 코딩하는 핵산서열을 상기 핵산 서열번호 50 내지 59로부터 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 하나 이상의 핵산서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산서열을 포함한다. 실질적 동일성이란 핵산의 변이 가 아미노산 치환을 수반하지 않는 보존적 치환 또는 아미노산의 변이를 초래하는 경우라도 상기 핵산에 의해 코딩되는 항체 또는 항원결합 단편이 본 발명에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
항체의 항원 대한 특이성 및 친화도
본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합단편은 특히 B7-H3 항원에 대한 특이성 및 항체 치료제/진단제로서 사용되기에 적절한 친화도를 가진다. 일 구현예에서, 표 6에 따르면, 응집체에 대한 친화도는 KD < 1.0 x 10-7 M; 또 다른 구현예에서, KD ≤ 1.0 x 10-8 M이다. 이러한 친화도를 갖는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 이보다 낮은 친화도 예를 들면 친화도가 10-7 M보다 큰 항체와 비교하여 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있는 장점이 있다. 이는 항체를 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 보다 간편한 피하주사와 같은 방식으로 투여해도 충분한 효능을 얻을 수 있기 때문에, 임상에서 큰 장점이 있다.
항체의 가변영역
본 발명은 또한 상술한 바와 같이 상기 표 2a 및 표 2b에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변영역 또는 항체 중쇄 가변영역 및 이러한 경쇄 및 중쇄 가변영역의 면역학적 기능적 단편, 유도체, 돌연변이 단백질 및 변이체를 포함하는 항체(및 상응하는 핵산서열)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄의 가변영역이 다양하게 조합된 항체는 "VHx/VLy"로 나타낼 수 있으며, 여기서 "X"는 중쇄 가변영역 서열번호에 상응하고, "y"는 경쇄 가변영역의 서열번호에 상응한다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 가변영역은 다음과 같은 조합을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다: VH30/VL35, VH30/VL36, VH30/VL37, VH30/VL38, VH30/VL39, VH31/VL35, VH31/VL36, VH31/VL37, VH31/VL38, VH31/VL39, VH32/VL35, VH32/VL36, VH32/VL37, VH32/VL38, VH32/VL39, VH33/VL35, VH33/VL36, VH33/VL37, VH33/VL38, VH33/VL39, VH34/VL35, VH34/VL36, VH34/VL37, VH34/VL38, VH34/VL39.
앞서 언급한 바와 같은 상기 다양한 가변영역의 조합은 온전한 항체 및 scFV 등을 포함하는 다양한 형태의 항체로 사용될 수 있다.
다양한 다른 형태의 항체
본 발명에 개시된 항체는 또한 상기 본 발명에 개시된 항체의 변이체이다. 예를 들면, 항원의 일부는 상기 개시된 중쇄 또는 경쇄, 가변영역 또는 CDR 서열의 하나 이상의 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 활성 또는 항원성을 실질적으로 영향을 미치지 않는 치환을 의미한다. 일 구현예에서 보존적 아미노산 치환은 하기 아미노산 분류 중에서 동일한 분류에 속하는 다른 잔기로의 치환을 일컫는다. 자연-발생 아미노산은 측쇄 특성에 공통적 특징에 기초하여 다음과 같이 분류될 수 있다: 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: His, Lys, Arg; 5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe 보존적 아미노산 치환은 또한 펩타이드 모방체와 같은 비-자연-발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 이러한 잔기는 전형적으로 세포가 아닌, 화학적 합성에 의해 도입된다.
비제한적인 예시적인 보존적 아미노산 치환의 예는 표 3에 나타내나 이로 제한하는 것은 아니다.
[표 3] 보존적 아미노산 치환
Figure pat00058
비-보존적 치환은 상기 분류 중에서 다른 분류에 속하는 잔기로 치환을 포함한다. 이러한 치환은 인간 항체와 상동성인 항체의 영역 또는 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다.
항체의 제조
본 발명에서 비-인간 항체는, 예를 들면, 임의의 항체-생성 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 당나귀, 또는 비-인간 영장류(예를 들면, 시노몰구스 또는 붉은털 원숭이와 같은 원숭이) 또는 유인원(예를 들면 침팬지))로부터 유래될 수 있다. 비인간 항체는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날일 수 있거나, 또는 재조합 DNA를 발현시킴으로써 숙주 세포 내에서 합성될 수 있다. 완전 인간항체는 인간 면역글로불린 유전자 좌를 포함하는 형질전환 동물에 항원을 투여하거나, 또는 인간 항체의 레퍼토리를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 항원으로 처리하여, 목적하는 항체를 선택함으로써 제조될 수 있다.
모노클로날 항체(mAb)는 종래의 모노클로날 항체 방법, 예를 들면, 문헌(참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495)의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에 개시된 단쇄 항체는 아미노산 가교(짧은 펩타이드 링커)를 이용하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(Fv 영역) 단편을 연결하여 생성될 수 있다. 본 발명에 개시된 단쇄 항체는 표 1a 내지 1f에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변영역의 도메인 조합을 포함하는 scFv, 또는 표 1a 내지 표 1f에 개시된 CDR을 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 조합이 포함되지만 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 개시된 항체는 또한 서브타입 스위칭을 통해, 상이한 서브타입 항체로 변경될 수 있다. 따라서 IgG 항체는, 예를 들면, IgM 항체로부터 유래될 수 있고, 그 역도 가능하다.
따라서, 본 발명에 개시된 항체에는, 예를 들면, 목적하는 아이소타입(예를 들면, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, 및 IgD)으로 스위칭된 본 발명에 개시된 가변 도메인 조합 항체가 포함된다.
또한, 목적하는 바람직한 기능적 및 생화학적 특징을 갖는 B7-H3 결합 단백질을 생성하기 위하여, 표 2a 및 표 2b에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 표 la 내지 표 1f에 기재된 CDR에 보존적 변형(및 코딩 핵산에 상응하는 변형)이 수행될 수 있다. 이러한 변형을 수행하는 방법은 상술한 바와 같다.
질환에서 B7-H3의 역할
B7-H3는 면역관문 리간드에 속하는 단백질로 항원제시 항원제시세포(antigen presenting cells, APCs)에서 발현한다. T 세포 표면의 B7-H3 수용체와 결합하여 T 세포의 면역반응 억제를 유도한다.
B7-H3는 다양한 암종에서도 과발현하지만 정상조직에서의 발현은 매우 낮다. 예를 들면 유방암, 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신경 모세포종, 간세포암, 자궁경부암, 골육종, 구강암, 방광암, 신경교종, 비소세포폐암, 췌장암, 위암, 난소암, 대장암, 방광암, 흑생종, 자궁내 막암, 두경 부암, 요로상피 암 또는 구상피 세포암 등 다양한 고형암에서 확인되며, 급성 백혈병(Acute leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 여러 종류의 림프종(lymphoma)과 같은 혈액암에서도 과발현된다. 이러한 B7-H3의 과발현은 암세포의 침윤, 전이 촉진 및 암의 신생혈관 형성에 기여하며 결과적으로 환자의 예후와 생존률 악화와 관련되어 있다.
따라서 B7-H3의 암세포 특이적 발현은 B7-H3가 효과적인 암 표적이 될 수 있어, 이를 특이적으로 인식하는 항체의 개발이 필요하다는 것을 나타낸다. 또한 면역관문 리간드인 B7-H3의 기능을 고려하면, B7-H3 수용체의 결합을 방해하는 B7-H3 중화항체는 B7-H3를 과발현하는 다양한 암의 치료 및 암의 표적화에 유용한 수단으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
치료 목적을 위한 인간 B7-H3 항체 및 이를 포함하는 항체 접합체의 용도
본 발명에 따른 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 항체 접합체는 질환의 치료가 필요한 대상체의 질환의 치료에 사용될 수 있다. B7-H3은 주로 항원제시세포에서 발현하며, 다양한 종류의 암에서도 발현하지만 정상조직에서의 발현은 매우 낮다. 또한 암에서 B7-H3의 발현은 암환자의 좋지 않은 예후와 관련이 있으며, 암세포의 침윤, 전이 촉진 및 암의 신생혈관 형성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면 B7-H3은 위암, 폐암, 유방암 및 기타 고형암에서 과발현되고 암 혈관세포에서도 과발현되어 있어, 표적 치료제로 사용될 수 있다. 이는 B7-H3 항체가 암의 치료에 유용한 수단으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 항암 항체 치료를 위해 예를 들면 B7-H3 항체 및 이를 포함하는 항체 접합체는 앞서 기술한 바와 같이 항체 또는 이를 포함하는 항체 접합체 단독 또는 세포독성제, 화학요법제 또는 방사선 치료제와 연결 또는 다중항체의 형태로 다른 항체와 연결 또는 세포치료제의 형태로, B7-H3을 발현하는 암 세포의 제거에 사용될 수 있다. 따라서, B7-H3에 결합하는 항체 및 이를 포함하는 항체 접합체는 항체 또는 이를 포함하는 항체 접합체 단독 또는 항암화학요법제, 세포독성제 또는 방사선 물질과 결합되어 또는 다중항체 형태로 다른 타겟에 대한 특이적 항체와 연결 또는 세포치료제에서 항암 표적에 대한 표적화의 목적으로 구현되어, 상기 항체 유래 치료제를 B7-H3을 발현하는 세포로 유도하는 표적 치료제로 사용될 수 있다.
또한 면역관문 리간드인 B7-H3는 T 세포 표면의 B7-H3 수용체와 결합하여 T 세포의 면역반응 억제를 유도한다. 따라서 B7-H3와 B7-H3 수용체의 결합을 방해하는 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체 및 이를 포함하는 항체-약물 접합체는 B7-H3 면역관문억제제로 작용하여, B7-H3 면역관문에 의해 억제된 면역세포 예를 들면 T 세포의 활성화를 유도하는 면역 항암치료제로 사용될 수 있다.
이런 측면에서 본 발명은 또한 B7-H3 면역관문에 의해 억제된 T 세포의 활성을 재활성화시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편, 또는 이를 포함하는 항체-약물 접합체를 상기 치료가 필요한 대상체 또는 세포 또는 조직에 처리하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명에 따른 항체 및 이를 포함하는 항체-약물 접합체는 항암 면역항체 예를 들면 PD-1 (Programmed Death 1), PD-L1 (Programmed Death Ligand 1), CTLA(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein)-4, LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3), CD28, CD122, 4-1BB, TIM3(T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3), OX-40(CD134), OX40L(CD252), CD40, CD40L, LIGHT(또는 tumor necrosis factor superfamily member 14 (TNFSF14)), ICOS(CD278), ICOSL, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL, TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), CD27, VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation), B7-H4, HEVM(Herpes Virus Entry Mediator) 또는 BTLA(B and T Lymphocyte Attenuator), CD47 또는 CD73에 특이적으로 결합하여 항암 면역반응을 나타내는 항체와 조합으로 사용되어 보다 효과적으로 면역세포의 활성화를 유도하여, 암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
면역 항체는 크게 면역관문억제제와 면역보조자극분자 활성제로 나눌 수 있다. 면역관문(immune checkpoint)은 면역활성화를 조절하며 면역의 항상성 및 자가면역 예방에 중요한 기능을 한다. 특히 암에서 면역관문 기전이 억제되어 초기 암에 대한 면역반응을 억제하는 것으로 알려져 있다.이러한 이유로 면역관문억제제 가 효과적 암치료제로 작용할 수 있다(Pardoll, Nature Reviews Cancer volume 12, pages 252-264 (2012)). 면역관문의 기능을 갖는 분자는 자극성 및 억제성 면역관문 분자를 포함하며, 후자에는 예를 들면 A2AR(Adenosine A2A receptor), B7-H3, BTLA(B and T Lymphocyte Attenuator), CTLA(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein), IDO(Indoleamine 2,3-dioxygenase), KIR(Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor), LAG3(Lymphocyte Activation Gene-3), PD-L 1 (Programmed Death 1), TIM-3(T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3), VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)가 포함된다. 면역관문억제제는 상기 억제성 면역관문 분자를 억제 또는 차단하는 물질이다.
면역보조자극분자는 림프구의 표면에 존재하는 단백질로, 특정 리간드와 함께 항원 및 항원 수용체 결합 후의 온전한(complete) 활성화에 필요하다(The Immune Response Basic and Clinical Principles 2006, Pages 209-245 Tak W. Mak and Mary E. Saunders Elsevier Inc.).
치료 방법: 약학적 제형, 투여 경로
항체, 또는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물을 사용한 치료 방법이 또한 제공된다. 일 구현예에서 항체, 또는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물은 환자에 제공된다. 항체, 또는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물은 일 구현예 에서 암세포 표면, 암 신생 혈관 또는 항원제시세포에 발현되는 인간 B7-H3에 결합함으로써, B7-H3 면역관문을 억제하여 T 세포를 활성화시킨다. 본 발명에 따른 항체는 암세포 표면 또는 암 신생혈관에 발현하는 인간 B7-H3에 결합함으로써 암세포의 성장을 억제한다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물은 세포독성제와 결합한 형태로 암세포 표면에 발현되는 인간 B7-H3에 결합함으로써, 항체에 결합된 세포독성제를 암세포에 특이적으로 전달하여 암세포의 사멸을 유도한다. 일 구현예에서 항체는 같은 표적 또는 다른 표적에 특이적인 항체와 같은 이중항체 등 다중항체의 형태로 암세포 표면에 발현되는 인간 B7-H3에 결합함으로써, 다중항체의 암세포에 대한 특이성을 높이거나 암세포와 면역세포등의 다른 종류의 세포간의 연결을 유도하여 암세포의 사멸을 유도한다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 항체, 또는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물은 항암 면역항체, 특히 항 4-1BB 또는 항 PD-L1과 조합으로 사용되어 T 세포를 활성화를 통해 암을 억제할 수 있다.
항체, 또는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물의 치료적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물도 또한 제공된다. 또한, 예를 들면, 이러한 약학적 조성물을 투여함으로써 암 환자를 치료하는 방법이 포함된다. 용어 "환자"는 인간 환자를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항암제, 또는 이들의 조합을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항체의 제조
실시예 1-1: 항원의 제조
항 B7-H3 항체 제조를 위한 파지 디스플레이 수행에 사용되는 항원을 구매하여 사용하였다. 인간 B7-H3 의 경우 NP_001019907.1 의 아미노산 서열 1번에서 461번을 포함하며 C 말단에 히스티딘-태그(His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질(2318-B3/CF, R&D Systems) 사용하였다.
하기 실시예의 ELISA 분석, SPR 분석 또는 T 세포 활성 분석에 사용되는 항원을 다음과 같이 구매하여 사용하였다. 인간 B7-H3의 경우 NP_001019907.1 의 아미노산 서열 1번에서 461번을 포함하며 C 말단에 히스티딘-태그(His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질(Sino Biological, 11188-H08H)과 C 말단에 인간 IgGl의 Fc 부분이 결합되어 있는 단백질(Sino Biological, 11188-H02H)을 사용하였다.
실시예 1-2: 파이지 라이브러리 스크리닝을 통한 항체 선별 제조
라이브러리 파아지(Library phage)의 제조
다양한 항원에 대한 결합 가능성을 가지는 인간 유래 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리(Mol. Cells OT, 225-235, February 28, 2009) 유전자를 가진 대장균을 2X YT(Amresco, J902-500G), 암피실린(Ampicilin)이 100 ㎍/㎖, 2% 글루코스(sigma, G7021)를 포함하는 배지에 2 x 1010개를 접종하여 37℃에서 2시간에서 3시간 동안 배양하여 0D600 값이 0.5에서 0.7이 되도록 하였다. 배양한 대장균을 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시킨 후, 2X YT [2X YT, 암피실린(Ampicilin) 100 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(Duchefa, I1401)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하여 파이지 패킹을 유도하였다. 이어 배양한 세포를 4℃, 4500 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리한 후, 상등액에 4% PEG 8000(sigma, P2139)과 3% NaCl(Samchun, S2097)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음 위에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 4℃, 8000 rpm 조건으로 원심분리한 후, 상등액은 버리고 세포 펠렛에 PBS (Phosphate buffered saline, Gibco 10010-023)를 첨가하여 현탁하였다. 현탁액을 4℃, 1200 rpm 조건으로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 새 튜브로 옮겨 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.
파아지 디스플레이(Phage display)를 통한 패닝(panning)
인간 B7-H3 단백질과 결합하는 항체를 선별하기 위해 실시예 1의 히스티딘-태그(His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질을 이용하여 다음과 같이 패닝을 총 3회 진행하였다.
구체적으로 면역시험관(immunotube, maxisorp 444202)에 2 ㎍/㎖ 농도의 재조합 인간 B7-H3 단백질을 1 ㎖ 첨가하여 37℃, 200 rpm 조건에서 1시간 반응시켜 시험관 표면에 단백질을 흡착시켰다. 이어 상등액을 제거하고 탈지유(Skim milk)가 3% 포함된 용액을 시험관에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 통해 재조합 인간 B7-H3 단백질이 흡착되지 않은 면역시험관 표면에 Skim milk를 흡착시켜 비특이적 결합을 차단하였다. 이어 상등액을 제거한 후, 실시예 1-2에서 준비한 파지 라이브러리의 1012 CFU를 3% Skim milk가 포함된 용액에 섞어 상기 면역시험에 넣고 37℃, 150 rpm 조건에서 1시간 반응시켜 인간 B7-H3 단백질 특이적인 파지가 항원에 결합하도록 하였다.
이어 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 3회 씻어내어 제거하고, 남아있는 항원 특이적 파지 항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 1 ㎖ 넣어 회수하였다. 트리에틸아민 용액의 pH가 낮기 때문에 회수된 파지를 lM Tris 완충액(pH 7.4)으로 중화시킨 후, OD600에서 0.8~1로 키운 ER2537 대장균에 37℃, 120 rpm 조건에서 1시간 30분 동안 감염시켰다. 배 양액을 4℃, 4500 rpm 조건으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 가라않은 세포를 감염된 대장균을 암피실린(Ampicilin)을 포함하는 2X YT 한천배지에 도말하여 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 모두 긁어 5 ㎖의 2X YT 암피실린 배양액에 현탁하고 50% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고 나머지는 다음 실험을 위해 파아지를 제조하였다. 배양된 대장균 20 ㎕를 암피실린이 포함된 2X TB에 접종하여 키운 후 헬퍼 파아지 감염시키고 실시예 2-1 과 2-2을 2번 더 반복하여 인간 B7-H3 단백질 특이적인 파아지 풀(phage pool)을 증폭 및 농축하였다.
단일클론 파아지 항체 선별(single clone screening)
상기 패닝을 통해 얻은 파아지 풀(phage pool)로부터 인간 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB-암피실린 한천배지에 상기 파아지 풀을 도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이어 단일클론을 웰당 200 ㎕의 super broth(SB) 배지가 들어간 96 깊은 웰 플레이트에 접종하여 37℃에서 4시간 배양하여 키운 후, 일부를 다른 플레이트에 옮겨 Cell stock을 만들었다. 남아 있는 세포 배양액에 1 mM IPTG 되게 넣어 주고 30℃에서 16시간 동안 배양하여 scFv의 생산을 유도하였다. 배양한 배양액을 4℃, 6000 rpm 조건으로 20분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 세포만을 얻은 후 TES 용액을 이용하여 세포를 용해시킨 후에 다시 원심분리하여 상등액만 얻어서 사용하였다.
이어 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 B7-H3-His 항원(2318-B3/CF,R&D Systems)과 결합하는 단일클론 가용성 scFv를 발현하는 클론을 선택하였다(Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual, lst ed. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. pp.l1.9-11.12). 구체적으로 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY, USA)에 실시예 1에서 준비한 재조합 인간 B7-H3-His 단백질을 PBS에 희석하여 웰당 100 ng 넣고, 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 다음날 플레이트에 단백질을 PBST(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)로 씻어준 후, 비특이적인 결합을 방지하기 위해 3% BSA이 포함된 PBS 완충용액을 웰당 200 ㎕을 넣고 37℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이어 PBST로 다시 씻어준 후 미리 원심분리하여 준비한 파지가 포함된 상등액을 각 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어준 후 인간 B7-H3에 결합된 파지를 검출하기 위해 항-HA HRP(Horseradish peroxidase) 결합 항체(Roche, 12 013 819 001)를 1% BSA가 포함된 PBS에 1:5000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Thermo, 34028) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1N H2S04를 50 ㎖ 넣어 반응을 종료하였다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 값이 1.0 이상인 클론을 선별하였다.
이로부터 재조합 인간 B7-H3 단백질에 결합하는 5개 항체 클론(B5, C4I, D8G, F6V, 및 10F11)을 선별하였으며, 상기 각 항체의 중쇄 가변 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 CDR 서열은 다음 표와 같다.
[표 4]
Figure pat00059
상기 가변영역 및 CDR 서열을 코딩하는 핵산서열은 B5, C4I, D8G, F6V, 및 10F11의 순서대로 하기 전장 핵산서열에 포함되어 있다: 서열번호 50(중쇄) 및 55(경쇄); 서열번호 51(중쇄) 및 56(경쇄); 서열번호 52(중쇄) 및 57(경쇄); 서열번호 53(중쇄) 및 58(경쇄); 서열번호 54(중쇄) 및 59(경쇄). 상기 핵산서열에서 불변영역을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 61 내지 63(중쇄), 및 서열번호 65 내지 67(경쇄)이다.
실시예 2: 항 B7-H3 scFv의 전체 IgG 형태로 변환 및 생산
실시예 2-1: 항 B7-H3 scFv의 전체 IgG 형태로의 클로닝
상기 실시예 1에서 확보한, 각 인간 B7-H3 특이적 단일클론 파아지 항체의 서열을 전체 IgG(full IgG) 형태로 변환하기 위해, 실시예 1에서 확보한 각 클론의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산을 합성하였다(제노텍, 대한민국). 인간 IgGl 서브타입의 중쇄와 경쇄 불변영역(각각 서열번호 60 및 64) 단백질을 코딩하는 유전자(중쇄 불변영역 서열번호 61(C4I, D8G, 10F11 clone), 62(B5 clone), 63(F6V clone) 및 경쇄 불변영역 65(C4I, D8G, 10F11 clone), 66(B5 clone) 및 67(F6V clone))를 합성하여 상기 각 중쇄와 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산과 연결하였다. 각 항체의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 핵산은 각각 pcDNA3.1 기반의 발현 벡터에 클로닝하여 CHO-S 등의 포유동물세포주에서 항체 핵산을 암호화하는 벡터를 확보하였다. 또한 기존 항 B7-H3 항체인 Enoblituzumab를 비교군 항체로 사용하기 위해 항체의 가변영역 서열을 특허 (US 8,802,091)에서 확보하여 유전자를 확보하였고 상술한 방법과 동일하게 클로닝하여 84D로 명명하여 사용하였다. 또한 기존 항 B7-H3 ADC인 MGC018를 비교군 ADC로 사용하기 위해 이를 구성하고 있는 항체의 가변영역 서열을 특허출원 (WO 2017/180813)에서 확보하여 유전자를 확보하였고 상술한 방법과 동일하게 클로닝하여 사용하였다.
IgG 형태의 본 발명에 따른 항체는 B5, C4I, D8G, F6V 및 10F11의 순서대로 하기 중쇄 및 경쇄 전장 서열로 개시된다: 서열번호 50(중쇄) 및 55(경쇄); 서열번호 51(중쇄) 및 56(경쇄); 서열번호 52(중쇄) 및 57(경쇄); 서열번호 53(중쇄) 및 58(경쇄); 서열번호 54(중쇄) 및 59(경쇄).
실시예 2-2: 항 B7-H3 항체 의 발현
항 B7-H3 항체의 발현은 Thermo사에서 개발한 ExpiCHO-S™(Thermo Fisher, A29127) 세포를 이용하였고, 항체의 발현은 제조사의 ExpiCHO™Expression System Kit(Thermo Fisher, A29133) 프로토콜에 준수하여 수행하였다.
제조방법을 간단히 설명하면, ExpiCHO-S 세포를 8% CO2, 37℃ 조건의 진탕배 양기(shaking incubator)에서 120 rpm 조건으로 배양하였다. 트랜스펙션(Transfection) 당일 ExpiCHO-S 세포를 6 x 106 cells/㎖의 세포 농도로 ExpiCHO™ Expression Medium(Thermo Fisher, A2910001)을 첨가하여 희석하여 준비하였다.
이어 실시예 2-1의 중쇄와 경쇄를 발현하는 각 벡터를 각각 배지 ㎖당 1 ㎍씩 OptiPRO™ SFM 배지(Thermo Fisher, 12309050)에 희석하고, ExpiCHO Expression system에 포함되어 있는 ExpiFectamine™CHO를 ㎖당 3.2 ㎕를 OptiPRO™ SFM 배지 희석하였다. 상기 벡터 및 ExpiFectamine™CHO 혼합물을 서로 섞어 상온에서 5분 동안 반응시킨 후, 준비된 세포에 혼합물을 넣어 8% CO2, 37℃, 120 rpm 조건으로 20시간 배양하였다. 20시간 후에 ExpiCHO™ Expression System Kit(Thermo Fisher, A29133)에 포함되어 있는 Enhencerl, ExpiCHO™ Feed를 각각 ㎖당 2.2 ㎕, 240 ㎕를 세포에 첨가한 후 8% CO2, 37℃, 120 rpm 조건으로 7일에서 10일 정도 배양하였다.
배양이 끝난 후 세포배양액을 4℃, 6000 rpm 조건으로 30분간 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 냉장보관하였다.
실시예 2-3: 항 B7-H3 항체의 분리 정제
평형화 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl)을 Mab selectsure(GE healthcare, 5 ㎖)에 통과시켜 평형시킨 이후, 실시예 2-2의 배양액을 컬럼(Mab selectsure(GE healthcare, 5 ㎖))에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 50 mM Na-citrate(pH 3.4), 100 mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1M Tris-HCl(pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2가 되게 하였다. 완충액을 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하였다.
실시예 3: 항 B7-H3 IgG 항체의 B7-H3에 대한 결합 특이성 분석
실시예 3-1: 항 B7-H3 IgG 항체의 재조합 B7-H3 항원에 대한 결합능 분석(ELISA)
상기 실시예 2에서 제조된, 실시예 1에서 선별된 항 B7-H3 IgG 항체의 B7-H3 항원에 대한 특이적 결합능을 확인하기 위해 ELISA 기반 용액 결합 시험을 사용하여 분석하였다.
구체적으로 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 재조합 인간 B7-H3 단백질을 l ㎍/㎖ 농도로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어준 후, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 사용한 재조합 인간 B7-H3 단백질은 실시예 1에서 분석용으로 구매한 제품을 사용하였다.
이어 단백질을 제거하고 PBST로 씻어준 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ㎕ 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적인 결합을 차단시켰다. 이어 96-웰 플레이트상에서 실시예 2에서 준비한 항 B7-H3 항체를 10 ㎍/㎖을 기준으로 일정 비율로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕ 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어준 후 인간 B7-H3에 결합된 항체를 검출하기 위해 HRP-접합 항 인간 IgG F(ab')2 항체 (Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 우혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1N H2S04를 50 ㎕ 넣어 반응을 종료하고 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm과 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 1에 기재되어 있다. ELISA 방법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 인간 B7-H3의 세포외영역에 농도 의존적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 3-2: 항 B7-H3 항체의 B7 패밀리의 다른 단백질들에 결합능 분석
B7 패밀리 단백질은 서로 20~40%의 아미노산 동일성을 가지고 있으며 면역글로불린 도메인의 반복성과 같이 구조적 관련성을 가진다. 그래서 다른 B7 패밀리 단백질이 아닌 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는지 아래와 같이 분석하였다.
면역 특이 결합성 확인을 위해 구조적 유사성을 가지는 B7 패밀리 구성 단백질: B7-l(Sino Biological, Cat #: 10698-H08H), B7-2(Sino Biological, Cat #: 10699-H08H), B7-DC(Sino Biological, Cat #: 10292-H08H), B7-Hl(Sino Biological, Cat #: 10084-H08H), B7-H2(Sino Biological, Cat #: 11559-H08H), B7-H4(Sino Biological, Cat#: 10738-H08H), B7-H5(Sino Biological, Cat#: 13482-H08H), B7-H6(Sino Biological, Cat #: 16140-H08H), B7-H7(Sino Biological, Cat #: 16139-H02H)은 구매하여 사용하였다.
구체적으로 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 재조합 인간 B7 패밀리 단백질을 l ㎍/㎖ 농도로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어준 후, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 사용한 재조합 단백질은 실시예 1에서 분석용으로 구매 한 제품을 사용하였다.
이어 단백질을 제거하고 PBST로 씻어준 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ㎕ 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적인 결합을 차단시켰다. 이어 96-웰 플레이트 상에서 실시예 2에서 준비한 항 B7-H3 항체를 10 ㎍/㎖으로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕ 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어준 후 항원에 결합된 항체를 검출하기 위해 HRP-접합 항 인간 IgG F(ab')2 항체 (Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 우혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1N H2S04를 50 ㎕ 넣어 반응을 종료하고 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm 및 650nm에서 홉광도를 측정하였다.
결과는 도 2에 기재되어 있다. ELISA법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 B7 패밀리 단백질이 아닌 B7-H3에만 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 3-3: 항 B7-H3 항체의 인간, 원숭이, 및 마우스 B7-H3 항원에 대한 종간 교차 반응성 분석
인간에 대한 임상 진행 이전에 항 B7-H3 항체의 항체 효능 및 면역 조절기 활성을 평가하기 위해서는 설치류 또는 영장류 모델에서의 평가가 중요하다. 인간 B7-H3의 서열은 원숭이와 마우스에서 90% 이상 상동성을 공유하고 있다. 실시예 2에서 제조된 본 발명의 항 B7-H3 항체의 마우스 또는 원숭이 B7-H3에 대한 교차 반응성을 다음과 같이 ELISA 분석법을 통해 분석하였다.
종간 교차반응성을 확인하기 위해 C 말단에 히스티딘 태그(His tag)이 결합된 재조합 마우스 B7-H3 단백질(Sino Biological, Cat#: 50973-M08H)와 C 말단에 인간 IgGl의 Fc 부분이 결합되어 있는 재조합 원숭이 B7-H3 단백질(Sino Biological, Cat#: 90806-C02H) 항원을 구매하여 사용하였다.
96-웰 플레이트(Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 재조합 인간 B7-H3, 마우스 B7-H3, 원숭이 B7-H3 단백질을 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어준 후, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅하였다. 사용한 재조합 단백질은 실시예 1에서 분석용으로 구매한 제품을 사용하였다.
이어 단백질을 제거하고 PBST로 씻어준 후, 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ㎕ 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적인 결합을 차단시켰다. 이어 96-웰 플레이트 상에서 실시예 2에서 준비한 항 B7-H3 항체를 10 ㎍/㎖부터 일정 비율로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕ 넣고 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBST로 씻어준 후 인간 B7-H3, 원숭이 B7-H3, 마우스 B7-H3에 결합한 항체를 검출하기 위해 HRP-접합 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 우혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 1:l0,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 씻어준 후 TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ㎕ 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후 1N H2S04를 50 ㎕ 넣어 반응을 종료하고 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm 및 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 3과 도 4에 기재되어 있다. ELISA법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 본 발명의 항 B7-H3 항체는 인간과 원숭이의 B7-H3에 대한 결합 정도는 유사하게 나타났으나 마우스 B7-H3에 대한 결합 정도는 상대적으로 낮았다(도 3). 각 항체 클론별 마우스 B7-H3에 대한 결합 정도는 상이하였으며, 비교항체로 사용한 84D 항체는 마우스 B7-H3 단백질 에 결합하지 않는 것으로 관찰되었다(도 4).
실시예 3-4: 항 B7-H3 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정
이어 FACS 분석을 통하여 실시예 2에서 제조된 본 발명의 항 B7-H3 항체가 세 포 표면에서 발현되는 인간 B7-H3에 결합하는 능력을 측정하였다. 특정 항원에 대한 항체가 치료용 항체 등 생체 내에서 사용되기 위해서는 세포 표면 발현 항원에 결합하는 것이 필수적인 요소이다. 일부 항체의 경우 정제된 항원에는 결합하지만 세포 표면 발현 항원에는 결합하지 않는다. 이런 경우 생체 내로 항체를 투여하여도 항원에 대한 결합이 불가능하므로 항원을 발현하고 있는 세포에 항체가 결합하지 못하여 치료용 항체 등 생체 내에서의 활성을 보일 수 없다. 이에 본 발명의 항 B7-H3 항체가 세포 표면 발현 B7-H3에 결합하는지 여부를 FACS 분석을 통하여 확인하였다.
실험을 위하여 인간 B7-H3를 발현하는 암세포주인 MCF-7(Human breast adenocarcinoma cell line, ATCC® HTB-22™), DLD1(colorectal adenocarcinoma cell lines, ATCC® CCL-221™), HCC1954(TNM stage IIA, grade 3, ductal carcinoma, ATCC® CRL-2338™), 및 HCT116(colon cancer cell, ATCC® CCL-247™) 및 인간 B7-H3를 발현하지 않는 암세포주인 Jurkat(acute T cell leukemia, ATCC® TIB-152™)을 이용하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS 버퍼로 세척한 후, 세포수를 계수하여 웰당 2 x l05 cells로 맞춰 200 ㎕ PBS 넣어 준비한다. 실시예 2의 항 B7-H3 항체 및 비교군 항체(84D) 각각을 1% BSA가 포함된 PBS에 10 ㎍/㎖ 농도 또는 10 ㎍/㎖ 농도부터 일정 비율로 희석하여 미리 준비해둔 세포와 혼합하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척 후 FITC 표지된 항-human Fc FITC(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0 mg/㎖를 1:500으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 음성대조군은 FITC 표지된 항-human Fc FITC만 처리하였다. 다시 PBS 버퍼를 이용해 2회 세척 후, FACSCalibur 기기를 이용하여 항-BCMA IgG가 결합된 정도를 측정하였다.
각각의 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 인간 B7-H3-단일클론항체-FITC 결합에 의한 이동된 판독 결과를 음성대조군 결합과 비교하였다. 결과는 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 음성대조군에서 이동된 판독 결과로 나눈 값(MFI)으로 표기하였으며, 도 5 및 도 6에 기재되어 있다. FACS법을 이용한 결합능 측정 결과 항 B7-H3 항체는 세포 표면에 발현하는 인간 B7-H3 에 특이적으로 그리고 농도 의존적인 양상으로 결합함을 확인하였다.
실시예 3-5: 항-B7-H3 IgG 항체의 다양한 암종에서의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정
이어 FACS 분석 을 통하여 본 발명의 항 B7-H3 항체가 다양한 종류의 암세포주에서 세포 표면 발현 B7-H3에 결합하는지 여부를 확인하였다. B7-H3는 다양한 암세포에서 발현하는데 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer), 신장 세포 암(Renal cell carcinoma), 신경 모세포종(Neuroblastoma), 대장암(Colorectal cancer), 췌장암(Pancreatic cancer), 위암(Gastric cancer), 폐암(Lung cancer), 전립선암(Prostate cancer), 자궁내막암(Endometrial cancer), 간세포 암(Hepatocellular carcinoma), 폐암(Lung cancer), 유방암(Breast cancer), 자궁 경부암(Cervical cancer), 골육종(Osteosarcoma), 구강암(Oral carcinoma), 방광암(Bladder cancer), 신경교종(Glioma), 흑색종(Melanoma) 등 다양한 고형암에서 확인되며 급성 백혈병(Acute leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 여러 종류의 림프종(lymphoma)와 같은 혈액종에서도 발현되는 것으로 보고 되어있다.
이 실험을 위하여 다양한 종류의 암세포 A2780(human ovarian cancer, ECACC, 93112519), SKOV-3(human ovarian adenocarcinoma, ATCC® HTB-77™), OVCAR-3(human ovarian adenocarcinoma, ATCC® HTB-161™), HCT116(colon cancer cell, ThermoFIshcer Sci), HT29(olorectal adenocarcinoma, ATCC® HTB-38™), DLD-1 (colorectal adenocarcinoma cell lines, ATCC® CCL-221™), Calu-6(Non-small-cell lung carcinoma, ATCC® HTB-56™), HCC1954(TNM stage IIA, grade 3, ductal carcinoma, ATCC® CRL-2338™), HCC1187(TNM stage IIA, ATCC® CLC-2322™), 신장암 세포주 786-0(renal cell adenocarcinoma, ATCC® CRL-1932™), A498(kidney carcinoma, ATCC® HTB-44™), Pane-1 (pancreas epithelioid carcinoma, TCC® CRL-1469™), NCI-N87(gastric carcinoma, TCC® CRL-5822™), HeLa(cervix adenocarcinoma, ATCC® CCL-2™), JeKo-1 (Lymphoma, ATCC® CRL-3006™)와 FACSCalibur(BD Biosciences) 기기를 이용하여 항 B7-H3 항체와 B7-H3의 결합된 정도를 다음과 같이 측정 하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS에서 세척한 후, 세포수를 계수하여 2 x l05 cells/200 ㎕ PBS로 맞춘 뒤, 실시예 2에서 준비된 각 B7-H3 단일클론 항체를 10 ㎍/㎖으로 처리 후 4℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척한 뒤 FITC 표지된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체(Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0 mg/㎖)를 1:500으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 세포를 PBS에서 세척하고 FACSCalibur 기기를 이용하여 판독하였다. 음성대조군은 FITC 라벨링된 불가변영역(Fc) 특이적인 항체만 처리하였다. 각 암세포주간 B7-H3의 발현정도를 비교하기 위하여 각 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 이동된 판독 결과를 음성대조군에서 이동된 판독 결과로 나눈 값(MFI)을 표기하였다. 결과는 표 5에 기재되어 있다.
[표 5]
Figure pat00060
FACS법을 이용한 결합능 측정 결과 본 발명의 항 B7-H3 항체는 난소암, 대장암, 비소세포폐암, 유방암, 신장암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 림프종 유래의 다양한 암세포주에서 결합이 확인되었다. 또한 본 발명의 항 B7-H3 항체는 비교군으로 사용한 항체인 84D와 비교하여 동일한 농도에서 더 높은 결합력을 나타내어 세포 표면 발현 B7-H3에 대한 결합정도가 더 우수함을 확인하였다.
실시예 3-6: 항 B7-H3 항체의 마우스 유래 암세포의 마우스 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정(FACS)
이어 FACS 분석을 통하여 본 발명의 항 B7-H3 항체가 세포 표면 발현 마우스 B7-H3에 결합하는 능력을 측정하였다. 실시예 3-3에서 본 발명의 항 B7-H3 항체가 인간 B7-H3와 마우스 B7-H3 재조합 단백질에 모두 결합함을 ELISA법을 통하여 확인하였다. 본 발명의 항 B7-H3 항체가 마우스 암세포주의 세포 표면에 발현하는 마우스 B7-H3에 결합하는지 여부를 확인하기 위하여 마우스 유래 암세포주인 CT26 (Mus mesculus colon carcinoma, ATCC® CRL-2638™), B16F10(Mus musculus skin melanoma, ATCC® CRL-6475™), TC-l(Mus musulus Lung tumor, ATCC® CRL-2493™) 세포주를 사용하였다.
구체적으로 각 세포주를 해리시키고 PBS 버퍼로 세척한 후, 세포수를 계수하여 웰당 2 x l05 cells로 맞춰 200 ㎕ PBS 넣어 준비한다. 실시예 2번의 항 B7-H3 항체 및 비교항체(84D) 각각을 1% BSA가 포함된 PBS에 10 ㎍/㎖ 농도 또는 10 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 미리 준비해둔 세포와 혼합하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척 후, FITC 표지된 항-human Fc FITC(Sigma, F9512)를 1:500으로 희석하여 웰당 100 ㎕ 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 대조군은 FITC 표지된 항-human Fc FITC만 처리하였다. 다시 PBS 버퍼를 이용해 2회 세척 후, FACSCalibur 기기를 이용하여 항-B7-H3 IgG가 결합된 정도를 측정하였다.
각각의 B7-H3 단일클론항체를 처리한 실험군에서 인간 B7-H3-단일클론항체-FITC 결합에 의한 이동된 판독 결과를 대조군 결합과 비교하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다. FACS법을 이용한 결합능 측정 결과 본 발명의 항 B7-H3 항체들은 세포 표면에 발현하는 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 4: 항 B7-H3 항체의 B7-H3에 대한 친화도(Affinity) 측정
항원 B7-H3와 항 B7-H3 항체와의 결합친화도를 SPR방법으로 측정하였다. 먼저 1X HBS-EP버퍼로 희석한 항 B7-H3 항체를 contact time 60초, stabilization period 60초, 유속 30 ㎕/min으로 Protein A chip(GE healthcare, Cat. No. 29127556)에 50 RU가 되도록 capture하였다. 1X HBS-EP 버퍼로 항원 B7-H3(R&D systems, 2318-B3-050/CF)을 100 nM부터 3.125 nM까지 2배씩 단계 희석하여 준비 하였다. 이 때 blank로 1X HBS-EP buffer를 추가하여 준비하였다. 항 B7-H3 항체를 capture한 chip 위에 준비한 항원 B7-H3을 유속 30 ㎕/min으로 association time 60초, dissociation time 180초간 흘려주었다. Regeneration은 10 mM Glycine-HCl pH 1.5(GE healthcare, Cat.No. BR100354)를 유속 30 ㎕/min으로 contact time 30초로 하였다. 결과는 표 6 에 기재하였다.
[표 6] 항 B7-H3 항체의 B7-H3에 대한 친화도 측정 결과
Figure pat00061
실시예 5: 항 B7-H3 항체의 항체 의존적 세포독성 측정
항체의 항암 치료 효과는 세포사멸 유도, 보체-의존적 세포독성 (Complement-dependent cytotoxicity, CDC), 항체 의존적 세포 식세포 작용(antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP) 및 항체 의존적 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 등의 기작을 통해 이루어 지는데, 특히 ADCC 기작은 항체의 효능을 나타내는 지표 중 하나이며 치료용 항체의 항암효과에 있어 핵심적인 기능으로 알려져 있다.
항체 의존적 세포독성은 자연살해세포(NK, Naturalkillercell)가 항체를 통해서 종양세포 등의 표적 세포를 살해하는 작용 활성을 의미하며 직접적으로 암세포의 증식, 전이를 억제할 수 있다. 본 발명의 항 B7-H3 항체의 항암치료제 개발을 위한 기전 분석의 하나로 항체 의존적 세포독성 능력을 분석하였다.
항 B7-H3 항체의 항체 의존성 세포독성 능력은 ADCC Reporter Bioassay(Promega, G7018) 키트를 이용하여 확인하였다. 실험방법은 제조사의 프로토콜에 준수하여 수행하였다.
항체 의존성 세포독성 능력 분석을 위해 B7-H3의 발현정도가 상대적으로 높은 세포주로 MCF-7 유방암 세포주, Calu-6 폐암 세포주, DLD-1 대장암 세포주를, B7-H3의 발현정도가 상대적으로 낮은 세포주로는 Mino 외투세포림프종 세포주를 사용하였다. B7-H3 발현이 없는 음성대조군으로는 Jurkat 성인 T 세포 백혈병 세포주를 사용하였다. 구체적으로 부착배양세포주인 MCF-7, Calu-6, DLD-1 세포주는 실험 전날 해리시킨 후 4℃, 1200 rpm 조건으로 5분간 원심분리한 후, 세포를 10% 소태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지에 혼탁하여 96 웰 플레이트에 웰당 5 x l03 또는 l x l04 세포를 접종하여 배양하였다. 실험 당일 배지를 제거하고 PBS로 씻어준 후, 세포에 LowIgG Serum(Promega, AX20A)이 4% 첨가된 RPMI 1640 배지를 25 ㎕ 첨가하여 준비하였다. 현탁배양 세포주인 Mino와 Jurkat 세포주는 4℃, 1200rpm 조건으로 5분간 원심분리한 후, RPMI 1640(4% LowIgG Serum)배지에 혼탁하여 96 웰 플레이트에 웰당 5 x l03 또는 l x l04/25 ㎕ 세포를 접종하였다.
실시예 2에서 준비한 본 발명의 항 B7-H3 항체 및 비교군 항체(84D) 각각을 10 ㎍/㎖ 또는 15 ㎍/㎖ 또는 18 ㎍/㎖의 농도부터 일정 비율로 RPMI 1640 배지(4% Low IgG Serum)에 희석하여 준비한 후 웰당 25 ㎕씩 첨가하였다. 이어 ADCC reporter Bioassay에 포함된 Jurkat/NFAT-FcγRIIIa 세포를 37℃ 워터배스에 넣어 녹인 후, RPMI 1640 배지(4% Low IgG Serum)를 3.6 mL 첨가하여 혼합하였다. 각 웰당 Jurkat/NFAT-FcγRIIIa 세포를 25 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 6시간 동안 반응시킨다. 이어 Bio-Glo luciferase assay(Promega, G7941)에 들어 있는 기질을 포함된 버퍼에 녹여 웰당 75 ㎕를 첨가하여 실온에서 5분에서 10분 정도 반응시킨 후 형광을 측정하였다.
항 B7-H3 항체에 의한 항체 의존적 세포독성 효과는 도 8에 기재되어 있다. B7-H3 발현하지 않는 음성대조군인 Jurkat 세포주에서는 항체 의존적 세포독성이 관찰되지 않았으나 B7-H3가 발현하는 MCF-7, Calu-6, DLD-l, Mino 세포주에서만 항 B7-H3 항체 특이적으로 항체 의존적 세포독성 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 항체가 B7-H3을 발현하는 암세포에만 특이적으로 결합하여 항체 의존성 세포독성을 유도하므로 암세포의 사멸에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 특히 본 발명의 항 B7-H3 항체는 비교항체인 84D와 비교하였을 때 반수영향농도(EC50)가 낮고 항체 의존성 세포독성 신호의 세기는 강력하므로 보다 효과적으로 암치료에 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 6: 항 B7-H3 항체의 T 세포 활성화 유도능 측정
실시예 6-1. 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)에서 B7-H3 단백질에 의한 T 세포 활성 억제 효과 측정
B7-H3는 면역관문 리간드에 속하는 단백질로 T 세포 표면의 B7-H3 수용체와 결합하여 T 세포의 면역반응 억제를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 먼저 활성화된 T 세포에 의한 사이토카인(인터페론 감마)의 분비가 B7-H3 단백질에 의해 억제되는지 여부를 알아보기 위하여 PBMC에 B7-H3 단백질을 처리한 후 인간 T 세포의 사이토카인 분비량을 측정하였다.
구체적으로 인간 T 세포를 활성화시키기 위해 항-CD3 항체(UCHT1, Biolegend)를 5 ㎍/㎖이 되도록 PBS에 희석하여 준비하였고, B7-H3 단백질의 억제 효과를 알아보기 위해 B7-H3 단백질(Sino Biological, 11188-H08H) 또는 음성대조군인 IgGl(BioXCell, BP0297, IgGl 또는 Cont. Ab로 표기)을 5 ㎍/㎖로 희석한 항-CD3 항체에 첨가하여 40 ㎍/㎖부터 4배 연속적인 희석을 진행하여 준비하였다. 희석하여 준비한 항-CD3 항체와 B7-H3 단백질 또는 항-CD3 항체와 음성대조군은 96-웰 세포 배양 플레이트(Coming)에 50 ㎕/well로 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS로 1회 세척하였다. 구매하여 준비한 인간 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, CTL)는 FBS(Fetal Bovine Serum)가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액에 현탁하여 항-CD3 항체와 B7-H3 단백질 또는 항-CD3 항체와 음성대조군을 처리하여 코팅한 플레이트에 1 x 106 cells/well로 분주하여 배양하였다. 배양 3일 후, 배양 상층액을 사용하여 분석기 제조사의 지침에 따라 ELISA 분석기(R&D system)로 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량 분석 실험을 진행하였다. 결과는 도 9a에 기재되어 있다. 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량을 측정한 결과 B7-H3 단백질에 의해 T 세포의 활성이 억제되어 인터페론 감마 생성이 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 6-2: 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)에서 항 B7-H3 항체에 의한 T 세포 활성화 유도능 측정
이어 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)를 이용하여 B7-H3 단백질에 의해 억제된 T 세포의 활성을, 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체가 다시 활성화시킬 수 있는지를 조사하였다. B7-H3 단백질과 T 세포 표면의 B7-H3 수용체간의 결합을 차단할 수 있는 항 B7-H3 항체는 B7-H3에 의해 억제된 T 세포의 면역반응을 재활성화시킬 수 있다. 이렇게 활성화된 T 세포는 면역 항암치료 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
실시예 6-1에서와 같이 활성화된 T 세포에 의한 사이토카인(인터페론 감마)의 분비가 B7-H3 단백질에 의해 억제되는 것을 본 발명에서 제조한 항 B7-H3 항체가 차단시킬 수 있는지를 B7-H3 단백질로 코팅된 플레이트에 PBMC를 넣고 본 발명의 항 B7-H3 항체를 처리한 후 인간 T 세포의 사이토카인 분비량 측정을 실시하였다. 인간 T 세포를 활성화시키기 위해 항-CD3 항체(UCHT1, Biolegend)를 5 ㎍/㎖이 되도록 PBS에 희석하여 준비하였고, B7-H3 단백질에 의한 T 세포 활성화를 억제시키기 위해 5 ㎍/㎖로 희석한 항-CD3 항체에 B7-H3 단백질을 10 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 희석하여 준비한 항-CD3 항체에 첨가하여 희석한 B7-H3 단백질은 96-웰 세포 배양 플레이트(Corning)에 50 ㎕/well로 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS로 1회 세척하여 준비하였다. 항 B7-H3 항체와 음성대조군인 IgGl(BioXCell, BP0297, IgGl 또는 Cont. Ab로 표기)은 FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen)가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액(Invitrogen)에 첨가하여 16 ㎍/㎖로부터 4배 연속적인 희석을 진행하여 준비하였다. 구매하여 준비한 인간 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, CTL)는 FBS가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액에 현탁하여 항-CD3 항체와 B7-H3 단백질을 처리하여 코팅한 플레이트에 1 x 106 cells/well로 분주하였다. 인간 말초혈액 단핵구 세포를 분주한 플레이트에 4배 연속적인 희석을 진행하여 준비한 한 항 B7-H3 항체와 음성대조군 IgGl을 50 ㎕/well로 분주하였다. 마지막으로 FBS가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액을 100 ㎕/well로 분주하여 항체가 세포에 처리되는 최고 농도의 최종 농도가 4 ㎍/㎖ (27 nM)이 되도록 실험하였다. 항 B7-H3 항체를 단일 농도로 처리한 실험의 경우 항체의 최종 농도가 10 ㎍/㎖이 되도록 처리하였다. 배양 3일 후, 배양 상층액을 사용하여 분석기 제조사의 지침에 따라 ELISA 분석기 (R&D system)로 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량 분석 실험을 진행하였다.
결과는 도 9b에 기재되어 있다. 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량을 측정한 결과 본 발명에서 제조된 항 B7-H3 항체는 B7-H3 단백질에 의해 억제된 T 세포를 재활성화시켜 인터페론 감마의 생성이 촉진되는 것을 확인하였다. 상기 분석결과는 암의 성장을 억제할 수 있는 하나의 기전으로, 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체가 T 세포의 활성화를 유도할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 본 발명의 항 B7-H3 항체가 면역관문억제제로 개발될 수 있음을 시사한다.
대표적인 면역관문억제제인 항 PD-L1, 항 PD-1 항체는 각각 면역관문리 간드인 PD-L1 또는 T 세포 표면에서 발현되는 면역관문수용체인 PD-1에 결합함으로써 PD-L1 과 PD-1 간의 결합을 차단하는 항체이다. 항 PD-1 항체와 항 PD-L1 항체는 탁월한 항암효능으로 각광받고 있으나 모든 환자에서 효과가 있는 것은 아니다. 현재 시판되고 있는 면역관문억제제의 경우 처방 환자 가운데 20% 정도에서만 효과가 확인되고 있다. 면역 항암치료제의 항암 효과의 극대화를 위해 다양한 병용투여가 연구 개발되고 있다. B7-H3는 PD-1/PD-L1 면역관문과는 상이한 리간드 및 수용체로 인해 상이한 면역관문 기전을 통해 T 세포의 활성을 억제하므로 본 발명의 항 B7-H3 항체는 기존 면역관문억제제에 반응성이 없는 환자군에서 치료효능을 보일 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 6-3: 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)에서 항 B7-H3 항체와 면역 항암치료제의 병용처리 효과 분석
이어 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)에서 항 B7-H3 항체와 선 개발된 면역 항암치료제와의 병용처리에 의한 T 세포의 활성을 측정하였다.
실시예 6-2에서 확인한 바와 같이 본 발명의 항 B7-H3 항체는 면역관문 억제 효능을 가지고 있다. 최근 뛰어난 임상효능으로 각광받고 있는 면역 항암치료제는 크게 면역관문억제제와 면역보조자극분자 활성화제로 나눌 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이 본 발명의 항 B7-H3 항체는 면역관문억제제로 작용하나 대표적인 면역관문억제제인 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체와는 그 작용 기작이 상이하다. 항 PD-1 항체와 항 PD-L1 항체는 탁월한 항암효능으로 각광받고 있으나 환자 반응성이 평균 20% 정도로 낮아 반응성을 높이기 위해 다양한 병용투여가 연구 개발되고 있다.
4-1BB 항체는 면역보조자극분자인 4-1BB를 촉진시켜 면역세포의 활성화를 유도하는 항체로 면역관문억제제인 항 PD-L1 또는 항 PD-1 항체와는 그 기전이 상이하다. 항 4-1BB 항체는 면역세포의 보조자극분자인 4-1BB를 촉진시켜 면역세포의 활성화를 유도하는 항체로 항암 효과를 보일 것으로 기대되는 면역 항암치료제이다. 그러나 Urelumab의 임상시험에서 간독성을 유발하는 부작용이 나타났다. Urelumab에 의한 간독성의 문제를 해결하기 위하여 투여 용량을 낮추고, 면역관문억제제인 항 PD-1 등과 병용투여하는 임상 연구가 진행하는 중이다.
따라서 면역관문을 억제하는 본 발명의 항 B7-H3 항체와 또 다른 면역관문억제제인 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 또는 보조자극분자를 활성화하는 항 4-1BB 항체의 병용투여는 서로 상이한 기작으로 면역세포를 활성화시켜 더욱 우수한 면역 항암 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 항 B7-H3 항체와 면역 항암 항체치료제와의 병용처리 효과를 확인하기 위해 T 세포에 의한 사이토카인(인터페론 감마)의 분비가 항 B7-H3 항체와 면역 항암치료제의 병용처리에 의해 증가하는지 여부를 조사하였다. 항 PD-1 항체는 Merck사의 Pembrolizumab을 W02008-156712에 개시된 서열을 바탕으로, 항 PD-L1 항체는 Roche사의 Atezolizumab을 WO2016-196298에 개시된 서열을 바탕으로, 항 4-1BB 항체는 BMS사에서 임상진행중인 Urelumab를 W02005-035584에 개시된 서열을 바탕으로 유전자 합성 및 생산하여 사용하였다.
구체적으로 인간 T 세포를 활성화시키기 위해 항-CD3 항체(UCHT1, Biolegend)를 5 ㎍/㎖이 되도록 PBS에 희석하여 준비하였고, B7-H3 단백질에 의한 T 세포 활성화를 억제시키기 위해 5 ㎍/㎖로 희석한 항-CD3 항체에 B7-H3 단백질을 10 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 희석하여 준비한 항-CD3 항체에 첨가하여 희석한 B7-H3 단백질은 96-웰 세포 배양 플레이트(Corning)에 50 ㎕/well로 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS로 1회 세척하여 준비하였다. 본 발명의 항 B7-H3 항체와 음성대조군인 IgGl(BioXCell, BP0297, IgGl 또는 Cont. Ab로 표기) 그리고 상기 제조된 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 또는 항 4-1BB 항체는 FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen)가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액(Invitrogen)에 첨가하여 처리 농도의 4배 농도로 준비하였다. 구매하여 준비한 인간 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, CTL)는 FBS가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액에 현탁하여 항-CD3 항체와 B7-H3 단백질을 처리하여 코팅한 플레이트에 1 x 106 cells/well로 분주하였다. 인간 말초혈액 단핵구 세포를 분주한 플레이트에 4배 연속적인 희석을 진행하여 준비한 한 항 B7-H3 항체와 음성대조군 IgGl 그리고 항 4-1BB 항체를 50 ㎕/well로 분주하였다. 마지막으로 FBS가 10%가 되도록 첨가한 RPMI-1640 배양액을 100 ㎕/well로 분주하여 항체가 세포에 처리하였다. 단일 농도로 처리한 실험의 경우 항 B7-H3 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 및 항4-1BB 항체를 항체의 최종농도가 10 ㎍/mL이 되도록 처리하였다. 농도별로 처리한 실험의 경우 항 B7-H3 항체와 항 4-1BB 항체 각각의 최종농도가 최고 농도 20 nM부터 4배씩 연속적인 희석 농도로 처리하였다. 배양 3일 후, 배양 상층액을 사용하여 분석기 제조사의 지침에 따라 ELISA 분석기(R&D system)로 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량 분석 실험을 진행하였다.
결과는 도 10에 기재되어 있다. 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량을 측정한 결과 항 B7-H3 항체를 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L1 항체 또는 항 4-1BB 항체와 병용처리하면 각 항체를 단독처리한 경우보다 더욱 강하게 T 세포를 활성화시켜 인터페론 감마의 생성이 더욱 촉진되는 것을 확인하였다. 상기 분석결과는 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체와 기존 항암 면역치료제와 함께 사용되어 T 세포의 활성화를 보다 강화시켜, 항암치료제로 사용 시에 항암 효과가 극대화 될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 7: 마우스동계종양이식모델에서 항 B7-H3 항체와 항 PD-1 항체 병용투여에 의한 항암효능 분석
인간 면역관문단백질의 기능을 차단하는 항체의 면역관문 억제 효능을 동물 모델에서 확인하기 위해서는 마우스의 면역세포를 인간 면역세포로 교체한 인간화마우스 또는 마우스의 면역관문단백질을 인간 면역관문단백질로 치환한 형질전환마우스를 이용하여야한다. 그러나 상기 차단항체가 인간과 마우스 간에 종간 교차반응성이 있는 경우에는 마우스동계종양모델을 통해 면역관문 억제 효능을 확인할 수 있다.
실시예 3-3과 3-6에서 확인한 바와 같이 본 발명의 항 B7-H3 항체는 마우스 B7-H3 항원에 대한 종간 교차 반응성이 있다. 본 발명의 항 B7-H3 항체의 항암효능을 확인하기 위해 마우스동계종양모델에 항 마우스 PD-1 항체인 RMPl-14(BioXCell, BE0146)와 함께 병용처리하여 종양의 증식 억제 효능을 다음과 같이 확인하였다. CT26은 마우스(BALB/c)로부터 유래된 결장암 세포주(Colon carcinoma)로 마우스 B7-H3를 과발현하는 세포주이다. 실시예 2에서 제조된 본 발명에 따른 항 B7-H3 항체 가 CT26 마우스 암세포주 표면에 발현된 마우스 B7-H3에 결합하는 것을 실시예 3-6에서 확인하였다(도 7).
실험방법을 구체적으로 설명하면 CT26(BALB/c origin) 세포주를 해리시키고 PBS 버퍼로 세척한 후, 세포수를 계수하여 웰당 5 x l05 cells로 맞춰 200 ㎕ PBS 넣어 준비하였다. 준비된 세포를 마우스(BALB/c, 6주령, Samtako)의 피하(subcutaneous) 경로로 주입하고 종양 크기가 50~100 mm3가 되었을 때, 각각 해당하는 항체를 한 마리에 200 ㎍씩 총 1 mg을 3일 간격으로 5회에 걸쳐 처리하였다. 대조군과 항 PD-1(RMP1-14) 항체 단독, 항 PD-1 항체 및 항 B7-H3 항체를 병용처리한 군의 종양 크기를 칼리퍼를 이용하여 종양의 가장 긴 직경(D1)과 그에 수직인 직경(D2)을 측정하여 0.5*D1*(D2)2와 같이 계산하여 부피를 구하였다(도 11).
종양 관찰 중 종양의 크기가 2000 mm3보다 크거나 궤양이 생길 경우 해당 마우스의 경우 안락사하였다. 모든 항체 처리가 끝난 후 총 30일 동안 관찰하여 생존률 및 종양의 크기를 측정하였다.
결과는 도 11에 나타내었다. 그 결과 항 PD-1(RMP1-14) 항체 단독으로 처리한 군과 비교하여 항 PD-1 과 항 B7-H3 항체를 병용투여한 군에서 종양 증식 억제 효과 및 생존률의 향상을 확인하였다. 상기 결과는 면역관문 억제 효능을 보이는 본 발명의 항 B7-H3 항체와 또 다른 면역관문억제제로 상이한 기작을 통해 면역세포를 활성화시키는 항 PD-1 항체를 병용투여하면 항암치료 효과가 강화되는 것을 의미한다. 실시예 3-3에서 확인할 수 있듯이 본 발명의 항 B7-H3 항체의 마우스 B7-H3에 대한 결합력은 인간 B7-H3 대비 상대적으로 낮은 편이다. 낮은 마우스 B7-H3에 대한 결합력에도 불구하고 본 발명의 항 B7-H3 항체는 동계종양이식모델에서 항 PD-1 항체와 병용투여에서 항 PD-1 항체의 단독투여 대비 뚜렷한 암성장 억제 효능 및 생존률의 향상이 나타났다. 본 발명의 항 B7-H3 항체는 인간 B7-H3에 보다 강력하게 결합함으로 인간 B7-H3을 차단함으로써 나타나는 면역관문 억제 효과는 마우스동계종양이식모델에서의 결과보다 강력할 것으로 기대된다.
실시예 8: 마우스동계종양이식모델에서 항 B7-H3 항체와 항 PD-1 항체의 병용투여에 의한 종양 침윤 림프구(TIL) 변화 분석
종양 침윤 림프구(TIL, Tumor-infiltrating lymphocytes)는 혈류를 떠나 종양 쪽으로 이동한 백혈구(White blood cell)를 지칭한다. 종양 침윤 림프구는 T 세포와 B 세포를 포함하여 단핵 및 다형 핵 면역세포를 포함하며 종양 유형과 단계에 따라 다르며 질병 예후와 관련이 있다. 특히 면역 항암항체의 작용 기전은 종양 침윤 림프구의 분석을 통해 확인이 가능하다.
항 B7-H3 항체(F6V)와 항 PD-1 항체(RMP-14-1)의 병용투여(combi로 기재)에 의한 항암 효과 기전을 분석하기 위하여 종양 침윤 림프구를 분석 하였다. 실험은 실시예 8번과 동일한 방법으로 진행되었으며 각 항체의 3번 투여가 완료된 후 마우스에서 종양을 분리하여 종양 침윤 림프구를 얻었다. 종양 침윤 림프구에 사이토카인 생성을 자극하는 물질인 PMA 50 ng/ml, lonomycine l μM을 처리하여 재활성화 시킨 후 면역세포의 변화를 분석하였다(도 12). 항암 면역반응 핵심 역할을 하는 대표적인 면역세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)와 조절 T 세포(regulatory T cell)이다. 실험 결과 본 발명의 항 B7-H3 항체와 항 PD-1 항체를 병용투여한 마우스에서 분리한 종양 침윤 림프구에서 확연한 세포독성 T 세포의 활성화와 조절 T 세포(regulatory T cell)의 증식 억제가 관찰되었다.
세포독성 T 세포는 암세포 등 면역세포가 표적화한 세포의 살해를 유도하는 세포로 CD8의 발현을 특징으로 한다. 활성화된 세포독성 T 세포들은 인터페론 감마(IFNγ)와 같은 사이토카인(cytokine)과 세포 살해를 유도하는 그랜자임 B(Granzyme B)의 분비가 증가한다. 본 발명의 항 B7-H3 항체와 항 PD-1 항체를 병용투여한 마우스에서 분리한 종양 침윤 림프구에서는 CD8+ T 세포 중 IFNγ+Granzyme B+의 비율이 유의하게 증가하였으며, CD8+ T 세포 중 그랜자임 B의 분비 증가가 관찰되었다.
조절 T 세포(regulatory T cell)는 종양에서 면역세포를 억제하는데 중요한 역할을 하는 세포로 Foxp3와 CD4의 발현을 특징으로 한다. 종양 미세 환경에서 조절 T 세포가 증가되어 있는 경우, 면역세포의 활성이 낮아져 암세포의 효과적인 제거가 어렵게 된다. 따라서 면역 항암 효과를 위해서는 조절 T 세포를 억제하는 것이 중요하다. 본 발명의 항 B7-H3 항체와 항 PD-1 항체를 병용투여한 마우스에서 분리한 종양 침윤 림프구에서 조절 T 세포의 빈도와 세포수를 항 Foxp3 항체(eBioscience, FJK-16s)를 이용하여 확인하였고, 조절 T 세포의 증식능력(proliferative capacity)은 항 Ki67(BD, B56) 항체를 이용하여 확인하였다.
결과는 도 12에 기재되어 있다. 실험 결과 항 B7-H3 항체와 항 PD-1를 병용투여한 군에서 조절 T 세포의 수가 감소했을 뿐 아니라 조절 T 세포의 증식능력을 나타내는 K167+ 빈도가 감소하였음을 확인하였다. 이러한 결과는 항 B7-H3 항체와 항 PD-1 항체의 병용투여가 세포독성 T 세포의 활성의 증가와 조절 T 세포의 억제를 동시에 유도함으로써 면역활성화를 통해 항암 효과를 나타내는 것을 의미한다.
실시예 9: 화합물 1, 2, 3 및 4의 제조
Figure pat00062
Figure pat00063
Figure pat00064
Figure pat00065
상기 화합물 1, 2, 3 및 4는 특허 WO2017-089895에 기재된 방법으로 제조하였다.
상기 상기 화합물 1, 2, 3 및 4에서 MMAE 또는 MMAF의 구조는 다음과 같다 :
Figure pat00066
Figure pat00067
실시예 10: 화합물 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 제조
Figure pat00068
Figure pat00069
Figure pat00070
Figure pat00071
Figure pat00072
Figure pat00073
상기 화합물 5, 6, 7, 9 및 10은 대한민국 출원번호 10-2018-0036895호에 기재된 방법으로 제조하였다.
또한, 상기 화합물 8은 대한민국 출원번호 10-2019-0000514호에 기재된 방법으로 제조하였다.
실시예 11: ADC의 제조
ADC의 제조는 다음의 두 단계를 거쳐 제조되었으며, 공통적으로 사용한 LCB14-0511 및 LCB14-0606은 한국공개특허 제10-2014-0035393호에 기재된 방법으로 제조하였다. LCB14-0511 및 LCB14-0606 구조식은 다음과 같다:
Figure pat00074
Figure pat00075
또한, ADC의 제조를 위해 본 발명의 B7-H3 단일클론항체(B5, C4I 및 D8G)에 CaaX 서열이 추가된 항체를 제작하여 사용하였다. 아울러, 비교군 ADC의 제조를 위해 비교군 항체(84D)에 CaaX 서열이 추가된 항체(MGC018)를 사용하였다.
1단계 : prenylated antibody의 제조
항체의 프레닐레이션 반응 혼합물을 제조하여 30℃에서 16시간 반응하였다. 반응혼합물은 24 μM 항체, 200 nM FTase (Calbiochem #344145)와 0.144 mM LCB14-0511 또는 LCB14-0606을 포함하는 완충용액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM MgCl2, 10 μM ZnCl2, 0.144 mM DTT)으로 구성하였다. 반응 종료 후 프레닐레이션된 항체는 PBS 완충용액으로 평형화된 G25 Sepharose 컬럼 (AKTA purifier, GE healthcare)으로 제염시켰다.
2단계 : drug-conjugation 방법
<옥심 결합 반응 (conjugation by oxime bond formation)>
프레닐레이션된 항체와 링커-약물간의 옥심결합 생성반응 혼합물은 100 mM Na-아세테이트 완충용액 pH 5.2, 10% DMSO, 20 μM 항체와 200 μM 링커-약물(in house, 실시예 9, 10의 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 및 9)을 섞어 제조하였으며 30℃에서 약하게 교반하였다. 6시간 또는 24시간 반응 후에 FPLC(AKTA purifier, GE healthcare) 과정을 거쳐 사용된 과량의 저분자 화합물들을 제거하였으며 단백질 분획은 수집하여 농축하였다.
<클릭 결합 반응 (conjugation by click reaction)>
프레닐레이션된 항체와 링커-약물간의 클릭결합 생성반응 혼합물은 10% DMSO, 20 μM 항체와 200 μM 링커-약물(in house, 실시예 10의 화합물 7 및 10), 1 mM 카퍼(II) 설페이트 펜타하이드레이트, 2 mM (BimC4A)3 (Sigma-Aldrich 696854), 10 mM 소듐 아스코르베이트 (sodium ascorbate) 및 10 mM 아미노구아니딘 염산염을 섞어 제조하였으며 25 ℃에서 3시간 반응 후에 20 mM EDTA를 처리하여 30분 동안 반응하였다. 반응 종료 후, FPLC(AKTA purifier, GE healthcare) 과정을 거쳐 사용된 과량의 저분자 화합물들을 제거하였으며 단백질 분획은 수집하여 농축하였다.
[표 7]
ADC 제조목록
Figure pat00076
실시예 12: ADC의 특성 분석
실시예 11에서 제조한 ADC를 이용하여 본 발명에 따른 ADC의 특성을 분석하였다.
이를 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC) 분석을 수행하였다. ADC를 페닐-5PW 컬럼(7.5×75 mm, 10 μm, Tosoh Bioscience, USA)으로 소수성 상호 작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피시켰다. 1.5M 황산암모늄을 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 완충액 A로서 사용하고, 30% 아세토나이트릴을 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 완충액 B로서 사용하였여 70% A/30% B를 초기 조건으로 안정화시켰다. 70% A/30% B 대 10% A/90% B의 선형 구배를 사용하여 그 다음 25분 동안 용출을 하고 10% A/90% B로 5분간 추가적으로 용출을 수행하였다. 유량 및 온도를 각각 1.0 ㎖/min 및 25℃로 설정하였다. 검출을 254 및 280 nm 둘 다에서 후속하였다. B7-H3 항체 및 프레닐화 B7-H3 항체를 대조군으로 사용하였다.
또한, 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석을 수행하였다. ADC를 SWXL(6.0×40 mm, Tosoh Bioscience, USA) 가드컬럼과 G3000SWxl 컬럼(7.8×300mm, 5μm, Tosoh Bioscience, USA)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피시켰다. 250 mM 인산 클로라이드와 15% 이소프로필 알콜을 포함하는 200 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)을 이동상으로 하여 0.5 ㎖/min의 유속, 25℃ 조건에서 30분 동안 분석하였다. 검출을 254 및 280 nm 둘 다에서 후속하였다. SEC-HPLC 항체 및 프레닐화 SEC-HPLC 항체를 대조군으로 사용하였다(분석 결과는 나타내지 않음).
실시예 13: In vitro 세포독성 평가
실시예 11에서 제조한 ADC의 암세포주에 대한 세포증식억제 활성을 측정하였다.
이를 위해 시판 중인 B7-H3을 발현하는 암세포주(OVCAR3, Calu-6, Calu-3, HT29 및 HCC1187 세포주)를 사용하였다. 96-웰 플레이트에 각 암세포주를 웰(well)당 4,000~5,000개씩 접종(seeding)하여 4시간 동안 배양한 뒤에 표 7에 기재된 ADC를 0.0015~10.0 nM (3배 연속 희석) 농도로 처리하였다. 144시간 뒤에 살아있는 세포수를 WST-8 (Dojindo molecular technology inc.) 키트를 사용하여 정량하였다.
결과는 아래 표 8에 기재되어 있다. B7-H3이 과발현된 암세포주에서 본 발명의 항-B7-H3 단일클론항체가 접합된 ADC가 기존 항-B7-H3 항체가 접합된 ADC(ADC17, ADC18)보다 세포독성이 매우 뛰어남을 확인하였다. 또한, 피롤로벤조디아제핀 계열의 ADC는 오리스타틴 계열의 ADC에 비해 세포독성이 강하게 나타나는 것을 확인하였다.
[표 8]
ADC 시료의 세포독성 비교
Figure pat00077
실시예 14: In vivo 암 성장 억제 효능 분석
실시예 14-1: B7-H3 발현 폐암 세포주 이식 마우스 모델에서 ADC에 의한 암 성장 억제 효능 분석
암컷 Balb/C 누드 마우스에 B7-H3을 발현하는 인간 폐암 세포주인 Calu-3 세포주를 1 x 107 cells/head 이식하여 인간 암 이식 종양 마우스를 제작했다. 이식후 종양 크기가 평균 184 mm3 에 도달하였을 때 (Day 1) 군분리를 실시하고 실시예 11에서 제조한 ADC5(B5-CaaX-PBD) 0.25 mpk 또는 1.0 mpk, ADC6(B5-CaaX-PBD2) 0.25 mpk 또는 1.0 mpk, 또는 ADC4(B5-CaaX-MMAE) 2.5 mpk 또는 5.0 mpk를 1회 마우스 정맥내로 투여하였다. 대조군은 PBS 10 ml/kg을 마우스 정맥내로 투여하였다. 마우스에 이식된 종양크기 및 체중은 최초 투여(Day 1) 직전에 측정되고, 그 후 35일 동안 주기적으로 측정하였다.
결과는 도 13a 및 도 13b에 기재되어 있다. B7-H3 발현 폐암 세포주 이식 마우스 모델에서 본 발명의 ADC가 암의 성장을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 피롤로벤조디아제핀 계열의 ADC에 의한 암의 성장 억제가 오리스타틴 계열의 ADC보다 강하게 나타나는 것을 확인하였다.
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atatatagcg atggatcaaa tacctattat 180 gctgatagcg tgaaagggcg atttactata tcacgggaca attccaagaa tacattgtac 240 cttcagatga actcccttag ggccgaagac actgccgtgt actattgtgc aaagatgctt 300 catcgttttg attattgggg gcaaggaact ctggtgactg tctcaagcgc ctccaccaag 360 ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 720 ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga ggtgacttgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggagc agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagccccggg agccccaggt gtacaccctg cccccctccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtccc ccggcaagtg a 1341 <210> 53 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length heavy chain clone F6V <400> 53 gaagttcagc tgttggaatc tggcggcgga ttggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctctggctt caccttctcc gactacgcta tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gattggagtg ggtgtccgga atttcccctg gcggctctaa cacctactac 180 gccgattccg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caaggatgcc 300 tggatcgcca gactgctgct gttcgattat tggggccagg gcacactggt caccgtgtcc 360 tctgcttcta ccaagggacc ctctgtgttc cctctggctc cttccagcaa gtctacctct 420 ggtggaaccg ctgctctggg ctgcctggtc aaggattact ttcctgagcc tgtgaccgtg 480 tcttggaact ccggtgctct gacatctggc gtgcacacct ttccagctgt gctgcagtcc 540 tctggcctgt actctctgtc ctctgtcgtg accgtgcctt ctagctctct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagcct tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660 cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cctccatgtc ctgctccaga actgctcggc 720 ggtccctccg ttttcctgtt tccacctaag cctaaggaca ccctgatgat ctctcggacc 780 cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tctcacgagg atcccgaagt gaagttcaat 840 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 900 aactccacct acagagtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg ctcctatcga aaagaccatc 1020 tccaaggcta agggccagcc tcgggaacct caggtgtaca ccctgcctcc atctcgggaa 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctcgtga agggattcta cccttccgat 1140 atcgccgtgg aatgggagtc caatggccag cctgagaaca actacaagac aacccctcct 1200 gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactccaagc tgacagtgga caagtctcgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgttct gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtctct gtcccctggc aaatga 1356 <210> 54 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length heavy chain clone 10F11 <400> 54 gaggttcagc tccttgaatc aggggggggt cttgtccagc ccggaggttc ccttcgcttg 60 agctgtgcag catcagggtt taccttcagt tcttatggga tgtcttgggt acgtcaggca 120 cctggcaaag gtctcgaatg ggtcagtggt atatattctg gcggaagcag taagtactac 180 gccgatagcg taaaaggtcg tttcaccatc tctagggaca attccaagaa taccttgtac 240 ttgcagatga acagtctccg agctgaagat acagctgtct actattgtgc taaaaacagg 300 cttcgattcg attattgggg ccagggtact cttgttactg tcagtagtgc ctccaccaag 360 ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 720 ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga ggtgacttgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggagc agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagccccggg agccccaggt gtacaccctg cccccctccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtccc ccggcaagtg a 1341 <210> 55 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length light chain clone B5 <400> 55 cagtctgttc tgactcagcc tccttctgct tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgttccg gctcctcctc caacatcggc tctaacgccg tgtcctggta tcagcagttg 120 cctggcacag cccctaagct gctgatctac tacaactctc acagaccctc cggcgtgccc 180 gacagattct ctggctctaa gtctggcacc tccgccagcc tggctatctc tggactgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcggc tcttgggatg cctctctgaa cgcttatgtg 300 ttcggcggag gcaccaagct gacagtgttg ggacaaccta aggccgctcc tagcgtgacc 360 ctgtttcctc catcttctga ggaactgcag gccaacaagg ctaccctcgt gtgcctgatc 420 tctgactttt accctggcgc tgtgaccgtg gcctggaagg ctgatagttc tcctgtgaag 480 gccggcgtgg aaaccaccac accttccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 540 tacctgtctc tgacccctga acagtggaag tcccaccggt cctactcttg ccaagtgacc 600 catgagggct ccaccgtgga aaagacagtg gcccctgctg agtgctcttg a 651 <210> 56 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length light chain clone C4I <400> 56 cagtctgtgc ttacccaacc tcctagtgca agtggtaccc ctggacaacg agtaacaatc 60 agttgcactg gtagttcaag taatatagga tctaacgacg taagttggta tcagcaactt 120 cctggtacag cacctaagtt gctcatttac gcaaactccc atagaccctc tggcgtccct 180 gatcgtttca gcggtagtaa atccggtaca tcagcttcct tggctatatc tggtctcaga 240 tccgaggacg aagctgacta ttactgtggg agttgggatg actctttgtc cggctacgtt 300 tttggaggag gcaccaagtt gacagtgctg ggtcagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcctg a 651 <210> 57 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length light chain clone D8G <400> 57 caatctgtgc tgacccaacc acccagtgct tcaggcacac ccggacagag ggtgactata 60 agttgcagcg ggtcaagttc aaatatcgga agcaattccg tgacctggta ccaacagctc 120 cccggtactg caccaaagct ccttatctat gctgattctc agcggcctag tggagtgcct 180 gatcggttca gcggttcaaa gtccggtacc tccgcttctt tggcaataag tggattgcgc 240 tccgaggatg aggcagatta ttattgcggg acatgggata gcagtcttaa tgcctacgta 300 ttcggcggtg gtaccaaact tacagttctc ggccagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcctg a 651 <210> 58 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length light chain clone F6V <400> 58 cagtctgttc tgactcagcc tccttctgct tctggcaccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgttccg gctcctcctc caacatcggc tctaacgctg tgacctggta tcagcagctg 120 cctggcacag cccctaaact gctgatctac tacaacaaca agcggccctc tggcgtgccc 180 gacagattct ctggatctaa gtccggcacc tctgccagcc tggctatctc tggactgaga 240 tctgaggacg aggccgacta ctactgcggc acctgggatg attctctgtc cggctatgtg 300 ttcggcggag gcacaaaact gacagtgctg ggacagccta aggccgctcc ttctgtgacc 360 ctgtttcctc catcctctga ggaactgcag gccaacaagg ctaccctcgt gtgcctgatc 420 tctgactttt atcctggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ctgatagttc tcctgtgaag 480 gccggcgtgg aaaccaccac accttccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 540 tacctgtctc tgacccctga acagtggaag tcccaccggt cctactcttg ccaagtgacc 600 catgagggct ccaccgtgga aaagacagtg gcccctgctg agtgctcttg a 651 <210> 59 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding full length light chain clone 10F11 <400> 59 caaagcgttt tgactcagcc tccttcagct tctggaactc caggacaacg tgtcaccatc 60 agttgcaccg gctcttcctc caacatcgga agtaacagcg ttacctggta tcagcagctc 120 ccaggcactg ccccaaagct cttgatatac tcagactccc atcgaccatc cggagttcct 180 gacagattca gcggttcaaa atctggtact tctgcatcac ttgccatttc cggtctccga 240 tcagaagacg aagctgacta ttattgtgga acctgggatg cctcccttaa cgcttacgtt 300 ttcggaggtg gcaccaagct cacagttctc ggacagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcctg a 651 <210> 60 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(330) <223> Heavy chain constant region IgG1 <400> 60 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 61 <211> 993 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_structure <222> (1)..(993) <223> Sequence encoding heavy chain constant region IgG1 clone C4I, D8G, 10F11 <400> 61 gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc cacctccggc 60 ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120 tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc 180 ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcct cctccctggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300 aagtcctgcg acaagaccca cacctgccct ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 360 ccctccgtgt tcctgttccc tcctaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 420 gaggtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacaac 540 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc 660 aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc ctccgacatc 780 gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 900 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960 cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag tga 993 <210> 62 <211> 993 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(993) <223> Sequence encoding heavy chain constant region IgG1 clone B5 <400> 62 gcttctacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggt 60 ggaaccgctg ctctgggctg cctggtcaag gattactttc ctgagcctgt gaccgtgtct 120 tggaactccg gtgctctgac atctggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtcctct 180 ggcctgtact ctctgtcctc tgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 300 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcca ccatgtcctg ctccagaact gctcggcggt 360 ccctccgttt tcctgtttcc acctaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 420 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 480 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 540 tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 600 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatctcc 660 aaggctaagg gccagcctcg ggaacctcaa gtgtacacct tgccaccttc cagagaagag 720 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ttccgatatc 780 gccgtggaat gggagtctaa cggccagcca gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 840 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtctcggtgg 900 cagcagggca acgtgttctc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960 cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa tga 993 <210> 63 <211> 993 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(993) <223> Sequence encoding heavy chain constant region IgG1 clone F6V <400> 63 gcttctacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggt 60 ggaaccgctg ctctgggctg cctggtcaag gattactttc ctgagcctgt gaccgtgtct 120 tggaactccg gtgctctgac atctggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtcctct 180 ggcctgtact ctctgtcctc tgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 300 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaact gctcggcggt 360 ccctccgttt tcctgtttcc acctaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 420 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 480 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 540 tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 600 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatctcc 660 aaggctaagg gccagcctcg ggaacctcag gtgtacaccc tgcctccatc tcgggaagag 720 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gattctaccc ttccgatatc 780 gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 840 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtctcggtgg 900 cagcagggca acgtgttctc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960 cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa tga 993 <210> 64 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(105) <223> Light chain constant region Lamda <400> 64 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 65 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> Sequence encoding Light chain constant region Lamda clone C4I, D8G, 10F11 <400> 65 cagcccaagg ccgccccctc cgtgaccctg ttccccccct cctccgagga gctgcaggcc 60 aacaaggcca ccctggtgtg cctgatctcc gacttctacc ccggcgccgt gaccgtggcc 120 tggaaggccg actcctcccc cgtgaaggcc ggcgtggaga ccaccacccc ctccaagcag 180 tccaacaaca agtacgccgc ctcctcctac ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcctgcca ggtgacccac gagggctcca ccgtggagaa gaccgtggcc 300 cccgccgagt gctcctga 318 <210> 66 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> Sequence encoding Light chain constant region Lamda clone B5 <400> 66 caacctaagg ccgctcctag cgtgaccctg tttcctccat cttctgagga actgcaggcc 60 aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctct gacttttacc ctggcgctgt gaccgtggcc 120 tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag 180 tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcttgcca agtgacccat gagggctcca ccgtggaaaa gacagtggcc 300 cctgctgagt gctcttga 318 <210> 67 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> Sequence encoding Light chain constant region Lamda clone F6V <400> 67 cagcctaagg ccgctccttc tgtgaccctg tttcctccat cctctgagga actgcaggcc 60 aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctct gacttttatc ctggcgccgt gaccgtggcc 120 tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag 180 tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcttgcca agtgacccat gagggctcca ccgtggaaaa gacagtggcc 300 cctgctgagt gctcttga 318

Claims (146)

  1. 일반식 I의 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 I]
    Ab - (X)y
    상기 식에서,
    Ab는 B7-H3를 특이적으로 인식하는 분리된 항체 또는 그 항원결합 단편이고, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보성 결정부위; 및 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보성 결정부위를 포함하며,
    상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 4로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH2는 서열번호 5 내지 9로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRH3은 서열번호 10 내지 14로부터 선택되는 어느 하나이고,
    상기 CDRL1은 서열번호 15 내지 19로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL2는 서열번호 20 내지 24로부터 선택되는 어느 하나이고; 상기 CDRL3은 서열번호 25 내지 29로부터 선택되는 어느 하나이며,
    상기 X는 독립적으로 하나 이상의 활성제 및 링커를 포함하는 화학적 잔기이고, 및
    상기 링커는 항체와 활성제를 연결하며,
    상기 y는 1 내지 20의 정수이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 다음 중 어 느 하나의 조합인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    (a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 5, 및 10;
    (b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 6, 및 11;
    (c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 7, 및 12;
    (d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 8, 및 13; 또는
    (e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 4, 9, 및 14.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 다음 중 어느 하나의 조합인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    (a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 15, 20 및 25;
    (b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 16, 21 및 26;
    (c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 22 및 27;
    (d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 23 및 28; 또는
    (e) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 19, 24 및 29.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 다음 중 어느 하나의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 다음 중 어느 하나의 조합:
    (a) 각각 서열번호 1, 5, 및 10,
    (b) 각각 서열번호 2, 6, 및 11,
    (c) 각각 서열번호 3, 7, 및 12,
    (d) 각각 서열번호 1, 8, 및 13, 또는
    (e) 각각 서열번호 4, 9, 및 14;
    상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 다음 중 어느 하나의 조합:
    (f) 각각 서열번호 15, 20 및 25;
    (g) 각각 서열번호 16, 21 및 26;
    (h) 각각 서열번호 17, 22 및 27;
    (i) 각각 서열번호 18, 23 및 28; 또는
    (j) 각각 서열번호 19, 24 및 29.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열은 다음 중 어느 하나의 조합인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    (a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 5, 및 10, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 15, 20 및 25;
    (b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 6, 및 11, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 16, 21 및 26;
    (c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 7, 및 12, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 22 및 27;
    (d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 8, 및 13, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 23 및 28; 또는
    (e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 4, 9, 및 14, 그리고 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 19, 24 및 29.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    서열번호 30 내지 34로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열;
    상기 서열번호 30 내지 34로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    상기 서열번호 30 내지 34로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    서열번호 35 내지 39로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열;
    상기 서열번호 35 내지 39로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    상기 서열번호 35 내지 39로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    서열번호 40 내지 44로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열;
    서열번호 40 내지 44로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    서열번호 40 내지 44로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    서열번호 45 내지 49로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열;
    서열번호 45 내지 49로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    서열번호 45 내지 49로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 서열번호 60으로 표시되는 인간 중쇄 IgGl 불변영역 및/또는 서열번호 64로 표시되는 인간 경쇄 람다 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    서열번호 30 및 35; 서열번호 31 및 36; 서열번호 32 및 37; 서열번호 33 및 38; 또는 서열번호 34 및 39.
  12. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 하기 서열로 표시되는 중쇄 및 경쇄 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    서열번호 40 및 45; 서열번호 41 및 46; 서열번호 42 및 47; 서열번호 43 및 48; 또는 서열번호 44 및 49.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 인간 모노클로날 항체이고, 마우스 및 원숭이의 B7-H3에 교차반응성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 B7-H3는 인간, 마우스 또는 원숭이 의 B7-H3인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디, 다이아바디, scAb, dAb, 이가항체 또는 다가항체인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 항체와 활성제 사이의 링커는 절단 가능한 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 링커는 일반식 Ⅱ의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 Ⅱ]
    Figure pat00078

    상기 식에서,
    G는 글루쿠론산(glucuronic acid) moiety 또는
    Figure pat00079
    이고; 상기 R3은 수소 또는 카복실 보호기이고, 상기 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기이고;
    B는 활성제이며;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C8 알킬 또는 C3-C8 사이클로알킬이고;
    W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO2NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- 또는 -PO2NR'-이고, 상기 C, S 또는 P는 직접적으로 페닐링(phenyl ring)에 결합하며, 상기 R' 및 R''는 각각 독립적으로 수소, C1-C8 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C1-C8 알콕시, C1-C8 알킬티오, 모노- 또는 다이- C1-C8 알킬아미노, C3-C20 헤테로아릴 또는 C6-C20아릴인 화합물이며;
    Z는 독립적으로 C1-C8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로이고;
    n은 0 내지 3의 정수이며;
    L은, 하기 중 어느 하나이다:
    A) C1-C50 알킬렌 또는 1-50 원자 헤테로알킬렌이며, 하기 중 하나 이상을 만족한다:
    (i) L은 하나 이상의 불포화 결합을 포함하고;
    (ii) L 내의 2 개의 원자가 치환체와 같은 2가 치환체로 치환되고; 이는 헤테로아릴렌(heteroarylene)을 완성시키며;
    (iii) L은 1 내지 50 원자 헤테로알킬렌이고;
    (iv) 상기 알킬렌은 하나 이상의 C1-20 알킬로 치환되고;
    B) 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 하기 일반식 Ⅲ의 이소프레닐 유도체 유닛을 적어도 하나 이상 포함한다:
    [일반식 Ⅲ]
    Figure pat00080

  20. 제 19항에 있어서, 상기 G는
    Figure pat00081
    이고,
    R3은 수소 또는 카복실 보호기이고,
    상기 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 하이드록실 보호기인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 R3은 수소이고, 상기 각각의 R4는 수소인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  22. 제 19항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 수소인 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  23. 제 19항에 있어서, 상기 Z는 독립적으로 C1-C8 알킬, 할로겐, 시아노 또는 나이트로인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  24. 제 19항에 있어서, 상기 n은 0인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  25. 제 19항에 있어서, 상기 W는 -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO2NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- 또는 -PO2NR'-이고, 상기 C, S 또는 P는 직접적으로 페닐링(phenyl ring)에 결합하며, 상기 R' 및 R''는 각각 독립적으로 수소, C1-C8 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C1-C8 알콕시, C1-C8 알킬티오, 모노- 또는 다이- C1-C8 알킬아미노, C3-C20 헤테로아릴 또는 C6-C20아릴인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  26. 제 19항에 있어서, 상기 W는 -C(O)-, -C(O)NR'- 또는 -C(O)O-인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 C(O)는 페닐링에 결합하고, NR'은 L에 결합하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  28. 제 19항에 있어서, 상기 G는
    Figure pat00082
    이고,
    W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 C(O)는 페닐링에 결합하고, NR'은 L에 결합하며,
    R3 및 R4는 수소인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  29. 제 19항에 있어서, 상기 L은 C1-C50 알킬렌 또는 1-50 원자 헤테로알킬렌이며, 하기 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    (i) L은 하나 이상의 불포화 결합을 포함하고;
    (ii) L 내의 2 개의 원자가 치환체와 같은 2가 치환체로 치환되고; 이는 헤테로아릴렌(heteroarylene)을 완성시키며;
    (iii) L은 1 내지 50 원자 헤테로알킬렌이고; 및
    (iv) 상기 알킬렌은 하나 이상의 C1-20 알킬로 치환된다.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 L은 질소 함유 1-50 원자 헤테로 알킬렌이고, 상기 링커는 친수성 아미노산의 2 이상의 원자를 포함하고, 상기 질소는 친수성 아미노산의 카르보닐과 펩타이드 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  31. 제 19항에 있어서, 상기 W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 W의 질소는 친수성 아미노산의 질소 원자인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  32. 제 30항 또는 제 31항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 프롤린, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  33. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 아미노산은 링커의 옥심(oxime)을 링커의 폴리에틸렌 글리콜 유닛에 공유 결합시키는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 프롤린, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  35. 제 30항 또는 31항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 수용액에서 중성 pH에서 전하를 나타내는 모이어티(moiety)를 갖는 측쇄를 포함하는 아미노산인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 아스파테이트 또는 글루타메이트인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  37. 제 35항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 오르니틴 또는 라이신인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 친수성 아미노산은 아르기닌인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  39. 제 19항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 하나이상의 친수성 아미노산을 포함하며, 수용액에서 중성 pH에서 전하를 나타내는 모이어티(moiety)를 갖는 측쇄를 포함하는 아미노산인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 펩타이드의 각각의 아미노산은 알라닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 라이신, 오르니틴, 프롤린, 세린 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 펩타이드는 적어도 하나의 아스파테이트 또는 글루타메이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  42. 제 19항에 있어서, 상기 W는 -C(O)NR'- 이고, 상기 W의 질소는 펩타이드의 N-말단 아미노산의 질소 원자인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  43. 제 40항에 있어서, 상기 펩타이드는 링커의 옥심(oxime)을 링커의 폴리에틸렌 글리콜 유닛에 공유 결합시키는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  44. 제 39항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  45. 제 19항에 있어서, 상기 L은 티오에테르 결합에 의해 항체와 공유결합하고, 상기 티오에테르 결합은 항체의 시스테인의 황원자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 항체의 C-말단에 아미노산 모티프를 포함하고, 상기 티오에테르 결합은 상기 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고, C가 시스테인이고, Y가 지방족 아미노산이며, X가 글루타민, 글루타메이트, 세린, 시스테인, 메티오닌, 알라닌 및 루신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며; 및
    상기 티오에테르 결합은 상기 아미노산 모티프의 시스테인의 황원자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 아미노산 모티프는 CYYX 서열이고, Y가 알라닌, 이소루이신, 류신, 메티오닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 아미노산 모티프는 CVIM 또는 CVLL 서열인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  50. 제 46항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20 개의 아미노산 중 적어도 하나가 글리신인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20 개의 아미노산 중 적어도 세 개가 글리신 또는 프롤린인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  52. 제 50항에 있어서, 상기 아미노산 모티프에 선행하는 1 내지 20 개의 아미노산 중 적어도 1개가 글리신, 아스파르트 산, 아르기닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  53. 제 46항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 모티프에 선행하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산은 각각 글리신인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  54. 제 19항에 있어서, 상기 L은 C-말단에 아미노산 서열 GGGGGGGCVIM을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  55. 제 19항에 있어서, 상기 L은 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 하기 일반식 Ⅲ의 이소프레닐 유도체 유닛을 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 Ⅲ]
    Figure pat00083

  56. 제 19항에 있어서, 상기 L은 옥심을 포함하는 3 내지 50 헤테로알킬렌이고, 상기 옥심의 산소 원자는 W와 연결된 L의 측면에 있고, 옥심의 탄소 원자는 Ab에 연결된 L의 측면에 있으며; 또는 상기 옥심의 탄소 원자는 W에 연결된 L의 측면에 있고, 옥심의 산소 원자는 Ab에 연결된 L의 측면에 있는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  57. 제 55항 또는 제56항에 있어서, 상기 L은 옥심을 포함하고, 하나 이상의 이소프레닐 유닛은 옥심을 Ab에 공유 결합시키는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  58. 제 19항에 있어서, 상기 L은 일반식 VIII 또는 일반식 IX로 표시되는 연결 유닛을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 VIII]
    -(CH2)r(V(CH2)p)q-
    [일반식 IX]
    -(CH2CH2X)w-
    상기 V는 단일결합, -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2- 또는 -SO2NR25-이고;
    X는 -O-, C1-C8 알킬렌 또는 -NR21-이고;
    R21 내지 R25는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬 C6-C20 아릴 또는 C1-C6 알킬C3-C20 헤테로아릴이고;
    r은 0 내지 10의 정수이고;
    p는 0 내지 10의 정수이고;
    q는 1 내지 20의 정수이고; 및
    w는 1 내지 20의 정수이다.
  59. 제 58항에 있어서, 상기 q는 4 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  60. 제 58항에 있어서, 상기 q는 2 내지 12의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  61. 제 58항에 있어서, 상기 q는 6 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  62. 제 60항에 있어서, 상기 q는 2, 5 또는 11의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  63. 제 58항에 있어서, 상기 r은 2의 정수인 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  64. 제 58항에 있어서, 상기 p은 2의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  65. 제 58항에 있어서, 상기 V는 -O-인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  66. 제 58항에 있어서,
    상기 r은 2의 정수이고;
    상기 p은 2의 정수이며;
    상기 q는 2, 5 또는 11의 정수이고; 및
    상기 V는 -O-인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  67. 제 58항에 있어서, 상기 X는 -O-인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  68. 제 58항에 있어서, 상기 w는 6 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  69. 제 58항에 있어서, 상기 X는 -O-이고, w는 6 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  70. 제 58항에 있어서, 상기 L은
    Figure pat00084
    또는
    Figure pat00085
    로 표시되는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 L은 1 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  72. 제 70항에 있어서, 상기 L은 3 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  73. 제 70항에 있어서, 상기 L은 5 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  74. 제 70항에 있어서, 상기 L은 6 내지 12 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  75. 제 70항에 있어서, 상기 L은 3 -OCH2CH2- 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  76. 제 58항에 있어서, 상기 L은 옥심을 포함하고, 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛은 옥심을 활성제에 공유 결합시키는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  77. 제 19항에 있어서, 상기 L은 1,3-양극성고리 첨가반응(1,3-dipolar cycloaddition reactions), 헤테로-디엘스 반응(hetero-diels reactions), 친핵성 치환 반응(nucloephilic substitution reactions), 논-알돌 형 카보닐 반응(nonaldol type carbonyl reactions), 탄소-탄소 다중 결합에 대한 첨가(additions to carbon-carbon multiple bonds), 산화 반응(oxidation reactions) 또는 클릭 반응(click reactions)에 의하여 형성된 결합 유닛을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  78. 제 77항에 있어서, 상기 결합 유닛은 아세틸렌과 아지드와의 반응, 또는 알데히드 또는 케톤 그룹과 하이드라진 또는 하이드록실아민과의 반응으로 형성되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  79. 제 19항에 있어서, 상기 L은 하기 일반식 Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ 또는 Ⅶ로 표시되는 결합 유닛을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 Ⅳ]
    Figure pat00086

    [일반식 Ⅴ]
    Figure pat00087

    [일반식 Ⅵ]
    Figure pat00088

    [일반식 Ⅶ]
    Figure pat00089

    상기 식에서,
    상기 L1은 단일결합 또는 C1-C30의 알킬렌이고;
    R11은 수소 또는 C1-C10의 알킬이다.
  80. 제 79항에 있어서, 상기 L1은 단일결합인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  81. 제 79항에 있어서, 상기 L1은 C11의 알킬렌인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  82. 제 79항에 있어서, 상기 L1은 C12의 알킬렌인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  83. 제79항에 있어서, 상기 L은
    Figure pat00090
    또는
    Figure pat00091
    을 포함하고,
    상기 V는 단일 결합 , -O-, -S-, -NR21-, -C(O)NR22-, -NR23C(O)-, -NR24SO2-, 또는 -SO2NR25- 이고;
    R21 내지 R25 는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 알킬 C6-20 아릴, 또는 C1-6알킬 C3-20 헤테로아릴이며;
    r은 1 내지 10의 정수이고;
    p는 0 내지 10의 정수이며;
    q는 1 내지 20의 정수이고; 및
    L1은 단일결합인 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  84. 제 83항에 있어서, 상기 r은 2 또는 3의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  85. 제 83항에 있어서, 상기 p는 1 또는 2의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  86. 제 83항에 있어서, 상기 q는 1 내지 6의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  87. 제 83항에 있어서, 상기 r은 2 또는 3의 정수; p는 1 또는 2의 정수 및 q는 1 내지 6의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  88. 제 83항에 있어서,
    Figure pat00092
    을 포함하며,
    상기 Ab는 항-B7-H3 항체이고; B는 활성제이며, n은 1 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  89. 제 83항에 있어서,
    Figure pat00093
    을 포함
    하며, 상기 Ab는 항-B7-H3 항체이고; B는 활성제이며, n은 1 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  90. 제 83항에 있어서,
    Figure pat00094
    을 포함하며,
    상기 Ab는 항-B7-H3 항체이고; B는 활성제이며, n은 0 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.

  91. 제 83항에 있어서,
    Figure pat00095
    을 포함하며, 상기 Ab는 항-B7-H3 항체이고; B는 활성제이며, n은 1 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  92. 제 19항에 있어서, 상기 이소프레노이드 트랜스퍼라제는 파네실 단백질 트랜스퍼라아제(FTase) 또는 게라닐게라닐 트랜스퍼라제(GGTase)인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  93. 제 19항에 있어서, 상기 L은 Ab에 공유 결합된 하나 이상의 분지형 링커를 포함하고,
    i) 각각의 분지형 링커는 주링커(PL)에 의해 Ab에 공유 결합된 분지 유닛(BR)을 포함하고;
    ii) 각각의 분지형 링커는 제 1 활성제를 분지 유닛에 결합시키고, 제 2 링커 (SL) 및 절단기(CG)를 포함하는 제 1 분지(B1)를 포함하며; 및
    iii) 각각의 분지형 링커는 a) 제 2 활성제가 제 2 링커 (SL) 및 절단기(CG)에 의해 분지 유닛에 공유 결합 된 제 2 분지 (B2); 또는 b) 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(moiety)가 분지 유닛에 공유 결합되어 있는 제 2 분지를 포함하고,
    상기 각각의 절단기는 항체 접합체부터 활성제를 방출하기 위해 가수분해되는 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  94. 제 93항에 있어서, 상기 분지형 링커는
    Figure pat00096
    ,
    Figure pat00097
    ,
    Figure pat00098
    또는
    Figure pat00099
    이고,
    상기 L2, L3, L4 는 각각 독립적으로 직접 결합 또는 -CnH2n-이며, 상기 n은 1 내지 30의 정수이고,
    상기 G1, G2, G3은 독립적으로 직접 결합,
    Figure pat00100
    ,
    Figure pat00101
    ,
    Figure pat00102
    또는
    Figure pat00103
    이며,
    상기 R30은 수소 또는 C1-30 알킬; 및
    상기 L5는 직접 결합 또는 C1-10 알킬렌, R50은 수소 C1-30 알킬인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  95. 제 94항 있어서,
    Figure pat00104
    를 포함하고,
    상기 B 및 B'는 동일하거나 상이할 수 있는 활성제를 나타내고;
    n은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내며;
    f는 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수를 나타내고; 및
    L은 Ab에 대한 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  96. 제 95항에 있어서, 상기 n은 1 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  97. 제 95항에 있어서, 상기 n은 4 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  98. 제 95항에 있어서, 상기 L은 옥심을 포함하고, 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 유닛은 옥심을 활성제에 공유 결합시키는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  99. 제 93항에 있어서, 상기 절단기는 표적 세포 내에서 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  100. 제 93항에 있어서, 상기 절단기는 하나 이상의 활성제를 방출시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  101. 제 93항에 있어서, 상기 항체 접합체는 Ab를 포함하고; Ab에 공유 결합 된 하나 이상의 분지형 링커를 포함하며; 및 분지형 링커에 공유 결합 된 2개 이상의 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  102. 제 101항에 있어서, 2 이상의 분지형 링커가 Ab와 결합되고, 각각의 분지형 링커가 2개 이상의 활성제와 결합하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  103. 제 102항에 있어서, 3개 분지형 링커는 Ab와 결합되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  104. 제 102항에 있어서, 4개 분지형 링커는 Ab와 결합되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  105. 제 101항에 있어서, 1개 분지형 링커는 Ab와 결합되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  106. 제 101항에 있어서, 각각의 분지형 링커는 두 개의 활성제와 결합되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  107. 제 101항에 있어서, 상기 접합체는 2개 이상의 상이한 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  108. 제 107항에 있어서, 하나 이상의 분지형 링커는 2개 이상의 활성제와 결합되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  109. 제 101항에 있어서, 각각의 활성제는 절단 가능한 결합에 의해 분지형 링커에 결합된 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  110. 제 101항에 있어서, 각각의 분지형 링커는 분지형 유닛을 포함하고, 각각의 활성제는 2차 링커를 통해 분지형 유닛에 결합하고, 상기 분지형 유닛 1차 링커에 의해 항-B7-H3 항체에 결합되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  111. 제 110항에 있어서, 상기 분지형 유닛은 질소 원자인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  112. 제 110항에 있어서, 상기 분지형 유닛은 아미드이고, 1차 링커는 아미드의 카르보닐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  113. 제 110항에 있어서, 상기 분지형 유닛은 아미드이고, 2차 링커는 아미드의 카르보닐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  114. 제 110항에 있어서, 상기 분지형 유닛은 라이신 유닛인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  115. 제 19항에 있어서, 상기 B는 활성제인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  116. 제 115항에 있어서, 상기 활성제는 화학요법제 또는 톡신인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  117. 제 115항에 있어서, 상기 활성제는 면역 조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 항기생충제 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  118. 제 115항에 있어서, 상기 활성제는 하기로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    (a) 엘로티닙(erlotinib), 보르테조밉(bortezomib), 풀베스트란트(fulvestrant), 수텐트(sutent), 레트로졸(letrozole), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 루코보린(leucovorin), 라파마이신(rapamycin), 라파티닙(lapatinib), 로나파르닙(lonafarnib), 소라페닙(sorafenib), 제피티닙(gefitinib), AG1478, AG1571, 티오테파(thiotepa), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan), 피포술판(piposulfan), 벤조도파(benzodopa), 카르보콘(carboquone), 메츄도파(meturedopa), 유레도파(uredopa), 에틸렌이민(ethylenimine), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethiylenethiophosphoramide), 트리메틸롤로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신(bullatacin), 불라타시논(bullatacinone), 캄토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), CC-1065, 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin), 비젤레신(bizelesin), 크립토피신 1(cryptophycin 1), 크립토피신 8(cryptophycin 8), 돌라스타틴(dolastatin), 듀오카마이신(duocarmycin), KW-2189, CB1-TM1, 엘루테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕티인(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard), 카르무스틴(carmustine), 클로로코토신(chlorozotocin), 포테쿠스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimnustine), 칼리키아미신(calicheamicin), 칼리키아미신 감마 1(calicheamicin gamma 1), 칼리키아미신 오메가 1(calicheamicin omega 1), 디네미신(dynemicin), 디네미신 A(dynemicin A), 클로드로네이트(clodronate), 에스페르아미신(esperamicin), 네오카르지노스타틴크로모포어(neocarzinostatin chromophore), 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 안트르마이신(antrmycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르니노마이신(carninomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루부신(detorubucin), 6-디아조-5-옥소-L-노르루신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피롤리노-독소루비신(2-pyrrolino-doxorubucin), 리포소말 독소루비신(liposomal doxorubicin), 데옥시독소루비신(deoxydoxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토미그린(streptomigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 5-플루오로우라신(5-fluorouracil), 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티구아닌(thiguanine), 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자유리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시유리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone),프로피오네이트(propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스테인(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토테인(mitotane), 트릴로스테인(trilostane), 폴린산(folinic acid), 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드 글리코사이드(aldophosphamide glycoside), 아미노레불린산(aminolevulinic acid), 에닐우라실(eniluracil), 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 엘립티니움 아세테이트(elliptinium acetate), 에토글루시드(etoglucid), 갈리움 나이트레이트(gallium nitrate), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 렌티난(lentinan), 로니다이닌(lonidainine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocins), 미토구아존(mitoguazone), 미토잔트론(mitoxantrone), 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피라루비신(pirarubicin), 로소잔트론(losoxantrone), 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide), 프로카르바진(procarbazine), 폴리사카라이드-k(polysaccharidek), 라족세인(razoxane), 리조신(rhizoxin), 시조피란(sizofiran), 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone),2,2',2''-트리클로로트리에틸아민(2,2',2''-trichlorotriethylamine), T-2 톡신, 베라큐린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A), 안구이딘(anguidine), 우레탄(urethane), 빈데신(vindesine), 다카르바진(dacarbazine), 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨(mitobronitol), 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 아라비노사이드(arabinoside), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 티오테파(thiotepa), 파클리탁셀(paclitaxel), 파클리탁셀, 파클리탁셀의 알부민-엔지니어드 나노파티클(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel), 도세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈, 6-티오구아닌, 머캅토퓨린, 시스플라틴, 카보플라틴(carboplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 플래티늄(platinum), 에토포사이드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 미톡산트론(mitoxantrone), 빈크리스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 노반트론(novantrone), 테니포사이드(teniposide), 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신(daunomycin), 아미노프테린(aminopterin), 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), CPT-11, 토포이소머라아제 저해제 RFS 2000, 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine), 레티노산(retinoic acid), 카페시타빈(capecitabine), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 산;
    (b) 모노카인(monokine), 림포카인(lympokine), 폴리펩타이드 호르몬(traditional polypeptide hormone), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 티록신(thyroxine), 릴렉신(relaxin), 프로릴렉신(prorelaxin), 당단백 호르몬(glycoprotein hormone), 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone), 갑상샘자극호르몬(thyroid stimulating hormone), 황체형성호르몬(luteinizing hormone), 간 성장인자 섬유모세포성장인자(hepatic growth factor fibroblast growth factor), 프롤락틴(prolactin), 태반성 락토젠(placental lactogen), 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 종양괴사인자-α, 종양괴사인자-β, 뮐러관 억제물질(mullerian inhibiting substance), 마우스 고나도트로핀-연관 펩타이드(mouse gonadotropin associated peptide), 인히빈(inhibin), 액티빈(activin), 혈관내피증식인자(vascular endothelial growth factor), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 골유도 인자(osteoinductive factor), 인터페론, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 콜로니자극인자(colony stimulating factor, CSF), 마크로파지-CSF, 과립구-마크로파지-CSF(granulocyte-macrophage-CSF), 과립구-CSF, 인터루킨(IL), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 폴리펩타이드 인자, LIF, 키트 리간드(kit ligand), 또는 이들의배합물;
    (c) 디프테리아 톡신, 보툴리눔 톡신, 테타누스 톡신, 디센터리 톡신, 콜레라 톡신, 아마니틴, α-아마니틴, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 유도체, 인돌리노벤조디아제핀, 피리디노벤조디아제핀, 테트로도톡신, 브레베톡신(brevetoxin), 시구아톡신(ciguatoxin), 리신(ricin), AM 톡신, 오리스타틴(auristatin), 투불리신(tubulysin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아마이신(calicheamycin), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), SG2285, 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴유사체(dolastatin analog), 크립토피신(cryptophycin), 캄토테신(camptothecin), 리족신(rhizoxin), 리족신 유도체(rhizoxin derivatives), CC-1065, CC-1065 유사체 또는 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin), 에네다인 항생제(enediyne antibiotic), 에스페라마이신(esperamicin), 에포틸론(epothilone), 톡소이드(toxoid), 또는 이들의 배합물;
    (d) 친화성 리간드(affinity ligand), 여기에서 친화성 리간드는 기질, 저해제, 활성화제, 신경전달물질, 방사성 동위원소, 또는 이들의 배합물;
    (e) 방사능표지(radioactive label), 32P, 35S, 형광다이, 전자밀도 반응제(electron dense reagent), 효소, 비오틴, 스트렙타비딘(streptavidin), 디옥시제닌(dioxigenin), 햅텐(hapten), 면역성 단백질(immunogenic protein), 타겟에 컴플러멘터리한 서열을 갖는 핵산 분자(nucleic acid molecule with a sequence complementary to a target) 또는 이들의 배합물;
    (f) 면역조절 화합물(immunomodulatory compound), 항-암제(anti-cancer agent), 항-바이러스제(anti-viral agent), 항-박테리아제(anti-bacterial agent), 항-곰팡이제(anti-fungal agent), 및 항-기생충제(anti-parasitic agent), 또는 이들의 배합물;
    (g) 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜(4-hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 또는 토레미펜(toremifene);
    (h) 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 메제스톨 아세테이트(megestrol acetate), 엑스메스탄(exemestane), 레트로졸(letrozole), 또는 아나스트로졸(anastrozole)
    (i) 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 리우프롤라이드(leuprolide), 고세렐린(goserelin), 또는 트록사시타빈(troxacitabine);
    (j) 아로마타아제 저해제;
    (k) 단백질 키나아제 저해제;
    (l) 리피드 키나아제 저해제;
    (m) 안티센스 올리고뉴클레오티드;
    (n) 리보자임;
    (o) 백신; 및
    (p) 항-맥관형성제(anti-angiogenic agent).
  119. 제 1항에 있어서,
    상기 Ab는 항-B7-H3 항체이고;
    상기 활성제는 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine) 이량체이며;
    상기 링커는 Ab를 피롤로벤조디아제핀 이량체의 N10 또는 N10' 위치와 연결시키고; 및
    y는 1 내지 20의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  120. 제 119항에 있어서,
    상기 활성제는 피롤로벤조디아제핀 이량체이고;
    상기 피롤로벤조디아제핀 이량체는 N10 위치에서 X 또는 N10' 위치에서 X'로 치환되고, 여기서 X 또는 X'는 피롤로벤조디아제핀 이량체를 링커에 연결하며;
    X 및 X'는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -S(O)O-*, -C(O)-*, -C(O)NRX-*, -S(O)2NRX-*, -(P(O)R')NRX-*, -S(O)NRX-*, 또는 PO2NRX-*이고;
    RX는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C3-20 헤테로아릴, 또는 C5-20 아릴이며;
    RX'는 OH, N3, CN, SH, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴, 또는 아미노이고; 및
    *는 피롤로벤조디아제핀 이량체와 링커 사이의 결합 지점인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  121. 제 120항에 있어서, 상기 X 및 X'는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -C(O)-* 또는 -C(O)NRX-*인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  122. 제 120항에 있어서, 상기 피롤로벤조디아제핀 이량체는 하기 일반식 X 또는 일반식 XI로 기재되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 X]
    Figure pat00105

    [일반식 XI]
    Figure pat00106

    상기 식에서,
    상기 점선은 C1과 C2 사이, C2와 C3 사이, C'1과 C'2 사이, 또는 C'2과 C'3 사이의 이중 결합의 선택적 존재를 나타내며;
    RX1 및 RX1'는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, ORm, =CH-Rm' =C(Rm')2, OSO2-Rm, CO2Rm, CORm, 할로 또는 디할로이고;
    Rm'는 Rm, CO2Rm, CORm, CHO, CO2H 또는 할로이며,
    각각의 Rm는 독립적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴로이고;
    RX2, RX2' RX3, RX3', RX5, 및 RX5'는 독립적으로 H, Rm, OH, ORm, SH, SRm, NH2, NHRm, NRm 2, NO2, Me3Sn 또는 할로이며;
    RX4 및 RX4'는 독립적으로 H, Rm, OH, ORm, SH, SRm, NH2, NHRm, NRm 2, NO2, Me3Sn, 할로, C1-6 알킬 C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-12 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -CN, -NCO, -ORn, -OC(O)Rn, -OC(O)NRnRn', -OS(O)Rn, -OS(O)2Rn, -SRn, -S(O)Rn, -S(O)2Rn, -S(O)NRnRn', -S(O)2NRnRn', -OS(O)NRnRn', -OS(O)2NRnRn', -NRnRn', -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)ORo, -NRnC(O)NRoRo', -NRnS(O)Ro, -NRnS(O)2Ro, -NRnS(O)NRoRo', -NRnS(O)2NRoRo', -C(O)Rn, -C(O)ORn 또는 -C(O)NRnRn'이고;
    RX 및 RX'는 독립적으로 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, C1-8 알킬, C3-8 사이클로 알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴 또는 모노- 또는 디(di)-C1-8 알킬아미노이며;
    Y 및 Y'는 독립적으로 O, S, 또는 N(H)이고;
    RX6는 독립적으로 C3-12 알킬렌, C3-12 알케닐렌, 또는 C3-12 헤테로알킬렌이며;
    RX7 및 RX7'는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORr, -OC(O)Rr, -OC(O)NRrRr', -OS(O)Rr, -OS(O)2Rr, -SRr, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, -S(O)NRrRr', -S(O)2NRrRr', -OS(O)NRrRr', -OS(O)2NRrRr', -NRrRr', -NRrC(O)Rs, -NRrC(O)ORs, -NRrC(O)NRsRs', -NRrS(O)Rs, -NRrS(O)2Rs, -NRrS(O)NRsRs', -NRrS(O)2NRsRs, -C(O)Rr, -C(O)ORs 또는 -C(O)NRrRr'이고;
    각각의 Rr, Rr', Rs, 및 Rs' 은 독립적으로 H, C1-7 알킬, C2-7 알케닐, C2-7 알키닐, C3-13 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴로이며;
    각 RX8 및 RX8'는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 헤테로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -S(O)Rm, -S(O)2Rm, -S(O)NRmRm', -S(O)2NRmRm', -NRmRm', -NRmC(O)Rm, -NRmC(O)ORn, -NRmC(O)NRnRn', -NRmS(O)Rn, -NRmS(O)2Rn, -NRmS(O)NRnRn', -NRmS(O)2NRnRn', -C(O)Rm, -C(O)ORm 또는 -C(O)NRmRm'이고;
    Za 는 ORX12a, NRX12aRX12a, 또는 SRX12a이며;
    Zb 는 ORX13a, NRX13aRX13a, 또는 SRX13a이고;
    Za'는 ORX12a, NRX12aRX12a, 또는 SRX12a이며;
    Zb'는 ORX13a', NRX13'RX13a' 또는 SRX13a'이고;
    각 RX12a, RX12a', RX13a' 및 RX13a'는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 to 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테아릴, -C(O)RX15a, -C(O)ORX15a 또는 -C(O)NRX15aRX15a'이며; 및
    각각의 RX15a 및 RX15a' 는 독립적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로 아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴이고;
    상기 RX13a 및 RX14a 는 이들이 부착된 원자와 함께 임의적으로 결합하여 3 내지 7-원 헤테로 사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로 사이클로알킬, 또는 3 내지 7-원 헤테로 아릴을 형성하고, 및 RX13a' 및 RX14a'이들이 부착된 원자와 함께 임의적으로 결합하여 3 내지 7-원 헤테로 사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 3 내지 7-원 헤테로 아릴을 형성하며; 및
    상기 각각의 Rn, Rn', Ro, Ro', Rp, 및 Rp' 는 독립적으로 H, C1-7 알킬, C2-7 알케닐, C2-7 알키닐, C3-13 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴이다.
  123. 제 122항에 있어서, 상기 Rm는 독립적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 Rm는 추가적으로 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, C2-12 알키닐, C5-20 아릴, C5-20 헤테로아릴, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  124. 제 122항에 있어서, 상기 RX4 및 RX4'는 독립적으로 H, Rm, OH, ORm, SH, SRm, NH2, NHRm, NRmRm', NO2, Me3Sn, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-12 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -CN, -NCO, -ORn, -OC(O)Rn, -OC(O)NRnRn', -OS(O)Rn, -OS(O)2Rn, -SRn, -S(O)Rn, -S(O)2Rn, -S(O)NRnRn', -S(O)2NRnRn', -OS(O)NRnRn', -OS(O)2NRnRn', -NRnRn', -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)ORo, -NRnC(O)NRoRo', -NRnS(O)Ro, -NRnS(O)2Ro, -NRnS(O)NRoRo', -NRnS(O)2NRoRo', -C(O)Rn, -C(O)ORn 및 -C(O)NRnRn'로 부터 선택되고,
    상기 RX4 또는 RX4'는 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-12 아릴 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴이고, 추가적으로 하나 이상의 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORp, -OC(O)Rp, -OC(O)NRpRp', -OS(O)Rp, -OS(O)2Rp, -SRp, -S(O)Rp, -S(O)2Rp, -S(O)NRpRp', -S(O)2NRpRp', -OS(O)NRpRp', -OS(O)2NRpRp', -NRpRp', -NRpC(O)Rq, -NRpC(O)ORq, -NRpC(O)NRqRq', -NRpS(O)Rq, -NRpS(O)2Rq, -NRpS(O)NRqRq', -NRpS(O)2NRqRq', -C(O)Rp, -C(O)ORp 또는 -C(O)NRpRp로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  125. 제 122항에 있어서, 상기 RX7 및 RX7' 는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORr, -OC(O)Rr, -OC(O)NRrRr', -OS(O)Rr, -OS(O)2Rr, -SRr, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, -S(O)NRrRr', -S(O)2NRrRr', -OS(O)NRrRr', -OS(O)2NRrRr', -NRrRr', -NRrC(O)Rs, -NRrC(O)ORs, -NRrC(O)NRsRs', -NRrS(O)Rs, -NRrS(O)2Rs, -NRrS(O)NRsRs', -NRrS(O)2NRsRs, -C(O)Rr, -C(O)ORs 또는 -C(O)NRrRr'으로부터 선택되고,
    상기 RX7 또는 RX7' 는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴이고, 추가적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-6 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴, 5 내지 7-원 헤테로아릴, -ORt, -OC(O)Rt, -OC(O)NRtRt', -OS(O)Rt, -OS(O)2Rt, -SRt, -S(O)Rt, -S(O)2Rt, -S(O)NRtRt', -S(O)2NRtRt', -OS(O)NRtRt', -OS(O)2NRtRt', -NRtRt', -NRtC(O)Ru, -NRtC(O)ORu, -NRtC(O)NRuRu', -NRtS(O)Ru, -NRtS(O)2Ru, -NRtS(O)NRuRu', -NRtS(O)2NRuRu', -C(O)Rt, -C(O)ORt 또는 -C(O)NRtRt'로 치환되며,
    상기 Rr, Rr', Rs, Rs', Rt, Rt', Ru 및 Ru'는 독립적으로 H, C1-7 알킬, C2-7 알케닐, C2-7 알키닐, C3-13 사이클로알킬, 3 내지 7-원 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴, 및 5 내지 7-원 헤테로아릴로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  126. 제 122항에 있어서, 상기 RX1 및 RX1' 는 독립적으로 Rm 으로부터 선택되고; 및
    Rm은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C5-7 아릴 및 C3-6 헤테로아릴로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  127. 제 122항에 있어서, 상기 RX2, RX2', RX3, RX3', RX5, 및 RX5'은 독립적으로 H 또는 OH로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  128. 제 122항에 있어서, 상기 RX4 및 RX4' 는 독립적으로 Rm으로부터 선택되고; 및
    Rm 은 C1-6 알콕시인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  129. 제 122항에 있어서, 상기 RX4 및 RX4' 는 독립적으로 메톡시, 에톡시 및 부톡시로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  130. 제 122항에 있어서, 상기 Y 및 Y'는 O인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  131. 제 122항에 있어서, 상기 RX6 는 C3-12 알킬렌, C3-12 알케닐렌 또는 C3-12 헤테로알킬렌이고, 상기 RX6은 -NH2, -NHRm, -NHC(O)Rm, -NHC(O)CH2-[OCH2CH2]n-RXX, 또는 -[CH2CH2O]n-RXX로 치환되고;
    상기 RXX는 H, OH, N3, CN, NO2, SH, NH2, ONH2, NHNH2, 할로, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-8 알콕시, C1-8 알킬티오, C3-20 헤테로아릴, C5-20 아릴 또는 모노- 또는 디-C1-8 알킬 아미노이며; 및
    n은 1 내지 6의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  132. 제 122항에 있어서, 상기 활성제는 하기 일반식 XII 또는 일반식 XIII로 기재되는 피롤로벤조디아제핀 이량체인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    [일반식 XII]
    Figure pat00107

    [일반식 XIII]
    Figure pat00108

    상기 Xa 및 Xa'는 독립적으로 결합 또는 C1-6 알킬렌으로부터 선택되고;
    ZX' 및 ZX 는 독립적으로 수소, C1-8 알킬, 할로겐, 시아노, 나이트로,
    Figure pat00109
    ,
    Figure pat00110
    또는 -(CH2)m-OCH3로부터 선택되며;
    각각의 R80, R90 및 R100 는 수소, C1-8 알킬, C2-6 알케닐, 및 C1-6 알콕시로부터 선택되고; 및
    m은 0 내지 12의 정수임.
  133. 제 132항에 있어서, 상기 ZX' 및 ZX 는 독립적으로 수소,
    Figure pat00111
    ,
    Figure pat00112
    및 -(CH2)m-OCH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
    상기 각각의 R80, R90 및 R100 는 수소, C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
    m은 1 내지 6의 정수인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  134. 제 1항에 있어서, 상기 활성제는
    Figure pat00113
    ,
    Figure pat00114
    ,
    Figure pat00115
    ,
    Figure pat00116
    ,
    Figure pat00117
    ,
    Figure pat00118
    ,
    Figure pat00119
    ,
    Figure pat00120
    ,
    Figure pat00121
    ,
    Figure pat00122
    ,
    Figure pat00123
    ,
    Figure pat00124
    ,
    Figure pat00125
    ,
    Figure pat00126
    ,
    Figure pat00127
    ,
    Figure pat00128
    ,
    Figure pat00129
    ,
    Figure pat00130
    ,
    Figure pat00131
    ,
    Figure pat00132
    ,
    Figure pat00133
    ,
    Figure pat00134
    ,
    Figure pat00135
    ,
    Figure pat00136
    ,
    Figure pat00137
    ,
    Figure pat00138
    ,
    Figure pat00139
    ,
    Figure pat00140
    및
    Figure pat00141
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  135. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원결합 단편은 상기 B7-H3에 부가하여 하나 이상의 항원에 대한 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  136. 제 1 항 내지 제 17항 및 제 135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그 항원결합 단편은 항체의존적 세포독성의 유도, 또는 B7-H3 면역관문을 억제하여, B7-H3 면역관문에 의해 억제된 T 세포의 활성을 재활성하는 것을 특징으로 하는, 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  137. 제 1항의 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  138. 제 137항에 있어서, 상기 조성물은 B7-H3 과발현과 관련된 질환의 치료용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  139. 제 138항에 있어서, 상기 B7-H3 과발현과 관련된 질환은 암인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  140. 제 139항에 있어서, 상기 암은 B7-H3를 과발현하는 암으로, 유방암, 갑상성 암, 전립선암, 신장암, 신경 모세포종, 간세포암, 자궁경부암, 골육종, 구강암, 방광암, 신경교종, 비소세포폐암, 췌장암, 위암, 난소암, 대장암, 방광암, 흑생종, 자궁내막암, 두경부암, 요로상피암 또는 구상피 세포암을 포함하는 고형암; 또는 급성 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함하는 혈액암인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  141. 제 137 항 내지 제 140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 PD-1(Programmed cell death protein 1), PD-L1(Programmed Death Ligand 1), CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3), CD28(Cluster of Differentiation 28), CD122, 4-1BB(또는 CD137), TIM3(T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3), OX-40(또는 CD 134), OX40L(또는 CD252)), CD40, CD40L(또는 CD 154), LIGHT(또는 tumor necrosis factor superfamily member 14 (TNFSF14)), ICOS(Inducible T-cell costimulator 또는 CD278), ICOSL(또는 CD275), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(또는 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18), TIGIT(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), CD27, VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation), B7H3(또는 CD276), B7H4(또는 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1), HEVM(Herpes Virus Entry Mediator)또는 BTLA(B and T Lymphocyte Attenuator), CD47(또는 integrin associated protein (IAP))또는 CD73(또는 5'-nucleotidase (5'-NT)) 에 특이 적 으로 결합하여 항암 면역 반응을 나타내는 하나 이상의 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  142. 제 137 항 내지 제 140항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 약학적으로 유효한 양의 화학 치료제(chemotherapeutic agent)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  143. 제 1항의 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물, 또는 제 137항의 조성물을 포함하는 키트.
  144. 제 143항에 있어서, 상기 키트는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 치료를 위한 투여용 또는 B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 치료용인 것을 특징으로 하는, 키트.
  145. B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 치료 방법으로,
    제 1항의 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물, 또는 제 137항의 조성물의 치료적 유효량을 상기 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 치료 방법.
  146. 제 1항의 항체 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물, 또는 제 137항의 조성물의 B7-H3 과발현과 관련된 질환의 치료용 용도.
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