TW202413427A - 一種靶向ｐｄ－１和ｖｅｇｆ的抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

提供了一種靶向PD-1和VEGF的抗體及其應用。也提供了一種抗原結合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分具有特異性結合PD-1的功能，該第二靶向部分具有特異性結合VEGF的功能。

Description

一種靶向PD-1和VEGF的抗體及其應用
本申請關於生物醫藥領域，具體關於一種靶向PD-1和VEGF的抗體及其應用。
惡性腫瘤是目前全球範圍內嚴重威脅人類健康的疾病，是疾病導致人類死亡的主要類型。隨著國內人口老齡化的日漸加劇，腫瘤發生率不斷提高，有效的治療藥物亟待開發。
免疫檢查點藥物的開發為近年來研究熱點。程序性死亡受體1(programmed death 1)簡稱PD-1廣泛表達於免疫細胞，是一種重要的免疫抑制分子。PD-1的主要配體為PD-L1，PD-L1主要表達於腫瘤細胞表面。配體PD-L1和受體PD-1結合後，在腫瘤微環境中抑制T細胞活化，導致T細胞等免疫系統無法正常殺傷腫瘤細胞，進而實現免疫逃逸。PD-1或PD-L1免疫療法的作用機制是針對PD-1或PD-L1設計特定的單株抗體，阻止PD-1和PD-L1的識別，恢復T細胞正常功能，從而使T細胞有效殺傷腫瘤細胞。目前已開發出多款針對這一信號通路的治療性抗體，如帕博利珠單抗(Pembrolizumab)和納武利尤單抗(Nivolumab)，但在治療過程中普遍存在響應率低，易產生耐藥性等現象。
另外，在腫瘤的生長過程中表皮生長因子VEGF能特異性刺激內皮細胞的增殖，在多種類型的腫瘤血管生成中起關鍵作用。VEGF與表皮生長因子受體VEGFR結合後能夠藉由下游信號通路介導胞內相關蛋白基因轉錄表達，促進血管內皮細胞增殖。目前已開發出諸如貝伐單抗(Bevacizumab)等多款靶向人VEGF人源化單株抗體，但在治療過程中仍存在響應率低，易產生耐藥性等現象。
同時，目前在售的治療性抗體藥絕大多數為單株抗體，抗體特異性針對單一靶點，治療過程中更傾向於出現響應率低，易產生耐藥性等現象。因此，本領域亟需一種結構穩定、療效好且適合大規模工業化生產的靶向PD-1和VEGF多特異性抗體。
本申請所述的抗原結合蛋白具有至少一種選自下組的特點：易表達純化、與VEGF結合親和活性高、能夠有效調控PD-1和PD-L1的信號，和抑制腫瘤生長。
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段，該第二靶向部分包含特異性結合VEGF的抗體或其抗原結合片段；
其中，該第一靶向部分包含抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：5或11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：6或12所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：7或13所示的胺基酸序列；
其中，該第一靶向部分包含抗體或其抗原結合片段的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1包含SEQ ID NO：8或14所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：9或15所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：10或16所示的胺基酸序列；
其中，該第二靶向部分包含奈米抗體的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
一方面，本申請提供了一種核酸，其編碼本申請的抗原結合蛋白。
一方面，本申請提供了一種載體，其包含本申請的核酸。
一方面，本申請提供了一種免疫綴合物，其包含本申請的抗原結合蛋白。
一方面，本申請提供了一種細胞，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、和/或本申請的免疫綴合物。
一方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、和/或本申請的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
一方面，本申請提供了一種試劑盒，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、和/或本申請的醫藥組成物。
一方面，本申請提供了一種製備如本申請的抗原結合蛋白的方法，其包括在使得該抗原結合蛋白能夠表達的條件下培養如本申請的細胞。
一方面，本申請提供了一種本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療腫瘤。
一方面，本申請提供了一種本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒用於治療。
一方面，本申請提供了一種本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒用於預防、緩解和/或治療腫瘤。
一方面，本申請提供了一種用於預防、緩解和/或治療腫瘤的方法，包括向受試者施用有效量的本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒。
一方面，本申請提供了一種抑制PD-1蛋白與PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白結合，和/或抑制VEGF蛋白與VEGFR蛋白結合的方法，該方法包含施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒。
一種調控免疫反應的方法，該方法包含施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒。
本申請雙特異性抗體分子結構可以為IgG-VHH，使用該形式的針對PD-1或PD-L1與VEGF靶點的雙特異性抗體可以有效的避免抗體輕重鏈的錯配，分子穩定性更高，更適合於工業化生產。同時本申請的抗原結合分子可以阻斷兩個信號通路，以及具有腫瘤微環境的靶向性，可以有更好的安全性及治療效果。
所屬技術領域中具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域中具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域中具有通常知識者能夠對所揭露的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。
圖2顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的食蟹猴PD-1蛋白。
圖3顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L1與CHOK1表面的人PD-1蛋白結合。
圖4顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L2與CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。
圖5顯示的是人源化抗體1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3都能刺激淋巴細胞分泌IL2的結果。
圖6顯示的是酵母細胞壁表面展示單域抗體的構建方案。
圖7顯示的是單域抗體阻斷VEGF165和人VEGFR2的結合結果。
圖8顯示的是Ab1910VE18和Ab1910VE21抗體的阻斷結果。
圖9顯示的是雙特異性抗體Kab5、Kab6與細胞表面抗原PD-1的結合結果。
圖10顯示的是雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L1的結合結果。
圖11顯示的是雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L2的結合結果。
圖12顯示的是雙特異性抗體與VEGFR2競爭結合抗原VEGF的活性結果。
圖13顯示的是雙特異性抗體刺激混合淋巴細胞分泌細胞因子IL2的結果。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，所屬技術領域中具有通常知識者可由本說明書所揭露的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“第一靶向部分”和“第二靶向部分”通常是指本申請抗原結合蛋白中能夠靶向特定分子的部分。例如，該靶向部分可以包括但不 限於抗體或其片段、肽、激素、生長因子、細胞因子和任何其它天然的或非天然的配體。
在本申請中，術語“連接子”通常是指接合或連接2個或更多個離散的分開的單體域的部分。連接子可以是肽連接子，其包含藉由肽鍵連接的2個或更多胺基酸殘基的多肽，且用於連接一個或多個抗原結合部分。例如，該連接子可以是(GxS)n，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，x=3且n=1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或x=4且n=1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，該連接子可以是ADIEGRMD。
在本申請中，術語“VEGF”通常是指血管內皮細胞生長因子，包括其天然存在的等位基因形式和加工形式。該VEGF可包括VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和/或PlGF。在本申請中，該VEGF可以為VEGF-A，也可稱為VEGF165。VEGF-A可結合受體酪胺酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR3和Neuropilin-1(NRP-1)。VEGF165與VEGFR2結合後藉由下游PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK信號通路介導胞內相關蛋白基因轉錄表達，促進血管內皮細胞增殖。術語“VEGF”還可以指來自非人物種諸如小鼠，大鼠或靈長類動物的VEGF。在本申請中，來自特定物種的VEGF可以表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF。通常，VEGF可以指人VEGF。術語“VEGF”還用於指完整VEGF的截短形式或片段，還包括VEGF的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物以及具有至少一個與VEGF共同表位的類似物。VEGF序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人VEGFA蛋白序列可在NCBI登錄號NP_001020537、NP_001020538、NP_001020539、NP_001020540或NP_001020541下找到。
在本申請中，術語“PD-1”通常是指程序性死亡1受體，也可稱為“程序性死亡1”、“CD279”、“分化簇279”、“PD1”、“PDCD1”或“CD297”。PD-1蛋白通常包括胞外IgV域、跨膜區和胞內尾。PD-1通常在T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、活化的單核細胞和樹突細胞(DC)上表達。PD-1可以結合其配體PD-L1和PD-L2。術語“PD-1”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-1或經修飾的PD-1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人或猴)和齧齒類(例如，小鼠或大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-1。PD-1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。“PD-1”包括完整的PD-1及其片段，還包括PD-1的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物以及具有至少一個與PD-1共同表位的類似物。PD-1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_005009.2下找到，示例性的全長食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_001271065或Uniprot登錄號B0LAJ3下找到。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程序性死亡配體1蛋白。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，並且是由(人類中)CD274基因編碼的蛋白。PD-L1可以結合其受體，例如程序性死亡1(PD-1)。PD-L1和PD-1的絡合藉由抑制T細胞增殖和產生細胞因子IL-2和IFN-γ發揮免疫抑制作用。術語“PD-L1”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1或經修飾的PD-1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人或猴)和齧齒類(例如，小鼠或大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。該術語還涵蓋天然存在的PD-L1的變體，例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基本 結構包括4個結構域：胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。PD-L1序列是本領域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的信息。示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到。
在本申請中，術語“PD-L2”通常是指程序性死亡配體2蛋白，也可稱為“程序性死亡2”、“CD273”、“分化簇273”、“B7-DC”或“PDCD1LG2”。術語“PD-L2”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L2或經修飾的PD-L2，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人或猴)和齧齒類(例如，小鼠或大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L2。PD-L2可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。“PD-L2”包括完整的PD-L2及其片段，還包括PD-L2的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物以及具有至少一個與PD-L2共同表位的類似物。PD-L2序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-L2蛋白序列可在NCBI登錄號NP_079515.2下找到。
在本申請中，術語“VEGFR”通常是指血管內皮細胞生長因子受體，包括其天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGFR可包括VEGFR1、CEGFR2和VEGFR3，以及其他選擇性剪接變體。VEGFR可以是膜結合的或可溶的。術語“VEGFR”還可以指來自非人物種諸如小鼠，大鼠或靈長類動物的VEGFR。在本申請中，來自特定物種的VEGFR可以表示如下，hVEGFR表示人VEGFR，mVEGFR表示鼠VEGFR。通常，VEGFR可以指人VEGFR。術語“VEGFR”還用於指完整VEGFR的截短形式或片段，還包括VEGFR的功能性變 體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物以及具有至少一個與VEGFR共同表位的類似物。VEGFR序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人VEGFR2蛋白序列可在NCBI登錄號NP_002244下找到。
在本申請中，當說到蛋白質、多肽和/或核酸分子時，還包括該蛋白質、多肽和/或核酸分子的同源物。在本申請中，術語“同源物”通常是指與野生型胺基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的胺基酸序列或核苷酸序列。術語“同源性”可以等同於序列“同一性”。同源序列可以包括可以與主題序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的胺基酸序列。通常，同源物將包含與主題胺基酸序列相同的活性位點等。同源性可以根據相似性(即具有相似化學性質/功能的胺基酸殘基)來考慮，也可以在序列同一性方面表達同源性。在本申請中，提及的胺基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一項具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整個長度上具有該百分比同一性的序列。
在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。抗原結合蛋白可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者，及其功能性片段。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“抗體”通常是指對指定蛋白質或肽或其片段有反應性的免疫球蛋白。抗體可以是來自任何類的抗體，包括但不限於IgG、IgA、 IgM、IgD和IgE，及來自任何亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗體。抗體可具有選自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重鏈恆定區。抗體還可具有選自例如kappa(κ)或lambda(λ)的輕鏈。本申請的抗體可衍生自任何物種。
在本申請中，術語“抗原結合片段”通常是指抗體分子的某部分，該部分包含胺基酸殘基，該胺基酸殘基與抗原相互作用並賦予抗體對於抗原的特異性和親和力。抗原結合片段的實例可包括但不限於Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab'''通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子；此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。在本申請中，術語“VHH”通常是指包含重鏈抗體的可變抗原結合結構域的抗體。VHH也可稱為奈米抗體。
在本申請中，術語“可變區”或“可變結構域”通常是指參與抗體與抗原的結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。在本申請中，術語“可變”通常是 指，抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈可變區和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)，分別為LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可變域中更高度保守的部分被稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDR結構環區連接。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。
在本領域中，可以藉由多種方法來編碼抗體的可變區或劃分抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat編號方案和定義規則，基於結構環區域位置的Chothia編號方案和定義規則，efranc等人的基於種系V基因的胺基酸序列比對的IMGT編號方案和定義規則，還有Honneger’s編號方案(AHo’s)，Martin編號方案，Gelfand編號方案等。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變和/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外。單株抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。
在本申請中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如小鼠來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。
在本申請中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置 換的抗體。在CDR區中，胺基酸的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術和RNA-多肽技術等。
在本申請中，術語“結合”、“特異性結合”或“對...特異性的”通常是指可測量且可再現的相互作用，諸如抗原和抗體之間的結合，其可以確定在存在分子(包括生物學分子)的異質群體的情況中靶物的存在。例如，抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物(其可以是表位)的抗體是以比其結合其它靶物更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。
在本申請中，術語“KD”、“K D ”可互換地使用，通常是指平衡解離常數，“KD”是解離速率常數(kdis，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon，也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(KD)表示抗原結合蛋白(例如抗體)對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知，包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面電漿共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質芯片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量，則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
在本申請中，術語“靈長類動物”通常是指猴和猿物種，並包括猴物種，諸如來自獼猴屬(例如，食蟹猴(Macaca fascicularis)和或恆河猴(Macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))的猴，以及狨猴(來自狨(Callithrix)屬的物種)，松鼠猴(來自松鼠猴(Saimiri)屬的物種)和絹毛猴(來自檉柳猴(Saguinus)屬的物種)，以及猿物種，諸如黑猩猩(Pan troglodytes)，並且還包括智人(Homo sapiens)。
在本申請中，術語“多肽”或“蛋白質”可互換地使用，通常是指胺基酸殘基的聚合物。該術語也適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的類似物或模擬物的胺基酸聚合物、以及天然存在的胺基酸聚合物。該術語也可包括修飾的胺基酸聚合物，例如，藉由添加糖殘基以形成糖蛋白或被磷酸化修飾。多肽和蛋白質可由天然存在的和非重組的細胞或由遺傳工程改造的或重組的細胞產生，並且可包含具有天然蛋白質的胺基酸序列的分子、或具有天然序列的一個或多個胺基酸的缺失、添加和/或取代的分子。術語 “多肽”和“蛋白質”特別包括本申請所述的抗原結合蛋白的一個或多個胺基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
在本申請中，術語“分離的”通常是指大體上不含其天然存在的環境中通常伴隨或與之相互作用的組分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白質)。該分離的生物材料視需要地包含在其天然環境(例如，核酸或蛋白質)中該生物材料未發現具有的另外的材料。在本申請中，當涉及蛋白質時，“分離”通常是指該分子從發現該分子天然存在的整個生物體中分離和分開，或基本不存在其它相同類型的生物大分子。當涉及核酸分子時，它與天然與其結合的序列完全或部分分離，或該核酸具有與其結合的異源序列，或該核算從染色體分離。
在本申請中，術語“免疫綴合物”通常是指抗原結合蛋白與其它活性劑連接形成的物質，其他活性劑可以是小分子活性劑，例如化療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針或光譜探針。
在本申請中，術語“核酸”分子通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或轉譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並轉譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以包含或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請所述的抗原結合蛋白的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中，該細胞可以是哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。
在本申請中，術語“醫藥組成物”通常是指這樣的製劑，其以允許活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對將施用該組成物的對象具有不可接受的毒性的另外的成分。
在本申請中，術語“治療”通常是指期望改變所治療個體的天然病程，且可為實現防治或在臨床病變過程中進行的臨床介入。合乎需要的治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發性、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態以及緩和或改善預後。在一些情形中，抗原結合蛋白(例如，抗VEGF抗體)可用來延遲疾病發展或減緩疾病進展。
在本申請中，術語“施用”通常是指向受試者(例如，患者)給予一定劑量的化合物(例如，抗癌治療劑)或醫藥組成物(例如，包含抗癌治療劑的醫藥組成物)的方法。施用可藉由任何合適的方式進行，包括腸胃外、肺內和鼻內，以 及(如果局部治療需要)損傷內施用。胃腸外輸注包括例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性還是良性)以及所有癌前和癌性細胞和組織。在本申請中，該腫瘤可以為細胞和組織的VEGF或VEGFR高表達的腫瘤。腫瘤可包括實體瘤和/或非實體瘤(例如，血液瘤、淋巴瘤)。
在本申請中，術語“在......之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。在本申請中，“第一胺基酸片段”和“第二胺基酸片段”可以為相同或不同的任意一段胺基酸片段。
在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由......組成”的含義。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、 3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
發明詳述
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段，該第二靶向部分包含特異性結合VEGF的抗體或其抗原結合片段；
其中，該第一靶向部分包含抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：5或11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：6或12所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：7或13所示的胺基酸序列；
其中，該第一靶向部分包含抗體或其抗原結合片段的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1包含SEQ ID NO：8或14所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：9或15所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：10或16所示的胺基酸序列；
其中，該第二靶向部分包含抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
例如，本申請第一靶向部分可包含抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
例如，本申請第一靶向部分可包含抗體或其抗原結合片段的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
例如，本申請第一靶向部分可包含抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
如，本申請第一靶向部分可包含抗體或其抗原結合片段的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
例如，本申請第一靶向部分可包含HCDR3，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、22、和24中任一項所示的VH的HCDR3。例如，本申請第一靶向部分可包含HCDR2，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、22、和24中任一項所示的VH的HCDR2。例如，本申請第一靶向部分可包含HCDR1，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、22、和24中任一項所示的VH的HCDR1。例如，本申請第一靶向部分可包含HCDR3、HCDR2、和HCDR1，該HCDR3、HCDR2、和HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、22、和24中任一項所示的VH的HCDR3、HCDR2、和HCDR1。例如，本申請第一靶向部分可包含HFR1、HFR2、HFR3、和/或HFR4，該HFR1、HFR2、HFR3、HFR4可分別包含胺基酸序列如SEQ ID NO：1、3、22、和24中 任一項所示的VH的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4。例如，可根據Chothia規則劃分。
例如，本申請第一靶向部分可包含LCDR3，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、21和23中任一項所示的VL的LCDR3。例如，本申請第一靶向部分可包含LCDR2，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、21和23中任一項所示的VL的LCDR2。例如，本申請第一靶向部分可包含LCDR1，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、21和23中任一項所示的VL的LCDR1。例如，本申請第一靶向部分可包含LCDR3、LCDR2、和LCDR1，該LCDR3、LCDR2、和LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、21和23中任一項所示的VL的LCDR3、LCDR2、和LCDR1。例如，本申請第一靶向部分可包含LFR1、LFR2、LFR3、和/或LFR4，該LFR1、LFR2、LFR3、LFR4可分別包含胺基酸序列如SEQ ID NO：2、4、21、和23中任一項所示的VL的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4。例如，可根據Chothia規則劃分。
在一個實施方案中，本申請提供了一種抗原結合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段，該第二靶向部分包含特異性結合VEGF的抗體或其抗原結合片段：
其中，該特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：8所示的胺基 酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，
其中該特異性結合VEGF的抗體或其抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在一個具體的實施方案中，該第二靶向部分直接或者藉由連接子連接在第一靶向部分的抗體重鏈的C末端。
例如，其中該第一靶向部分包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含選自SEQ ID NO：1、3、22和24中任一項所示的胺基酸序列。
例如，其中該第一靶向部分包含抗體輕鏈可變區VL，且該VL包含選自SEQ ID NO：2、4、21和23中任一項所示的胺基酸序列。
例如，其中該第一靶向部分包含抗體重鏈可變區VH和抗體輕鏈可變區VL，該VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。例如，該VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。例如，該VH包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序 列。例如，該VH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
例如，其中該第一靶向部分還包含抗體重鏈恆定區，該抗體重鏈恆定區源自IgG恆定區。例如，源自IgG4恆定區。例如，第一靶向部分可以包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。例如，其中該第一靶向部分還包含抗體輕鏈恆定區。例如，第一靶向部分可以包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
根據本申請的抗原結合蛋白，其中該第二靶向部分包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。根據本申請的抗原結合蛋白，其中該第二靶向部分包含抗體重鏈恆定區。例如，源自IgG1恆定區。例如，第二靶向部分可以包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。例如，其中該第二靶向部分為奈米抗體。
在一個實施方案中，本申請提供了一種抗原結合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段，該第二靶向部分包含特異性結合VEGF的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合蛋白是雙特異性抗體Kab5或Kab6。
一個實施方案中，雙功能抗體Kab5包含重鏈或輕鏈，其中該重鏈從N端至C端依次包含胺基酸序列SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：25；該輕鏈從N端至C端依次包含胺基酸序列SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：31。
一個實施方案中，雙功能抗體Kab6包含重鏈或輕鏈，其中該重鏈從N端至C端依次包含胺基酸序列SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：25；該輕鏈從N端至C端依次包含胺基酸序列SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：31。
在本申請中，該抗原結合蛋白每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源，或者屬特定的類別。例如，輕鏈和重鏈的可變區及恆定部分均來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域中具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。
根據本申請的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。例如，其中抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。例如，該抗原結合蛋白包含雙特異性抗體。例如，該抗原結合蛋白包含IgG-VHH類型雙特異性抗體。
例如，該第二靶向部分位於該第一靶向部分的C端和/或N端。例如，該第一靶向部分包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該第二靶向部分位於該第一靶向部分的抗體重鏈、和/或抗體輕鏈的C端。
例如，該第二靶向部分與該第一靶向部分直接或間接連接。例如，該第二靶向部分與該第一靶向部分藉由連接子連接。例如，本領域可以用連接兩端多肽的連接子連接該第二靶向部分與該第一靶向部分。例如，該連接子包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
根據本申請的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含該第一多肽鏈包含該第一靶向部分的抗體重鏈或其抗原結合片段、視需要存在或不存在的連接子以及該第二靶向部分的抗體或其抗原結合片段，且該第二多肽鏈包含該第一靶向部分的抗體輕鏈或其抗原結合片段。例如，本申請中的第一多肽鏈中的該第一靶向部分與該第二靶向部分可以直接連接，例如連接子不存在或者，藉由化學鍵連接。例如，本申請中的第一多肽鏈中的該第一靶向部分與該第二靶向部分可以間接連接，例如藉由連接子連接。例如連接子結構可以為本申請已知的連接肽。例如，該第一多肽鏈可以包含：該第一靶向部分的重鏈可變區-第一靶向部分的重鏈恆定區-X-該第二靶向部分的可變區-該第二靶向部分的恆定區，以及該第二多肽鏈可以包含：該第一靶向部分的輕鏈可變區-第一靶向部分的輕鏈恆定區，其中該X為不存在或者包含該連接子。
例如，該第一多肽鏈自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗體重鏈或其抗原結合片段和該第二靶向部分的抗體或其抗原結合片段。例如，該第一多肽鏈自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗體重鏈或其抗原結合片段，連接子和該第二靶向部分的抗體或其抗原結合片段。
本申請中，該分離的抗原結合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-1。例如，該KD的值可以以約1×10-8M或以下、約9×10-9M或以下、約8×10-9M或以下、約7×10-9M或以下、約6×10-9M或以下、約5×10-9M或以下、約4×10-9M或以下、約3×10-9M或以下、約2×10-9M或以下、約1×10-9M或以下的值結合源自人的PD-1，例如，使用FortieBio Octet分子相互作用分析儀所檢測的。
在另一情形中，本申請所述PD-1抗原結合蛋白與PD-1的結合活性可使用流式細胞術或酶聯免疫法測定進行檢測。例如，在FACS檢測中，使用穩定表達人PD-1的宿主細胞(如CHOK1細胞)，該PD-1抗原結合蛋白結合PD-1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.001nM至約1nM之間，約0.01nM至約1nM之間，約0.01nM至約1.2nM之間，或，約0.1nM至約1.5nM之間。
例如，在FACS檢測中，使用穩定表達猴PD-1的宿主細胞(如CHOK1細胞)，該PD-1抗原結合蛋白結合PD-1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.01nM至約1nM之間，約0.02nM至約1.0nM之間，約0.1nM至約1.0nM之間。
在另一個方面，本申請所述的抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。
例如，首先將穩定表達人PD-1的宿主細胞(如HEK293細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-L1蛋白孵育。 然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合。例如，IC50值約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.01nM至約5nM之間，約0.1nM至約1.0nM之間，約0.5nM至約1.5nM之間。
例如，首先將穩定表達人PD-1的宿主細胞(如CHOK1細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-L2蛋白孵育。然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L2結合。例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.1nM至約2.5nM之間，約0.1nM至約3nM之間。
本申請中，該分離的抗原結合蛋白能夠以1×10-7M或更低的KD值結合VEGF(例如，VEGF165)。例如，該KD的值可以以約5×10-8M或以下、約4×10-8M或以下、約3×10-8M或以下、約2×10-8M或以下、約1×10-8M或以下、約9×10-9M或以下、約8×10-9M或以下、約7×10-9M或以下、約6×10-9M或以下、約5×10-9M或以下、約4×10-9M或以下、約3×10-9M或以下、約2×10-9M或以下、約1×10-9M或以下、約9×10-10M或以下、約8×10-10M或以下、約7×10-10M或以下的值結合源自人的VEGF，例如，使用FortieBio Octet分子相互作用分析儀所檢測的。
本申請所述的抗原結合蛋白能夠阻斷VEGF(例如，VEGF165)與VEGFR(例如VEGFR2)的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷VEGF與VEGFR的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。
例如，首先將人VEGFR(例如VEGFR2)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用被標記的VEGF蛋白孵育。然後，檢測OD450，以證實該抗原結合蛋白阻斷VEGF(例如，VEGF165)與VEGFR(例如VEGFR2)結合。 例如，阻斷活性的IC50在約0.001μg/mL至約10μg/mL之間，約0.001μg/mL至約5μg/mL之間，約0.01μg/mL至約1μg/mL之間，約0.02μg/mL至約0.5μg/mL之間，約0.2μg/mL至約15μg/mL之間，約0.2μg/mL至約12μg/mL之間，約0.2μg/mL至約10μg/mL之間，約0.3μg/mL至約8μg/mL之間，約0.3μg/mL至約6μg/mL之間，約0.5μg/mL至約5μg/mL之間，約0.1μg/mL至約2μg/mL之間，或約0.5μg/mL至約1.5μg/mL之間。
一方面，本申請提供了一種核酸，其編碼本申請的抗原結合蛋白。該一種或多種核酸分子可編碼本申請所述的抗原結合蛋白。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗原結合蛋白的各個多肽鏈。本申請所述的核酸分子可以為分離的。
一方面，本申請提供了一種載體，其包含本申請的核酸。本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
一方面，本申請提供了一種免疫綴合物，其包含本申請的抗原結合蛋白。例如，本申請的免疫綴合物還可以包含具有細胞殺傷能力的化合物。例如，本申請的免疫綴合物還可以包含跨膜域、胞內刺激域、和/或胞內信號域。
一方面，本申請提供了一種細胞，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、和/或本申請的免疫綴合物。例如，本申請提供了宿主細胞，該宿主細胞可包含本申請所述的一種或多種核酸分子和/或本申請 所述的一種或多種載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請所述的核酸分子或載體。例如，本申請的細胞不具有發育成為完整生物體的潛能。
一方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、和/或本申請的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。該藥學上可接受的載劑在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒性，本申請中的醫藥組成物還可含有多於一種活性化合物，通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化合物。
一方面，本申請提供了一種試劑盒，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、和/或本申請的醫藥組成物。
一方面，本申請提供了一種製備如本申請的抗原結合蛋白的方法，其包括在使得該抗原結合蛋白能夠表達的條件下培養如本申請的細胞。
一方面，本申請提供了一種本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療腫瘤。例如，其中該腫瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表達的腫瘤。根據本申請的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。根據本申請的用途，其中該腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
一方面，本申請提供了一種本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、 和/或本申請的試劑盒，其用於預防、緩解和/或治療腫瘤。例如，其中該腫瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表達的腫瘤。根據本申請的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。根據本申請的用途，其中該腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
一方面，本申請提供了一種預防、緩解和/或治療腫瘤的方法，包含施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒。例如，其中該腫瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表達的腫瘤。根據本申請的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。根據本申請的用途，其中該腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
一方面，本申請提供了一種抑制PD-1蛋白與PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白結合，和/或抑制VEGF蛋白與VEGFR蛋白結合的方法，該方法包含施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非治療目的的方法。在某些情形中，該方法可包括使生物樣品與本申請所述的抗原結合蛋白和/或PD-1在容許該抗原結合蛋白和/或PD-1結合PD-L1的條件下接觸，檢測PD-1與PD-L1之間是否形成複合物。在某些情形中，該方法可包括使生物樣品與本申請所述的抗原結合蛋白和/或VEGF在容許該抗原結合蛋白和/或VEGF結合VEGFR的條件下接觸，檢測VEGFR與VEGFR之間是否形成複合物。
一種調控免疫反應的方法，該方法包含施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸、本申請的載體、本申請的免疫綴合物、本申請的細胞、本申請的醫藥組成物、和/或本申請的試劑盒。例如，該調控免疫反應包含刺激免疫細胞分泌細胞因子。例如，該調控免疫反應包含刺激免疫細胞分泌IL-2。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請發明的各個技術方案，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
實施例1抗PD-1抗體製備與檢測
1.1 融合瘤抗體篩選與製備
用Human PD-1,Mouse IgG2a Fc Tag融合蛋白(Acrobiosystem，PD1-H5255a)與pcDNA3.4-hPD-1質粒DNA免疫Balb/c和SJL小鼠各5隻，每次間隔2~3週，3次後用Human PD-1,Mouse IgG2a Fc Tag融合蛋白或CHOK1-hPD-1穩轉細胞株(金斯瑞，M00529)做加強免疫1-3次，採血測效價。效價檢測採用流式細胞儀測定血清與過表達人PD-1蛋白的CHOK1或293T細胞結合，取結合效價高的小鼠脾細胞與骨髓瘤(Sp2/0)細胞進行融合。
利用流式細胞儀從融合板中篩選出與CHOK1-hPD-1細胞特異性結合並能同時阻斷配體PD-L1、PD-L2與細胞CHOK1-hPD1結合的株，利用有限稀釋法進行亞選殖，最終篩選到可分泌特異性抗體的單株。採用無血清培養基進行小規模生產純化得到單株抗體做後續鑑定，包含檢測抗體與CHOK1-hPD1的結合能力、對PD-L1、PD-L2與CHOK1-hPD-1結合的阻斷功能以及混合淋巴細胞實驗最終得到候選抗人PD-1單株抗體41D2-2C3D7與46H3A8。經單株抗體測序獲得鼠源融合瘤株41D2-2C3D7與46H3A8的可變區序列如下：
>41D2-2C3D7重鏈可變區序列(SEQ ID NO：1)
Figure 112129978-A0202-12-0031-1
>41D2-2C3D7輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：2)
Figure 112129978-A0202-12-0031-2
>46H3A8重鏈可變區序列(SEQ ID NO：3)
Figure 112129978-A0202-12-0031-3
>46H3A8輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：4)
Figure 112129978-A0202-12-0031-4
表1鼠源融合瘤株41D2-2C3D7重鏈及輕鏈CDR區序列
Figure 112129978-A0202-12-0032-5
表2鼠源融合瘤株46H3A8重鏈及輕鏈CDR區序列
Figure 112129978-A0202-12-0032-7
1.2 鼠源融合瘤41D2-2C3D7、46H3A8單株抗體人源化
藉由序列比對挑選最同源的人Germline抗體(例如可以來源於IMGT)做為人源化設計框架。
輕鏈以IGKV1-9*01(SEQ ID NO：17)，IGKJ4*01(SEQ ID NO：18)為框架，重鏈以IGHV3-21*01(SEQ ID NO：19)，IGHJ5*01(SEQ ID NO：20)為框架，根據序列比對和可變區結構信息對41D2-2C3D7、46H3A8輕重鏈可變區胺基酸進行1-2輪人源化突變。突變後，41D2-2C3D7獲得人源化輕重鏈可變區41D2HzL4(SEQ ID NO：21)與41D2HzH3(SEQ ID NO：22)；46H3A8獲得人源化輕重鏈可變區1910h3hzL3(SEQ ID NO：23)與1910h3hzH4(SEQ ID NO：24)。對人源化抗體輕重鏈可變區可以進行Chothia編號，定義抗體輕鏈和重鏈CDR區。將41D2HzL4、1910h3hzL3序列與人Kappa鏈恆定區CL(胺基酸序列SEQ ID NO：31)組合成抗體輕鏈，將41D2HzH3、1910h3hzH4序列與人IgG4恆定區CH(胺基酸序列SEQ ID NO：32)組合成抗體重鏈，組合後配對組成人源化抗體41D2HzL4H3(也稱為1910D2HzL4H3)和1910h3hzL3H4。
>41D2HzL4輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：21)
Figure 112129978-A0202-12-0033-8
>41D2HzH3重鏈可變區序列(SEQ ID NO：22)
Figure 112129978-A0202-12-0033-9
>1910h3hzL3輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：23)
Figure 112129978-A0202-12-0033-10
>1910h3hzH4重鏈可變區序列(SEQ ID NO：24)
Figure 112129978-A0202-12-0033-11
1.3 人源化抗體動力學參數測定
(1)採用Octet RED96e(Fortebio)測定人源化抗體1910h3hzL3H4及41D2HzL4H3與人PD-1(Sino Biological，貨號：10377-H08H)的親和力，抗原及 抗體均用1xPBST(1xPBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma-alorich，P1379)稀釋，抗原使用濃度為100nM，抗體使用濃度為50nM。
(2)樣品上機檢測(Octet Data Acquisition 11.1.0.11)：首先，將樣品加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，體系為200μL/孔。然後設置軟體參數，板溫設定為30℃，收集標準動力學信號的頻率為5.0Hz。接著，用1xPBST預濕AHC傳感器(Fortébio，貨號：18-0015)10分鐘，然後上機檢測。每個循環包含以下步驟：1)浸入緩衝液60秒；2)檢測抗原是否與傳感器有非特異性結合；3)10mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；4)浸入緩衝液60秒；5)抗體固化在傳感器上，時間為20秒；6)傳感器浸入緩衝液180秒；7)抗原與抗體結合，時間180秒；8)抗原抗體的解離，時間10分鐘；9)傳感器再生。
(3)數據分析
採用Fortebio的Data Analysis 11.0軟體，對抗原-抗體以1：1的結合方式，測定結合速率(Ka)和解離速率(Kd)，以此計算抗體的平衡解離常數(KD)。人結果如表3所示：
表3人源化抗體與人PD-1的親和力
Figure 112129978-A0202-12-0034-43
結果顯示，1910h3hzL3H4與Pembrolizumab比較，抗體與人PD-1的親和力相當；41D2HzL4H3與人PD-1的親和力較Pembrolizumab提高約4.2倍。說明人源化後抗體與PD-1具有較高的結合親和力。
1.4 候選抗體與細胞表面人或食蟹猴PD-1的結合活性
收集CHOK-hPD-1(金斯瑞，M00529)細胞或CHOK1-cynoPD-1(金斯瑞，M00572)，用FACS緩衝液(含有2% FBS的PBS)洗一遍後重新懸浮，按1E5/50ul/孔，分液到96孔板(Corning 3799)中。抗體加到上述96孔U型板中，50ul/孔，混勻後4℃孵育1小時。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS緩衝液洗一遍。每孔加入1：1000的Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen)，100ul/孔，混勻4℃孵育1小時。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS buffer洗一遍，30ul FACS緩衝液重新懸浮上機檢測。
圖1顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。圖2顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的食蟹猴PD-1蛋白。結果表明人源化抗體與細胞表面人或食蟹猴PD-1的結合活性同Pembrolizumab相當。
1.5 候選抗體阻斷細胞表面人PD-1與PD-L1或PD-L2的結合活性
收集CHOK1-hPD-1細胞，用FACS緩衝液洗一遍後重新懸浮，按1E5/50ul/孔，分液到96孔U型板中。抗體稀釋後加到上述96孔板中，25ul/孔，生物素化的PD-L1(Sinobiological，貨號10084-H02H-B)(或PD-L2，Acrobiosystem，貨號PD2-H82F6)稀釋後加到上述96孔板中，25ul/孔，混勻後4℃孵育1小時。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS緩衝液洗一遍。每孔加入1：1000的SA-Alexa Fluor 488(Invitrogen cat：S32354)，100ul/孔， 混勻4℃孵育30分鐘。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS緩衝液洗一遍，30ul FACS緩衝液重新懸浮上機檢測。
圖3顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L1與CHOK1表面的人PD-1蛋白結合。圖4顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L2與CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。結果表明人源化抗體阻斷細胞表面人PD-1與PD-L1或PD-L2的結合活性較好。
1.6 候選抗體誘導的混合淋巴細胞反應
使用細胞培養基(1640+2% FBS)復蘇人樹突狀DC細胞，調整DC細胞密度至1*10^5-1*10^7cells/mL，然後加入終濃度為50μg/ml絲裂黴素C，37度避光處理30分鐘後加入10ml培養基終止，400g離心10分鐘，隨後用10mL培養基清洗一遍。梯度稀釋anti-PD-1抗體：抗體最高終濃度為2.5μg/mL(配製濃度為10μg/mL)，10倍梯度稀釋(5個濃度點+1個0濃度)，然後相應細胞培養板(康寧，貨號：3599)中加入50μL配製好的anti-PD-1抗體。收集人外周血淋巴細胞PBMC和絲裂黴素C處理好的DC細胞，調整DC細胞密度至2*10^5cells/mL，隨後將細胞加入培養板中，每孔50μL，即每孔DC細胞數為1*10^4cells/孔；調整PBMC細胞密度至2*10^6cells/mL，隨後將細胞加入培養板中，每孔100μL，即每孔PBMC細胞數為2*10^5cells/孔。將細胞培養板置於37℃、5%二氧化碳細胞培養箱孵育5天，5天後，300g離心5分鐘，收集上清用Human IL-2 ELISA試劑盒(BD，貨號：550611)檢測IL-2含量，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行，數據用GraphPad Prism軟體進行處理。
結果如圖5所示，結果表明，人源化抗體1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3都能刺激淋巴細胞分泌IL2，活性與Pembrolizumab相似。說明本申請抗原結合蛋白刺激免疫細胞分泌細胞因子的能力較好。
實施例2抗VEGF單域抗體製備與檢測
2.1 噬菌體單域抗體庫構建及淘選
採取三隻未免疫目的抗原的羊駝的血樣，每隻取150ml。從血樣中分離淋巴細胞提取總RNA，構建噬菌體展示奈米抗體文庫，庫容大小為3*109cfu。取6ml轉化的抗體文庫菌製備噬菌體用於特異性淘選，菌體總量大於庫容50倍。
將50ml Streptavidin Magnetic Beads(Thermo fisher，貨號：88817)預結合1ml噬菌體室溫孵育30min，去除非特異性結合。去除背景後的奈米抗體文庫噬菌體加入10ug Biotinylated Human VEGF165(百普賽斯，貨號：VE5-H82Q0)，150ul Streptavidin Magnetic Beads，室溫孵育15min，PBST(PBS中含有0.05% Tween-20)洗14遍，洗去不結合的噬菌體。用450ul 100mM鹽酸沖提抗原特異性結合的噬菌體，加入50ul pH11的1M Tris-HCl中和並感染處於對數生長期的大腸桿菌SS320，產生並純化噬菌體用於下一輪的篩選。篩選方法與第一輪相同，僅將抗原用量減為4ug。取兩輪篩選後富集的噬菌體用酶聯免疫(ELISA)鑑定富集情況，結果表4所示，結果表明，經過兩輪淘選後噬菌體富集明顯。
表4第二輪富集後的酶聯免疫(ELISA)鑑定
Figure 112129978-A0202-12-0038-14
2.2 酵母展示文庫構建與篩選
如圖6所示酵母細胞壁表面展示單域抗體的構建方案，以噬菌體抗體庫兩輪淘選後質粒為模板，設計引子進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增奈米抗體基因(VHH)；PCR擴增的VHH基因片段回收後與酵母展示質粒共轉入釀酒酵母菌株EBY100(購自ATCC)，藉由釀酒酵母的同源重組使VHH基因插入至酵母展示質粒中，進而實現在酵母細胞壁表面展示單域抗體。
使用流式分選儀對酵母展示文庫進行兩輪分選，將分選獲得的酵母菌塗布營養缺陷型平板培養基，挑46個單株進行測序，最終獲得5個獨一序列的單域重鏈抗體。對相應的酵母單株菌落進行流式染色分析，取1×106個細胞按表5顯示的各個方案進行染色。
表5單株酵母菌落流式染色鑑定方案
Figure 112129978-A0202-12-0038-15
方案1與human VEGF165-Bio結合細胞群的強弱由PE平均螢光信號強度(MFI)反映，同理方案2和方案3可以評估Mouse VEGF-Bio以及非特異性的結合水平，方案4競爭信號由APC平均螢光信號強度(MFI)反映。結果表6所示，排除與人VEGF、鼠VEGF不結合的株，最終獲得抗人VEGF165單域重鏈抗體的單株Y20A6。株Y20A6結合及競爭的能力均理想。
表6酵母展示文庫二輪篩選後酵母單株菌落流式染色分析結果
Figure 112129978-A0202-12-0039-44
2.3 單域抗體人源化設計與表達
對單株抗體Y20A6的序列進行IMGT/Domain Gap Align，查找與其同源性最高的人源的germline為IGHV3-23*04。抗體序列按Chothia規則編號，對單株Y20A6進行如下表7所示的突變，得到Hz20A6.2和Hz20A6.3。
表7單域抗體序列人源化設計
Figure 112129978-A0202-12-0039-45
將Y20A6與人源化後株Hz20A6.1、Hz20A6.3的重鏈可變區與IgG1 Fc N297A(SEQ ID NO：30)融合，組成抗體重鏈，形成重鏈單域抗體Ab1910VE6(對應Y20A6)、Ab1910VE8(對應Hz20A6.2)和Ab1910VE9(對應Hz20A6.3)。進行密碼子優化，基因合成後裝入表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。表達質粒擴增和質粒抽提後質粒轉入ExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根據供應商ExpiCHO表達系統方法進行抗體瞬轉表達，得到純化的抗體表達、純化數據如表8所示。
表8單域抗體表達、純化數據
Figure 112129978-A0202-12-0040-18
2.4 單域抗體與人VEGF165的結合活性測定
參考實施例1.3中的方法，測定人源化前後單域抗體與人VEGF165的親和力，結果如下表9所示，AB1910VE8、AB1910VE9與人VEGF親和力較好，選取AB1910VE8和AB1910VE9抗體做阻斷功能實驗。
表9單域抗體與人VEGF165的親和力
Figure 112129978-A0202-12-0040-47
2.5 單域抗體阻斷人VEGF165與人VEGFR2結合的活性測定
採用競爭ELISA方法測定單域抗體阻斷VEGF165和人VEGFR2的結合活性，具體為將人VEGFR2(Acro，貨號：KDR-H5227)用PBS(Gibco，貨號：10010-023)稀釋到1μg/mL，加入到96孔板中，每孔100μL，貼封板膜，置於4度孵育過夜。第二天用洗滌液PBST(0.05% TWEEN-20：sigma-alorich，P1379) 洗板3次，繼而用洗滌液配製封閉液PBST+2%BSA(BSA：VWR,0332-1KG)，每孔加入300μL封閉液，37℃封閉1小時。用封閉液配製Anti-VEGF和Biotin-hVEGF(Acro，貨號：VE5-H82Q0)，Anti-VEGF的配製起始濃度為200μg/mL，5倍梯度稀釋(7個濃度點+1個0濃度點)，Biotin-hVEGF的配製濃度為90ng/mL。繼而取出封閉好的酶標板，用洗滌液洗板3次，取50μL稀釋後的Anti-VEGF加入到96孔板中，再取50μL的Biotin-hVEGF加入到96孔板中，37℃共孵育1小時。用洗滌液洗板3次，封閉液1：5000稀釋二抗SA-HRP(sigma，S2438)，以100μL/孔加至酶標板內，37℃孵育1小時。用洗滌液洗板3次，每孔加入100μL TMB顯色液(Biopanda，貨號：TMB-S-003)，室溫避光顯色，然後每孔加入50μL終止液(Solarbio，貨號：C1058)終止反應，在450nm波長處測定吸光值。
單域抗體阻斷VEGF165和人VEGFR2的結合結果如圖7所示，結果顯示，Ab1910VE8、Ab1910VE9和Ab1910VE6均具有阻斷功能，從中選取AB1910VE9做親和力成熟。
2.6 單域抗體親和力成熟文庫構建
對Ab1910VE9序列進行親和力成熟，提高其與人VEGF的親和力。將Ab1910VE9的CDR區按Chothia定義，對其HCDR1-3、LCDR1-3位點胺基酸進行隨機突變，構建突變文庫。設計NNK突變引子進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增各CDR突變文庫基因片段。將各CDR突變文庫基因片段與酵母展示質粒分別轉入釀酒酵母菌株EBY100(購自ATCC)，使各CDR突變文庫展示於酵母表面。同時將Ab1910VE9的親本序列展示於酵母表面，作為對照使用。
文庫經過培養、誘導後，使用Biotin-Human VEGF165進行三輪分選，起始濃度3nM，10倍梯度稀釋。收集展示水平高且與抗原結合能力強的細胞群；分選後細胞塗布於SD-Trp固體培養基，30℃靜置培養3天。
挑取單株進行測序，對獲得的獨一序列的單株進行流式染色鑑定，與1nM Biotin-Human VEGF165孵育染色，比較不同株的展示平均螢光信號強度與抗原結合平均螢光信號強度的比值，反映了單個分子與抗原的結合能力。根據結合力數值，最終挑取了表達抗體Ab1910VE21(重鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO：25)，抗體表達編號與單株鑑定結果如下表10所示。Ab1910VE21的Chothia編號的CDR區胺基酸序列如下表11。
表10單株鑑定結果與抗體表達編號
Figure 112129978-A0202-12-0042-20
>1910VE21單域抗體重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：25)
Figure 112129978-A0202-12-0042-22
表11 1910VE21單域抗體CDR區序列
Figure 112129978-A0202-12-0042-21
2.7 親和力成熟單域抗體表達及SEC-HPLC純度分析
將表10中單域抗體進行表達、純化。對表達抗體進行SEC-HPLC純度分析，方法如下：
(1)將樣品稀釋至1mg/mL，混勻，12000rpm離心5min，取上清轉至樣品瓶，放入HPLC樣品盤。設置色譜條件如下：
Figure 112129978-A0202-12-0043-23
(2)色譜管柱採用流動相(200mM磷酸鹽緩衝液，pH6.8)平衡後，進樣分析，用色譜軟體進行數據分析，峰面積歸一化法計算各個峰的峰面積百分比。
親和力成熟單域抗體表達、純化數據如下表12所示。
表12親和力成熟單域抗體表達、純化數據
Figure 112129978-A0202-12-0043-24
2.8 親和力成熟單域抗體動力學參數測定
參照實施例1.3中的方法，測定人源化抗體與人VEGF165的親和力，結果如表13所示，親和力成熟後的抗體分子AB1910VE21親和力提高數倍。
表13親和力成熟抗體與人VEGF165的親和力
Figure 112129978-A0202-12-0044-48
2.9 親和力成熟VEGF抗體阻斷人VEGF165和人VEGFR2的結合功能實驗
參照實施例2.5的方法，測定親和力成熟VEGF抗體阻斷人VEGF165和人VEGFR2的結合功能實驗。
實驗結果如圖8所示，結果顯示Ab1910VE18，Ab1910VE21抗體的阻斷效果和Bevacizumab相當。
實施例3抗PD-1/VEGF雙特異性抗體Kab5、Kab6設計與檢測
3.1 雙特異性抗體設計與製備
按下表方式設計雙特異性抗體Kab5、Kab6，即在一個IgG抗體的兩條重鏈的C端連接一個奈米抗體片段。
表14雙特異性抗體Kab5，Kab6的設計
Figure 112129978-A0202-12-0044-26
Linker胺基酸序列為(SEQ ID NO：29)：ADIEGRMD
將Kab5、Kab6基因合成後裝入表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。表達質粒擴增和質粒抽提後質粒轉入ExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根據供應商ExpiCHO表達系統方法進行抗體瞬轉表達，純化抗體用於後續性質測定。
3.2 雙特異性抗體Kab5、Kab6與人VEGF165的親和力測定
參照實施例1.3中的方法，測定biotin human VEGF165(ACRO，貨號：VE5-H82Q0)和雙特異性抗體Kab5、Kab6的親和力。結果如下表15所示，Kab5和Kab6與人VEGF165親和力差異較小，略低於Bevacizumab。
表15雙特異性抗體Kab5、Kab6與人VEGF165的親和力
Figure 112129978-A0202-12-0045-27
3.3 雙特異性抗體Kab5、Kab6與人PD-1的親和力測定
參照實施例1.3中的方法，測定PD-1(Sino Biological，貨號：10377-H08H)和雙特異性抗體Kab5、Kab6的親和力。結果如下表16所示，結果顯示Kab5和Kab6與人PD-1親和力差異較小，均優於Pembrolizumab。
表16雙特異性抗體Kab5、Kab6與人PD-1的親和力
Figure 112129978-A0202-12-0045-29
3.4 雙特異性抗體Kab5、Kab6與細胞表面抗原PD-1的結合活性
參照實施例1.4中的方法，測定雙特異性抗體Kab5、Kab6與細胞表面抗原PD-1的結合活性。雙特異性抗體Kab5、Kab6與細胞表面抗原PD-1的結合結果如圖9所示。結果表明，雙特異性抗體Kab5、Kab6與細胞表面抗原PD-1的結合活性同人源化抗體41D2HzL4H3相似。
3.5 雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L1，PD-L2的結合活性
參照實施例1.5中的方法，測定雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L1，PD-L2的結合活性。雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L1的結合結果如圖10所示，雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L2的結合結果如圖11所示，結果表明，雙特異性抗體阻斷細胞表面抗原PD-1與PD-L1、PD-L2的結合活性同人源化抗體41D2HzL4H3相似。
3.6 雙特異性抗體與VEGFR2競爭結合VEGF的活性測定
競爭ELISA方法測定雙特異性抗體與VEGFR2競爭結合抗原VEGF的活性，參照實施例2.5的測定方法，測定雙功能抗體與VEGFR2競爭結合抗原VEGF的活性。雙特異性抗體與VEGFR2競爭結合抗原VEGF的活性結果如圖12所示，結果顯示Kab5和Kab6阻斷效果相當，且都優於Bevacizumab。
3.7 雙特異性抗體誘導混合淋巴細胞反應
參照實施例1.6的實驗方法，測定雙特異性抗體的誘導混合淋巴細胞分泌細胞因子IL2的反應，雙特異性抗體刺激混合淋巴細胞分泌細胞因子IL2的結果如圖13所示，結果顯示，Kab5和Kab6雙特異性抗體具有和Pembrolizumab相似的功能。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對所屬術領域中具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方式的範圍內。
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Claims (28)

  1. 一種抗原結合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，該第一靶向部分包含特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段，該第二靶向部分包含特異性結合VEGF的抗體或其抗原結合片段；
    其中，該第一靶向部分包含特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該LCDR1包含5EQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列；或者；
    其中，HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；
    其中，該第二靶向部分包含抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗原結合蛋白，其中該第一靶向部分包含抗體重鏈可變區VH和抗體輕鏈可變區VL，其中，
    (i)該VH包含選自SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；
    (ii)該VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；
    (iii)該VH包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列；或者
    (iv)該VH包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2所述的抗原結合蛋白，其中該第一靶向部分還包含抗體重鏈恆定區，該抗體重鏈恆定區源自IgG恆定區，例如包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該第一靶向部分還包含抗體輕鏈恆定區，例如包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該第二靶向部分包含抗體重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該第二靶向部分包含抗體重鏈恆定區，該抗體重鏈恆定區源自IgG恆定區，例如包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的抗原結合蛋白，其中抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含雙特異性抗體，例如該抗原結合蛋白包含IgG-VHH類型雙特異性抗體，例如是雙特異性抗體Kab5、Kab6。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該第一靶向部分包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該第二靶向部分位於該第一靶向部分的抗體重鏈的C端，其中，該第二靶向部分與該第一靶向部分直接連接或藉由連接子間接連接。
  11. 如請求項10所述的抗原結合蛋白，其中該連接子包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含該第一靶向部分的抗體重鏈或其抗原結合片段、視需要存在或不存在的連接子以及該第二靶向部分的抗體或其抗原結合片段，且該第二多肽鏈包含該第一靶向部分的抗體輕鏈或其抗原結合片段。
  13. 如請求項12所述的抗原結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含：該第一靶向部分的重鏈可變區-第一靶向部分的重鏈恆定區-X-該第二靶向部分的可變區-該第二靶向部分的恆定區，以及該第二多肽鏈包含：該第一靶向部分的輕鏈可變區-第一靶向部分的輕鏈恆定區，其中該X為不存在或者包含該連接子。
  14. 如請求項12或13所述的抗原結合蛋白，其中該第一多肽鏈自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗體重鏈或其抗原結合片段和該第二靶向部分的抗體或其抗原結合片段，或者，該第一多肽鏈自N端至C端依次包含第 一靶向部分的抗體重鏈或其抗原結合片段，連接子和該第二靶向部分的抗體或其抗原結合片段。
  15. 一種核酸，其編碼如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白。
  16. 一種載體，其包含如請求項15所述的核酸。
  17. 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白。
  18. 一種細胞，其包含如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項15所述的核酸、如請求項16所述的載體、和/或如請求項17所述的免疫綴合物。
  19. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項15所述的核酸、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的免疫綴合物、和/或如請求項18所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
  20. 一種試劑盒，其包含如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項15所述的核酸、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的免疫綴合物、如請求項18所述的細胞、和/或如請求項19所述的醫藥組成物。
  21. 一種製備如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白的方法，其包括在使得該抗原結合蛋白能夠表達的條件下培養如請求項18所述的細胞。
  22. 一種如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項15所述的核酸、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的免疫綴合物、 如請求項18所述的細胞、如請求項19所述的醫藥組成物、和/或如請求項20所述的試劑盒在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療腫瘤。
  23. 如請求項22所述的用途，其中該腫瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表達的腫瘤。
  24. 如請求項22或23所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
  25. 如請求項22至24中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
  26. 一種抑制PD-1蛋白與PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白結合、和/或抑制VEGF蛋白與VEGFR蛋白結合的方法，該方法包含施用如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項15所述的核酸、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的免疫綴合物、如請求項18所述的細胞、如請求項19所述的醫藥組成物、和/或如請求項20所述的試劑盒。
  27. 一種調控免疫反應的方法，該方法包含施用如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項15所述的核酸、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的免疫綴合物、如請求項18所述的細胞、如請求項19所述的醫藥組成物、和/或如請求項20所述的試劑盒。
  28. 如請求項27所述的方法，其中該調控免疫反應包含刺激免疫細胞分泌細胞因子。
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