JP2018502060A - 抗cd147抗体、方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、当該配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ASCIIのコピーは、2015年11月5日に作成され、ファイル名はPRD3361WOPCT_SL.txtであり、そのサイズは72,842バイトである。
本明細書の主題は、一般的にはCD47に結合する抗体に関する。本明細書に述べられる抗CD47抗体は、白血病などの血液学的疾患の治療薬として有用である。
・ヒトCD47及びカニクイザルCD47に特異的に結合すること、
・CD47とSIRPαとの相互作用を遮断すること、
・顕著なヒト血小板凝集活性を有さないこと、
・顕著な赤血球凝集活性を有さないこと、
・マクロファージによる腫瘍細胞の貪食作用を促進することが可能であること、
・ヒトの癌のマウスモデルにおいて強い抗腫瘍活性を示すこと、が挙げられる。
当業者であれば、本明細書における開示には具体的に記載されるもの以外の変更及び改変を行うことが可能である点は認識されるであろう。本開示は、すべてのそのような変更及び改変を包含するものとして理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において言及されるか又は示される工程、要素、組成物、及び化合物のすべてを個別に又は包括的に含み、また、前記工程又は要素のすべての組み合わせ又は任意の2つ以上も含むものである。
別途定義されないかぎり、本開示に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。
本明細書に述べられるモノクローナル抗体は、CD47に結合し、SIRPαとCD47との結合を阻害し、CD47−SIRPαにより媒介されるシグナル伝達を低減させ、貪食作用を促進し、腫瘍の増殖及び/又は移動を阻害する能力を有するものである。阻害作用は、例えば本明細書の実施例で述べる細胞アッセイを用いて判定される。
本明細書に述べられる抗体は、CD47によって、かつ/又はCD47/SIRPαによって媒介されるシグナル伝達を、調節、遮断、阻害、低下、拮抗、中和するか、又は他の形でこれを妨げる能力について評価を行うことができる。例えば、かかる評価法は、1つ以上の本明細書に述べられる抗体の存在下で、CD47によって、かつ/又はCD47/SIRPαによって媒介されるシグナル伝達を測定することを含みうる。これらのアッセイは、競合的結合アッセイを含むものでもよく、又は例えば、実施例7に述べられるように、マクロファージによるCD47発現細胞の貪食作用を促進する能力などの生物学的測定値を測定するものでもよい。
本明細書に述べられる抗体は、完全なヒト抗体又はヒト化抗体を含む。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫反応を生じることなくヒトに投与するのに適している。
例えば異常なCD47シグナル伝達にともなう疾患及び障害の治療における抗体の有効性を高めるために、本明細書に述べられる抗体をエフェクター機能に関して改変することが望ましい場合がある。例えば、CD47は遍在的に発現されるため、突然変異を抗体のFc領域に導入することによってエフェクター機能を喪失させ、これにより正常な細胞傷害の確率を低下させることができる。
記載される実施形態に基づく治療薬は、適当な担体、賦形剤、及び改善された移動性、送達性、忍容性などを与えるために製剤に添加される他の物質とともに投与される点は認識されよう。すべての製薬化学者にとって周知の処方集である「レミントン製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(15th ed,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1975)(特にその中のBlaug、SeymourによるChapter 87))に多くの適当な製剤を見出すことができる。これらの製剤としては例えば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー剤、ワックス、オイル、脂質、脂質(カチオン性又はアニオン性)含有小胞(Lipofectin(商標)など)、DNA接合体、無水吸収性ペースト、水中油型及び油中水型エマルション、エマルションカーボワックス(異なる分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。製剤中の有効成分が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路において生理学的に適合性及び忍容性を示すものであるかぎり、上記の混合物のいずれも本開示に基づく治療及び療法における使用に適切となりうる。
本明細書に述べられる抗体、並びにその誘導体、フラグメント、アナログ及びホモログは、投与に適した医薬組成物中に含有させることができる。かかる組成物を調製するうえで関係する原理及び考慮事項、並びに成分の選択におけるガイダンスは当該技術分野では周知のものであり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences:The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro,et al.,editors)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995;Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994;及びPeptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,Vol.4),1991,M.Dekker,New Yorkを参照されたい。
本開示は、調節物質、すなわちSIRPαに対するCD47の結合を調節するか又は他の形で妨げる候補又は試験化合物若しくは物質(例えばペプチド、ペプチド模倣体、小分子、又は他の薬剤)、又はCD47及び/若しくはCD47−SIRPαのシグナル伝達機能を調節するか又は他の形で妨げる候補又は試験化合物若しくは物質を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)を提供する。異常なCD47及び/又はCD47−SIRPαの発現、活性及び/又はシグナル伝達にともなう疾患を治療するうえで有用な化合物を同定する方法も提供される。スクリーニング方法には、当該技術分野で知られているか若しくは用いられているもの、又は本明細書に述べられるものが含まれる。例えば、CD47をマイクロタイタープレート上に固定化し、候補又は試験化合物(例えばCD47抗体)とSIRPαの存在下でインキュベートすることができる。この後、結合したSIRPαを二次抗体を使用して検出し、吸光度をプレートリーダーで検出することができる。
本明細書に述べられる抗体は、診断用及び予防用製剤に使用することができる。一実施形態では、記載される抗体の1つ以上のものを、例えばこれらに限定されないが癌又は他の腫瘍状態のような上記に述べた疾患の1つ以上を発症するリスクを有する対象に投与することができる。上記に述べた癌又は他の腫瘍状態の1つ以上のものに対する対象の臓器の疾病素質を、遺伝子型的、血清学的、又は生化学的マーカーを用いて判定することができる。
Balb/c系マウスを、ヒトCD47−Fc Chimera組換え体(R&D systems社)により免疫し、フロイントアジュバント(Sigma社)、InterFAD(マウスインターフェロンα、PBL InterferonSource社)、又は2−dose adjuvant(Creative Diagnostics社)を用い、標準的な免疫化のプロトコールを用いて抗CD47抗体の産生を開始した。CD47抗体を発現するハイブリドーマを作製するため、免疫したマウスから脾臓を収穫し、SP20−Bcl2ミエローマ細胞と融合させるためにB細胞を単離した。4つの融合体(C47Y1、C47Y2、C47Y3、及びC47Y4)からのハイブリドーマクローンを、CD47に対する抗体結合についてELISAによりアッセイした(Fc−Tagに対しては行わなかった)。CD47に対して特異的結合を示したハイブリドーマ上清を、meso scale discovery(MSD)に基づいたアッセイによって、CD47を発現したJurkat細胞(TIB−152、ATCC)に対する結合について、また、Jurkat細胞に対するSIRPαの結合の遮断について更にスクリーニングした。
CD47試薬及び方法:C末端に6×HISタグ(配列番号55)を付加した組換えヒトCD47細胞外ドメイン(ECD)タンパク質(配列番号22)を、ファージパンニング用に自社で作製した。ヒトCD47のcDNAクローンをOrigene社より入手し、ECD領域をPCRにより増幅して哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。HEK293F細胞の一過性トランスフェクションの後、分泌されたHisタグを付加したヒトCD47−ECDタンパク質を、HisTrapカラム(GE Healthcare社)を用いた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって精製した。ピーク画分をプールし、濃縮した後、26/60 Superdex 200カラム(GE Healthcare)上でクロマトグラフにかけて最終的な磨き工程を行って、CD47−ECDタンパク質のモノマー型及びダイマー型を得た。CD47−ECDタンパク質を、ファージパンニング実験用に10倍のモル過剰量のsulfo−NHS−LC−ビオチン(Pierce社)でビオチン化した。
全体で23種類の作製されたCD47抗体(ハイブリドーマ法による20種類、及びファージディスプレイ法による3種類)の、CD47に結合する能力及びCD47の特定の生物活性を阻害する能力を、下記に述べるような異なるインビトロアッセイを用いて分析した。
C47B116のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号30)の初期の分析は、最も近いマウス生殖系列遺伝子はHVではIGHV1S29*02であり、HJではIGHJ4*01であることを示唆している。C47B116のVLドメインのアミノ酸配列(配列番号54)の初期の分析は、最も近いマウス生殖系列遺伝子はIGKV117*01及びIGKJ2*01であることを示唆している。ヒトにおける免疫原性を低下させるためのC47B116のヒトフレームワーク適合(HFA)を行うため、C47B116のVL及びVH配列のマウスフレームワークを、CDRはそのままに維持しつつヒトのフレームワークで置換するために、自社のデノボライブラリーを用いた配列相同性分析及び将来的なアフィニティー成熟の考慮に基づいて4つのヒトVH(IGHV1−3、IGHV1−46、IGHV1−69、及びIGHV5−51)及び3つのヒトVL(IGKV2−28、IGKV3−1、及びIGKV4−1)の変異体鎖を設計した。各VH(配列番号4、5、31、及び32)及びVL(配列番号7、33、及び34)鎖のコンストラクトは遺伝子アセンブリーにより作製し、ヒトIgG2σ発現用のベクターにクローニングした。VH及びVL変異体の組み合わせをHEK 293Expi発現システムに同時トランスフェクトし、得られた12HFA変異体をプロテインAクロマトグラフィーによって培養上清から精製した。精製したC47B116 HFA変異体は、上記に述べたようにしてSIRPα遮断、ヒト及びカニクイザルCD47に対する結合アフィニティー、並びに赤血球凝集について再び特性評価を行った。赤血球凝集アッセイでは、2倍の連続希釈液を調製した出発濃度は、試験した大部分のmAbについて200μg/mlとした。抗体のストック濃度があまり濃縮されていない場合には、連続希釈の出発濃度を125μg/ml(C47B160)、170μg/ml487B156)、及び195μg/ml(C47B159)で調製した。すべての変異体が、強いSIRPα遮断活性を示した(図5)。C47B148、C47B151、C47B152、C47B156、及びC47B160は赤血球凝集を誘発し、フレームワークがこの活性に寄与している可能性を示唆している。反応速度論的結合実験で調べるために選択したC47B116HFA変異体は、ヒトCD47とカニクイザルCD47に同様のアフィニティーを示した。いくつかのHFA変異体(C47B155、C47B157、C47B159及びC47B161)は、CD47に対する高い結合アフィニティー(親mAbであるC47B116の5倍以内)を維持したのに対して、他のもの(C47B147、C47B149、C47B151及びC47B153)は、より顕著なアフィニティーの喪失を示した(C47B116と比較して6倍以上の低下)。これらのデータを表6にまとめる。C47B157及びC47B161は、強いSIRPα遮断活性、ヒト及びカニクイザルCD47の両方に対する高い結合アフィニティーを維持したが、赤血球凝集活性も生物物理学的特性上の懸念材料も示さなかったことから、更なる特性評価を行うために選択した。
C47B91の重鎖(配列番号35)は5−51生殖系列に由来し、軽鎖(配列番号36)はL6生殖系列に由来するものである。C47B91のアフィニティー成熟を行うために2つのFabライブラリーを設計した。Fabライブラリーの一方は重鎖ライブラリー(C47F8L1)であり、デノボのV5.0からC47B91のVHのCDR1及びCDR2に多様性を付加したものであり(表7)、他方のFabライブラリーは軽鎖ライブラリー(C47F18L1)であり、デノボのV5.0からC47B91のVL生殖系列(L6)に基づいてVLの多様性を付加したものである(表8)。これらのFabライブラリーは、米国特許第6,472,147号及び国際公開第09/085462号に記載されるようにして、クローニングの目的で制限酵素部位に若干の変更を行って、pIXファージディスプレイシステムで構築した。
抗体C47B161、C47B167、C47B222、C47B227及びB6H12.2の詳細なエピトープ及びパラトープを、それらの対応するFabとCD47 ECD−C15G突然変異体[(配列番号49)、以下、単にCD47と呼ぶ]との共結晶化及びX線結晶解析による構造決定によって決定した。C47B167は、実施例4でC47B116について述べたのと同様のアプローチを用いてエピトープビン3のC47B131のヒトフレームワーク適合から誘導した。この抗体は、SIRPα結合を遮断し(EC50=0.79μg/ml)、中度のアフィニティー(kD=5.2nM)でヒトCD47に結合し、赤血球凝集を誘発しない。
各CD47分子の構造モデルは、IgVドメインに相当する1〜少なくとも114番目までの残基を有し、位置5、16、32、55、及び93にグリカンを有している(確認できるグリカンのないC47B161/Fab複合体のCD47を除く)。CD47のC末端6xHis(配列番号55)は無秩序となっている。各Fabの構造モデルは、軽鎖の1〜少なくとも211番目までの残基と重鎖の1〜少なくとも217番目までの残基を含んでいる。FabのC末端6xHisタグ(配列番号55)及び鎖間ジスルフィド結合は無秩序となっている。C47B222/C47B227の重鎖の場合、残基135〜140も無秩序となっている。抗体/抗原結合部位は5つの複合体すべてにおいて電子密度により明確に示されており、これにより結合残基の位置を高い信頼性で決定することができる。各Fabはすべての図で順番に番号付けされており、CD47の番号付けは成熟タンパク質のN末端から始まっている。
C47B161、C47B167、及びC47B222/C47B227/B6H12.2は、抗体競合ビンニングアッセイにより明らかとされたように3つの異なるエピトープビンに結合する。C47B222及びC47B227が同じ全体的位置に結合するのに対して、C47B167は細胞膜のより近くに結合し、C47B161及びB6H12.2は、CD47のより先端に近い領域に結合する。膜により近いエピトープへの結合によって、抗体の第2のFabアームに伝播しうるFabへの更なる束縛が生じ、別のCD47分子に対するこのアームの結合をより困難としうる。本発明者らは、エピトープの位置による第2のFabアームへの束縛によって、CD47/抗体/CD47の架橋による細胞凝集が少なくなるものと考える。C47B222のFabの場合、HCはLCよりも広い範囲でCD47と接触しており、膜により近い鎖である。
図7に見られるように、C47B161は、CD47のN末端(Q1及びL3)、BC(N27及びE29)及びFG(残基101−103)のループ領域、並びにF(残基E97)及びG(E104)のβ鎖の残基で構成される構造エピトープを認識する。M259は、エピトープビン2領域に結合してCD47の約690Å2の範囲を覆っている。
C47B167は、図8に示されるようなC(Y37及びK39)、C’(R45、D46及びT49)及びC”(N55〜T58)のβ鎖、並びにC‘C”(A53、L54)及びC”E(V59〜T61、S64、A66、K67)のループ領域の残基からなる構造エピトープを認識する。C47B167は、エピトープビン3領域に結合してCD47の約930Å2の範囲を覆っている。
C47B222は、図10に示されるように、C(Y37及びK39)、C’(D46、T49、D51)、C”(K56、T58)及びF(T99)のβ鎖、並びにBC(E35)、C’C”(A53及びL54)、C”E(V59)及びFG(L101、T102)ループ領域の残基からなる構造エピトープを認識する。C47B222のエピトープはビン1領域に位置し、約730Å2のCD47の範囲を覆っている。C47B222は、C47B161、C47B167、C47B227及びB6H12.2とCD47への結合について競合する。他のエピトープと重複するC47B222エピトープの領域が図6に示されている。
B6H12.2は、エピトープビン1領域に結合し、コントロール抗体として使用された。B6H12.2は、図10に示されるように、C(V36、Y37、K39及びK41)、C’(D46、D51)、F(E97、T99)及びG(E104)のβ鎖、並びにBC(E29、Q31、N32、T34及びE35)、C’C”(A53)及びFG(E100〜R103)ループ領域の残基からなる構造エピトープを認識する。やはりビン1にクラスター化しているC47B222及びC47B227と異なり、B6H12.2は、C”β鎖及びC”Dループ領域のいずれの残基も認識しない。それにも関わらず、B6H12.2は、C47B161、C47B167、C47B222及びC47B227よりも大きなエピトープ範囲を有している(C47B161の690Å2、C47B167の930Å2、C47B222の730Å2、及びC47B227の800Å2に対して約1055Å2)。
C47B161と異なり、B6H12.2はCD47のN末端領域を認識しない。C47B167、C47B222、及びC47B227と異なり、B6H12.2は、CD47のC”β鎖又はC”Dループ領域のいずれの残基も認識しない(図6を参照)。詳細には、B6H12.2で同定されたエピトープと一致しない各Fabのエピトープ残基は、
C47B161:N末端(Q1及びL3)及びBCループ(N27)領域内の残基、
C47B167:β鎖C’(R45及びT49)、C’C’’ループ(L54)、β鎖C’’(K56、S57、及びT58)及びC’’Dループ(V59、P60、T61、S64及びK67)領域内の残基、
C47B222:β鎖C’(T49)、C’C’’ループ(L54)、β鎖C’’(K56及びT58)及びC’’Dループ(V59)領域内の残基、
C47B227:C’C’’ループ(L54)及びβ鎖C’’(K56及びT58)領域内の残基である。
バイオアッセイで更なる評価を行うため、所望の特性を有するいくつかのヒトCD47 IgG2σ抗体をIgG1 Fcフォーマットに変換した。それらのIgG1変異体は、ヒトCD47に結合してSIRPα結合を遮断することが確認された。赤血球凝集を誘発しなかったIgG1/IgG2σ Fc変異体(C47B222、C47B157、及びC47B161)を、貪食作用の促進、アポトーシス、補体媒介性細胞傷害性(CDC)、及び血小板凝集活性について更にインビトロで評価した。更に、これら3つのmAbの抗腫瘍活性をインビボで試験した。
C47B157、C47B161、及びC47B222がヒトマクロファージによるCD47発現標的細胞の貪食作用を促進するか否かを評価するためにインビトロ貪食作用アッセイを行った。簡単に述べると、CD14陽性単球を、Stemcell EasySephuman monocyte enrichment kit without CD16 depletionを使用して、ネガティブディプリーションによりleukopakから精製したPBMCから単離した。精製した単球を、10%FBS(Invitrogen社)及び25ng/ml M−CSF(R&D Systems社)を添加したX−VIVO−10培地(Lonza社)に0.1x106細胞/cm2で播種し、7日間マクロファージに分化させた。IFN−γ (R&D Systems社)を分化の最後の24時間中に50ng/mlで加えた。この後、付着したマクロファージをAccutase(Sigma社)処理により組織培養皿から剥離させ、このマクロファージ(1×105)を、96ウェルU字底プレートに異なる濃度の抗CD47mAbの存在下でGFP発現Jurkat細胞(1×105)と1:1の比で播種した。細胞を37℃で90分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、細胞をPBSで1回洗い、Accutase処理により剥離した(20分間のインキュベーション)。細胞をペレット化して洗い、APC結合抗ヒトCD11b抗体(eBiosciences社)でマクロファージを30分間染色した後、Stain Buffer(BD Biosciences社)で2回洗った。細胞をMacsQuantフローサイトメーター上に取った。FloJoソフトウェアによりデータを分析した。貪食作用率(%)を以下の式によって求めた。すなわち、[((GFP陽性,Cd11b陽性細胞)/(GFP陽性,CD11b陽性+GFP陽性細胞))×100%]。
いくつかの抗CD47mAb(例えばAD−22、1F7及びMABL−1)が、CD47がライゲーションされる際に可溶形態の標的細胞のアポトーシスを媒介することが述べられている。C47B157、C47B161及びC47B222が、CD47がライゲーションされる際にアポトーシスを媒介するか否かを試験するため、Jurkat細胞又はHL60細胞(100 μl中、1×106細胞/ml)を、10%FBSを添加したRPMT1640培地中、抗体(0.05、0.5、及び5μg/ml)の存在下又は非存在下で、37℃で24時間インキュベートした。アポトーシスは、FITC Annexin−V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen社)により検出した。アポトーシスは、初期アポトーシス(アネキシンV陽性/PI陰性)と後期アポトーシス(アネキシンV陽性/ PI陰性)との合計として表した。
補体媒介性細胞傷害性(CDC)についてC47B157、C47B161、及びC47B222を試験した。Wil2−S標的細胞を用いてCDCアッセイを行った。50,000個のWil2−S細胞を、不透明な白色96ウェルプレート中、10%熱不活化FBS及び0.1mM NEAAを添加した25μlのRPMI−1640培地に播種した(試薬はすべてInvitrogen社より入手)。抗体を添加した、又は添加しない25μlの培地を加えた後、細胞を37℃で30分間インキュベートした。この後、50μlのヒト血清(Bioreclamation社、補体が保存されたもの)を加え、細胞を37℃で2時間インキュベートした。最大溶解度を評価するため、20μlの2%Triton−X−100をコントロールウェルに加え、細胞を37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、100μlのCellTiter−Glo Reagent(Promega社、バッファーと基質のプレミクスチャ)を各ウェルに加え、内容物を静かに混合して細胞溶解を誘発し、発光を2104 EnVision Multilabelリーダー(Perkin Elmer社)で記録した。比溶解度を以下の式により計算した。すなわち、[比溶解度=((実験放出量−自然放出量)/(最大放出量−自然放出量))*100]。
市販の抗CD47mAb B6H12(mIgG1)が、血小板凝集を誘発したという観察(Fujimoto TT,Katsutani S,Shimomura T,Fujimura K.(2003)J Biol Chem 278:26655〜26665)に基づき、C47B157、C47B161、及びC47B222の血小板凝集活性を測定するためのアッセイを確立した。簡単に述べると、健康なドナー志願者から血液をバキュテナー血液採取管(BD Biosciences社)に採取し、クエン酸ナトリウムで緩衝した。多血小板血漿(PRP)及び乏血小板血漿(PPP)を、製造者のプロトコールに従ってPDQ血小板機能遠心分離機(Biodata Corporation社)を使用して調製した。血小板凝集を、製造者により推奨されるようにPAP−8E血小板凝集計(Biodata Corporation社)を使用して測定した。詳細には、25μlのADP (ポジティブコントロール、Biodata Corporation社)又は抗体を、225μlのPRPに最終濃度10μMのADP、又は100、140、150、若しくは200μg/mlの試験抗体となるように(試験した抗体の入手しやすさに応じて)加えた。継続的な攪拌下、37℃で250μlの試料を透過する光の透過率を測定することによって凝集度を測定した。PPPの透過率を100%とした。凝集度を全体で6分間にわたって記録した。
C47B157、C47B161、及びC47B222のインビボ抗腫瘍活性を3つのヒト腫瘍細胞モデルで試験した。簡単に述べると、最初の2つのモデルでは、10×106個のHL−60細胞又は5×106個のMV4−11細胞をNSGマウスに静脈内移植した。これらのモデルの両方で、腫瘍細胞の移植後6日目に抗体による治療を開始し、0.2及び10mg/kgを腹腔内注射によって週2回、動物に投与した。合計で6回の用量を投与し(最終投与は23日目)、各用量群は5匹のマウスで構成した。HL−60/NSGマウスモデルでは、14日目から始めて末梢血をマウスから週1回採取し、FACSにより分析して腫瘍細胞のアウトグロース(outgrowth)及び治療効果を評価した(最終の採取は42日目)。MV4−11/NSGモデルでは、34日目に末梢血をマウスから採取し、FACSにより分析して末梢血中の腫瘍細胞のアウトグロースに対する治療の効果を評価した。第3のインビボモデルでは、10×106個のKasumi−3細胞をNSGマウスに静脈内移植し、腫瘍細胞の移植後6日目に治療を開始した。腹腔内注射により0.2及び10mg/kgで週2回、合計で12回の用量を動物に投与した。最終の用量は44日目に投与し、各用量群は5匹のマウスで構成した。14日目から始めて末梢血をマウスから週1回採取し、FACSにより分析して末梢血中の腫瘍細胞のアウトグロースを評価した。
上記の実施例で述べたように、恐らくはマクロファージのSIRPα受容体に対する標的細胞のCD47の結合を遮断し、その結果として、結合が遮断されなければ標的細胞がマクロファージに送るであろう「私を食べないで(eat-me-not)」シグナルを遮断することにより、細胞貪食作用を促進することができる抗体が作製された。図21のCD47/Fab構造とCD47/SIRPα構造との重ね合わせは、すべてのFvドメインとSIRPαのD1ドメインとがぶつかる領域を示しており、抗体とSIRPαが両方とも同時にCD47に結合することを不可能としている。
Claims (25)
- 以下の性質:
a.CD47に特異的に結合すること、
b.CD47がシグナル調節タンパク質α(SIRPα)と相互作用することを妨げること、
c.顕著な血小板凝集活性を有さないこと、
を有する、単離抗体。 - 前記抗体が、以下のCD47(シグナル配列を除く配列番号21)のアミノ酸残基:
a.Q1、L3、N27、E29、E97、L101、T102、R103、及びE104;
b.Y37、K39、R45、D46、T49、A53、L54、N55、K56、S57、T58、V59、P60、T61、S64、A66、及びK67;
c.E35、K39、Y37、D46、49、D51、A53、L54、K56、T58、V59、T99、L101、及びT102;又は
d.E29、Q31、N32、T34、E35、V36、Y37、K39、N41、D46、D51、A53、E97、T99、E100、L101、T102、R103、及びE104
と相互作用することによってCD47に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。 - ヒト又はカニクイザルCD47に特異的に結合し、配列番号4〜6からなる群から選択される重鎖可変領域(VH)を有する、単離抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号7及び8からなる群から選択される軽鎖可変領域(VL)を有する、請求項3に記載の抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号4〜6からなる群から選択されるVH領域と、配列番号7及び8からなる群から選択されるVL領域とを有する、請求項3に記載の抗体。
- 前記VH鎖領域が、配列番号4又は配列番号5を有し、配列番号7を有するVL鎖領域と組み合わされた、請求項5に記載の抗体。
- 前記VH鎖領域が、配列番号6を有し、配列番号8を有するVL鎖領域と組み合わされた、請求項5に記載の抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号9又は配列番号10に記載のVH相補性決定領域1(CDR1)配列、配列番号11又は配列番号12に記載のVH CDR2配列、配列番号13又は配列番号14に記載のVH CDR3配列、配列番号15又は配列番号16に記載のVL CDR1配列、配列番号17又は配列番号18に記載のVL CDR2配列、及び配列番号19又は配列番号20に記載のVL CDR3配列を有する、請求項3に記載の抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号9に記載のVH CDR1配列、配列番号11に記載のVH CDR2配列、配列番号13に記載のVH CDR3配列、配列番号15に記載のVL CDR1配列、配列番号17に記載のVL CDR2配列、及び配列番号19に記載のVL CDR3配列を有する、請求項8に記載の抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号10に記載のVH CDR1配列、配列番号12に記載のVH CDR2配列、配列番号14に記載のVH CDR3配列、配列番号16に記載のVL CDR1、配列番号18に記載のVL CDR2配列、及び配列番号20に記載のVL CDR3配列を有する、請求項8に記載の抗体。
- 前記抗体の前記VH鎖が、前記抗体の前記VL鎖よりもCD47とより広範囲の接触を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体の前記VH鎖が結合するエピトープは、CD47発現細胞の膜の近くに位置し、前記抗体の前記VL鎖がCD47上のSIRPα結合部位を塞ぐ、請求項2〜10のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、顕著な赤血球凝集活性を有さない、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体の血小板凝集活性が、前記抗体の非存在下で観察される血小板凝集度よりも10%以下だけより高い、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記CD47が、ヒトCD47又はカニクイザルCD47である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、CD47発現細胞のマクロファージ媒介貪食作用を促進する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、IgG1アイソタイプ及びIgG2アイソタイプからなる群から選択されるIgGアイソタイプを有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- 癌又は他の腫瘍状態の症状を緩和する方法であって、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体を、該抗体の投与を必要とする対象に、前記対象の前記癌又は他の腫瘍状態の症状を緩和するのに充分な量で投与することを含む、方法。
- 前記対象がヒトである、請求項20に記載の方法。
- 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、CD47がSIRPαと相互作用することを妨げる、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、IgG1アイソタイプ及びIgG2アイソタイプからなる群から選択されるIgGアイソタイプを有する、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 化学療法を投与することを更に含む、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
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