CN105164159A - 新的抗体缀合物及其用途 - Google Patents

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CN105164159A CN201480018139.7A CN201480018139A CN105164159A CN 105164159 A CN105164159 A CN 105164159A CN 201480018139 A CN201480018139 A CN 201480018139A CN 105164159 A CN105164159 A CN 105164159A
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Abstract

本发明提供新的抗体药物缀合物(ADC)及使用所述ADC治疗增生性病症的方法。

Description

新的抗体缀合物及其用途
【交叉引用申请】
本申请主张2013年2月22日申请的美国临时申请第61/768368号的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。
【序列表】
本申请含有经EFS-Web以ASCII格式提交且在此以全文引用的方式并入本文中的序列表。该ASCII复本(2014年2月15日建立)的名称为S69697_1110WO_ST25.txt且尺寸为582KB(596,345位字节)。
【技术领域】
本申请总体上是关于新颖化合物，其包含缀合于吡咯并苯并二氮(PBD)的抗DLL3抗体或其免疫反应性片段，及该等化合物用于治疗或预防癌症及癌症的任何复发或转移的用途。
【背景技术】
干细胞及祖细胞的分化及增殖为正常的进行性过程，其共同起作用以支援器官发生期间的组织生长、细胞修复及细胞置换。紧密地调节系统以确保基于生物的需要而仅产生适当的信号。细胞增殖及分化通常仅视需要发生以用于置换受损或将死的细胞或用于生长。然而，可由多种因素引起该等过程的破坏，包括各种信号传导化学物的不足或过量、存在微环境改变、遗传突变或其组合。正常细胞增殖及/或分化的破坏可引起各种病症，包括增生性疾病，诸如癌症。
癌症的常规治疗包括化学疗法、放射疗法及免疫疗法。通常该等治疗不起作用且外科切除可能无法提供可行的临床替代手段。现有护理标准的局限性在患者经历第一线治疗且接着复发的情况下尤其明显。在该等情况下，频繁地出现顽抗性肿瘤，其通常为侵袭性及不可治愈的。至少部分地归因于现有疗法在防止复发、肿瘤再发生及转移方面的不足，许多实体肿瘤的整体存活率近年来仍然基本无变化。现有治疗的治疗局限性使开发可有效靶向致瘤细胞且在可管理的附带损害下消除致瘤细胞的新颖试剂的需要变得显著。
一种开发该等试剂及相关治疗的有前景的领域包含使用抗体的靶向疗法。在此方面，已公认将抗体疗法用于癌症、免疫学及血管生成病症的患者的靶向治疗(Carter,P.(2006)NatureReviewsImmunology6:343-357)。更具体而言，已证实使用包含细胞结合剂靶向组分及药物有效负载组分的抗体药物缀合物(亦即ADC或免疫缀合物)进行细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的局部递送可促进肿瘤细胞内药物的细胞内积聚。该局部化可使肿瘤内药物的浓度相对较高，而实现相同肿瘤浓度的未结合(亦即非靶向)的药物的全身施用可引起正常细胞不可接受的毒性程度(Xie等人(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtun等人(2006)CancerRes.66(6):3214-3121；Law等人(2006)CancerRes.66(4):2328-2337；Wu等人(2005)NatureBiotech.23(9):1137-1145；LambertJ.(2005)CurrentOpin.inPharmacol.5:543-549；HamannP.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents15(9):1087-1103；Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212；Trail等人(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Syrigos及Epenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614)。
由临床观点出发，该等抗体药物缀合物可因此提供增强的功效及毒性的相应降低。设计及改进ADC的努力集中于单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物作用机制、结合技术及连接子、药物/抗体比率(负载)及药物释放性质(Junutula等人,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249；McDonagh(2006)ProteinEng.Design&Sel.19(7):299-307；Doronina等人(2006)Bioconj.Chem.17:114-124；Erickson等人(2006)CancerRes.66(8):1-8；Sanderson等人(2005)Clin.CancerRes.11:843-852；Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358；Hamblett等人(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070)。关于抗体选择性及肿瘤定位，已证实多种已知肿瘤标记出于多种原因(包括低表达、缺乏内化作用、脱落等)而为无效的ADC目标。过去，亦证实合适ADC药物成分的选择存在问题。已提议将多种试剂用于ADC，包括通过包括微管蛋白结合、DNA结合、蛋白酶体及/或拓扑异构酶抑制的机制来提供细胞毒性及细胞生长抑制作用的药物部分。尽管一些试剂获得成功，但某些细胞毒性药物在与大型抗体或蛋白质受体配体结合时倾向于为惰性或活性不足。因此，选择适当的靶向或细胞结合剂及有效药物有效负载作为ADC成分对于提供呈现所需临床概况的化合物而言是重要的。
一种有希望作为潜在ADC有效负载的化合物为吡咯并苯并二氮(PBD)。在此方面，PBD具有识别及结合于DNA的特测序列(包括优选序列PuGPu)的能力。第一种PBD抗肿瘤抗生素，蒽霉素(anthramycin)，发现于1965年(Leimgruber等人,J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)；Leimgruber等人,J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793(1965))。自那时起，已报道了许多天然存在的PBD，且针对多种类似物已开发了10种以上的合成路径(Thurston等人,Chem.Rev.1994,433-465(1994)；Antonow,D.及Thurston,D.E.,Chem.Rev.2011111(4),2815-2864)。家族成员包括赤霉素(abbeymycin)(Hochlowski等人,J.Antibiotics,40,145-148(1987))、奇卡霉素(chicamycin)(Konishi等人,J.Antibiotics,37,200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180487；Thurston等人,Chem.Brit.,26,767-772(1990)；Bose等人,Tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(mazethramycin)(Kuminoto等人,J.Antibiotics,33,665-667(1980))、新丝拉霉素A(neothramycinA)及新丝拉霉素B(Takeuchi等人,J.Antibiotics,29,93-96(1976))、泊罗霉素(porothramycin)(Tsunakawa等人,J.Antibiotics,41,1366-1373(1988))、普斯卡星(prothracarcin)(Shimizu等人,J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)；Langley及Thurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara等人,J.Antibiotics,41,702-704(1988)；Itoh等人,J.Antibiotics,41,1281-1284(1988))、西伯利亚霉素(sibiromycin)(Leber等人,J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988))及托马霉素(tomamycin)(Arima等人,J.Antibiotics,25,437-444(1972))。
PBD具有通式结构：
其差别在于在其芳族A环和吡咯并C环两者中取代基的数目、类型及位置，以及在于C环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置处，存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲醚(NH-CH(OMe))，其为负责烷基化DNA的亲电子中心。所有已知的天然产物均在手性C11a位置具有(S)构型，当自C环朝向A环看时，所述构型为其提供了右手扭转(right-handedtwist)。此赋予其适当三维形状以与B型DNA的小沟具有相同螺旋性(isohelicity)，引起在结合位点处滑动配合(Kohn,InAntibioticsIII.Springer-Verlag,NewYork,第3-11页(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。PBD在小沟中形成加合物的能力使其能够干扰DNA加工，因此其用作抗肿瘤剂。
尤其有利的吡咯并苯并二氮化合物是由Gregson等人(Chem.Commun.1999,797-798)描述为化合物1，及由Gregson等人(J.Med.Chem.2001,44,1161-1174)描述为化合物4a。此化合物，亦称为SG2000，展示如下：
WO2007/085930描述二聚体PBD化合物的制备，该等化合物具有用于连接至细胞结合剂(诸如抗体)的连接基团。连接子存在于连接二聚体的单体PBD单元的桥中。
WO2011/130598描述二聚体PBD化合物，其具有用于连接至细胞结合剂(诸如抗体)的连接基团。此等化合物中的连接子连接至一个可用N10位置且优选通过酶对连接基团的作用而裂解。
尽管多种PBDADC有希望用于治疗某些增生性病症，但在本领域中仍需要临床有效靶向化合物及使用该等化合物治疗增生性病症的方法。
【发明内容】
提供本发明以实现此等及其他目标，本发明在广义上是关于方法、化合物、组合物及制品，其包含有包含所选PBD的某些抗体药物缀合物，该等抗体药物缀合物可用于治疗DLL3相关病症(例如增生性病症或赘生性病症)。为此，本发明提供δ样配体3(或DLL3)抗体与所选PBD的缀合物，该等缀合物有效靶向肿瘤细胞及/或癌症干细胞且可用于治疗罹患多种增生性病症及该等病症的任何扩增、再发生、复发或转移的患者。在广泛的方面中，本发明是关于δ样配体3(DLL3)抗体与所选吡咯并苯并二氮的缀合物，其提供以下ADC1-5中实质上阐述的DLL3免疫缀合物。因此，在一个方面中，本发明是关于选自由以下组成的组的缀合物
及
其中Ab包括抗DLL3抗体或其免疫反应性片段。各缀合物中与连接子药物部分的结合优选是经由抗DLL3抗体上的游离硫醇实现。
在其他方面中，本发明包含以下组合物：包含ADC1的组合物、包含ADC2的组合物、包含ADC3的组合物、包含ADC4的组合物或包含ADC5的组合物。
如所指示，该等缀合物可用于治疗、管理、改善或预防增生性病症或其复发或发展。本发明的所选实施方式提供该等DLL3缀合物的用途，其是用于恶性肿瘤的免疫治疗性治疗，优选包含肿瘤引发细胞出现率的降低。所揭示的ADC可单独使用或与多种抗癌症化合物结合使用，诸如化学治疗剂或免疫治疗剂(例如治疗性抗体)或生物反应修饰剂。在其他所选实施方式中，两种或两种以上离散DLL3抗体药物缀合物可组合使用以提供增强的抗赘生作用。
在另一方面中，如随附实施例中所阐述，本发明提供制备ADC1-5的方法，其包含使选自由以下组成的组的化合物与抗DLL3抗体或其免疫反应性片段结合：
及
为达成本申请的目的，DL将用作“药物连接子(drug-linker)”的缩写且将包含如上文所阐述的药物连接子1-5(亦即DL1、DL2、DL3、DL4及DL5)。
应了解，可使用本领域中公认的技术使连接子所附的末端马来酰亚胺部分(DL1-DL3及DL5)或碘乙酰胺部分(DL4)与所选DLL3抗体上的游离巯基结合。除在下文中更详细论述的外，DL1-5的各化合物的合成途径提供于本文中的随附实施例1中，而结合该等化合物以提供ADC1-5的特定方法阐述于实施例7中。
应注意，为达成本申请的目的，应了解，除非上下文另有指示，否则术语“调节子”及“抗体”可互换地使用。类似地，术语“抗DLL3缀合物”及“DLL3缀合物”或仅“缀合物”均是指阐述为包含抗DLL3抗体的ADC1-5的化合物且除非上下文另有指示，否则其可互换地使用。
在任何情况下，提供本发明以达成此等及其他目标，本发明在广义上是关于上述DLL3缀合物及相关方法、组合物及制品，其可用于治疗DLL3相关病症(例如增生性病症或赘生性病症)。为此，本发明提供新颖的δ样配体3(或DLL3)抗体缀合物，其有效靶向肿瘤细胞及/或癌症干细胞且可用于治疗罹患多种恶性肿瘤的患者。如本文中将更详细论述，存在至少两种天然存在的DLL3同工型或变体且所揭示的调节子可包含一种同工型或另一种同工型或其两者或与其选择性相关联。此外，在某些实施方式中，所揭示的DLL3调节子可进一步与一或多种DLL家族成员(例如DLL1或DLL4)反应，或在其他实施方式中，可经产生及选择以独占地与一或多种DLL3同工型相关联或反应。
亦应了解，所揭示的抗体药物缀合物可包含任何可满足以下条件的调节子、抗体或其免疫反应性片段：识别DLL3决定子(或其片段)、与DLL3决定子(或其片段)竞争、对抗DLL3决定子(或其片段)、拮抗DLL3决定子(或其片段)、与DLL3决定子(或其片段)相互作用、结合DLL3决定子(或其片段)或与DLL3决定子(或其片段)相关联及调整、调控、改变、调节、改变或改良DLL3蛋白质对一或多种生理途径的影响及/或抑制或消除DLL3相关细胞。因此，在广义上，本发明总体上是关于DLL3缀合物及其用途。此外，如下文广泛论述，该等抗体药物缀合物可用于提供适用于预防、诊断或治疗增生性病症(包括癌症)的药物组合物。
关于ADC1-5，应了解，相容抗体可具有多种形式中的任一种，包括例如多株及单克隆抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、人源化抗体及人类以及前述各者中的每一者的免疫反应性片段及/或变体。优选实施方式将包含相对非免疫原性抗体，诸如人源化或完全人类构建体。当然，在本发明中，本领域技术人员可容易地鉴别与DLL3抗体调节子的重链及轻链可变区相关联的一或多个互补决定区(CDR)及使用该等CDR在无过度实验的情况下工程改造或制造嵌合、人源化或CDR接枝抗体。因此，在某些优选实施方式中，所揭示的ADC的DLL3抗体组分包含合并有一或多个互补决定区(CDR)的抗体，该一或多个互补决定区是如图3A及3B中所定义且来源于其中阐述的例示性邻接轻链(图3A)或重链(图3B)鼠可变区(SEQIDNO:21-387，单号)。图3中亦展示例示性人源化(CDR接枝)轻链及重链可变区序列，包含SEQIDNO:389-407。在优选实施方式中，包含图3A及3B中阐述的CDR的抗体将包含单克隆抗体，且在更佳实施方式中，将包含嵌合、CDR接枝或人源化抗体。编码图3A及3B中阐述的各氨基酸序列的例示性核酸序列随附于本文中的序列表中。
在另一实施方式中，本发明的抗体包含重链及轻链可变区，其包含与本文中所描述的例示性抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中抗体保留本发明的抗DLL3抗体的所需功能性。
更具体而言，在所选实施方式中，ADC1-5中的任一者中所包括的抗体可包含具有轻链可变区及重链可变区的抗体或其免疫反应性片段，其中该轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列：SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37、SEQIDNO:41、SEQIDNO:45、SEQIDNO:49、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73、SEQIDNO:77、SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:121、SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145、SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:205、SEQIDNO:209、SEQIDNO:213、SEQIDNO:217、SEQIDNO:221、SEQIDNO:225、SEQIDNO:229、SEQIDNO:233、SEQIDNO:237、SEQIDNO:241、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:253、SEQIDNO:257、SEQIDNO:261、SEQIDNO:265、SEQIDNO:269、SEQIDNO:273、SEQIDNO:277、SEQIDNO:281、SEQIDNO:285、SEQIDNO:289、SEQIDNO:293、SEQIDNO:297、SEQIDNO:301、SEQIDNO:305、SEQIDNO:309、SEQIDNO:313、SEQIDNO:317、SEQIDNO:321、SEQIDNO:325、SEQIDNO:329、SEQIDNO:333、SEQIDNO:337、SEQIDNO:341、SEQIDNO:345、SEQIDNO:349、SEQIDNO:353、SEQIDNO:357、SEQIDNO:361、SEQIDNO:365、SEQIDNO:369、SEQIDNO:373、SEQIDNO:377、SEQIDNO:381及SEQIDNO:385，且其中该重链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列：SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31、SEQIDNO:35、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:47、SEQIDNO:51、SEQIDNO:55、SEQIDNO:59、SEQIDNO:63、SEQIDNO:67、SEQIDNO:71、SEQIDNO:75、SEQIDNO:79、SEQIDNO:83、SEQIDNO:87、SEQIDNO:91、SEQIDNO:95、SEQIDNO:99、SEQIDNO:103、SEQIDNO:107、SEQIDNO:111、SEQIDNO:115、SEQIDNO:119、SEQIDNO:123、SEQIDNO:127、SEQIDNO:131、SEQIDNO:135、SEQIDNO:139、SEQIDNO:143、SEQIDNO:147、SEQIDNO:151、SEQIDNO:155、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:167、SEQIDNO:171、SEQIDNO:175、SEQIDNO:179、SEQIDNO:183、SEQIDNO:187、SEQIDNO:191、SEQIDNO:195、SEQIDNO:199、SEQIDNO:203、SEQIDNO:207、SEQIDNO:211、SEQIDNO:215、SEQIDNO:219、SEQIDNO:223、SEQIDNO:227、SEQIDNO:231、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:243、SEQIDNO:247、SEQIDNO:251、SEQIDNO:255、SEQIDNO:259、SEQIDNO:263、SEQIDNO:267、SEQIDNO:271、SEQIDNO:275、SEQIDNO:279、SEQIDNO:283、SEQIDNO:287、SEQIDNO:291、SEQIDNO:295、SEQIDNO:299、SEQIDNO:303、SEQIDNO:307、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:319、SEQIDNO:323、SEQIDNO:327、SEQIDNO:331、SEQIDNO:335、SEQIDNO:339、SEQIDNO:343、SEQIDNO:347、SEQIDNO:351、SEQIDNO:355、SEQIDNO:359、SEQIDNO:363、SEQIDNO:367、SEQIDNO:371、SEQIDNO:375、SEQIDNO:379、SEQIDNO:383及SEQIDNO:387。在其他优选实施方式中，所选调节子将包含与上述鼠序列65％、70％、75％或80％同源的重链及轻链可变区。在其他实施方式中，所选调节子将包含与所揭示的鼠序列85％、90％或甚至95％同源的重链及轻链可变区氨基酸序列。在此方面，应了解，来源于小鼠来源抗体的人源化抗体典型地具有优选与源抗体约70％至约85％同源的重链及轻链可变区。通过比较，人源化抗体将典型地具有优选与受体人类抗体约80％至约95％同源的重链及轻链可变区。
在其他优选实施方式中，所选抗体将包含一或多个自上述轻链及重链可变区氨基酸序列中的任一者获得的CDR。因此，本发明的所选实施方式包括DLL3调节子，其包含一或多个来自SEQIDNO:21至387(单号)中的任一者的CDR。抗体优选将包含三个自图3A中阐述的单一轻链可变区氨基酸序列获得的轻链CDR及三个自图3B中阐述的单一重链可变区氨基酸序列获得的重链CDR。例如，示例性抗体可包含三个自图3A中阐述的单一轻链可变区氨基酸序列获得的轻链CDR及三个自图3B中阐述的单一重链可变区氨基酸序列获得的重链CDR，其中所述轻链和重链可变区来自相同的克隆。在其他实施方式中，本发明的缀合物将包含任何与任一种上述调节子就结合进行竞争的抗体或其免疫反应性片段。
因此，本发明的另一方面包含ADC，其合并有自以下获得或来源的抗体：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150；或上述鉴别的抗体中的任一种，或者其嵌合或人源化形式。在其他实施方式中，本发明的ADC将包含DLL3抗体，其具有一或多个来自上述调节子中的任一者的CDR，例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在另一方面中，本发明将包含缀合物，其中抗DLL3抗体或其免疫反应性片段包含轻链可变区及重链可变区，其中该轻链可变区包含来源于选自由以下组成的组的氨基酸序列的氨基酸序列：SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37、SEQIDNO:41、SEQIDNO:45、SEQIDNO:49、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73、SEQIDNO:77、SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:121、SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145、SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:205、SEQIDNO:209、SEQIDNO:213、SEQIDNO:217、SEQIDNO:221、SEQIDNO:225、SEQIDNO:229、SEQIDNO:233、SEQIDNO:237、SEQIDNO:241、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:253、SEQIDNO:257、SEQIDNO:261、SEQIDNO:265、SEQIDNO:269、SEQIDNO:273、SEQIDNO:277、SEQIDNO:281、SEQIDNO:285、SEQIDNO:289、SEQIDNO:293、SEQIDNO:297、SEQIDNO:301、SEQIDNO:305、SEQIDNO:309、SEQIDNO:313、SEQIDNO:317、SEQIDNO:321、SEQIDNO:325、SEQIDNO:329、SEQIDNO:333、SEQIDNO:337、SEQIDNO:341、SEQIDNO:345、SEQIDNO:349、SEQIDNO:353、SEQIDNO:357、SEQIDNO:361、SEQIDNO:365、SEQIDNO:369、SEQIDNO:373、SEQIDNO:377、SEQIDNO:381及SEQIDNO:385，且其中该重链可变区包含来源于选自由以下组成的组的氨基酸序列的氨基酸序列：SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31、SEQIDNO:35、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:47、SEQIDNO:51、SEQIDNO:55、SEQIDNO:59、SEQIDNO:63、SEQIDNO:67、SEQIDNO:71、SEQIDNO:75、SEQIDNO:79、SEQIDNO:83、SEQIDNO:87、SEQIDNO:91、SEQIDNO:95、SEQIDNO:99、SEQIDNO:103、SEQIDNO:107、SEQIDNO:111、SEQIDNO:115、SEQIDNO:119、SEQIDNO:123、SEQIDNO:127、SEQIDNO:131、SEQIDNO:135、SEQIDNO:139、SEQIDNO:143、SEQIDNO:147、SEQIDNO:151、SEQIDNO:155、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:167、SEQIDNO:171、SEQIDNO:175、SEQIDNO:179、SEQIDNO:183、SEQIDNO:187、SEQIDNO:191、SEQIDNO:195、SEQIDNO:199、SEQIDNO:203、SEQIDNO:207、SEQIDNO:211、SEQIDNO:215、SEQIDNO:219、SEQIDNO:223、SEQIDNO:227、SEQIDNO:231、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:243、SEQIDNO:247、SEQIDNO:251、SEQIDNO:255、SEQIDNO:259、SEQIDNO:263、SEQIDNO:267、SEQIDNO:271、SEQIDNO:275、SEQIDNO:279、SEQIDNO:283、SEQIDNO:287、SEQIDNO:291、SEQIDNO:295、SEQIDNO:299、SEQIDNO:303、SEQIDNO:307、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:319、SEQIDNO:323、SEQIDNO:327、SEQIDNO:331、SEQIDNO:335、SEQIDNO:339、SEQIDNO:343、SEQIDNO:347、SEQIDNO:351、SEQIDNO:355、SEQIDNO:359、SEQIDNO:363、SEQIDNO:367、SEQIDNO:371、SEQIDNO:375、SEQIDNO:379、SEQIDNO:383及SEQIDNO:387。例如，这样的抗体可包含图3A和图3B中鉴别的相同克隆的轻链可变区和重链可变区。
在其他相容实施方式中，本发明的抗体药物缀合物将包含CDR接枝或人源化DLL3抗体hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56中的一者。
其他实施方式是关于包含抗体的ADC，其中该抗体包含：
抗体轻链，其包含有包含SEQIDNO:408的轻链可变区CDR1、包含SEQIDNO:409的轻链可变区CDR2及包含SEQIDNO:410的轻链可变区CDR3；及
抗体重链，其包含有包含SEQIDNO:411的重链可变区CDR1、包含SEQIDNO:412的重链可变区CDR2及包含SEQIDNO:413的重链可变区CDR3。
在另一实施方式中，本发明是关于包含抗体的ADC，其中该抗体包含：
抗体轻链，其包含有包含SEQIDNO:414的轻链可变区CDR1、包含SEQIDNO:415的轻链可变区CDR2及包含SEQIDNO:416的轻链可变区CDR3；及
抗体重链，其包含有包含SEQIDNO:417的重链可变区CDR1、包含SEQIDNO:418的重链可变区CDR2及包含SEQIDNO:419的重链可变区CDR3。
在另一实施方式中，本发明是关于包含抗体的ADC，其中该抗体包含：
抗体轻链，其包含有包含SEQIDNO:420的轻链可变区CDR1、包含SEQIDNO:421的轻链可变区CDR2及包含SEQIDNO:422的轻链可变区CDR3；及
抗体重链，其包含有包含SEQIDNO:423的重链可变区CDR1、包含SEQIDNO:424的重链可变区CDR2及包含SEQIDNO:425的重链可变区CDR3。
在另一实施方式中，本发明是关于包含抗体的ADC，其中该抗体包含：
抗体轻链，其包含有包含SEQIDNO:426的轻链可变区CDR1、包含SEQIDNO:427的轻链可变区CDR2及包含SEQIDNO:428的轻链可变区CDR3；及
抗体重链，其包含有包含SEQIDNO:429的重链可变区CDR1、包含SEQIDNO:430的重链可变区CDR2及包含SEQIDNO:431的重链可变区CDR3。
在另一实施方式中，本发明是关于包含抗体的ADC，其中该抗体包含：
抗体轻链，其包含有包含SEQIDNO:432的轻链可变区CDR1、包含SEQIDNO:433的轻链可变区CDR2及包含SEQIDNO:434的轻链可变区CDR3；及
抗体重链，其包含有包含SEQIDNO:435的重链可变区CDR1、包含SEQIDNO:436的重链可变区CDR2及包含SEQIDNO:437的重链可变区CDR3。
在某些优选实施方式中，上述抗体中的每一者均包含人源化抗体。此外，如本文中所描述，编码该等例示性人源化重链及轻链可变区的核酸序列阐述于随附序列表中。
此外，本发明的一个方面可包含DLL3多肽与癌症干细胞的治疗性关联。因此，在某些其他实施方式中，本发明将包含ADC1-5的DLL3缀合物，其在施用个体时降低肿瘤引发细胞的出现率。优选使用体外或体内有限稀释分析测定出现率的降低。在尤其优选实施方式中，该分析可使用体内有限稀释分析进行，其包含将活的人类肿瘤细胞移植至无免疫应答的小鼠中。或者，有限稀释分析可使用体外有限稀释分析进行，其包括将活的人类肿瘤细胞有限稀释沉积至体外集落支持条件(supportingconditions)。在任一种情况下，出现率降低的分析、计算或定量将优选包含使用泊松分布统计(Poissondistributionstatistics)以提供精确计算。应了解，尽管该等定量方法为优选，但其他劳动密集度较低的方法(诸如流动式细胞测量术或免疫组织化学)亦可用于提供所需值且因此明确地涵盖于本发明的范围内。在该等情况下，出现率的降低可使用已知针对肿瘤引发细胞富集的肿瘤细胞表面标记的流动式细胞测量分析或免疫组织化学检测来测定。
在此方面，应了解，本发明是至少部分基于发现DLL3免疫原与肿瘤永续细胞(亦即癌症干细胞)在治疗学上相关联，该等肿瘤永续细胞与各种增生性病症(包括赘瘤形成)的病源学有关。更具体而言，本申请揭示施用所揭示的DLL3缀合物可介导、降低、消耗、抑制或消除由肿瘤引发细胞引起的致瘤信号传导(例如降低肿瘤引发细胞的出现率)。此降低的信号传导(无论通过肿瘤引发细胞的消耗、中和、减少、消除、重新程序化或静止或通过改良肿瘤细胞形态(例如诱导的分化、干细胞微环境破坏(nichedisruption))又可通过抑制肿瘤形成、肿瘤保持、扩增及/或转移及复发而更有效地治疗DLL3相关病症。
除与癌症干细胞的上述关联外，有证据表明DLL3同工型可能与包含或呈现神经内分泌特征或表型决定子的肿瘤的生长、复发或转移潜力有关。为达成本发明的目的，该等肿瘤将包含神经内分泌肿瘤及伪神经内分泌肿瘤。由此，使用本文中所描述的新颖DLL3缀合物介入该等致瘤细胞的增殖可通过一种以上机制(例如肿瘤引发细胞降低及破坏致癌途径信号传导)改善或治疗病症，从而提供累加或协同效应。其他优选实施方式可利用细胞表面DLL3蛋白质的细胞内化作用来递送所连接的抗癌剂。在此方面，应了解，本发明不受任何特定作用机制限制，而是涵盖所揭示的调节子治疗DLL3相关病症(包括各种赘瘤形成)的广泛用途。
在其他优选实施方式中，调节子将与DLL3的特定抗原决定基、部分、基序或结构域缔合或结合。如下文将详细论述，两种DLL3同工型合并有相同的细胞外区域(参见图2)，该细胞外区域至少包含一个N端结构域、一个DSL(δ/锯齿状/lag-2)结构域及六个EGF样结构域(亦即EGF1-EGF6)。因此，在某些实施方式中，调节子将与DLL3的N端结构域(亦即成熟蛋白质中的氨基酸27-175)结合或缔合，而在其他所选实施方式中，调节子将与DSL结构域(亦即DLL3的氨基酸176-215)或其中抗原决定基缔合。本发明的其他方面包含与位于DLL3的特定EGF样结构域中的特定抗原决定基缔合或结合的抗体。在此方面，特定调节子可与位于EGF1(氨基酸216-249)、EGF2(氨基酸274-310)、EGF3(氨基酸312-351)、EGF4(氨基酸353-389)、EGF5(氨基酸391-427)或EGF6(氨基酸429-465)中的抗原决定基缔合或结合。当然，应了解，上述结构域中的每一者可包含一个以上抗原决定基及/或一个以上仓室(bin)。在尤其优选实施方式中，本发明将包含与DSL结构域或其中抗原决定基结合、反应或缔合的抗体。在其他优选实施方式中，本发明将包含与特定EGF样结构域或其中抗原决定基结合、反应或缔合的抗体。在其他优选实施方式中，调节子将与N端结构域或其中抗原决定基结合、反应或缔合。
关于调节子或抗体“仓室”，应了解，可使用本领域中公认的技术经由竞争性抗体结合来分析或定位DLL3抗原，以便界定位于蛋白质上或沿蛋白质定位的特定仓室。尽管本文中更详细地论述且在以下实施例中展示，但若两个抗体(其中一个可称为“参考抗体”、“仓室定界抗体”或“定界抗体”)彼此竞争结合目标抗原，则可认为其位于同一个仓室中。在该等情况下，标的抗体抗原决定基可相同、实质上相同或足够靠近(线性含义(当其由少数氨基酸分隔时)或构形性)，使得两种抗体被以位阻或静电方式抑制或妨碍与抗原结合。该等界定的仓室可总体上与某些DLL3结构域相关联(例如参考抗体将与特定结构域中所含抗原决定基结合)，但相关性并不总是精确(例如结构域中可能存在一个以上仓室或仓室可以构象方式界定且包含一个以上结构域)。应了解，本领域技术人员可容易地确定DLL3结构域之间的关系且凭经验确定仓室。
在本发明中，使用本领域中公认的技术(例如ELISA、表面等离振子共振或生物层干涉术)的竞争性结合分析界定至少九个相异的仓室，发现其中每个仓室均含有很多抗体调节子。为达成本发明的目的，将九个仓室称为仓室A至仓室I。因此，在所选实施方式中，本发明将包含驻留于选自由以下组成的组的仓室中的ADC1-5的抗体药物缀合物：仓室A、仓室B、仓室C、仓室D、仓室E、仓室F、仓室G、仓室H及仓室I。
在其他实施方式中，本发明的缀合物包含驻留于由选自由以下组成的组的参考抗体界定的仓室中的抗体：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。在其他实施方式中，本发明的ADC将包含来自仓室A的抗体、来自仓室B的抗体、来自仓室C的抗体、来自仓室D的抗体、来自仓室E的抗体、来自仓室F的抗体、来自仓室G的抗体、来自仓室H的抗体或来自仓室I的抗体。其他优选实施方式将包含参考抗体调节子及任何与参考抗体竞争的抗体。
当在所揭示的调节子的上下文中使用时，术语“竞争”或“竞争抗体”意谓抗体之间的结合竞争，如由其中参考抗体或免疫功能性片段实质上阻止或抑制(例如大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％)测试抗体与共同抗原的特异性结合的分析法确定。用于确定该竞争的相容方法包含本领域中已知的技术，诸如生物层干涉术、表面等离振子共振、流动式细胞测量术、竞争性ELISA等。
本发明亦提供适用于治疗DLL3相关病症(诸如癌症)的试剂盒或装置及相关方法，其利用本文中揭示的DLL3缀合物，以及本文中揭示的DLL3缀合物的药物组合物，其可用于治疗DLL3相关病症，如癌症。为此，本发明优选提供适用于治疗DLL3相关病症的制品，其包含容器，该容器含有ADC1-5与说明材料的抗体药物缀合物，其是用于使用该等缀合物治疗、改善或预防DLL3相关病症或其发展或复发。
以上为概述且因此必然含有简化、一般化及细节的缺省；因此，本领域技术人员应了解，概述仅为说明性且不意欲造成任何限制。本文中所描述的方法、组合物及/或装置及/或其他标的物的其他方面、特征及优点将自本文中阐述的教导变得显而易见。提供概述以按简化形式引入概念的选择，该等概念进一步描述于以下实施方式中。此概述不意欲鉴别所主张标的物的关键特征或基本特征，亦不意欲用作确定所主张主题的范围的辅助物。
【附图简述】
图1提供DLL3蛋白质的两个同工型(SEQIDNO:1及SEQIDNO:2)的序列比对。
图2提供DLL3蛋白质的细胞外区域的示意图，其说明各种结构域的位置。
图3A及3B以表格形式提供与所揭示的抗体药物缀合物相容的多种鼠及人源化例示性DLL3抗体的轻链及重链可变区的邻接氨基酸序列(SEQIDNO:21-407，单号)，其是如本文中的实施例中所描述经分离、克隆及工程改造。
图4示意性描绘如本文中的实施例中所描述经分离、克隆及工程改造的例示性DLL3调节子的结构域水平作图分析的结果。
图5阐述如表格中呈现的例示性DLL3调节子的生物化学及免疫学性质。
图6提供根据本发明产生的例示性抗体药物缀合物的列表。
【发明详述】
I.前言
本文中揭示可例示本发明的原理的本发明的特定说明性实施方式，但本发明可以多种不同形式实施。应强调的是，本发明不限于所说明的特定实施方式。此外，本文中所使用的任何章节标题是仅用于组织目的且不应视为限制所描述的标的物。最终，为达成本发明的目的，除非另有说明，否则所有鉴别序列寄存编号可见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库及/或NCBI存档序列数据库中。
如上文所论述，已发现DLL3表型决定子临床上与各种增生性病症(包括呈现神经内分泌特征的赘瘤形成)相关联，且DLL3蛋白质及其变体或同工型提供可用于治疗相关疾病的有效肿瘤标记。在此方面，本发明提供上文阐述为ADC1-5的多种抗体药物缀合物，其包含抗DLL3抗体靶向剂及PBD有效负载。如下文更详细论述及随附实施例中所阐述，所揭示的DLL3ADC尤其可有效消除致瘤细胞且因此适用于治疗及预防某些增生性病症或其发展或复发。
此外，如本申请中所示，已发现DLL3标记或决定子(诸如细胞表面DLL3蛋白质)在治疗学上与癌症干细胞(亦称为肿瘤永续细胞)相关联且可有效用于消除癌症干细胞或使其静止。经由使用本文中揭示的结合的DLL3调节子选择性降低或消除癌症干细胞的能力的惊人的处在于已知该等细胞通常对许多常规治疗具有抗性。亦即，传统的以及最近关注的治疗方法的有效性通常受到抗性癌症干细胞的存在及/或出现的限制，该等抗性癌症干细胞即使在面对此等不同的治疗方法时仍能够使肿瘤永久生长。此外，由于较低的或不一致的表达，与癌症干细胞相关联的决定子通常产生弱治疗目标，无法保持与致瘤细胞相关联或无法存在于细胞表面。与先前技术的教导明显不同，本发明所揭示的抗体药物缀合物及方法可有效克服此固有抗性且特定消除、消耗该等癌症干细胞、使该等癌症干细胞静止或促进该等癌症干细胞的分化，由此消除其维持或重新诱导潜在肿瘤生长的能力。此外，由于DLL3蛋白质的表达与细胞内位置(诸如高尔基体(Golgi))显著相关，因此不确定该等表型决定子可成功用作本文中教导的特定ADC的治疗目标。
因此，尤其值得注意的是，DLL3缀合物(诸如本文中揭示的DLL3缀合物)可有利地用于治疗及/或预防所选增生性(例如赘生性)病症或其发展或复发。应了解，尽管下文将尤其根据特定结构域、区域或抗原决定基或在包含神经内分泌特征的癌症干细胞或肿瘤及其与所揭示的抗体药物缀合物的相互作用的情形中广泛论述本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应了解，本发明的范围不受该等例示性实施方式限制。实情为，本发明的最广泛实施方式及随附权利要求是广泛及明确地针对所揭示的DLL3缀合物及其在治疗及/或预防多种DLL3相关或介导的病症(包括赘生性或细胞增生性病症)中的用途，而与任何特定作用机制或特定目标肿瘤、细胞或分子组分无关。
为此且如本申请中说明，出人意料地发现所揭示的DLL3缀合物可有效用于靶向及消除增生性或致瘤细胞或以其他方式剥夺其能力以及治疗DLL3相关病症(例如赘瘤形成)。如本文中所用，“DLL3相关病症”应始终意谓任何在疾病或病症的病程或病源学期间由DLL3遗传组分或表达(“DLL3决定子”)的表型畸变标记、诊断、检测或鉴别的病症或疾病(包括增生性病症)。在此方面，DLL3表型畸变或决定子可例如包含DLL3蛋白质表达量升高或降低、某些可定义的细胞群体上的异常DLL3蛋白质表达或细胞生命循环中的不当时期或阶段时的异常DLL3蛋白质表达。当然，应了解，DLL3的遗传型决定子的类似表达模式(例如mRNA转录水平)亦可用于分类、检测或治疗DLL3病症。
关于所揭示的缀合物，本发明提供PBD二聚体，其中一个连接子连接至一个PBD部分上的位置且经由该连接子与DLL3抗体调节子缀合。经由此等经小心地工程改造的构型，缀合物允许优选不保留连接子的任何部分的活性PBD化合物的释放。亦即，不存在可不利地影响PBD有效负载的反应性的残余部分或连接子残余物。因此，所揭示的DLL3缀合物在连接子裂解时释放以下二聚型PBD化合物。
ADC1的缀合物释放化合物PBD1：
ADC2的缀合物释放化合物PBD2：
ADC3的缀合物释放化合物PBD3：
ADC4的缀合物释放化合物PBD4：
ADC5的缀合物释放化合物PBD5：
因此，PBD1、PBD2、PBD3、PBD4或PBD5的毒性化合物的递送是由ADC1-5经由连接基团上(且具体而言，合并的缬氨酸-丙氨酸二肽部分上)的酶(诸如组织蛋白酶)的作用在所需活化位点(亦即在致瘤细胞内)实现。如下文更详细论述，所揭示的PBD细胞毒素的局部递送可以实质上低于相关非靶向护理化学疗法标准的毒性提供若干类型的致瘤细胞的有效消除。
在此方面，本发明的一个方面包含递送选自由PBD1、PBD2、PBD3、PBD4及PBD5组成的组的化合物，其包含施用DLL3缀合物的步骤。
II.DLL3生理学
洛奇(Notch)信号传导途径(首先在线虫(C.elegans)及果蝇(Drosophila)中发现且接着证实自无脊椎动物至脊椎动物具有进化保守性)参与一系列基本生物学过程，包括正常胚胎发育、成年人组织恒定及干细胞保持(D'Souza等人,2010；Liu等人,2010)。在特异性作用、成型及形态发生期间，洛奇信号传导对于多种细胞类型而言为关键的。通常，此是经由侧抑制机制发生，其中表达洛奇配体的细胞采用预设细胞命运，从而又经由洛奇信号传导的刺激来抑制相邻细胞中的此命运(Sternberg,1988,Cabrera1990)。发现此由洛奇信号传导介导的二元细胞命运选择在许多组织中起作用，包括正在发育的神经系统(delaPompa等人,1997)、造血及免疫系统(Bigas及Espinosoa,2012；Hoyne等人,2011；Nagase等人,2011)、肠管(Fre等人,2005；Fre等人,2009)、内分泌胰脏(Apelqvist等人,1999；Jensen等人,2000)、垂体(Raetzman等人,2004)及弥漫性神经内分泌系统(Ito等人,2000；Schonhoff等人,2004)。尽管洛奇信号传导在多种发育系统中起作用，但用于实施此二元切换的一般化机制呈现保守性；例如在预设细胞命运选择是由称为基本螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白质的转录调节子确定的细胞中，洛奇信号传导引起一类洛奇响应基因的活化，其又抑制bHLH蛋白质的活性(Ball,2004)。此等二元决策在发育及信号传导插入物的更广泛情形中发生，从而允许洛奇信号传导实现增殖或抑制增殖，及引起自我更新或抑制自我更新。
在果蝇中，洛奇信号传导是主要由一个洛奇接受基因及两个配体基因(称为锯齿状及δ)介导(Wharton等人,1985；Rebay等人,1991)。在人类中，存在四种已知洛奇受体及五种DSL(δ-锯齿状LAG2)配体--锯齿状的两种同是物，称为Jagged1及Jagged2，及δ的三种同是物，称为δ样配体或DLL1、DLL3及DLL4。通常，信号接收细胞表面上的洛奇受体是通过与表达于相反的、信号发送细胞表面上的配体的相互作用(称为反式相互作用)而活化。此等反式相互作用引起洛奇受体的一系列蛋白酶介导的裂解。因此，洛奇受体细胞内结构域自由地自细胞膜易位至细胞核，其在细胞核中与转录因子的CSL家族(人类中的RBPJ)搭配且将其自转录抑制因子转化为洛奇响应基因的活化子。
在人类洛奇配体中，DLL3的不同之处在于其似乎不能经由反式相互作用活化洛奇受体(Ladi等人,2005)。尽管顺式抑制的确切机制尚不清楚且可视配体而变化，但洛奇配体亦可以顺式(相同细胞上)与洛奇受体相互作用，引起洛奇信号的抑制(例如参见Klein等人,1997；Ladi等人,2005；Glittenberg等人,2006)。两种假设抑制模式包括通过阻止反式相互作用来调节细胞表面的洛奇信号传导，或通过扰乱受体处理或通过实体上引起内质网或高尔基体中受体的滞留来降低细胞表面上洛奇受体的量(Sakamoto等人,2002；Dunwoodie,2009)。然而，显然相邻细胞上洛奇受体及配体的表达的随机差异可经由转录及非转录过程扩增，且顺式相互作用与反式相互作用的微妙平衡可引起相邻组织中不同细胞命运的洛奇介导的区隔的精细调谐(Sprinzak等人,2010)。
DLL3(亦称为δ样3或SCDO1)为洛奇DSL配体的δ样家族的成员。代表性DLL3蛋白质直系同源物包括(但不限于)人类(寄存编号NP_058637及NP_982353)、黑猩猩(chimpanzee)(寄存编号XP_003316395)、小鼠(寄存编号NP_031892)及大鼠(寄存编号NP_446118)。在人类中，DLL3基因由位于染色体19q13上的8个外显子(跨度9.5kBp)组成。最后一个外显子内的替代性剪接产生两种经加工的转录物，一种具有2389个碱基(寄存编号NM_016941)且一种具有2052个碱基(寄存编号NM_203486)。前一种转录物编码618个氨基酸的蛋白质(寄存编号NP_058637；图1，SEQIDNO:1)，而后一种转录物编码587个氨基酸的蛋白质(寄存编号NP_982353；图1，SEQIDNO:2)。DLL3的此两种蛋白质同工型在其细胞外结构域及其跨膜结构域中共有共100％同一性，不同之处仅在于较长的同工型含有经扩展的细胞质尾端，该尾端在蛋白质的羧基端含有32个额外残基(图1)。尽管可在肿瘤细胞中检测到两种同工型，但同工型的生物学相关性尚不清楚。
通常，DSL配体是由一系列结构域构成：独特的N端结构域，接着为保守性DSL结构域、多个串联表皮生长因子(EGF)样重复体、跨膜结构域及细胞质结构域，该细胞质域在配体内保守性不高，其含有多个赖氨酸残基，该等赖氨酸残基为独特E3泛素连接酶的潜在泛素化位点。DSL结构域为简并EGF结构域，其为与洛奇受体的相互作用所必需但不足以单独实现该相互作用(Shimizu等人,1999)。此外，大部分DSL配体中的开头两个EGF样重复体含有称为DOS结构域的较小蛋白质序列基序，其在活化洛奇信号传导时与DSL结构域以共同操作方式(co-operatively)相互作用。
图2提供DLL3蛋白质的细胞外区域的示意图，其说明六个EGF样结构域、单一DSL结构域及N端结构域的一般邻接位置。通常，认为EGF结构域存在于约氨基酸残基216-249(结构域1)、274-310(结构域2)、312-351(结构域3)、353-389(结构域4)、391-427(结构域5)及429-465(结构域6)处，且DSL结构域存在于约氨基酸残基176-215及hDLL3的约氨基酸残基27-175的N端结构域处(SEQIDNO:1及SEQIDNO:2)。如本文中更详细论述及以下实施例中所展示，各EGF样结构域、DSL结构域及N端结构域均包含如由相异氨基酸序列所界定的DLL3蛋白质的一部分。应注意，为达成本发明的目的，可将各别EGF样结构域称为EGF1至EGF6，其中EGF1最靠近蛋白质的N端部分。关于蛋白质的结构组成，本发明的一个重要方面为所揭示的DLL3调节子经产生、制造、工程改造或选择以与所选结构域、基序或抗原决定基反应。在某些情况下，该等位点特异性调节子可视其主要作用方式而提供增强的反应性及/或功效。
应注意，如本文中所用，如本文中所用的术语“成熟蛋白质”或“成熟多肽”是指由哺乳动物细胞中的表达产生的蛋白质的形式。通常假设一旦起始跨越粗内质网的正在生长的蛋白质链的输出，则由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽(SP)序列，该信号肽序列是由完整多肽裂解以产生蛋白质的“成熟”形式。在DLL3的两种同工型中，成熟蛋白质包含26个氨基酸的信号肽，其可在细胞表面表达之前剪裁。因此，在成熟蛋白质中，N端结构域将自蛋白质中的位置27延伸至DSL结构域的开始处。当然，若蛋白质并非以此方式加工，则N端结构域将保持延伸至SEQIDNO:1及SEQIDNO:2中的位置1。
在各种δ样配体中，DLL3与家族中的其他成员差别最大，因为其含有退化型DSL结构域、无DOS基序且含有缺乏赖氨酸残基的细胞内结构域。退化型DSL及缺乏DOS基序与DLL3不能以反式(细胞之间)引起洛奇信号传导一致，表明DLL3(与DLL1或DLL4不同)仅充当洛奇信号传导的抑制剂(Ladi等人,2005)。研究表明DLL3可主要驻留于顺式高尔基体中(Geffers等人,2007)，其将与假设的细胞内保留洛奇受体或妨碍洛奇受体的加工、防止输出至细胞表面及改为将其重新靶向溶酶体的能力一致(Chapman等人,2011)。然而，当蛋白质在模型系统中经人工过表达时(Ladi等人,2005)，一些DLL3蛋白质可在细胞表面呈现，但显然此并非正常生物学情形或DLL3mRNA转录物升高的肿瘤中的情况；有些令人惊讶的是，本文中揭示的肿瘤类型中检测到的蛋白质含量表明大量DLL3蛋白质逃逸至各种肿瘤的细胞表面。
此外，如上文所论述，洛奇信号传导在呈现神经内分泌特征的神经内分泌细胞及肿瘤的发展及维持中起作用。在此方面，洛奇信号传导与正常内分泌器官及弥漫型神经内分泌系统中的广泛细胞命运决策有关。举例而言，在胰脏中，需要洛奇信号传导抑制由bHLH转录因子NGN3介导的预设内分泌表型的发展(Habener等人,2005)。类似的洛奇介导的内分泌细胞命运的抑制可在肠内分泌细胞(Schonhoff等人,2004)、甲状腺甲状滤泡旁细胞(Cook等人,2010)、垂体中指定相对比率的神经内分泌细胞类型(Dutta等人,2011)中发生，且可能与肺内的细胞采用神经内分泌或非神经内分泌表型的决策有关(Chen等人,1997；Ito等人,2000；Sriuranpong等人,2002)。因此，显然在许多组织中，洛奇信号传导的抑制与神经内分泌表型有关。
通常在肿瘤中观测到发展信号传导途径的不当再活化或正常信号传导途径的失调，且在洛奇信号传导情况下，与许多肿瘤类型相关联(Koch及Radtke,2010；Harris等人,2012)。已研究发现洛奇途径为淋巴瘤、结肠直肠癌、胰腺癌及一些类型的非小细胞肺癌中的致癌基因(参见Zarenczan及Chen,2010及其中参考文献)。相反，报道洛奇在具有神经内分泌特征的肿瘤中充当肿瘤抑制剂(参见Zarenczan及Chen,2010,见上文)。具有神经内分泌特征的肿瘤通常不出现在广泛范围的原发性位点，且其详尽分类仍存在问题(Yao等人,2008；Klimstra等人,2010；2011)，其可分类为四种主要类型：低级良性类癌瘤、具有恶性性质的低级分化良好型神经内分泌肿瘤、具有混合型神经内分泌及上皮特征的肿瘤及高级分化不良神经内分泌癌瘤。在此等分类中，分化不良型神经内分泌癌瘤(其包括小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)的子集)为具有不良预后的癌症类型。已假设SCLC为支气管源起源，部分由肺神经内分泌细胞产生(Galluzzo及Bocchetta,2011)。与此等具有神经内分泌表型的肿瘤中的每一者的起源的特定细胞来源无关，预期抑制洛奇信号传导(通过洛奇途径基因本身中的直接病变或其他抑制洛奇信号传导的基因的活化)可引起此等肿瘤的神经内分泌表型的获取。通过扩展，引起洛奇途径扰动的基因可产生用于治疗具有神经内分泌表型的肿瘤的治疗性目标，尤其用于当前具有差的临床结果的适应症。
ASCL1为一种该类基因，其显示经由DLL3与洛奇信号传导途径相互作用。显然许多神经内分泌肿瘤均展示分化不良(亦即部分完成)的内分泌表型；举例而言，经标记的各种内分泌蛋白质及多肽(例如嗜铬粒蛋白A，CHGA；降血钙素，CALCA；原吗啡黑色素皮质素，POMC；生长抑素，SST)、与分泌小泡有关的蛋白质(例如突触素，SYP)及与负责生物活性胺合成的生物化学途径有关的基因(例如多巴脱羧酶，DDC)的升高或表达。或许不意外的是，此等肿瘤通常过表达ASCL1(亦称为mASH1(小鼠中)或hASH1(人类中))，ASCL1为已知在编排引起神经及神经内分泌表型的基因级联中起作用的转录因子。尽管级联的特定分子细节尚不清楚，但越来越清楚的是，对于某些细胞类型，尤其是甲状腺甲状滤泡旁细胞(Kameda等人,2007)、肾上腺髓质的嗜铬细胞(Huber等人,2002)及在肺的弥漫性神经内分泌系统中发现的细胞(Chen等人,1997；Ito等人,2000；Sriuranpong等人,2002)，ASCL1为精细调谐的发展调节回路的一部分，其中细胞命运选择是由ASCL1介导及洛奇介导的基因表达级联的平衡介导。举例而言，发现ASCL1表达于正常小鼠肺神经内分泌细胞中，而洛奇信号传导效应子HES1表达于肺非神经内分泌细胞中(Ito等人,2000)。越来越了解到此两个级联与潜在交叉调节处于精细平衡。已证实洛奇效应子HES1可下调ASCL1表达(Chen等人,1997；Sriuranpong等人,2002)。此等结果明确表明洛奇信号传导可抑制神经内分泌分化。然而，结合于DLL3启动子的ASCL1活化DLL3表达的证明(Henke等人,2009)及DLL3使洛奇信号传导降低的观测结果(Ladi等人,2005)否定了神经内分泌表型与非神经内分泌表型之间细胞命运选择的遗传回路。
鉴于洛奇信号传导似乎演化为放大相邻细胞之间的细微差异以实现具有不同分化路径(例如，如上文所描述的“侧抑制”)的清晰界定的组织结构域，此等数据共同表明在具有神经内分泌表型的癌症中，精细调谐的发展调节回路变为再活化及失调。尽管不明显的是，鉴于DLL3在细胞的内膜区室内的正常驻留(Geffers等人,2007)及假设其与内膜区室内中的洛奇相互作用，DLL3将提供抗体治疗剂开发的合适细胞表面靶标，神经内分泌肿瘤中DLL3表达升高的结果可提供用于具有神经内分泌表型(例如NET及pNET)的肿瘤的独特的治疗性靶标。通常发现实验室系统中蛋白质的大量过表达可引起细胞内过表达的蛋白质的错误定位。因此，存在以下合理的、但在无实验检查下不明显的假设：肿瘤中DLL3的过表达可引起蛋白质的一些细胞表面表达，且由此呈现用于本发明的所揭示的ADC的靶标。
III.癌症干细胞
如上文所提及，令人惊讶地发现异常DLL3表达(遗传型及/或表型)与各种致瘤细胞亚群相关联。在此方面，本发明提供DLL3抗体药物缀合物，其可尤其适用于靶向该等细胞(例如癌症干细胞)，由此促进赘生性病症的治疗、管理或预防。因此，在优选实施方式中，根据本发明的教导，所揭示的DLL3ADC可有利地用于降低肿瘤引发细胞出现率且由此促进增生性病症的治疗或管理。
为达成本申请的目的，术语“肿瘤引发细胞”(TIC)涵盖“肿瘤永续细胞”(TPC；亦即癌症干细胞或CSC)及高增生性“肿瘤祖细胞”(称为TProg)，其通常共同包含主体肿瘤或肿瘤块的唯一亚群(亦即0.1％-40％)。为达成本发明的目的，术语“肿瘤永续细胞”及“癌症干细胞”或“赘生性干细胞”为等效物且在本文中可互换地使用。TPC与TProg的不同之处在于TPC可完全概括存在于肿瘤内的肿瘤细胞的组成且具有无限自我更新能力，如由少数经分离细胞的连续移植(经由小鼠的两次或两次以上继代)证明，而TProg不会显示无限自我更新能力。
本领域技术人员应了解，至少部分归因于区分单细胞与细胞丛集(亦即细胞对等)的能力，使用合适细胞表面标记的荧光活化细胞分类(FACS)为分离高度富集的癌症干细胞亚群(例如纯度>99.5％)的可靠方法。使用该等技术已显示，当将低细胞数目的高度纯化TProg细胞移植于无免疫应答小鼠中时，其可刺激原发性移植物中肿瘤生长。然而，不同于经纯化的TPC亚群，产生TProg的肿瘤并不完全反映母体肿瘤的表型细胞异质性且明确无效地重新起始后续移植物中的连续肿瘤形成。相反，癌症干细胞亚群完全复原母体肿瘤的细胞多相性且在连续分离及移植时可有效引发肿瘤。因此，本领域技术人员应认识到，尽管TPC与TProg皆可在原发性移植物中产生肿瘤，但两者之间的明确差异为TPC具有在以低细胞数目连续移植后持久刺激异源肿瘤生长的独特能力。表征TPC的其他常见方法包含细胞表面标记的形态学及检查、转录谱及药物反应，但标记表达可随培养条件及体外细胞系继代而变。
因此，为达成本发明的目的，肿瘤永续细胞(与负载正常组织中细胞阶层的正常干细胞相同)优选是由其无限自我更新，同时能够保持多谱系分化的能力定义。因此，肿瘤永续细胞能够产生肿瘤形成子代(亦即肿瘤起始细胞：TPC及TProg)与非肿瘤形成(NTG)子代。如本文中所使用，非肿瘤形成细胞(NTG)是指由肿瘤引发细胞产生、但自身不能自我更新或产生构成肿瘤的肿瘤细胞异源谱系的肿瘤细胞。在实验上，即使以过量细胞数目移植，NTG细胞仍无法在小鼠中再现肿瘤形成。
如所指示，TProg亦根据其在小鼠中产生肿瘤的能力有限而归类为肿瘤引发细胞(或TIC)。TProg为TPC的子代且通常能够进行有限次数的非自我更新细胞分裂。此外，TProg细胞可进一步分成早期肿瘤祖细胞(ETP)及晚期肿瘤祖细胞(LTP)，其每一者可由表型(例如细胞表面标记物)及再现肿瘤细胞架构的不同能力来区分。尽管存在该等技术性差异，但ETP与LTP在功能上亦与TPC不同，因为当以低细胞数目移植时其一般不太能够连续重构肿瘤且通常不反映母体肿瘤的异质性。尽管存在上述区别，但亦已显示各种TProg群体可在个别情况下获得通常归于干细胞的自我更新能力且自身变成TPC(或CSC)。在任何情况下，两种类型的肿瘤引发细胞均很可能在单一患者的典型肿瘤块中呈现且可使用如本文所揭示的调节剂治疗。亦即，所揭示的组合物在降低出现率或改变该等DLL3阳性肿瘤引发细胞的化学敏感性中通常有效，而与肿瘤中所出现的特定实施方式或混合物无关。
在本发明的上下文中，与构成肿瘤块的TProg(ETP与LTP)、NTG细胞及浸润肿瘤的非TPC来源细胞(例如纤维母细胞/基质、内皮及造血细胞)相比，TPC更具肿瘤形成性，相对更静止且通常更具化学抗性。假设常规疗法及方案大部分已设计成使肿瘤减积且侵袭快速增殖细胞，与较快增殖的TProg及其他块状肿瘤细胞群体相比，TPC很可能对常规疗法及方案更具抗性。此外，TPC通常表现使其对常规疗法具有相对化学抗性的其他特征，诸如多重抗药性转运蛋白的表达增加、DNA修复机制增强及抗细胞凋亡蛋白。此等性质(每一者均造成TPC的耐药性)构成标准肿瘤学治疗方案无法确保大部分晚期赘瘤形成患者长期受益的关键原因；亦即无法适当地靶向及去除刺激持续肿瘤生长及再发的细胞(亦即TPC或CSC)。
与许多先前治疗不同，本发明的新颖抗体药物缀合物在施用ADC的个体时优选降低肿瘤引发细胞的出现率。如上文所述，肿瘤引发细胞出现率的降低可因以下而出现：a)消除、耗尽、敏化、静止或抑制肿瘤引发细胞；b)控制肿瘤引发细胞的生长、扩大或再发；c)中断肿瘤引发细胞的引发、繁殖、维持或增殖；或d)以其他方式阻碍肿瘤形成细胞的存活、再生及/或转移。在一些实施方式中，肿瘤引发细胞出现率的降低因一或多个生理学路径变化而出现。途径的变化(无论由肿瘤引发细胞的降低或消除或由改良其潜力(例如诱导分化、干细胞微环境破坏)或以其他方式妨碍其影响肿瘤环境或其他细胞的能力引起)又可通过抑制肿瘤形成、肿瘤保持及/或转移及复发而实现DLL3相关病症的更有效治疗。
本领域中公认的可用于评估肿瘤引发细胞的该出现率降低的方法包括体外或体内有限稀释分析，优选接着使用泊松分布统计进行计算，或评估预定的确定事件的出现率，诸如体内或体外产生肿瘤的能力。尽管该有限稀释分析包含计算肿瘤引发细胞出现率降低的优选方法，但其他亦可使用其他的需求不高的方法有效地确定所需值(尽管精确度略低)且与本文中的教导完全相容。因此，如本领域技术人员将了解，亦可经由熟知的流动式细胞测量或免疫组织化学方法确定出现率值的降低。关于所有上述方法，参见例如Dylla等人2008,PMID:18560594及Hoey等人2009,PMID:19664991；其均以全文且尤其针对所揭示的方法引用的方式并入本文中。
关于有限稀释分析，肿瘤引发频率的体外计算可由将分化或未分化的人类肿瘤细胞(例如分别来自经处理及未经处理的肿瘤)沉积于促进群落形成的体外生长条件中来完成。由此，群落形成细胞可通过群落的简单计数及表征，或由例如将人类肿瘤细胞以连续稀释物形式沉积于板中且在涂布后至少10天对各孔进行评分(如对群落形成为阳性或阴性)组成的分析来计算。体内限制稀释实验或分析(一般其测定肿瘤引发细胞出现率的能力更加精确)涵盖例如将来自未经处理的对照或经处理的群体的人类肿瘤细胞的连续稀释液移植于无免疫应答小鼠中，随后在移植后至少60天评定各小鼠为肿瘤形成阳性或阴性。通过体外或体内有限稀释分析推导细胞出现率值优选通过将泊松分布统计应用于阳性及阴性事件的已知出现率，由此得出满足阳性事件(在此情况下分别为群落或肿瘤形成)定义的事件的出现率来进行。
关于与本发明相容的可用于计算肿瘤引发细胞出现率的其他方法，最常见方法包含可定量流动式细胞测量术及免疫组织化学染色程序。尽管不如上文刚刚描述的有限稀释分析技术精确，但此等程序的劳动密集性小得多且可在相对短的时间范围内提供合理的值。因此，应了解，本领域技术人员可使用流动式细胞测量细胞表面标记概况测定，其使用一或多种结合于本领域中公认的已知针对肿瘤引发细胞富集的细胞表面蛋白质的抗体或试剂(例如PCT申请2012/031280中阐述的可能相容标记，其全部并入本文中)且由此测量来自各种样品的TIC含量。在另一个相容方法中，本领域技术人员可通过使用一或多种能够结合据信可区分此等细胞的细胞表面蛋白质的抗体或试剂的免疫组织化学来计算原位(例如组织切片中)TIC出现率。
应认识到，多种标记(或其不存在)与癌症干细胞的各种群体相关联且用于分离或表征肿瘤细胞亚群。在此方面，例示性癌症干细胞标记物包含OCT4、Nanog、STAT3、EPCAM、CD24、CD34、NB84、TrkA、GD2、CD133、CD20、CD56、CD29、B7H3、CD46、转铁蛋白受体、JAM3、羧肽酶M、ADAM9、抑瘤素M(oncostatinM)、Lgr5、Lgr6、CD324、CD325、巢蛋白(nestin)、Sox1、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、mf2、yy1、smarcA3、smarckA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、(TCF4)SLC7A8、IL1RAP、TEM8、TMPRSS4、MUC16、GPRC5B、SLC6A14、SLC4A11、PPAP2C、CAV1、CAV2、PTPN3、EPHA1、EPHA2、SLC1A1、CX3CL1、ADORA2A、MPZL1、FLJ10052、C4.4A、EDG3、RARRES1、TMEPAI、PTS、CEACAM6、NID2、STEAP、ABCA3、CRIM1、IL1R1、OPN3、DAF、MUC1、MCP、CPD、NMA、ADAM9、GJA1、SLC19A2、ABCA1、PCDH7、ADCY9、SLC39A1、NPC1、ENPP1、N33、GPNMB、LY6E、CELSR1、LRP3、C20orf52、TMEPAI、FLVCR、PCDHA10、GPR54、TGFBR3、SEMA4B、PCDHB2、ABCG2、CD166、AFP、BMP-4、β-索烃素、CD2、CD3、CD9、CD14、CD31、CD38、CD44、CD45、CD74、CD90、CXCR4、修饰素(decorin)、EGFR、CD105、CD64、CD16、CD16a、CD16b、GLI1、GLI2、CD49b及CD49f。参见例如Schulenburg等人,2010,PMID:20185329,U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221，其均以引用的方式并入本文中。此外应了解，上述标记中的每一者在本发明的双特异性或多特异性抗体的情形中亦可用作次要目标抗原。
类似地，与某些肿瘤类型的癌症干细胞相关联的细胞表面表型的非限制性实施例包括CD44hiCD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46hiCD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 hiCD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域中已知的其他癌症干细胞表面表型。参见例如Schulenburg等人,2010,见上文；Visvader等人,2008,PMID:18784658及U.S.P.N.2008/0138313，其均以全文引用的方式并入本文中。本领域技术人员应了解，诸如上文刚刚所例示的标记物表型可结合标准流动式细胞测量分析及细胞分选技术使用以表征、分离、纯化或富集TIC及/或TPC细胞或细胞群体以供进一步分析。本发明所关注的是CD46、CD324及视情况存在的CD66c在许多人类结肠直肠癌(“CR”)、乳癌(“BR”)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、胰腺癌(“PA”)、黑色素瘤(“Mel”)、卵巢癌(“OV”)及头颈部癌(“HN”)肿瘤细胞的表面上高度或异质地表达，不管所分析的肿瘤试样为原发性患者肿瘤试样还是来源于患者的非传统异种移植物(NTX)肿瘤。
使用以上参考的方法中的任一种及本领域中已知的选择标记，可根据本文中的教导对由所揭示的DLL3调节子(包括与细胞毒性剂缀合物的调节子)引起的TIC(或其中TPC)的出现率的降低进行定量。在一些情况下，本发明的化合物可降低使TIC或TPC降低(通过上文说明的多种机制，包括消除、诱导分化、干细胞微环境破坏、静止等)达10％、15％、20％、25％、30％或甚至35％。在其他实施方式中，TIC或TPC的出现率可降低约40％、45％、50％、55％、60％或65％。在某些实施方式中，所揭示的化合物可使TIC或TPC的出现率降低70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％。当然，应了解，TIC或TPC的出现率的任何降低可能引起赘瘤形成的致肿瘤性、持续性、复发及侵袭性相应降低。
IV.细胞结合剂
1.抗体结构
如上文所提及，本发明的尤其优选实施方式包含具有呈抗体或其免疫反应性片段形式的细胞结合剂的DLL3缀合物，其优先与DLL3蛋白质及视情况其他DLL家族成员的同工型的一或多个结构域缔合。在此方面，抗体以及其变体及衍生物(包括认可的命名法及编号系统)已广泛描述于例如Abbas等人(2010),CellularandMolecularImmunology(第6版),W.B.SaundersCompany；或Murphey等人(2011),Janeway’sImmunobiology(第8版),GarlandScience中。
“抗体”或“完整抗体”典型地是指Y形四聚蛋白，其包含两个重(H)多肽链及两个轻(L)多肽链，该等多肽链由共价二硫键及非共价相互作用结合在一起。人类轻链包含可变域(VL)及恒定域(CL)，其中恒定域可基于氨基酸序列及基因座容易地分类为κ或λ。各重链包含一个可变域(VH)及及一个恒定区，该恒定区在IgG、IgA及IgD情况下包含三个名为CH1、CH2及CH3的结构域(IgM及IgE具有第四个结构域CH4)。在IgG、IgA及IgD类别中，CH1及CH2结构域是由可挠性绞链区分离，该可挠性绞链区为具有可变长度(在IgG中通常为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸及半胱氨酸的区段。轻链及重链中的可变域通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区域与恒定域接合，且重链亦具有“D”区域，其具有约10个额外氨基酸。各类别的抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间及链内二硫键。
如本文中所用，术语“抗体”可广泛解释且包括多株抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化及灵长类动物化抗体、CDR接枝抗体、人类抗体、以重组方式产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白质及其变体)、免疫特异性抗体片段(诸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、单链片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修饰，及任何其他免疫反应性分子，只要其呈现与DLL3决定子的优先缔合或结合即可。此外，除非由上下文约束条件说明，否则该术语进一步包含所有类别的抗体(亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有同型(亦即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。对应于不同抗体类别的重链恒定域典型地分别由相应小写希腊字母α、δ、ε、γ及μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定域的氨基酸序列而指定为两种明确相异类型(称为κ及λ)中的一种。
在所选实施方式中且如随附实施例中所示，CL结构域可包含κCL结构域。在其他实施方式中，源抗体可包含λCL结构域。如所有人类IgGCL结构域的序列是公知的，本领域技术人员可根据本发明容易地分析λ及κ序列且使用其提供相容抗体构建体。类似地，处于说明及例示的目的，以下论述及随附实施例将主要表征IgG1(鼠或人)型抗体。与轻链恒定区相同，来自不同同型(IgM、IgD、IgE、IgA)及子类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)的重链恒定域序列是公知的及被表征。因此，本领域技术人员可容易地开发包含任何同型或子类的抗DLL3抗体且如本文中教导使其中每一者与所揭示的PBD结合以产生本发明的抗体药物缀合物。
在不同抗体中，抗体的可变域展示显著的氨基酸组成变化且主要负责抗原识别及结合。各轻链/重链配对的可变区形成抗体结合位点，使得完整IgG抗体具有两个结合位点(亦即其为二价的)。VH及VL结构域包含三个具有极高可变性的区域，其称为高变区，或更通常称为互补决定区(CDR)，其由四个可变性较低的区域(称为构架区(FR))构架及分离。VH区域与VL区域之间的非共价缔合形成Fv片段(对于“可变片段”)，其含有抗体的两个抗原结合位点中的一个。ScFv片段(对于单链可变片段)，其可由遗传工程改造获得，在单一多肽链(由肽连接子分离的抗体的VH区及VL区)中缔合。
如本文中所用，除非另有说明，否则将氨基酸指派至各结构域、构架区域及CDR可根据由以下文献提供的编号方案中的一种来进行：Kabat等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(第5版),USDept.ofHealthandHumanServices,PHS,NIH,NIH出版号91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel编,(2007)HandbookofTherapeuticAntibodies,第3版,Wily-VCHVerlagGmbHandCo.。包含如由Kabat、Chothia及MacCallum定义的CDR的氨基酸残基(如自Abysis网站数据库(见下文)获得)陈述于下文中。
表1
Kabat Chothia MacCallum
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 52-56 47-58
VH CDR3 95-102 95-102 93-101
VL CDR1 24-34 24-34 30-36
VL CDR2 50-56 50-56 46-55
VL CDR3 89-97 89-97 89-96
抗体序列中的可变区及CDR可根据在本领域中已开发的一般规则(如上文陈述，例如Kabat编号系统)或通过将序列针对可变区的数据库比对来鉴别。用于鉴别此等区域的方法描述于Kontermann及Dubel编,AntibodyEngineering,Springer,NewYork,NY,2001及Dinarello等人,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileyandSonsInc.,Hoboken,NJ,2000中。抗体序列的例示性数据库描述于“Abysis”网站,www.bioinf.org.uk/abs(由A.C.Martin,DepartmentofBiochemistry&MolecularBiologyUniversityCollegeLondon,London,England维护)及VBASE2网站,www.vbase2.org(如Retter等人,Nucl.AcidsRes.,33(数据库问题):D671-D674(2005)中描述)中且可由其获得。优选序列是使用Abysis数据库分析，其整合来自Kabat、IMGT及ProteinDataBank(PDB)的数据与来自PDB.的结构数据。参见Dr.AndrewC.R.Martin'sbookchapterProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyVariableDomains.In:AntibodyEngineeringLabManual(Duebel,S.及Kontermann,R.编,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547,亦可自网站bioinforg.uk/abs获得)。Abysis数据库网站进一步包括已开发用于鉴别可根据本文中的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文中阐述的所有CDR均是根据Abysis数据库网站按照Kabat衍生。
对于本发明中论述的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据首先描述于Edelman等人,1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA63(1):78-85中的Eu索引进行，其描述据称为第一个测序的人类IgG1的骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列。Edelman的Eu索引亦阐述于Kabat等人,1991(见上文)中。因此，重链的上下文中的术语“如Kabat中阐述的EU索引”或“Kabat的EU索引”是指基于如Kabat等人,1991(见上文)中阐述的Edelman等人的人类IgG1Eu抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统类似地阐述于Kabat等人,1991中。与本发明相容的例示性κCL及IgG1重链恒定区氨基酸序列是如随附序列表中的SEQIDNO:5及SEQIDNO:6中所阐述。本领域技术人员应了解，可使用标准分子生物学技术使所揭示的恒定区序列与所揭示的重链及轻链可变区接合以产生全长抗体，其可并入本发明的DLL3缀合物中。
本发明的抗体或免疫球蛋白可包含或来源于任何特异性识别任何DLL3决定子或与任何DLL3决定子缔合的抗体。如本文中所用，“决定子”或“靶标”意谓任何可检测的特性、性质、标记或因子，其可与特定细胞、细胞群体或组织相关联地鉴别或特定地在特定细胞、细胞群体或组织之中或之上发现。决定子或靶标在性质上可为形态学、功能性或生物化学且优选为表型。在某些优选实施方式中，决定子为由特定细胞类型或在某些条件下(例如在特定干细胞微环境中的细胞周期或细胞的特定时间点期间)由细胞不同地表达(过表达或表达不足)的蛋白质。为达成本发明的目的，决定子优选不同地表达于异常癌细胞上且可包含DLL3蛋白质或其任一种剪接变体、同工型或家族成员，或其特定结构域、区域或抗原决定基。“抗原”、“免疫原性决定子”、“抗原决定子”或“免疫原”意谓任何在引入免疫活性动物中且由动物的免疫反应产生的抗体识别时可刺激免疫反应的蛋白质(包括DLL3)或其任何片段、区域、结构域或抗原决定基。存在或不存在本文中预期的决定子可用于鉴别细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤、致瘤细胞或CSC)。
如以下实施例所阐述，本发明的所选实施方式包含免疫特异性结合于DLL3的鼠抗体，其可视为“源”抗体。在其他实施方式中，本发明涵盖的抗体可经由源抗体的恒定区或抗原决定基结合氨基酸序列的视情况选用的修饰而自该等“源”抗体获得。在一个实施方式中，若源抗体中的所选氨基酸是经由缺失、突变、取代、整合或组合而改变，则抗体是自源抗体“衍生”。在另一实施方式中，“衍生”抗体为其中源抗体的片段(例如一或多个CDR或整个可变区)与受体抗体序列组合或并入受体抗体序列中以提供衍生物抗体(例如嵌合、CDR接枝或人源化抗体)的抗体。出于各种原因(例如改良对决定子的亲和力；改良细胞培养物中的产量及产率；降低体内免疫原性；降低毒性；促进活性部分的结合；或产生多特异性抗体)，此等“衍生”(例如人源化或CDR接枝)抗体可使用标准分子生物学技术产生。该等抗体亦可通过化学方法或翻译后修饰经由成熟分子(例如糖基化作用模式或聚乙二醇化作用)的修饰自源抗体衍生。
在本发明的情形中，应了解，任一个来源于图3A或图3B中阐述的鼠可变区氨基酸序列的轻链及重链CDR均可根据本发明的教导与受体抗体组合或重新排列以提供最佳化抗人类DLL3(例如人源化或嵌合抗hDLL3)抗体。亦即，可将自图3A中阐述的邻接轻链可变区氨基酸序列或图3B中阐述的邻接重链可变区氨基酸序列(共同为SEQIDNO:21-387，单号)衍生或获得的一或多个CDR并入DLL3调节子中，且尤其在优选实施方式中，并入与一或多个DLL3同工型免疫特异性缔合的CDR接枝或人源化抗体中。该等人源化调节子的“衍生”轻链及重链可变区氨基酸序列的实施例亦阐述于图3A及图3B(SEQIDNO:389-407，单号)中。
在图3A及图3B中，经标注的CDR及构架序列是使用专有Abysis数据库根据Kabat定义。然而，如本文中所论述，本领域技术人员可容易地定义、鉴别、衍生及/或枚举图3A或图3B中阐述的每一个各别重链及轻链序列的CDR，如由Kabat等人、Chothia等人或MacCallum等人所定义。因此，包含由所有该等命名法定义的CDR的每一种标的CDR及抗体均包括于本发明的范围内。更广泛言之，术语“可变区CDR氨基酸残基”或更简单言的，“CDR”包括如使用以上阐述的任何基于序列或结构的方法鉴别的CDR中的氨基酸。在此情形中，图3A及图3B中的例示性人源化抗体的KabatCDR是作为SEQIDNO:408-437提供于随附序列表中。
在其他实施方式中，相容DLL3抗体包含重链及轻链可变区，该等重链及轻链可变区包含与本文中所描述的例示性抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列(人源化及鼠的)，且其中抗体保留本发明的抗DLL3抗体的所需功能性。
举例而言，相容DLL3抗体可包含具有轻链可变区及重链可变区的抗体或其免疫反应性片段，其中该轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列：SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37、SEQIDNO:41、SEQIDNO:45、SEQIDNO:49、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73、SEQIDNO:77、SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:121、SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145、SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:205、SEQIDNO:209、SEQIDNO:213、SEQIDNO:217、SEQIDNO:221、SEQIDNO:225、SEQIDNO:229、SEQIDNO:233、SEQIDNO:237、SEQIDNO:241、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:253、SEQIDNO:257、SEQIDNO:261、SEQIDNO:265、SEQIDNO:269、SEQIDNO:273、SEQIDNO:277、SEQIDNO:281、SEQIDNO:285、SEQIDNO:289、SEQIDNO:293、SEQIDNO:297、SEQIDNO:301、SEQIDNO:305、SEQIDNO:309、SEQIDNO:313、SEQIDNO:317、SEQIDNO:321、SEQIDNO:325、SEQIDNO:329、SEQIDNO:333、SEQIDNO:337、SEQIDNO:341、SEQIDNO:345、SEQIDNO:349、SEQIDNO:353、SEQIDNO:357、SEQIDNO:361、SEQIDNO:365、SEQIDNO:369、SEQIDNO:373、SEQIDNO:377、SEQIDNO:381及SEQIDNO:385，且其中该重链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列：SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31、SEQIDNO:35、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:47、SEQIDNO:51、SEQIDNO:55、SEQIDNO:59、SEQIDNO:63、SEQIDNO:67、SEQIDNO:71、SEQIDNO:75、SEQIDNO:79、SEQIDNO:83、SEQIDNO:87、SEQIDNO:91、SEQIDNO:95、SEQIDNO:99、SEQIDNO:103、SEQIDNO:107、SEQIDNO:111、SEQIDNO:115、SEQIDNO:119、SEQIDNO:123、SEQIDNO:127、SEQIDNO:131、SEQIDNO:135、SEQIDNO:139、SEQIDNO:143、SEQIDNO:147、SEQIDNO:151、SEQIDNO:155、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:167、SEQIDNO:171、SEQIDNO:175、SEQIDNO:179、SEQIDNO:183、SEQIDNO:187、SEQIDNO:191、SEQIDNO:195、SEQIDNO:199、SEQIDNO:203、SEQIDNO:207、SEQIDNO:211、SEQIDNO:215、SEQIDNO:219、SEQIDNO:223、SEQIDNO:227、SEQIDNO:231、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:243、SEQIDNO:247、SEQIDNO:251、SEQIDNO:255、SEQIDNO:259、SEQIDNO:263、SEQIDNO:267、SEQIDNO:271、SEQIDNO:275、SEQIDNO:279、SEQIDNO:283、SEQIDNO:287、SEQIDNO:291、SEQIDNO:295、SEQIDNO:299、SEQIDNO:303、SEQIDNO:307、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:319、SEQIDNO:323、SEQIDNO:327、SEQIDNO:331、SEQIDNO:335、SEQIDNO:339、SEQIDNO:343、SEQIDNO:347、SEQIDNO:351、SEQIDNO:355、SEQIDNO:359、SEQIDNO:363、SEQIDNO:367、SEQIDNO:371、SEQIDNO:375、SEQIDNO:379、SEQIDNO:383及SEQIDNO:387。
在其他实施方式中，VH及/或VL氨基酸序列可与上文阐述的序列65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。具有与上文阐述的序列的VH及VL区具有高(亦即80％或大于80％)同源性的VH及VL区域的抗体可使用标准分子生物学技术获得或衍生。举例而言，如以下表4中所示，如实施例4中阐述的自鼠源抗体衍生的人源化抗体将包含与源抗体的重链及轻链可变区具有约75％至85％同源性的重链及轻链可变区。
如本文中所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比与两个序列之间的同一性百分比等效。两个序列之间的同一性百分比为由序列共有的相同位置的数目的函数(亦即同源性％＝相同位置数目/总位置数目×100)，其考虑实现两个序列的最佳比对所需引入之间隙的数目及各间隙的长度。序列的比较及两个序列之间同一性百分比的测定可使用如以下非限制性实施例中所描述的数学演算法实现。
亦可使用已合并入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers及W.Miller的演算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))、使用PAM120权数残基表、间隙长度处罚12及间隙处罚4来测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可使用已并入GCG软件包(可自www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))演算法、使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵及空隙权重16、14、12、10、8、6或4及长度权重1、2、3、4、5或6来测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
另外或可选地，本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以进行针对公共数据库的搜寻，以便例如鉴别相关序列。该等搜寻可使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质搜寻可通过XBLAST程序、分数＝50、字长＝3进行以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得间隙比对以用于比较目的，可如Altschul等人,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所描述利用GappedBLAST。当利用BLAST及GappedBLAST程序时，可使用各程序(例如XBLAST及NBLAST)的默认参数。
2.抗体产生
a.多株抗体
在各种宿主动物(包括兔、小鼠、大鼠等)中产生多株抗体在本领域中是公知的。在一些实施方式中，含有多株抗DLL3抗体的血清是通过使动物出血或处死动物而获得。血清可以自动物获得的形式用于研究目的，或在替代例中，抗DLL3抗体可经部分或完全纯化以提供免疫球蛋白部分或均质性抗体制剂。
简言之，用DLL3免疫原(例如可溶性DLL3或sDLL3)(其可例如包含所选同工型、结构域及/或肽)或表达DLL3或其免疫反应性片段的活细胞或细胞制剂使所选动物免疫。视接种的物种而定，本领域中已知的可用于提高免疫学反应的佐剂包括(但不限于)弗氏(Freund's)(完全及不完全)佐剂、矿物质凝胶(诸如氢氧化铝)、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂)、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔螺血氰蛋白、二硝基酚及可能有效的人类佐剂，诸如BCG(卡介苗(bacilleCalmette-Guerin))及小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)。该等佐剂可保护抗原免于因在局部沉积中螯合而快速分散，或其可含有刺激宿主分泌针对巨噬细胞及免疫系统的其他组分具有趋化性的因子的物质。免疫程序优选将涉及经预定时间周期进行的所选免疫原的两次或更多次施用。
可分析如图1中所示的DLL3蛋白质的氨基酸序列以选择用于产生抗体的DLL3蛋白质的特异性区域。举例而言，使用DLL3氨基酸序列的疏水性及亲水性分析来鉴别DLL3结构中的亲水性区域。DLL3蛋白质中展示免疫原性结构的区域以及其他区域及结构域可使用本领域中已知的各种其他方法容易地鉴别，诸如舒-法斯曼(Chou-Fasman)、加尼尔-罗布森(Garnier-Robson)、凯特-杜立德(Kyte-Doolittle)、埃森伯格(Eisenberg)、卡普拉斯-舒尔茨(Karplus-Schultz)或詹姆士-沃夫(Jameson-Wolf)分析。平均可挠性概况可使用BhaskaranR.,PonnuswamyP.K.,1988,Int.J.Pept.ProteinRes.32:242-255的方法产生。β-转角(Beta-turn)概况可使用Deleage,G.,RouxB.,1987,ProteinEngineering1:289-294的方法产生。因此，由此等程序或方法中的任一者鉴别的各DLL3区域、结构域或基序均属于本发明的范围且可经分离或工程改造以提供免疫原，从而产生包含所需性质的调节子。用于产生DLL3抗体的优选方法进一步由本文中提供的实施例说明。用于制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法在本领域中是公知的。本领域中亦熟知用于制备蛋白质与载体(诸如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性缀合物的方法。在一些情况下，使用直接结合，其使用例如碳化二亚胺试剂；在其他情况下，连接试剂可为有效的。如在本领域中理解，DLL3免疫原的施用通常通过经合适时间周期的注射且使用合适佐剂进行。在免疫程序期间，可如以下实施例中所描述获得抗体的滴度以确定抗体形成的适当性。
b.单克隆抗体
此外，本发明涵盖单克隆抗体的应用。如本领域中已知，术语“单克隆抗体”(或mAb)是指自基本上均质性抗体的群体(亦即组成该群体的个别抗体除可能少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外为相同的)获得的抗体。在某些实施方式中，该单克隆抗体包括包含与抗原结合或缔合的多肽序列的抗体，其中抗原结合多肽序列是通过包括自多个多肽序列选择单一目标结合多肽序列的方法获得。
一般而言且如本文中的实施例中所阐述，单克隆抗体可使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如)或其某一组合。举例而言，单克隆抗体可使用杂交瘤及本领域中公认的生物化学及遗传工程技术产生，诸如以下文献中更详细地描述，其均以全文引用的方式并入本文中：An,Zhigiang(编)TherapeuticMonoclonalAntibodies:FromBenchtoClinic,JohnWileyandSons,第1版2009；Shire等人(编)CurrentTrendsinMonoclonalAntibodyDevelopmentandManufacturing,SpringerScience+BusinessMediaLLC,第1版2010；Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版1988；Hammerling等人,in:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。应理解，可进一步改变所选结合序列例如以改良对靶标的亲和力、人源化目标结合序列、改良其在细胞培养物中的产量、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，且包含经改变的目标结合序列的抗体亦为本发明的抗体。
c.嵌合及人源化抗体
在另一实施方式中，本发明的抗体可包含来源于共价接合蛋白质区段的嵌合抗体，该等共价接合蛋白质区段是来自至少两个不同物种或类别的抗体。术语“嵌合”抗体是关于满足以下条件的构建体：其中一部分重链及/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体以及该等抗体的片段中的相应序列相同或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人,1984,PMID:6436822)。
在一个实施方式中，嵌合抗体可包含鼠VH及VL氨基酸序列以及来源于人类来源的恒定区，例如如下文描述的人源化抗体。在一些实施方式中，抗体可为“CDR接枝”抗体，其中该抗体包含一或多个来自特定物种或属于特定抗体类别或子类的CDR，而抗体链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列一致或同源。对于在人类中使用，可将所选啮齿动物CDR(例如小鼠CDR)接枝至人类抗体中，置换人类抗体中一或多个天然存在的CDR。此等构建体通常具有提供完全强度抗体功能(例如补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))同时降低个体对抗体的不良免疫反应的优点。
“人源化”抗体与CDR接枝抗体类似。如本文中所用，非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含来源于一或多个非人类免疫球蛋白的氨基酸序列。在一个实施方式中，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体或接受体抗体)，其中来自受体的一或多个CDR的残基由来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的一或多个CDR的残基置换。在某些优选实施方式中，人免疫球蛋白的可变域中的一或多个FR中的残基由来自供体抗体的相应非人类残基置换，以便帮助保持接枝CDR的适当三维构型且由此改良亲和力。此可称为引入“回复突变”。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基以例如进一步改进抗体效能。
可使用各种来源以确定在人源化抗体中使用何种人类序列。该等来源包括人类生殖系序列，例如Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today16:237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBOJ14:4628-4638中所揭示；V-BASE目录(VBASE2-Retter等人,NucleicAcidRes.33；671-674,2005)，其提供人免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(由Tomlinson,I.A.等人编译,MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK)；或共同人类FR，例如U.S.P.N.6,300,064中所描述。
CDR接枝及人源化抗体描述于例如U.S.P.N.6,180,370及5,693,762中。关于其他细节，参见例如Jones等人,1986,PMID:3713831；及U.S.P.N.6,982,321及7,087,409。
另一方法称为“人类工程改造(humaneering)”，其描述于例如U.S.P.N.2005/0008625中。在另一实施方式中，非人类抗体可由人类T细胞抗原决定基的特定缺失或通过WO98/52976及WO00/34317中揭示的方法进行“去免疫”来修饰。
如上文所论述，在所选实施方式中，至少60％、65％、70％、75％或80％人源化或CDR接枝抗体重链或轻链可变区氨基酸残基将与受体人类序列的重链或轻链可变区氨基酸残基相对应。在其他实施方式中，至少83％、85％、87％或90％人源化抗体可变区残基将与受体人类序列的可变区残基相对应。在另一优选实施方式中，每一个人源化抗体可变区中的超过95％的部分将与接受者人类序列相对应。
人源化抗体可变区与人类受体可变区的序列同一性或同源性可如先前所论述来确定，且当以此方式测量时，优选共有至少60％或65％序列同一性，更佳至少70％、75％、80％、85％或90％序列同一性，甚至更佳至少93％、95％、98％或99％序列同一性。优选地，不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守性氨基酸取代”为其中氨基酸残基通过具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代者。一般而言，保守性氨基酸取代应实质上不改变蛋白的功能特性。在两个或两个以上氨基酸序列的保守性取代彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似度可上调以校正取代的保守性质。
d.人类抗体
在另一实施方式中，抗体可包含完全人类抗体。术语“人类抗体”是指具有与由人类产生及/或使用任一种用于产生人类抗体的技术产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。
人类抗体可使用本领域中已知的各种技术产生。一种技术为噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选人类)抗体的文库，用相关抗原或其抗体结合部分筛选文库，且分离结合抗原的噬菌体，由此可获得免疫反应性片段。用于制备及筛选该等文库的方法在本领域中是公知的，且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如Pharmacia重组型噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。亦存在其他可用于产生及筛选抗体呈现文库的方法及试剂(参见例如U.S.P.N.5,223,409；PCT公开案第WO92/18619号、第WO91/17271号、第WO92/20791号、第WO92/15679号、第WO93/01288号、第WO92/01047号、第WO92/09690号；及Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982(1991))。
在一个实施方式中，可通过筛选如上制备的重组型组合抗体文库来分离重组型人类抗体。在一个实施方式中，文库为scFv噬菌体展示文库，其是使用人类VL及VHcDNA产生。该等人类VL及VHcDNA是由自B细胞分离的mRNA制备。
由未经处理的文库(天然或合成)产生的抗体可具有中等亲和力(Ka为约106M-1至107M-1)，但如本领域中所描述，亲和力成熟亦可通过自二级文库构筑及重新选择来体外模仿。举例而言，可通过使用易错聚合酶体外随机引入突变(Leung等人,Technique,1:11-15(1989)中报道)。此外，可通过例如用具有跨越所关注的CDR的随机序列的引物、使用PCR在所选个别Fv克隆中使一或多个CDR随机突变且筛选较高亲和力克隆来进行亲和力成熟。WO9607754描述用于诱导免疫球蛋白轻链的CDR中的突变诱发以产生轻链基因的文库的方法。另一有效方法是将噬菌体展示所选择的VH域或VL域与获自未免疫供者的天然存在V域变体谱系重组且在若干轮链改组中针对较高亲和力进行筛选，如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术允许产生解离常数KD(koff/kon)为约10-9M或更小的抗体及抗体片段。
在其他实施方式中，可使用包含在表面上表达结合对的真核细胞(例如酵母)的文库来使用类似程序。参见例如U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一个实施方式中，人类抗体是选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人类抗体(Vaughan等人NatureBiotechnology14:309-314(1996)；Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6157-6162(1998))。在其他实施方式中，人类结合对可自诸如酵母的真核细胞中所产生的组合性抗体文库分离。参见例如U.S.P.N.7,700,302。该等技术有利地允许筛选大量候选调节子且可相对容易地操作候选序列(例如通过亲和力成熟或重组型改组)。
人类抗体亦可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如小鼠)中来产生，该等转基因动物中的内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人免疫球蛋白基因。在攻击时，观察人类抗体产生，其在各方面均密切地类似于人类中所见，包括基因重排、组装及抗体谱系。此方法描述于例如与技术有关的U.S.P.N.5,545,807；U.S.P.N.5,545,806；U.S.P.N.5,569,825；U.S.P.N.5,625,126；U.S.P.N.5,633,425；U.S.P.N.5,661,016以及U.S.P.N.6,075,181及U.S.P.N.6,150,584；以及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中。或者，人类抗体可经由使产生针对目标抗原的抗体的人类B-淋巴细胞(该等B淋巴细胞可自罹患赘生性病症的个体回收或可在体外进行免疫接种)永生化来制备。参见例如Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。
3.抗体的重组型产生
抗体及其片段可使用自抗体产生细胞获得的遗传物质及重组技术产生或修饰(参见例如Berger及Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology第152卷AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA；Sambrook及Russell(编)(2000)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版),NY,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel等人(2002)ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2006年增刊)；及U.S.P.N.7,709,611)。
更具体而言，本发明的另一方面是关于编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯形式存在。当核酸通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl结合、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳及本领域中熟知的其他技术)自其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化时，其是“经分离”或“变成基本上纯的”。本发明的核酸可为例如DNA或RNA，且可能含有或可能不含有内含子序列。更一般而言，如本文中所用的术语“核酸”包括基因组DNA、cDNA、RNA及其人工变体(例如肽核酸)(无论单股或双股)。在优选实施方式中，核酸为cDNA分子。
本发明的核酸可使用标准分子生物学技术获得。对于经杂交瘤(例如下文中进一步描述的由带有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，编码由该杂交瘤制备的抗体的轻链及重链的cDNA可经由标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于自免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，编码抗体的核酸可自文库回收。
一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段，该等DNA片段可进一步通过标准重组DNA技术处理，例如以使该等可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，使编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段，诸如抗体恒定区或可挠性连接子。如上下文中所用的术语“可操作地连接”欲意谓接合该等两个DNA片段以便使由两个DNA片段编码的氨基酸序列在框架中保留。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至另一编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子而将编码VH区的经分离DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版号91-3242)且涵盖该等区域的DNA片段可由标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最佳为IgG1或IgG4恒定区。如下文更详细论述，与本文中的教导相容的例示性IgG1恒定区是作为SEQIDNO:6阐述于随附序列表中。对于Fab片段重链基因而言，可将编码VH的DNA可操作性连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可通过使VL编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子可操作地连接将编码VL区的经分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版号91-3242)且涵盖此等区域的DNA片段可由标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但最佳为κ恒定区。在此方面中，例示性相容κ轻链恒定区是作为SEQIDNO:5阐述于随附序列表中。
本发明亦提供包含上述该等核酸的载体，其可操作地连接至启动子(参见例如WO86/05807；WO89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)；以及真核生物的分泌途径的其他转录调节及处理控制元件。本发明亦提供具有该等载体及宿主表达系统的宿主细胞。
如本文中所用，术语“宿主表达系统”包括任何类型的可经工程改造以产生本发明的核酸或多肽及抗体的细胞系统。该等宿主表达系统包括(但不限于)经重组型噬菌体DNA或质体DNA转化或转染的微生物(例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经重组型酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属(Saccharomyces))；或具有重组型表达构建体的哺乳动物细胞(例如COS、CHO-S、HEK-293T、3T3细胞)，该等重组型表达构建体含有来源于哺乳动物细胞或病毒的基因组的启动子(例如腺病毒晚期启动子)。宿主细胞可经两种表达载体共转染，例如第一载体编码重链衍生的多肽且第二载体编码轻链衍生的多肽。
转化哺乳动物细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如U.S.P.N.4,399,216、U.S.P.N.4,912,040、U.S.P.N.4,740,461及U.S.P.N.4,959,455。宿主细胞亦可经工程改造以允许产生具有各种特征的抗原结合分子(例如经修饰的具有GnTIII活性的糖形或蛋白质)。
为以长期高产率产生重组蛋白质，稳定表达为优选。因此，稳定表达所选抗体的细胞系可使用本领域中认可的标准技术工程改造且形成本发明的一部分。宿主细胞可经受适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺嘌呤位点等)调控的DNA及可选标记物转化，而非使用含有病毒复制起点的表达载体。可使用本领域中熟知的任一种选择系统，包括谷氨酰胺合酶基因表达系统(GS系统)，其提供用于在某些条件下增强表达的有效方法。GS系统是完全或部分结合EP0216846、EP0256055、EP0323997及EP0338841以及U.S.P.N.5,591,639及U.S.P.N.5,879,936而论述。另一种用于开发稳定细胞系的优选表达系统为FreedomTMCHO-S试剂盒(LifeTechnologies)。
一旦通过重组型表达或任何其他所揭示的技术产生本发明的抗体，其可由本领域中已知的方法纯化或分离，意谓其经鉴别且自其天然环境分离及/或回收且与将妨碍抗体的诊断或治疗性用途的污染物分离。经分离的抗体包括重组型细胞内的原位抗体。
此等经分离的制剂可使用本领域中认可的各种技术纯化，诸如离子交换及尺寸排阻层析、透析、渗滤及亲和层析，尤其为蛋白质A或蛋白质G亲和层析。
4.产生后选择
不管如何获得，抗体产生细胞(例如杂交瘤、酵母群落等)可针对所需特征(包括例如稳定生长、高抗体产量及所需抗体特征，诸如针对相关抗原的高亲和力)而经选择、克隆及进一步筛选。杂交瘤可在细胞培养物中体外扩增或可在同基因无免疫应答的动物中体内扩增。选择、克隆及扩增杂交瘤及/或群落的方法已为一般本领域技术人员所熟知。一旦鉴别所需抗体，则可使用常用、本领域中认可的分子生物学及生物化学技术分离、操作及表达相关遗传物质。
由未经处理的文库产生的抗体(或天然或合成)可具有中等亲和力(Ka为约106M-1至107M-1)。为增强亲和力，可通过构筑抗体文库(例如通过使用易错聚合酶体外引入随机突变)及自该等二级文库选择针对抗原具有高亲和力的抗体(例如通过使用噬菌体或酵母呈现)来体外模仿亲和力成熟。WO9607754描述用于诱导免疫球蛋白轻链的CDR中的突变诱发以产生轻链基因的文库的方法。
可使用多种技术选择抗体，包括(但不限于)噬菌体或酵母呈现，其中在噬菌体或酵母上合成人类组合抗体或scFv片段的文库，用相关抗原或其抗体结合部分筛选文库，及分离结合抗原的噬菌体或酵母，由此可获得抗体或免疫反应性片段(Vaughan等人,1996,PMID:9630891；Sheets等人,1998,PMID:9600934；Boder等人,1997,PMID:9181578；Pepper等人,2008,PMID:18336206)。用于产生噬菌体或酵母呈现文库的试剂盒是可商购的。亦存在其他可用于产生及筛选抗体呈现文库的方法及试剂(参见U.S.P.N.5,223,409；WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690；及Barbas等人,1991,PMID:1896445)。该等技术有利地允许筛选大量候选抗体且提供相对容易的序列操作(例如通过重组型改组)。
5.抗体片段及衍生物
a.片段
无论选择何种形式的调节子(例如嵌合、人源化等)实践本发明，应了解，均可根据本文中的教导使用其免疫反应性片段。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如本文中所用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其免疫特异性结合于所选抗原或免疫原性决定子或与所选抗原或免疫原性决定子反应或与衍生该等片段的完整抗体就特异性抗原结合而竞争。
例示性片段包括：VL、VH、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单域抗体片段、双功能抗体、线抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，活性片段包含一部分抗体，该部分抗体保留其与抗原/底物或受体相互作用且以与完整抗体类似的方式(尽管效率可能稍微较低)修饰抗原/底物或受体的能力。
在其他实施方式中，抗体片段为包含Fc区域且保留当以完整抗体形式存在时通常与Fc区域相关联的生物功能(诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合)中的至少一种的片段。在一个实施方式中，抗体片段为单价抗体，其具有与完整抗体实质上类似的体内半衰期。举例而言，该抗体片段可包含连接至能够赋予片段体内稳定性的Fc序列的抗原结合臂。
如本领域技术人员将公认，可经由完整或完全抗体的化学或酶促处理(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或通过重组型方法获得片段。关于抗体片段的更详细描述，参见例如FundamentalImmunology,W.E.Paul编,RavenPress,N.Y.(1999)。
b.多价抗体
在一个实施方式中，本发明的调节子可为单价或多价(例如二价、三价等)。如本文中所用，术语“效价”是指与抗体相关联的潜在目标结合位点的数目。各目标结合位点特异性结合一个目标分子或目标分子上的特定位置或基因座。当抗体为单价时，分子的各结合位点将特异性结合于单一抗原位置或抗原决定基。当抗体包含一个以上目标结合位点(多价)时，各目标结合位点可特异性结合同一个或不同分子(例如可结合于不同配体或不同抗原，或同一个抗原上的不同抗原决定基或位置)。参见例如U.S.P.N.2009/0130105。在各种情况下，至少一个结合位点将包含与DLL3同工型相关联的抗原决定基、基序或结构域。
在一个实施方式中，调节子为双特异性抗体，其中两个链具有不同特异性，如Millstein等人,1983,Nature,305:537-539中所描述。其他实施方式包括具有其他特异性的抗体，诸如三特异性抗体。其他更复杂的相容多特异性构建体及其制造方法阐述于U.S.P.N.2009/0155255以及WO94/04690；Suresh等人,1986,MethodsinEnzymology,121:210；及WO96/27011中。
如上文所提及，多价抗体可免疫特异性结合于所需目标分子的不同抗原决定基，或可免疫特异性结合于目标分子以及异源抗原决定基，诸如异源多肽或固体载体物质。尽管抗DLL3抗体的优选实施方式仅结合两个抗原(亦即双特异性抗体)，但本发明亦涵盖具有其他特异性的抗体(诸如三特异性抗体)。双特异性抗体亦包括交联或“异缀合物”抗体。举例而言，异缀合物中的抗体中的一者可与抗生物素蛋白偶合，另一者与生物素偶合。举例而言，已提出该等抗体使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373及EP03089)。异缀合物抗体可使用任何便利的交联方法制备。合适交联剂以及多种交联技术在本领域中是公知的，且揭示于U.S.P.N.4,676,980中。
在其他实施方式中，使用一般本领域技术人员熟知的方法使具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列(诸如包含铰链、CH2及/或CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定域)融合。
c.Fc区修饰
除上文阐述的所揭示的抗体的可变区或结合区的各种修饰、取代、添加或缺失以外，本领域技术人员应了解，本发明的所选实施方式亦可包含恒定区(亦即Fc区)的取代或修饰。更具体而言，预期本发明的DLL3调节子可尤其含有一或多种其他氨基酸残基取代、突变及/或修饰，其产生具有优选特征的化合物，该等特征包括(但不限于)：药物动力学改变、血清半衰期延长、结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、Fc配体与Fc受体(FcR)的结合改变、增强或降低的“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或“CDC”(补体依赖性细胞毒性)活性、改变的糖基化作用及/或二硫键及经改良的结合特异性。在此方面，应了解，此等Fc变体可有利地用于增强所揭示的调节子的有效抗赘生性质。
为此，本发明的某些实施方式可包含Fc区的取代或修饰，例如添加一或多种氨基酸残基、取代、突变及/或修饰以用于产生具有增强或优选Fc效应子功能的化合物。举例而言，与Fc结构域与Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之间的相互作用有关的氨基酸残基的变化可引起细胞毒性增加及/或药物动力学改变，诸如血清半衰期延长(参见例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods4:25-34(1994)；及deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)，其均以引用的方式并入本文中)。
在所选实施方式中，可通过修饰(例如取代、删除或添加)经鉴别与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用有关的氨基酸残基来产生体内半衰期延长的抗体(参见例如国际公开案第WO97/34631号；第WO04/029207号；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。关于该等实施方式，Fc变体在哺乳动物(优选为人类)中的半衰期可大于5天、大于10天、大于15天、优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。半衰期延长可引起较高血清效价，其因此降低抗体的施用频率及/或降低所施用的抗体的浓度。可在例如转基因小鼠或经转染的表达人类FcRn的人类细胞系中，或在接受具有变异型Fc区的多肽的施用的灵长类动物中分析体内与人类FcRn的结合及人类FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO2000/42072描述与FcRn的结合改良或减少的抗体变体。亦参见例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在其他实施方式中，Fc变化可引起ADCC或CDC活性增强或降低。如本领域中已知，CDC是指目标细胞在补体存在下的溶解，且ADCC是指细胞毒性的一种形式，其中结合于某些细胞毒素细胞(例如自然杀手细胞、嗜中性白血球及巨噬细胞)上的FcR上的所分泌的Ig使此等细胞毒素效应细胞能够特异性结合于负载抗原的目标细胞且接着杀死具有细胞毒素的目标细胞。在本发明的情形中，抗体变体具有“改变”的FcR结合亲和力，其与亲本或未经修饰的抗体或包含原生序列FcR的抗体相比为增强或降低的结合。该等显示降低的结合的变体可具有极少或不具有可感知的结合，例如与FcR的结合为原生序列的0-20％，例如由本领域中熟知的技术测定。在其他实施方式中，与原生免疫球蛋白Fc结构域相比，变体将呈现增强的结合。应了解，该等类型的Fc变体可有利地用于增强所揭示的抗体的有效抗赘生性质。在其他实施方式中，该等变化引起结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、糖基化作用改变及/或二硫键(例如对于结合位点)、改良的结合特异性、吞噬作用增加；及/或细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
d.糖基化作用改变
其他实施方式包含一或多种经工程改造的糖形，亦即包含改变的糖基化作用模式或改变的碳水化合物组成的DLL3调节子，其共价连接至蛋白质(例如在Fc结构域中)。参见例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。经工程改造的糖形可适用于多种目的，包括(但不限于)增强或降低效应子功能、增加调节子对目标的亲和力或促进调节子产生。在某些需要降低效应子功能的实施方式中，分子可经工程改造以表达糖基化形式。已熟知可引起消除一或多个可变区构架糖基化作用位点由此消除该位点处的糖基化作用的取代(参见例如U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。相反，可通过在一或多个其他糖基化作用位点处进行工程改造来赋予含有Fc的分子增强的效应子功能或改良的结合。
其他实施方式包括Fc变体，其具有改变的糖基化组成，诸如具有降低的海藻糖基残基量的次海藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNAc结构的抗体。已证明该等改变的糖基化作用模式可增加抗体的ADCC能力。经工程改造的糖形可由本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用经工程改造或变异型表达品系、通过与一或多种酶(例如N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTI11))共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子或通过在包含Fc区的分子经表达后修饰碳水化合物(参见例如WO2012/117002)。
e.其他处理
调节子可在产生期间或产生后经不同修饰，例如通过糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用、酰胺化作用、由已知保护基/封端基团进行的衍生作用、蛋白水解分裂、与抗体分子或其他细胞配体连接等。多种化学修饰中的任一种均可通过已知技术进行，包括(但不限于)由溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行的特异性化学裂解；乙酰化作用；甲酰化作用；氧化；还原；在衣霉素存在下的代谢性合成等。
本发明亦涵盖各种翻译后修饰，包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链、N端或C端的处理、化学部分与氨基酸基序的连接、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰以及由原核宿主细胞表达引起的N端甲硫氨酸残基的添加或缺失。此外，调节子亦可经可检测的标记(诸如酶、荧光、放射性同位素或亲和标记)修饰以允许检测及分离调节子。
6.抗体特征
无论调节子是以何种方式获得或其呈上述哪一种形式，所揭示的调节子的各种实施方式均可呈现某些特征。在所选实施方式中，可针对有利性质来选择、克隆及进一步筛选抗体产生细胞(例如杂交瘤或酵母群落)，该等有利性质包括例如稳定生长、高调节子产量及如下文更详细论述，所需调节子特征。在其他情况下，可通过针对动物的接种选择特定抗原(例如特异性DLL3同工型)或目标抗原的免疫反应性片段来赋予或影响调节子的特征。在其他实施方式中，所选调节子可如上文所描述经工程改造以增强或改进免疫化学特征，诸如亲和力或药物动力学。
a.中和抗体
在某些实施方式中，缀合物将包含“中和”抗体或其衍生物或片段。亦即，本发明可包含抗体分子，其结合特定结构域、基序或抗原决定基且能够阻断、降低或抑制DLL3的生物活性。更一般而言，术语“中和抗体”是指满足以下条件的抗体：其结合于目标分子或配体或与目标分子或配体相互作用且阻止目标分子与结合配偶体(诸如受体或底物)的结合或缔合，由此中断生物反应，否则该生物反应将由分子的相互作用引起。
应了解，可使用本领域中已知的竞争性结合分析法评估抗体或其免疫功能性片段或衍生物的结合及特异性。在本发明中，当过量的抗体使结合于DLL3的结合配偶体的量降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99％以上时(如例如由洛奇受体活性或在体外竞争性结合分析法中测量)，本发明抗体或片段将保持抑制或降低DLL3与结合配偶体或底物的结合。在例如针对DLL3的抗体的情况下，中和抗体或拮抗剂将优选使洛奇受体的活性改变达至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99％以上。应了解，此改良的活性可使用本领域中认可的技术直接测量或可由活性改变对下游的影响(例如肿瘤发生、细胞存活或洛奇反应基因的活化或抑制)来测量。抗体中和DLL3活性的能力优选是通过抑制DLL3与洛奇受体的结合来评估或通过抗体缓解DLL3介导的洛奇信号传导的抑制的能力来评估。
b.内化抗体
有证据表明大部分经表达的DLL3蛋白质保持与致瘤细胞表面缔合，由此允许所揭示的调节子的局部化及内化作用。在优选实施方式中，该等调节子可与抗癌症剂(诸如在内化时杀死细胞的细胞毒素部分)缔合或结合。在尤其优选实施方式中，调节子将包含内化抗体药物缀合物。
如本文中所用，“内化”调节子为在与相关抗原或受体结合时由细胞吸收(以及任何有效负载)的调节子。如将了解，在优选实施方式中，内化调节子可包含抗体以及抗体缀合物，该抗体包括抗体片段及其衍生物。内化作用可在体外或体内发生。对于治疗性应用，内化作用将优选在有需要的个体中在体内发生。内化的抗体分子的数目可充分或足以杀死表达抗原的细胞，尤其表达抗原的癌症干细胞。视抗体或抗体缀合物的效能而定，在一些情况下，细胞中吸收单一抗体分子足以杀死抗体结合的目标细胞。举例而言，某些毒素的有效性很高，使得少量的与抗体结合的毒素的分子的内化作用便足以杀死肿瘤细胞。可通过本领域中认可的分析法(包括以下实施例中描述的分析法)确定抗体在与哺乳动物细胞结合时是否内化。检测抗体是否内化于细胞中的方法亦描述于U.S.P.N.7,619,068中，其以全文引用的方式并入本文中。
c.消耗抗体
在其他实施方式中，抗体将包含消耗抗体或其衍生物或片段。术语“消耗”抗体是指优选与细胞表面上或附近的抗原结合或缔合且诱导、促进或引起细胞的死亡或消除(例如通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的抗体。在一些实施方式中，所选消耗抗体将与细胞毒性剂缔合或结合。
优选消耗抗体将能够移除、消除或杀死预定细胞群体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％DLL3致瘤细胞或使其失能。在一些实施方式中，细胞群体可包含经浓缩、切片、纯化或分离的肿瘤永续细胞。在其他实施方式中，细胞群体可包含完全肿瘤样品或异源肿瘤提取物，该等提取物包含肿瘤永续细胞。本领域技术人员应了解，如以下实施例(例如实施例8至10)中所描述的标准生物化学技术可用于根据本文中的教导监测及定量致瘤细胞或肿瘤永续细胞的消耗。
d.分仓及抗原决定基作图
应进一步了解，所揭示的抗DLL3抗体调节子将与由所选目标或其片段呈现的离散抗原决定基或免疫原性决定子缔合或结合。在某些实施方式中，抗原决定基或免疫原性决定子包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方式中，可具有特定三维结构特征及/或比电荷特征。因此，如本文中所用，术语“抗原决定基”包括任何能够特异性结合于免疫球蛋白或T细胞受体或以其他方式与分子相互作用的蛋白质决定子。在某些实施方式中，当抗体优先识别蛋白质及/或巨分子的复杂混合物中的其目标抗原时，则认为抗体与抗原特异性结合(或免疫特异性结合或反应)。在优选实施方式中，当平衡解离常数(KD)小于或等于10-6M或小于或等于10-7M，更佳当平衡解离常数小于或等于10-8M，且甚至更佳当解离常数小于或等于10-9M时，认为抗体与抗原特异性结合。
更直接的是，术语“抗原决定基”是以其常用生物化学含义使用且是指目标抗原中能够由特定抗体调节子识别及特异性结合的部分。当抗原为多肽(诸如DLL3)时，抗原决定基通常可由邻接氨基酸及由于蛋白质的三级折叠而相邻的非接触氨基酸形成(“构象抗原决定基”)。在该等构象抗原决定基中，存在跨越蛋白质上氨基酸残基的相互作用点，该等相互作用点彼此线性分离。由邻接氨基酸形成的抗原决定基(有时称为“线状”或“连续”抗原决定基)通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的抗原决定基通常在蛋白质变性时损失。在任何情况下，抗体抗原决定基在唯一空间构象中典型地包括至少3个、且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
在此方面中，应了解，在某些实施方式中，抗原决定基可与DLL3蛋白质的一或多个区域、结构域或基序(例如同工型1的氨基酸1-618)缔合或驻留于其中。如本文中更详细论述，DLL3蛋白质的细胞外区域包含一系列通常经识别的结构域，包括六个EGF样结构域及DSL结构域。为达成本发明的目的，术语“结构域”将根据其公认含义使用且将始终指蛋白质内的可识别或可定义的保守性结构实体，其呈现独特的二级结构含量。在许多情况下，具有共同功能的同源结构域将通常展示序列相似性且可在多种不同蛋白质中发现(例如EGF样结构域据称可在至少471种不同蛋白质中发现)。类似地，本领域中认可的术语“基序”将根据其常用含义使用且应通常指蛋白质的短的、保守性区域，其典型地具有十至二十个邻接氨基酸残基。如本文中所论述，所选实施方式包含调节子，其与DLL3的特定区域、结构域或基序内的抗原决定基缔合或结合。
在任何情况下，一旦确定抗原上的所需抗原决定基，则可产生针对该抗原决定基的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含抗原决定基的肽进行免疫。或者，在发现过程期间，抗体的产生及表征可说明与位于特定结构域或基序中的所需抗原决定基有关的信息。由此信息，则可针对与相同抗原决定基的结合来以竞争方式筛选出抗体。一种实现此目的的方法为进行竞争研究，从而发现彼此竞争性结合的抗体，亦即抗体竞争结合抗原。用于基于抗体的交叉竞争而对抗体进行分仓的高通量过程描述于WO03/48731中。其他分仓或结构域含量或抗原决定基定位的方法(包含调节子竞争或酵母上的抗原片段表达)阐述于以下实施例中。
如本文中所用，术语“分仓(binning)”是指用于基于抗体的抗原结合特征及竞争而将抗体分组或分类的方法。尽管该等技术适用于对本发明的调节子进行定义及分类，但分仓并非始终与抗原决定基直接相关且该等抗原决定基结合的初始测定可由本文中所描述的本领域中认可的其他方法改进及证实。然而，如以下实施例中论述及展示，凭经验将抗体调节子分配至各个仓室可提供可指示所揭示的调节子的治疗潜力的信息。
更具体而言，可使用本领域中已知及本文中的实施例中阐述的方法确定所选参考抗体(或其片段)是否结合于相同抗原决定基或交叉竞争结合第二测试抗体(亦即处于相同仓室)。在一个实施方式中，参考抗体调节子与DLL3抗原在饱和条件下缔合，且接着使用标准免疫化学技术测定二级或测试抗体调节子结合于DLL3的能力。若测试抗体能够实质上与参考抗DLL3抗体同时结合于DLL3，则与初级或参考抗体相比，二级或测试抗体结合于不同抗原决定基。然而，若测试抗体不能实质上同时结合于DLL3，则测试抗体结合于相同抗原决定基、重叠抗原决定基或与由初级抗体结合的抗原决定基紧邻(至少位阻上)的抗原决定基。亦即，测试抗体就抗原结合进行竞争且与参考抗体处于同一仓室。
当在所揭示的调节子的情形中使用时，术语“竞争”或“竞争抗体”意谓抗体之间的竞争，如由其中测试抗体或所测试的免疫功能性片段阻止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的分析法所测定。通常，该分析法涉及使用经纯化的结合于固体表面或载有该等物质中的任一者的抗原(例如DLL3或其结构域或片段)、未经标记的测试免疫球蛋白及经标记的参考免疫球蛋白。通过在测试免疫球蛋白存在下测定结合于固体表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白是以过量存在及/或允许首先结合。由竞争分析法鉴别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合于同一抗体决定基的抗体，及与由参考抗体结合的抗体决定基足够近的相邻抗体决定基结合从而发生位阻的抗体。关于测定竞争性结合的方法的其他细节提供于本文实施例中。通常，当竞争抗体以过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些实施例中，结合受抑制达至少80％、85％、90％、95％或97％或97％以上。
相反，当参考抗体被结合时，其优选抑制随后添加的测试抗体(亦即DLL3调节子)的结合达至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些实施例中，测试抗体的结合受抑制达至少80％、85％、90％、95％或97％或97％以上。
在本发明中且如以下实施例中所阐述，已测定(经由表面等离振子共振或生物层干涉测量术)DLL3的细胞外结构域由竞争性结合定义至少九个仓室，本文中称为“仓室A”至“仓室I”。鉴于由调节子分仓技术提供的解析，相信该九个仓室包含DLL3蛋白质的细胞外区域中的大部分仓室。
在此方面中，且如本领域中已知及以下实施例中详细描述，所需分仓或竞争性结合数据可使用固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA或ELISA)、夹心竞争分析法、BiacoreTM2000系统(亦即表面等离振子共振-GEHealthcare)、Analyzer(亦即生物层干涉测量术-ForteBio,Inc.)或流动式细胞测量方法获得。如本文中所用的术语“表面等离振子共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析即时特定相互作用的光学现象。术语“生物层干涉测量术”是指光学分析技术，其分析自两个表面反射的白光的干涉图案：生物传感器尖端上固定的蛋白质的层，及内部参考层。结合于生物传感器尖端的分子数目的任何变化均引起干涉图案偏移，该偏移可即时测量。在尤其优选实施方式中，分析(无论表面等离振子共振、生物层干涉测量术或流动式细胞测量术)是使用Biacore或ForteBio器具或流式细胞仪(例如FACSAriaII)进行，如以下实施例中说明。
为了进一步表征与所揭示的DLL3抗体调节子缔合或结合的抗原决定基，使用由Cochran等人(JImmunolMethods.287(1-2):147-158(2004)描述的方案(其以引用的方式并入本文中)的改良版本进行结构域水平抗原决定基作图。简言之，DLL3中包含特定氨基酸序列的个别结构域表达于酵母表面上且经由流动式细胞测量术测定与各DLL3抗体的结合。结果论述于以下实施例6中且展示于图4中。
其他相容抗原决定基定位技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹法(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)(本文中特定地以全文引用的方式并入)或肽裂解分析。此外，可使用诸如抗原决定基切除、抗原决定基提取及抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)(本文中特定地以全文引用的方式并入)。在其他实施方式中，修饰辅助探测(Modification-AssistedProfiling；MAP)，亦称为基于抗原结构的抗体探测(AntigenStructure-basedAntibodyProfiling；ASAP)提供根据各抗体与经化学或酶促修饰的抗原表面的结合概况的相似性来将大量针对相同抗原的单克隆抗体(mAb)归类的方法(U.S.P.N.2004/0101920，其特定地以全文引用的方式并入本文中)。各类别可反映独特抗原决定基，其与由另一类别表示的抗原决定基明显不同或部分重叠。此技术允许快速过滤遗传一致抗体，使得表征可集中于遗传相异抗体。应了解，MAP可用于将本发明的hDLL3抗体调节子分类为结合不同抗原决定基的抗体群。
适用于改变固定的抗原的结构的试剂包括酶，诸如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胞内蛋白酶Glu-C、胞内蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)。适用于改变固定的抗原的结构的试剂亦可为化学试剂，诸如丁二酰亚氨基酯及其衍生物、含有一级胺的化合物、肼及碳肼、游离氨基酸等。
抗原蛋白质可固定在生物传感器晶片表面或聚苯乙烯珠上。后者可经例如分析法处理，该分析法为诸如多工LUMINEXTM检测分析法(LuminexCorp.)。由于LUMINEX用至多100种不同类型的珠操作多工分析的能力，LUMINEX提供几乎无限的具有各种修饰的抗原表面，引起生物传感器分析法中抗体抗原决定基探测的改良的解析。
e.结合亲和力
除抗原决定基特异性以外，所揭示的抗体可使用物理特征(诸如结合亲和力)表征。在此方面，本发明进一步涵盖抗体的用途，该等抗体对一或多种DLL3同工型或在泛抗体情况下，对DLL家族中一个以上成员具有高结合亲和力。如本文中所用，术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对目标抗原的KD为10-8M或低于10-8M，更佳为10-9M或低于10-9M，且甚至更佳为10-10M或低于10-10M。然而，“高亲和力”结合可针对其他抗体同型而变化。举例而言，IgM同型的“高亲和力”结合是指抗体的KD为10-7M或低于10-7M，更佳为10-8M或低于10-8M，甚至更佳为10-9M或低于10-9M。
如本文中所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。据称本发明的抗体在解离常数KD(koff/kon)≤10-7M时免疫特异性结合其目标抗原。当KD≤5×10-9M时，抗体以高亲和力特异性结合抗原，且当KD≤5×10-10M时，以极高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方式中，抗体的KD≤10-9M为且解离速率为约1×10-4/秒。在本发明的一个实施方式中，解离速率<1×10-5/秒。在本发明的其他实施方式中，抗体将以介于约10-7M与10-10M之间的KD结合于DLL3，且在另一实施方式中，其将以KD≤2×10-10M结合。本发明的其他所选实施方式包含解离常数或KD(koff/kon)满足以下条件的抗体：小于10-2M、小于5×10-2M、小于10-3M、小于5×10-3M、小于10-4M、小于5×10-4M、小于10-5M、小于5×10-5M、小于10-6M、小于5×10-6M、小于10-7M、小于5×10-7M、小于10-8M、小于5×10-8M、小于10-9M、小于5×10-9M、小于10-10M、小于5×10-10M、小于10-11M、小于5×10-11M、小于10-12M、小于5×10-12M、小于10-13M、小于5×10-13M、小于10-14M、小于5×10-14M、小于10-15M或小于5×10-15M。
在特定实施方式中，免疫特异性结合于DLL3的本发明的抗体的缔合速率常数或kon(或ka)速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为至少105M-ls-l、至少2×105M-ls-l、至少5×105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5×106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5×107M-ls-l或至少108M-ls-l。
在另一实施方式中，免疫特异性结合于DLL3的本发明的抗体的解离速率常数或koff(或kd)速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)小于10-ls-1、小于5×10-ls-1、小于10-2s-1、小于5×10-2s-l、小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-l。
在本发明的其他所选实施方式中，抗DLL3抗体的亲合力常数或Ka(kon/koff)为至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1、至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M-1、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1或至少5×1015M-1。
除上述调节子特征以外，本发明的抗体可使用其他物理特征进一步表征，包括例如热稳定性(亦即熔融温度；Tm)及等电点(参见例如Bjellqvist等人,1993,Electrophoresis14:1023；Vermeer等人,2000,Biophys.J.78:394-404；Vermeer等人,2000,Biophys.J.79:2150-2154，其均以引用的方式并入本文中)。
V.抗体药物缀合物及药物连接子部分
应了解，本发明的DLL3缀合物包含经由连接子部分与PBD药物有效负载共价连接的DLL3细胞结合剂。如本文中论述，本发明的DLL3缀合物可用于在目标位置(例如致瘤细胞)处提供PBD1、PBD2、PBD3、PBD4或PBD5中的任一者。此宜由所揭示的ADC实现，该等ADC在释放及活化药物有效负载之前将结合的药物有效负载以相对未反应、无毒状态引导至目标位点。此毒性有效负载的靶向释放是主要由并入药物连接子化合物DL1-5中的连接子实现，制造该等药物连接子化合物DL1-5使得直至ADC到达致瘤细胞方才裂解及释放细胞毒性二聚型PBD。此有利地在肿瘤位点处提供活性PBD药物的相对高含量，同时最小化非靶向细胞及组织的暴露。
1.连接子化合物
更具体而言，并入所揭示的ADC中的连接子优选在细胞外稳定、防止ADC分子聚集及保持ADC可自由地溶于水性介质中且处于单体状态。在传送或递送至细胞中之前，抗体-药物缀合物(ADC)优选为稳定的且保持完整，亦即抗体保持连接至药物部分。尽管连接子在目标细胞外部稳定，但其经设计以在细胞内以某一有效速率裂解。因此，有效连接子将：(i)保持抗体的特异性结合性质；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定及完整，亦即不裂解，直至缀合物递送或传送至其目标位点；及(iv)保持PBD药物部分的细胞毒性、细胞杀死作用或细胞抑制作用。ADC的稳定性可由标准分析技术测量，诸如质谱分析、HPLC及分离/分析技术LC/MS。抗体与药物部分的共价连接需要连接子具有两个反应性官能基，亦即在反应性含义上为二价。已知适用于连接两个或多于两个功能性或生物学活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原及报道基团)的二价连接子，且以描述其方法及所得缀合物(Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress:NewYork,第234-242页)。
为此，本发明的DLL3ADC包含可由存在于细胞内环境(例如溶酶体或内体或小窝内)的裂解剂裂解的连接子。在ADC1-5的情况下，连接子包含肽基连接子，其由细胞内肽酶或蛋白酶酶(包括(但不限于)溶酶体或内体蛋白酶)裂解。在某些实施方式中，肽基连接子的长度优选为至少两个氨基酸或在其他实施方式中为至少三个氨基酸。裂解剂可包括组织蛋白酶B及组织蛋白酶D以及纤维蛋白溶酶，已知其中各者均可使二肽药物衍生物水解，引起目标细胞内活性药物的释放。在所揭示的药物-连接子部分DL1-DL5中，可由细胞内蛋白酶裂解的肽基连接子为缬氨酸-丙氨酸二肽部分。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点为试剂通常在结合时灭毒且缀合物的血清稳定性通常较高。
除可由酶裂解的二肽单元外，在ADC1-5(或DL1-DL5)中发现的所揭示的连接子各包括间隔基单元、用于将药物-连接子连接至细胞结合剂的结合部分及(至少在DL4及DL5情况下)在连接子裂解时提供PBD药物的完全断开的自我分解部分。关于自我分解基团，DL4及DL5均并入相同部分。为此，自我分解连接子及二肽共同形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其说明如下：
其中星号指示与所选PBD细胞毒性部分的连接位点，且波形线表示与连接子的其余部分(例如间隔基-抗体结合区段)的连接位点，该连接子可与抗体结合。在二肽的酶促裂解时，自我分解型连接子在远端位点活化时将允许受保护化合物(亦即毒性PBD二聚体)的完全释放，其沿以下展示的流程进行：
其中L*为包含现在裂解的肽基单元的连接子的其余部分的活化形式。PBD4及PBD5的完全释放确保其将保持所需毒性活性。
如下文将更详细论述及实施例7中阐述，本发明的药物连接子将连接至反应性硫醇亲核试剂。可通过用还原剂(诸如DTT(二硫苏糖醇))处理使抗体具有与连接子试剂结合的反应性。理论上，各半胱氨酸桥将因此形成两种反应性硫醇亲核试剂。U.S.P.N.7,521,541教导通过引入反应性半胱氨酸氨基酸而经工程改造的抗体。
在DL1、DL2、DL3及DL5中，细胞结合剂与药物-连接子部分之间的连接是经由细胞结合剂的硫醇残基及连接子上的末端顺丁烯二酰亚氨基团实现。在该等实施方式中，细胞结合剂与药物-连接子之间的连接为：
其中星号表示与药物-连接子的其余部分的连接位点且波形线表示与细胞结合剂的其余部分的连接位点。在此实施方式中，S原子典型地来源于DLL3抗体。
关于DL4，结合部分包含末端碘乙酰胺，其可与活化的硫醇反应以提供所需ADC4。如以下实施例7中所阐述，DL4的优选缀合过程与在其他实施方式中发现的顺丁烯二酰亚胺结合基团的优选缀合过程略微不同。在任何情况下，在本发明中，本领域技术人员可容易地使每一种所揭示的药物-连接子化合物与相容DLL3调节子结合。
2.PBD化合物
如上文所论述及以下实施例中呈现，每一种所揭示的PBD化合物(即将在下文中描绘)均呈现细胞毒性，使其成为待并入本发明的ADC中的潜在候选物。作为DL1-5中的每一者的组分的PBD1-5中的每一者的合成十分详细地呈现于以下实施例1中。在本发明中，可容易地产生包含本发明的ADC的有效负载的毒性化合物及如本文中所阐述来使用。在连接子裂解时自ADC1-5释放的PBD化合物即将描述于下文中：
根据本发明，该等化合物在肿瘤位点处的递送及释放可显示治疗或管理增生性病症的临床有效性。关于化合物，应了解，每一种所揭示的PBD均在各C环中具有两个sp2中心，与在各C环具有仅一个sp2中心的化合物相比，其可允许DNA的小沟中更强的结合(且因此具有更大毒性)。因此，当如本文中所阐述使用DLL3ADC中时，所揭示的PBD可证明对治疗增生性病症尤其有效。
3.药物-连接子部分
根据本文中的教导，所揭示的PBD将与如上文阐述的连接子组合以提供如下文即将阐述的药物-连接子化合物DL1-DL5。每一种所揭示的药物-连接子的合成的详细方案阐述于以下实施例1中。
及
关于药物-连接子DL1-5，应了解，DL1、DL2、DL3及DL5各包含末端顺丁烯二酰亚氨基团，其可用于使化合物与所选DLL3抗体结合。相反，DL4包含末端碘乙酰胺基团，其是用于使PBD有效负载与目标抗体结合。在某些条件下，使用碘乙酰胺部分可避免某些不需要的副反应及提供增强的ADC稳定性。此外，应了解，DL4及DL5包含PBD，其经由B环上的N10位置连接至DLL3调节子，而DL1、DL2及DL3是经由C环上的C2位置连接至所选抗体。关于经由N10位置连接的化合物，应进一步注意，连接子包含PABC自我分解型部分以确保有效负载的完全分离。在本发明中，本领域技术人员可容易地确定哪种DL(及相关ADC)将对治疗所选增生性病症显示有效性。
4.化合物特征
以下实施方式及下文即将阐述的变化适用于所揭示的ADC、药物连接子及/或PBD且明确地涵盖于本发明的范围内。
a.溶剂合物
可能适宜或需要制备、纯化及/或操作药物连接子、ADC或PBD的相应溶剂合物。术语“溶剂合物”在本文中是以常规含义使用以指代溶质(例如活性化合物、活性化合物的盐)与溶剂的复合物。若溶剂为水，则溶剂合物可便利地称为水合物，例如单水合物、二水合物、三水合物等。
本发明包括其中溶剂添加跨越PBD部分的亚胺键的化合物，其说明与下文中，其中溶剂为水或醇(RAOH，其中RA为C1-4烷基)：
此等形式可称为PBD的甲醇胺及甲醇胺醚形式(如以上关于R10的部分中所描述)。此等平衡态的平衡视发现化合物的条件以及部分本身的性质而定。
b.异构体
某些化合物可以一或多种特定几何异构、光学异构、对映异构、非对映异构、差向异构、立体异构、互变异构、构象异构或变旋异构形式存在，包括(但不限于)顺式-及反式-形式；E-及Z-形式；c-、t-及r-形式；内-及外-形式；R-、S-及内消旋-形式；D-及L-形式；d-及l-形式；(+)及(-)形式；酮-、烯醇-及烯醇化物-形式；同-及逆-形式；顺错-及反错-形式；α-及β-形式；直立及平伏形式；舟型-、椅型-、扭曲型-、信封型-及半椅型-形式；及其组合，下文中总称为“异构体”(“异构形式”)。
术语“手性”是指具有镜像配偶体的不可重叠性的性质的分子，而术语“非手性”是指可重叠于其镜像配偶体上的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但原子或基团的空间排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或两个以上手性中心且分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质及反应性。非对映异构体混合物可在高解析度分析程序(诸如电泳及层析)下分离。
“对映异构体”是指化合物的互为不可重叠镜像的两种立体异构体。
本文中所用立体化学定义及惯例通常是根据S.P.Parker编写,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)McGraw-HillBookCompany,NewYork；及Eliel,E.及Wilen,S.,“StereochemistryofOrganicCompounds”,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1994。本发明的化合物可含有不对称或手性中心，且因此以不同立体异构形式存在。意欲本发明化合物的所有立体异构形式(包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体及滞转异构体以及其混合物，诸如外消旋混合物)形成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，亦即其能够使平面偏光的平面旋转。在描述光学活性化合物时，字首D及L或R及S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d及l或(+)及(-)用以表示化合物使平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l意谓化合物为左旋。具有前缀(+)或d的化合物为右旋。对于指定化学结构，此等立体异构体除互为镜像外均相同。特定立体异构体亦可称为对映异构体，且该等异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可在化学反应或化学制程中未进行立体选择或无立体专一性的情况下出现。术语“外消旋混合物”及“外消旋物”是指缺乏光学活性的两种对映异构体物质的等摩尔混合物。
应注意，除如下文对互变异构形式所论述以外，自如本文所用的术语“异构体”明确排除结构(或构造)异构体(亦即原子之间的连接不同而非仅原子空间位置不同的异构体)。举例而言，提及甲氧基(-OCH3)时不应视为提及其结构异构体羟基甲基(-CH2OH)。类似地，提及邻氯苯基时不应视为提及其结构异构体间氯苯基。然而，提及一类结构时可充分包括属于该种类的结构异构形式(例如C1-7烷基包括正丙基及异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、第二丁基及叔-丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基及对甲氧基苯基)。
上述排除不适于互变异构形式，例如酮、烯醇及烯醇化物形式，如(例如)以下互变异构对中的互变异构形式：酮/烯醇(说明于下文中)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮基及硝基/酸式硝基(aci-nitro)。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可经由低能量障壁相互转化的具有不同能量的结构异构体。举例而言，质子互变异构体(亦称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移而相互转化，诸如酮-烯醇及亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括通过一些键结电子重组而相互转化。
应注意，术语“异构体”尤其包括具有一或多个同位素取代的化合物。举例而言，H可为包括1H、2H(D)及3H(T)的任何同位素形式；C可为包括12C、13C及14C的任何同位素形式；O可为包括16O及18O的任何同位素形式；及其类似物。
可并入本发明化合物中的同位素的实施例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟及氯的同位素，诸如(但不限于)分别为2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl及125I。本发明的各种同位素标记的化合物，例如其中合并有放射性同位素(诸如3H、13C及14C)的化合物。该等同位素标记的化合物可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术(诸如正电子发射断层摄影法(PET)或单光子发射电脑断层摄影法(SPECT)，包括药物或底物组织分布分析法)或患者的放射性治疗中。经氘标记或取代的本发明的治疗化合物可具有改良的DMPK(药物代谢及药物动力学)性质，该等性质与分布、代谢及排泄(ADME)有关。经诸如氘的重同位素取代由于代谢稳定性更大而可产生某些治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量需求降低。经18F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。经同位素标记的本发明化合物及其前药一般可通过进行流程或下文所述的实施例及制备方法中所揭示的程序，通过以容易获得的同位素标记试剂代替非同位素标记试剂而制备。此外，以较重同位素，尤其用氘(亦即2H或D)进行的取代可得到由较大代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求减小或治疗指数改良。应理解，在此情形下，氘视为取代基。此类重同位素，尤其氘的浓度可由同位素富集因子定义。在本发明的化合物中，未特定指定为特定同位素的任何原子意欲代表该原子的任何稳定同位素。
除非另外说明，否则提及特定化合物时包括所有该等异构形式，包括其(完全或部分)外消旋混合物及其他混合物。该等异构形式的制备(例如不对称合成)及分离(例如分步结晶及层析)方法为本领域中已知的或可通过以已知方式修改本文所教导的方法或已知方法容易地获得。
5.缀合物及药物负载
如上文所论述，以下抗体药物缀合物是由本发明提供：
及
一旦产生及/或制造本发明的调节子及药物-连接子及根据本文中的教导选择，则其可连接或结合以提供所揭示的ADC。如本文中所用，术语“缀合物”或“调节子缀合物”或“抗体缀合物”或“DLL3缀合物”或“ADC”可互换地使用且始终意谓ADC1、ADC2、ADC3、ADC4或ADC5中的任一者。可使用本领域中认可的技术使所选抗体与药物-连接子结合以提供所需ADC。优选结合方法阐述于以下实施例7中。此外，通过改变如本领域中已知的结合条件或选择特定抗体构建体，可产生呈现各种药物与抗体的化学计量摩尔比率的ADC且明确地属于本发明的范围内。
更一般而言，本领域技术人员应了解，多种不同反应可用于所揭示的药物-连接子与DLL3结合剂的连接或缔合。作为实施例，抗体上的亲核基团包括(但不限于)侧链硫醇基，例如半胱氨酸。硫醇基为亲核性且能够与连接子部分(诸如本发明的连接子部分)上的亲电子基团反应以形成共价键。本发明的优选抗体将具有可还原的链间二硫化物，亦即提供该等亲核基团的半胱氨酸桥。因此，在某些实施方式中，调节子半胱氨酸的游离硫氢基与所揭示的药物-连接子的末端马来酰亚胺或碘乙酰胺基团的反应将提供所需结合。在该等情况下，可通过用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP))处理使抗体具有与连接子试剂结合的反应性。理论上，各半胱氨酸二硫键将因此形成两种反应性硫醇亲核试剂。在其他实施方式中，可经由赖氨酸与试剂(包括(但不限于)2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂(Traut'sreagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)的反应将其他亲核基团引入抗体中，引起胺转化为硫醇。尽管该等试剂为优选，但应了解，所揭示的药物-连接子与DLL3调节子的结合可使用本领域技术人员已知的提供抗体或细胞结合剂的亲核基团与药物-连接子试剂的共价键结的各种反应、条件及试剂实现。如所指示，尤其优选方法更详细地阐述于以下实施例7中。
至少部分视用于实现结合的方法而定，本发明的ADC及ADC组合物可包含各种化学计量摩尔比率的药物及抗体部分。如本文中所用，化学计量摩尔比率是根据“药物与抗体比率”、“DAR”或“药物负载”定义。另一方面，药物负载或DAR为每细胞结合剂(例如组合物中的抗体)中PBD药物的加权平均数。当本发明的PBD化合物与IgG1中的天然存在的半胱氨酸结合时，药物负载可在每细胞结合剂1至8份药物范围内，亦即其中1、2、3、4、5、6、7或8份药物部分共价连接至各细胞结合剂。本发明的组合物的DAR优选为约2、4或6且在尤其优选实施方式中，DAR将包含约2。
更具体而言，本发明的缀合物组合物包含与一定范围的PBD化合物(1至8份(在IgG1情况下))结合的细胞结合剂，例如抗体。因此，所揭示的抗体药物缀合物组合物包括抗体药物缀合物化合物的混合物，其中大部分成分抗体共价连接至一或多个PBD药物部分，且其中药物部分可在各种氨基酸残基处连接至抗体。亦即，在结合后，本发明的ADC组合物将包含DLL3缀合物与各种浓度的不同药物负载(例如每IgG1抗体1至8份药物)的混合物。使用选择性结合条件及纯化方法，可使缀合物组合物达到其主要含有单一主要所需ADC物质(例如药物负载为2)及相对低含量的其他ADC物质(例如药物负载为1、4、6等)的程度。DAR值表示完整组合物(亦即所有ADC种类合起来)的药物负载的加权平均值。由于所用定量方法的固有不确定性及在商业环境中完全移除非主要ADC物质的困难，可接受的DAR值或说明通常呈现为某一范围或分布(亦即DAR为2+/-0.5)。医药环境中优选使用包含属于该范围(亦即1.5至2.5)内的所测量的DAR的组合物。
因此，在某些优选实施方式中，本发明将包含DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(各+/-0.4)的组合物。在其他优选实施方式中，本发明将包含DAR为2、4、6或8+/-0.4。最终，在所选优选实施方式中，本发明将包含DAR为2+/-0.4。应了解，在某些优选实施方式中，范围或偏差可小于0.4。因此，在其他实施方式中，组合物的DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(+/-0.3)；DAR为2、4、6或8+/-0.3或甚至更佳DAR为2+/-0.3。在其他实施方式中，IgG1缀合物组合物将优选包含DAR为1、2、3、4、5、6、7或8(各+/-0.4)的组合物及相对低含量(亦即小于30％)的非主要ADC物质。在其他优选实施方式中，ADC组合物将包含DAR为2、4、6或8(各+/-0.4)及相对低含量(<30％)的非主要ADC物质。在尤其优选实施方式中，ADC组合物将包含DAR为2+/-0.4及相对低含量(<30％)的非主要ADC物质。
来自结合反应的ADC制剂中每抗体中的药物分布可通过常规方法表征，诸如UV、逆相HPLC、HIC、质谱分析、ELISA分析法及电泳。亦可确定根据每抗体中的药物的ADC的定量分布。通过ELISA，可确定特定ADC制剂中每抗体中药物的平均值(Hamblett等人(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Sanderson等人(2005)Clin.CancerRes.11:843-852)。然而，每抗体中的药物分布值不可由抗体-抗原结合及ELISA的探测限制辨别。又，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA分析法不确定药物部分在何处连接至抗体(诸如重链或轻链片段)或特定氨基酸残基。在一些情况下，可通过诸如逆相HPLC或电泳的方法实现均质ADC(其中DAR包含来自具有其他药物负载的ADC的某一良好定义的值)的分离、纯化及表征。该等技术亦适用于其他类型的缀合物。
当抗体中一个以上亲核或亲电子基团与药物-连接子中间物反应或相继与连接子试剂及药物部分试剂反应时，则所得产物为ADC化合物(具有连接抗体的药物部分的分布，例如1、2、3等)的混合物。液相层析方法(诸如聚合逆相(PLRP)及疏水性相互作用(HIC))可通过药物负载值分离混合物中的化合物。然而，可分离具有单一药物负载值的ADC制剂，此等单一负载值ADC仍可包含非均质混合物，因为药物部分可经由连接子在抗体上的不同位点处连接。
对于一些抗体-药物缀合物，药物负载的数目可受抗体上的连接位点数目限制。举例而言，抗体可具有仅一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可具有仅一个或若干个具有足够反应性的硫醇基，连接子可经由该等硫醇基连接。较高药物负载(例如>5)可引起某些抗体-药物缀合物的聚集、不可溶、毒性或细胞渗透性损失。
典型地，低于理论最大值的药物部分在结合反应期间与抗体结合。抗体可含有例如多个不与药物-连接子中间物或连接子试剂反应的赖氨酸残基。仅反应性最高的赖氨酸基团可与胺反应性连接子试剂反应。又，仅反应性最高的半胱氨酸硫醇基可与硫醇反应性连接子试剂反应。通常，抗体不含有许多(若存在)可连接至药物部分的游离及反应性半胱氨酸硫醇基。化合物的抗体中的大部分半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在且必须用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP)在部分或完全还原条件下还原。可以若干种不同方式控制ADC的负载(药物/抗体比率)，包括：(i)限制药物-连接子中间物或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制结合反应时间或温度，及(iii)部分化或限制半胱氨酸硫醇修饰的还原条件。
应进一步了解，可通过工程改造一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基将反应性硫醇基引入抗体(或其片段)中(例如制备包含一或多个非原生半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)。亦即，半胱氨酸氨基酸可在抗体中且不形成链内或分子间二硫键的活性部位处经工程改造(Junutula等人,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249)。经工程改造的半胱氨酸硫醇可与本发明的连接子试剂或药物-连接子试剂(其具有硫醇反应性、亲电子基团，诸如顺丁烯二酰亚胺或α-卤酰胺)反应以形成具有经工程改造的抗体及PBD药物部分的ADC。因此可设计、控制及知晓药物部分的位置。可控制药物负载，因为经工程改造的半胱氨酸硫醇基典型地以高产率与硫醇反应性的连接子试剂或药物-连接子试剂反应。通过重链或轻链上单一位点处的取代来工程改造IgG抗体以引入半胱氨酸氨基酸可在对称抗体上产生两个新的半胱氨酸。可通过缀合产物ADC的近似均质性实现药物负载为近2。
VI.医药制剂及治疗性用途
1.制剂及施用途径
视所选缀合物的形式、所欲递送模式、所治疗或监测的疾病及多种其他变数而定，可视需要使用本领域中认可的技术调配本发明的组合物。在一些实施方式中，本发明的治疗性组合物可以纯施用或以含有最少量其他组分的形式施用，而其他组合物可视情况经调配以含有合适的在本领域中熟知的医药学上可接受的载剂，包含赋形剂及助剂(参见例如Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacywithFactsandComparisons:DrugfactsPlus,第20版(2003)；Ansel等人,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,第7版,LippencottWilliamsandWilkins(2004)；Kibbe等人,HandbookofPharmaceuticalExcipients,第3版,PharmaceuticalPress(2000))。各种医药学上可接受的载剂(包括媒剂、佐剂及稀释剂)容易购自多种商业来源。此外，多种医药学上可接受的辅助物质(诸如pH值调节剂及缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂及其类似物)亦可购得。某些非限制性例示性载剂包括生理食盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
更具体而言，应了解，在一些实施方式中，本发明的治疗组合物可以纯形式施用或以含有最少量其他组分的形式施用。相反，本发明的DLL3ADC可视情况经调配以含有合适的医药学上可接受的载剂(包含赋形剂及助剂)，该等载剂为本领域中熟知且为相对惰性物质，其有助于缀合物的施用或帮助将活性化合物加工成经医药学上最佳化以递送至作用位点的制剂。举例而言，赋形剂可提供形成或同一性或充当稀释剂以改良ADC的药物动力学或稳定性。合适赋形剂或添加剂包括(但不限于)稳定剂、湿润剂及乳化剂、用于改变容积摩尔渗透浓度的盐、囊封剂、缓冲剂及皮肤渗透增强剂。在某些优选实施方式中，药物组合物可以冻干形式提供及在施用之前在例如缓冲盐水中复原。该等复原组合物优选静脉内施用。
所揭示的用于全身施用的ADC可经调配以用于经肠、非经肠或局部施用。实际上，所有三种类型的制剂可同时使用以实现活性成分的全身施用。用于非经肠及非注射药物递送的赋形剂以及制剂阐述于Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy第20版MackPublishing(2000)中。适用于非经肠施用的制剂包括呈水可溶形式的活性化合物(例如水可溶盐)的水溶液。此外，可施用活性化合物的悬浮液，如适用于油性注射悬浮液。合适亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，例如经己基取代的聚(丙交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三酸甘油酯。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的黏度的物质且该等物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。悬浮液亦可视情况含有稳定剂。脂质体亦可用于封装用于递送至细胞中的试剂。
适用于经肠施用的制剂包括硬明胶胶囊或软明胶胶囊、丸剂、锭剂(包括包衣锭剂)、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
适用于非经肠施用(例如通过注射)的制剂包括水性或非水性、等张、无热原质、无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中活性成分是以溶解、悬浮或以其他方式提供(例如于脂质体或其他微粒中)。该等液体可额外含有其他医药学上可接受的成分，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂，及使制剂与所欲受体的血液(或其他相关体液)等张的溶质。赋形剂的实施例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油及其类似物。适用于该等制剂中的等张载剂的实施例包括氯化钠注射液、林格氏溶液(Ringer'sSolution)或乳酸盐林格氏注射液(LactatedRinger'sInjection)。
用于非经肠施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含约10μg/ml至约100mg/ml的ADC浓度。在某些所选实施方式中，ADC浓度将包含20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他优选实施方式中，ADC浓度将包含2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。
通常，本发明的化合物及组合物(包含DLL3ADC)可通过各种途径体内施用有需要的个体，包括(但不限于)经口、静脉内、动脉内、皮下、非经肠、鼻内、肌肉内、颅内、心内、心室内、气管内、经颊、经直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮及鞘内腔施用，或通过植入或吸入以其他方式施用。标的组合物可调配成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括(但不限于)锭剂、胶囊、散剂、粒剂、软膏剂、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂及喷雾剂。适当制剂及施用途径可根据所欲应用及治疗方案来选择。在尤其优选实施方式中，将静脉内递送本发明的化合物。
2.剂量
类似地，特定给药方案(亦即剂量、时序及重复)将视特定个体及个体的病史以及经验上的考虑因素(诸如药物动力学(例如半衰期、清除率等))而定。施用频率可根据疗程确定及调节，且是基于降低增生性或致瘤细胞的数目、保持该等赘生性细胞减少、降低赘生性细胞的增殖或延缓转移发生。在其他实施方式中，可调节或降低所施用的剂量以管理潜在副作用及/或毒性。或者，标的治疗性组合物的持续连续释放制剂可适用。
本领域技术人员将了解，缀合物化合物及包含缀合物化合物的组合物的合适剂量可视患者而不同。确定最佳剂量将通常涉及治疗利益程度与任何风险或有害副作用之间的平衡。所选剂量将视多种因素而定，包括(但不限于)特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的排泄速率、治疗持续时间、其他组合使用的药物、化合物及/或材料、病状的严重性以及患者的物种、性别、年龄、体重、条件、一般健康状况及先前病史。化合物量及施用途径将最终由医师、兽医或临床医师决定，但通常将选择剂量以实现可在作用位点处实现所需作用而不引起显著不良或有害副作用的局部浓度。
通常，本发明的ADC可以各种范围施用。此等范围包括每剂量每千克体重约5微克至每剂量每千克体重约100毫克；每剂量每千克体重约50微克至每剂量每千克体重约约5毫克；每剂量每千克体重约100微克至每剂量每千克体重约约10毫克。其他范围包括每剂量每千克体重约100微克至每剂量每千克体重约20毫克及每剂量每千克体重约0.5毫克至每剂量每千克体重约20毫克。在某些实施方式中，剂量为每千克体重至少约100微克、每千克体重至少约至少约250微克、每千克体重至少约750微克、每千克体重至少约3毫克、每千克体重至少约5毫克、每千克体重至少约10毫克。
在所选实施方式中，ADC将以每剂量每千克体重约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100微克施用(优选静脉内)。其他实施方式将包含ADC以每剂量每千克体重约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000微克施用。在其他优选实施方式中，所揭示的缀合物将以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.58、9或10mg/kg施用。在其他实施方式中，缀合物可以每剂量每千克体重12、14、16、18或20毫克施用。在其他实施方式中，缀合物可以每剂量每千克体重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100毫克施用。通过本文中的教导，本领域技术人员可基于临床前动物研究、临床观测以及标准医药及生物化学技术及测量容易地确定各种ADC的合适剂量。在尤其优选实施方式中，该等DLL3缀合物剂量将在一段时间内静脉内施用。此外，该等剂量可在预定疗程内分多次施用。
其他给药方案可基于体表面积(BodySurfaceArea；BSA)计算，如U.S.P.N.7,744,877中所揭示。如所熟知，BSA是使用患者身高及体重计算且提供个体尺寸的测量，如由其身体的表面积表示。在某些实施方式中，缀合物可以1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2的剂量及以100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量施用。亦应了解，可使用本领域中认可及经验上的技术确定合适剂量。
在任何情况下，DLL3ADC优选视需要施用有需要的个体。施用频率可由本领域技术人员(诸如主治医师)基于所治疗的病状、所治疗的个体的年龄、所治疗的病状的严重性、所治疗的个体的一般健康状况及其类似因素等考虑因素决定。通常，DLL3缀合物的有效剂量是以一或多次施用个体。更具体而言，ADC的有效剂量是以每月一次、每月一次以上或小于每月一次施用个体。在某些实施方式中，DLL3ADC的有效剂量可分多次施用，包括历时至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年或若干年。在其他实施方式中，所揭示的调节子的施用可历时若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干个月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或若干年。
在某些优选实施方式中，涉及结合的调节子的疗程将包含所选药物产品在数周或数月时间内的多次给药。更具体而言，本发明的结合的调节子可以每天一次、每两天一次、每四天一次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次或每三个月一次施用。在此方面，应了解，可基于患者反应及临床实践改变剂量或调节时间间隔。
亦可凭经验确定已接受一或多次施用的个体中所揭示的治疗性组合物的剂量及方案。举例而言，可向个体施用增加的剂量的如本文中所描述制备的治疗性组合物。在所选实施方式中，剂量可分别基于凭经验确定或观测的副作用或毒性而逐渐增加或降低或减少。为评估所选组合物的功效，可如先前描述使用特定疾病、病症或病状的标记。对于癌症，此等标记包括经由触诊或目测直接测量肿瘤尺寸、通过x射线或其他成像技术间接测量肿瘤尺寸；如由直接肿瘤活组织检验及肿瘤样品的显微镜检验评估的改良；根据本文中所描述的方法鉴别之间接肿瘤标记(例如PSA(对于前列腺癌))或致瘤抗原的测量、疼痛或麻痹降低；语言、视觉、呼吸或其他与肿瘤相关的失能得到改良；食欲增加；或生活品质提高，如由经认可的测试或存活期延长测量。本领域技术人员将显而易见，剂量将视个体、赘生性病状的类型、赘生性病状的阶段、赘生性病状是否开始转移至个体中的其他位置以及曾经使用的治疗及并行治疗而定。
3.组合疗法
根据本发明，组合疗法可尤其有效地降低或抑制不需要的赘生性细胞增殖、降低癌症发生、降低或预防癌症复发或降低或预防癌症的扩散或转移。在该等情况下，本发明的ADC通过移除CSC(否则CSC将支援肿瘤块及使肿瘤块永续)及由此实现现有护理减积或抗癌剂标准的更有效使用而可充当敏化剂或化学敏化剂。亦即，在某些实施方式中，所揭示的ADC可提供增强的作用(例如性质上相加或协同)，其增强另一种所施用的治疗剂的作用模式。在本发明的情形中，“组合疗法”应广泛加以解释且仅是指DLL3ADC及一或多种抗癌剂的施用，该等抗癌剂包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向抗癌剂(包括单克隆抗体及小分子实体)、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞激素、激素疗法、辐射疗法以及抗转移剂及免疫治疗剂，包括特异性及非特异性方法。
组合结果无需为当各治疗(例如ADC及抗癌剂)独立进行时所观测到的作用的累加和。尽管一般需要至少累加作用，但超过单一疗法的一的任何抗肿瘤作用增加亦为有益的。此外，本发明无需组合治疗呈现协同作用。然而，本领域技术人员应了解，在构成优选实施方式的某些所选组合下可观测到协同作用。
在实践组合疗法时，DLL3缀合物及抗癌剂可以单一组合物形式或以两种或两种以上使用相同或不同施用途经的不同组合物形式同时施用个体。或者，ADC可在抗癌剂治疗之前或之后例如数分钟至数周范围内的时间间隔施用。各次递送之间的时间周期使抗癌剂及缀合物能够对肿瘤发挥组合作用。在至少一个实施方式中，抗癌剂及ADC是彼此在约5分钟至约两周内施用。在其他实施方式中，施用DLL3ADC与抗癌剂之间可间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
组合疗法可施用一次、两次或至少一段时间直至病状得到治疗、减轻或治愈。在一些实施方式中，组合疗法是分多次施用，例如每天三次至每六个月一次。可根据诸如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次的时程进行施用，或可经由微型真空泵连续施用。如上文说明，组合疗法可经由任何途径施用。组合疗法可施用远离肿瘤位点的位点。
在一个实施方式中，ADC是与一或多种用于短治疗周期的抗癌剂组合施用有需要的个体。本发明亦涵盖不连续施用或分成若干次部分施用的每日给药。缀合物及抗癌剂可在交替的天或周交替施用；或可进行一系列抗体治疗，接着进行抗癌剂疗法的一或多种治疗。在任何情况下，如一般本领域技术人员将理解，化学治疗剂及所揭示的缀合物的合适剂量将通常与临床疗法(其中化学疗法是单独或与其他化学疗法组合施用)中已使用的剂量类似。
在另一优选实施方式中，本发明的DLL3缀合物可用于维持疗法中以降低或消除疾病初始呈现后肿瘤复发概率。优选地，病症将得到治疗且初始肿瘤块得以消除、减小或以其他方式改善，因此患者无症状或得到缓解。此时可向个体施用医药学上有效量的所揭示的DLL3缀合物一或多次，尽管使用标准诊断程序发现存在极少或不存在疾病的适应症。在一些实施方式中，ADC将在一段时间内按规则时程施用，诸如每周一次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次。根据本文中的教导，本领域技术人员可容易地确定有利于降低疾病复发可能性的剂量及给药方案。此外，视患者反应及临床与诊断参数而定，该等治疗可持续数周、数月、数年的时段或甚至无限期地持续。
在另一优选实施方式中，本发明的ADC可预防性使用或作为佐剂疗法使用以预防或降低减积过程后肿瘤转移的可能性。如本发明中所使用，“减积过程”广泛定义且应意谓消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增生的任何程序、技术或方法。例示性减积过程包括(但不限于)手术、辐射治疗(亦即束辐射)、化学疗法、免疫疗法或切除术。在本发明中，在本领域技术人员可容易确定的合适时间，可如临床、诊断或治疗诊断程序所提示施用所揭示的ADC以降低肿瘤转移。缀合物可以医药学上有效剂量(如使用标准技术确定)施用一或多次。优选给药方案将由可对其进行改良的合适诊断或监测技术实现。
本发明的其他实施方式包含向无症状但具有发展增生性病症的风险的个体施用所揭示的DLL3缀合物。亦即，本发明的缀合物可以实际上预防意义使用且施用经检验或测试且具有一或多种所述风险因素(例如基因组适应症、家族史、体内或体外测试结果等)但未发展赘瘤形成的患者。在该等情况下，本领域技术人员将能够经由经验观测或经由经认可的临床实践确定有效给药方案。
4.抗癌剂
如本申请中所论述，本发明的DLL3缀合物可与抗癌剂组合使用。术语“抗癌剂”或“抗增生剂”意谓任何可用于治疗细胞增生性病症(诸如癌症)的试剂，且包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞激素、激素疗法、辐射疗法以及抗转移剂及免疫治疗剂。
如本文中所用，术语“细胞毒性剂”意谓对细胞具有毒性且可降低或抑制细胞功能及/或引起细胞破坏的物质。在某些实施方式中，该物质为来源于活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实施例包括(但不限于)细菌(例如白喉毒素(Diptheriatoxin)、假单胞菌(Pseudomonas)内毒素及外毒素、葡萄球菌肠毒素A(StaphylococcalenterotoxinA))、真菌(例如α-帚曲菌素(α-sarcin)、局限曲菌素(restrictocin))、植物(例如相思豆毒素、蓖麻毒素、莫迪素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陆抗病毒蛋白质(pokeweedanti-viralprotein)、沙泊宁(saporin)、gelonin(gelonin)、地肤子皂苷(momoridin)、栝蒌素(trichosanthin)、大麦毒素、油桐蛋白质(Aleuritesfordiiprotein)、康乃馨蛋白质(dianthinprotein)、美洲大蠊蛋白质(Phytolaccamericanaprotein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂(Momordicacharantiainhibitor)、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制剂(saponariaofficinalisinhibitor)、白树素(gelonin)、丝林霉素(mitegellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)及霉菌毒素(tricothecene))或动物(例如细胞毒性RNase，诸如细胞外胰脏RNase；DNaseI，包括其片段及/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。
为达成本发明的目的，“化学治疗剂”包含非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖及/或存活的化合物(例如细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)。该等化学试剂通常针对细胞生长或分裂所必需的细胞内过程，且因此对癌性细胞(其通常快速生长及分裂)尤其有效。举例而言，长春新碱(vincristine)使微管脱聚合，且因此抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可包括任何抑制或经设计以抑制癌性细胞或可能变为癌性或产生致瘤后代的细胞(例如TIC)的化学试剂。该等试剂通常组合施用且通常在以组合形式时最有效，例如在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。
可与本发明的DLL3ADC组合使用的抗癌剂的实施例包括(但不限于)烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、伸乙基亚胺及甲基阿美胺(methylamelamine)、多聚乙酰、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、伊留塞罗宾(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、沙克迪因(sarcodictyin)、斯邦士他汀(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、迪米星(dynemicin)、双膦酸盐、埃斯培拉霉素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克那霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、阿霉素(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、派来霉素(peplomycin)、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、克拉霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、百士欣(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、柔红霉素(zorubicin)；抗代谢物、埃罗替尼(erlotinib)、威罗菲尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、索拉菲尼(sorafenib)、依鲁替尼(ibrutinib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(诸如弗林酸(frolinicacid))、乙酰格雷酮(aceglatone)、醛磷酰胺醣苷、氨基乙酰丙酸、因尼拉尔(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、贝斯布希(bestrabucil)、比山群(bisantrene)、艾达西特(edatraxate)、迪夫法明(defofamine)、秋水仙碱(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵(elliptiniumacetate)、艾普塞隆(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多醣(lentinan)、洛达尼(lonidainine)、类美登素(maytansinoids)、丙脒腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他汀(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinicacid)、2-乙基肼、甲基苯甲肼、多醣复合物(polysaccharidecomplex)(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)、丙亚胺；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙基胺；新月毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、维拉库林A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridinA)及安归定(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉毒素(taxoids)、瘤可宁(chloranbucil)；吉姆他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲胺喋呤；铂类似物、长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；小蓝莓(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸；类视黄素；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；草酸铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制剂(其降低细胞增殖)及以上任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中亦包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素及选择性雌激素受体调节剂、抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂及抗雄激素；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸；核糖核酸酶，诸如VEGF表达抑制剂及HER2表达抑制剂；疫苗、rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞宾及埃斯波霉素(Esperamicin)，及以上任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。
尤其优选抗癌剂包含市售或临床可用化合物，诸如埃罗替尼(erlotinib)(Genentech/OSIPharm.)、多西他赛(docetaxel)、(Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉姆他滨(gemcitabine)(Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺二胺，二氯铂(II)，CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1， ScheringPlough)、塔莫昔酚(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺， )及阿霉素(doxorubicin)()。其他市售或临床可用抗癌剂包含草酸铂(Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(MillenniumPharm.)、索坦(sutent)(SU11248，Pfizer)、来曲唑(letrozole)(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，ArrayBioPharma,AstraZeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，SemaforePharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、氟维司群(fulvestrant)(AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(leucovorin/folinicacid)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016，GlaxoSmithKline)、诺拉法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH66336，ScheringPlough)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，BayerLabs)、吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11，Pfizer)、替吡法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(无十六醇聚氧乙烯醚)、太平洋紫杉醇的经白蛋白工程改造的奈米粒子制剂(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Il)、范德替尼(vandetanib)(rINN，ZD6474，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)、坦罗莫司(temsirolimus)(Wyeth)、帕佐潘尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、堪佛司非米德(canfosfamide)(Telik)、噻替派及环磷酰胺()；长春瑞滨()；卡培他滨(capecitabine)(Roche)、塔莫昔酚(包括柠檬酸塔莫昔酚、(柠檬酸托瑞米芬(toremifinecitrate))、(乙酸甲地孕酮)、(西美斯坦(exemestane)；Pfizer)、服美斯坦(formestanie))、法倔唑(fadrozole)、(伏罗唑(vorozole))、(来曲唑(letrozole)；Novartis)及(安那唑(anastrozole)；AstraZeneca)。
在其他实施方式中，本发明的DLL3缀合物可与当前处于临床试验或市售的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一者组合使用。为此，所揭示的DLL3缀合物可与选自由以下组成的组的抗体组合使用：阿巴沃单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛图单抗(amatuximab)、阿纳图单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴韦图单抗(bavituximab)、贝托莫单抗(bectumomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、比瓦珠单抗(bivatuzumab)、布里纳单抗(blinatumomab)、贝土西单抗(brentuximab)、坎土珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、西瓦图单抗(clivatuzumab)、康纳单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、多兹图单抗(drozitumab)、杜利图单抗(duligotumab)、杜斯图单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛图单抗(dalotuzumab)、埃克昔单抗(ecromeximab)、埃洛珠单抗(elotuzumab)、恩斯图单抗(ensituximab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法乐珠单抗(farletuzumab)、非拉珠单抗(ficlatuzumab)、非图木单抗(figitumumab)、福沃图单抗(flanvotumab)、福图西单抗(futuximab)、盖尼图单抗(ganitumab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、吉乐木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊加图单抗(imgatuzumab)、因达西单抗(indatuximab)、依诺珠单抗(inotuzumab)、因特图单抗(intetumumab)、伊派利单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛沃图单抗(lorvotuzumab)、卢卡图单抗(lucatumumab)、玛帕单抗(mapatumumab)、马图珠单抗(matuzumab)、米拉图单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米图单抗(mitumomab)、莫西图单抗(moxetumomab)、拉纳图单抗(narnatumab)、那图莫单抗(naptumomab)、尼西图单抗(necitumumab)、尼莫珠单抗(nimotuzumab)、诺非图单抗(nofetumomabn)、奥卡拉单抗(ocaratuzumab)、奥法图单抗(ofatumumab)、奥拉珠单抗(olaratumab)、奥纳珠单抗(onartuzumab)、奥珀珠单抗(oportuzumab)、奥瑞沃单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕撒图单抗(parsatuzumab)、帕瑞图单抗(patritumab)、派图单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、平妥单抗(pintumomab)、普瑞木单抗(pritumumab)、拉克图单抗(racotumomab)、拉木西单抗(ramucirumab)、拉德瑞单抗(radretumab)、瑞洛图单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、萨土莫单抗(satumomab)、西博珠单抗(sibrotuzumab)、西图昔单抗(siltuximab)、斯图珠单抗(simtuzumab)、索利托单抗(solitomab)、塔卡珠单抗(tacatuzumab)、他普莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、图土珠单抗(tucotuzumab)、乌利昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃瑟珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎图木单抗(zalutumumab)、CC49、3F8及其组合。
其他尤其优选实施方式将包括使用在测试中或认可用于癌症疗法的抗体，包括(但不限于)利妥昔单抗、曲妥珠单抗、奥吉妥单抗(gemtuzumabozogamcin)、阿仑单抗、替坦异贝莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、托西莫单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、拉木西单抗、奥法图单抗、伊派利单抗及维汀贝土西单抗(brentuximabvedotin)。本领域技术人员将能够容易地鉴别其他与本文中的教导相容的抗癌剂。
5.放射疗法
本发明亦提供DLL3缀合物与放射疗法(亦即任何用于诱导肿瘤细胞内局部DNA损害的机制，诸如γ辐射、X射线、UV辐射、微波、电子发射及其类似物)的组合。亦涵盖使用放射性同位素至肿瘤细胞的直接递送的组合疗法，且所揭示的缀合物可与靶向抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法经约1周至约2周的时段以脉冲形式施用。放射疗法可施用患有头颈癌的个体持续约6周至7周。视情况，放射疗法可以单次剂量或以多次连续剂量施用。
VII.适应症
应了解，本发明的ADC可用于治疗、预防、管理或抑制任何DLL3相关病症的发生或复发。因此，无论单独施用或与抗癌剂或放射疗法以组合形式施用，本发明的ADC尤其适用于通常治疗患者或个体中的赘生性病状，其包括良性或恶性肿瘤(例如肾上腺、肝脏、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠直肠的、前列腺、胰脏、肺、甲状腺、肝、子宫颈、子宫内膜、食道及子宫癌瘤；肉瘤；神经胶母细胞瘤；及各种头颈肿瘤)；白血病及淋巴恶性肿瘤；其他病症，诸如神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑及其他腺、巨噬细胞、上皮、基质及囊胚腔病症；以及发炎性、血管生成、免疫病症及由病原体引起的病症。具体而言，关键治疗目标为赘生性病状，包含实体肿瘤，但本发明的范围涵盖血液恶性肿瘤。
如本文中所用的术语“治疗”在治疗病状的情形中通常是关于治疗及疗法(无论人类或动物(例如在兽医应用中))，其中实现一些所需治疗作用，例如抑制病状发展，且包括发展速率降低、发展速率停止、病状消退、病状的改善及病状的治愈。亦包括作为预防措施(亦即防范、预防)的治疗。
如本文中所用的术语“治疗有效量”是关于活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂量的量，其在根据所需治疗方案施用时可有效产生一些所需治疗作用，与合理的效益/风险比率相称。
类似地，如本文中所用的术语“预防有效量”是关于活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂量的量，其在根据所需治疗方案施用时可有效产生一些所需预防作用，与合理的效益/风险比率相称。
更具体而言，根据本发明经受治疗的赘生性病状可选自包括(但不限于)以下的群：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌及移行细胞癌)、骨癌(釉质瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑癌及脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞型肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维性组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆形细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因氏瘤(Ewing'stumor)、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维生成不良、骨纤维性结构不良、胆囊癌及胆管癌、妊娠期滋养层疾病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、胰岛细胞瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi'sSarcoma)、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、神经管母细胞瘤、黑素瘤、脊膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良症候群、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周边神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤(posteriousunvealmelanoma)、罕见血液病症、转移性肾癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、转移性甲状腺癌及子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌及平滑肌瘤)。
在某些优选实施方式中，增生性病症将包含实体肿瘤，包括(但不限于)肾上腺、肝脏、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宫颈、子宫、食道、结肠直肠、前列腺、胰脏、肺(小细胞及非小细胞)、甲状腺、癌瘤、肉瘤、神经胶母细胞瘤及各种头颈肿瘤。在其他优选实施方式中，且如以下实施例中所示，所揭示的ADC可尤其有效治疗小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。在一个实施方式中，肺癌为顽抗性、复发性或对以铂为主的药剂(例如卡铂、顺铂、草酸铂、拓扑替康(topotecan))及/或紫杉烷(例如多西他赛、太平洋紫杉醇、拉若他赛(larotaxel)或卡巴他赛(cabazitaxel))具有抗性。
在尤其优选实施方式中，所揭示的ADC可用于治疗小细胞肺癌。关于该等实施方式，结合的调节子可施用呈现局限期(limitedstage)疾病的患者。在其他实施方式中，所揭示的ADC将施用呈现扩散期(extensivestage)疾病的患者。在其他优选实施方式中，所揭示的ADC将施用顽抗性患者(亦即在初始疗程期间或在初始疗程完成之后不久复发的患者)或复发性小细胞肺癌患者。其他实施方式包含向敏感患者(亦即在基本疗法后超过2-3个月复发的患者)施用所揭示的ADC。在各种情况下，应了解，视所选给药方案及临床诊断而定，相容ADC可与其他抗癌剂组合使用。
如上文所论述，所揭示的ADC可进一步用于预防、治疗或诊断具有神经内分泌特征的肿瘤或包括神经内分泌肿瘤的表型。由扩散的内分泌系统引起的真性或正则神经内分泌肿瘤(NET)相对罕见，其发病率为每100,000人中2-5名，但具有高侵袭性。神经内分泌肿瘤在肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(骨髓甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)中发生。此等肿瘤可分泌若干种激素，包括血清素及/或嗜铬粒蛋白A，其可引起衰竭性症状，称为类癌瘤症候群。该等肿瘤可由阳性免疫组织化学标记(诸如神经元特异性烯醇酶(NSE，亦称为γ烯醇酶，基因符号＝ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)及突触素(SYP))或已知呈现升高的表达的基因(诸如ASCL1)表示。不幸的是，传统化学疗法通常无法尤其有效地治疗NET及肝脏转移。
尽管所揭示的ADC可有利地用于治疗神经内分泌肿瘤，但其亦可用于治疗、预防或诊断伪神经内分泌肿瘤(pNET)，该等伪神经内分泌肿瘤以基因型方式或以表型方式模仿、类似或呈现与正则神经内分泌肿瘤的共有特性。伪神经内分泌肿瘤或具有神经内分泌特征的肿瘤为由弥漫性神经内分泌系统的细胞或其中神经内分泌分化级联在致癌过程期间异常再活化的细胞引起的肿瘤。该等pNET通常与传统定义的神经内分泌肿瘤共有某些表型或生物化学特征，包括产生生物学活性胺、神经传递素及肽激素的子集的能力。组织学上，该等肿瘤(NET及pNET)共有共同外观，其通常展示密集连接的具有最小细胞质(无刺激细胞病理学)及圆形至椭圆形点状细胞核的小细胞。为达成本发明的目的，可用于定义神经内分泌及伪神经内分泌肿瘤的通常表达的组织学标记或遗传标记包括(但不限于)嗜铬粒蛋白A、CD56、突触素、PGP9.5、ASCL1及神经元特异性烯醇酶(NSE)。
因此，本发明的ADC可有利地用于治疗伪神经内分泌肿瘤及正则神经内分泌肿瘤。在此方面，ADC可如本文中所描述用于治疗肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(骨髓甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)中产生的神经内分泌肿瘤(NET及pNET)。此外，本发明的ADC可用于治疗表达一或多种选自由NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A、ASCL1及PGP9.5(UCHL1)组成的组的标记的肿瘤。亦即，本发明可用于治疗罹患肿瘤(其为NSE+或CD56+或PGP9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+或其一些组合)的个体。
关于血液科恶性疾病，应进一步了解，本发明的化合物及方法可尤其有效治疗各种B细胞淋巴瘤，包括低度/NHL滤泡性细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥漫性NHL、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞性NHL、高度小无核裂细胞NHL、巨瘤性NHL、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma；BL)、AIDS相关淋巴瘤、单核细胞性B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴腺病、小淋巴细胞性、滤泡性、弥漫性大细胞、弥漫性小核裂细胞、大细胞免疫母细胞性淋巴母细胞瘤、小无核裂性伯基特与非伯基特滤泡性、主要大细胞淋巴瘤；滤泡性、主要小核裂细胞淋巴瘤；及滤泡性、混合小核裂细胞与大细胞淋巴瘤。参见Gaidono等人,“Lymphomas”,INCANCER:PRINCIPLES&PRACTICEOFONCOLOGY,第2卷:2131-2145(DeVita等人编,第5期增刊1997)。本领域技术人员应了解，由于改变分类系统，故此等淋巴瘤通常将具有不同名称，且具有归类为不同名称的淋巴瘤的患者亦可受益于本发明的组合治疗方案。
本发明亦提供呈现良性或癌前肿瘤的个体的预防性或防范性治疗。除DLL3相关病症外，相信使用本发明的治疗亦不应排除任何特定类型的肿瘤或增生性病症。然而，肿瘤细胞的类型可与本发明与第二治疗剂、尤其化学治疗剂及靶向抗癌剂的组合的使用有关。
所治疗的“个体”或“患者”优选为人类，但如本文中所用，该等术语明确地始终包含任何物种，包括所有哺乳动物。因此个体/患者可为动物、哺乳动物、有胎盘哺乳动物、有袋动物(例如袋鼠、袋熊)、单孔科动物(例如鸭嘴兽(duckbilledplatypus))、啮齿动物(例如天竺鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、鸟类动物(例如鸟)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪科动物(例如猪)、羊(例如绵羊)、牛(例如母牛)、灵长类动物、猿类(例如猴子或猿)、猴子(例如狨猿、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
VIII.制品
亦提供包含一或多个容器的医药封装及试剂盒，该一或多个容器包含一或多种剂量的DLL3ADC。在某些实施方式中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的包含例如抗DLL3缀合物的组合物(具有或不具有一或多种其他试剂)。对于其他实施方式，该单位剂量供应于用于注射的单一用途预填充注射器中。在其他实施方式中，单位剂量中所含的组合物可包含生理食盐水、蔗糖或其类似物；缓冲液，诸如磷酸盐或其类似物；及/或调配在稳定且有效的pH值范围内。或者，在某些实施方式中，缀合物组合物可以冻干粉末形式提供，其可在添加合适液体(例如无菌水或生理食盐水溶液)时复原。在某些优选实施方式中，组合物包含一或多种抑制蛋白质聚集的物质，其包括(但不限于)蔗糖及精氨酸。容器上或与容器相关的任何标记均指示密封的缀合物组合物是用于治疗所选赘生性疾病病状。
本发明亦提供用于产生DLL3缀合物及视情况选用的一或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。试剂盒包含容器及容器上或与容器相关的标记或药品说明书。合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑胶)形成且含有医药学上有效量的呈结合或未结合形式的所揭示的DLL3缀合物。在其他优选实施方式中，容器包含无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的阻塞物的小瓶)。该等试剂盒将通常在合适容器中含有DLL3缀合物的医药学上可接受的制剂及相同或不同容器中的视情况选用的一或多种抗癌剂。试剂盒亦可含有用于诊断或组合疗法的其他医药学上可接受的制剂。举例而言，除本发明的DLL3缀合物外，该等试剂盒可含有多种抗癌剂中的任一或多者，诸如化学疗法或放射治疗药物；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；及/或其他抗癌剂。
更具体而言，试剂盒可具有单一容器，该单一容器含有DLL3ADC且具有或不具有其他组分，或其可具有用于各种所需试剂的不同容器。当提供组合治疗剂进行结合时，可将单一溶液以摩尔当量组合形式或以一种组分超过其他组分形式预混合。或者，试剂盒中的DLL3缀合物及任何视情况选用的抗癌剂可在施用患者之前在不同容器内单独保存。试剂盒亦可包含用于含有医药学上可接受的无菌缓冲液或其他稀释剂的第二/第三容器构件，该缓冲液或稀释剂为诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)、林格氏溶液及右旋糖溶液。
当试剂盒的组分是以一或多种液体溶液形式提供时，液体溶液优选为水溶液，其中尤其优选为无菌水溶液或生理食盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，该粉末可通过添加合适溶剂来复原。预想该溶剂亦可提供于另一容器中。
如上文简要说明，试剂盒亦可含有用于施用动物或患者抗体缀合物及任何视情况选用的组分的构件，例如一或多种针、静脉内袋或注射器或甚至滴管、吸管或其他该类设备，该等设备可用于将制剂注入或引入动物中或施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒亦通常包括用于含有小瓶或诸如此类的构件，及市售的其他密闭组件，例如置放及保存所需小瓶及其他设备的射出成形或吹塑成形塑胶容器。任何标记或药品说明书均指示DLL3缀合物组合物是用于治疗癌症，例如小细胞肺癌。
在其他优选实施方式中，本发明的缀合物可与适用于预防或治疗增生性病症的诊断或治疗性装置结合使用或包含该等装置。举例而言，在一个优选实施方式中，本发明的化合物及组合物可与某些诊断装置或器具组合，该等诊断装置或器具可用于检测、监测、定量或探测与增生性病症的病源学或表达有关的细胞或标记化合物。对于所选实施方式，标记化合物可包含NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A及PGP9.5。
在尤其优选实施方式中，装置可用于体内或体外检测、监测及/或定量循环肿瘤细胞(参见例如WO2012/0128801，其以引用的方式并入本文中)。在其他优选实施方式中且如上文所论述，循环肿瘤细胞可包含癌症干细胞。
IX.序列表概述
本申请附有包含多种核酸及氨基酸序列的序列表。以下表2提供所包括的序列的概述。
表2
SEQ ID NO. 说明
1 DLL3同工型1蛋白质
2 DLL3同工型2蛋白质
3 抗原决定基SC16.23蛋白质
4 抗原决定基SC16.34及SC 16.56蛋白质
5 κ恒定区蛋白质
6 IgGI恒定区蛋白质
7-19 保留
20 SC16.3 VL DNA(与经编码的蛋白质比对)
21 SC16.3 VL蛋白质
22 SC16.3 VH DNA(与经编码的蛋白质比对)
23 SC16.3 VH蛋白质
24-387 其他鼠克隆，如SEQ ID NO:20-23中
388-407 人源化克隆，如SEQ ID NO:20-23中
408、409、410 hSC16.13 CDRL1、CDRL2、CDRL3
411、412、413 hSC16.13 CDRH1、CDRH2、CDRH3
414、415、416 hSC16.15 CDRL1、CDRL2、CDRL3
417、418、419 hSC16.15 CDRH1、CDRH2、CDRH3
420、421、422 hSC16.25 CDRL1、CDRL2、CDRL3
423、424、425 hSC16.25 CDRH1、CDRH2、CDRH3
426、427、428 hSC16.34 CDRL1、CDRL2、CDRL3
429、430、431 hSC16.34 CDRH1、CDRH2、CDRH3
432、433、434 hSC16.56 CDRL1、CDRL2、CDRL3
435、436、437 hSC16.56 CDRH1、CDRH2、CDRH3
X.其他内容
除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学及技术术语应具有由普通本领域技术人员所通常理解的含义。此外，除非上下文另有所需，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。更具体而言，除非上下文另外明确指示，否则如本说明书及随附申请专利范围中所使用，单数形式“一”及“该”包括复数个指示物。因此，举例而言，提及“蛋白质”包括复数个蛋白质；提及“细胞”包括细胞混合物及其类似物。此外，说明书及随附申请专利范围中所提供的范围包括端点及端点之间的所有点。因此，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0及2.0与3.0之间的所有点。
通常，与本文所述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质及核酸化学及杂交结合使用的命名法及其技术为本领域中熟知且常用的命名法及技术。除非另有指示，否则本发明的方法及技术通常根据本领域中熟知的常规方法且如本说明书中通篇引用及论述的各种一般及更特定参考文献中所述来进行。参见例如Abbas等人,CellularandMolecularImmunology,第6版,W.B.SaundersCompany(2010)；SambrookJ.及RussellD.MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人,ShortProtocolsinProteinScience,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书，如本领域中通常所实现或如本文中所述执行。关于本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医药及药物化学使用的命名法及该等学科的实验方法及技术为本领域中熟知及常用的。此外，本文中所使用的任何章节标题是仅用于组织目的且不应视为限制所描述的标的物。
本文中使用的某些缩写：
Ac乙酰基
Acm乙酰胺基甲基
Alloc烯丙氧羰基
Boc二碳酸二-第三丁酯
t-Bu叔-丁基
Bzl苯甲基，其中Bzl-OMe为甲氧基苯甲基且Bzl-Me为甲基苯
Cbz或Z苯甲氧基羰基，其中Z-Cl及Z-Br分别为氯苯甲氧基羰基及溴苯甲氧基羰基
DMFN,N-二甲基甲酰胺
Dnp二硝苯基
DTT二硫苏糖醇
Fmoc9H-芴-9-基甲氧基羰基
impN-10亚胺保护基：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯基-Val-Ala-PABMC-OSu马来酰亚胺己酰基-O-N-丁二酰亚胺
Moc甲氧基羰基
MP马来酰亚胺丙酰胺
Mtr4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰胺
PAB对-氨基苯甲氧基羰基
PEG乙烯氧基
PNZ氨基甲酸对硝基苯甲酯
Psec2-(苯基磺酰基)乙氧基羰基
TBDMS叔-丁基二甲基甲硅烷基
TBDPS叔-丁基二苯基甲硅烷基
Teoc2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基
Tos甲苯磺酰基
Troc2,2,2-三氯异氧基羰基氯
Trt三苯甲基
Xan呫吨基
实施例
参考以下实施例将更容易了解上文由此总体上描述的本发明，该等实施例是以说明的方式提供且不欲限制本发明。该等实施例不欲表示以下实验为所进行的全部或唯一实验。除非另外指示，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度以摄氏度计，且压力为大气压或近大气压。
实施例1
制造PBD药物-连接子化合物
PBD药物-连接子化合物DL1-DL5是如下合成：
A.一般实验方法
旋光度是用ADP220偏光计(BellinghamStanleyLtd.)测量且浓度(c)以g/100mL给出。熔点是使用数位熔点设备(Electrothermal)测量。IR光谱是用Perkin-ElmerSpectrum1000FTIR光谱仪记录。1H及13CNMR光谱是分别在400MHz及100MHz下使用BrukerAvanceNMR光谱仪在300K下获得。化学位移是相对于TMS(δ＝0.0ppm)报道，且信号指定为s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、dt(双三重峰)、dd(双二重峰)、ddd(双重双二重峰)或m(多重峰)，其中偶合常数以赫兹(Hz)给出。质谱分析(MS)数据是使用耦接至具有Waters2996PDA的Waters2695HPLC的WatersMicromassZQ器具收集。所用WatersMicromassZQ参数为：毛细管(kV)，3.38；锥体(V)，35；提取器(V)，3.0；源温度(℃)，100；去溶剂化温度(℃)，200；锥体流动速率(L/h)，50；去溶剂化流动速率(L/h)，250。高解析度质谱分析(HRMS)数据是在WatersMicromassQTOFGlobal上在阳性W模式下使用经金属涂布的硼硅玻璃尖端将样品引入器具中来记录。薄层层析(TLC)是在硅胶铝板(Merck60，F254)上进行，且急骤层析利用硅胶(Merck60，230-400目ASTM)。除HOBt(NovaBiochem)及固体负载试剂(Argonaut)外，所有其他化学品及溶剂均是购自Sigma-Aldrich且未经进一步纯化即按原样使用。无水溶剂是通过在干燥氮气氛围下在合适干燥剂存在下蒸馏而制备，且经由分子筛或钠线储存。石油醚是指在40℃-60℃沸腾的部分。
在产生所揭示的化合物时，LC/MS是使用两种略微不同的程序进行。默认程序为所描述的第一种方法，除非另有说明，否则使用第一种方法。
方法1(默认方法，除非另有说明，否则使用该方法)-HPLC(WatersAlliance2695)是使用水(A)(甲酸0.1％)及乙腈(B)(甲酸0.1％)的移动相进行。梯度：初始组成5％B保持1.0分钟，接着经3分钟周期自5％B增加至95％B。该组成在95％B下保持0.1分钟，接着在0.03分钟内返回至5％B且保持0.87分钟。总梯度运行时间等于5分钟。
方法2-HPLC(WatersAlliance2695)是使用水(A)(甲酸0.1％)及乙腈(B)(甲酸0.1％)的移动相进行。梯度：初始组成5％B保持1.0分钟，接着经2.5分钟周期自5％B增加至95％B。该组成在95％B下保持0.5分钟，接着在0.1分钟内返回至5％B且保持0.9分钟。总梯度运行时间等于5分钟。
在两种方法中流动速率均为3.0mL/min，经由进入质谱仪中的零死体积T形连接件分离400μL。波长检测范围：220nm至400nm。功能类型：二极管阵列(535次扫描)。柱：PhenomenexOnyxMonolithicC1850×4.60mm。
逆相急骤纯化条件如下：Flash纯化系统(Varian971-Fp)是使用水(A)及乙腈(B)的移动相进行。梯度：初始组成5％B历经20C.V.(柱体积)接着在60C.V内自5％B达到70％B。该组成在95％B下保持15C.V.，且接着在5C.V.内返回至5％B且在5％B下保持10C.V.。总梯度运行时间等于120C.V.。流动速率6.0mL/min。波长检测范围：254nm。柱：AgilentAX1372-1SF10-5.5gC8。
制备型HPLC是进行如下：逆相超高效能液相层析(UPLC)是在以下尺寸的PhenomenexGeminiNX5μC-18柱上进行：150×4.6mm(用于分析)，及150×21.20mm(用于制备工作)。所有UPLC实验均在梯度条件下进行。所用溶离剂为溶剂A(具有0.1％甲酸的H2O)及溶剂B(具有0.1％甲酸的CH3CN)。所用流动速率为1.0ml/min(用于分析)及20.0ml/min(用于制备型HPLC)。检测是在254nm及280nm下进行。
B.合成药物-连接子DL1(途径1)
(a)1',3'-双[2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苯氧基]丙烷(3)
偶氮二甲酸二异丙酯(71.3mL，73.2g，362mmol)在0℃-5℃(冰/丙酮)下在氮气氛围下经60分钟时间逐滴添加至经顶置式搅拌的香子兰酸甲酯2(60.0g，329mmol)及Ph3P(129.4g，494mmol)于无水THF(800mL)中的溶液中。反应混合物在0℃-5℃下再搅拌1小时，随后经20分钟时间逐滴添加1,3-丙二醇(11.4mL，12.0g，158mmol)于THF(12mL)中的溶液。使反应混合物升温至室温且搅拌5天。通过真空过滤收集所得白色沉淀物3，用THF洗涤且在真空干燥器中干燥至恒重。产量＝54.7g(84％(基于1,3-丙二醇))。由LC/MS发现纯度令人满意(3.20min(ES+)m/z(相对强度)427([M+Na]+,10)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(dd,2H,J＝1.8,8.3Hz),7.54(d,2H,J＝1.8Hz),6.93(d,2H,J＝8.5Hz),4.30(t,4H,J＝6.1Hz),3.90(s,6H),3.89(s,6H),2.40(p,2H,J＝6.0Hz)。
(b)1',3'-双[2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)-5-硝基苯氧基]丙烷(4)
固体Cu(NO3)2.3H2O(81.5g，337.5mmol)在0℃-5℃(冰/丙酮)下缓慢添加至经顶置式搅拌的双-酯3(54.7g，135mmol)于乙酸酐(650mL)中的浆料中。反应混合物在0℃-5℃下搅拌1小时且接着升温至室温。发生轻度放热(约40℃-50℃)，伴随混合物变稠且在此阶段观测到NO2逸出。再添加乙酸酐(300mL)且反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物浇注至冰(约1.5L)上，搅拌且返回至室温。通过真空过滤收集所得黄色沉淀物且在干燥器中干燥得到呈黄色固体状的所需双-硝基化合物4。产量＝66.7g(100％)。由LC/MS发现纯度令人满意(3.25min(ES+)m/z(相对强度)517([M+Na]+,40)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(s,2H),7.06(s,2H),4.32(t,4H,J＝6.0Hz),3.95(s,6H),3.90(s,6H),2.45-2.40(m,2H)。
(c)1',3'-双(4-羧基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丙烷(5)
甲酯4(66.7g，135mmol)于THF(700mL)中的浆料用1NNaOH(700mL)处理且反应混合物在室温下剧烈搅拌。搅拌4天后，浆料变为黑色溶液，其在减压下经历旋转蒸发以移除THF。所得水性残余物用浓盐酸酸化至pH1且收集无色沉淀物5且在真空烘箱中充分干燥(50℃)。产量＝54.5g(87％)。由LC/MS发现纯度令人满意(2.65min(ES+)m/z(相对强度)489([M+Na]+,30))；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.62(s,2H),7.30(s,2H),4.29(t,4H,J＝6.0Hz),3.85(s,6H),2.30-2.26(m,2H)。
(d)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双[(5-甲氧基-2-硝基-1,4-伸苯基)羰基]]双[(2S,4R)-甲基-4-羟基吡咯烷-2-甲酸酯](6)
乙二酰氯(24.5mL，35.6g，281mmol)添加至经搅拌的硝基苯甲酸5(43g，92.3mmol)及DMF(6mL)于无水DCM(600mL)中的悬浮液中。在初始起泡后，反应悬浮液变为溶液且混合物在室温下搅拌16小时。通过用MeOH处理反应混合物的样品确认转化成酸氯化物且通过LC/MS观测到所得双-甲酯。通过在减压下蒸发移除大部分溶剂；所得浓缩溶液再溶解于最少量无水DCM中且用乙醚研磨。通过过滤收集所得黄色沉淀物，用冷的乙醚洗涤且在真空烘箱中在40℃下干燥1小时。固体酸氯化物在-40℃(干冰/CH3CN)下经25分钟时间分批添加至经搅拌的(2S,4R)-甲基-4-羟基吡咯烷-2-甲酸酯盐酸盐(38.1g，210mmol)及TEA(64.5mL，g，463mmol)于DCM(400mL)中的悬浮液中。反应立即完成，如由LC/MS(2.47min(ES+)m/z(相对强度)721([M+H]+,100)判断。混合物用DCM(200mL)稀释且用1NHCl(300mL)、饱和NaHCO3(300mL)、盐水(400mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且在真空中蒸发溶剂得到呈橙色固体状的纯的产物6(66.7g，100％)。[α]22 D＝-46.1°(c＝0.47,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)(旋转异构体)δ7.63(s,2H),6.82(s,2H),4.79-4.72(m,2H),4.49-4.28(m,6H),3.96(s,6H),3.79(s,6H),3.46-3.38(m,2H),3.02(d,2H,J＝11.1Hz),2.48-2.30(m,4H),2.29-2.04(m,4H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)(旋转异构体)δ172.4,166.7,154.6,148.4,137.2,127.0,109.7,108.2,69.7,65.1,57.4,57.0,56.7,52.4,37.8,29.0；IR(ATR,CHCl3)3410(br),3010,2953,1741,1622,1577,1519,1455,1429,1334,1274,1211,1177,1072,1050,1008,871cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)721([M+H]+,47),388(80)；HRMS[M+H]+.理论值C31H36N4O16m/z721.2199,实验值(ES+)m/z721.2227。
(e)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双(11aS,2R)-2-(羟基)-7-甲氧基-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮-5,11-二酮](7)
方法A：硝基-酯6(44g，61.1mmol)于MeOH(2.8L)中的溶液添加至5L3-颈圆底烧瓶中的新近购买的镍(约50g于H2O中的约50％浆料)及抗撞击颗粒中。混合物在回流下加热且接着用水合肼(21.6mL，22.2g，693mmol)于MeOH(200mL)中的溶液逐滴处理，此时观测到剧烈起泡。当添加完成(约45分钟)时，再小心添加镍直至起泡停止且反应混合物的初始黄色褪色。混合物在回流下再加热5分钟，此时通过TLC(90:10v/vCHCl3/MeOH)及LC/MS(2.12min(ES+)m/z(相对强度)597([M+H]+,100))认为反应完成。反应混合物立即通过真空抽吸经由含有硅藻土的烧结漏斗热过滤。通过在真空中蒸发使滤液体积降低，此时形成无色沉淀物，通过过滤收集且在真空干燥器中干燥得到7(31g，85％)。[α]27 D＝+404°(c＝0.10,DMF)；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.2(s,2H,NH),7.26(s,2H),6.73(s,2H),5.11(d,2H,J＝3.98Hz,OH),4.32-4.27(m,2H),4.19-4.07(m,6H),3.78(s,6H),3.62(dd,2H,J＝12.1,3.60Hz),3.43(dd,2H,J＝12.0,4.72Hz),2.67-2.57(m,2H),2.26(p,2H,J＝5.90Hz),1.99-1.89(m,2H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.1,164.0,149.9,144.5,129.8,117.1,111.3,104.5,54.8,54.4,53.1,33.5,27.5；IR(ATR,纯)3438,1680,1654,1610,1605,1516,1490,1434,1379,1263,1234,1216,1177,1156,1115,1089,1038,1018,952,870cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)619([M+Na]+,10),597([M+H]+,52),445(12),326(11)；HRMS[M+H]+理论值C29H32N4O10m/z597.2191,实验值(ES+)m/z597.2205。
方法B：10％Pd/C(7.5g，10％w/w)于DMF(40mL)中的悬浮液添加至硝基-酯6(75g，104mmol)于DMF(360mL)中的溶液中。悬浮液在Parr氢化设备中氢化8小时。在氢摄取停止后，通过LC/MS监测反应进展。通过过滤移除固体Pd/C且滤液在真空(低于10mbar)中在40℃下通过旋转蒸发而浓缩，得到含有微量DMF及残余木炭的黑色油。残余物在水浴(旋转蒸发器浴)上在40℃下于EtOH(500mL)中消化且所得悬浮液经硅藻土过滤且用乙醇(500mL)洗涤得到透明滤液。水合肼(10mL，321mmol)添加至溶液中且反应混合物在回流下加热。20分钟后，观测到形成白色沉淀物且再继续回流30分钟。将混合物冷却至室温且通过过滤撷取沉淀物，用乙醚(沉淀物的2:1体积)洗涤且在真空干燥器中干燥得到7(50g，81％)。方法B的分析数据：与所得方法A的数据相同(旋光度、1HNMR、LC/MS及TLC)。
(f)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双(11aS,2R)-2-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮-5,11-二酮](8)
TBSCl(27.6g，182.9mmol)及咪唑(29.9g，438.8mmol)在0℃(冰/丙酮)下添加至浑浊的四内酰胺7(21.8g，36.6mmol)于无水DMF(400mL)中的溶液中。混合物在氮气氛围下搅拌3小时，随后认为反应完成，如通过LC/MS(3.90min(ES+)m/z(相对强度)825([M+H]+,100)判断。将反应混合物浇注至冰(约1.75L)上且在搅拌下升温至室温。通过真空过滤收集所得白色沉淀物，用H2O、乙醚洗涤且在真空干燥器中干燥得到纯的8(30.1g，99％)。[α]23 D＝+234°(c＝0.41,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,2H,NH),7.44(s,2H),6.54(s,2H),4.50(p,2H,J＝5.38Hz),4.21-4.10(m,6H),3.87(s,6H),3.73-3.63(m,4H),2.85-2.79(m,2H),2.36-2.29(m,2H),2.07-1.99(m,2H),0.86(s,18H),0.08(s,12H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ170.4,165.7,151.4,146.6,129.7,118.9,112.8,105.3,69.2,65.4,56.3,55.7,54.2,35.2,28.7,25.7,18.0,-4.82及-4.86；IR(ATR,CHCl3)3235,2955,2926,2855,1698,1695,1603,1518,1491,1446,1380,1356,1251,1220,1120,1099,1033cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)825([M+H]+,62),721(14),440(38)；HRMS[M+H]+.理论值C41H60N4O10Si2m/z825.3921,实验值(ES+)m/z825.3948。
(g)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双(11aS,2R)-2-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮-5,11-二酮](9)
n-BuLi(68.3mL于己烷中的1.6M溶液，109mmol)在氮气氛围下于-30℃(干冰/乙二醇)下逐滴添加至经搅拌的四内酰胺8(30.08g，36.4mmol)于无水THF(600mL)中的悬浮液中。反应混合物在此温度下搅拌1小时(现为红橙色)，此时逐滴添加SEMCl(19.3mL，18.2g，109mmol)于无水THF(120mL)中的溶液。反应混合物缓慢升温至室温且在氮气氛围下搅拌16小时。认为反应完成，如通过TLC(EtOAc)及LC/MS(4.77min(ES+)m/z(相对强度)1085([M+H]+,100)判断。通过在真空中蒸发移除THF且所得残余物溶解于EtOAc(750mL)中，用H2O(250mL)、盐水(250mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且在真空中蒸发得到粗的呈油状的经N10-SEM保护的四内酰胺9(最大39.5g，100％)。产物未经纯化即用于下一步骤中。[α]23 D＝+163°(c＝0.41,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(s,2H),7.22(s,2H),5.47(d,2H,J＝9.98Hz),4.68(d,2H,J＝9.99Hz),4.57(p,2H,J＝5.77Hz),4.29-4.19(m,6H),3.89(s,6H),3.79-3.51(m,8H),2.87-2.81(m,2H),2.41(p,2H,J＝5.81Hz),2.03-1.90(m,2H),1.02-0.81(m,22H),0.09(s,12H),0.01(s,18H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ170.0,165.7,151.2,147.5,133.8,121.8,111.6,106.9,78.1,69.6,67.1,65.5,56.6,56.3,53.7,35.6,30.0,25.8,18.4,18.1,-1.24,-4.73；IR(ATR,CHCl3)2951,1685,1640,1606,1517,1462,1433,1360,1247,1127,1065cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)1113([M+Na]+,48),1085([M+H]+,100),1009(5),813(6)；HRMS[M+H]+.理论值C53H88N4O12Si4m/z1085.5548,实验值(ES+)m/z1085.5542。
(h)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双(11aS,2R)-2-羟基-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮-5,11-二酮](10)
TBAF的溶液(150mL于THF中的1.0M溶液，150mmol)在室温下添加至经搅拌的粗双-甲硅烷基醚9[84.0g(最大56.8g)，52.4mmol]于THF(800mL)中的溶液中。在搅拌1小时后，通过TLC(95:5v/vCHCl3/MeOH)分析反应混合物显示反应完成。通过在室温下在减压下蒸发移除THF且所得残余物溶解于EtOAc(500mL)中且用NH4Cl(300mL)洗涤。合并的有机层用盐水(60mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且在减压下蒸发得到粗产物。通过急骤层析(梯度溶离：100％CHCl3至96:4v/vCHCl3/MeOH)纯化得到呈白色泡沫状的纯的四内酰胺10(36.0g，79％)。LC/MS3.33min(ES+)m/z(相对强度)879([M+Na]+,100),857([M+H]+,40)；[α]23 D＝+202°(c＝0.34,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.28(s,2H),7.20(s,2H),5.44(d,2H,J＝10.0Hz),4.72(d,2H,J＝10.0Hz),4.61-4.58(m,2H),4.25(t,4H,J＝5.83Hz),4.20-4.16(m,2H),3.91-3.85(m,8H),3.77-3.54(m,6H),3.01(宽单峰,2H,OH),2.96-2.90(m,2H),2.38(p,2H,J＝5.77Hz),2.11-2.05(m,2H),1.00-0.91(m,4H),0.00(s,18H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ169.5,165.9,151.3,147.4,133.7,121.5,111.6,106.9,79.4,69.3,67.2,65.2,56.5,56.2,54.1,35.2,29.1,18.4,-1.23；IR(ATR,CHCl3)2956,1684,1625,1604,1518,1464,1434,1361,1238,1058,1021cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)885([M+29]+.,70),857([M+H]+,100),711(8),448(17)；HRMS[M+H]+.理论值C41H60N4O12Si2m/z857.3819,实验值(ES+)m/z857.3826。
(i)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双(11aS)-7-甲氧基-2-氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮-5,11-二酮](11)
二醇10(25.6g，30mmol，1当量)、NaOAc(6.9g，84mmol，2.8当量)及TEMPO(188mg，1.2mmol，0.04当量)在Ar下溶解于DCM(326mL)中。冷却至-8℃(内部温度)且经15分钟分批添加TCCA(9.7g，42mmol，1.4当量)。30分钟后TLC(EtOAc)及LC/MS[3.60min.(ES+)m/z(相对强度)854.21([M+H]+,40),(ES-)m/z(相对强度)887.07([M-H+Cl]-.,10)]指示反应完成。添加冷的DCM(200mL)且混合物经硅藻土垫过滤，随后用饱和碳酸氢钠/硫代硫酸钠(1:1v/v；200mL×2)的溶液洗涤。有机层通过MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂得到黄色/橙色海绵状物(25.4g，99％)。LC/MS[3.60min.(ES+)m/z(相对强度)854.21([M+H]+,40)；[α]20 D＝+291°(c＝0.26,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(s,2H),7.25(s,2H),5.50(d,2H,J＝10.1Hz),4.75(d,2H,J＝10.1Hz),4.60(dd,2H,J＝9.85,3.07Hz),4.31-4.18(m,6H),3.89-3.84(m,8H),3.78-3.62(m,4H),3.55(dd,2H,J＝19.2,2.85Hz),2.76(dd,2H,J＝19.2,9.90Hz),2.42(p,2H,J＝5.77Hz),0.98-0.91(m,4H),0.00(s,18H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ206.8,168.8,165.9,151.8,148.0,133.9,120.9,111.6,107.2,78.2,67.3,65.6,56.3,54.9,52.4,37.4,29.0,18.4,-1.24；IR(ATR,CHCl3)2957,1763,1685,1644,1606,1516,1457,1434,1360,1247,1209,1098,1066,1023cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)881([M+29]+.,38),853([M+H]+,100),707(8),542(12)；HRMS[M+H]+.理论值C41H56N4O12Si2m/z853.3506,实验值(ES+)m/z853.3502。
(j)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]双(11aS)-7-甲氧基-2-[[(三氟甲基)磺酰基]氧基]-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,10,11,11a-四氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮-5,11-二酮](12)
无水2,6-二甲基吡啶(5.15mL，4.74g，44.2mmol)在氮气氛围下在-45℃(干冰/乙腈)下一次性注射至经剧烈搅拌的双-酮11(6.08g，7.1mmol)于无水DCM(180mL)中的溶液中。快速地逐滴注射自新近打开的安瓿获得的无水三氟甲磺酸酐(7.2mL，12.08g，42.8mmol)，同时保持温度为-40℃或低于-40℃。反应混合物在-45℃下搅拌1小时，此时TLC(50/50v/v正己烷/EtOAc)显示起始物质完全耗尽。冷的反应混合物立即用DCM(200mL)稀释且在剧烈摇动下用水(1×100mL)、5％棕檬酸溶液(1×200mL)、饱和NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤且干燥(MgSO4)。过滤且在减压下蒸发溶剂得到粗产物，其通过急骤柱层析(梯度溶离：90:10v/v正己烷/EtOAc至70:30v/v正己烷/EtOAc)纯化得到呈黄色泡沫状的双-烯醇三氟甲磺酸酯12(5.5g，70％)。LC/MS4.32min(ES+)m/z(相对强度)1139([M+Na]+,20)；[α]24 D＝+271°(c＝0.18,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(s,2H),7.26(s,2H),7.14(t,2H,J＝1.97Hz),5.51(d,2H,J＝10.1Hz),4.76(d,2H,J＝10.1Hz),4.62(dd,2H,J＝11.0,3.69Hz),4.32-4.23(m,4H),3.94-3.90(m,8H),3.81-3.64(m,4H),3.16(ddd,2H,J＝16.3,11.0,2.36Hz),2.43(p,2H,J＝5.85Hz),1.23-0.92(m,4H),0.02(s,18H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ167.1,162.7,151.9,148.0,138.4,133.6,120.2,118.8,111.9,107.4,78.6,67.5,65.6,56.7,56.3,30.8,29.0,18.4,-1.25；IR(ATR,CHCl3)2958,1690,1646,1605,1517,1456,1428,1360,1327,1207,1136,1096,1060,1022,938,913cm-1；MS(ES+)m/z(相对强度)1144([M+28]+.,100),1117([M+H]+,48),1041(40),578(8)；HRMS[M+H]+.理论值C43H54N4O16Si2S2F6m/z1117.2491,实验值(ES+)m/z1117.2465。
(a)(S)-三氟甲烷磺酸8-(3-(((S)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基酯(13)
将Pd(PPh3)4(116.9mg，0.101mmol)添加至经搅拌的三氟甲磺酸双-烯醇酯12(5.65g，5.06mmol)、4-氨基苯基硼酸四甲基乙二醇酯(1g，4.56mmol)、Na2CO3(2.46g，23.2mmol)、MeOH(37mL)、甲苯(74mL)及水(37mL)的混合物中。将反应混合物在氮气氛围下在30℃下搅拌24小时，此时所有硼酸酯耗尽。接着将反应混合物蒸发至干燥，随后残余物溶解于EtOAc(150mL)中且用H2O(2×100mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且在减压下蒸发得到粗产物。通过急骤层析(梯度溶离：80:20v/v己烷/EtOAc至60:40v/v己烷/EtOAc)纯化得到呈浅黄色泡沫状的产物13(2.4g，45％)。LC/MS4.02min(ES+)m/z(相对强度)1060.21([M+H]+,100)；1H-NMR:(CDCl3,400MHz)δ7.40(s,1H),7.33(s,1H),7.27(bs,3H),7.24(d,2H,J＝8.5Hz),7.15(t,1H,J＝2.0Hz),6.66(d,2H,J＝8.5Hz),5.52(d,2H,J＝10.0Hz),4.77(d,1H,J＝10.0Hz),4.76(d,1H,J＝10.0Hz),4.62(dd,1H,J＝3.7,11.0Hz),4.58(dd,1H,J＝3.4,10.6Hz),4.29(t,4H,J＝5.6Hz),4.00-3.85(m,8H),3.80-3.60(m,4H),3.16(ddd,1H,J＝2.4,11.0,16.3Hz),3.11(ddd,1H,J＝2.2,10.5,16.1Hz),2.43(p,2H,J＝5.9Hz),1.1-0.9(m,4H),0.2(s,18H)。13C-NMR:(CDCl3,100MHz)δ169.8,168.3,164.0,162.7,153.3,152.6,149.28,149.0,147.6,139.6,134.8,134.5,127.9,127.5,125.1,123.21,121.5,120.5,120.1,116.4,113.2,108.7,79.8,79.6,68.7,68.5,67.0,66.8,58.8,58.0,57.6,32.8,32.0,30.3,19.7,0.25。
(b)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-环丙基-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-5,11(10H,11aH)-二酮(14)
三苯胂(0.24g，0.8mmol)、氧化银(I)(1.02g，4.4mmol)、环丙基硼酸(0.47g，5.5mmol)及起始物质13(1.15g，1.1mmol)在氩气氛围下溶解于二噁烷(30mL)中。磷酸三钾(2.8g，13.2mmol)用杵棒及研钵研磨且快速添加至反应混合物中。将反应混合物抽成真空且用氩气冲洗3次且加热至71℃。添加钯(II)双(氯化苯甲腈)(84mg，0.22mmol)且将反应容器抽成真空且用氩气冲洗3次。10分钟后，获取小样本以通过TLC(80:20v/v乙酸乙酯/己烷)及LC/MS进行分析。30分钟后，反应完成(LC/MS分析指示起始物质完全耗尽)且反应物经硅藻土过滤且滤板用乙酸乙酯(400mL)洗涤。滤液用水(2×200mL)及盐水(2×200mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。通过硅胶柱层析(30:70v/v己烷/乙酸乙酯)纯化得到呈橙色/黄色固体状的产物14(0.66g，63％)。方法1,LC/MS(3.85min(ES+)m/z(相对强度)952.17([M+H]+,100)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(d,2H,J＝8.4Hz),7.30(s,1H),7.25-7.19(m,4H),6.68(s,1H),6.62(d,2H,J＝8.4Hz),5.49(dd,2H,J＝5.6,10.0Hz),4.73(明显三重峰,2H,J＝10.8Hz),4.54(dd,1H,J＝3.2,10.4Hz),4.40(dd,1H,J＝3.2,10.4Hz),4.29-4.23(m,4H),3.91-3.85(m,7H),3.80-3.71(m,2H),3.70-3.61(m,2H),3.38-3.32(m,1H),3.12-3.01(m,1H),2.50-2.69(m,1H),2.40(q,2H,J＝5.6Hz),1.50-1.43(m,1H),0.99-0.71(m,6H),0.54-0.59(m,2H),0.00(s,18H)ppm。
(c)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-5(11aH)-酮(15)
SEM二内酰胺14(0.66g，0.69mmol)溶解于THF(23mL)中且在氩气氛围下冷却至-78℃。经5分钟逐滴添加溶液(1.7mL，1M于THF中)，同时监测温度。20分钟后，获取小样本且用水洗涤以用于LC/MS分析。添加水(50mL)且移除冷浴。萃取有机层且用盐水(60mL)洗涤。合并的水层用CH2Cl2/MeOH(90/10v/v)(2×50mL)洗涤。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。粗产物溶解于MeOH(48mL)、CH2Cl2(18mL)及水(6mL)中，且添加足够硅胶以得到黏稠的悬浮液。搅拌5天后，悬浮液经烧结漏斗过滤且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(约200mL)洗涤直至产物不再溶离。有机层用盐水(2×70mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。通过硅胶柱层析(100％CHCl3至96/4v/vCHCl3/MeOH)纯化得到呈黄色固体状的产物15(302mg，66％)。方法1,LC/MS(2.42min(ES+)m/z(相对强度)660.74([M+H]+,30)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,1H,J＝3.6Hz),7.78(d,1H,J＝3.6Hz),7.58-7.44(m,3H),7.34-7.20(m,3H),6.88-6.66(m,4H),4.35-4.15(m,6H),3.95-3.75(m,7H),3.39-3.22(m,1H),3.14-3.04(m,1H),2.93-2.85(m,1H),2.46-2.36(m,2H),1.49-1.41(m,1H),0.80-0.72(m,2H),0.58-0.51(明显单峰,2H)ppm。
(d)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯(16)
在用氩气填充的经脱气的圆底烧瓶中，HO-Ala-Val-alloc(149.6mg，0.549mmol)及EEDQ(135.8mg，0.549mmol)溶解于无水CH2Cl2/MeOH的9:1混合物(5mL)中。烧瓶包裹在铝箔中且反应混合物在室温下搅拌1小时，随后添加起始物质15(302mg，0.457mmol)。反应混合物在室温下再搅拌40小时，随后通过在减压下旋转蒸发来移除挥发性物质(在反应后进行LC/MS,RT起始物质2.32分钟,(ES+660.29([M+H]+,100))。粗产物通过硅胶柱层析(100％CHCl3至90/10v/vCHCl3/MeOH)直接纯化得到纯的产物(16)，42％产率(174mg)。方法2LC/MS(2.70min(ES+)m/z(相对强度)914.73([M+H]+.,60),660.43(60),184.31(100))。
(e)(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺(17)
起始物质16(170mg，0.185mmol)在填充有氩气的圆底烧瓶中溶解于无水CH2Cl2(5mL)中，随后添加吡咯烷(41μL，0.21mmol)。烧瓶用氩气吹扫/再填充三次，随后添加Pd(PPh3)4(14mg，0.084mmol)且重复冲洗操作。1小时后，观测到起始物质完全耗尽(在反应后进行LC/MS)且将Et2O(50mL)添加至反应混合物中，搅拌反应混合物直至所有产物溶解于溶液中。固体经烧结漏斗过滤且用Et2O(2×25mL)洗涤两次。更换收集烧瓶且分离的固体溶解于CHCl3(100mL或直至所有产物通过烧结漏斗)中。接着通过在减压下旋转蒸发来移除挥发性物质，得到粗产物17(168mg)，其直接用于下一步骤中。LC/MS方法2(2.70min(ES+)m/z(相对强度)830.27([M+H]+.,50),660.13(80),171.15(100))。
(f)N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(18或DL1)
在用氩气吹扫及填充的圆底烧瓶中，起始物质17(154mg，0.185mmol)及EDCI.HCl(110mg，0.185mmol)溶解于无水CH2Cl2(5mL)中。混合物在室温下搅拌1小时，随后添加PEG8-顺丁烯二酰亚胺(35.6mg，0.185mmol)且反应混合物再搅拌16小时(或直至反应完成，通过LC/MS监测)。反应溶液用CH2Cl2(50mL)稀释且有机物用H2O(50mL)及盐水(50mL)洗涤，随后经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发来移除溶剂，得到粗产物。通过硅胶柱层析(100％CHCl3至85/15v/vCHCl3/MeOH)纯化得到所需产物(135mg)，然而观测到残余微量的未反应的PEG8-顺丁烯二酰亚胺(通过LC/MS,2.21分钟,方法2)。通过自动逆相硅胶层析(H2O/CH3CN)(参见一般条件信息)成功移除杂质，得到纯的最终产物(18，37mg纯产物，自110mg开始，33％)。总产率＝17％。方法2LC/MS(2.58min(ES+)m/z(相对强度)1404.03([M+H]+,20),702.63(100))。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(t,J＝3.5Hz,1H),7.80(d,J＝4.0Hz,1H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,1H),7.54-7.50(m,2H),7.45(s,1H),7.39-7.31(m,2H),6.87(d,J＝10.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.72-6.68(m,2H),4.74-4.62(m,1H),4.45-4.17(m,7H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),3.67-3.58(m,34H),3.54(m,2H),3.42(dd,J＝10.2,5.2Hz,2H),3.16-3.07(m,1H),2.92(dd,J＝16.1,4.1Hz,1H),2.62-2.49(m,4H),2.48-2.39(m,2H),2.37-2.25(m,1H),1.92(s,1H),1.52-1.44(m,3H),1.10-0.93(m,6H),0.79(dd,J＝9.2,5.3Hz,2H),0.57(dd,J＝9.2,5.3Hz,2H),未观测到NH。
C.合成药物-连接子DL1(途径2)
(a)(R)-2-((R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酸(20b)
HO-Ala-Val-H20a(350mg，1.86mmol)及Na2CO3(493mg，4.65mmol)溶解于经蒸馏的H2O(15mL)中且混合物冷却至0℃，随后添加二噁烷(15mL)(发生氨基酸盐的部分沉淀)。在剧烈搅拌下经10分钟逐滴添加Fmoc-Cl(504mg，1.95mmol)于二噁烷(15mL)中的溶液。所得混合物在0℃下搅拌2小时，随后移除冰浴且保持搅拌16小时。通过在减压下旋转蒸发移除溶剂且残余物溶解于水(150mL)中。用1NHCl将pH值自9调节至2且接着水层用EtOAc(3×100mL)萃取。合并的有机物用盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除挥发性物质，得到纯的HO-Ala-Val-Fmoc20b(746mg，97％产率)。LC/MS2.85min(ES+)m/z(相对强度)410.60；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝7.77Hz,2H),7.60(d,J＝7.77Hz,2H),7.43(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(d,J＝7.5Hz,2H),6.30(bs,1H),5.30(bs,1H),4.71-7.56(m,1H),4.54-4.36(m,2H),4.08-3.91(m,1H),2.21-2.07(m,1H),1.50(d,J＝7.1Hz,3H),1.06-0.90(m,6H)。
(b)((S)-3-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂-2-基)苯基)氨基)丙-2-基)氨基)丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(20)
在经氩气冲洗的烧瓶中，4-氨基苯基硼酸四甲基乙二醇酯(146.9mg，0.67mmol)添加至预先在室温下搅拌30分钟的HO-Ala-Val-Fmoc20b(330mg，0.8mmol)、DCC(166mg，0.8mmol)及DMAP(5mg，饱和)于无水DCM(8mL)中的溶液中。接着将反应混合物在室温下搅拌隔夜。在反应后进行LCMS及TLC。反应混合物用CH2Cl2稀释且有机物用H2O及盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除溶剂。将粗产物干燥装载至硅胶层析柱(己烷/EtOAc，6:4)上且分离呈白色固体状的纯产物20，88％产率(360mg)。
(c)三氟甲烷磺酸8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基酯(21)
双-三氟甲磺酸酯12(2.03g，1.81mmol)、硼酸四甲基乙二醇酯(1g，1.63mmol)及Na2CO3(881mg，8.31mmol)溶解于甲苯/MeOH/H2O的2:1:1混合物(40mL)中。反应烧瓶用氩气吹扫及填充三次，随后添加四(三苯基膦)钯(0)(41mg，0.035mmol)且将反应混合物加热至30℃隔夜。在减压下移除溶剂且残余物溶解于H2O(100mL)中且用EtOAc(3×100mL)萃取。合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除挥发性物质。通过硅胶柱层析(己烷/EtOAc，8:2至25:75)纯化粗产物得到纯的21，33％产率(885mg)。LC/MS3.85min(ES+)m/z(相对强度)1452.90；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.78-7.16(m,17H),7.13(s,1H),6.51-6.24(m,1H),5.51(dd,J＝10.0,5.1Hz,2H),5.36-5.11(m,1H),4.74(dd,J＝10.1,4.4Hz,2H),4.70-4.53(m,2H),4.47(d,J＝6.4Hz,1H),4.37(d,J＝7.2Hz,1H),4.27(m,4H),4.20-4.14(m,1H),3.90(s,3H),3.89(s,3H),3.77(ddd,J＝16.7,9.0,6.4Hz,3H),3.71-3.61(m,2H),3.24-2.91(m,3H),2.55-2.33(m,2H),2.22-2.07(m,1H),1.52-1.37(m,3H),1.04-0.86(m,10H),0.00(s,18H)。
(d)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(22)
在氩气氛围下，将三苯胂(42mg，0.137mmol)添加至PBD-三氟甲磺酸酯21(250mg，0.172mmol)、环丙基硼酸(73.9mg，0.86mmol)、氧化银(159mg，0.688mmol)及磷酸三钾(438mg，2.06mmol)于无水二噁烷(10mL)的混合物中。反应物用氩气冲洗3次且添加双(苯甲腈)氯化钯(II)(13.2mg，0.034mmol)。反应物再用氩气冲洗3次，随后温至75℃且搅拌10分钟。反应混合物经硅藻土垫过滤，接着用乙酸乙酯冲洗。通过在减压下旋转蒸发移除溶剂。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；1％甲醇/氯仿)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物22(132mg，50％产率)。LC/MS3.83min(ES+)m/z(相对强度)1345.91；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.88-7.14(m,17H),6.69(s,1H),6.45-6.25(m,1H),5.57-5.41(m,2H),5.34-5.14(m,1H),4.78-4.67(m,2H),4.62-4.55(m,1H),4.50-4.45(m,2H),4.51-4.44(m,1H),4.31-4.21(m,4H),4.16(m,1H),3.92(s,3H),3.86(s,3H),3.82-3.71(m,2H),3.66(m,3H),3.40-3.28(m,1H),3.07(m,1H),2.70-2.57(m,1H),2.47-2.36(m,2H),2.15(m,1H),1.51-1.40(m,3H),1.03-0.87(m,11H),0.77-0.71(m,2H),0.60-0.54(m,2H),0.00(t,J＝3.0Hz,18H)。
(e)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(23)
的溶液(0.5mL，1M于THF中)在氩气氛围下在-78℃下逐滴添加至SEM二内酰胺22(265mg，0.19mmol)于THF(10mL)的溶液中。添加是经5分钟完成以便保持反应混合物的内部温度恒定。20分钟后，等分试样用水淬灭以进行LC/MS分析，LC/MS分析表明反应完成。将水(20mL)添加至反应混合物中且移除冷浴。有机层用EtOAc(3×30mL)萃取且合并的有机物用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发来移除溶剂。粗产物溶解于MeOH(12mL)、CH2Cl2(6mL)、水(2mL)及足够的硅胶中以形成黏稠搅拌悬浮液。5天后，悬浮液经烧结漏斗过滤且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(200mL)洗涤直至产物溶离完成。有机层用盐水(2×70mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除溶剂。通过硅胶柱层析(100％CHCl3至96％CHCl3/4％MeOH)纯化得到呈黄色固体状的产物23(162mg，78％)。LC/MS3.02min(ES+)m/z(相对强度)1052.37。
(f)(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺(17)
向SEM-二内酰胺23(76mg，0.073mmol)于DMF(1mL)中的溶液中添加过量哌啶(0.2mL，2mmol)。混合物在室温下搅拌20分钟，此时反应完成(如由LC/MS监测)。反应混合物用CH2Cl2(75mL)稀释且有机相用H2O(3×75mL)洗涤直至完全移除哌啶。有机相经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂，得到粗产物17，其按原样用于下一步骤中。LC/MS2.32min(ES+)m/z(相对强度)830.00。
(g)N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-环丙基-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(18或DL1)
EDCI盐酸盐(14mg，0.0732mmol)在氩气氛围下添加至顺丁烯二酰亚胺-PEG8-酸(43.4mg，0.0732mmol)于无水CH2Cl2(5mL)中的悬浮液中。混合物在室温下搅拌1小时，随后添加PBD17(60.7mg，0.0732mmol)。保持搅拌直至反应完成(通常5小时)。反应物用CH2Cl2稀释且有机相用H2O及盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。相继通过小心硅胶层析(以100％CHCl3为起始物质至9:1CHCl3/MeOH缓慢溶离)及逆相层析纯化产物以移除未反应的顺丁烯二酰亚胺-PEG8-酸。分离产物18(DL1)(17.6％，21.8mg)。LC/MS2.57min(ES+)m/z(相对强度)1405.30；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(t,J＝3.5Hz,1H),7.80(d,J＝4.0Hz,1H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,1H),7.54-7.50(m,2H),7.45(s,1H),7.39-7.31(m,2H),6.87(d,J＝10.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.72-6.68(m,2H),4.74-4.62(m,1H),4.45-4.17(m,7H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),3.67-3.58(m,34H),3.54(m,2H),3.42(dd,J＝10.2,5.2Hz,2H),3.16-3.07(m,1H),2.92(dd,J＝16.1,4.1Hz,1H),2.62-2.49(m,4H),2.48-2.39(m,2H),2.37-2.25(m,1H),1.92(s,1H),1.52-1.44(m,3H),1.10-0.93(m,6H),0.79(dd,J＝9.2,5.3Hz,2H),0.57(dd,J＝9.2,5.3Hz,2H),未观测到NH。
D.合成药物-连接子DL2(途径1)
(a)(S)-三氟甲烷磺酸7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基酯(24)
Pd(PPh3)4(20.6mg，0.018mmol)添加至经搅拌的三氟甲磺酸双-烯醇酯12(500mg，0.44mmol)、N-甲基哌嗪硼酸酯(100mg，0.4mmol)、Na2CO3(218mg，2.05mmol)、MeOH(2.5mL)、甲苯(5mL)及水(2.5mL)的混合物中。将反应混合物在氮气氛围下在30℃下搅拌24小时，此时所有硼酸酯耗尽。接着将反应混合物蒸发至干燥，随后残余物溶解于EtOAc(100mL)中且用H2O(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且在减压下蒸发得到粗产物。通过急骤层析(梯度溶离：80:20v/v己烷/EtOAc至60:40v/v己烷/EtOAc)纯化得到呈浅黄色泡沫状的产物24(122.6mg，25％)。
LC/MS3.15min(ES+)m/z(相对强度)1144([M+H]+,20％)。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(25)
PBD-三氟甲磺酸酯24(359mg，0.314mmol)、硼酸四甲基乙二醇酯20(250mg，0.408mmol)及三乙胺(0.35mL，2.51mmol)溶解于甲苯/MeOH/H2O的2:1:1混合物(3mL)中。微波容器用氩气吹扫及填充三次，随后添加四(三苯基膦)钯(0)(21.7mg，0.018mmol)且将反应混合物置放于微波中在80℃下保持10分钟。接着，添加CH2Cl2(100mL)且有机物用水(2×50mL)及盐水(50mL)洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除挥发性物质。通过硅胶柱层析(CHCl3/MeOH，100％至9:1)纯化粗产物得到纯的25(200mg，43％产率)。LC/MS3.27min(ES+)m/z(相对强度)1478([M+H]+,100％)。
(c)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(26)
的溶液(0.34mL，1M于THF中)在氩气氛围下在-78℃下逐滴添加至SEM二内酰胺25(200mg，0.135mmol)于THF(5mL)中的溶液中。添加是经5分钟完成以便保持反应混合物的内部温度恒定。20分钟后，等分试样用水淬灭以进行LC/MS分析，LC/MS分析表明反应完成。将水(20mL)添加至反应混合物中且移除冷浴。有机层用EtOAc(3×30mL)萃取且合并的有机物用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发来移除溶剂。粗产物溶解于MeOH(6mL)、CH2Cl2(3mL)、水(1mL)及足够的硅胶中以形成黏稠搅拌悬浮液。5天后，悬浮液经烧结漏斗过滤且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(100mL)洗涤直至产物溶离完成。有机层用盐水(2×50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除溶剂。通过硅胶柱层析(100％CHCl3至96％CHCl3/4％MeOH)纯化得到呈黄色固体状的产物26(100mg，63％)。LC/MS2.67min(ES+)m/z(相对强度)1186([M+H]+,5％)。
(d)(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((R)-7-甲氧基-8-(3-(((R)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺(27)
向PBD26(36.4mg，0.03mmol)于DMF(0.9mL)中的溶液中添加过量哌啶(0.1mL，1mmol)。混合物在室温下搅拌20分钟，此时反应完成(如由LC/MS监测)。反应混合物用CH2Cl2(50mL)稀释且有机相用H2O(3×50mL)洗涤直至完全移除哌啶。有机相经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂，得到粗产物27，其按原样用于下一步骤中。LC/MS2.20min(ES+)m/z(相对强度)964([M+H]+,5％)。
(e)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)己酰胺(28或DL2)。
EDCI盐酸盐(4.7mg，0.03mmol)在氩气氛围下添加至6-马来酰亚胺己酸(6.5mg，0.03mmol)于无水CH2Cl2(3mL)中的悬浮液中。混合物在室温下搅拌1小时，随后添加PBD27(34mg，粗物质)。保持搅拌直至反应完成(6小时)。反应物用CH2Cl2稀释且有机相用H2O及盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。相继通过小心硅胶层析(以100％CHCl3为起始物质至9:1CHCl3/MeOH缓慢溶离)及逆相层析纯化产物以移除未反应的顺丁烯二酰亚胺-PEG8-酸。经2个步骤分离产物28(41％，14.6mg)。LC/MS2.40min(ES+)m/z(相对强度)1157([M+H]+,5％)
E.合成药物-连接子DL2(途径2)
PBD-三氟甲磺酸酯21(469mg，0.323mmol)、硼酸四甲基乙二醇酯(146.5mg，0.484mmol)及Na2CO3(157mg，1.48mmol)溶解于甲苯/MeOH/H2O的2:1:1混合物(10mL)中。反应烧瓶用氩气吹扫三次，随后添加四(三苯基膦)钯(0)(7.41mg，0.0064mmol)且将反应混合物加热至30℃隔夜。在减压下移除溶剂且残余物溶解于H2O(50mL)中且用EtOAc(3×50mL)萃取。合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除挥发性物质。通过硅胶柱层析(CHCl3100％至CHCl3/MeOH95％:5％)纯化粗产物得到纯的25，33％产率(885mg)。LC/MS3.27min(ES+)m/z(相对强度)1478([M+H]+,100％)。
F.合成药物-连接子DL3(途径1)
(a)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-5,11(10H,11aH)-二酮(29)
3,4-(亚甲二氧基)苯基硼酸(356mg，2.1mmol，1.3当量)、TEA(1.8mL，12.9mmol，8当量)及三氟甲磺酸酯/苯胺13(1.75g，1.7mmol，1当量)在Ar氛围下溶解于乙醇(7mL)、甲苯(13mL)及水(2mL)的混合物中。将反应混合物抽成真空且用Ar冲洗3次，随后添加四(三苯基膦)钯(0)(114mg，0.1mmol，0.06当量)。再次将烧瓶抽成真空且用Ar冲洗3次，且在微波中在80℃下加热8分钟，其中预先搅拌时间为30秒。TLC(80:20v/v乙酸乙酯/己烷)分析指示起始物质完成耗尽。反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释且用水(50mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。通过硅胶柱层析(60:40至20:80v/v己烷/乙酸乙酯)纯化得到呈黄色固体状的产物29(1.21g，71％)。LC/MS(3.92min(ES+)m/z(相对强度)1032.44([M+H]+,100)。
(b)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-5(11aH)-酮(30)
SEM二内酰胺29(0.25g，0.24mmol，1当量)溶解于THF(8mL)中且在Ar氛围下冷却至-78℃。经5分钟逐滴添加(0.6mL，1M于THF中，2.5当量)，同时监测温度。20分钟后，获取小样本且处理以用于LCMS分析。添加水(50mL)，移除冷浴且溶液用乙酸乙酯(50mL)洗涤。萃取有机层且用盐水(60mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。粗产物溶解于EtOH(15mL)中，添加CH2Cl2(7.5mL)及水(2.5mL)以及足够的硅胶直至其为黏稠悬浮液。搅拌5天后，经烧结漏斗过滤且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(100mL)洗涤直至产物不再溶离。有机层用盐水(2×50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。通过硅胶柱层析(具有1％至4％MeOH的CHCl3梯度)纯化得到呈黄色固体状的产物30(94mg，53％)。LC/MS(2.53min(ES+)m/z(相对强度)739.64([M]+.,70)。
(c)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯(31)
在Ar氛围下，丙氨酸-缬氨酸-Alloc(180mg，0.66mmol，1.2当量)与EEDQ(163mg，0.66mmol，1.2当量)一起于无水CH2Cl2(21mL)及甲醇(1mL)中搅拌1小时。PBD30(407mg，0.55mmol，1当量)溶解于无水CH2Cl2(21mL)及甲醇(1mL)中且添加至反应物中。在室温下搅拌5天后，LC/MS证实大部分产物形成。在真空中移除溶剂，随后通过柱层析(具有1％至6％MeOH的CH2Cl2梯度)纯化，得到呈黄色固体状的产物31(184mg，34％)。LC/MS(2.95min(ES+)m/z(相对强度)994.95([M+H]+,60)。
(d)(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺(32)
亚胺31(100mg，0.1mmol，1当量)在Ar氛围下溶解于无水DCM(10mL)中(借助于一滴甲醇帮助溶解)。逐滴添加吡咯烷(30μL，0.15mmol，1.5当量)，随后将烧瓶抽成真空且用Ar冲洗三次。添加Pd(PPh3)4(7mg，6μmol，0.06当量)且将烧瓶抽成真空且用Ar冲洗三次。1小时后，LC/MS分析指示产物形成及起始物质完全耗尽。Et2O(60mL)添加至反应混合物中且搅拌直至所有产物溶解于溶液中。沉淀物经烧结漏斗过滤且用Et2O(2×20mL)洗涤两次。更换收集烧瓶且使分离的固体溶解且与CHCl3(100mL)一起经烧结物洗涤。在真空中移除溶剂得到呈黄色固体状的粗产物32，其直接用于下一步骤中。LC/MS(1.14min(ES+)m/z(相对强度)910.40([M+H]+,67)。
(e)N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(33或DL3)
亚胺32(92mg，0.1mmol，1.1当量)溶解于CHCl3(6mL)中，用一滴无水MeOH帮助溶解。相继添加顺丁烯二酰亚胺-PEG8-酸(53mg，0.09mmol，1当量)及EEDQ(33mg，0.14mmol，1.5当量)。在室温下在Ar下剧烈搅拌4天直至LC/MS分析证实大部分产物形成。在真空中移除溶剂且通过硅胶柱层析(具有1％至10％MeOH的CHCl3梯度)部分纯化粗产物得到33(81mg)。通过制备型HPLC进一步纯化物质得到呈黄色固体状的33(26.3mg，18％)。快速甲酸运行:LC/MS(1.39min(ES+)m/z(相对强度)1485.00([M+H]+,64)。
G.合成药物-连接子DL3(途径2)
(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸9H-芴-9-基)甲酯(34)
三氟甲磺酸酯21(0.5g，0.35mmol，1当量)、3,4-(亚甲二氧基)苯基硼酸(75mg，0.45mmol，1.3当量)及Na2CO3(0.17g，1.6mmol，4.5当量)在Ar氛围下溶解于甲苯(11mL)、EtOH(5.5mL)及水(5.5mL)中。将烧瓶抽成真空且用Ar冲洗三次。添加Pd(PPh3)4(24mg，0.02mmol，0.06当量)且再将烧瓶抽成真空且用Ar冲洗三次。加热至30℃且搅拌隔夜。LC/MS分析证实起始物质完全耗尽。在真空中移除溶剂且残余物溶解于水(60mL)中，随后用乙酸乙酯(60mL×3)洗涤。合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。通过柱层析(50:50至25:75v/v己烷/乙酸乙酯)纯化得到呈黄色固体状的产物34(310mg，64％)。LC/MS(1.44min(ES-)m/z(相对强度)1423.35([M-H]-.,79)。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(35)
SEM二内酰胺34(0.31g，0.22mmol，1当量)溶解于THF(10mL)中且在Ar氛围下冷却至-78℃。经5分钟逐滴添加(0.5mL，1M于THF中，2.5当量)，同时监测温度。30分钟后，获取小样本且处理以用于LC/MS分析。添加水(50mL)，移除冷浴且溶液用乙酸乙酯(50mL)洗涤。萃取有机层且用盐水(60mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。粗产物溶解于EtOH(13.2mL)中，添加CH2Cl2(6.6mL)及水(2.2mL)以及足够的硅胶直至其为黏稠悬浮液。搅拌5天后，经烧结漏斗过滤且用CH2Cl2/MeOH(9:1)(100mL)洗涤直至产物不再溶离。有机层用盐水(2×50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。通过硅胶柱层析(具有1％至4％MeOH的CHCl3梯度)纯化得到呈黄色固体状的产物35(185mg，75％)。LC/MS(1.70min(ES+)m/z(相对强度)1132.85([M+H]+,60)。
(c)(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺(32)
亚胺35(82mg，0.07mmol，1当量)溶解于DMF(1mL)中，随后缓慢添加(0.2mL，2mmol，过量)。此溶液在室温下搅拌20分钟直至LC/MS分析证实起始物质完全消耗。反应混合物用CH2Cl2(50mL)稀释，用水(50mL×4)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在真空中移除溶剂。产物33未经进一步纯化即用于下一步骤中。LC/MS(1.15min(ES+)m/z(相对强度)910.60([M+H]+,58)。
H.合成药物-连接子DL5
(i)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(49)
(a)5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲醛(42)
纯三异丙基甲硅烷基氯(56.4mL，262mmol)添加至咪唑(48.7g，715.23mmol)与4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛41(47g，238mmol)的混合物中(在一起研磨)。加热混合物直至酚及咪唑熔融及溶解于溶液中(100℃)。搅拌反应混合物15分钟且接着使其冷却，因此观测到烧瓶底部形成固体(咪唑氯化物)。反应混合物用5％EtOAc/己烷稀释且直接装载于硅胶上，且衬垫相继用5％EtOAc/己烷及10％EtOAc/己烷溶离(由于少量过量，因此在产物中发现极少量未反应的TIPSCl)。所需产物用含5％乙酸乙酯的己烷溶离。通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，接着在高真空下干燥得到结晶感光固体(74.4g，88％)。由LC/MS发现纯度令人满意(4.22min(ES+)m/z(相对强度)353.88([M+H]+,100))；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.43(s,1H),7.60(s,1H),7.40(s,1H),3.96(s,3H),1.35-1.24(m,3H),1.10(m,18H)。
(b)5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酸(43)
亚氯酸钠(47.3g，523mmol，80％工业级)及磷酸二氢钠(35.2g，293mmol)(NaH2PO4)于水(800mL)中的溶液在室温下添加至化合物2(74g，209mmol)于四氢呋喃(500mL)中的溶液中。过氧化氢(60％w/w，140mL，2.93mol)立即添加至经剧烈搅拌的双相混合物中。反应混合物逸出气体(氧)，起始物质溶解且反应混合物的温度上升至45℃。30分钟后，LC/MS表明反应完成。反应混合物在冰浴中冷却且添加盐酸(1M)以将pH值降低至3(发现在许多实施例中无需此步骤，因为pH值在反应结束时已为酸性；请检查萃取之前的pH值)。接着反应混合物用乙酸乙酯(1L)萃取且有机相用盐水(2×100mL)洗涤且经硫酸镁干燥。过滤有机相且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂，得到定量产率的呈黄色固体状的产物43。LC/MS(3.93min(ES-)m/z(相对强度)367.74([M-H]-,100))；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(s,1H),7.24(s,1H),3.93(s,3H),1.34-1.22(m,3H),1.10(m,18H)。
(c)((2S,4R)-2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)甲酮(45)
DCC(29.2g，141mmol，1.2当量)在0℃下添加至酸3(43.5g，117.8mmol，1当量)及羟基苯并三唑水合物(19.8g，129.6mmol，1.1当量)于二氯甲烷(200mL)中的溶液中。移除冷浴且反应在室温下进行30分钟，此时在氩气下在-10℃下快速添加(2S,4R)-2-叔-丁基二甲基甲硅烷氧基甲基-4-羟基吡咯烷44(30g，129.6mmol，1.1当量)及三乙胺(24.66mL，176mmol，1.5当量)于二氯甲烷(100mL)中的溶液(大规模，添加时间可通过进一步冷却反应混合物来缩短)。反应混合物在室温下搅拌40分钟至1小时且通过LC/MS及TLC(EtOAc)监测。通过经硅藻土过滤移除固体且有机相用冷的0.1M盐酸水溶液洗涤直至测量到pH值为4或5。接着有机相用水洗涤，接着用饱和碳酸氢钠水溶液及盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。残余物经历柱急骤层析(硅胶；梯度40/60乙酸乙酯/己烷至80/20乙酸乙酯/己烷)。通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂得到纯的产物45(45.5g纯产物(66％)，且17g稍微不纯的产物(共90％))。LC/MS4.43min(ES+)m/z(相对强度)582.92([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),6.74(s,1H),4.54(s,1H),4.40(s,1H),4.13(s,1H),3.86(s,3H),3.77(d,J＝9.2Hz,1H),3.36(dd,J＝11.3,4.5Hz,1H),3.14-3.02(m,1H),2.38-2.28(m,1H),2.10(ddd,J＝13.3,8.4,2.2Hz,1H),1.36-1.19(m,3H),1.15-1.05(m,18H),0.91(s,9H),0.17-0.05(m,6H),(存在旋转异构体)。
(d)(S)-5-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)吡咯烷-3-酮(46)
在0℃下将TCCA(8.82g，40mmol，0.7当量)添加至经搅拌的45(31.7g，54mmol，1当量)及TEMPO(0.85g，5.4mmol，0.1当量)于无水二氯甲烷(250mL)中的溶液中。反应混合物剧烈搅拌20分钟，此时TLC(50/50乙酸乙酯/己烷)显示起始物质完全耗尽。反应混合物经硅藻土过滤且滤液用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)、硫代硫酸钠(9g于300mL中)、盐水(100mL)洗涤且经硫酸镁干燥。在减压下旋转蒸发得到定量产率的产物46。LC/MS4.52min(ES+)m/z(相对强度)581.08([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.78-7.60(m,1H),6.85-6.62(m,1H),4.94(dd,J＝30.8,7.8Hz,1H),4.50-4.16(m,1H),3.99-3.82(m,3H),3.80-3.34(m,3H),2.92-2.17(m,2H),1.40-1.18(m,3H),1.11(t,J＝6.2Hz,18H),0.97-0.75(m,9H),0.15--0.06(m,6H),(存在旋转异构体)。
(e)(S)-三氟甲烷磺酸5-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-4,5-二氢-1H-吡咯-3-基酯(47)
在-50℃(丙酮/干冰浴)下在2,6-二甲基吡啶(25.6mL，23.5g，220mmol，4当量，经筛干燥)存在下将三氟甲磺酸酐(27.7mL，46.4g，165mmol，3当量)注射(温度控制)至经剧烈搅拌的酮46(31.9g，55mmol，1当量)于无水二氯甲烷(900mL)中的悬浮液中。搅拌反应混合物1.5小时，在进行微处理(水/二氯甲烷)后进行LC/MS，显示反应完成。将水添加至仍然冷的反应混合物中且分离有机层且用饱和碳酸氢钠、盐水及硫酸镁洗涤。过滤有机相且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。残余物经历柱急骤层析(硅胶；10/90v/v乙酸乙酯/己烷)，移除过量溶离剂得到产物47(37.6g，96％)。LC/MS,方法2,4.32min(ES+)m/z(相对强度)712.89([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H),6.75(s,1H),6.05(d,J＝1.8Hz,1H),4.78(dd,J＝9.8,5.5Hz,1H),4.15-3.75(m,5H),3.17(ddd,J＝16.2,10.4,2.3Hz,1H),2.99(ddd,J＝16.3,4.0,1.6Hz,1H),1.45-1.19(m,3H),1.15-1.08(m,18H),1.05(s,6H),0.95-0.87(m,9H),0.15-0.08(m,6H)。
(f)(S)-(2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)甲酮(48)
在氩气氛围下将三苯胂(1.71g，5.60mmol，0.4当量)添加至三氟甲磺酸盐47(10.00g，14mmol，1当量)、甲基硼酸(2.94g，49.1mmol，3.5当量)、氧化银(13g，56mmol，4当量)及磷酸三钾(17.8g，84mmol，6当量)于无水二噁烷(80mL)中的混合物中。反应物用氩气冲洗3次且添加双(苯甲腈)氯化钯(II)(540mg，1.40mmol，0.1当量)。反应物再用氩气冲洗3次，随后瞬时温热至110℃(在添加烧瓶之前将干式加热设备(drysyn)加热块预先温热至110℃)。10分钟后，反应物冷却至室温且经硅藻土垫过滤。通过在减压下旋转蒸发移除溶剂。所得残余物经历柱急骤层析(硅胶；10％乙酸乙酯/己烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物48(4.5g，55％)。LC/MS,4.27min(ES+)m/z(相对强度)579.18([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H),6.77(s,1H),5.51(d,J＝1.7Hz,1H),4.77-4.59(m,1H),3.89(s,3H),2.92-2.65(m,1H),2.55(d,J＝14.8Hz,1H),1.62(d,J＝1.1Hz,3H),1.40-1.18(m,3H),1.11(s,9H),1.10(s,9H),0.90(s,9H),0.11(d,J＝2.3Hz,6H)。
(g)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(49)
在约15℃下将锌粉(28g，430mmol，37当量)添加至化合物48(6.7g，11.58mmol)于含5％甲酸的乙醇v/v(70mL)中的溶液中。使用冰浴控制所引起的放热以保持反应混合物的温度低于30℃。30分钟后，反应混合物经硅藻土垫过滤。滤液用乙酸乙酯稀释且有机相用水、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；含10％乙酸乙酯的己烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂，得到产物49(5.1g，80％)。LC/MS,4.23min(ES+)m/z(相对强度)550.21([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.28(s,1H),6.67(s,1H),6.19(s,1H),4.64-4.53(m,J＝4.1Hz,1H),4.17(s,1H),3.87(s,1H),3.77-3.69(m,1H),3.66(s,3H),2.71-2.60(m,1H),2.53-2.43(m,1H),2.04-1.97(m,J＝11.9Hz,1H),1.62(s,3H),1.26-1.13(m,3H),1.08-0.99(m,18H),0.82(s,9H),0.03--0.03(m,J＝6.2Hz,6H)。
(ii)(11S,11aS)-11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-((5-碘基戊基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯
(a)(S)-(2-(2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸烯丙酯(50)
在-78℃(丙酮/干冰浴)下在无水吡啶(0.48mL，6.00mmol，2.2当量)存在下将氯甲酸烯丙酯(0.30mL，3.00mmol，1.1当量)添加至胺49(1.5g，2.73mmol)于无水二氯甲烷(20mL)中的溶液中。30分钟后，移除浴槽且使反应混合物升温至室温。反应混合物用二氯甲烷稀释且添加饱和硫酸铜水溶液。接着有机层相继用饱和碳酸氢钠水溶液及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂，得到粗产物50，其按原样用于下一反应中。LC/MS,4.45min(ES+)m/z(相对强度)632.91([M+H]+,100)
(b)(S)-(2-(2-(羟基甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸烯丙酯(51)
粗物质50溶解于乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(28:4:4:8mL)的7:1:1:2混合物中且在室温下搅拌。3小时后，通过LC/MS观测到起始物质完全消失。反应混合物用乙酸乙酯稀释且相继用水(2×500mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量乙酸乙酯。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；含25％乙酸乙酯的己烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物51(1g，71％)。LC/MS,3.70min(ES+)m/z(相对强度)519.13([M+H]+,95)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(s,1H),7.69(s,1H),6.78(s,1H),6.15(s,1H),5.95(ddt,J＝17.2,10.5,5.7Hz,1H),5.33(dq,J＝17.2,1.5Hz,1H),5.23(ddd,J＝10.4,2.6,1.3Hz,1H),4.73(tt,J＝7.8,4.8Hz,1H),4.63(dt,J＝5.7,1.4Hz,2H),4.54(s,1H),3.89-3.70(m,5H),2.87(dd,J＝16.5,10.5Hz,1H),2.19(dd,J＝16.8,4.6Hz,1H),1.70(d,J＝1.3Hz,3H),1.38-1.23(m,3H),1.12(s,10H),1.10(s,8H)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-氨基甲酸烯丙酯(52)
二甲基亚砜(0.35mL，4.83mmol，2.5当量)在氩气氛围下在-78℃(干冰/丙酮浴)下逐滴添加至乙二酰氯(0.2mL，2.32mmol，1.2当量)于无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中。10分钟后，缓慢添加51(1g，1.93mmol)于无水二氯甲烷(8mL)中的溶液，同时保持温度仍为-78℃。15分钟后，逐滴添加三乙胺(1.35mL，经由分子筛干燥，9.65mmol，5当量)且移除干冰/丙酮浴。使反应混合物达到室温且用冷的盐酸(0.1M)、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水萃取。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量二氯甲烷得到产物52(658mg，66％)。LC/MS,3.52min(ES+)m/z(相对强度)517.14([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(s,1H),6.75-6.63(m,J＝8.8,4.0Hz,2H),5.89-5.64(m,J＝9.6,4.1Hz,2H),5.23-5.03(m,2H),4.68-4.38(m,2H),3.84(s,3H),3.83-3.77(m,1H),3.40(s,1H),3.05-2.83(m,1H),2.59(d,J＝17.1Hz,1H),1.78(d,J＝1.3Hz,3H),1.33-1.16(m,3H),1.09(d,J＝2.2Hz,9H),1.07(d,J＝2.1Hz,9H)。
(d)(11S,11aS)-11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(53)
在0℃下在氩气下将三氟甲磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯(0.70mL，3.00mmol，3当量)添加至化合物52(520mg，1.00mmol)及2,6-二甲基吡啶(0.46mL，4.00mmol，4当量)于无水二氯甲烷(40mL)中的溶液中。10分钟后，移除冷浴且反应混合物在室温下搅拌1小时。反应混合物用水、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水萃取。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量物质。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；梯度，含10％乙酸乙酯的己烷至含20％乙酸乙酯的己烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物53(540mg，85％)。LC/MS,4.42min(ES+)m/z(相对强度)653.14([M+Na]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(s,1H),6.71-6.64(m,J＝5.5Hz,2H),5.83(d,J＝9.0Hz,1H),5.80-5.68(m,J＝5.9Hz,1H),5.14-5.06(m,2H),4.58(dd,J＝13.2,5.2Hz,1H),4.36(dd,J＝13.3,5.5Hz,1H),3.84(s,3H),3.71(td,J＝10.1,3.8Hz,1H),2.91(dd,J＝16.9,10.3Hz,1H),2.36(d,J＝16.8Hz,1H),1.75(s,3H),1.31-1.16(m,3H),1.12-1.01(m,J＝7.4,2.1Hz,18H),0.89-0.81(m,9H),0.25(s,3H),0.19(s,3H)。
(e)(11S,11aS)-11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(54)
将乙酸锂(87mg，0.85mmol)添加至化合物53(540mg，0.85mmol)于湿润的二甲基甲酰胺(6mL，50:1DMF/水)中的溶液中。4小时后，反应完成且反应混合物用乙酸乙酯(25mL)稀释且用棕檬酸水溶液(pH约3)、水及盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量乙酸乙酯。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；梯度，含25％乙酸乙酯的己烷至含75％乙酸乙酯的己烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物54(400mg，定量)。LC/MS,(3.33min(ES+)m/z(相对强度)475.26([M+H]+,100)。
(f)(11S,11aS)-11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-((5-碘基戊基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(55)
将二碘基戊烷(0.63mL，4.21mmol，5当量)及碳酸钾(116mg，0.84mmol，1当量)添加至酚54(400mg，0.84mmol)于丙酮(4mL，经分子筛干燥)中的溶液中。接着将反应混合物温至60℃且搅拌6小时。通过在减压下旋转蒸发移除丙酮。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；50/50，v/v，己烷/乙酸乙酯)。收集且合并纯的部分，且移除过量溶离剂以得到55，90％产率。LC/MS,3.90min(ES+)m/z(相对强度)670.91([M]+,100)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.23(s,1H),6.69(s,1H),6.60(s,1H),5.87(d,J＝8.8Hz,1H),5.83-5.68(m,J＝5.6Hz,1H),5.15-5.01(m,2H),4.67-4.58(m,1H),4.45-4.35(m,1H),4.04-3.93(m,2H),3.91(s,3H),3.73(td,J＝10.0,3.8Hz,1H),3.25-3.14(m,J＝8.5,7.0Hz,2H),2.92(dd,J＝16.8,10.3Hz,1H),2.38(d,J＝16.8Hz,1H),1.95-1.81(m,4H),1.77(s,3H),1.64-1.49(m,2H),0.88(s,9H),0.25(s,3H),0.23(s,3H)。
(iii)11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊-3-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲酯(70)
(a)3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯基)肼基)丙酰胺基)-4-甲基-2-氧代戊酸烯丙酯(56)
在5℃(冰浴)下将三乙胺(2.23mL，18.04mmol，2.2当量)添加至经搅拌的胺49(4g，8.20mmol)及三光气(778mg，2.95mmol，0.36当量)于无水四氢呋喃(40mL)中的溶液中。监测周期性地自反应混合物移出等分试样且用甲醇淬灭且进行LC/MS分析来监测异氰酸酯反应的进行。一旦异氰酸酯形成完成，通过注射将alloc-Val-Ala-PABOH(4.12g，12.30mmol，1.5当量)及三乙胺(1.52mL，12.30mmol，1.5当量)于无水四氢呋喃(40mL)中的溶液快速添加至新近制备的异氰酸酯中。反应混合物在40℃下搅拌4小时。通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；梯度，含1％甲醇的二氯甲烷至含5％甲醇的二氯甲烷)。(使用EtOAc及己烷的替代性层析条件亦成功)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到产物56(3.9g，50％)。LC/MS,4.23min(ES+)m/z(相对强度)952.36([M+H]+,100)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(brs,1H),8.46(s,1H),7.77(brs,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(d,J＝8.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.57(d,J＝7.6Hz,1H),6.17(s,1H),6.03-5.83(m,1H),5.26(dd,J＝33.8,13.5Hz,3H),5.10(s,2H),4.70-4.60(m,2H),4.58(dd,J＝5.7,1.3Hz,2H),4.06-3.99(m,1H),3.92(s,1H),3.82-3.71(m,1H),3.75(s,3H),2.79-2.64(m,1H),2.54(d,J＝12.9Hz,1H),2.16(dq,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.67(s,3H),1.46(d,J＝7.0Hz,3H),1.35-1.24(m,3H),1.12(s,9H),1.10(s,9H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H),0.87(s,9H),0.07--0.02(m,6H)。
(b)3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(羟基甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯基)肼基)丙酰胺基)-4-甲基-2-氧代戊酸烯丙酯(57)
TBS醚56(1.32g，1.38mmol)溶解于乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(14:2:2:4mL)的7:1:1:2混合物中且在室温下搅拌。3小时后，通过LC/MS未观测到起始物质。反应混合物用乙酸乙酯(25mL)稀释且相继用水、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量乙酸乙酯。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；含2％甲醇的二氯甲烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物57(920mg，80％)。LC/MS,3.60min(ES+)m/z(相对强度)838.18([M+H]+.,100)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(s,1H),8.35(s,1H),7.68(s,1H),7.52(d,J＝8.1Hz,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),6.77(s,1H),6.71(d,J＝7.5Hz,1H),6.13(s,1H),5.97-5.82(m,J＝5.7Hz,1H),5.41-5.15(m,3H),5.10(d,J＝3.5Hz,2H),4.76-4.42(m,5H),4.03(t,J＝6.6Hz,1H),3.77(s,5H),2.84(dd,J＝16.7,10.4Hz,1H),2.26-2.08(m,2H),1.68(s，3H)，1.44(d，J＝7.0Hz，3H)，1.30(dt，J＝14.7，7.4Hz，3H)，1.12(s9H),1.10(s,9H),0.96(d,J＝6.8Hz,3H),0.93(d,J＝6.8Hz,3H)。
(c)11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊-3-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲酯(58)
二甲基亚砜(0.2mL，2.75mmol，2.5当量)在氩气氛围下在-78℃(干冰/丙酮浴)下逐滴添加至乙二酰氯(0.11mL，1.32mmol，1.2当量)于无水二氯甲烷(7mL)中的溶液中。10分钟后，缓慢添加57(920mg，1.10mmol)于无水二氯甲烷(5mL)中的溶液，同时保持温度仍为-78℃。15分钟后，逐滴添加三乙胺(0.77mL，经由分子筛干燥，5.50mmol，5当量)且移除干冰/丙酮浴。使反应混合物达到室温且用冷的盐酸(0.1M)、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水萃取。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量二氯甲烷。所得残余物经历柱急骤层析(硅胶；梯度，含2％甲醇的二氯甲烷至含5％甲醇的二氯甲烷)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物58(550mg，60％)。LC/MS,3.43min(ES+)m/z(相对强度)836.01([M]+.,100)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(s,1H),7.52-7.40(m,2H),7.21-7.08(m,J＝11.5Hz,2H),6.67(s,1H),6.60-6.47(m,J＝7.4Hz,1H),5.97-5.83(m,1H),5.79-5.66(m,1H),5.38-4.90(m,6H),4.68-4.52(m,J＝18.4,5.5Hz,4H),4.04-3.94(m,J＝6.5Hz,1H),3.87-3.76(m,5H),3.00-2.88(m,1H),2.66-2.49(m,2H),2.21-2.08(m,2H),1.76(s,3H),1.45(d,J＝7.0Hz,3H),1.09-0.98(m,J＝8.9Hz,18H),0.96(d,J＝6.7Hz,3H),0.93(d,J＝6.9Hz,3H)。
(d)11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊-3-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲酯(59)
在0℃下在氩气下将三氟甲磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯(0.38mL，1.62mmol，3当量)添加至化合物58(450mg，0.54mmol)及2,6-二甲基吡啶(0.25mL，2.16mmol，4当量)于无水二氯甲烷(5mL)中的溶液中。10分钟后，移除冷浴且反应混合物在室温下搅拌1小时。反应混合物用水、饱和碳酸氢钠水溶液及盐水萃取。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶剂。所得残余物经历柱急骤层析(硅胶；50/50v/v己烷/乙酸乙酯)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物59(334mg，65％)。LC/MS,4.18min(ES+)m/z(相对强度)950.50([M]+.,100)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.21(s,1H),7.08(d,J＝8.2Hz,2H),6.72-6.61(m,J＝8.9Hz,2H),6.16(s,1H),5.97-5.79(m,J＝24.4,7.5Hz,2H),5.41-5.08(m,5H),4.86(d,J＝12.5Hz,1H),4.69-4.60(m,1H),4.57(s,1H),4.03(t,J＝6.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.74(td,J＝9.6,3.6Hz,1H),2.43-2.09(m,J＝34.8,19.4,11.7Hz,3H),1.76(s,3H),1.43(d,J＝6.9Hz,3H),1.30-1.21(m,3H),0.97(d,J＝6.7Hz,3H),0.92(t,J＝8.4Hz,3H),0.84(s,9H),0.23(s,3H),0.12(s,3H)。
(e)11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊-3-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲酯(60)
将乙酸锂(50mg，0.49mmol)添加至化合物59(470mg，0.49mmol)于湿润的二甲基甲酰胺(4mL，50:1DMF/水)中的溶液中。4小时后，反应完成且反应混合物用乙酸乙酯稀释且用棕檬酸(约pH3)、水及盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量乙酸乙酯。所得残余物经历柱急骤层析(硅胶；梯度，50/50至25/75v/v己烷/乙酸乙酯)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到所需产物60(400mg，定量)。LC/MS,3.32min(ES+)m/z(相对强度)794.18([M+H]+.,100)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.21(s,1H),7.08(d,J＝8.2Hz,2H),6.72-6.61(m,J＝8.9Hz,2H),6.16(s,1H),5.97-5.79(m,J＝24.4,7.5Hz,2H),5.41-5.08(m,5H),4.86(d,J＝12.5Hz,1H),4.69-4.60(m,1H),4.57(s,1H),4.03(t,J＝6.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.74(td,J＝9.6,3.6Hz,1H),2.43-2.09(m,J＝34.8,19.4,11.7Hz,3H),1.76(s,3H),1.43(d,J＝6.9Hz,3H),1.30-1.21(m,3H),0.97(d,J＝6.7Hz,3H),0.92(t,J＝8.4Hz,3H),0.84(s,9H),0.23(s,3H),0.12(s,3H)。
(iv)11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苯甲酯(64)
(a)(11S)-8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊-3-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲基)氧基)羰基)-11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(61)
将碳酸钾(70mg，0.504mmol，1当量)添加至55(370mg，0.552mmol，1.2当量)及酚60(400mg，0.504mmol)于无水丙酮(25mL)中的溶液中。反应物在70℃下搅拌8小时。LC/MS证实所有起始物质未耗尽，因此将反应物在室温下搅拌隔夜且第二天再搅拌2小时。通过在减压下旋转蒸发移除丙酮。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；含80％乙酸乙酯的己烷至100％乙酸乙酯)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到产物61(385mg，57％)。LC/MS,4.07min(ES+)m/z(相对强度)1336.55([M+H]+.,50)。
(b)(11S)-8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二氧代戊-3-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲基)氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(62)
将四-正丁基氟化铵(1M，0.34mL，0.34mmol，2当量)添加至61(230mg，0.172mmol)于无水四氢呋喃(3mL)中的溶液中。起始物质在10分钟后全部耗尽。反应混合物用乙酸乙酯(30mL)稀释且相继用水及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量乙酸乙酯。所得残余物62以粗混合物形式用于下一反应中。LC/MS,2.87min(ES+)m/z(相对强度)1108.11([M+H]+.,100)。
(c)11-羟基-7-甲氧基-8-((5-((7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S)-4-(2-(1-((1-氨基-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)肼基)苯甲酯(63)
四(三苯基膦)钯(0)(12mg，0.01mmol，0.06当量)添加至粗物质62(0.172mmol)及吡咯烷(36μL，0.43mmol，2.5当量)于无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中。搅拌反应混合物20分钟且用二氯甲烷稀释且相继用饱和氯化铵水溶液及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量二氯甲烷。所得残余物63以粗混合物形式用于下一反应中。LC/MS,2.38min(ES+)m/z(相对强度)922.16([M+H]+.,40)。
(d)11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苯甲酯(64或DL5)
将1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDCI，33mg，0.172mmol)添加至粗63(0.172mmol)及Mal-(PEG)8-酸(100mg，0.172mmol)于无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中。搅拌反应物2小时且通过LC/MS观测到不再存在起始物质。反应物用二氯甲烷稀释且相继用水及盐水洗涤。有机相经硫酸镁干燥，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量二氯甲烷。所得残余物经历急骤柱层析(硅胶；100％氯仿至含10％甲醇的氯仿)。收集且合并纯的部分，且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到64或DL5(60mg，25％(经3个步骤))。
I.合成药物-连接子DL4(途径1)
化合物65为WO2011/130598的化合物79
11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基)氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸(11S)-4-(1-碘基-20-异丙基-23-甲基-2,18,21-三氧代-6,9,12,15-四氧-3,19,22-三氮杂二十四酰胺基)苯甲酯(66或DL4)
将N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC，4.71μL，0.0304mmol)添加至胺65(0.0276mmol)及碘基-(PEG)4-酸(13.1mg，0.0304mmol)于无水二氯甲烷(0.8mL)中的溶液中。搅拌反应物3小时且通过LC/MS观测到不再存在起始物质。反应混合物直接装载至薄层层析(TLC)板上且通过制备型TLC(含10％甲醇的氯仿)纯化。将纯的材料带自TLC板刮去，溶解于含10％甲醇的氯仿中，过滤且通过在减压下旋转蒸发移除过量溶离剂，得到66(D)(20.9mg，56％)。LC/MS,方法2,3.08min(ES+)m/z(相对强度)1361.16([M+H]+,100)。
J.合成药物-连接子DL4(途径2)
此实施例J中使用以下方法。
LCMS数据是使用具有Agilent6110四极聚焦器MS的Agilent1200系列LC/MS在电喷电离作用下获得。移动相A-含0.1％乙酸的水。移动相B-0.1％于乙腈中。流动速率为1.00ml/min。梯度自5％B经3分钟上升至95％B，在95％B保持1分钟且接着经6秒下降至5％B。总运行时间为5分钟。柱：PhenomenexGemini-NX3μmC18，30×2.00mm。层析是基于254nm下的UV检测。质谱是使用MS以阳性模式获得。质子NMR化学位移值是使用BrukerAV400在400MHz下以δ标度测量。已使用以下缩写：s，单峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰。偶合常数是以Hz报道。除非另有说明，否则柱层析(通过急骤程序)是用MerckKieselgel二氧化硅(Art.9385)进行。质谱分析(MS)数据是使用耦接至Waters2795HPLC分离模组的WatersMicromassLCT器具收集。薄层层析法(TLC)是用硅胶铝板(Merck60，F254)进行。所有其他化学品及溶剂均购自Sigma-Aldrich或FisherScientific且未经进一步纯化即按原样使用。
旋光度是用ADP220偏光计(BellinghamStanleyLtd.)测量且浓度(c)以g/100mL给出。熔点是使用数位熔点设备(Electrothermal)测量。IR光谱是用Perkin-ElmerSpectrum1000FTIR光谱仪记录。1H及13CNMR光谱是分别在400MHz及100MHz下使用BrukerAvanceNMR光谱仪在300K下获得。化学位移是相对于TMS(□＝0.0ppm)报道，且信号指定为s(单峰)、d(双重线)、t(三重峰)、dt(双三重峰)、dd(双二重峰)、ddd(双重双二重峰)或m(多重峰)，其中偶合常数以赫兹(Hz)给出。质谱分析(MS)数据是使用耦接至具有Waters2996PDA的Waters2695HPLC的WatersMicromassZQ器具收集。所用WatersMicromassZQ参数为：毛细管(kV)，3.38；锥体(V)，35；提取器(V)，3.0；源温度(℃)，100；去溶剂化温度(℃)，200；锥体流动速率(L/h)，50；去溶剂化流动速率(L/h)，250。高解析度质谱分析(HRMS)数据是在WatersMicromassQTOFGlobal上在阳性W模式下使用经金属涂布的硼硅玻璃尖端将样品引入器具中来记录。薄层层析(TLC)是在硅胶铝板(Merck60，F254)上进行，且急骤层析利用硅胶(Merck60，230-400目ASTM)。除HOBt(NovaBiochem)及固体负载试剂(Argonaut)外，所有其他化学品及溶剂均是购自Sigma-Aldrich且未经进一步纯化即按原样使用。无水溶剂是通过在干燥氮气氛围下在合适干燥剂存在下蒸馏而制备，且经由分子筛或钠线储存。石油醚是指在40℃-60℃沸腾的部分。
一般LC/MS条件：HPLC(WatersAlliance2695)是使用水(A)(甲酸0.1％)及乙腈(B)(甲酸0.1％)的移动相进行。梯度：初始组成5％B保持1.0分钟，接着在3分钟内自5％B达到95％B。组成在95％B下保持0.5分钟，且接着在0.3分钟内返回至5％B。总梯度运行时间等于5分钟。流动速率3.0mL/min，经由进入质谱仪的零死体积T形连接件分离400μL。波长检测范围：220nm至400nm。功能类型：二极管阵列(535次扫描)。柱：OnyxMonolithicC1850×4.60mm
最初制备以下中间物。
(a-i)(S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸(I2)
氯甲酸烯丙酯(36.2ml，340.59mmol，1.2当量)逐滴添加至经搅拌的L-缬氨酸(I1)(33.25g，283.82mmol，1.0当量)及碳酸钾(59.27g，425.74mmol，1.5当量)于水(650mL)及THF(650mL)中的溶液中。反应混合物在室温下搅拌18小时，接着溶剂在减压下浓缩且剩余溶液用乙醚(3×100mL)萃取。水性部分用浓盐酸酸化至pH2且用DCM(3×100mL)萃取。合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到呈无色油状的产物(57.1g，假设100％产率)。LC/MS(1.966min(ES+)),m/z:202.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.57(brs,1H),7.43(d,1H,J＝8.6Hz),5.96-5.86(m,1H),5.30(ddd,1H,J＝17.2,3.4,1.7Hz),5.18(ddd,1H,J＝10.4,2.9,1.6Hz),4.48(dt,2H,J＝5.3,1.5Hz),3.85(dd,1H,J＝8.6,6.0Hz),2.03(oct,1H,J＝6.6Hz),0.89(d,3H,J＝6.4Hz),0.87(d,3H,J＝6.5Hz)。
(a-ii)(S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(I3)
向经搅拌的受保护的酸I2(60.6g，301.16mmol，1.0当量)及N-羟基酰亚胺(34.66g，301.16mmol，1.0当量)于无水THF(800mL)中的溶液中添加二环己基碳化二亚胺(62.14g，301.16mmol，1当量)。反应物在室温下搅拌18小时。接着过滤反应混合物，固体用THF洗涤且合并的滤液在减压下浓缩。残余物再溶解于DCM中且在0℃下静置30分钟。过滤悬浮液且用冷的DCM洗涤。在减压下浓缩滤液，得到呈黏性无色油状的产物(84.7g，假设100％产率)，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。LC/MS(2.194min(ES+)),m/z:321.0[M+Na]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.0(d,1H,J＝8.3Hz),5.97-5.87(m,1H),5.30(ddd,1H,J＝17.2,3.0,1.7Hz),5.19(ddd,1H,J＝10.4,2.7,1.4Hz),4.52(dt,2H,J＝5.3,1.4Hz),4.32(dd,1H,J＝8.3,6.6Hz),2.81(m,4H),2.18(oct,1H,J＝6.7Hz),1.00(d,6H,J＝6.8Hz)。
(a-iii)(S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酸(I4)
将丁二酰亚胺酯I3(12.99g，43.55mmol，1.0当量)于THF(50mL)中的溶液添加至L-丙氨酸(4.07g，45.73mmol，1.05当量)及NaHCO3(4.02g，47.90mmol，1.1当量)于THF(100mL)及H2O(100mL)中的溶液中。混合物在室温下搅拌72小时，此时在减压下移除THF。用柠檬酸将pH值调节至3-4以使白色胶状物沉淀。在用乙酸乙酯(6×150mL)萃取后，合并的有机物用H2O(200mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。用乙醚湿磨得到呈白色粉末状的产物，通过过滤收集且用乙醚(5.78g，49％)洗涤。
LC/MS(1.925min(ES+)),m/z:273.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.47(brs,1H),8.17(d,1H,J＝6.8Hz),7.16(d,1H,J＝9.0Hz),5.95-5.85(m,1H),5.29(dd,1H,J＝17.2,1.7Hz),5.17(dd,1H,J＝10.4,1.5Hz),4.46(m,2H),4.18(quin,1H,J＝7.2Hz),3.87(dd,1H,J＝9.0,7.1Hz),1.95(oct,1H,J＝6.8Hz),1.26(d,3H,J＝7.3Hz),0.88(d,3H,J＝6.8Hz),0.83(d,3H,J＝6.8Hz)。
(a-iv)(S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代丙-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸烯丙酯(I5)
EEDQ(5.51g，22.29mmol，1.05当量)添加至对氨基苯甲醇(2.74g，22.29mmol，1.05当量)及酸I4(5.78g，21.23mmol，1当量)于无水THF(100mL)中的溶液中且在室温下搅拌72小时。接着在减压下浓缩反应混合物且所得褐色固体用乙醚湿磨且过滤，接着用过量乙醚洗涤，得到呈灰白色固体状的产物(7.1g，88％)。LC/MS(1.980min(ES+)),m/z:378.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.89(brs,1H),8.13(d,1H,J＝7.0Hz),7.52(d,2H,J＝8.5Hz),7.26(m,1H),7.23(d,2H,J＝8.5Hz),5.91(m,1H),5.30(m,1H),5.17(m,1H),4.46(m,2H),5.09(t,1H,J＝5.6Hz),4.48(m,2H),4.42(m,3H),3.89(dd,1H,J＝8.6,6.8Hz),1.97(m,1H),1.30(d,3H,J＝7.1Hz),0.88(d,3H,J＝6.8Hz),0.83(d,3H,J＝6.7Hz)。
1-碘基-2-氧代-6,9,12,15-四氧-3-氮杂十八-18-酸(I7)
碘基乙酸酐(0.250g，0.706mmol，1.1当量)于无水DCM(1mL)中的溶液添加至含氨基-PEG(4)-酸I6(0.170g，0.642mmol，1.0当量)的DCM(1mL)中。混合物在黑暗中在室温下搅拌隔夜。反应混合物用0.1MHCl洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。通过急骤层析(硅胶，含3％MeOH及0.1％甲酸的氯仿至含10％MeOH及0.1％甲酸的氯仿)纯化残余物，得到呈橙色油状的产物(0.118g，42％)。LC/MS(1.623min(ES+)),m/z:433..98[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.069(s,1H),7.22(brs,1H),3.79(t,2H,J＝5.8Hz),3.74(s,2H),3.72-3.58(m,14H),3.50-3.46(m,2H),2.62(t,2H,J＝5.8Hz)。
(ii)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-(3-碘基丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(74)
(a)三氟甲烷磺酸(S)-5-((叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-(三异丙基甲硅烷氧基)苯甲酰基)-4,5-二氢-1H-吡咯-3-基酯(47)
在-50℃下，三氟甲磺酸酐(28.4g，100.0mmol，3.0当量)经25分钟逐滴添加至经剧烈搅拌的酮46(19.5g，30.0mmol，1.0当量)于含有2,6-二甲基吡啶(14.4g，130.0mmol，4.0当量)的DCM(550mL)中的溶液中。搅拌反应混合物1.5小时，此时LC/MS指示完成反应。有机相相继用水(100mL)、饱和碳酸氢钠(150mL)、盐水(50mL)洗涤，且有机相经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，90/10v/v正己烷/EtOAc)纯化，得到呈淡黄色油状的产物(19.5g，82％)。LC/MS(4.391min(ES+)),m/z:713.25[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),6.72(s,1H),6.02(t,1H,J＝1.9Hz),4.75(m,1H),4.05(m,2H),3.87(s,3H),3.15(ddd,1H,J＝16.2,10.3,2.3Hz),2.96(ddd,1H,J＝16.2,4.0,1.6Hz),1.28-1.21(m,3H),1.07(d,18H,J＝7.2Hz),0.88(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,3H)。
(b)(S,E)-(2-((叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基)甲酮(67)
四(三苯基膦)钯(0)(0.41g，0.35mmol，0.03当量)在氮气氛围下添加至三氟甲磺酸酯47(8.4g，11.8mmol，1.0当量)、E-1-丙烯-1-基硼酸(1.42g，16.5mmol，1.4当量)及磷酸钾(5.0g，23.6mmol，2.0当量)于无水二噁烷(60mL)中的混合物中。混合物在25℃下搅拌120分钟，此时LC/MS指示完成反应。添加乙酸乙酯(120mL)及水(120mL)，移除有机相，用盐水(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。通过急骤层析(硅胶，95/5v/v正己烷/EtOAc至90/10v/v正己烷/EtOAc)纯化残余物得到呈黄色泡沫状的产物(4.96g，70％)。LC/MS(4.477min(ES+)),m/z:605.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),6.74(s,1H),5.93(d,1H,J＝15.4Hz),5.67(s,1H),4.65(m,1H),4.04(m,2H),3.86(s,3H),2.85(m,1H),2.71(m,1H),1.72(dd,3H,J＝6.8,1.0Hz),1.30-1.22(m,3H),1.07(d,18H,J＝7.2Hz),0.87(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。
(c)(S,E)-(2-氨基-5-甲氧基-4-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基)(2-((叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(68)
经20分钟向丙烯基中间物67(5.5g，9.1mmol，1.0当量)于5％v/v甲酸/乙醇(55mL)中的溶液中逐份添加锌粉(22.0g，0.33mol，37当量)，使用冰浴保持温度在25℃-30℃之间。30分钟后，反应混合物经短的床过滤。用乙酸乙酯(65mL)洗涤且合并的有机物相继用水(35mL)、饱和碳酸氢钠(35mL)及盐水(10mL)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，90/10v/v正己烷/EtOAc)纯化，得到呈淡黄色油状的产物(3.6g，69.0％)。LC/MS(4.439min(ES+)),m/z:575.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.75(m,1H),6.40(brs,1H),6.28(m,1H),6.11(d,1H,J＝15.4Hz),5.53(m,1H),4.67(m,1H),4.36(m,2H),3.93(brs,1H),3.84(brs,1H),3.73(s,3H),2.86(dd,1H,J＝15.7,10.4Hz),2.73(dd,1H,J＝15.9,4.5Hz),1.80(dd,3H,J＝6.8,1.3Hz),1.35-1.23(m,3H),1.12(d,18H,J＝7.3Hz),0.89(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。
(d)(S,E)-2-(2-((叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基氨基甲酸烯丙酯(69)
在-78℃下，氯甲酸烯丙酯(0.83g，6.88mmol，1.1当量)添加至胺68(3.6g，6.26mmol，1.0当量)于含有无水吡啶(1.09g，13.77mmol，2.2当量)的无水DCM(80mL)中的溶液中。移除干冰且使反应混合物升温至室温。再搅拌15分钟后，LC/MS指示完成反应。有机相相继用0.01NHCl(50mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)、盐水(10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到淡黄色油，其未经进一步纯化即用于下一步骤中(4.12g，假设100％产率)。LC/MS(4.862min(ES+)),m/z:659.2[M+H]+。
(e)(S,E)-2-(2-(羟基甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-(三异丙基甲硅烷氧基)苯基氨基甲酸烯丙酯(70)
粗中间物69(假设100％产率，4.12g，6.25mmol，1.0当量)溶解于乙酸(70mL)、甲醇(10mL)、THF(10mL)及水(20mL)的混合物中且在室温下搅拌。6小时后，反应混合物用乙酸乙酯(500mL)稀释且相继用水(2×500mL)、饱和碳酸氢钠(300mL)及盐水(50mL)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，1/99v/v甲醇/DCM至5/95v/v甲醇/DCM)纯化，得到呈黄色油状的产物且回收另外1g未反应的起始物质。此物质经历如上相同的反应条件，但搅拌16小时。在处理及纯化后，分离出副产物(2.7g，79％，2个步骤)。LC/MS(3.742min(ES+)),m/z:545.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(m,1H),7.72(m,1H),6.81(s,1H),6.37(m,1H),6.10(d,1H,J＝15.8Hz),5.97(m,1H),5.53(m,1H),5.36(ddd,1H,J＝17.2,3.1,1.5Hz),5.25(ddd,1H,J＝10.4,2.5,1.3Hz),4.78(m,1H),4.65(dt,2H,J＝5.7,1.3Hz),3.84(m,3H),3.79(s,3H),3.04(dd,1H,J＝16.7,10.5Hz),2.40(dd,1H,J＝16.0,4.5Hz),1.82(dd,3H,J＝6.8,1.0Hz),1.36-1.26(m,3H),1.14(d,18H,J＝7.3Hz)。
(f)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(71)
在-78℃下，在氮气氛围下，将无水二甲亚砜(1.16g，14.87mmol，3.0当量)逐滴添加至乙二酰氯(0.94g，7.43mmol，1.5当量)于DCM(25mL)中的溶液中。保持温度为-78℃，10分钟后，逐滴添加一级醇70(2.7g，4.96mmol，1.0当量)于DCM(20mL)中的溶液。再过15分钟后，添加无水三乙胺(2.5g，24.78mmol，5.0当量)，且使反应混合物升温至室温。反应混合物相继用冷的0.1NHCl(50mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)及盐水(10mL)洗涤，且有机层经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到呈黄色油状的产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中(2.68g，假设100％产率)。LC/MS(3.548min(ES+)),m/z:543.2[M+H]+。
(g)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(72)
在0℃下，在氮气氛围下，将三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯(3.93g，14.87mmol，3.0当量)添加至甲醇胺71(假设100％产率，2.68g，4.96mmol，1.0当量)及2,6-二甲基吡啶(2.12g，19.83mmol，4.0当量)于无水DCM(40mL)中的溶液中。10分钟后，使反应混合物升温至室温且再搅拌60分钟。有机相相继用水(10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)及盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，氯仿至2/98v/v甲醇/氯仿)纯化，得到呈黄色油状的产物(2.0g，63％，2个步骤)。LC/MS(4.748min(ES+)),m/z:657.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(s,1H),6.86(m,1H),6.66(s,1H),6.22(d,1H,J＝15.4Hz),5.81(d,1H,J＝8.8Hz),5.78(m,1H),5.48(m,1H),5.11(d,1H,J＝5.0Hz),5.08(m,1H),4.58(dd,1H,J＝13.4,5.4Hz),4.35(dd,1H,J＝13.2,5.7Hz),3.83(s,3H),3.76(s,1H),3.00(dd,1H,J＝15.6,11.0Hz),2.53(m,1H),1.81(dd,3H,J＝6.8,0.9Hz),1.30-1.18(m,3H),1.08(d,9H,J＝2.3Hz),1.06(d,9H,J＝2.3Hz),0.86(s,9H),0.25(s,3H),0.18(s,3H)。
(h)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(73)
乙酸锂二水合物(0.31g，3.04mmol，1.0当量)在25℃下添加至二氮72(2.0g，3.04mmol，1.0当量)于湿润的DMF(20mL)中的溶液中且搅拌4小时。反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释且相继用0.1M柠檬酸(50mL，pH3)、水(50mL)及盐水(10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。通过急骤层析(硅胶，50/50v/v正己烷/EtOAc至25/75v/v正己烷/EtOAc)纯化残余物得到呈淡黄色固体状的产物(0.68g，45％)。LC/MS(3.352min(ES+)),m/z:501.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.02(s,1H),6.66(m,1H),6.53(s,1H),6.03(d,1H,J＝15.5Hz),5.80(s,1H),5.63(d,1H,J＝8.9Hz),5.55(m,1H),5.29(m,1H),4.87(m,2H),4.39(dd,1H,J＝13.5,4.2Hz),4.20(dd,1H,J＝13.2,5.7Hz),3.73(s,3H),3.59(m,1H),2.81(dd,1H,J＝16.1,10.5Hz),2.35(d,1H,J＝15.7Hz),1.61(d,3H,J＝6.4Hz),0.67(s,9H),0.05(s,3H),0.00(s,3H)。
(i)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-(3-碘基丙氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(74)
将二碘基丙烷(0.295g，1.00mmol，5.0当量)及碳酸钾(0.028g，0.20mmol，1.0当量)添加至酚33(0.100g，0.020mmol，1.0当量)于无水丙酮(5mL)中的溶液中。反应混合物在60℃下加热6小时，此时LC/MS证实完成反应。反应混合物在减压下浓缩至干燥且通过急骤层析(硅胶，75/25v/v正己烷/EtOAc至50/50v/v正己烷/EtOAc)纯化残余物，得到呈无色油状的产物(0.074g，56％)。LC/MS(3.853min(ES+)),m/z:669.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(s,1H),6.90(s,1H),6.68(s,1H),6.24(d,1H,J＝15.3Hz),5.87(d,1H,J＝8.9Hz),5.78(m,1H),5.53(m,1H),5.12(m,2H),4.65(m,2H),4.41(m,1H),4.11(m,1H),3.93(s,3H),3.81(m,1H),3.40(t,2H,J＝6.7Hz),3.05(dd,1H,J＝16.3,10.1Hz),2.57(m,1H),2.34(m,2H),1.84(d,3H,J＝6.6Hz),0.92(s,9H),0.28(s,3H),0.26(s,3H)。
(iii)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酯(79)
(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯(75)
在5℃(冰浴)下，三乙胺(0.256mL，1.84mmol，2.2当量)添加至经搅拌的胺68(0.480g，0.835mmol，1.0当量)及三光气(0.089g，0.301mmol，0.36当量)于无水THF(15mL)中的溶液中。通过周期性地自反应混合物移出等分试样且用甲醇淬灭且进行LCMS分析来监测异氰酸酯反应的进行。一旦异氰酸酯反应完成，通过注射将Alloc-Val-Ala-PABOHI5(0.473g，1.25mmol，1.5当量)及三乙胺(0.174mL，1.25mmol，1.5当量)于无水THF(10mL)中的溶液快速添加至新近制备的异氰酸酯中。反应物在40℃下搅拌4小时，接着在室温下搅拌隔夜。在减压下浓缩混合物，且通过急骤层析(硅胶，20/80v/v正己烷/EtOAc至50/50v/v正己烷/EtOAc，接着1/99v/vDCM/MeOH至5/95v/vDCM/MeOH)纯化，得到呈黄色固体状的产物(0.579g，71％)。LC/MS(4.468min(ES+)),m/z:978.55[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(brs,1H),8.42(s,1H),7.78(brs,1H),7.53(d,2H,J＝8.1Hz),7.31(d,2H,J＝8.6Hz),6.76(s,1H),6.59(d,1H,J＝7.6Hz),6.36(brs,1H),6.04(d,1H,J＝15.9Hz),5.90(m,1H),5.55(m,1H),5.33-5.21(m,3H),5.10(s,2H),4.66(m,2H),4.57(dd,2H,J＝5.6,1.0Hz),3.98(dd,1H,J＝7.3,6.8Hz),3.90(m,1H),3.81(m,1H),3.78(s,3H),2.82(dd,1H,J＝15.4,9.6Hz),2.72(dd,1H,J＝15.9,3.5Hz),2.17(m,1H),1.78(dd,3H,J＝6.5,0.8Hz),1.46(d,3H,J＝7.1Hz),1.29(m,3H),1.11(d,18H,J＝7.1Hz),0.97(d,3H,J＝6.8Hz),0.92(d,3H,J＝6.8Hz),0.83(s,9H),0.04(s,3H),0.01(s,3H)。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(羟基甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯(76)
甲硅烷基醚75(1.49g，1.52mmol，1.0当量)溶解于乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(14:2:2:4mL)的7:1:1:2混合物中且在室温下搅拌。2小时后，反应物用EtOAc(100mL)稀释，相继用水、碳酸氢钠水溶液及盐水洗涤。接着有机相经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，100/0接着99/1至92/8v/vDCM/MeOH)纯化，得到呈橙色固体状的产物(1.2g，92％)。LC/MS(3.649min(ES+)),m/z:865.44[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),8.35(s,1H),7.69(brs,1H),7.53(d,2H,J＝8.7Hz),7.32(d,2H,J＝8.3Hz),6.78(s,1H),6.56(m,2H),6.32(brs,1H),6.05(d,1H,J＝14.9Hz),5.90(m,1H),5.56(m,1H),5.30(m,2H),5.22(m,1H),5.10(d,2H,J＝3.1Hz),4.73(m,1H),4.64(m,1H),4.57(d,2H,J＝5.8Hz),4.01(m,1H),3.79(m,2H),3.76(s,3H),2.98(dd,1H,J＝16.3,10.2Hz),2.38(dd,1H,J＝16.6,4.1Hz),2.16(m,1H),1.78(dd,3H,J＝6.8,0.9Hz),1.46(d,3H,J＝7.1Hz),1.29(m,3H),1.11(d,18H,J＝7.4Hz),0.97(d,3H,J＝6.7Hz),0.92(d,3H,J＝6.8Hz)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酯(77)
在-78℃下，在氮气氛围下，无水二甲亚砜(0.180g，2.3mmol，3.0当量)逐滴添加至乙二酰氯(0.147g，1.1mmol，1.5当量)于DCM(10mL)中的溶液中。保持温度为-78℃，20分钟后，逐滴添加一级醇76(0.666g，0.77mmol，1.0当量)于DCM(10mL)中的溶液。15分钟后，添加无水三乙胺(0.390g，3.85mmol，5.0当量)，且使反应混合物升温至室温。反应混合物相继用冷的0.1NHCl(10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)及盐水(5mL)洗涤。接着有机层经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。接着通过急骤层析(硅胶，50/50v/v正己烷/EtOAc至25/75v/v正己烷/EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的产物(0.356g，54％)。LC/MS(3.487min(ES+)),m/z:862.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(brs,1H),7.47(d,2H,J＝7.6Hz),7.17(s,1H),7.14(d,2H,J＝7.5Hz),6.86(brs,1H),6.65(brs,1H),6.42(d,1H,J＝7.6Hz),6.22(d,1H,J＝14.4Hz),5.80(m,1H),5.40(m,1H),5.53(m,1H),5.32(m,1H),5.21(d,2H,J＝9.6Hz),5.06(d,1H,J＝12.3Hz),4.90(m,1H),4.58(m,3H),3.98(m,1H),3.84(m,1H),3.81(s,3H),3.50(m,1H),3.05(dd,1H,J＝16.0,10.3Hz),2.76(m,1H),2.15(m,1H),1.80(dd,3H,J＝6.7,0.8Hz),1.44(d,3H,J＝7.1Hz),1.16(m,3H),1.01(d,18H,J＝6.6Hz),0.96(d,3H,J＝6.8Hz),0.92(d,3H,J＝6.8Hz)。
(d)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三异丙基甲硅烷氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酯(78)
在0℃下，在氮气氛围下，三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯(0.46g，1.74mmol，3.0当量)添加至二级醇77(0.5g，0.58mmol，1.0当量)及2,6-二甲基吡啶(0.25g，2.32mmol，4.0当量)于无水DCM(10mL)中的溶液中。10分钟后，使反应混合物升温至室温且再搅拌120分钟。接着有机相相继用水(10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)及盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，50/50v/v正己烷/EtOAc)纯化，得到呈白色固体状的产物(0.320g，57％)。LC/MS(4.415min(ES+)),m/z:976.52[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(brs,1H),7.48(d,2H,J＝8.0Hz),7.21(s,1H),7.14(d,2H,J＝8.3Hz),6.89(s,1H),6.65(s,1H),6.38(d,1H,J＝7.3Hz),6.25(d,1H,J＝14.6Hz),5.93(m,1H),5.85(d,1H,J＝8.8Hz),5.50(m,1H),5.34(m,1H),5.24(m,2H),5.15(d,1H,J＝12.5Hz),4.86(d,1H,J＝12.2Hz),4.62(m,3H),4.01(m,1H),3.86(s,3H),3.78(m,1H),3.04(m,1H),2.56(m,1H),2.20(m,1H),1.84(dd,3H,J＝6.6,0.7Hz),1.48(d,3H,J＝6.8Hz),1.20(m,3H),1.05(d,9H,J＝2.9Hz),1.03(d,9H,J＝2.9Hz),0.99(d,3H,J＝6.8Hz),0.95(d,3H,J＝6.8Hz),0.88(s,9H),0.27(s,3H),0.14(s,3H)。
(e)(11S,11aS)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酯(79)
乙酸锂二水合物(0.010g，0.10mmol，1.0当量)在25℃下经3小时添加至甲硅烷基醚78(0.100g，0.10mmol，1.0当量)于湿润的DMF(2mL)中的溶液中。接着反应混合物用乙酸乙酯(20mL)稀释且相继用0.1M柠檬酸(20mL，pH3)、水(20mL)及盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。残余物通过急骤层析(硅胶，5/95v/v甲醇/DCM)纯化，得到呈淡黄色油状的产物(0.070g，83％)。LC/MS(3.362min(ES+)),m/z:820.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(s,1H),7.48(d,2H,J＝8.2Hz),7.25(s,1H),7.12(d,2H,J＝8.1Hz),6.88(s,1H),6.68(s,1H),6.47(d,1H,J＝7.6Hz),6.24(d,1H,J＝15.2Hz),6.03(s,1H),5.92(m,1H),5.84(d,1H,J＝8.9Hz),5.50(m,1H),5.34(m,1H),5.26(m,2H),5.18(d,1H,J＝12.3Hz),4.80(d,1H,J＝12.4Hz),4.66-4.60(m,3H),4.02(m,1H),3.95(s,3H),3.81(m,1H),3.03(m,1H),2.57(m,1H),2.19(m,1H),1.84(dd,3H,J＝6.8,0.8Hz),1.48(d,3H,J＝7.1Hz),1.00(d,3H,J＝6.8Hz),0.95(d,3H,J＝6.8Hz),0.87(s,9H),0.26(s,3H),0.12(s,3H)。
(iv)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((20S,23S)-1-碘基-20-异丙基-23-甲基-2,18,21-三氧代-6,9,12,15-四氧-3,19,22-三氮杂二十四酰胺基)苯甲酯(66或DL4)
(a)(11S,11aS)-8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲氧基)羰基)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基氧基)丙氧基)-11-(叔-丁基二甲基甲硅烷氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(80)
碳酸钾(0.030g，0.21mmol，1.0当量)添加至酚79(0.175g，0.21mmol，1.0当量)及碘连接子74(0.214g，0.32mmol，1.5当量)于丙酮(10mL)中的溶液中。反应混合物在密封烧瓶中、在75℃下、在氮气氛围下加热17小时。反应混合物在减压下浓缩至干燥且通过急骤层析(硅胶，2/98v/v甲醇/DCM至5/95v/v甲醇/DCM)纯化，得到呈淡黄色固体状的产物(0.100g，35％)。LC/MS(4.293min(ES+)),m/z:1359.13[M]+。
(b)(11S,11aS)-8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(烯丙氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基氧基)丙氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸烯丙酯(81)
四-正丁基氟化铵(1M，0.22mL，0.22mmol，2.0当量)添加至甲硅烷基醚80(0.150g，0.11mmol，1.0当量)于无水THF(2mL)中的溶液中。反应混合物在室温下搅拌20分钟，随后LC/MS指示完成反应。反应混合物用乙酸乙酯(10mL)稀释且相继用水(5mL)及盐水(5mL)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到黄色固体。通过急骤层析(硅胶，6/94v/v甲醇/DCM至10/90v/v甲醇/DCM)纯化，得到呈淡黄色固体状的产物(0.090g，73％)。LC/MS(2.947min(ES+)),m/z:1154.0[M+Na]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(brs,1H),7.39(d,2H,J＝7.6Hz),7.18(d,2H,J＝10.6Hz),7.10(m,3H),6.86(d,2H,J＝10.0Hz),6.74(s,1H),6.55(s,1H),6.22(dd,2H,J＝15.3,6.6Hz),5.85(m,2H),5.74(m,3H),5.52(m,2H),5.22(m,1H),5.00(m,2H),4.57(m,6H),4.41(m,2H),4.09(m,4H),3.85(m,11H),3.06(m,2H),2.76(m,2H),2.20(m,2H),2.08(m,1H),1.79(d,6H,J＝6.4Hz),1.40(d,3H,J＝6.1Hz),0.90(m,6H)。
(c)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((R)-2-((R)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酯(65)
四(三苯基膦)钯(0)(0.005g，0.005mmol，0.06当量)添加至双-甲醇胺81(0.090g，0.08mmol，1.0当量)及吡咯烷(16μL，0.20mmol，2.5当量)于无水DCM(5mL)中的溶液中。20分钟后，反应混合物用DCM(10mL)稀释且相继用饱和氯化铵(5mL)及盐水(5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤且在减压下移除溶剂，得到呈淡黄色固体状的粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中(0.075g，假设100％产率)。LC/MS(2.060min(ES+)),m/z:947.2[M+H]+。
(d)(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-8-基氧基)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮-10(5H)-甲酸4-((20S,23S)-1-碘基-20-异丙基-23-甲基-2,18,21-三氧代-6,9,12,15-四氧-3,19,22-三氮杂二十四酰胺基)苯甲酯(66或DL4)
EDCI(0.015g，0.08mmol，1.0当量)添加至胺65(假设100％产率，0.075g，0.08mmol，1.0当量)及碘乙酰胺-PEG4-酸I7(0.034g，0.08mmol，1.0当量)于无水二氯甲烷(5mL)中的溶液中且反应物在黑暗中搅拌。50分钟后，再添加一定量的碘乙酰胺-PEG4-酸I7(0.007g，0.016mmol，0.2当量)以及一定量的EDCI(0.003g，0.016mmol，0.2当量)。在总共2.5小时后，反应混合物用二氯甲烷(15mL)稀释且相继用水(10mL)及盐水(10mL)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤且在减压下浓缩。所得残余物通过急骤层析(硅胶，氯仿100％至90:10v/v氯仿:甲醇)纯化。合并纯的部分得到产物(0.0254g，23％，2个步骤)。收集粗物质部分且通过制备型TLC(硅胶，90:10v/v氯仿:甲醇)纯化，得到第二批产物(0.0036g，3％，2个步骤)。LC/MS(2.689min(ES+)),m/z:681.01/2[M+2H]+。
应了解，此实施例1中合成的化合物可与如本文中揭示的抗DLL3抗体结合以提供所揭示的ADC1-5。
实施例2
产生抗DLL3抗体
抗DLL3鼠抗体是按如下方式制造。在第一免疫操作中，三只小鼠(以下品系每种一只：Balb/c、CD-1、FVB)用经等体积或明矾佐剂乳化的人类DLL3-fc蛋白质(hDLL3-Fc)接种。hDLL3-Fc融合构建体自AdipogenInternational购得(目录号AG-40A-0113)。每只小鼠用10μghDLL3-Fc于TiterMax中的乳液进行初始免疫。接着每两周一次每只小鼠用含5μghDLL3-Fc的明矾佐剂对小鼠进行增强免疫。在融合之前，最终注射为每只小鼠含5μghDLL3-Fc的PBS。
在第二免疫操作中，六只小鼠(以下品系每种两只：Balb/c、CD-1、FVB)用经等体积或明矾佐剂乳化的人类DLL3-His蛋白质(hDLL3-His)接种。重组型hDLL3-His蛋白质自经工程改造以过表达hDLL3-His的CHO-S细胞的上清液纯化。每只小鼠用10μghDLL3-His于TiterMax中的乳液进行初始免疫。接着每两周一次每只小鼠用含5μghDLL3-His的明矾佐剂对小鼠进行增强免疫。最终注射为2×105个经工程改造以过表达hDLL3的HEK-293T细胞。
使用固相ELISA分析法关于对人类DLL3具有特异性的小鼠IgG抗体筛选小鼠血清。高于背景的阳性信号指示对DLL3具有特异性的抗体。简言之，用重组型DLL3-His(0.5μg/ml于ELISA涂布缓冲剂中)涂布96孔板(VWRInternational，目录号610744)隔夜。用含有0.02％(v/v)Tween20的PBS洗涤后，各孔在室温(RT)下用含3％(w/v)BSA的PBS(200微升/孔)阻断1小时。将小鼠血清滴定(1:100、1:200、1:400及1:800)且以50微升/孔添加至经DLL3涂布的板中且在室温下培育1小时。洗涤板且接着与50微升/孔经HRP标记的山羊抗小鼠IgG(在3％BSA-PBS或含2％FCS的PBS中1:10,000倍稀释)一起在室温下培育1小时。再洗涤板且在室温下经15分钟添加40微升/孔TMB底物溶液(ThermoScientific34028)。在显色后，添加等体积2NH2SO4以停止底物显色且通过分光光度计在OD450下分析各板。
将血清阳性免疫的小鼠处死且解剖引流淋巴结(腿弯部、腹股沟及髂骨肌)且用作抗体产生细胞的来源。使用BTX型Hybrimmune系统(BTXHarvardApparatus)，通过电细胞融合，将B细胞(约229×106个细胞来自经hDLL3-Fc免疫的小鼠，且510×106个细胞来自经hDLL3-His免疫的小鼠)的细胞悬浮液与非分泌型P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以1:1的比率融合。将细胞再悬浮于由补充有以下物质的DMEM培养基组成的杂交瘤选择培养基中：偶氮丝氨酸、15％胎儿克隆I血清、10％BMCondimed(RocheAppliedSciences)、1mM非必需氨基酸、1mMHEPES、100IU青霉素-链霉素及50μM2-巯基乙醇，且在四个T225烧瓶中于每烧瓶100mL选择培养基中培养。烧瓶置于含有5％CO2及95％空气37℃含湿气培育箱中六至七天。
在融合后第六天或第七天，自烧瓶收集杂交瘤文库细胞且在200μL补充型杂交瘤选择介质(如上文所描述)中以一个细胞/孔(使用FACSAriaI细胞分类器)涂于64个Falcon96孔板中，且48个96孔板用于hDLL3-His免疫操作。其余文库储存于液氮中。
培养杂交瘤10天且使用如下进行的流动式细胞测量术关于对hDLL3具有特异性的抗体筛选上清液。每孔1×105个经工程改造以过表达人类DLL3、小鼠DLL3(用染料预先染色)或食蟹猕猴DLL3(用Dylight800预先染色)的HEK-293T细胞与25μL杂交瘤上清液一起培育30分钟。细胞用PBS/2％FCS洗涤且接着每份样品与25μL经DyeLight649标记的山羊抗小鼠IgG一起培育，二级特异性Fc片段在PBS/2％FCS中1:300倍稀释。培育15分钟后，细胞用PBS/2％FCS洗涤两次且与DAPI一起再悬浮于PBS/2％FCS中，且通过流动式细胞测量术分析超过用同型对照抗体染色的细胞的荧光。其余未使用的杂交瘤文库细胞在液氮中冷冻以用于未来文库测试及筛选。
hDLL3-His免疫操作产生约50种鼠抗hDLL3抗体且hDLL3-Fc免疫操作产生约90种鼠抗hDLL3抗体。
实施例3
抗DLL3抗体的测序
基于上述内容，选择多种以显著高亲和力结合固定的人类DLL3或h293-hDLL3细胞的例示性相异单克隆抗体用于测序及进一步分析。如图3A及图3B中以表格方式所示，来自实施例2中产生的所选单克隆抗体的轻链可变区(图3A)及重链可变区(图3B)的序列分析证实许多序列具有新的互补决定区且通常显示新的VDJ配置。应注意，图3A及图3B中阐述的互补决定区及构架区是使用Abysis数据库的专属版本根据Kabat等人(见上文)定义。
最初将表达所需抗体的所选杂交瘤细胞溶解于试剂(PlusRNAPurificationSystem,LifeTechnologies)中以制备编码抗体的RNA。104个至105个细胞再悬浮于1mLTrizol中且在添加200μL氯仿后剧烈摇动。样品接着在4℃下离心10分钟且水相转移至新的微量离心管中且添加等体积的70％乙醇。将样品装载于RNeasyMini旋转柱上，置放于2mL收集管中且根据制造商说明进行处理。通过溶离提取全部RNA，与100μL不含RNase的水一起引导至旋转柱膜。通过在1％琼脂糖凝胶中部分分离3μL来测定RNA制剂的品质，随后在-80℃下储存直至使用。
使用5'引物混合物将各杂交瘤的Ig重链的可变区扩增，该5'引物混合物包含32个小鼠特异性前导序列引物(经设计以靶向完全小鼠VH谱系)与3'小鼠Cγ引物(对所有小鼠Ig同型具有特异性)的组合。类似地，含有三十二个5'Vκ前导序列的引物混合物(经设计以扩增Vκ小鼠家族中的每一者)与单一反转引物(对小鼠κ恒定区具有特异性)组合使用以对κ轻链进行扩增及测序。对于含有λ轻链的抗体，扩增是进行三个5'VL前导序列与一个对小鼠λ恒定区具有特异性的反向引物的组合进行。VH及VL转录物是使用QiagenOneStepRT-PCR试剂盒按如下方式自100ng完全RNA扩增。对各杂交瘤进行总共八次RT-PCR反应，四次反应针对Vκ轻链且四次反应针对Vγ重链。PCR反应混合物包括3μLRNA、0.5μL100μM重链或κ轻链引物(由IntegratedDataTechnologies定制合成)、5μL5×RT-PCR缓冲剂、1μLdNTPs、1μL酶混合物(含有反转录酶及DNA聚合酶)以及0.4μL核糖核酸酶抑制剂RNasin(1单位)。热循环程序为室温步骤50℃历时30分钟，95℃历时15分钟，接着30次(95℃历时30秒，48℃历时30秒，72℃历时1分钟)的循环。接着在72℃下最终培育10分钟。
所提取的PCR产物使用与上文关于可变区的扩增所描述相同的特异性可变区引物测序。为制备用于直接DNA测序的PCR产物，其使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(QIAquickTMPCRPurificationKit；Qiagen)根据制造商方案纯化。DNA使用50μL无菌水自旋转柱溶离且接着直接自两个股测序。使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析核苷酸序列以鉴别具有最高序列同源性的生殖系V、D及J基因成员。通过使用专属抗体序列数据库将VH及VL基因与小鼠生殖系数据库比对来比较衍生的序列与IgV区及IgJ区的已知生殖系DNA序列。
更具体而言，图3A描绘来自抗DLL3抗体的许多新的鼠轻链可变区的邻接氨基酸序列及来源于代表性鼠轻链的例示性人源化轻链可变区。类似地，图3B描绘来自相同抗DLL3抗体的许多新的鼠重链可变区的邻接氨基酸序列及来源于相同的提供人源化轻链的鼠抗体的例示性人源化重链可变区。鼠轻链及重链可变区氨基酸序列提供于SEQIDNO:21-387(单号)中，而人源化轻链及重链可变区氨基酸序列提供于SEQIDNO:389-407(单号)中。
因此，图3A及图3B共同提供多种可操作的鼠抗DLL3抗体(称为SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150)及例示性人源化抗体(称为hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56)的注释序列。应注意，此等相同名称可指产生标的抗体的克隆，且因此任何特定名称的使用应在周围揭示内容的情形下加以解释。
为达成本申请的目的，各特定抗体的SEQID编号为连续单号。因此，mAbSC16.3包含分别用于轻链及重链可变区的氨基酸SEQIDNO:21及SEQIDNO:23。在此方面，SC16.4包含SEQIDNO:25及SEQIDNO:27，SC16.5包含SEQIDNO:29及SEQIDNO:31等。各抗体氨基酸序列的相应核酸序列包括于随附序列表中且具有相应氨基酸SEQIDNO前紧接的SEQIDNO。因此，举例而言，SC16.3抗体的VL及VH的SEQIDNO分别为21及23，且SC16.3抗体的VL及VH的核酸序列的SEQIDNO分别为SEQIDNO:20及SEQIDNO:22。
关于所报道的序列，应注意，由于测序不规则性，某些重链及轻链可变区序列在程序期间过早地截短。此引起所报道中构架4序列中遗漏一或多个氨基酸。在该等情况下，已供应相容氨基酸(通过来自其他克隆的相应序列的评述确定)以本质上完成标的可变区序列。举例而言，将残基“IK”添加至图3A中SC16.22轻链序列(SEQIDNO:73)的终端以提供具有完全构架4的可操作的轻链可变区。将编码所添加的氨基酸的碱基类似地添加至相应核酸序列(SEQIDNO:72)中以确保同一性。在图3A及图3B中(但非随附序列表中)的各种该类情况下，所添加的氨基酸标有下划线及黑体以便易于识别。
实施例4
产生嵌合及人源化抗DLL3抗体
如上文所提及，使用来自实施例2的某些鼠抗体(SC16.13、SC16.15、SC16.25、SC16.34及SC16.56)衍生包含人类恒定区及鼠可变区的嵌合抗体以及包含接枝于人类受体抗体中的鼠CDR的人源化抗体。在优选实施方式中，可将该等衍生的抗体(嵌合或人源化)并入所揭示的DLL3缀合物中。
更具体而言，嵌合抗DLL3抗体是使用本领域中认可的如下技术产生。自杂交瘤提取完全RNA且如实施例3中所阐述扩增。自衍生的核酸序列获得与鼠抗体的VH及VL链的V、D及J基因区段有关的数据。对抗体的VH及VL链的前导序列具有特异性的引物集合是使用以下限制位点设计：AgeI及XhoI(用于VH片段)，以及XmaI及DraIII(用于VL片段)。PCR产物用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，接着用限制酶AgeI及XhoI(用于VH片段)以及XmaI及DraIII(用于VL片段)消化。VH及VL消化的PCR产物分别纯化及接合至人类IgG1(SEQIDNO:6)重链恒定区表达载体或кCL(SEQIDNO:5)人类轻链恒定区表达载体中。
接合反应是使用200UT4-DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)、7.5μL消化及纯化的基因特异性PCR产物及25ng线性化载体DNA以10μL总体积进行。胜任型大肠杆菌DH10B细菌(LifeTechnologies)经由在42℃下与3μL接合产物一起热休克来转化，且以100μg/mL的浓度涂于安比西林(ampicillin)板上。在扩增的接合产物的纯化及消化后，将VH片段克隆至pEE6.4HuIgG1表达载体(Lonza)的AgeI-XhoI限制位点中且将VL片段克隆至pEE12.4Hu-κ表达载体(Lonza)的XmaI-DraIII限制位点中。
嵌合抗体是通过HEK-293T细胞与pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表达载体的共转染表达。在转染之前，HEK-293T细胞在标准条件下在150mm板中于补充有10％热灭活FCS、100μg/mL链霉素及100U/mL青霉素G的杜贝克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMediumDMEM)中培养。细胞生长至80％融合度以用于短暂转染。将12.5μgpEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ载体DNA中的每一者添加至含50μLHEK-293T转染试剂的1.5mLOpti-MEM中。混合物在室温下培育30分钟且涂布。在转染后三至六天收集上清液。通过在800×g下离心10分钟自细胞碎片清理含有重组型嵌合抗体的培养物上清液且在4℃下储存。通过蛋白质A亲和层析纯化重组型嵌合抗体。
亦使用相同鼠抗DLL3抗体(例如SC16.13、SC16.15、SC16.25、SC16.34及SC16.56)衍生CDR接枝或人源化抗体。在此方面中，鼠抗体是使用专属电脑辅助CDR接枝方法(AbysisDatabase,UCLBusiness)及标准分子工程技术按如下方式人源化。可变区的人类构架区是基于人类生殖系抗体序列的构架序列及CDR正则结构与相关小鼠抗体的构架序列及CDR之间的最高同源性设计。为达成分析目的，各CDR结构域的氨基酸分配是根据Kabat等人编号法进行。一旦选择可变区，则其是由合成基因区段(IntegratedDNATechnologies)产生。人源化抗体是使用上文关于嵌合抗体描述的分子方法克隆及表达。
所选人类受体可变区的遗传组成展示于表3中各人源化抗体下方。表3中描绘的序列与图3A及图3B中关于标的克隆阐述的注释重链及轻链序列对应。更具体而言，以下表3中的条目对应于阐述SEQIDNO:389及391(hSC16.13)、SEQIDNO:393及395(hSC16.15)、SEQIDNO:397及399(hSC16.25)、SEQIDNO:401及403(hSC16.34)以及SEQIDNO:405及407(hSC16.56)的邻接可变区序列。除遗传组成外，表3展示在此等所选实施方式中，无需构架变化或回复突变便可保持所选抗体的良好结合性质。当然，在其他CDR接枝构建体中，应了解，该等构架变化或回复突变可合乎需要且因此明确涵盖于本发明的范围内。
表3
尽管构架区域中无残基改变，但在一个人源化克隆(hSC16.13)中，将突变引入重链CDR2中以解决稳定性问题。检验抗体与经修饰的CDR的结合亲和力以确保其等效于相应嵌合或鼠抗体。
在所有所选抗体通过CDR接枝而人源化后，分析所得轻链及重链可变区氨基酸序列以确定其关于鼠供体及人类受体轻链及重链可变区的同源性。以下表4中展示的结果表明人源化构建体与具有鼠供体序列的构建体相比一致地呈现较高的关于人类受体序列的同源性。更具体而言，与人源化抗体及供体杂交瘤蛋白质序列的同源性(74％-83％)相比，鼠重链及轻链可变区展示与人类生殖系基因的最接近匹配类似的整体百分比同源性(85％-93％)。
表4
在测试时，且如下文将更详细论述，各种衍生的人源化构建体呈现大致与由鼠亲本抗体所展示相当的良好的结合特征。
实施例5
抗DLL3抗体的特征
使用各种方法分析如上文所阐述产生的所选DLL3抗体调节子的结合及免疫化学特征。特定地，通过本领域中认可的方法(包括流动式细胞测量术)根据关于人类、食蟹猕猴、大鼠及小鼠抗原识别(亦即使用细胞及DLL3蛋白质构建体)的亲和力、动力学、分级结合位置及交叉反应性来表征多种抗体调节子。所选调节子的亲和力及动力学常数kon及koff是在ForteBioRED(ForteBio,Inc.)上使用生物层干涉测量分析或使用Biacore2000的表面等离振子共振(各根据制造商说明)测量。
表征结果阐述于图5中的表格中，其中可发现所选调节子通常呈现奈摩尔范围内的相对高亲和力且在许多情况下，具有交叉反应性。图5进一步列举凭经验确定的抗体仓室以及由标的抗体结合的DLL3结构域，如使用酵母介导的抗原片段表达确定，诸如以下实施例6中更详细地描述。
对于抗体分级，根据制造商说明使用ForteBioRED鉴别结合于相同或不同仓室的竞争抗体。简言之，参考抗体(Ab1)捕获于抗小鼠捕获晶片上，接着使用高浓度非结合抗体阻断晶片且收集基线。接着通过特异性抗体(Ab1)捕获单体型、重组型人类DLL3旗标(AdipogenInternational)，且将尖端浸入具有作为对照的相同抗体(Ab1)的孔或具有不同测试抗体(Ab2)的孔中。若观测到与新抗体的其他结合，则确定Ab1及Ab2处于不同仓室。若未发生其他结合，如通过与对照Ab1比较结合程度确定，则确定Ab2处于相同仓室。如本领域中已知，此过程可放大以使用表示96孔板中的唯一仓室的一整列抗体筛选独特抗体的大型文库。在本发明中，此分级过程展示结合于DLL3蛋白质上至少九种不同仓室(图5中指定为仓室A至I)的经筛选抗体。基于DLL3抗原的表观尺寸(其中ECD为约56kD)及所用分级方法的解析度，相信九种鉴别的仓室表示DLL3细胞外抗原上呈现的大部分仓室。
除如上文所阐述评估例示性调节子外，进行流动式细胞测量术以确认所选SC16抗体调节子可与人类DLL3免疫特异性缔合及确定相同抗体是否与食蟹猕猴、大鼠及/或小鼠DLL3交叉反应。更具体而言，使用FACSCantoII及过表达小鼠、大鼠、食蟹猕猴或人类DLL3的293细胞通过流动式细胞测量术分析例示性鼠抗体。在一些情况下，使用由Cochran等人(JImmunolMethods.287(1-2):147-158(2004))描述的方法，使用FACSCantoII及呈现食蟹猕猴DLL3的酵母细胞通过流动式细胞测量术分析例示性小鼠调节子。
基于流动式细胞测量术，发现所有所选抗体调节子均结合于过表达于293细胞上的人类DLL3(数据未图示)，同时发现多种测试抗体与食蟹猕猴及/或小鼠DLL3交叉反应(所有与小鼠反应的抗体亦与大鼠反应)。在此方面，且如图5中列举，已发现与人类DLL3免疫特异性反应的十三种调节子中的八种调节子亦与小鼠(或大鼠)DLL3反应。特定地，发现mAbSC16.4、SC16.8、SC16.15、SC16.34、SC16.39、SC16.46、SC16.51及SC16.56以较高或较低程度与小鼠DLL3交叉反应，而mAbSC16.7、SC16.10、SC16.13、SC16.25及SC16.65不与小鼠DLL3显著缔合。鉴于小鼠DLL3与人类DLL3的同工型2约83％同源，该等结果并不意外。应了解，此交叉反应性可经由在药物发现及发展中使用动物模型而在本发明的情形中有利地开发。
除上述分析法外，分析来自实施例4的人源化构建体hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56以确定CDR接枝过程是否显著地改变其结合特征。在此方面中，比较人源化构建体(CDR接枝)与“传统”嵌合抗体，该等"传统"嵌合抗体包含小鼠亲本(或供体)重链及轻链可变域以及实质上等效于人源化构建体中所使用的恒定区的人类恒定区。通过此等构建体，使用Biacore2000(GEHealthcare)进行表面等离振子共振(SPR)以鉴别由人源化过程引起的速率常数的任何微小变化。
基于人类DLL3抗原的25nM及12.5nM的浓度级数及使用1:1朗缪尔结合模型(Langmuirbindingmodel)，估算结合于人类DLL3抗原的SC16.15抗体的KD为0.2nM。接着用其他人源化构建体及嵌合构建体进行类似实验以证明其保留治疗性亲和力值(数据未图示)。该等结果证明人源化过程未本质上影响调节子的亲和力且表明其为用于所揭示的DLL3ADC的有效候选物。
实施例6
抗DLL3抗体的结构域及抗原决定基定位
为了对与所揭示的DLL3抗体药物缀合物缔合或结合的抗原决定基进行表征及定位，使用由Cochran等人,2004(见上文)描述的方案的改进版本对许多例示性抗体进行结构域级抗原决定基定位。简言之，DLL3中包含特定氨基酸序列的个别结构域表达于酵母表面上，且经由流动式细胞测量术测定与所选DLL3抗体的结合。
更具体而言，产生酵母呈现质体构建体以用于以下构建体的表达：DLL3细胞外结构域(氨基酸27-466)；DLL1-DLL3嵌合体，其由与DLL3(氨基酸220-466)的EGF样结构域1至6融合的DLL1(氨基酸22-225)的N端区域及DSL结构域组成；DLL3-DLL1嵌合体，其由与DLL1(氨基酸222-518)的EGF样结构域1至8融合的DLL3(氨基酸27-214)的N端区域及DSL结构域组成；EGF样结构域#1(氨基酸215-249)；EGF样结构域#2(氨基酸274-310)；EGF样结构域#1及#2(氨基酸215-310)；EGF样结构域#3(氨基酸312-351)；EGF样结构域#4(氨基酸353-389)；EGF样结构域#5(氨基酸391-427)；及EGF样结构域#6(氨基酸429-465)。(关于结构域信息，通常参见UniProtKB/Swiss-Prot数据库条目Q9NYJ7，其以引用的方式并入本文中。应注意，氨基酸编号是参考具有诸如SEQIDNO:1中阐述的前导序列的未经加工的DLL3蛋白质)。对于N端区域或EGF结构域的总体分析，与片段相反，使用具有家族成员DLL1(DLL1-DLL3及DLL3-DLL1)的嵌合体以最小化与蛋白质折叠有关的潜在问题。先前已证实结构域定位抗体不与DLL1交叉反应，表明与此等构建体的任何结合均是经由与构建体的DLL3部分的缔合发生。此等质体转化成酵母，其接着如Cochran等人所描述生长及诱导。
为了测试与特定构建体的结合，200,000个表达所需构建体的经诱导的酵母细胞在PBS+1mg/mLBSA(PBSA)中洗涤两次，且在50μLPBSA中与生物素化抗HA克隆3F10(RocheDiagnostics)(0.1μg/mL)及50nM经纯化的抗体或来自培养7天的杂交瘤的未经纯化的上清液的1:2稀释物一起培育。细胞在冰上培育90分钟，接着在PBSA中洗涤2次。细胞接着在具有适当二级抗体(对于鼠抗体)的50μLPBSA中培育。Alexa488结合的抗生蛋白链菌素及Alexa647结合的山羊抗小鼠(均来自LifeTechnologies)各以1μg/mL添加，且对于人源化或嵌合抗体，Alexa647结合的抗生蛋白链菌素(LifeTechnologies)及R-藻红素结合的山羊抗人类(JacksonImmunoresearch)各以1μg/mL添加。在冰上培育二十分钟后，细胞用PBSA洗涤两次且在FACSCantoII上分析。结合于DLL3-DLL1嵌合体的抗体指定为与N端区域+DSL结合。特异性结合于特定EGF样结构域上的抗原决定基的抗体指定为与其各别结构域结合。
为了将抗原决定基分类为构形(例如非连续)或线型，呈现DLL3细胞外结构域的酵母在80℃下热处理30分钟，接着在冰冷的PBSA中洗涤两次。呈现变性抗原的酵母(变性酵母)接着经受与如上文所描述相同的染色方案及流动式细胞测量术分析。结合于变性及原生酵母的抗体归类为结合于线型抗原决定基，而结合原生酵母但不结合变性酵母的抗体归类为构形特异性。
测试抗体的结构域级抗原决定基定位数据的示意性概述呈现于图4中，其中结合线型抗原决定基的抗体标有下划线且相应仓室(若确定)标注于括号中。图4的评述表明大部分调节子倾向于定位在DLL3的N端/DSL区域中发现的抗原决定基或第二EGF样结构域中的抗原决定基。如先前提及，图5以表格形式呈现与多种所选调节子的仓室确定及结构域定位有关的类似数据。
进一步使用两种方法中的一种对所选抗体进行精细抗原决定基定位。第一种方法使用Ph.D.-12噬菌体展示肽文库试剂盒(NewEnglandBiolabsE8110S)，其是根据制造商说明使用。简言之，用于抗原决定基定位的抗体以50μg/mL在3mL0.1M碳酸氢钠溶液(pH8)中涂于NuncMaxiSorp管(Nunc)上隔夜。该管用含3％BSA溶液的碳酸氢盐溶液阻断。接着，使含1011个输入噬菌体的PBS+0.1％Tween-20结合，接着在0.1％Tween-20下进行十次连续洗涤以冲去未结合的噬菌体。剩余噬菌体在室温下随温和搅拌用1mL0.2M甘氨酸溶离10分钟，接着用150μL1MTris-HCl(pH9)中和。溶离的噬菌体再次与1011个输入噬菌体一起扩增及涂布，在洗涤步骤期间使用0.5％Tween-20以增加选择严格度。来自第二轮的溶离噬菌体的24个斑块的DNA使用QiaprepM13Spin试剂盒(Qiagen)分离及测序。使用ELISA分析法确认克隆噬菌体的结合，其中将经定位的抗体或对照抗体涂于ELISA板上，阻断且暴露于各噬菌体克隆。使用辣根过氧化酶结合的抗M13抗体(GEHealthcare)及1步骤型TurboTMBELISA溶液(Pierce)检测噬菌体结合。使用VectorNTI(LifeTechnologies)将来自特异性结合噬菌体的噬菌体肽序列与抗原ECD肽序列比对以确定结合的抗原决定基。
或者，使用酵母呈现方法(Chao等人,NatProtoc.1(2):755-768,2007))对选择抗体进行抗原决定基定位。简言之，DLL3ECD突变体的文库是通过易出错的PCR产生，该PCR使用用于各克隆的一种氨基酸突变的目标突变诱发速率的核苷酸类似物8-氧代-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸盐及2'-去氧-p-核苷-5'-三磷酸盐(均来自TriLinkBio)。此等文库转化呈酵母呈现格式。使用上文关于结构域级定位描述的技术，文库针对HA及50nM下的抗体结合进行染色。使用FACSAria(BD)，将与野生型DLL3ECD相比呈现结合损失的克隆分类。此等克隆再生长，且经受另一轮针对与目标抗体的结合损失的FACS分类。使用ZymoprepYeastPlasmidMiniprep试剂盒(ZymoResearch)对个别ECD克隆进行分离及测序。必要时，使用Quikchange定点突变试剂盒(Agilent)将突变体重新格式化成单一突变型ECD克隆。
接着筛选个别ECD克隆以确定结合损失是否由抗原决定基的突变或引起错误折叠的突变引起。涉及半胱氨酸、脯氨酸及终止密码子的突变由于高度的错误折叠突变可能性而自动废除。接着筛选剩余ECD克隆与非竞争性、构形特异性抗体的结合。推断出损失与非竞争性、构形特异性抗体的结合的ECD克隆含有错误折叠突变，而推断出保留等效的与野生型DLL3ECD的结合的ECD克隆经适当折叠。推断出后一群组中ECD克隆中的突变发生于抗原决定基中。结果列举于以下表5中。
表5
抗体克隆 抗原决定基 SEQ ID NO:
SC16.23 Q93、P94、G95、A96、P97 3
SC16.34 G203、R205、P206 4
SC16.56 G203、R205、P206 4
更具体而言，所选抗体(具有其衍生的抗原决定基没，该等抗原决定基包含与抗体结合有关的氨基酸残基)的概述列举于表5中。在此方面中，抗体SC16.34及SC16.56显然与共同氨基酸残基相互作用，与图4中展示的分级信息及结构域定位结果一致。此外，发现SC16.23与相异邻接抗原决定基相互作用且发现不与SC16.34或SC16.56处于同一仓室。
实施例7
DLL3抗体药物缀合物的制备
为了进一步证明本发明的多功能性，通过使DL1-DL5的化合物与DLL3抗体(诸如本文中揭示的DLL3抗体)结合来制备实质上如ADC1-5中阐述的抗DLL3抗体药物缀合物。在此方面中，应了解，由于选择用于DL4的连接子，使用两种稍微不同的缀合过程提供所揭示的缀合物。更具体而言，ADC1-3及5是优选使用以下第一缀合过程制备且ADC4是优选使用以下第二程序制备。
(a)马来酰亚胺结合
更具体而言，制备DLL3抗体药物缀合物，其包含共价连接至所揭示的抗体的DL1-DL3及DL5中阐述的连接子及吡咯并苯并二氮(PBD)二聚体(通常参见U.S.P.N2011/0256157及2012/0078028以及U.S.P.N6,214,345，其均以全文引用的方式并入本文中)。
DL1-DL3及DL5的药物-连接子组合是实质上如以上实施例1中所描述且使用本领域中认可的技术合成及纯化。在制备后，包含末端马来酰亚胺部分的药物-连接子单元与所选DLL3抗体上的游离巯基结合。在此方面，DLL3缀合物是经由用三(2-羧乙基)膦(TCEP)部分还原所选DLL3抗体，接着进行经还原的Cys残基与马来酰亚胺-连接子有效负载的反应来制备。
更具体而言，在20℃下于200mMTris(pH7.5)及32mMEDTA缓冲剂中，每摩尔mAb用1.3摩尔三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原所选DLL3抗体调节子90分钟。使反应物冷却至15℃且连接子有效负载溶解于DMA中，接着以3.2mol/molmAb的比率添加，随后添加额外量的DMA使最终浓度达到6％(v/v)。反应进行30分钟。通过添加等摩尔过量的N-乙酰基半胱氨酸来将未反应的药物-连接子加盖。接着使用AKTAExplorerFPLC系统(G.E.Healthcare)通过离子交换柱纯化实质上如ADC1-3及5中阐述的缀合物以移除聚集的高分子量抗体、共溶剂及小分子。接着溶离的缀合物通过切向流动过滤(TFF)至制剂中、接着进行浓度调节及添加清洁剂来更换缓冲液。分析最终缀合物的蛋白质浓度(通过测量UV)、聚集(SEC)、药物与抗体比率(DAR)(通过逆相(RP)HPLC)、是否存在未结合的抗体(通过疏水性相互作用层析(HIC)HPLC)、非蛋白质物质(通过RPHPLC)及体外细胞毒性(使用DLL3表达细胞系)。
(b)碘乙酰胺结合
实质上按如下方式制备ADC4。DL4是如实施例1中阐述合成及提供。在制备后，包含末端碘乙酰胺部分的细胞毒素-连接子单元与所选DLL3抗体上的游离巯基结合。在此方面，DLL3缀合物是经由用三(2-羧乙基)膦(TCEP)部分还原所选DLL3抗体，接着进行经还原的Cys残基与碘乙酰胺-连接子有效负载的反应来制备。
更具体而言，在20℃下于PBS(pH7.2)及5mMEDTA缓冲剂中，每摩尔mAb用1.8摩尔TCEP还原所选DLL3抗体调节子90分钟。接着用100mM硼酸钠将经还原的抗体溶液调节至pH8.5且含连接子有效负载的DMSO以至少5mol/molmAb的比率添加，随后添加额外量的DMSO使最终浓度达到6％(v/v)。接着反应在20℃下进行隔夜。接着缀合物通过切向流动过滤(TFF)至渗滤缓冲液中、接着进行浓度调节及添加清洁剂来更换缓冲液。接着分析最终缀合物的蛋白质浓度(通过测量UV)、聚集(SEC)、药物与抗体比率(DAR)(通过逆相(RP)HPLC)及体外细胞毒性(使用DLL3表达细胞系)。
使用上述程序或本领域中已知的实质上类似的方法，如本文中所描述产生及表征多种包含各种DLL3抗体调节子与DL部分的组合的缀合物。在此方面，图6提供可根据本发明通过使特异性抗体(例如SC16.3)与所选药物-连接子(例如DL1)结合以提供相应ADC(亦即SC16.3-DL1或SC16.3-ADC1)而产生的ADC的概述。本领域技术人员应了解，除鉴别为人源化(例如hSC16.34-DL4)以外，图6例示性构建体中的抗体名称中的每一者均可表示任何类型的抗体(嵌合、人源化、人类、IgG1、IgG3等)或其免疫反应性片段。此外，应了解，例示性ADC1、ADC2、ADC3及ADC5化合物是使用实施例7(a)中阐述的方案结合，而例示性ADC4化合物是使用实施例7(b)中阐述的方案结合。应了解，在所选方面中，本发明包含如图6中阐述的缀合物。
实施例8
DLL3抗体药物缀合物体外消除肿瘤细胞
为了证明本发明的DLL3ADC能够介导细胞毒性剂递送至活细胞，使用根据先前实施例制备的所选DLL3缀合物进行体外细胞杀死分析法。
体外评估具有若干种PBD有效负载(亦即PBD1-PBD5)中的一种的DLL3靶向ADC且以奈摩尔亲和力与经工程改造以过表达人类DLL3的人类293细胞(而非原生亲本293细胞)上的DLL3特异性结合。为了探测体外所选ADC1-5的潜在细胞毒性，评估其杀死过表达人类DLL3的293细胞的能力。特定地，亲本293T细胞或经工程改造以表达DLL3的293T细胞与所选ADC1-5的稀释物一起培育48-72小时，随后使用CellTiter(Promega)根据制造商说明评估细胞活力。选择以0.1-100pM的IC50杀死过表达DLL3的293细胞，但显示极小的杀死原生亲本293细胞的能力的ADC作为临床前候选物。
基于293细胞毒性分析法，选择缀合物以用于进一步肿瘤细胞检验。最初将2,500个细胞/孔的人类KDY66(表达内源DLL3的肾NETNTX)解离至单一细胞悬浮液中且在如本领域中已知补充有无血清培养基的生长因子中涂于BDPrimariaTM板(BDBiosciences)上。24小时后，将各种浓度(0.1-100pM)的经纯化的DLL3抗体缀合物(例如SC16.26-DL1、SC16.81-DL2、SC16.118-DL4及SC16.67-DL5)以及合适对照物(例如未结合的IgG1-DL缀合物)添加至培养物中。七天后，检验板以确定DLL3抗体缀合物对细胞活力的影响。通过使用CellTiter根据制造商说明计算活细胞数目来确定抗体药物缀合物内化及杀死肿瘤细胞的能力。将使用含有暴露于同型抗体缀合物对照物的细胞的培养物的原始荧光计数设定为100％参考值且相应地计算所有其他计数。预期一些或所有DLL3缀合物以介于0.1pM与100pM之间的IC50杀死KDY66肿瘤细胞，且同型缀合物对照物呈现极高IC50值。
在稀释分析法中测试活性DLL3抗体缀合物以确定活性的EC50值。使用与上文所描述相同的分析法，所选抗体缀合物及合适缀合物对照物与经涂布的卵巢肿瘤细胞(例如OV26，卵巢NETNTX肿瘤)一起培育。预期所有缀合物中的一些缀合物展示卵巢肿瘤细胞的有效杀死，其中EC50测量值在微摩尔或次微摩尔范围内。相反，预期对照性ADC呈现相对高EC值，表明其未有效内化且结合的药物保持惰性状态。
为了进一步证明所揭示的本发明的多功能性，将来源于大细胞神经内分泌肺癌瘤(LU37)的肿瘤细胞暴露于根据本文中的教导的所选缀合物(例如SC16.26-DL1、SC16.81-DL2及SC16.67-DL5)。更具体而言，在补充有无血清培养基的生长因子中以每孔2,500个LU37NTX细胞涂布(BDPrimariaTM板)，一天后添加结合的DLL3抗体及结合的同型对照物。经涂布的细胞暴露于各种浓度的DLL3缀合物及对照性缀合物七天。暴露后，通过如上文所描述使用CellTiter计算活细胞数目来确定细胞活力。预期DLL3缀合物可以临床相关浓度消除肿瘤细胞。举例而言，预期DLL3缀合物在小于约100pM的浓度下具有体外杀死50％LU37细胞的能力，而同型对照性缀合物需要>1nM的浓度方可杀死50％肿瘤细胞。
该等结果表明所揭示的缀合物适用于治疗多种赘生性病症。
实施例9
DLL3抗体药物缀合物体内抑制肿瘤生长
鉴于上述体外结果，进行实验以评估所揭示的DLL3ADC体内缩减及抑制表达DLL3的人类肿瘤的生长的能力。更具体而言，测试包含小鼠及人源化调节子的所选DLL3缀合物以证明其抑制免疫缺乏小鼠中人类NTX肿瘤生长的能力。
为了准备进行实验，使用本领域中认可的技术使患者衍生的NTX肿瘤(LU37、LU73及OV26)在雌性NOD/SCID受体小鼠的侧腹中皮下生长。每周两次监测肿瘤体积及小鼠体重。当肿瘤体积达到150-250mm3时，将小鼠随机分配至处理组且经由腹膜内注射来注射各种剂量的DLL3缀合物(例如SC16.21-DL2、SC16.144-DL4、hSC16.34-DL5、hSC16.56-DL1)或包含相同DL的同型对照物(各实质上如以上实施例7中所描述产生)。小鼠在七天内接受三次相同ADC注射(0.1-1mg/kg)，每次注射之间之间隔时间相同。在处理后，监测肿瘤体积及小鼠体重直至肿瘤超过800mm3或小鼠变衰弱。
预期所选DLL3缀合物可或多或少地展示降低肿瘤体积或抑制肿瘤生长的能力。在一些情况下，对于三种不同肿瘤细胞系中的每一者，预期预期肿瘤生长抑制为持久性，例如持续长达30天、40天、50天、60天或更长时间。多种结合的调节子(包括人源化缀合物)体内长期延缓或抑制生长的能力将进一步证实所揭示的DLL3缀合物作为用于治疗增生性病症的治疗剂的用途。
实施例10
DLL3抗体药物缀合物降低癌症干细胞出现率
如先前实施例中阐述，预期所揭示的DLL3缀合物可有效抑制肿瘤生长。此外，如上文所论述，DLL3表达与通常已知为抗药性及促使肿瘤复发及转移的癌症干细胞相关联。因此，为了证明用DLL3-ADC治疗可降低NTX细胞系的复发潜力，进行体内限制稀释分析法(LDA)以确定在用DLL3缀合物(例如hSC16.13-DL2或hSC16.34-DL5)治疗后，小细胞肺癌肿瘤中癌症干细胞的出现率。
患者衍生的小细胞肺癌异种移植肿瘤(LU95)及来自乳头状肾细胞癌瘤(KDY66)的患者衍生的异种移植物在免疫缺乏宿主小鼠中皮下生长。当肿瘤平均体积达到150mm3-250mm3时，将小鼠随机分配至两个组中，其中每组七只小鼠。经由腹膜内注射，在第0天、第4天及第7天向小鼠注射作为阴性对照的人类IgG1-DL2或人类IgG1-DL5(1mg/kg；各组n＝7只小鼠)或DLL3缀合物，例如hSC16.13-DL2或hSC16.34-DL5(1mg/kg；各组n＝7只小鼠)。在第8天，使各组中的两只代表性小鼠(共四只)安乐死且收集其肿瘤且分散于单细胞悬浮液中。预期剩余五只小鼠中经同型对照缀合物处理的肿瘤继续生长，而剩余五只小鼠中经DLL3缀合物处理的肿瘤的体积降低至零或接近零。
使用标准流动式细胞测量技术及经标记的抗DLL3抗体，评估自四个处理组中的每一组收集的肿瘤以确认阳性DLL3表达。接着收集来自每一各别处理组的肿瘤细胞且经由FACS使用FACSAriaIII(BectonDickinson)根据制造商说明及本领域中认可的技术分离活的人类细胞。简言之，细胞用FITC结合的抗小鼠H2Kd及抗小鼠CD45抗体(均来自BioLegend,Inc.)标记且接着以1μg/ml再悬浮于DAPI中。接着在标准条件下通过收集的DAPI-、mH2Kd-及mCD45-人类细胞及废弃的小鼠细胞将所得悬浮液分类。
接着五只受体小鼠的群组用2000、500、120或30个来自经DLL3缀合物处理的肿瘤的经分类的活的人类细胞移植。作为比较，五只受体小鼠的群组用来1000、250、60或15个自经各别同型缀合物对照物处理的肿瘤的经分类的活的人类细胞移植。每周一次测量受体小鼠中的肿瘤，且在肿瘤达到1500mm3前使个别小鼠安乐死。在肿瘤生长开始后，研究在连续四周任何其他小鼠中未出现新颖肿瘤后结束。此时，针对肿瘤生长将受体小鼠分成阳性或阴性，其中阳性生长具有超过100mm3的体积。预期经DLL3缀合物处理的LU95或KDY66细胞的受体与经DL2同型对照物处理的LU95或KDY66细胞的受体相比产生较少肿瘤。
使用泊松分布统计(L-Calc软体，StemcellTechnologies)，使用移植后18周具有及不具有肿瘤的受体的注射细胞剂量计算各群体中肿瘤引发细胞的出现率。预期在经DLL3缀合物处理的动物中，LU95或KDY66样品中以每10,000个活的人类细胞计的TIC数目显著降低，例如降低至少约10倍，或降低20倍，或降低50倍，或降低100倍。癌症干细胞出现率的显著降低表明本发明的调节子可显著及特定地降低癌症干细胞群体及(作为扩展)肿瘤复发、转移或再生长潜力。
所有专利、专利申请及公开案以及可用电子档材料(包括例如核苷酸序列提交(例如GenBank及RefSeq中)及氨基酸序列提交(例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中)，以及来自GenBank及RefSeq中的经注释的编码区的翻译文件)均以引用的方式并入本文中。上文详细描述及实施例仅出于清楚理解的目的给出。不应将其理解为不必要的限制。本发明不受限于所展示及所描述的精确细节，由于对本领域技术而言明显的变体将包含在通过权利要求所定义的本发明中。

Claims (57)

1.一种缀合物，其选自由以下组成的组
其中Ab包括抗DLL3抗体或其免疫反应性片段。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体包括单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述单克隆抗体是选自嵌合抗体、人源化抗体及人类抗体。
4.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述单克隆抗体包括消耗抗体。
5.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述单克隆抗体包括内化抗体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体或其免疫反应性片段包含具有三个互补决定区的轻链可变区及具有三个互补决定区的重链可变区，其中至少一个轻链互补决定区如图3A所示，并且至少一个重链互补决定区如图3B所示。
7.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体或其免疫反应性片段包含轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列：SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37、SEQIDNO:41、SEQIDNO:45、SEQIDNO:49、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73、SEQIDNO:77、SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:121、SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145、SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:205、SEQIDNO:209、SEQIDNO:213、SEQIDNO:217、SEQIDNO:221、SEQIDNO:225、SEQIDNO:229、SEQIDNO:233、SEQIDNO:237、SEQIDNO:241、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:253、SEQIDNO:257、SEQIDNO:261、SEQIDNO:265、SEQIDNO:269、SEQIDNO:273、SEQIDNO:277、SEQIDNO:281、SEQIDNO:285、SEQIDNO:289、SEQIDNO:293、SEQIDNO:297、SEQIDNO:301、SEQIDNO:305、SEQIDNO:309、SEQIDNO:313、SEQIDNO:317、SEQIDNO:321、SEQIDNO:325、SEQIDNO:329、SEQIDNO:333、SEQIDNO:337、SEQIDNO:341、SEQIDNO:345、SEQIDNO:349、SEQIDNO:353、SEQIDNO:357、SEQIDNO:361、SEQIDNO:365、SEQIDNO:369、SEQIDNO:373、SEQIDNO:377、SEQIDNO:381及SEQIDNO:385，且其中所述重链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列：SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31、SEQIDNO:35、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:47、SEQIDNO:51、SEQIDNO:55、SEQIDNO:59、SEQIDNO:63、SEQIDNO:67、SEQIDNO:71、SEQIDNO:75、SEQIDNO:79、SEQIDNO:83、SEQIDNO:87、SEQIDNO:91、SEQIDNO:95、SEQIDNO:99、SEQIDNO:103、SEQIDNO:107、SEQIDNO:111、SEQIDNO:115、SEQIDNO:119、SEQIDNO:123、SEQIDNO:127、SEQIDNO:131、SEQIDNO:135、SEQIDNO:139、SEQIDNO:143、SEQIDNO:147、SEQIDNO:151、SEQIDNO:155、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:167、SEQIDNO:171、SEQIDNO:175、SEQIDNO:179、SEQIDNO:183、SEQIDNO:187、SEQIDNO:191、SEQIDNO:195、SEQIDNO:199、SEQIDNO:203、SEQIDNO:207、SEQIDNO:211、SEQIDNO:215、SEQIDNO:219、SEQIDNO:223、SEQIDNO:227、SEQIDNO:231、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:243、SEQIDNO:247、SEQIDNO:251、SEQIDNO:255、SEQIDNO:259、SEQIDNO:263、SEQIDNO:267、SEQIDNO:271、SEQIDNO:275、SEQIDNO:279、SEQIDNO:283、SEQIDNO:287、SEQIDNO:291、SEQIDNO:295、SEQIDNO:299、SEQIDNO:303、SEQIDNO:307、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:319、SEQIDNO:323、SEQIDNO:327、SEQIDNO:331、SEQIDNO:335、SEQIDNO:339、SEQIDNO:343、SEQIDNO:347、SEQIDNO:351、SEQIDNO:355、SEQIDNO:359、SEQIDNO:363、SEQIDNO:367、SEQIDNO:371、SEQIDNO:375、SEQIDNO:379、SEQIDNO:383及SEQIDNO:387。
8.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体是来源于选自由以下组成的组的抗体：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。
9.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体或其免疫反应性片段包含轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区包含来源于选自由以下组成的组的氨基酸序列的氨基酸序列：SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:33、SEQIDNO:37、SEQIDNO:41、SEQIDNO:45、SEQIDNO:49、SEQIDNO:53、SEQIDNO:57、SEQIDNO:61、SEQIDNO:65、SEQIDNO:69、SEQIDNO:73、SEQIDNO:77、SEQIDNO:81、SEQIDNO:85、SEQIDNO:89、SEQIDNO:93、SEQIDNO:97、SEQIDNO:101、SEQIDNO:105、SEQIDNO:109、SEQIDNO:113、SEQIDNO:117、SEQIDNO:121、SEQIDNO:125、SEQIDNO:129、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:141、SEQIDNO:145、SEQIDNO:149、SEQIDNO:153、SEQIDNO:157、SEQIDNO:161、SEQIDNO:165、SEQIDNO:169、SEQIDNO:173、SEQIDNO:177、SEQIDNO:181、SEQIDNO:185、SEQIDNO:189、SEQIDNO:193、SEQIDNO:197、SEQIDNO:201、SEQIDNO:205、SEQIDNO:209、SEQIDNO:213、SEQIDNO:217、SEQIDNO:221、SEQIDNO:225、SEQIDNO:229、SEQIDNO:233、SEQIDNO:237、SEQIDNO:241、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:253、SEQIDNO:257、SEQIDNO:261、SEQIDNO:265、SEQIDNO:269、SEQIDNO:273、SEQIDNO:277、SEQIDNO:281、SEQIDNO:285、SEQIDNO:289、SEQIDNO:293、SEQIDNO:297、SEQIDNO:301、SEQIDNO:305、SEQIDNO:309、SEQIDNO:313、SEQIDNO:317、SEQIDNO:321、SEQIDNO:325、SEQIDNO:329、SEQIDNO:333、SEQIDNO:337、SEQIDNO:341、SEQIDNO:345、SEQIDNO:349、SEQIDNO:353、SEQIDNO:357、SEQIDNO:361、SEQIDNO:365、SEQIDNO:369、SEQIDNO:373、SEQIDNO:377、SEQIDNO:381及SEQIDNO:385，且其中所述重链可变区包含来源于选自由以下组成的组的氨基酸序列的氨基酸序列：SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31、SEQIDNO:35、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:47、SEQIDNO:51、SEQIDNO:55、SEQIDNO:59、SEQIDNO:63、SEQIDNO:67、SEQIDNO:71、SEQIDNO:75、SEQIDNO:79、SEQIDNO:83、SEQIDNO:87、SEQIDNO:91、SEQIDNO:95、SEQIDNO:99、SEQIDNO:103、SEQIDNO:107、SEQIDNO:111、SEQIDNO:115、SEQIDNO:119、SEQIDNO:123、SEQIDNO:127、SEQIDNO:131、SEQIDNO:135、SEQIDNO:139、SEQIDNO:143、SEQIDNO:147、SEQIDNO:151、SEQIDNO:155、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:167、SEQIDNO:171、SEQIDNO:175、SEQIDNO:179、SEQIDNO:183、SEQIDNO:187、SEQIDNO:191、SEQIDNO:195、SEQIDNO:199、SEQIDNO:203、SEQIDNO:207、SEQIDNO:211、SEQIDNO:215、SEQIDNO:219、SEQIDNO:223、SEQIDNO:227、SEQIDNO:231、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:243、SEQIDNO:247、SEQIDNO:251、SEQIDNO:255、SEQIDNO:259、SEQIDNO:263、SEQIDNO:267、SEQIDNO:271、SEQIDNO:275、SEQIDNO:279、SEQIDNO:283、SEQIDNO:287、SEQIDNO:291、SEQIDNO:295、SEQIDNO:299、SEQIDNO:303、SEQIDNO:307、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:319、SEQIDNO:323、SEQIDNO:327、SEQIDNO:331、SEQIDNO:335、SEQIDNO:339、SEQIDNO:343、SEQIDNO:347、SEQIDNO:351、SEQIDNO:355、SEQIDNO:359、SEQIDNO:363、SEQIDNO:367、SEQIDNO:371、SEQIDNO:375、SEQIDNO:379、SEQIDNO:383及SEQIDNO:387。
10.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体或其免疫反应性片段与选自由以下组成的组的参考抗体竞争结合DLL3蛋白质：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150，其中所述DLL3抗体或其免疫反应性片段与所述DLL3蛋白质的结合由所述参考抗体抑制至少30％。
11.根据权利要求1-10任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体属于选自由以下组成的组的仓室：仓室A、仓室B、仓室C、仓室D、仓室E、仓室F、仓室G、仓室H及仓室I。
12.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质N端结构域缔合的抗原决定基。
13.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质DSL结构域缔合的抗原决定基。
14.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质EGF1结构域缔合的抗原决定基。
15.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质EGF2结构域缔合的抗原决定基。
16.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质EGF3结构域缔合的抗原决定基。
17.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质EGF4结构域缔合的抗原决定基。
18.根据权利要求1-11任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于与所述DLL3蛋白质EGF5结构域缔合的抗原决定基。
19.根据权利要求1-19任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含来自SEQIDNO:21-387单号中的任一者的CDR。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含来自SEQIDNO:21-387单号中的任一者的复数个CDR。
21.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于包含DLL3蛋白质的氨基酸Q93、P94、G95、A96及P97(SEQIDNO:3)的抗原决定基。
22.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体与结合于包含DLL3蛋白质的氨基酸Q93、P94、G95、A96及P97(SEQIDNO:3)的抗原决定基的抗体竞争。
23.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体结合于包含DLL3蛋白质的氨基酸G203、R205及P206(SEQIDNO:4)的抗原决定基。
24.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体与结合于包含DLL3蛋白质的氨基酸G203、R205及P206(SEQIDNO:4)的抗原决定基的抗体竞争。
25.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含选自由hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56组成的组的抗体。
26.根据权利要求1-5任一项所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含轻链可变区及重链可变区，其中所述轻链可变区包含选自由SEQIDNO:389、SEQIDNO:393、SEQIDNO:397、SEQIDNO:401及SEQIDNO:405中所示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列，且其中所述重链可变区包含选自由SEQIDNO:391、SEQIDNO:395、SEQIDNO:399、SEQIDNO:403及SEQIDNO:407中所示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
27.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述抗DLL3抗体属于由选自由以下组成的组的参考抗体界定的仓室：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物，其中该缀合物包含ADC1。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物，其中该缀合物包含ADC2。
30.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物，其中该缀合物包含ADC3。
31.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物，其中该缀合物包含ADC4。
32.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物，其中该缀合物包含ADC5。
33.一种如图6所示的缀合物。
34.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至33中任一项所述的缀合物。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述药物与抗体比率(DAR)为2+/-0.4、4+/-0.4、6+/-0.4或8+/-0.4。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述DAR为2+/-0.4。
37.一种治疗DLL3相关病症的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的根据权利要求34-36任一项所述的药物组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述DLL3相关病症包括增生性病症。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述增生性病症包括赘生性病症。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述赘生性病症包括呈现神经内分泌特征的肿瘤。
41.根据权利要求39所述的用途，其中所述赘生性病症包括选自由以下组成的组的病症：肾上腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、大细胞肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌及乳癌。
42.根据权利要求37-41任一项所述的方法，其进一步包括施用抗癌剂的步骤。
43.一种降低有需要的个体中肿瘤引发细胞的出现率的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法，其中出现率的降低是使用已知针对肿瘤引发细胞富集的肿瘤细胞表面标记的流动式细胞测量分析或已知针对肿瘤引发细胞富集的肿瘤细胞表面标记的免疫组织化学检测来测定。
45.根据权利要求43所述的方法，其中出现率的降低是使用体外或体内有限稀释分析来测定。
46.根据权利要求45所述的方法，其中出现率的降低是使用体内有限稀释分析来测定，该体内有限稀释分析包括将活的人类肿瘤细胞移植至无免疫应答的小鼠中。
47.根据权利要求45所述的方法，其中出现率的降低是使用体外有限稀释分析来测定，该体外有限稀释分析包括将活的人类肿瘤细胞限制稀释沉积至体外集落支持条件。
48.一种使个体中肿瘤敏化用于抗癌剂的治疗的的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物。
49.一种抑制或预防有需要的个体中转移的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述个体在施用所述缀合物之前或之后经历减积过程。
51.一种对有需要的个体进行维持疗法的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物的步骤。
52.一种消耗罹患增生性病症的个体中肿瘤引发细胞的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物的步骤。
53.一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物。
54.一种治疗罹患小细胞肺癌的个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求34至36中任一项的药物组合物的步骤。
55.根据权利要求43-54任一项所述的方法，其进一步包括施用抗癌剂的步骤。
56.根据权利要求34-36任一项的药物组合物在制备用于权利要求43-55中任一项的方法中的药物中的应用。
57.一种制备根据权利要求1至33中任一项的缀合物的方法，其包括使抗DLL3抗体或其免疫反应性片段与选自由以下组成的组的化合物缀合的步骤
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