JP2019069983A - 新規抗体コンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

新規抗体コンジュゲートおよびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）にコンジュゲートしたＤｅｌｔａ様リガンド３（またはＤＬＬ３）抗体またはその免疫反応性フラグメントを含む新規の化合物ならびに癌およびその任意の再発または転移の処置または予防のためのその使用。【解決手段】ＤＬＬ３関連障害（例えば、増殖性障害または新生物障害）の処置で使用することができる選択されたＰＢＤを含む一定の抗体薬物コンジュゲートであって、該抗体薬物コンジュゲートを、広範な種々の増殖性障害およびその任意の拡大、再発、ぶり返し、または転移を罹患した患者を処置するために使用する。【選択図】図５

Description

相互参照出願
本出願は、２０１３年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／７６８３６８号
の優先権を主張し、その全体が参考として本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出した配列表を含み、この配列
表は、その全体が本明細書中で参考として援用される。２０１４年２月１５日に作成され
た前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称がＳ６９６９７＿１１１０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであ
り、サイズが５８２ＫＢ（５９６，３４５バイト）である。
発明の分野
本出願は、一般に、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）にコンジュゲートした抗ＤＬＬ
３抗体またはその免疫反応性フラグメントを含む新規の化合物ならびに癌およびその任意
の再発または転移の処置または予防のためのその使用に関する。
発明の背景
幹細胞および前駆細胞の分化および増殖は、器官発生、細胞修復、および細胞置換の間
の組織成長を支持するために協力して作用する通常の進行過程である。このシステムは、
確実に器官の必要性に基づいてのみ適切なシグナルを生成するように厳重に制御される。
細胞の増殖および分化は、通常、損傷を受けた細胞または死細胞の置換または成長に必要
な場合のみ起こる。しかし、これらの過程の破壊は、種々のシグナル伝達化学物質の過少
または過多、微小環境の変化、遺伝子変異、またはこれらの組み合わせが含まれる多数の
要因によって引き起こされ得る。正常細胞の増殖および／または分化の破壊は、癌などの
増殖性疾患が含まれる種々の障害を導き得る。
従来の癌処置には、化学療法、放射線療法、および免疫療法が含まれる。しばしばこれ
らの処置は無効であり、外科的切除は、実行可能な臨床的代替法となり得ない。現行の標
準治療の限界は、患者が一次処置を受け、その後に再発した場合に特に明白である。かか
る場合、しばしば侵襲性および不治の難治性腫瘍が頻繁に生じる。多数の固形腫瘍につい
ての総生存率はここ何年も大きく変化せず、これは、既存の治療がぶり返し、腫瘍の再発
および転移を防止することができないことに一部起因する。現在利用できる処置における
治療上の制限により、腫瘍形成性細胞を有効に標的し、扱い易い付帯的損傷と共にこれら
の細胞を排除するための新規の薬剤を開発する必要性が強調されている。
かかる薬剤および関連する処置の１つの有望な開発領域は、抗体を使用した標的治療を
含む。これに関して、癌、免疫学的障害、および血管新生障害患者の標的処置のための抗
体治療が確立されている（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：３４３−３５７）。より具体的には、細胞毒性薬または
細胞増殖抑制薬の局在送達のための細胞結合剤標的化成分および薬物ペイロード成分を含
む抗体薬物コンジュゲート（すなわち、ＡＤＣまたは免疫コンジュゲート）の使用は、腫
瘍細胞内の薬物の細胞内蓄積を促進することが示されている。かかる局在によって腫瘍内
に比較的高濃度の薬物が供給されるのに対して、同一の腫瘍濃度を達成するための非コン
ジュゲート化（すなわち、非標的化）薬物の全身投与により、正常細胞に許容できないレ
ベルの毒性が生じ得る（Ｘｉｅら（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈ
ｅｒ．６（３）：２８１−２９１；Ｋｏｖｔｕｎら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
６６（６）：３２１４−３１２１；Ｌａｗら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（
４）：２３２８−２３３７；Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（
９）：１１３７−１１４５；Ｌａｍｂｅｒｔ Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉ
ｎ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：５４３−５４９；Ｈａｍａｎｎ Ｐ．（２００５）
Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ １５（９）：１０８７−１１０３
；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２；Ｔｒａ
ｉｌら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２
８−３３７；Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４）。
臨床的観点から、かかる抗体薬物コンジュゲートにより、毒性を低下させながら有効性
を向上させることができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性ならびに薬物の作用
機構、コンジュゲート化技術およびリンカー、薬物／抗体比（負荷）、および薬物放出特
性に注目してＡＤＣのデザインおよび改善が行われている（Ｊｕｎｕｔｕｌａら，２００
８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２；Ｄｏｒｎａｎら
（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１３）：２７２１−２７２９；米国特許第７５２１５
４１号；米国特許第７７２３４８５号；ＷＯ２００９／０５２２４９；ＭｃＤｏｎａｇｈ
（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ．１９（７）：２９９−３
０７；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２
４；Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（８）：１−８；Ｓａ
ｎｄｅｒｓｏｎら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２
；Ｊｅｆｆｒｅｙら（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：１３４４−１３５８；Ｈ
ａｍｂｌｅｔｔら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０
７０）。抗体選択性および腫瘍局在に関して、多数の公知の腫瘍マーカーは、低発現、内
在化の欠如、脱落などが含まれる種々の理由で無効なＡＤＣ標的であることが証明されて
いる。適切なＡＤＣ薬構成要素の選択は、過去に問題が有ることが証明されている。種々
の薬剤がＡＤＣでの使用を提案されており、これらの薬剤には、チューブリン結合、ＤＮ
Ａ結合、プロテアソームおよび／またはトポイソメラーゼの阻害が含まれる機構によって
細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果を付与する薬物部分が含まれる。いくつかの成功に
もかかわらず、一定の細胞傷害性薬剤は、巨大な抗体またはタンパク質受容体リガンドに
コンジュゲートした場合に不活性または低活性である傾向がある。したがって、適切な標
的化剤または細胞結合剤およびＡＤＣ構成要素として有効な薬物ペイロードの選択は、所
望の臨床プロフィールを示す化合物を提供するために重要である。
潜在的なＡＤＣペイロードとして有望であることが示されている化合物の１つのクラス
は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。これに関して、ＰＢＤは、ＤＮＡの特定
の配列（好ましい配列ＰｕＧＰｕが含まれる）を認識して結合する能力を有する。第１の
ＰＢＤ抗腫瘍抗生物質であるアントラマイシンは、１９６５年に発見された（Ｌｅｉｍｇ
ｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７，５７９３−５７９５（１９６５）
；Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７，５７９１−５７９３
（１９６５））。それ以来、多数の天然に存在するＰＢＤが報告されており、種々のアナ
ログに対する１０を超える合成経路が開発されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら，Ｃｈｅｍ．
Ｒｅｖ．１９９４，４３３−４６５（１９９４）；Ａｎｔｏｎｏｗ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｈｕ
ｒｓｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１ １１１（４），２８１５−２８６
４）。ファミリーメンバーには、アブベイマイシン（Ｈｏｃｈｌｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０，１４５−１４８（１９８７））、チカマイシン（Ｋｏｎｉｓ
ｈｉら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３７，２００−２０６（１９８４））、ＤＣ−８
１（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐａｔｅｎｔ ５８−１８０ ４８７；Ｔｈｕｒｓｔｏｎら，Ｃ
ｈｅｍ．Ｂｒｉｔ．，２６，７６７−７７２（１９９０）；Ｂｏｓｅら，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ，４８，７５１−７５８（１９９２））、マゼトラマイシン（Ｋｕｍｉｎｏｔｏ
ら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３３，６６５−６６７（１９８０））、ネオトラマイ
シンＡおよびＢ（Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２９，９３−９６
（１９７６））、ポロトラマイシン（Ｔｓｕｎａｋａｗａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ，４１，１３６６−１３７３（１９８８））、プロトラカルシン（Ｓｈｉｍｉｚｕら，
Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２９，２４９２−２５０３（１９８２）；Ｌａｎｇｌｅｙ
ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５２，９１−９７（１９８７）
）、シバノミシン（ＤＣ−１０２）（Ｈａｒａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１，
７０２−７０４（１９８８）；Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１，１２８
１−１２８４（１９８８））、シビロマイシン（Ｌｅｂｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，１１０，２９９２−２９９３（１９８８））、およびトママイシン（Ａｒｉｍａ
ら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２５，４３７−４４４（１９７２））が含まれる。
ＰＢＤの一般構造は以下である。
Figure 2019069983
ＰＢＤは、その芳香環Ａおよびピロロ環Ｃの両方における置換基の数、タイプ、および
位置、ならびに環Ｃの飽和度が異なる。環Ｂにおいて、ＤＮＡのアルキル化を担う求電子
性中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（
ＯＨ））、またはカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれ
かが存在する。全ての公知の天然物はキラルＣ１１ａ位に（Ｓ）−立体配置を有し、環Ｃ
から環Ａに見た場合に右巻きで存在する。これにより、Ｂ型ＤＮＡの副溝に対して等らせ
ん性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）となるための適切な三次元形状が得られ、結合部位でぴ
ったり合うようになる（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ． Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）；Ｈｕｒｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，
１９，２３０−２３７（１９８６））。その副溝内に付加体を形成する能力により、ＤＮ
Ａプロセシングを妨害することができ、それ故、抗腫瘍薬として使用可能である。
特に有利なピロロベンゾジアゼピン化合物は、Ｇｒｅｇｓｏｎら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．１９９９，７９７−７９８）によって化合物１として記載され、Ｇｒｅｇｓｏｎら
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，１１６１−１１７４）によって化合物４ａと
して記載されている。この化合物は、ＳＧ２０００としても公知であり、以下に示す。
Figure 2019069983
ＷＯ２００７／０８５９３０は、抗体などの細胞結合剤への連結のためのリンカー基を
有する二量体ＰＢＤ化合物の調製を記載している。リンカーは、二量体の単量体ＰＢＤ単
位を連結する架橋中に存在する。
ＷＯ２０１１／１３０５９８は、抗体などの細胞結合剤への連結のためのリンカー基を
有する二量体ＰＢＤ化合物を記載しいている。これらの化合物中のリンカーは、利用可能
なＮ１０位の１つに結合し、好ましくは、リンカー基上の酵素の作用によって切断される
。
種々のＰＢＤ ＡＤＣが一定の増殖性障害の処置で有望であることが記載されている一
方で、臨床的に有効な標的化された化合物および増殖性障害を処置するためのかかる化合
物の使用方法が当該分野で依然として必要とされている。
米国特許第７５２１５４１号明細書 米国特許第７７２３４８５号明細書 国際公開第２００９／０５２２４９号 国際公開第２００７／０８５９３０号 国際公開第２０１１／１３０５９８号
Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：３４３−３５７ Ｘｉｅら（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（３）：２８１−２９１ Ｋｏｖｔｕｎら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（６）：３２１４−３１２１ Ｌａｗら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（４）：２３２８−２３３７ Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１３７−１１４５ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：５４３−５４９ Ｈａｍａｎｎ Ｐ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ １５（９）：１０８７−１１０３ Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２ Ｔｒａｉｌら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７ Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４ Ｊｕｎｕｔｕｌａら，２００８ｂ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２ Ｄｏｒｎａｎら（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１３）：２７２１−２７２９ ＭｃＤｏｎａｇｈ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ．１９（７）：２９９−３０７ Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２４ Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（８）：１−８ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２ Ｊｅｆｆｒｅｙら（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：１３４４−１３５８ Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０ Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７，５７９３−５７９５（１９６５） Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７，５７９１−５７９３（１９６５） Ｔｈｕｒｓｔｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９４，４３３−４６５（１９９４） Ａｎｔｏｎｏｗ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１ １１１（４），２８１５−２８６４ Ｈｏｃｈｌｏｗｓｋｉら，Ｊ．ＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣＳ，４０，１４５−１４８（１９８７） Ｋｏｎｉｓｈｉら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３７，２００−２０６（１９８４） Ｔｈｕｒｓｔｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔ．，２６，７６７−７７２（１９９０ Ｂｏｓｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８，７５１−７５８（１９９２） Ｋｕｍｉｎｏｔｏら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３３，６６５−６６７（１９８０） Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２９，９３−９６（１９７６） Ｔｓｕｎａｋａｗａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１，１３６６−１３７３（１９８８） Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２９，２４９２−２５０３（１９８２） Ｌａｎｇｌｅｙ ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５２，９１−９７（１９８７） Ｈａｒａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１，７０２−７０４（１９８８） Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１，１２８１−１２８４（１９８８） Ｌｅｂｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，２９９２−２９９３（１９８８） Ａｒｉｍａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２５，４３７−４４４（１９７２） Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５） Ｈｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９，２３０−２３７（１９８６） Ｇｒｅｇｓｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，７９７−７９８ Ｇｒｅｇｓｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，１１６１−１１７４
発明の概要
広義で、ＤＬＬ３関連障害（例えば、増殖性障害または新生物障害）の処置で使用する
ことができる選択されたＰＢＤを含む一定の抗体薬物コンジュゲートを含む方法、化合物
、組成物、および製品に関連する本発明によって、これらの目的および他の目的が提供さ
れる。これを受けて、本発明は、腫瘍細胞および／または癌幹細胞を有効に標的する選択
されたＰＢＤにコンジュゲートされたＤｅｌｔａ様リガンド３（またはＤＬＬ３）抗体を
提供し、この抗体を、広範な種々の増殖性障害およびその任意の拡大、再発、ぶり返し、
または転移を罹患した患者を処置するために使用することができる。広い態様では、本発
明は、すぐ下のＡＤＣ１〜５に実質的に記載のＤＬＬ３免疫コンジュゲートを提供するた
めに選択されたピロロベンゾジアゼピンにコンジュゲートしたＤｅｌｔａ様リガンド３（
ＤＬＬ３）抗体に関する。したがって、１つの態様では、本発明は、
Figure 2019069983
Figure 2019069983
Figure 2019069983
 からなる群から選択されるコンジュゲートであって、
ここで、Ａｂが抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントを含む、コンジュゲ
ートに関する。各コンジュゲート中のリンカー薬物部分へのコンジュゲートは、抗ＤＬＬ
３抗体上の遊離チオールを介することが好ましい。
他の態様では、本発明は、ＡＤＣ１を含む組成物、ＡＤＣ２を含む組成物、ＡＤＣ３を
含む組成物、ＡＤＣ４を含む組成物、またはＡＤＣ５を含む組成物を含む。
示すように、かかるコンジュゲートを増殖性障害またはその再発または進行の処置、管
理、改善、または予防のために使用することができる。本発明の選択された実施形態は、
腫瘍開始細胞頻度の低下を含むことが好ましい悪性疾患の免疫治療上の処置のためのかか
るＤＬＬ３コンジュゲートの使用を提供する。開示のＡＤＣを単独で使用することができ
るか、化学療法薬または免疫治療薬（例えば、治療抗体）または生化学的応答調節物質な
どの広範な種々の抗癌化合物と組み合わせて使用することができる。他の選択された実施
形態では、２つ以上の個別のＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを組み合わせて使用して、
抗腫瘍効果を強化することができる。
添付の実施例に記載の別の態様では、本発明は、以下：
Figure 2019069983
Figure 2019069983
 からなる群から選択される化合物を
抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントとコンジュゲートする工程を含む、
ＡＤＣ１〜５を作製する方法を提供する。本出願の目的のために、ＤＬを、「薬物−リン
カー」の略語として使用し、この略語は、前述の薬物リンカー１〜５（すなわち、ＤＬ１
、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、およびＤＬ５）を含むであろう。
当該分野で認識されている技術を使用してリンカーに付随する末端マレイミド部分（Ｄ
Ｌ１〜ＤＬ３およびＤＬ５）またはヨードアセトアミド部分（ＤＬ４）を選択されたＤＬ
Ｌ３抗体上の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートすることができることが認識されるで
あろう。以下のより詳細な考察に加えて、ＤＬ１〜５の各化合物への合成経路を本明細書
中に記載の実施例１で提供し、一方、ＡＤＣ１〜５を提供するためのかかる化合物の特定
のコンジュゲート化方法を実施例７に記載する。
本出願の目的のために、文脈上そうでないと示されない限り、用語「モジュレーター」
および「抗体」を交換可能に使用することができると認識されることに留意のこと。同様
に、用語「抗ＤＬＬ３コンジュゲート」および「ＤＬＬ３コンジュゲート」、または単純
に「コンジュゲート」は全て、抗ＤＬＬ３抗体を含むＡＤＣ１〜５として記載の化合物を
いい、文脈上そうでないと示されない限り、交換可能に使用することができる。
任意の事象では、広義で、ＤＬＬ３関連障害（例えば、増殖性障害または新生物障害）
の処置で使用することができる上記ＤＬＬ３コンジュゲートおよび関連する方法、組成物
、ならびに製品に関連する本発明によってこれらの目的および他の目的が提供される。こ
れを受けて、本発明は、腫瘍細胞および／または癌幹細胞を有効に標的する新規のＤｅｌ
ｔａ様リガンド３（すなわち、ＤＬＬ３）抗体コンジュゲートを提供し、この抗体を、広
範な種々の悪性疾患を罹患した患者を処置するために使用することができる。本明細書中
により詳細に考察されるように、少なくとも２つの天然に存在するＤＬＬ３イソ型または
バリアントが存在し、開示のモジュレーターは、あるイソ型または他のイソ型またはその
両方を選択的に含むかこれらと会合することができる。さらに、一定の実施形態では、開
示のＤＬＬ３モジュレーターは、１つ以上のＤＬＬファミリーメンバー（例えば、ＤＬＬ
１またはＤＬＬ４）とさらに反応することができるか、他の実施形態では、１つ以上のＤ
ＬＬ３イソ型と排他的に会合するか反応するように生成および選択することができる。
開示の抗体薬物コンジュゲートは、ＤＬＬ３決定基（またはそのフラグメント）を認識
、競合、アゴナイズ、アンタゴナイズ、相互作用、結合、または会合し、１つ以上の生理
学的経路に及ぼすＤＬＬ３タンパク質の影響を調節、調整、変更、制御、変化、または修
飾し、そして／またはＤＬＬ３関連細胞を阻害または排除する任意のモジュレーター、抗
体またはその免疫反応性フラグメントを含むことができることがさらに認識されるであろ
う。したがって、広義では、本発明は、一般に、ＤＬＬ３コンジュゲートおよびその使用
に関する。さらに、以下で広く考察されるように、かかる抗体薬物コンジュゲートを使用
して、増殖性障害（癌が含まれる）の予防、診断、または処置に有用な薬学的組成物を提
供することができる。
ＡＤＣ１〜５に関して、適合性抗体が、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、ならびに
前述の各々の免疫反応性フラグメントおよび／またはバリアントが含まれる多数の形態の
いずれか１つをとることができると認識されるであろう。好ましい実施形態は、ヒト化構
築物または完全にヒトの構築物などの比較的非免疫原性の抗体を含むであろう。勿論、本
開示を考慮して、当業者は、ＤＬＬ３抗体モジュレーターの重鎖可変領域および軽鎖可変
領域に会合した１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を容易に同定し、これらのＣＤＲを
過度に実験することなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはＣＤＲグラフティング抗体を
操作または作製するために使用することができる。したがって、一定の好ましい実施形態
では、開示のＡＤＣのＤＬＬ３抗体成分は、図３Ａおよび３Ｂで定義し、且つ本明細書中
に記載の例示的な連続する軽鎖（図３Ａ）または重鎖（図３Ｂ）のマウス可変領域（配列
番号２１〜３８７、奇数）に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を組み込んだ
抗体を含む。例示的なヒト化（ＣＤＲグラフティング）軽鎖および重鎖可変領域配列も配
列番号３８９〜４０７を含む図３に示す。好ましい実施形態では、図３Ａおよび３Ｂに記
載のＣＤＲを含む抗体は、モノクローナル抗体を含み、さらにより好ましい実施形態では
、キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体、またはヒト化抗体を含むであろう。図３Ａお
よび３Ｂに記載の各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列を、配列表に添付してい
る。
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書中に記載の例示的抗体のアミノ酸
配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記抗体は、
本発明の抗ＤＬＬ３抗体の所望の機能的性質を保持する。
より詳細には、選択された実施形態では、任意のＡＤＣ１〜５中に含まれる抗体は、軽
鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体またはその免疫反応性フラグメントを含むこ
とができ、ここで、前記軽鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、
配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５
３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番
号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配
列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、配
列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、配
列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、配
列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配
列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９３、配列番号１９７、配
列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、配
列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、配
列番号２４１、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、配
列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７７、配
列番号２８１、配列番号２８５、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、配
列番号３０１、配列番号３０５、配列番号３０９、配列番号３１３、配列番号３１７、配
列番号３２１、配列番号３２５、配列番号３２９、配列番号３３３、配列番号３３７、配
列番号３４１、配列番号３４５、配列番号３４９、配列番号３５３、配列番号３５７、配
列番号３６１、配列番号３６５、配列番号３６９、配列番号３７３、配列番号３７７、配
列番号３８１、および配列番号３８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくと
も６０％相同なアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号２３、配列番号２７
、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号
５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列
番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９５、
配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、配
列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５、配
列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配
列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配
列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９５、配
列番号１９９、配列番号２０３、配列番号２０７、配列番号２１１、配列番号２１５、配
列番号２１９、配列番号２２３、配列番号２２７、配列番号２３１、配列番号２３５、配
列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５５、配
列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２７１、配列番号２７５、配
列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９５、配
列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３０７、配列番号３１１、配列番号３１５、配
列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２７、配列番号３３１、配列番号３３５、配
列番号３３９、配列番号３４３、配列番号３４７、配列番号３５１、配列番号３５５、配
列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７５、配
列番号３７９、配列番号３８３、および配列番号３８７からなる群から選択されるアミノ
酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含む。他の好ましい実施形態では、選択
されたモジュレーターは、前述のマウス配列と６５、７０、７５、または８０％相同な重
鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むであろう。さらなる他の実施形態では、モジュレー
ターは、開示のマウス配列と８５、９０、またはさらに９５％相同な重鎖可変領域および
軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むであろう。これに関して、マウス起源の抗体に由来す
るヒト化抗体が典型的には起源となる抗体に関しておよそ７０％〜およそ８５％相同なこ
とが好ましい重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有すると認識されるであろう。比較とし
て、ヒト化抗体は、典型的には、受容体ヒト抗体の可変領域と好ましくはおよそ８０％〜
およそ９５％相同な重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するであろう。
他の好ましい実施形態では、選択された抗体は、前述の軽鎖可変領域および重鎖可変領
域のアミノ酸配列のいずれかから得た１つ以上のＣＤＲを含むであろう。したがって、本
発明の選択された実施形態は、配列番号２１〜３８７の奇数番号のいずれか１つ由来の１
つ以上のＣＤＲを含むＤＬＬ３モジュレーターを含む。好ましくは、抗体は、図３Ａに記
載の単一の軽鎖可変領域のアミノ酸配列から得た３つの軽鎖ＣＤＲおよび図３Ｂに記載の
単一の重鎖可変領域のアミノ酸配列から得た３つの重鎖ＣＤＲを含むであろう。例えば、
例示的な抗体は、図３Ａに記載の単一の軽鎖可変領域のアミノ酸配列から得た３つの軽鎖
ＣＤＤＲおよび図３Ｂに記載の単一の重鎖可変領域のアミノ酸配列由来の３つの重鎖ＣＤ
Ｒを含むことができ、ここで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は同一クローンに由来す
る。さらに他の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、前述のモジュレーターのいず
れかと結合を競合する任意の抗体またはその免疫反応性フラグメントを含むであろう。
したがって、本発明の別の態様は、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ
１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６
．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６
．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６
．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６
．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６
．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６
．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６
．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６
．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６
．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、
ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６
．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５
、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１
６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２
５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ
１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１
３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、Ｓ
Ｃ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．
１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９、およびＳＣ１６．１５０から得たかこれ
らに由来するＡＤＣ組込み抗体；または上記で同定した抗体、またはそのキメラバージョ
ンもしくはヒト化バージョンのいずれかを含む。他の実施形態では、本発明のＡＤＣは、
前述のモジュレーターのいずれか由来の１つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５
、または６つのＣＤＲ）を有するＤＬＬ３抗体を含むであろう。
別の態様では、本発明は、コンジュゲートであって、抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反
応性フラグメントが軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域が、
配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４
１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番
号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配
列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号
１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号
１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号
１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号
１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号
１８９、配列番号１９３、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号
２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号
２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号２４５、配列番号
２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号
２６９、配列番号２７３、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号
２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、配列番号３０１、配列番号３０５、配列番号
３０９、配列番号３１３、配列番号３１７、配列番号３２１、配列番号３２５、配列番号
３２９、配列番号３３３、配列番号３３７、配列番号３４１、配列番号３４５、配列番号
３４９、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３６１、配列番号３６５、配列番号
３６９、配列番号３７３、配列番号３７７、配列番号３８１、および配列番号３８５から
なる群から選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が
、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号
４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列
番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、
配列番号９１、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番
号１１１、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番
号１３１、配列番号１３５、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番
号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番
号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番
号１９１、配列番号１９５、配列番号１９９、配列番号２０３、配列番号２０７、配列番
号２１１、配列番号２１５、配列番号２１９、配列番号２２３、配列番号２２７、配列番
号２３１、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４７、配列番
号２５１、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番
号２７１、配列番号２７５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番
号２９１、配列番号２９５、配列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３０７、配列番
号３１１、配列番号３１５、配列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２７、配列番
号３３１、配列番号３３５、配列番号３３９、配列番号３４３、配列番号３４７、配列番
号３５１、配列番号３５５、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番
号３７１、配列番号３７５、配列番号３７９、配列番号３８３、および配列番号３８７か
らなる群から選択されるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む、コンジュゲートを
含むであろう。例えば、かかる抗体は、図３Ａおよび図３Ｂで確認される同一クローンの
軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むことができる。
さらなる他の適合可能な実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、ＣＤＲグ
ラフティング抗体またはヒト化ＤＬＬ３抗体であるｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５
、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６のうちの１つを含むで
あろう。
他の実施形態は、抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
配列番号４０８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４０９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；および
配列番号４１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含む、ＡＤＣに関する。
別の実施形態では、本発明は、抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
配列番号４１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；および
配列番号４１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含む、ＡＤＣに関する。
別の実施形態では、本発明は、抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
配列番号４２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；および
配列番号４２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含む、ＡＤＣに関する。
別の実施形態では、本発明は、抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
配列番号４２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；および
配列番号４２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含む、ＡＤＣに関する。
別の実施形態では、本発明は、抗体を含むＡＤＣであって、前記抗体が、以下：
配列番号４３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；および
配列番号４３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ
２、および配列番号４３７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体重鎖
を含む、ＡＤＣに関する。
一定の好ましい実施形態では、前述の各抗体はヒト化抗体を含む。さらに、本明細書中
に記載のように、かかる例示的なヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核
酸配列は、添付の配列表に記載されている。
さらに、本発明の１つの態様は、ＤＬＬ３ポリペプチドの癌幹細胞との治療的会合を含
み得る。したがって、一定の他の実施形態では、本発明は、被験体への投与の際に腫瘍開
始細胞の頻度が低下するＡＤＣ１〜５のＤＬＬ３コンジュゲートを含むであろう。好まし
くは、頻度の低下を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ限界希釈分析を使用して決
定するであろう。特に好ましい実施形態では、かかる分析を、免疫無防備状態のマウスへ
のヒト腫瘍生細胞の移植を含むｉｎ ｖｉｖｏ限界希釈分析を使用して行うことができる
。あるいは、限界希釈分析を、ｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー支持条件へのヒト腫瘍生細胞の
限界希釈沈着を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ限界希釈分析を使用して行うことができる。いずれ
かの場合、頻度の低下の分析、計算、または定量は、好ましくは、正確な計算のためのポ
アソン分布統計学の使用を含むであろう。かかる定量法が好ましいが、フローサイトメト
リーまたは免疫組織化学などの他の労力の少ない集約的方法論を使用して所望の値を得る
こともでき、したがって、これらの方法論が本発明の範囲内であると明確に見なされると
認識されるであろう。かかる場合、頻度の低下を、腫瘍開始細胞で富化することが公知の
腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析または免疫組織化学的検出を使用して
決定することができる。
これに関して、本発明は、少なくとも一部が、新形成が含まれる種々の増殖性障害の病
因学に関与する腫瘍持続細胞（ｔｕｍｏｒ ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）（す
なわち、癌幹細胞）にＤＬＬ３免疫原が治療的に会合するという発見に基づくと認識され
るであろう。より具体的には、本出願は、開示のＤＬＬ３コンジュゲートの投与によって
腫瘍開始細胞による腫瘍形成性シグナル伝達を媒介、低下、枯渇、阻害、または排除する
（例えば、腫瘍開始細胞の頻度を低下させる）ことができることを開示する。腫瘍開始細
胞の枯渇、中和、減少、排除、再プログラミング、もしくはサイレンシングまたは腫瘍細
胞の形態の改変（例えば、分化の誘導、ニッチ破壊）のいずれかによるこのシグナル伝達
の減少は、腫瘍発生、腫瘍の維持、拡大および／または転移ならびに再発の阻害によって
ＤＬＬ３関連障害をより有効に処置可能である。
上記の癌幹細胞との会合に加えて、ＤＬＬ３イソ型が神経内分泌性の特徴または表現型
決定基を含むか示す腫瘍の成長、再発、または転移の可能性に関与し得るという証拠があ
る。本発明の目的のために、かかる腫瘍は、神経内分泌腫瘍および偽神経内分泌腫瘍を含
むであろう。本明細書中に記載の新規のＤＬＬ３コンジュゲートを使用したかかる腫瘍形
成性細胞の増殖への介入により、１つを超える機構によって障害が改善または処置されて
（例えば、腫瘍開始細胞の減少および発癌経路シグナル伝達の破壊）、相加効果または相
乗効果を得ることができる。さらに他の好ましい実施形態は、結合した抗癌剤を送達させ
るために細胞表面ＤＬＬ３タンパク質の細胞内在化を活用することができる。これに関し
て、本発明が任意の特定の作用機構に制限されないが、むしろ、ＤＬＬ３関連障害（種々
の新形成が含まれる）を処置するための開示のモジュレーターの広範な使用を含むと認識
されるであろう。
さらなる他の好ましい実施形態では、モジュレーターは、ＤＬＬ３の特異的なエピトー
プ、部分、モチーフ、またはドメインに会合するか結合するであろう。以下にいくらか詳
細に考察するように、両方のＤＬＬ３イソ型は、少なくともＮ末端ドメイン、ＤＳＬ（Ｄ
ｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ｌａｇ−２）ドメイン、および６つのＥＧＦ様ドメイン（す
なわち、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６）を含む同一の細胞外領域（図２を参照のこと）を組み込ん
でいる。したがって、一定の実施形態では、モジュレーターはＤＬＬ３のＮ末端ドメイン
（すなわち、成熟タンパク質中のアミノ酸２７〜１７５）に結合または会合し、一方で、
他の選択された実施形態では、モジュレーターはＤＳＬドメイン（すなわち、ＤＬＬ３の
アミノ酸１７６〜２１５）またはＤＳＬドメイン中のエピトープに会合するであろう。本
発明の他の態様は、ＤＬＬ３の特定のＥＧＦ様ドメイン中に存在する特異的エピトープに
会合または結合する抗体を含む。これに関して、特定のモジュレーターは、ＥＧＦ１（ア
ミノ酸２１６〜２４９）、ＥＧＦ２（アミノ酸２７４〜３１０）、ＥＧＦ３（アミノ酸３
１２〜３５１）、ＥＧＦ４（アミノ酸３５３〜３８９）、ＥＧＦ５（アミノ酸３９１〜４
２７）、またはＥＧＦ６（アミノ酸４２９〜４６５）中に存在するエピトープに会合また
は結合することができる。勿論、上記の各ドメインが１つを超えるエピトープおよび／ま
たは１つを超えるｂｉｎを含むことができると認識されるであろう。特に好ましい実施形
態では、本発明は、ＤＳＬドメインまたはＤＳＬドメイン中のエピトープに結合するか、
反応するか、会合する抗体を含むであろう。他の好ましい実施形態では、本発明は、特定
のＥＧＦ様ドメインまたはＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに結合するか、反応するか、
会合する抗体を含むであろう。さらなる他の好ましい実施形態では、モジュレーターは、
Ｎ末端ドメインまたはＮ末端ドメイン中のエピトープに結合するか、反応するか、会合す
るであろう。
モジュレーターまたは抗体「ｂｉｎ」に関して、当該分野で認識された技術を使用した
競合抗体結合によってＤＬＬ３抗原を分析またはマッピングしてタンパク質上またはタン
パク質に沿って存在する特異的ｂｉｎを定義することができると認識されるであろう。本
明細書中により詳細に考察され、且つ以下の実施例に示されているが、２つの抗体（その
うちの１つを、「基準抗体」、「ビンデリニエイティング抗体（ｂｉｎ ｄｅｌｉｎｅａ
ｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「デリニエイティング抗体」と命名することがで
きる）を、標的抗原への結合を相互に競合する場合に同一ｂｉｎにあると見なすことがで
きる。このような場合、本発明の抗体エピトープは、両抗体が抗原への結合を立体的また
は静電気的に阻害または妨害されるように（これらの抗体エピトープが数個のアミノ酸に
よってか高次構造的に分離される一次的意味で）同一か、実質的に同一か、十分に類似し
得る。かかる定義されたｂｉｎは、一般に、一定のＤＬＬ３ドメインに関連し得るが（例
えば、基準抗体は特異的ドメイン中に含まれるエピトープと結合するであろう）、相関関
係は常に正確というわけではない（例えば、ドメイン中に１つを超えるｂｉｎが存在し得
るか、ｂｉｎを高次構造的に定義することができ、１つを超えるドメインを含むことがで
きる）。当業者はＤＬＬ３ドメインと経験的に決定されたｂｉｎとの間の関係を容易に決
定することができると認識されるであろう。
本発明に関して、当該分野で認識された技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共
鳴、またはバイオレイヤー干渉法）を使用した競合的結合分析により、少なくとも９つの
個別の異なるｂｉｎが定義され、これらの各ｂｉｎはいくつかの抗体モジュレーターを含
むことが見出された。本開示の目的のために、９つのｂｉｎをｂｉｎＡ〜ｂｉｎＩと命名
した。したがって、選択された実施形態では、本発明は、ｂｉｎＡ、ｂｉｎＢ、ｂｉｎＣ
、ｂｉｎＤ、ｂｉｎＥ、ｂｉｎＦ、ｂｉｎＧ、ｂｉｎＨ、およびｂｉｎＩからなる群から
選択されるｂｉｎ中に存在するＡＤＣ１〜５の抗体薬物コンジュゲートを含むであろう。
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１
６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１
３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２
１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２
９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３
６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４
７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５
６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６
３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７
３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８
４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１
６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０
９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ
１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１
２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、Ｓ
Ｃ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．
１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、
ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６
．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４
、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９、およびＳＣ１６．１５０か
らなる群から選択される基準抗体によって定義されたｂｉｎ中に存在する抗体を含む。さ
らなる他の実施形態では、本発明のＡＤＣは、ｂｉｎＡ由来の抗体、ｂｉｎＢ由来の抗体
、ｂｉｎＣ由来の抗体、ｂｉｎＤ由来の抗体、ｂｉｎＥ由来の抗体、ｂｉｎＦ由来の抗体
、ｂｉｎＧ由来の抗体、ｂｉｎＨ由来の抗体、またはｂｉｎＩ由来の抗体を含むであろう
。さらなる他の好ましい実施形態は、基準抗体モジュレーターおよび基準抗体と競合する
任意の抗体を含むであろう。
用語「競合する」または「競合抗体」は、開示のモジュレーターの文脈で使用する場合
、基準抗体または免疫学的に機能的なフラグメントが共通の抗原への試験抗体の特異的結
合を実質的に（例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６
５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を超える）防止または阻害するア
ッセイによって定義された抗体間の結合競合を意味する。かかる競合の適合可能な決定方
法は、例えば、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競
合ＥＬＩＳＡなどの当該分野で公知の技術を含む。
本発明はまた、癌などのＤＬＬ３関連障害の処置に有用な本明細書中に開示のＤＬＬ３
コンジュゲートおよび本明細書中に開示のＤＬＬ３コンジュゲートの薬学的組成物を使用
するキットまたはデバイスおよび関連する方法を提供する。この目的のために、本発明は
、好ましくは、ＤＬＬ３関連障害またはその進行または再発を処置、改善、または防止す
るためのＡＤＣ１〜５の抗体薬物コンジュゲートおよびコンジュゲートを使用するための
説明書を含む容器を含むＤＬＬ３関連障害の処置に有用な製品を提供する。
前述は概要であるので、必然的に簡潔で一般化され、詳細は省略されている。したがっ
て、当業者は、概要は例示のみを目的とし、いかなる制限も意図しないことを認識するで
あろう。本明細書中に記載の方法、組成物、および／またはデバイスおよび／または他の
対象の他の態様、特徴、および利点は、本明細書中に記載の教示中で明らかとなるであろ
う。概要は、簡略化した形態で概念の選択を示すために提供し、これらの概念は以下の詳
細な説明にさらに記載されている。この概要は、特許請求の範囲に記載の対象の重要な特
徴または不可欠な特徴を明らかにすることを意図せず、特許請求の範囲に記載の対象の範
囲の決定を補助するために使用することも意図しない。
図１は、ＤＬＬ３タンパク質（配列番号１および２）の２つのイソ型の配列アラインメントを提供する。
図２は、種々のドメインの位置を例示したＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域の略図を提供する。
図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。
図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された開示の抗体薬物コンジュゲートに適合するいくつかの例示的なマウスＤＬＬ３抗体およびヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数番号）を表形式で提供する。
図４は、本明細書中の実施例に記載のように単離、クローン化、および操作された例示的なＤＬＬ３モジュレーターのドメインレベルマッピング分析の結果を模式的に示す。
図５は、表形式で示した例示的なＤＬＬ３モジュレーターの生化学的性質および免疫学的性質を示す。
図６は、本開示によって生成した例示的な抗体薬物コンジュゲートのリストを提供する。 図６は、本開示によって生成した例示的な抗体薬物コンジュゲートのリストを提供する。 図６は、本開示によって生成した例示的な抗体薬物コンジュゲートのリストを提供する。 図６は、本開示によって生成した例示的な抗体薬物コンジュゲートのリストを提供する。 図６は、本開示によって生成した例示的な抗体薬物コンジュゲートのリストを提供する。 図６は、本開示によって生成した例示的な抗体薬物コンジュゲートのリストを提供する。
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明を多数の異なる形態で具体化することができるが、本発明の原理を例示する特定
の例示的実施形態を本明細書中に開示する。本発明が例示した特定の実施形態に制限され
ないということを強調すべきである。さらに、本明細書中で使用した任意の項目の見出し
は整理することのみを目的とし、記載の主題を制限すると解釈すべきではない。最後に、
他で示さない限り、本開示の目的のために、全ての識別配列受入番号を、ＮＣＢＩ Ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベースおよび／またはＮＣＢ
Ｉ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出すことができる。
上記で考察されるように、ＤＬＬ３表現型決定基は神経内分泌性の特徴を示す種々の増
殖性障害（新形成が含まれる）に臨床的に関連し、ＤＬＬ３タンパク質およびそのバリア
ントまたはイソ型が関連する疾患の処置で活用することができる有用な腫瘍マーカーを提
供することが見出されている。これに関して、本発明は、抗ＤＬＬ３抗体標的化剤および
ＰＢＤペイロードを含む上記でＡＤＣ１〜５と示すいくつかの抗体薬物コンジュゲートを
提供する。以下でより詳細に考察され、且つ添付の実施例に示すように、開示のＤＬＬ３
ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞の排除で特に有効であり、したがって、一定の増殖性障害ま
たはその進行もしくは再発の処置および予防に有用である。
さらに、本出願に示すように、細胞表面ＤＬＬ３タンパク質などのＤＬＬ３マーカーま
たはＤＬＬ３決定基が癌幹細胞（腫瘍持続細胞としても公知）と治療的に会合し、これら
の細胞を排除またはサイレンシングするために有効に活用することができることが見出さ
れている。本明細書中に開示のコンジュゲートしたＤＬＬ３モジュレーターの使用によっ
て癌幹細胞を選択的に減少または排除することができることは、かかる細胞が一般に多数
の従来の処置に抵抗性を示すことが公知であるという点で驚くべきことである。すなわち
、伝統的な標的処置方法だけでなくより最近の標的処置方法の有効性も、しばしば、これ
らの多様な処置方法に直面しているにもかかわらず腫瘍成長を持続することができる耐性
癌幹細胞の存在および／または出現によって制限される。さらに、癌幹細胞に会合した決
定基は、しばしば、低発現もしくは不定の発現、腫瘍形成性細胞に会合し続けられないこ
と、または細胞表面上に存在できないことによって治療標的として不十分となる。先行技
術の教示と際立って対照的に、本発明に開示の抗体薬物コンジュゲートおよび方法は、こ
の固有の耐性を有効に克服し、かかる癌幹細胞を特異的に排除するか、枯渇させるか、分
化をサイレンシングするか促進し、それにより、根底にある腫瘍成長を維持または再誘導
する能力を無効にする。さらに、ＤＬＬ３タンパク質の発現がゴルジなどの細胞内の位置
に非常に関連するので、かかる表現型決定基を本明細書中に教示の特異的ＡＤＣの治療標
的として首尾よく活用することができるかどうかは不確実であった。
したがって、ＤＬＬ３コンジュゲート（本明細書中に開示のものなど）を選択された増
殖性（例えば、新生物性）障害またはその進行もしくは再発の処置および／または防止で
有利に使用することができるということに特に注目すべきである。本発明の好ましい実施
形態は、特に特定のドメイン、領域、またはエピトープに関して、または神経内分泌性の
特徴を含む癌幹細胞または腫瘍および開示の抗体薬物コンジュゲートとのその相互作用の
文脈において以下に広範に考察されているが、当業者は、本発明の範囲がかかる例示的な
実施形態によって制限されないことを認識するであろう。むしろ、本発明および添付の特
許請求の範囲の最も広範な実施形態は、いかなる特定の作用機構、特異的に標的化された
腫瘍、細胞、または分子成分と無関係に、開示のＤＬＬ３コンジュゲートならびに種々の
ＤＬＬ３関連障害またはＤＬＬ３媒介障害（新生物障害または増殖性障害が含まれる）の
処置および／または防止でのその使用に広範且つ明確に関連する。
これを受けて、本出願に証明するように、増殖性細胞または腫瘍形成性細胞を標的化し
て排除するかそうでなければ無力化し、ＤＬＬ３関連障害（例えば、新形成）を処置する
ために開示のＤＬＬ３コンジュゲートを有効に使用することができることが予想外に見出
された。本明細書中で使用する場合、「ＤＬＬ３関連障害」は、疾患または障害の進行中
または罹患中にＤＬＬ３の遺伝要素または発現（「ＤＬＬ３決定基」）の表現型異常が標
識、診断、検出、または同定される任意の障害または疾患（増殖性障害が含まれる）を意
味するものとする。これに関して、ＤＬＬ３表現型の異常または決定基は、例えば、ＤＬ
Ｌ３タンパク質発現レベルの上昇または低下、一定の限定できる細胞集団における異常な
ＤＬＬ３タンパク質発現、または細胞生活環の不適切な相または段階での異常なＤＬＬ３
タンパク質発現を含み得る。勿論、ＤＬＬ３の遺伝子型決定基（例えば、ｍＲＮＡ転写レ
ベル）の類似の発現パターンを使用してＤＬＬ３障害を分類、検出、または処置すること
もできることが認識されるであろう。
開示のコンジュゲートに関して、本発明は、ＰＢＤ部分の１つのある位置に連結したリ
ンカーを有し、リンカーを介してＤＬＬ３抗体モジュレーターにコンジュゲートしたＰＢ
Ｄ二量体を提供する。これらの慎重に操作した立体配置により、コンジュゲートは、好ま
しくはいかなるリンカー部分も保持しない活性なＰＢＤ化合物を放出可能である。すなわ
ち、ＰＢＤペイロードの反応に悪影響を及ぼし得る突起やリンカー残基が存在しない。し
たがって、開示のＤＬＬ３コンジュゲートは、リンカー切断の際に以下の二量体ＰＢＤ化
合物が放出される。
ＡＤＣ１のコンジュゲートは以下の化合物ＰＢＤ１を放出する。
Figure 2019069983
 ＡＤＣ２のコンジュゲートは以下の化合物ＰＢＤ２を放出する。
Figure 2019069983
 ＡＤＣ３のコンジュゲートは以下の化合物ＰＢＤ３を放出する。
Figure 2019069983
 ＡＤＣ４のコンジュゲートは以下の化合物ＰＢＤ４を放出する。
Figure 2019069983
 ＡＤＣ５のコンジュゲートは以下の化合物ＰＢＤ５を放出する。
Figure 2019069983
したがって、ＰＢＤ１、ＰＢＤ２、ＰＢＤ３、ＰＢＤ４、またはＰＢＤ５の有毒化合物
を、所望の活性化部位（すなわち、腫瘍形成性細胞内）に、連結基上、特に組み込まれた
バリン−アラニンジペプチド部分上のカテプシンなどの酵素作用によって、ＡＤＣ１〜５
を用いて送達させる。以下により詳細に考察するように、開示のＰＢＤ細胞毒素の局在化
送達により、標準的な非標的化学療法によるケアよりも実質的に低い毒性でいくつかの腫
瘍形成性細胞型を有効に排除することができる。
これらに関して、本発明の１つの態様は、ＤＬＬ３コンジュゲートを投与する工程を含
むＰＢＤ１、ＰＢＤ２、ＰＢＤ３、ＰＢＤ４、およびＰＢＤ５からなる群から選択される
化合物の送達を含む。
ＩＩ．ＤＬＬ３生理学
線虫およびショウジョウバエで最初に同定され、無脊椎動物から脊椎動物に進化的に保
存されていることが実質的に示されているＮｏｔｃｈシグナル伝達経路は、正常な胚発生
、成体組織ホメオスタシス、および幹細胞維持が含まれる一連の基本的生物学的過程に関
与する（Ｄ’Ｓｏｕｚａら，２０１０；Ｌｉｕら，２０１０）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達
は、特異化、パターン形成、および形態形成中の種々の細胞型に極めて重要である。頻繁
に、このＮｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する細胞が標準的な細胞
運命を採用する側方抑制機構によって起こるが、隣接細胞におけるこの運命はＮｏｔｃｈ
シグナル伝達の刺激を介して抑制される（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，１９８８，Ｃａｂｒｅｒ
ａ １９９０）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達によって媒介されるこの二元性の細胞運命の選
択は、多数の組織（神経系（ｄｅ ｌａ Ｐｏｍｐａら，１９９７）、造血系および免疫
系（Ｂｉｇａｓ ａｎｄ Ｅｓｐｉｎｏｓｏａ，２０１２；Ｈｏｙｎｅら，２０１１；Ｎ
ａｇａｓｅら，２０１１）、腸（Ｆｒｅら，２００５；Ｆｒｅら，２００９）、膵内分泌
部（Ａｐｅｌｑｖｉｓｔら，１９９９；Ｊｅｎｓｅｎら，２０００）、下垂体（Ｒａｅｔ
ｚｍａｎら，２００４）、および広範性神経内分泌系（Ｉｔｏら，２０００；Ｓｃｈｏｎ
ｈｏｆｆら，２００４）の発生が含まれる）において役割を果たすことが見出されている
。Ｎｏｔｃｈが例えば標準的な細胞運命の選択が塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス
（ｂＨＬＨ）タンパク質として公知の転写調節因子によって決定される細胞で役割を果た
す広範な発生系にもかかわらず、このバイナリスイッチを実施するための一般的機構が保
存されるようであり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達によってあるＮｏｔｃｈ応答遺伝子クラス
が活性化され、それにより、ｂＨＬＨタンパク質の活性が抑制される（Ｂａｌｌ，２００
４）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を増殖または阻害し、自己再生を誘発するか阻害させる発
生上およびシグナル伝達の合図のより広い脈絡でこれらのバイナリ決定が起こる。
ショウジョウバエでは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、主に、１つのＮｏｔｃｈ受容体遺
伝子および２つのリガンド遺伝子（ＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａとして公知）によっ
て媒介される（Ｗｈａｒｔｏｎら，１９８５；Ｒｅｂａｙら，１９９１）。ヒトでは、４
つの公知のＮｏｔｃｈ受容体および５つのＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ ＬＡＧ
２）リガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２として公知の２つのＳｅｒｒａｔｅ
ホモログおよびＤｅｌｔａ様リガンドと命名された３つのＤｅｌｔａホモログ）またはＤ
ＬＬ１、ＤＬＬ３、およびＤＬＬ４が存在する。一般に、シグナル受信細胞表面上のＮｏ
ｔｃｈ受容体が、対するシグナル送信細胞表面上に発現されたリガンドとの相互作用（ト
ランス相互作用と呼ばれる）によって活性化される。これらのトランス相互作用により、
一連のＮｏｔｃｈ受容体のプロテアーゼ媒介切断が起こる。その結果、Ｎｏｔｃｈ受容体
細胞内ドメインは、膜から核に自由に転位置し、核内で転写因子のＣＳＬファミリー（ヒ
トではＲＢＰＪ）と対になり、これらの対が転写リプレッサーをＮｏｔｃｈ応答遺伝子の
アクチベーターに変換する。
ヒトＮｏｔｃｈリガンドのうち、ＤＬＬ３は、トランス相互作用を介したＮｏｔｃｈ受
容体の活性化が不可能であるらしいという点で異なる（Ｌａｄｉら，２００５）。Ｎｏｔ
ｃｈリガンドはまた、シス（同一細胞上）でＮｏｔｃｈ受容体と相互作用してＮｏｔｃｈ
シグナルを阻害することができるにもかかわらず、正確なシス阻害機構は不明のままであ
り、リガンドに応じて変化し得る（例えば、Ｋｌｅｉｎら，１９９７；Ｌａｄｉら，２０
０５；Ｇｌｉｔｔｅｎｂｅｒｇら，２００６を参照のこと）。２つの仮定される阻害様式
には、トランス相互作用の防止、または受容体プロセシングの無秩序化または小胞体もし
くはゴルジ中の受容体の生理学的保持による細胞表面上のＮｏｔｃｈ受容体量の減少によ
る細胞表面でのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調整が含まれる（Ｓａｋａｍｏｔｏら，２００
２；Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅ，２００９）。しかし、隣接細胞上でのＮｏｔｃｈ受容体および
リガンドの発現の確率の差を、転写過程および非転写過程の両方によって増幅することが
でき、シスおよびトランス相互作用の微妙なバランスにより隣接組織の多様な細胞運命の
Ｎｏｔｃｈ媒介デリニエーションを繊細に調整することができることが明らかである（Ｓ
ｐｒｉｎｚａｋら，２０１０）。
ＤＬＬ３（Ｄｅｌｔａ様３またはＳＣＤＯ１としても公知）は、Ｎｏｔｃｈ ＤＳＬリ
ガンドのＤｅｌｔａ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オルソ
ログには、ヒト（受入番号ＮＰ＿０５８６３７およびＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジ
ー（受入番号ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受入番号ＮＰ＿０３１８９２）、お
よびラット（受入番号ＮＰ＿４４６１１８）が含まれるが、これらに限定されない。ヒト
では、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３上に存在する９．５ｋＢｐに及ぶ８個のエク
ソンからなる。最後のエクソン内の選択的スプライシングによって２つのプロセシングし
た転写物（一方が２３８９塩基（受入番号ＮＭ＿０１６９４１）および他方が２０５２塩
基（受入番号ＮＭ＿２０３４８６））が生じる。前者の転写物が６１８アミノ酸のタンパ
ク質（受入番号ＮＰ＿０５８６３７；図１、配列番号１）をコードするのに対して、後者
は５８７アミノ酸のタンパク質（受入番号ＮＰ＿９８２３５３；図１、配列番号２）をコ
ードする。これら２つのＤＬＬ３のタンパク質イソ型は、その細胞外ドメインおよび膜貫
通ドメインが概して１００％同一であり、より長いイソ型がタンパク質のカルボキシ末端
に３２個のさらなる残基を含む伸長した細胞質側末端を含むという点のみが異なる（図１
）。イソ型の生物学的関連性は不明であるが、両イソ型を腫瘍細胞中で検出することがで
きる。
一般に、ＤＳＬリガンドは、以下の一連の構造ドメインから構成される：固有のＮ末端
ドメイン、その後の保存されたＤＳＬドメイン、複数のタンデム型上皮成長因子（ＥＧＦ
）様リピート、膜貫通ドメイン、およびリガンド間で高度に保存されていないが、固有の
Ｅ３ユビキチンリガーゼによる潜在的なユビキチン化部位である複数のリジン残基を含む
細胞質ドメイン。ＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用に必要であるが十分
ではない縮重ＥＧＦドメインである（Ｓｈｉｍｉｚｕら，１９９９）。さらに、大部分の
ＤＳＬリガンドの最初の２つのＥＧＦ様リピートは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化し
た場合にＤＳＬドメインと協同的に相互作用するＤＯＳドメインとして公知のより小さな
タンパク質配列モチーフを含む。
図２は、６つのＥＧＦ様ドメイン、単一のＤＳＬドメイン、およびＮ末端ドメインの一
般的な並置を示すＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域の略図を提供する。一般に、ＥＧＦド
メインは、ｈＤＬＬ３の約アミノ酸残基２１６〜２４９（ドメイン１）、２７４〜３１０
（ドメイン２）、３１２〜３５１（ドメイン３）、３５３〜３８９（ドメイン４）、３９
１〜４２７（ドメイン５）、および４２９〜４６５（ドメイン６）に生じると認識されて
おり、ＤＳＬドメインはｈＤＬＬ３の約アミノ酸残基１７６〜２１５に生じ、Ｎ末端ドメ
インはｈＤＬＬ３の約アミノ酸残基２７〜１７５に生じると認識されている（配列番号１
および２）。本明細書中により詳細に考察され、且つ以下の実施例に示されているが、Ｅ
ＧＦ様ドメイン、ＤＳＬドメイン、およびＮ末端ドメインはそれぞれ、個別のアミノ酸配
列によって定義されるＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。本開示の目的のために、各ＥＧ
Ｆ様ドメインをＥＧＦ１〜ＥＧＦ６と命名することができ、ＥＧＦ１はタンパク質のＮ末
端部分に最も近いことに留意のこと。タンパク質の構造組成に関して、本発明の１つの有
意な態様は、選択されたドメイン、モチーフ、またはエピトープと反応させるために開示
のＤＬＬ３モジュレーターを生成、作製、操作、または選択することができることである
。ある場合において、かかる部位特異的モジュレーターにより、その主な作用様式に応じ
て高い反応性および／または有効性を得ることができる。
本明細書中で使用する場合、用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、
本明細書中で使用する場合、哺乳動物細胞中での発現によって産生されるタンパク質の形
態をいうことに留意のこと。一旦粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の搬出が開始
されると、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質はシグナルペプチド（ＳＰ）配列
を有し、このＳＰ配列が完全なポリペプチドから切断されてタンパク質の「成熟」形態が
産生されると一般に仮定されている。ＤＬＬ３の両イソ型では、成熟タンパク質は、細胞
表面発現前にクリッピングすることができる２６アミノ酸のシグナルペプチドを含む。し
たがって、成熟タンパク質では、Ｎ末端ドメインは、ＤＳＬドメインの最初までタンパク
質中の２７位から伸長するであろう。勿論、タンパク質がこの様式でプロセシングされな
い場合、Ｎ末端ドメインは配列番号１および２の１位にまで及んだままであろう。
ＤＬＬ３は、縮重ＤＳＬドメインを含み、ＤＯＳモチーフを含まず、且つ、リジン残基
を欠く細胞内ドメインを含むので、種々のＤｅｌｔａ様リガンドのうちで、ＤＬＬ３は、
ファミリー内の他のリガンドと比較して最も多様である。縮重ＤＳＬおよびＤＯＳモチー
フの欠如は、ＤＬＬ３がトランスで（細胞間）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘発することが
できないことと一致し、それにより、ＤＬＬ３は、ＤＬＬ１やＤＬＬ４と異なり、Ｎｏｔ
ｃｈシグナル伝達のインヒビターとしてのみ作用することが示唆される（Ｌａｄｉら，２
００５）。研究により、ＤＬＬ３は主にシス−ゴルジ中に存在することができ（Ｇｅｆｆ
ｅｒｓら，２００７）、このことはＮｏｔｃｈ受容体を細胞内に保持するかＮｏｔｃｈ受
容体のプロセシングを阻止して細胞表面への搬出を防止し、代わりにこれをリソソームに
再標的化する能力があるという仮説（Ｃｈａｐｍａｎら，２０１１）と一致すると考えら
れることが示されている。しかし、モデル系においてタンパク質が人為的に過剰発現され
る場合にいくつかのＤＬＬ３タンパク質は細胞表面に出現し得るが（Ｌａｄｉら、２００
５）、このことが通常の生物学的状況やＤＬＬ３ ｍＲＮＡ転写物が上昇する腫瘍でも当
てはまるかどうかは明らかではない。いくらかおどろくべきことに、本明細書中に開示の
腫瘍型で検出されたタンパク質レベルは、有意なＤＬＬ３タンパク質が種々の腫瘍細胞表
面に回避することを示す。
さらに、上記に考察するように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、神経内分泌細胞および神
経内分泌性の特徴を示す腫瘍の発生および維持で役割を果たす。これに関して、Ｎｏｔｃ
ｈシグナル伝達は、通常の内分泌器官および広範性神経内分泌系内の広範な細胞運命決定
に関与する。例えば、膵臓では、ｂＨＬＨ転写因子ＮＧＮ３によって媒介される標準的な
内分泌表現型の発生を抑制するためにＮｏｔｃｈシグナル伝達が必要である（Ｈａｂｅｎ
ｅｒら，２００５）。内分泌細胞運命の類似のＮｏｔｃｈ媒介抑制は、腸内分泌細胞（Ｓ
ｃｈｏｎｈｏｆｆら，２００４）、甲状腺傍濾胞細胞（Ｃｏｏｋら，２０１０）で起こり
、下垂体中の神経内分泌細胞型の相対比の特定において（Ｄｕｔｔａら，２０１１）、神
経内分泌表現型または非神経内分泌表現型を採用するための肺内の細胞決定に関与する可
能性が高い（Ｃｈｅｎら，１９９７；Ｉｔｏら，２０００；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら，
２００２）。それ故、多数の組織において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の抑制が神経内分泌
表現型に関連することが明らかである。
発生シグナル伝達経路の不適切な再活性化または正常なシグナル伝達経路の無制御は一
般に腫瘍で認められ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の場合、多数の腫瘍型に関連している（Ｋ
ｏｃｈ ａｎｄ Ｒａｄｔｋｅ，２０１０；Ｈａｒｒｉｓら，２０１２）。Ｎｏｔｃｈ経
路は、リンパ腫、直腸結腸癌、膵臓癌、およびいくつかのタイプの非小細胞肺癌における
癌遺伝子として研究されている（Ｚａｒｅｎｃｚａｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２０１０およ
びその参考文献を参照のこと）。対照的に、Ｎｏｔｃｈは、神経内分泌性の特徴を有する
腫瘍中で腫瘍抑制因子として作用することが報告されている（Ｚａｒｅｎｃｚａｎ ａｎ
ｄ Ｃｈｅｎ，２０１０前出を参照のこと）。神経内分泌性の特徴を有する腫瘍は広範な
原発部位で稀に生じ、その包括的分類には問題が残されているが（Ｙａｏら，２００８；
Ｋｌｉｍｓｔｒａら，２０１０；Ｋｌｏｐｐｅｌ，２０１１）、腫瘍を、以下の４つの主
なタイプに分類することができる：低悪性度良性カルチノイド、悪性挙動を示す低悪性度
高分化型神経内分泌腫瘍、神経内分泌性の特徴および上皮の特徴を併せ持つ腫瘍、および
高悪性度低分化型神経内分泌癌。これらの分類のうちで、低分化型神経内分泌癌（小細胞
肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のサブセットが含まれる）は、予後
不良を示す癌タイプである。ＳＣＬＣが気管支原性であり、肺神経内分泌細胞から一部生
じると仮定されている（Ｇａｌｌｕｚｚｏ ａｎｄ Ｂｏｃｃｈｅｔｔａ，２０１１）。
神経内分泌表現型を有するこれらの各腫瘍の特異的な細胞供給源は何でも、Ｎｏｔｃｈ経
路遺伝子自体の直接的病変またはＮｏｔｃｈシグナル伝達を抑制する他の遺伝子の活性化
のいずれかによるＮｏｔｃｈシグナル伝達の抑制により、これらの腫瘍の神経内分泌表現
型を獲得し得ると予想することができる。拡大解釈すれば、Ｎｏｔｃｈ経路を撹乱させる
遺伝子は、神経内分泌表現型を有する腫瘍の処置、特に現在臨床成績が思わしくない適応
症の治療標的を提供することができる。
ＡＳＣＬ１は、ＤＬＬ３を介してＮｏｔｃｈシグナル伝達経路と相互作用すると考えら
れる遺伝子の１つである。多数の神経内分泌腫瘍が低分化型（すなわち、部分的に完全な
）内分泌表現型（例えば、種々の内分泌タンパク質およびポリペプチド（例えば、クロモ
グラニンＡ、ＣＨＧＡ；カルシトニン、ＣＡＬＣＡ；プロピオメラノコリン、ＰＯＭＣ；
ソマトスタチン、ＳＳＴ）、分泌小胞に関連するタンパク質（例えば、シナプトフィシン
、ＳＹＰ）、および生理活性アミン合成を担う生化学的経路に関与する遺伝子（例えば、
ドパデカルボキシラーゼ、ＤＤＣ））の顕著な上昇または発現を示すことが明らかである
。おそらく驚くことではないが、これらの腫瘍は、ＡＳＣＬ１（マウスにおけるｍＡＳＨ
１またはヒトにおけるｈＡＳＨ１としても公知）（遺伝子カスケードを調整して神経表現
型および神経内分泌表現型を生成する役割を果たすことが公知の転写因子）を頻繁に過剰
発現する。カスケードの特異的な分子の詳細は依然として明確に定義されていないが、一
定の細胞型、特に、甲状腺傍濾胞細胞（Ｋａｍｅｄａら，２００７）、副腎髄質のクロム
親和性細胞（Ｈｕｂｅｒら，２００２）、および肺の広範性神経内分泌系で見出される細
胞（Ｃｈｅｎら，１９９７；Ｉｔｏら，２０００；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら，２００２
）について、ＡＳＣＬ１は、細胞運命の選択がＡＳＣＬ１媒介遺伝子発現カスケードおよ
びＮｏｔｃｈ媒介遺伝子発現カスケードのバランスによって媒介される細かく調整された
発生調節ループの一部であることが明らかになりつつある。例えば、ＡＳＣＬ１が正常な
マウス肺神経内分泌細胞で発現されることが見出された一方で、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達
エフェクターＨＥＳ１は肺非神経内分泌細胞で発現された（Ｉｔｏら，２０００）。これ
ら２つのカスケードは、微妙なバランスにあり、交差調節の可能性が認められつつある。
ＮｏｔｃｈエフェクターＨＥＳ１は、ＡＳＣＬ１発現を下方制御することが示されている
（Ｃｈｅｎら，１９９７；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら，２００２）。これらの結果は、Ｎ
ｏｔｃｈシグナル伝達が神経内分泌分化を抑制することができることを明確に証明してい
る。しかし、ＤＬＬ３プロモーターへのＡＳＣＬ１結合がＤＬＬ３発現を活性化すると証
明されており（Ｈｅｎｋｅら，２００９）、ＤＬＬ３がＮｏｔｃｈシグナル伝達を減弱す
ることが認められているので（Ｌａｄｉら，２００５）、神経内分泌表現型と非神経内分
泌表現型との間の細胞運命選択の遺伝子回路はつながっている。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が隣接細胞間のわずかな相違を増幅して多様な分化経路を有す
る組織ドメインに迅速に結合させるように進行する（例えば、上記の「側方抑制」）と思
われることを考慮すると、これらのデータをまとめると、細かく調整された発生調節ルー
プが神経内分泌表現型を有する癌において再度活性化され、調節不全になると示唆される
。細胞の内部膜区画内のＤＬＬ３の正常な存在（Ｇｅｆｆｅｒｓら，２００７）および細
胞内でのＮｏｔｃｈとのＤＬＬ３の推定される相互作用を考慮した場合にＤＬＬ３が抗体
治療薬の開発に適切な細胞表面標識を提供することは明白でない一方で、結果として得ら
れた神経内分泌腫瘍におけるＤＬＬ３発現の上昇は神経内分泌表現型（例えば、ＮＥＴお
よびｐＮＥＴ）を有する腫瘍のための固有の治療標的を提供することができる。実験系で
の膨大なタンパク質発現が細胞内の過剰発現細胞の誤った局在化を生じ得ることが一般に
認められている。したがって、腫瘍内のＤＬＬ３の過剰発現がいくつかのタンパク質を細
胞表面上に発現させ、それにより、開示の本発明のＡＤＣの標的を得ることができること
が妥当な仮説であるが、実験検証が無く依然として明白ではない。
ＩＩＩ．癌幹細胞
上記で示唆されるように、驚いたことに、異常なＤＬＬ３発現（遺伝子型および／また
は表現型）が種々の腫瘍形成性細胞亜集団に関連することが発見された。これに関して、
本発明は、かかる細胞（例えば、癌幹細胞）を標的化し、それにより、新生物障害の処置
、管理、または防止を容易にするのに特に有用であり得るＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲー
トを提供する。したがって、好ましい実施形態では、開示のＤＬＬ３ ＡＤＣを、本教示
にしたがって腫瘍開始細胞頻度を低下させ、それにより、増殖性障害の処置または管理を
容易にするために有利に使用することができる。
本出願の目的のために、用語「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣ）は、「腫瘍持続細胞」（ＴＰ
Ｃ；すなわち、癌幹細胞またはＣＳＣ）および抗増殖性「腫瘍前駆細胞」（ＴＰｒｏｇと
命名）の両方（これらは共に、一般に、大部分の腫瘍または腫瘍塊の固有の亜集団（すな
わち、０．１〜４０％）を含む）を含む。本開示の目的のために、用語「腫瘍持続細胞」
および「癌幹細胞」または「新生物幹細胞」は等価であり、本明細書中で交換可能に使用
することができる。ＴＰＣが腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再利用することが
でき、少数の単離細胞の連続移植（マウスによって２回以上継代）によって証明されるよ
うに自己複製能力が無制限であるという点でＴＰＣはＴＰｒｏｇと異なるのに対して、Ｔ
Ｐｒｏｇは無制限の自己複製能力を示さないであろう。
当業者は、適切な細胞表面マーカーを使用した蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が単一
細胞と細胞凝集塊（すなわち、二個組など）とを区別する能力に一部起因して高度に富化
した癌幹細胞亜集団（例えば、純度９９．５％超）を単離するための信頼できる方法であ
ると認識するであろう。かかる技術を使用して、少数の高度に精製したＴＰｒｏｇ細胞を
免疫無防備状態のマウスに移植した場合、これらの細胞が初回移植片中で腫瘍成長を促進
することができることが示されている。しかし、精製ＴＰＣ亜集団と異なり、ＴＰｒｏｇ
によって生成された腫瘍は、表現型細胞の不均一性において親腫瘍を完全に反映せず、そ
の後の移植片における連続腫瘍発生の再開において明確に非効率である。対照的に、癌幹
細胞亜集団は、親腫瘍の細胞不均一性を完全に再構成し、連続的に単離および移植した場
合に効率的に腫瘍形成を開始することができる。したがって、当業者は、ＴＰＣとＴＰｒ
ｏｇとの間の決定的な差は、これらの両方が初回移植片で腫瘍を生成することができるが
、少数の細胞の連続移植の際に不均一な腫瘍成長を恒久的に促進することができるＴＰＣ
固有の能力であると認識するであろう。ＴＰＣを特徴付けるための他の一般的アプローチ
は、形態学ならびに細胞表面マーカー、転写プロフィール、および薬物応答の試験を含む
が、マーカー発現は培養条件およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞株継代によって変化し得る
。
したがって、本発明の目的のために、腫瘍持続細胞は、正常組織において細胞ヒエラル
キーを支持する正常な幹細胞と同様に、好ましくは、多系列分化能力を維持しながら、不
確定に自己複製する能力によって定義される。したがって、腫瘍永続細胞は、腫瘍形成性
の子孫（すなわち、腫瘍開始細胞：ＴＰＣおよびＴＰｒｏｇ）および非腫瘍形成性（ＮＴ
Ｇ）の子孫の両方を生成することができる。本明細書中で使用する場合、「非腫瘍形成性
細胞」（ＮＴＧ）は、腫瘍開始細胞から生じる腫瘍細胞であるが、この細胞自体が腫瘍を
含む腫瘍細胞の異種系列を自己複製または生成する能力を持たない腫瘍細胞をいう。実験
的に、ＮＴＧ細胞は、過剰な細胞数を移植した場合でさえもマウスにおいて腫瘍を再現可
能に形成することができない。
示すように、ＴＰｒｏｇはまた、マウスにおける腫瘍生成能力が制限されているために
腫瘍開始細胞（またはＴＩＣ）に分類される。ＴＰｒｏｇはＴＰＣの子孫であり、典型的
には、限られた回数の細胞分裂の非自己複製が可能である。さらに、ＴＰｒｏｇ細胞を、
初期腫瘍前駆細胞（ＥＴＰ）および後期腫瘍前駆細胞（ＬＴＰ）にさらに分類することが
でき、これらはそれぞれ表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞構造の再活
用能力の相違によって区別することができる。かかる技術上の相違にもかかわらず、ＥＴ
ＰおよびＬＴＰの両方は、これらが一般に少数の細胞を移植した場合に腫瘍を連続的に再
構成する能力が低く、典型的には親腫瘍の不均一性を反映しないという点で、ＴＰＣと機
能的に異なる。前述の差異にもかかわらず、種々のＴＰｒｏｇ集団が、稀に、通常は幹細
胞に帰する自己複製能力を獲得し、ＴＰｒｏｇ集団自体がＴＰＣ（またはＣＳＣ）になる
ことができることも示されている。いずれにしても、両方の腫瘍開始細胞型は、単一の患
者の典型的な腫瘍塊内に存在し、本明細書中に開示のモジュレーターを使用した処置に供
される可能性が高い。すなわち、開示の組成物は、一般に、特定の実施形態または腫瘍中
に示される混合物と無関係に、かかるＤＬＬ３陽性腫瘍開始細胞の頻度を低下させるか化
学受容性を変化させる場合に有効である。
本発明の文脈では、ＴＰＣは、腫瘍の大部分を含むＴＰｒｏｇ（ＥＴＰおよびＬＴＰの
両方）、ＮＴＧ細胞、および腫瘍浸潤性非ＴＰＣ由来細胞（例えば、線維芽細胞／間質細
胞、内皮細胞、および造血細胞）より腫瘍形成性が高く、比較的静止性が高く、しばしば
、化学耐性が高い。従来の治療およびレジメンの大部分が腫瘍の減量および急速に増殖す
る細胞の攻撃の両方のためにデザインされていることを考慮して、ＴＰＣは、より迅速に
増殖するＴＰｒｏｇおよび他の大量の腫瘍細胞集団よりも従来の治療およびレジメンに対
する耐性が高い可能性が高い。さらに、ＴＰＣは、しばしば、従来の治療に対する化学耐
性を比較的高くする他の特徴（多剤耐性輸送体発現の増加、ＤＮＡ修復機構の増強、およ
び抗アポトーシスタンパク質など）を発現する。それぞれがＴＰＣによる薬物耐性に寄与
するこれらの性質は、新形成が進行期のほとんどの患者が確実に長期間の効果を得るため
の標準的な腫瘍治療レジメンの失敗（すなわち、継続的な腫瘍の成長および再発を促進す
る細胞（すなわち、ＴＰＣまたはＣＳＣ）を適切に標的化および根絶できないこと）の主
な理由である。
多数の先行技術の処置と異なり、本発明の新規の抗体薬物コンジュゲートは、好ましく
は、ＡＤＣの被験体への投与の際に腫瘍開始細胞の頻度を低下させる。上で述べたように
、腫瘍開始細胞頻度は、ａ）腫瘍開始細胞の排除、枯渇、感作、サイレンシング、または
阻害；ｂ）腫瘍開始細胞の成長、拡大、または再発の制御；ｃ）腫瘍開始細胞の開始、増
大、維持、増殖の妨害；またはｄ）そうでなければ、腫瘍形成性細胞の生存、再生、およ
び／または転移の阻止の結果として低下し得る。いくつかの実施形態では、腫瘍開始細胞
の頻度は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として低下する。腫瘍開始細胞の減少も
しくは排除またはその潜在能力（例えば、分化の誘導、ニッチ破壊）の改変、そうでなけ
れば腫瘍環境または他の細胞の影響力の妨害のいずれかによる経路の変化により、腫瘍発
生、腫瘍の維持および／または転移ならびに再発の阻害によってＤＬＬ３関連障害をより
有効に処置可能である。
当該分野で認識されている方法のうちでかかる腫瘍開始細胞頻度の低下を評価するため
に使用することができる方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの限界希釈分
析、好ましくはその後のポアソン分布統計学を使用した計数またはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍
の生成能力の有無などの所定の最終的な事象の頻度の評価である。かかる限界希釈分析が
腫瘍開始細胞頻度の低下の好ましい計算方法を含む一方で、精度がわずかに低下するが、
他の負担がより少ない方法を使用して所望の値を有効に決定することもでき、この方法は
、本明細書中の教示と完全に適合する。したがって、当業者に認識されるように、周知の
フローサイトメトリー手段または免疫組織学的手段によって頻度値の低下を決定すること
も可能である。全ての前述の方法に関して、例えば、Ｄｙｌｌａら ２００８，ＰＭＩＤ
：１８５６０５９４ ＆ Ｈｏｅｙら ２００９，ＰＭＩＤ：１９６６４９９１（それぞ
れ、その全体、特に開示の方法について、本明細書中で参考として援用される）を参照の
こと。
限界希釈分析に関して、分画または非分画のヒト腫瘍細胞（例えば、それぞれ、処置腫
瘍および未処置腫瘍由来）のいずれかをコロニー形成を促進するｉｎ ｖｉｔｒｏ成長条
件に置くことによって腫瘍開始細胞頻度をｉｎ ｖｉｔｒｏで計数することができる。こ
の様式では、コロニーの簡潔なカウントおよび特徴付け、または例えば、ヒト腫瘍細胞の
系列希釈でのプレートへの沈着およびプレーティングから少なくとも１０日後のコロニー
形成についての陽性または陰性の各ウェルのスコアリングからなる分析によってコロニー
形成細胞を計数することができる。腫瘍開始細胞頻度の決定能力が一般により正確なｉｎ
ｖｉｖｏ限界希釈実験または分析は、未処置コントロールまたは処置集団のいずれか由
来のヒト腫瘍細胞を、例えば、系列希釈で免疫無防備状態のマウスに移植し、その後に移
植から少なくとも６０日後に腫瘍形成について陽性または陰性のいずれかとして各マウス
をスコアリングすることを含む。ポアソン分布統計学を陽性事象および陰性事象の既知の
頻度に適用し、それにより、陽性事象の定義を満たす事象（この場合、それぞれコロニー
形成または腫瘍形成）についての頻度を得ることによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏでの限界希釈分析による細胞頻度値を導くことが好ましい。
腫瘍開始細胞頻度を計算するために使用することができる本発明に適合する他の方法に
関して、最も一般的な方法は、定量フローサイトメトリー技術および免疫組織化学染色手
順を含む。直前に記載の限界希釈分析技術ほど正確ではないが、これらの手順は、あまり
大きな人手を要さず、比較的短い時間枠で妥当な値が得られる。したがって、当業者は、
腫瘍開始細胞を富化することが公知の当該分野で認識された細胞表面タンパク質に結合す
る１つ以上の抗体または試薬を使用したフローサイトメトリーでの細胞表面マーカープロ
フィールの決定を使用し（例えば、潜在的に適合するマーカーは、ＰＣＴ出願番号２０１
２／０３１２８０（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のとおりであ
る）、それにより、種々のサンプル由来のＴＩＣレベルを測定することができると認識さ
れるであろう。さらに別の適合可能な方法では、当業者は、これらの細胞を区別すると考
えられる細胞表面タンパク質に結合することができる１つ以上の抗体または試薬を使用し
た免疫組織化学によってｉｎ ｓｉｔｕ（例えば、細胞切片中）でのＴＩＣ頻度を計数す
ることができる。
多数のマーカー（またはその非存在）は、種々の癌幹細胞集団に関連しており、腫瘍細
胞亜集団を単離するか特徴づけるために使用されていると認識されるであろう。これに関
して、例示的な癌幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、
ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、
ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチ
ダーゼＭ、ＡＤＡＭ９、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２
５、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、
ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌ
ｔ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺ
Ｄ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮ
Ｔ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＩＬ１ＲＡＰ、Ｔ
ＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１
、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＳＬＣ１
Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、Ｅ
ＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡ
Ｐ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＭＣＰ、ＣＰ
Ｄ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣ
Ｙ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬ
ＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、Ｇ
ＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦ
Ｐ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３
８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ
１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９
ｂ、およびＣＤ４９ｆを含む。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら，２０１０，ＰＭＩＤ
：２０１８５３２９、米国特許第７，６３２，６７８号、ならびに米国特許出願公開第２
００７／０２９２４１４号、同第２００８／０１７５８７０号、同第２０１０／０２７５
２８０号、同第２０１０／０１６２４１６号、および同第２０１１／００２０２２１号（
それぞれ、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。前述の各マーカーを、本
発明の二重特異性抗体または多重特異性抗体の文脈で二次標的抗原として使用することも
できるとさらに認識されるであろう。
同様に、一定の腫瘍型の癌幹細胞に関連する細胞表面表現型の非限定的な例には、ＣＤ
４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３
８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋Ｃ
Ｄ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ
２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７
１＋、ＡＢＣＢ５＋、ならびに当該分野で公知の他の癌幹細胞表面表現型が含まれる。例
えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら，２０１０，前出、Ｖｉｓｖａｄｅｒら，２００８，Ｐ
ＭＩＤ：１８７８４６５８、および米国特許出願公開第２００８／０１３８３１３号（そ
れぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。当業者は、直前
に例示のマーカー表現型などのマーカー表現型を、ＴＩＣ細胞および／もしくはＴＰＣ細
胞またはさらなる分析のための細胞集団を特徴付けるか、単離するか、精製するか、富化
するための標準的なフローサイトメトリー分析および細胞選別技術と併せて使用すること
ができると認識するであろう。本発明に関して、分析される腫瘍標本が原発性の患者の腫
瘍標本または患者由来の非伝統的な異種移植片（ＮＴＸ）腫瘍であったかどうかと無関係
に、ＣＤ４６、ＣＤ３２４、および、任意選択的に、ＣＤ６６ｃが、多数のヒトの直腸結
腸（「ＣＲ」）、乳房（「ＢＲ」）、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺（ＳＣＬＣ）
、膵臓（「ＰＡ」）、黒色腫（「Ｍｅｌ」）、卵巣（「ＯＶ」）、および頭頸部癌（「Ｈ
Ｎ」）の腫瘍細胞の表面上に高度にまたは不均一に発現することが興味深い。
任意の上記で参照した方法および当該分野で公知の選択マーカーを使用して、次いで、
本明細書中の教示にしたがって開示のＤＬＬ３モジュレーター（細胞毒性薬にコンジュゲ
ートしたものが含まれる）によって提供されるＴＩＣ（またはＴＩＣ中のＴＰＣ）の頻度
の低下を定量することが可能である。いくつかの例では、本発明の化合物は、（排除、分
化の誘導、ニッチ破壊、サイレンシングなどが含まれる上記の種々の機構によって）ＴＩ
ＣまたはＴＰＣの頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはさらに３５％
低下させることができる。他の実施形態では、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度の低下は、およ
そ４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％であり得る。一定の実施形態
では、開示の化合物は、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、またはさらに９５％低下させることができる。勿論、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度
の任意の低下に対応して新形成の腫瘍形成能、存続、再発、および侵襲性が低下する可能
性が高いと認識されるであろう。
ＩＶ．細胞結合剤
１．抗体の構造
上記で示唆されるように、本発明の特に好ましい実施形態は、ＤＬＬ３タンパク質のイ
ソ型、および、任意選択的に、他のＤＬＬファミリーメンバーの１つ以上のドメインに優
先的に会合する抗体またはその免疫反応性フラグメントの形態の細胞結合剤を有する開示
のＤＬＬ３コンジュゲートを含む。これに関して、抗体ならびにそのバリアントおよび誘
導体（認められた命名法およびナンバリングシステムが含まれる）は、例えば、Ａｂｂａ
ｓら（２０１０），Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ（６ｔｈ Ｅｄ．），Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；またはＭｕｒ
ｐｈｅｙら（２０１１），Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（８ｔｈ
Ｅｄ．），Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに広範に記載されている。
「抗体」または「インタクトな抗体」は、典型的には、共有結合的ジスルフィド結合お
よび非共有結合的相互作用によって保持された２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）
のポリペプチド鎖を含むＹ形状の四量体タンパク質をいう。ヒト軽鎖は、可変ドメイン（
ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、この定常ドメインを、アミノ酸配列および遺
伝子座に基づいてκまたはλに容易に分類することができる。各重鎖は、１つの可変ドメ
イン（ＶＨ）および定常領域を含み、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの場合、ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、およびＣＨ３と呼ばれる３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは第４のドメ
インＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの各クラスでは、ＣＨ１およびＣ
Ｈ２ドメインは、可動性ヒンジ領域によって分離され、この可動性ヒンジ領域は、種々の
長さ（一般に、ＩｇＧ中に約１０〜約６０個のアミノ酸）のプロリンおよびシステインが
豊富なセグメントである。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、約１２個以上のアミ
ノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結し、重鎖は約１０個のさらなるアミノ酸の
「Ｄ」領域も有する。各抗体クラスは、対合したシステイン残基によって形成される鎖間
および鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」を広義で解釈することができ、抗体には、
ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化
抗体および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフティング抗体、ヒト抗体、組換え抗体、細胞内抗
体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合
成抗体（そのムテインおよびバリアントが含まれる）、免疫特異性抗体フラグメント（Ｆ
ｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）フラグメントなど）、一本鎖フラグメント（
例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）およびその誘導体（Ｆｃ融合物および他の修飾物
が含まれる）、ならびに任意の他の免疫反応性分子（ＤＬＬ３決定基と優先的に会合また
は結合する限り）が含まれる。さらに、文脈的制約によって別段に記述しない限り、本用
語は、全ての抗体クラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）
および全てのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、Ｉｇ
Ａ１、およびＩｇＡ２）をさらに含む。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインを
、典型的には、対応する小文字のギリシャ文字（それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμ）
で示す。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づ
いて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１
つに割り当てることができる。
選択された実施形態では、添付の実施例に示すように、ＣＬドメインはκＣＬドメイン
を含むことができる。他の実施形態では、ソース抗体は、λＣＬドメインを含むことがで
きる。全てのヒトＩｇＧ ＣＬドメインの配列が周知であるので、当業者は、本開示にし
たがってλ配列およびκ配列の両方を容易に分析することができ、適合可能な抗体構築物
を提供するためにこれらの配列を使用する。同様に、説明および証明のために、以下の考
察および添付の実施例は、主に、ＩｇＧ１（マウスまたはヒト）タイプ抗体を考慮するで
あろう。軽鎖定常領域と同様に、異なるアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ
）およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）
由来の重鎖定常ドメイン配列は当該分野で周知であり、特徴付けられている。したがって
、当業者は、任意のアイソタイプまたはサブクラスを含む抗ＤＬＬ３抗体を容易に活用す
ることができ、本明細書中に教示するようにそれぞれを開示のＰＢＤとコンジュゲートし
て本発明の抗体薬物コンジュゲートを提供することができる。
抗体の可変ドメインは、抗体によってアミノ酸組成に非常にばらつきがあり、このばら
つきは主に抗体の認識および結合を担う。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトなＩ
ｇＧ抗体が２つの結合部位を有する（すなわち、二価である）ように抗体結合部位を形成
する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、超可変領域、より一般的には、相補性決定領
域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域を含み、この領域は、フレームワーク領域
（ＦＲ）として公知の４つの低可変領域によってフレーム化および分離されている。ＶＨ
領域とＶＬ領域との間の非共有結合的な会合により、抗体の２つの抗原結合部位のうちの
１つを含むＦｖフラグメント（「可変フラグメント」に相当する）を形成する。遺伝子操
作によって得ることができるｓｃＦｖフラグメント（可変一本鎖フラグメントに相当する
）は、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域が単一のポリペプチド鎖に会合し、これらの領域が
ペプチドリンカーによって分離されている。
本明細書中で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域、およびＣ
ＤＲへの割り当ては、別段に記述しない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ
（５ｔｈ Ｅｄ．），ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅ
ｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４
２；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８７，ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９
８９，ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら，１９９６，ＰＭＩＤ：８８７
６６５０；またはＤｕｂｅｌ，Ｅｄ．（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａ
ｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．によって提供されたナンバリングスキームのうちの１つに
従い得る。Ａｂｙｓｉｓウェブサイトデータベース（下記）から得られたＫａｂａｔ、Ｃ
ｈｏｔｈｉａ、およびＭａｃＣａｌｌｕｍによって定義されたＣＤＲを含むアミノ酸残基
を、以下に記載する。
Figure 2019069983
抗体配列中の可変領域およびＣＤＲを、当該分野で開発された通則（上記の、例えば、
Ｋａｂａｔナンバリングシステムなど）に従うか、既知の可変領域のデータベースに対し
て配列を整列させることによって同定することができる。これらの領域の同定方法は、Ｋ
ｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００１およびＤｉｎａｒｅ
ｌｌｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２０００に記載
されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ
／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎ
ｇｌａｎｄによって維持されている）およびＲｅｔｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，３３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７１−Ｄ６７４（２００５）に記
載のｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイトに記載されており、これ
らからアクセスすることができる。好ましくは、配列を、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、および
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）由来の配列データをＰＤＢ由来の構造デ
ータと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して分析する。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ
．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ ｂｏｏｋ ｃｈａｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒ
ｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａ
ｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−３
５４０４１３５４７もウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓで利用可能である
）を参照のこと。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書中の教示にしたが
って使用することができるＣＤＲ同定のために開発された通則をさらに含む。他で示さな
い限り、本明細書中に記載の全ＣＤＲを、ＫａｂａｔのようなＡｂｙｓｉｓデータベース
ウェブサイトにしたがって誘導する。
本発明で考察される重鎖定常領域のアミノ酸の位置について、ナンバリングは、報告に
よれば最初にヒトＩｇＧ１の配列が決定された骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記
載しているＥｄｅｌｍａｎら，１９６９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ６３（１）：７８−８５に最初に記載されたＥｕインデックスに従う。Ｅｄｅｌｍａ
ｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら，１９９１（前出）にも記載されている。したが
って、重鎖の文脈での用語「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」または「Ｋａｂａｔ
のＥＵインデックス」は、Ｋａｂａｔら，１９９１（前出）に記載のＥｄｅｌｍａｎらの
ヒトＩｇＧ１ Ｅｕ抗体に基づいた残基ナンバリングシステムをいう。軽鎖定常領域のア
ミノ酸配列のために使用されるナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔら，１９９１に同様
に記載されている。本発明に適合する例示的なκＣＬおよびＩｇＧ１重鎖定常領域のアミ
ノ酸配列は、添付の配列表中の配列番号５および６として記載している。当業者は、標準
的な分子生物学技術を使用して開示の定常領域の配列を開示の重鎖可変領域および軽鎖可
変領域と連結して本発明のＤＬＬ３コンジュゲートに組み込むことができる全長抗体を得
ることができると認識するであろう。
本発明の抗体または免疫グロブリンは、任意のＤＬＬ３決定基を特異的に認識するかこ
れと会合する任意の抗体を含むかこの抗体に由来し得る。本明細書中で使用される場合、
「決定基」または「標的」は、特定の細胞、細胞集団、または組織と同定可能に会合する
か、特定の細胞、細胞集団、または組織中または特定の細胞、細胞集団、または組織上に
特異的に見出される任意の検出可能な形質、性質、マーカー、または因子を意味する。決
定基または標的は、形態学的、機能的、または生化学的な性質を示すことができ、好まし
くは、表現型の性質を示す。一定の好ましい実施形態では、決定基は、特異的細胞型また
は一定の条件下での細胞（例えば、細胞周期の特定の時点の細胞または特定のニッチ中の
細胞）によって異なって発現される（過剰発現または過小発現される）タンパク質である
。本発明の目的のために、決定基は、好ましくは、異常な癌細胞上で異なって発現し、Ｄ
ＬＬ３タンパク質、またはその任意のスプライスバリアント、イソ型、もしくはファミリ
ーメンバー、その特異的なドメイン、領域、もしくはエピトープのいずれかを含むことが
できる。「抗原」、「免疫原性決定基」、「抗原決定基」、または「免疫原」は、免疫適
格動物に導入した場合に免疫応答を刺激することができ、且つ動物の免疫応答から産生さ
れた抗体によって認識される任意のタンパク質（ＤＬＬ３が含まれる）またはその任意の
フラグメント、領域、ドメイン、もしくはエピトープを意味する。本明細書中で意図され
る決定基の有無を使用して、細胞、細胞亜集団、または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性
細胞、またはＣＳＣ）を同定することができる。
以下の実施例に記載するように、本発明の選択された実施形態は、「ソース」抗体と見
なすことができるＤＬＬ３に免疫特異的に結合するマウス抗体を含む。他の実施形態では
、本発明によって意図される抗体を、ソース抗体の定常領域またはエピトープ結合アミノ
酸配列の任意選択的な改変によってかかる「ソース」抗体から誘導することができる。１
つの実施形態では、ソース抗体中の選択されたアミノ酸が欠失、変異、置換、取り込み、
または組み合わせによって変化する場合、抗体はソース抗体から「誘導」される。別の実
施形態では、「誘導」抗体は、ソース抗体のフラグメント（例えば、１つ以上のＣＤＲま
たは全可変領域）を、アクセプター抗体配列と組み合わせるかアクセプター抗体配列に組
み込んで誘導抗体（例えば、キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体、またはヒト化抗体
）が得られる抗体である。これらの「誘導」（例えば、ヒト化またはＣＤＲグラフティン
グ）抗体を、種々の理由（例えば、決定基との親和性を改善するため；細胞培養物中での
産生および収量を改善するため；ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性を低下させるため；毒性を
低下させるため；活性部分のコンジュゲートを容易にするため；または多重特異性抗体を
作製するためなど）のための標準的な分子生物学技術を使用して生成することができる。
かかる抗体を、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の改変（例えば、グリコシル
化パターンまたはペグ化）によってソース抗体から誘導することもできる。
本発明の文脈では、本教示に従って図３Ａまたは図３Ｂに記載のマウス可変領域のアミ
ノ酸配列から誘導された任意の開示の軽鎖および重鎖ＣＤＲをアクセプター抗体と組み合
わせるか再編成して最適化した抗ヒトＤＬＬ３（例えば、ヒト化またはキメラ抗ｈＤＬＬ
３）抗体を得ることができると認識されるであろう。すなわち、図３Ａに記載の連続した
軽鎖可変領域のアミノ酸配列または図３Ｂに記載の連続した重鎖可変領域のアミノ酸配列
（合わせて配列番号２１〜３８７、奇数番号）から誘導されたか得た１つ以上のＣＤＲを
、ＤＬＬ３モジュレーター、特に好ましい実施形態では、１つ以上のＤＬＬ３イソ型と免
疫特異的に会合するＣＤＲグラフティング抗体またはヒト化抗体に組み込むことができる
。かかるヒト化モジュレーターの「誘導された」軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミ
ノ酸配列の例を、図３Ａおよび３Ｂ（配列番号３８９〜４０７、奇数番号）にも記載して
いる。
図３Ａおよび３Ｂでは、注釈付きのＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を、専売のＡ
ｂｙｓｉｓデータベースを使用したＫａｂａｔにより定義している。しかし、本明細書中
で考察するように、当業者は、図３Ａまたは図３Ｂに記載の各重鎖および軽鎖の配列につ
いてＫａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａら、またはＭａｃＣａｌｌｕｍらによって定義のＣＤ
Ｒを容易に定義、同定、誘導、および／または計数することができる。したがって、全て
のかかる命名法によって定義される本発明のＣＤＲおよびＣＤＲを含む抗体のそれぞれは
、本発明の範囲内に明確に含まれる。より広義には、用語「可変領域ＣＤＲのアミノ酸残
基」またはより簡潔に「ＣＤＲ」には、上記の任意の配列または構造ベースの方法を使用
して定義されたＣＤＲ中のアミノ酸が含まれる。この文脈内で、図３Ａおよび３Ｂ中の例
示的なヒト化抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲを、配列番号４０８〜４３７として添付の配列表
に提供する。
さらに他の実施形態では、適合性ＤＬＬ３抗体は、本明細書中に記載の例示的な抗体（
ヒト化抗体およびマウス抗体の両方）のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖可
変領域および軽鎖可変領域を含み、前記抗体は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体の所望の機能的
特性を保持する。
例えば、適合性ＤＬＬ３抗体は、抗体または軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する
その免疫反応性フラグメントを含むことができ、ここで、前記軽鎖可変領域は、配列番号
２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列
番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、
配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８
９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、
配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、
配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、
配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、
配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、
配列番号１９３、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、
配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、
配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号２４５、配列番号２４９、
配列番号２５３、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、
配列番号２７３、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号２８９、
配列番号２９３、配列番号２９７、配列番号３０１、配列番号３０５、配列番号３０９、
配列番号３１３、配列番号３１７、配列番号３２１、配列番号３２５、配列番号３２９、
配列番号３３３、配列番号３３７、配列番号３４１、配列番号３４５、配列番号３４９、
配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３６１、配列番号３６５、配列番号３６９、
配列番号３７３、配列番号３７７、配列番号３８１、および配列番号３８５からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変
領域は、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配
列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３
、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号
８７、配列番号９１、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、
配列番号１１１、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、
配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、
配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、
配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８７、
配列番号１９１、配列番号１９５、配列番号１９９、配列番号２０３、配列番号２０７、
配列番号２１１、配列番号２１５、配列番号２１９、配列番号２２３、配列番号２２７、
配列番号２３１、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４７、
配列番号２５１、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６７、
配列番号２７１、配列番号２７５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、
配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３０７、
配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２７、
配列番号３３１、配列番号３３５、配列番号３３９、配列番号３４３、配列番号３４７、
配列番号３５１、配列番号３５５、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、
配列番号３７１、配列番号３７５、配列番号３７９、配列番号３８３、および配列番号３
８７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含
む。
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、上記配列と６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％相同であり得る。上記の配列のＶ
Ｈ領域およびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％またはそれを超える）相同性を有するＶ
Ｈ領域およびＶＬ領域を有する抗体を、標準的な分子生物学技術を使用して得るか誘導す
ることができる。例えば、以下の表４に示すように、マウスソース抗体から実施例４に記
載のように誘導したヒト化抗体は、ソース抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とおよ
そ７５％〜８５％相同な重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むであろう。
本明細書中で使用するように、２アミノ酸配列間の相同性は、２配列間の同一性と等価
である。２配列間の同一性は、２配列の至適なアラインメントのために導入する必要があ
るギャップ数および各ギャップの長さを考慮した配列が共有する同一の位置の数の関数で
ある（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および
２配列間の同一性の決定を、以下の非限定的な実施例に記載の数学アルゴリズムを使用し
て行うことができる。
２アミノ酸配列間の同一性を、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、
およびギャップペナルティ４を使用したＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組
み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂ
ｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することが
できる。さらに、２アミノ酸配列間の同一性を、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２
５０行列のいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、また
は４、およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を使用したＧＣＧソフトウ
ェア・パッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込
んだＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４
−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定することができる。
さらにまたはあるいは、本発明のタンパク質配列を、「問い合わせ配列」としてさらに
使用して公的データベースに対して検索し、例えば、関連配列を同定することができる。
かかる検索を、Ａｌｔｓｃｈｕｌら．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０
３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。
ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るためのＸＢ
ＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて行うことができる。比較の
ためのギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のように
Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐ
ｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴお
よびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
２．抗体の生成
ａ．ポリクローナル抗体
種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれる）内でのポリクローナル抗体
の産生は、当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗ＤＬＬ３
抗体含有血清を、動物から採血するか動物を屠殺することによって得る。血清を、動物か
ら得た形態で研究目的で使用することができるか、あるいは、抗ＤＬＬ３抗体を部分的ま
たは完全に精製して免疫グロブリン画分または相同な抗体調製物を得ることができる。
簡潔に述べれば、選択された動物を、例えば、選択されたイソ型、ドメイン、および／
またはペプチド、またはＤＬＬ３もしくはその免疫反応性フラグメントを発現する生細胞
もしくは細胞調製物を含むことができるＤＬＬ３免疫原（例えば、可溶性ＤＬＬ３または
ｓＤＬＬ３）で免疫する。接種した種に応じて免疫学的応答を増大させるために使用する
ことができる当該分野で公知のアジュバントには、フロイントアジュバント（完全および
不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウムなど）、界面活性物質（リゾレシチンなど
）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（ＢＣＧ
（カルメット・ゲラン桿菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなど
）が含まれるが、これらに限定されない。かかるアジュバントは、局所沈着物中に抗原を
隔離することによって抗原の急激な拡散を防止することができるか、宿主がマクロファー
ジに走化性を示す因子および免疫系の他の成分を分泌するように刺激する物質を含むこと
ができる。好ましくは、免疫スケジュールは、所定の時間にわたって拡大した選択された
免疫原の２回以上の投与を含むであろう。
図１に示すＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸配列を、抗体を生成するためのＤＬＬ３タン
パク質の特異的領域を選択するために分析することができる。例えば、ＤＬＬ３アミノ酸
配列の疎水性および親水性の分析を、ＤＬＬ３構造中の親水性領域を同定するために使用
する。免疫原性構造を示すＤＬＬ３タンパク質の領域ならびに他の領域およびドメインを
、当該分野で公知の種々の他の方法（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒ
ｏｂｓｏｎ分析、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ分析、Ｋａｒ
ｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ分析、またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析など）を使用して
容易に同定することができる。平均可動性プロフィールを、Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，
Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して作成することができる。βターンプロフ
ィールを、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を使用して作成することができる。したが
って、これらのプログラムまたは方法のいずれかによって同定されたＤＬＬ３領域、ドメ
イン、またはモチーフのそれぞれは本発明の範囲内であり、免疫原が得られるように単離
または操作して所望の性質を含むモジュレーターを得ることができる。ＤＬＬ３抗体の好
ましい生成方法を、本明細書中に提供した実施例によってさらに例示する。免疫原として
使用するためのタンパク質またはポリペプチドの調製方法は当該分野で周知である。タン
パク質のキャリア（ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他のキャリアタンパク質など）との免疫原性
コンジュゲートの調製方法も当該分野で周知である。いくつかの環境では、例えば、カル
ボジイミド試薬を使用した直接コンジュゲート化を使用し、他の例では、連結剤が有効で
ある。ＤＬＬ３免疫原を、しばしば、当該分野で理解されるように、適切な期間にわたる
適切なアジュバントを使用した注射によって投与する。免疫スケジュール中、以下の実施
例に記載のように抗体力価を得て抗体形成の妥当性を決定することができる。
ｂ．モノクローナル抗体
さらに、本発明は、モノクローナル抗体の使用を意図する。当該分野で公知のように、
用語「モノクローナル抗体」（またはｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団（すなわち
、集団を含む各抗体が可能性のある変異（例えば、天然に存在する変異）を除いて同一で
あり、この変異を少量で含み得る）から得た抗体をいう。一定の実施形態では、かかるモ
ノクローナル抗体には、抗原に結合するか抗原と会合するポリペプチド配列を含む抗体が
含まれ、ここで、前記抗原結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一
の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。
より一般的には、本明細書中の実施例に記載のように、モノクローナル抗体を、当該分
野で公知の広範な種々の技術（ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ
技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））、またはそ
のいくつかの組み合わせが含まれる）を使用して調製することができる。例えば、モノク
ローナル抗体を、ハイブリドーマ技術ならびに当該分野で認識された生化学的技術および
遺伝子操作技術（Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１ｓｔ ｅｄ．２００９；Ｓｈｉｒｅら（ｅｄ
ｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ，１ｓｔ ｅｄ．２０１０
；Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ
ｅｄ．１９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用され
る）により詳細に記載の技術など）を使用して産生することができる。選択された結合配
列を、例えば、標的に対する親和性を改善すること、標的結合配列をヒト化すること、細
胞培養物中でのその産生を改善すること、ｉｎ ｖｉｖｏでのその免疫原性を低下させる
こと、多重特異性抗体を作製することなどのためにさらに変更することができ、変更され
た標的結合配列を含む抗体も本発明の抗体であると理解すべきである。
ｃ．キメラ抗体およびヒト化抗体
別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の少なくとも２つの異なる種またはクラス由
来の共有結合的に連結されたタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含むこと
ができる。用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導さ
れたか特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である
か類似する一方で、鎖の残部が別の種から誘導されたか別の抗体のクラスまたはサブクラ
スに属する抗体およびかかる抗体のフラグメント中の対応する配列と同一であるか類似す
る構築物に関する（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，
ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。
１つの実施形態では、キメラ抗体は、マウスＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列およびヒト
供給源から誘導された定常領域を含むことができる（例えば、下記のヒト化抗体）。いく
つかの実施形態では、抗体は、「ＣＤＲグラフティング」抗体であり得、ここで、前記抗
体は、特定の種に由来するか特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する１つ以上のＣ
ＤＲを含む一方で、抗体鎖の残部が別の種から誘導されたか別の抗体のクラスまたはサブ
クラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか類似する。ヒトでの使用のために、
選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）を、ヒト抗体にグラフティングし、
１つ以上の天然に存在するヒト抗体のＣＤＲを置換することができる。これらの構築物は
、一般に、完全な強度の抗体機能（例えば、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体
依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が得られる一方で、被験体の抗体に対する望ま
しくない免疫応答が低下するという利点がある。
ＣＤＲグラフティング抗体に類似の抗体は、「ヒト化」抗体である。本明細書中で使用
する場合、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、１つ以上の非ヒト免疫グ
ロブリンから誘導されたアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。１つの実施形態では、ヒ
ト化抗体は、レシピエントの１つ以上のＣＤＲ由来の残基が非ヒト種（ドナー抗体）（マ
ウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類など）の１つ以上のＣＤＲ由来の残基に置換
されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体またはアクセプター抗体）である。一定の
好ましい実施形態では、グラフティングされるＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補
助し、それにより親和性を改善するために、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン中の１つ
以上のＦＲ中の残基をドナー抗体由来の対応する非ヒト残基に置換する。これを、「復帰
変異」の導入ということができる。さらに、例えば、抗体の性能をさらに精巧にするため
に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見出されない残基を含むこと
ができる。
種々の供給源を使用して、どのヒト配列をヒト化抗体中で使用するのかを決定すること
ができる。かかる供給源には、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９
５）ＥＭＢＯ Ｊ １４：４６２８−４６３８；ｔｈｅ Ｖ−ＢＡＳＥ ｄｉｒｅｃｔｏ
ｒｙ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３３；６７
１−６７４，２００５）（ヒト免疫グロブリンの可変領域配列の包括的ディレクトリ（Ｔ
ｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって編集）を提供する）に開示のヒ
ト生殖系列配列；または例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載のコンセンサス
ヒトＦＲが含まれる。
ＣＤＲグラフティング抗体およびヒト化抗体は、例えば、米国特許第６，１８０，３７
０号および同第５，６９３，７６２号に記載されている。さらなる詳細については、例え
ば、Ｊｏｎｅｓら，１９８６，ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；ならびに米国特許第６，９
８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号を参照のこと。
別の方法を、例えば、米国特許出願公開第２００５／０００８６２５号に記載の「ヒュ
ーマニアリング」と命名する。別の実施形態では、非ヒト抗体を、ヒトＴ細胞エピトープ
の特異的欠失またはＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示の方法によ
る「脱免疫」によって改変することができる。
上記の選択された実施形態で考察するように、少なくとも６０％、６５％、７０％、７
５％、または８０％のヒト化抗体またはＣＤＲグラフティング抗体の重鎖可変領域または
軽鎖可変領域のアミノ酸残基は、レシピエントヒト配列のアミノ酸残基に対応するであろ
う。他の実施形態では、少なくとも８３％、８５％、８７％、または９０％のヒト化抗体
の可変領域残基は、レシピエントヒト配列の可変領域残基に対応するであろう。１つのさ
らに好ましい実施形態では、９５％を超える各ヒト化抗体の可変領域は、レシピエントヒ
ト配列の可変領域に対応するであろう。
ヒトアクセプターの可変領域に対するヒト化抗体の可変領域の配列同一性または配列相
同性を、前に考察のように決定することができ、このような方法で測定した場合、好まし
くは少なくとも６０％または６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７
５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性、さらに好ましく少なくとも９３％、
９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するであろう。好ましくは、同一でない
残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、あるア
ミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有
する別のアミノ酸残基に置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパ
ク質の機能的性質を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置
換によって相互に異なる場合、配列同一性または類似度を増大させるように調整して置換
の保存性を補正することができる。
ｄ．ヒト抗体
別の実施形態では、抗体は、完全なヒト抗体を含むことができる。用語「ヒト抗体」は
、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、そして
／または任意のヒト抗体作製技術を使用して作製された抗体をいう。
ヒト抗体を、当該分野で公知の種々の技術を使用して産生することができる。１つの技
術はファージディスプレイであり、これは、（好ましくは、ヒト）抗体のライブラリーを
ファージ上で合成し、このライブラリーを目的の抗原またはその抗体結合部分を使用して
スクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、このファージから免疫反応性フラ
グメントを得ることができる。かかるライブラリーを調製およびスクリーニングする方法
は当該分野で周知であり、ファージディスプレイライブラリーの生成キットは市販されて
いる（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）
。抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングで使用することができる他
の方法および試薬も存在する（例えば、米国特許第５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開番号
ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５
６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；および
Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７
９８２（１９９１）を参照のこと）。
１つの実施形態では、組換えヒト抗体を、上記のように調製した組換え組み合わせ抗体
ライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。１つの実施形態では、ラ
イブラリーは、Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡ
を使用して生成したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）によって産生された抗体の親和性
は中程度であり得るが（Ｋａは約１０６〜１０７Ｍ−１）、親和性成熟を、当該分野に記
載の二次ライブラリーからの構築および再選択によってｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣すること
もできる。例えば、エラープローンポリメラーゼの使用によってｉｎ ｖｉｔｒｏで無作
為に変異を導入することができる（Ｌｅｕｎｇら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５
（１９８９）に報告あり）。さらに、例えば、目的のＣＤＲにわたるランダム配列を保有
するプライマーを使用したＰＣＲを使用して選択された各Ｆｖクローン中の１つ以上のＣ
ＤＲを無作為に変異することおよび高親和性クローンをスクリーニングすることによって
親和性成熟を行うことができる。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子ライブラリーを作製
するための免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ中に変異誘発を誘導する方法を記載していた。別
の有効なアプローチは、ファージディスプレイによって選択したＶＨドメインまたはＶＬ
ドメインを非免疫ドナーから得た天然に存在するＶドメインバリアントのレパートリーと
組み合わせることおよび数ラウンドのＭａｒｋｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７
７９−７８３（１９９２）に記載の鎖再シャフリングにおいてより高い親和性についてス
クリーニングすることである。この技術により、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約
１０−９Ｍ以下の抗体および抗体フラグメントを産生可能である。
他の実施形態では、真核細胞の表面上に結合対を発現する真核細胞（例えば、酵母）を
含むライブラリーを使用した類似の手順を使用することができる。例えば、米国特許第７
，７００，３０２号および米国特許出願第１２／４０４，０５９号を参照のこと。１つの
実施形態では、ヒト抗体をファージライブラリーから選択し、このファージライブラリー
はヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１４：３０９−３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６１５７−６１６２（１９９８）。他の実施形態では、ヒト結
合対を、酵母などの真核細胞中で生成した組み合わせ抗体ライブラリーから単離すること
ができる。例えば、米国特許第７，７００，３０２号を参照のこと。かかる技術により、
多数の候補モジュレーターを有利にスクリーニング可能であり、（例えば、親和性成熟ま
たは組換えシャフリングによって）候補配列が比較的に容易に操作される。
ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、マウス
）に導入することによって作製することもでき、ここで、ヒト抗体は、内因性免疫グロブ
リン遺伝子が部分的または完全に不活化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されてい
る。チャレンジの際、ヒト抗体産生が認められ、遺伝子再編成、アセンブリ、および抗体
レパートリーが含まれるあらゆる点で、ヒトで見られる抗体産生に酷似している。このア
プローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第
５，６６１，０１６号；ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関する同第米国特許第６
，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ
Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５
）に記載されている。あるいは、ヒト抗体をヒトＢリンパ球の不死化によって調製して、
標的抗原に指向する抗体を産生することができる（かかるＢリンパ球を、新生物障害を罹
患している個体から回収することができるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫することができた
かもしれない）。例えば、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５
）；Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１）；
および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
３．抗体の組換え産生
抗体およびそのフラグメントを、抗体産生細胞から得た遺伝子材料および組換え技術を
使用して産生または改変することができる（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅ
ｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓ
ｅｌｌ（Ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），ＮＹ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎ
ｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２００６）；および米国特許第７，
７０９，６１１号を参照のこと）。
より詳細には、本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核
酸は、完全な細胞中、細胞ライセート中、部分精製された形態、または実質的に純粋な形
態で存在し得る。標準的な技術（アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマト
グラフィ、アガロースゲル電気泳動、および当該分野で周知の他の技術が含まれる）によ
って他の細胞成分または他の夾雑物（例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質）から精
製して除去した場合、核酸は、「単離されている」または「実質的に純粋にされている」
。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んで
いても含んでいなくても良い。より一般に、用語「核酸」には、本明細書中で使用する場
合、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその人為的バリアント（例えば、ペプチド
核酸）が含まれ、一本鎖または二本鎖のいずれかである。１つの好ましい実施形態では、
核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の核酸を、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドー
マ（例えば、以下にさらに記載のヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニッ
クマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドー
マによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲ増
幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ラ
イブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を使用）から得た抗体について、抗体を
コードする核酸をライブラリーから回収することができる。
一旦ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られる
と、これらのＤＮＡフラグメントを標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作して、
例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、またはｓｃＦ
ｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮ
Ａフラグメントを、別のタンパク質（抗体定常領域または可動性リンカーなど）をコード
する別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結する。用語「作動可能に連結された」は、
本文脈で使用される場合、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列
がインフレームを維持するように２つのＤＮＡフラグメントを連結することを意味するこ
とを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを、ＶＨコードＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ
２、およびＣＨ３）にコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長
重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域の遺伝子配列は当該分野で公知で
あり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａ
ｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照
のこと）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントを、標準的なＰＣＲ増幅によって得る
ことができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１または
ＩｇＧ４の定常領域である。以下でより詳細に考察されるように、本明細書中の教示に適
合する例示的なＩｇＧ１定常領域は、添付の配列表中の配列番号６として記載している。
Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみ
をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に
ＶＬコードＤＮＡを作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖
遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列は当該分野で公知であ
り（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照の
こと）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントを、標準的なＰＣＲ増幅によって得るこ
とができる。軽鎖定常領域はκ定常領域またはλ定常領域であり得るが、最も好ましくは
κ定常領域である。これに関して、例示的な適合するκ軽鎖定常領域は、添付の配列表中
の配列番号５として記載されている。
本発明はまた、プロモーター（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６
；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）；ならびに真核生物分泌経路の
他の転写調節エレメントおよびプロセシング調節エレメントに作動可能に連結することが
できるかかる上記の核酸を含むベクターを提供する。本発明はまた、これらのベクターお
よび宿主−発現系を保有する宿主細胞を提供する。
本明細書中で使用する場合、用語「宿主−発現系」には、本発明の核酸またはポリペプ
チドのいずれかおよび抗体を生成するために操作することができる任意の種類の細胞系が
含まれる。かかる宿主−発現系には、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミド
ＤＮＡで形質転換されたかトランスフェクトされた微生物（例えば、大腸菌またはＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；または哺乳動物細胞またはウイルスのゲノム由来のプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する
哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細
胞）が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞を、２つの発現ベクター（例えば、
重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコード
する第２のベクター）で同時トランスフェクトすることができる。
哺乳動物細胞を形質転換する方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第４，
３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第
４，９５９，４５５号を参照のこと。宿主細胞を、種々の特徴（例えば、ＧｎＴＩＩＩ活
性を有する改変されたグリコフォームまたはタンパク質）を有する抗原結合分子の産生が
可能なように操作することもできる。
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のために、安定な発現が好ましい。し
たがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株を、標準的な当該分野で認識された技
術を使用して操作することができ、これは本発明の一部を形成する。ウイルス複製起点を
含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現調節エレメント（例
えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化
部位など）によって調節されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換することができる。
当該分野で周知の任意の選択系を使用することができ、この選択系には、一定の条件下で
の発現の増強に効率的なアプローチを提供するグルタミンシンセターゼ遺伝子発現系（Ｇ
Ｓ系）が含まれる。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、欧州特許第０２５６０５５
号、欧州特許第０３２３９９７号、および欧州特許第０３３８８４１号、ならびに米国特
許第５，５９１，６３９号および同第５，８７９，９３６号に関連して全体または一部が
考察されている。安定な細胞株の開発のための別の好ましい発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（
商標）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
一旦本発明の抗体が組換え発現または任意の他の開示の技術によって産生されると、当
該分野で公知の方法によって抗体を精製または単離することができ、このことは、抗体を
同定し、その天然の環境から分離および／または回収し、抗体の診断的使用または治療的
使用の妨げとなるであろう夾雑物から分離することを意味する。単離された抗体には、組
換え細胞内でｉｎ ｓｉｔｕの抗体が含まれる。
これらの単離された調製物を、種々の当該分野で認識されている技術（例えば、イオン
交換クロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィ、透析、ダイアフィルトレーシ
ョン、およびアフィニティクロマトグラフィ、特にプロテインＡまたはプロテインＧのア
フィニティクロマトグラフィなど）を使用して精製することができる。
４．産生後選択
どのように得られたとしても、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニー
など）を、所望の特徴（例えば、力強い成長、高抗体産生、および目的の抗原に対する高
い親和性などの望ましい抗体の特徴が含まれる）について選択し、クローン化し、さらに
スクリーニングすることができる。ハイブリドーマを、細胞培養においてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで拡大するか、同系内の免疫低下動物においてｉｎ ｖｉｖｏで拡大することができる
。ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択、クローン化、および拡大する方法は、
当業者に周知である。一旦所望の抗体が同定されると、関連する遺伝子材料を、一般的な
当該分野で認識されている分子生物学および生化学的技術を使用して、単離、操作、およ
び発現することができる。
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）によって産生された抗体の親和性
は中程度であり得る（Ｋａは約１０６〜１０７Ｍ−１）。親和性を増大させるために、親
和性成熟を、抗体ライブラリーの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼの使用によ
るｉｎ ｖｉｔｒｏでの無作為変異の導入による）および二次ライブラリー（例えば、フ
ァージディスプレイまたは酵母ディスプレイの使用による）由来の抗原に高親和性を示す
抗体の再選択によってｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することができる。ＷＯ９６０７７５４に
は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ中に変異誘発を誘導して軽鎖遺伝子ライブラリーを作製
する方法が記載されている。
種々の技術を使用して抗体を選択することができ、この技術には、ヒトコンビナトリア
ル抗体またはｓｃＦｖフラグメントのライブラリーをファージまたは酵母上で合成し、こ
のライブラリーを目的の抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、抗原に結合す
るファージまたは酵母を単離し、これらから抗体または免疫反応性フラグメントを得るこ
とができるファージディスプレイまたは酵母ディスプレイが含まれるが、これらに限定さ
れない（Ｖａｕｇｈａｎら，１９９６，ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら，１
９９８，ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら，１９９７，ＰＭＩＤ：９１８１５７
８；Ｐｅｐｐｅｒら，２００８，ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージディスプレイ
または酵母ディスプレイの生成キットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリー
の生成およびスクリーニングで使用することができる他の方法および試薬も存在する（米
国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９
２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７
、ＷＯ９２／０９６９０；およびＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５
を参照のこと）。かかる技術により、多数の候補抗体を有利にスクリーニング可能であり
、（例えば、組換えシャフリングによって）配列が比較的容易に操作される。
５．抗体フラグメントおよび誘導体
ａ．フラグメント
本発明を実施するためにどのモジュレーターの形態（例えば、キメラ、ヒト化など）が
選択されるかと無関係に、これらの形態の免疫反応性フラグメントを本明細書中の教示に
したがって使用することができると認識されるであろう。「抗体フラグメント」は、イン
タクトな抗体の少なくとも一部を含む。本明細書中で使用する場合、抗体分子の「フラグ
メント」という用語には、抗体の抗原結合フラグメントが含まれ、用語「抗原結合フラグ
メント」は、選択された抗原またはその免疫原性決定基に免疫特異的に結合または反応す
るか、フラグメントが誘導されるインタクトな抗体が特異的抗原結合を競合する免疫グロ
ブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントをいう。
例示的なフラグメントには、以下が含まれる：ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２
フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイ
ン抗体フラグメント、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメント
から形成された多重特異性抗体。さらに、活性フラグメントは、抗原／基質または受容体
と相互作用し、インタクトな抗体に類似の様式で（おそらくいくらか低い効率で）抗原／
基質または受容体を改変する能力を保持する抗体の一部を含む。
他の実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆｃ領域を含み、インタクトな抗体中に存在
する場合に通常はＦｃ領域と関連する少なくとも１つの生物学的機能（ＦｃＲｎ結合、抗
体半減期の調整、ＡＤＣＣ機能、および補体結合など）を保持する抗体フラグメントであ
る。１つの実施形態では、抗体フラグメントは、インタクトな抗体と実質的に類似するｉ
ｎ ｖｉｖｏ半減期を有する一価抗体である。例えば、かかる抗体フラグメントは、フラ
グメントにｉｎ ｖｉｖｏ安定性を付与することができるＦｃ配列に連結した抗原結合ア
ームを含むことができる。
当業者に十分に認識されるように、フラグメントを、インタクトな抗体、完全抗体、も
しくは抗体鎖の化学的処置もしくは酵素的処置（パパインまたはペプシンなど）または組
換え手段によって得ることができる。抗体フラグメントのより詳細な説明については、例
えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒ
ａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照のこと。
ｂ．多価抗体
１つの実施形態では、本発明のモジュレーターは、一価または多価（例えば、二価、三
価など）であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「結合価」は、抗体と会合する潜
在的な標的結合部位の数をいう。各標的結合部位は、１つの標的分子または標的分子上の
特異的な位置もしくは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価の場合、分子の各結合部
位は、単一の抗原位置またはエピトープに特異的に結合するであろう。抗体が１つを超え
る標的結合部位を含む場合（多価）、各標的結合部位は、同一または異なる分子に特異的
に結合することができる（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、または同一抗原
上の異なるエピトープもしくは位置に結合することができる）。例えば、米国特許出願公
開第２００９／０１３０１０５号を参照のこと。いずれの場合にも、少なくとも１つの結
合部位は、ＤＬＬ３イソ型に関連したエピトープ、モチーフ、またはドメインを含むであ
ろう。
１つの実施形態では、モジュレーターは、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら，１９８３，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３０５：５３７−５３９に記載のように、２つの鎖が異なる特異性を有する二重特
異性抗体である。他の実施形態は、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体が
含まれる。他のより精巧な適合する三重特異性構築物およびその作製方法は、米国特許出
願公開第２００９／０１５５２５５号およびＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら，１
９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０；ならびにＷＯ
９６／２７０１１に記載されている。
上記で示唆されるように、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異
的に結合することができるか、標的分子および異種エピトープ（異種ポリペプチドまたは
固体支持体材料など）の両方に免疫特異的に結合することができる。抗ＤＬＬ３抗体の好
ましい実施形態が２つの抗原のみに結合し（すなわち、二重特異性抗体）、一方で、三重
特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体も本発明に含まれる。二重特異性抗体には
、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲ
ート中の１つの抗体を、アビジンにカップリングし、他の抗体をビオチンにカップリング
することができる。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞の望ましくない細胞への標的化（
米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の処置（ＷＯ９１／００３６０、Ｗ
Ｏ９２／２００３７３、および欧州特許第０３０８９号）が提案されている。ヘテロコン
ジュゲート抗体を、任意の従来の架橋法を使用して作製することができる。適切な架橋剤
は当該分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に
開示されている。
さらに他の実施形態では、所望の結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を有する抗
体可変ドメインを、当業者に周知の方法を使用して免疫グロブリン定常ドメイン配列（ヒ
ンジ領域、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリ
ン重鎖定常ドメインなど）に融合する。
ｃ．Ｆｃ領域の改変
上記の開示の抗体の可変領域または結合領域に対する種々の改変、置換、付加、または
欠失に加えて、当業者は、本発明の選択された実施形態が定常領域（すなわち、Ｆｃ領域
）の置換または改変も含むことができると認識するであろう。より詳細には、本発明のＤ
ＬＬ３モジュレーターが、とりわけ、好ましい特徴（薬物動態学の変化、血清半減期の増
加、結合親和性の増加、免疫原性の低下、産生の増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃリ
ガンド結合の変化、「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）または「ＣＤＣ」
（補体依存性細胞傷害性）活性の増大または減少、グリコシル化および／またはジスルフ
ィド結合の変化、ならびに結合親和性の改変が含まれるが、これらに限定されない）を有
する化合物が得られる１つ以上のさらなるアミノ酸残基の置換、変異、および／または改
変を含むことができることが意図される。これに関して、これらのＦｃバリアントを、開
示のモジュレーターの有効な抗新生物性を増強するために有利に使用することができると
認識されるであろう。
この目的を達成するために、本発明の一定の実施形態は、Ｆｃ領域の置換または改変（
例えば、強化されたか好ましいＦｃエフェクター機能を有する化合物を産生するための１
つ以上のアミノ酸残基の付加、置換、変異、および／または改変）を含むことができる。
例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩ
ＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎ）との間の相互作用に関与するアミノ酸残基の変
化により、細胞傷害性の増大および／または薬物動態学的の変化（血清半減期の増加など
）が起こり得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏ
ｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）（それぞれ、本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと）。
選択された実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加した抗体を、ＦｃドメインとＦ
ｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基の改変（例えば、置
換、欠失、または付加）によって生成することができる（例えば、国際公開番号ＷＯ９７
／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；米国特許第６，７３７，０５６号および米国特
許出願公開第２００３／０１９０３１１号を参照のこと）。かかる実施形態に関して、Ｆ
ｃバリアントにより、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日超、１０日超、１５日超
、好ましくは２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヶ月超
、３ヶ月超、４ヶ月超、または５ヶ月超の半減期を得ることができる。半減期の増加によ
り、より高い血清力価が得られ、したがって、抗体の投与頻度が減少し、そして／または
抗体の投与濃度が減少する。ｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲ
ｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期を、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランス
ジェニックマウスまたはトランスフェクトされたヒト細胞株または変異Ｆｃ領域を有する
ポリペプチドを投与した霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２
０７２は、ＦｃＲｎへの結合が改良されたか減少した抗体バリアントを記載している。例
えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２
００１）も参照のこと。
他の実施形態では、Ｆｃの変更により、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を増加または減
少させることができる。当該分野で公知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞
の溶解をいい、ＡＤＣＣは、一定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好
中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃＲ上に結合した分泌型Ｉｇがこれらの細
胞傷害性エフェクター細胞を抗原保有標的細胞に特異的に結合させ、その後に細胞毒素を
用いて標的細胞を死滅させることができる細胞傷害性の一形態をいう。本発明の文脈では
、親抗体もしくは非改変抗体または未変性配列ＦｃＲを含む抗体と比較して結合性が増大
または減少したＦｃＲ結合親和性が「変化した」抗体バリアントを提供する。結合性が低
下したかかるバリアントは、例えば、当該分野で周知の技術によって決定した場合に、結
合性がほとんどないか、特記するほどないかもしれない（例えば、未変性配列と比較して
ＦｃＲへの結合が０〜２０％）。他の実施形態では、バリアントは、未変性の免疫グロブ
リンＦｃドメインと比較して高い結合性を示すであろう。これらのＦｃバリアント型を、
開示の抗体の有効な抗新生物性を強化するために有利に使用することができると認識され
るであろう。さらに他の実施形態では、かかる変更により、結合親和性の増大、免疫原性
の低下、産生の増加、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化（例えば、コ
ンジュゲート部位について）、結合特異性の改変、食作用の増加；および／または細胞表
面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが起こる。
ｄ．グリコシル化の変更
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム（すなわち、（例えば、
Ｆｃドメイン中の）タンパク質に共有結合的に結合した変化したグリコシル化パターンま
たは変化した炭水化物組成を含むＤＬＬ３モジュレーター）を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌ
ｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４
０を参照のこと。操作されたグリコフォームは、種々の目的（エフェクター機能の強化ま
たは低下、標的に対するモジュレーターの親和性の増加、またはモジュレーター産生の促
進が含まれるが、これらに限定されない）に有用であり得る。エフェクター機能の低下が
望まれる一定の実施形態では、分子を、無グリコシル化形態を発現するように操作するこ
とができる。１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位が排除され、それに
よりその部位でのグリコシル化が排除され得る置換は周知である（例えば、米国特許第５
，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号を参照のこと）。逆に、１つ以上の
さらなるグリコシル化部位の操作によってＦｃ含有分子のエフェクター機能を強化するか
結合を改善することができる。
他の実施形態は、グリコシル化組成が変化したＦｃバリアント（フコシル残基の量が減
少した低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体など）
を含む。かかるグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが証
明されている。操作されたグリコフォームを、当業者に公知の任意の方法（例えば、操作
発現株またはバリアント発現株の使用、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））との同時発現、種々の生物または種
々の生物由来の細胞株中でのＦｃ領域を含む分子の発現、またはＦｃ領域を含む分子が発
現した後の炭水化物の改変（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２を参照のこと））によ
って生成することができる。
ｅ．さらなるプロセシング
モジュレーターを、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の
保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の分
子リガンドへの連結などによって産生中または産生後に差分的に修飾することができる。
多数の化学修飾のうちのいずれかを、公知の技術（臭化シアン、トリプシン、キモトリプ
シン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元
、ツニカマイシンの存在下での代謝合成による特異的な化学的切断などが含まれるが、こ
れらに限定されない）によって行うことができる。
本発明にも含まれる種々の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化
物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ結合
型またはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端
メチオニン残基の付加または欠失が含まれる。さらに、モジュレーターを、検出可能な標
識（酵素標識、蛍光標識、放射性標識、または親和性標識など）で修飾してモジュレータ
ーを検出および単離することも可能である。
６．抗体の特徴
モジュレーターがたとえどのようにして得られようが、または前述のどの形態を取ろう
が、開示のモジュレーターの種々の実施形態は一定の特徴を示し得る。選択された実施形
態では、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー）を、好ましい性質
（例えば、力強い成長、高モジュレーター産生、および、以下でより詳細に考察されるよ
うに、望ましいモジュレーターの特徴が含まれる）について選択、クローン化、およびさ
らにスクリーニングすることができる。他の場合、モジュレーターの特徴を、動物への接
種のための特定の抗原（例えば、特異的ＤＬＬ３イソ型）または標的抗原の免疫反応性フ
ラグメントの選択によって付与するか影響を及ぼすことができる。さらなる他の実施形態
では、選択されたモジュレーターを上記のように操作して、親和性または薬物動態学的な
どの免疫化学的特徴を強化または精巧にすることができる。
ａ．中和抗体
一定の実施形態では、コンジュゲートは、「中和」抗体またはその誘導体もしくはフラ
グメントを含むであろう。すなわち、本発明は、特異的なドメイン、モチーフ、またはエ
ピトープに結合し、ＤＬＬ３の生物学的活性を遮断、減少、または阻害することができる
抗体分子を含むことができる。より一般的には、用語「中和抗体」は、標的分子またはリ
ガンドと結合または相互作用し、標的分子の結合パートナー（受容体または基質など）へ
の結合または会合を防止し、それにより、分子の相互作用に起因する生物学的応答を阻止
する抗体をいう。
当該分野で公知の競合的結合アッセイを使用して抗体またはその免疫学的に機能的なフ
ラグメントもしくは誘導体の結合および特異性を評価することができると認識されるであ
ろう。本発明に関して、抗体またはフラグメントは、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体活性によ
るかｉｎ ｖｉｔｒｏ競合的結合アッセイにおいて測定した場合に過剰量の抗体が結合パ
ートナーのＤＬＬ３への結合量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％
、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれを超えて減少
させる場合に、結合パートナーまたは基質へのＤＬＬ３の結合を阻害または減少したとす
る。ＤＬＬ３に対する抗体の場合、例えば、中和抗体またはアンタゴニストは、好ましく
は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７
０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれを超えて変化させ
るであろう。この改変された活性を、当該分野で認識された技術を使用して直接測定する
ことができるか、変化した活性が下方制御された影響（例えば、腫瘍形成、細胞生存、ま
たはＮｏｔｃｈ応答遺伝子の活性化もしくは抑制）によって測定することができると認識
されるであろう。好ましくは、抗体がＤＬＬ３活性を中和する能力を、Ｎｏｔｃｈ受容体
へのＤＬＬ３結合の阻害または抗体がＮｏｔｃｈシグナル伝達のＤＬＬ３媒介抑制を軽減
する能力の評価によって評価する。
ｂ．内在化抗体
発現されたＤＬＬ３タンパク質のかなりの部分は腫瘍形成性細胞表面に会合したままで
あり、それにより、開示のモジュレーターが局在化および内在化されるという証拠がある
。好ましい実施形態では、かかるモジュレーターを、抗癌剤（内在化の際に細胞を死滅さ
せる細胞傷害性部分など）に会合またはコンジュゲートすることができる。特に好ましい
実施形態では、モジュレーターは、中和抗体薬物コンジュゲートを含むであろう。
本明細書中で使用する場合、「内在化する」モジュレーターは、会合した抗原または受
容体への結合の際に細胞によって（任意のペイロードと共に）取り込まれるモジュレータ
ーである。認識されるように、内在化モジュレーターは、好ましい実施形態では、抗体（
その抗体フラグメントおよび誘導体が含まれる）および抗体コンジュゲートを含むことが
できる。内在化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。治療に適用す
るために、内在化は、好ましくは、必要とする被験体にてｉｎ ｖｉｖｏで起こるであろ
う。抗体分子の内在化数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現癌幹細胞を死滅させるのに十
分または適切であり得る。抗体または抗体コンジュゲートの潜在性に依存して、いくつか
の例では、細胞内への単一の抗体分子の取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させ
るのに十分である。例えば、一定の毒素は非常に強力であるので、抗体にコンジュゲート
した少数の毒素分子の内在化で腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。哺乳動物細胞への
結合の際に抗体が内在化するかどうかを、当該分野で認識されている種々のアッセイ（下
記の実施例に記載のアッセイが含まれる）によって決定することができる。抗体が細胞内
に内在化するかどうかを検出する方法も、米国特許第７，６１９，０６８号（その全体が
本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
ｃ．枯渇抗体
他の実施形態では、抗体は、枯渇抗体またはその誘導体もしくはフラグメントを含むで
あろう。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上または細胞表面付近で抗原と結合ま
たは会合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、または細胞毒性薬の導入によって）細胞の死
滅または排除を誘導するか、促進するか、引き起こす抗体をいう。いくつかの実施形態で
は、選択された枯渇抗体は、細胞毒性薬に会合されるかコンジュゲートされるであろう。
好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団中の少なくとも２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の
ＤＬＬ３腫瘍形成性細胞を除去するか、無能化するか、排除するか、死滅させることがで
きるであろう。いくつかの実施形態では、細胞集団は、富化されたか、分割されたか、精
製されたか、単離された腫瘍持続細胞を含み得る。他の実施形態では、細胞集団は、全腫
瘍サンプルまたは腫瘍持続細胞を含む不均一な腫瘍抽出物を含み得る。当業者は、本明細
書中の教示に従って以下の実施例（例えば、実施例８〜１０）に記載の標準的な生化学技
術を使用して腫瘍形成性細胞または腫瘍持続細胞の枯渇をモニタリングおよび定量するこ
とができると認識するであろう。
ｄ．ビニングおよびエピトープマッピング
開示の抗ＤＬＬ３抗体のモジュレーターが選択された標的またはそのフラグメントによ
って提示された個別のエピトープまたは免疫原性決定基と会合するか結合するとさらに認
識されるであろう。一定の実施形態では、エピトープまたは免疫原性決定基には、アミノ
酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子基が含ま
れ、一定の実施形態では、特異的な三次元構造の特徴および／または特異的な電荷の特徴
を有し得る。したがって、本明細書中で使用する場合、用語「エピトープ」には、免疫グ
ロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるか、そうでなければ分子と
相互作用することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。一定の実施形態では、抗
体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物中でその標的抗原を優先的に認識す
る場合、抗体は、抗原と特異的に結合する（または免疫特異的に結合するか反応する）と
いう。好ましい実施形態では、平衡解離定数（ＫＤ）が１０−６Ｍ以下または１０−７Ｍ
以下である場合、より好ましくは、平衡解離定数が１０−８Ｍ以下である場合、さらによ
り好ましくは解離定数が１０−９Ｍ以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合するとい
う。
より直接的には、用語「エピトープ」は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定
の抗体モジュレーターによって認識されて特異的に結合することができる標的抗原の一部
をいう。抗原がＤＬＬ３などのポリペプチドである場合、エピトープは、一般に、タンパ
ク質の三次折り畳みによって並置された連続アミノ酸および不連続アミノ酸の両方から形
成することができる（「高次構造エピトープ」）。かかる高次構造エピトープでは、相互
に線形に分離されるとタンパク質上のアミノ酸残基全体に相互作用点が散在する。連続ア
ミノ酸から形成されたエピトープ（時折、「線状」または「連続」エピトープという）は
、典型的には、タンパク質変性の際に保持されるのに対して、三次折りたたみによって形
成されたエピトープは、典型的には、タンパク質変性の際に失われる。任意の事象では、
抗体エピトープは、典型的には、固有の空間的高次構造で少なくとも３、より通常には、
少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。
これに関して、一定の実施形態では、エピトープを、ＤＬＬ３タンパク質の１つ以上の
領域、ドメイン、またはモチーフ（例えば、イソ型１のアミノ酸１〜６１８）と会合する
か、これらの中に存在することができると認識されるであろう。本明細書中でより詳細に
考察されるように、ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメインおよび
ＤＳＬドメインを含む一連の一般的に認識されているドメインを含む。本開示の目的のた
めに、用語「ドメイン」を、その一般的に受け入れられている意味で使用し、特有の二次
構造の内容物を示すタンパク質内の同定可能であるか定義可能である保存された構造実体
をいうものとする。多くの場合、共通の機能を有する相同ドメインは、通常、配列類似性
を示し、多数の異なるタンパク質中に見出されるであろう（例えば、ＥＧＦ様ドメインは
、報告によれば少なくとも４７１種の異なるタンパク質中に見いだされる）。同様に、当
該分野で認識されている用語「モチーフ」を、その一般的な意味に従って使用し、一般に
、典型的には１０〜２０個の連続アミノ酸残基であるタンパク質の短い保存領域をいうも
のとする。全体で考察されるように、選択された実施形態は、ＤＬＬ３の特異的な領域、
ドメイン、またはモチーフ内のエピトープと会合するか結合するモジュレーターを含む。
任意の事象で、一旦抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば、本発明に記載
の技術を使用したエピトープを含むペプチドでの免疫によってエピトープに対する抗体を
生成することが可能である。あるいは、探索過程中、抗体の生成および特徴付けにより、
特異的なドメインまたはモチーフ中に存在する所望のエピトープについての情報を解明す
ることができる。この情報から、次いで、同一エピトープへの結合について抗体を競合的
にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、相互に競
合的に結合する抗体（すなわち、抗体は抗原への結合を競合する）を見出すために競合研
究を行うことである。交差競合に基づいた抗体ビニングのための高処理プロセスは、ＷＯ
０３／４８７３１に記載されている。モジュレーター競合または酵母上の抗原フラグメン
ト発現を含むビニングまたはドメインレベルのエピトープマッピングの他の方法を、以下
の実施例に記載している。
本明細書中で使用する場合、用語「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」は、抗体の抗原結合
の特徴および競合に基づいて抗体をグループ化するか分類するために使用する方法をいう
。この技術が本発明のモジュレーターの定義およびカテゴリー化に有用である一方で、ｂ
ｉｎはエピトープと常に直接相関するわけではなく、かかるエピトープ結合の最初の決定
を、本明細書中に記載の他の当該分野で認識されている方法によってさらに精巧にし、確
認することができる。しかし、以下の実施形態で考察され、示されるように、抗体モジュ
レーターの個別のｂｉｎへの経験的割り当てにより、開示のモジュレーターの治療的潜在
性を示し得る情報が得られる。
より具体的には、当該分野で公知であり、且つ本明細書中の実施例に記載の方法の使用
によって、選択された基準抗体（またはそのフラグメント）が同一のエピトープに結合す
るか第２の試験抗体と結合を交差競合する（すなわち、同一ｂｉｎに存在する）かどうか
を決定することができる。１つの実施形態では、基準抗体モジュレーターを、飽和条件下
でＤＬＬ３抗原と会合し、次いで、二次抗体モジュレーターまたは試験抗体モジュレータ
ーがＤＬＬ３に結合する能力を、標準的な免疫化学的技術を使用して決定する。試験抗体
が基準抗ＤＬＬ３抗体と同時にＤＬＬ３に実質的に結合することができる場合、二次抗体
または試験抗体は一次抗体または基準抗体と異なるエピトープに結合する。しかし、試験
抗体が同時にＤＬＬ３に実質的に結合することができない場合、試験抗体は同一のエピト
ープ、重複エピトープ、または一次抗体によって結合したエピトープと非常に近い（少な
くとも立体的に）エピトープに結合する。すなわち、試験抗体は抗原結合を競合し、基準
抗体と同一のｂｉｎに存在する。
開示のモジュレーターの文脈で使用する場合、用語「競合する」または「競合抗体」は
、試験抗体または試験用の免疫学的に機能的なフラグメントが共通の抗原への基準抗体の
特異的結合を防止または阻害するアッセイによって決定した場合の抗体間の競合を意味す
る。典型的には、かかるアッセイは、固体表面に結合した精製された抗原（例えば、ＤＬ
Ｌ３またはそのドメインもしくはフラグメント）またはこれらのいずれかを保有する細胞
、非標識の試験免疫グロブリン、および標識基準免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻
害を、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量の決定によ
って測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰量で存在し、そして／または最初に結合
可能である。競合アッセイによって同定された抗体（競合抗体）には、基準抗体と同一の
エピトープに結合する抗体および基準抗体が結合したエピトープが立体障害を起こすのに
十分に近位の隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。競合的結合の決定方法に関する
さらなる詳細を、本明細書中の実施例に提供する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合
、競合抗体は、共通の抗原への基準抗体の特異的結合を、少なくとも３０％、４０％、４
５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害するであろう。いく
つかの場合、結合を、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％または
それを超えて阻害する。
逆に、基準抗体が結合する場合、基準抗体は、好ましくは、その後に添加した試験抗体
（すなわち、ＤＬＬ３モジュレーター）の結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害する。いくつかの場合、試
験抗体の結合を、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはそ
れを超えて阻害する。
本発明に関して、以下の実施例に記載するように、ＤＬＬ３の細胞外ドメインが競合的
結合よって本明細書中で「ｂｉｎＡ」〜「ｂｉｎＩ」と命名された少なくとも９つのｂｉ
ｎを画定すると（表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって）決定された
。モジュレータービニング技術によって提供された解答を考慮すると、これら９つのｂｉ
ｎがＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域に存在するｂｉｎの大部分を含むと考えられる。
これに関して、当該分野で公知であり、且つ以下の実施例に詳述のように、所望のビニ
ングまたは競合的結合のデータを、固相の直接または間接的な放射免疫アッセイ（ＲＩＡ
）、固相の直接または間接的な酵素免疫アッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、サンドイ
ッチ競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システム（すなわち、表面プラズモ
ン共鳴−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析機（すなわ
ち、バイオレイヤー干渉法−ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）、またはフローサイトメトリ
ー法を使用して得ることができる。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書中で使用す
る場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタ
イムの特異的相互作用の分析が可能な光学現象をいう。用語「バイオレイヤー干渉法」は
、以下の２つの表面から反射した白色光の干渉縞を分析する光学的分析技術をいう：バイ
オセンサーチップ上の固定タンパク質層および内部標準層。バイオセンサーチップへの分
子の結合数の任意の変化により、干渉縞がシフトし、これをリアルタイムで測定すること
ができる。特に好ましい実施形態では、分析（表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉
法、またはフローサイトメトリーのいずれであるかにかかわらず）を、以下の実施例で決
定するように、ＢｉａｃｏｒｅまたはＦｏｒｔｅＢｉｏ装置またはフローサイトメーター
（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ）を使用して行う。
開示のＤＬＬ３抗体モジュレーターが会合または結合するエピトープをさらに特徴づけ
るために、ドメインレベルエピトープマッピングを、Ｃｏｃｈｒａｎら（Ｊ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８７（１−２）：１４７−１５８（２００４）（本明細書中で
参考として援用される））に記載のプロトコールの修正形態を使用して行った。簡潔に述
べれば、特異的アミノ酸配列を含むＤＬＬ３の各ドメインを酵母表面上に発現させ、各Ｄ
ＬＬ３抗体による結合をフローサイトメトリーによって決定した。結果を、以下の実施例
６および図４で考察する。
他の適合するエピトープマッピング技術には、アラニンスキャニング変異体、ペプチド
ブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４
４３−６３）（その全体が本明細書中で参考として具体的に援用される）、またはペプチ
ド切断分析が含まれる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化
学修飾などの方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）（その全体が本明細書中で参考として具体的に援用
される）。他の実施形態では、改変支援プロファイリング（ＭＡＰ）（抗原構造ベースの
抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知）は、化学的にまたは酵素的に改変され
た抗原表面への各抗体の結合プロフィールの類似性に従って同一抗原に指向する多数のモ
ノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリー化する方法を提供する（米国特許出願公開第２
００４／０１０１９２０号、その全体が本明細書中で参考として具体的に援用される）。
各カテゴリーは、別のカテゴリーによって示されたエピトープと明確に異なるか部分的に
重複する固有のエピトープを反映し得る。この技術により、特徴付けが遺伝的に異なる抗
体に集中することができるように遺伝的に同一の抗体を迅速にフィルタリングすることが
可能である。ＭＡＰを使用して本発明のｈＤＬＬ３抗体モジュレーターを異なるエピトー
プに結合する抗体群に選別することができると認識されるであろう。
固定抗原の構造を変化させるのに有用な薬剤には、タンパク質分解酵素（例えば、トリ
プシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリ
プシンなど）などの酵素が含まれる。固定抗原の構造を変化させるのに有用な薬剤はまた
、スクシンイミジルエステルおよびその誘導体、第一級アミン含有化合物、ヒドラジンお
よびカルボヒドラジン、遊離アミノ酸などの化学物質であり得る。
抗原タンパク質を、バイオセンサーチップ表面上またはポリスチレンビーズ上のいずれ
かに固定することができる。後者を、例えば、多重ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ
（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）などのアッセイを使用して処理することができる。ＬＵ
ＭＩＮＥＸが１００までの異なるタイプのビーズを使用して多重分析を取り扱うことがで
きるので、ＬＵＭＩＮＥＸは、種々の改変を有するほぼ無制限の抗原表面を提供し、その
結果、バイオセンサーアッセイによる抗体エピトーププロファイリングの問題が改善され
る。
ｅ．結合親和性
エピトープ特異性に加えて、開示の抗体を、例えば、結合親和性などの物理的特徴を使
用して特徴づけることができる。これに関して、本発明は、１つ以上のＤＬＬ３イソ型、
または、ｐａｎ抗体の場合、ＤＬＬファミリーの１つを超えるメンバーに対して高い結合
親和性を有する抗体の使用をさらに含む。本明細書中で使用する場合、ＩｇＧ抗体に対す
る「高親和性」という用語は、標的抗原に対するＫＤが１０−８Ｍ以下、より好ましくは
１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下である抗体をいう。しかし、「
高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプで異なり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに
対する「高親和性」結合は、ＫＤが１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さ
らにより好ましくは１０−９Ｍ以下の抗体をいう。
用語「ＫＤ」は、本明細書中で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を
いうことが意図される。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が１０−７
Ｍ以下である場合にその標的抗原に免疫特異的に結合するといわれる。抗体は、ＫＤが５
×１０−９Ｍ以下の場合に高親和性で、ＫＤが５×１０−１０Ｍ以下である場合に非常に
高い親和性で特異的に抗原に結合する。本発明の１つの実施形態では、抗体のＫＤは１０
−９Ｍ以下であり、解離速度は約１×１０−４／秒である。本発明の１つの実施形態では
、解離速度は１×１０−５／秒未満である。本発明の他の実施形態では、抗体は、約１０
−７Ｍと１０−１０Ｍとの間のＫＤでＤＬＬ３に結合し、さらに別の実施形態では、抗体
は、２×１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合するであろう。本発明のさらなる他の選択された
実施形態は、解離定数、すなわちＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が１０−２Ｍ未満、５×１０
−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未
満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０
−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未
満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満
、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満
、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満
、または５×１０−１５Ｍ未満の抗体を含む。
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体の会合速度定数、
すなわちｋｏｎ（またはｋａ）速度（ＤＬＬ３（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←Ａｂ−Ａ
ｇ）は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくと
も５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−
１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または
少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１である。
別の実施形態では、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体の解離速度定数、す
なわちｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（ＤＬＬ３（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←Ａｂ−
Ａｇ）は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１
０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満
、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ
−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１
０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１
未満、または１０−１０ｓ−１未満である。
本発明の他の選択された実施形態では、抗ＤＬＬ３抗体の親和性定数、すなわちＫａ（
ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なく
とも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも
５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも
１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×
１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０
９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１
０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも
１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくと
も５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少
なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×１０１５Ｍ−１であろう。
前述のモジュレーターの特徴に加えて、本発明の抗体を、さらなる物理的特徴（例えば
、熱安定性（すなわち、融点；Ｔｍ）および等電点が含まれる）を使用してさらに特徴づ
けることができる（例えば、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔら，１９９３，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ １４：１０２３；Ｖｅｒｍｅｅｒら，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８
：３９４−４０４；Ｖｅｒｍｅｅｒら，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：２１５０
−２１５４（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
Ｖ．抗体薬物コンジュゲートおよび薬物−リンカー部分
本発明のＤＬＬ３コンジュゲートがリンカー部分を介してＰＢＤ薬物ペイロードに共有
結合的に連結したＤＬＬ３細胞結合剤を含むと認識されるであろう。本明細書中で考察さ
れるように、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートを使用して、標的位置（例えば、腫瘍形成
性細胞）にＰＢＤ１、ＰＢＤ２、ＰＢＤ３、ＰＢＤ４、またはＰＢＤ５のうちのいずれか
１つを提供することができる。これを、薬物ペイロードの放出および活性化前に結合した
薬物ペイロードを比較的非反応性の非毒性状態で標的部位に配向する開示のＡＤＣによっ
て有利に行う。この有毒ペイロードの標的放出は、主に、ＡＤＣが腫瘍形成性細胞に到達
するまで細胞傷害性二量体ＰＢＤを切断して放出されないように作製された薬物−リンカ
ー化合物ＤＬ１〜５中に組み込んだリンカーを介して行われる。これにより、非標的細胞
および非標的組織の曝露を最小にしながら腫瘍部位に比較的高レベルの活性ＰＢＤ薬が遊
離に提供される。
１．リンカー化合物
より詳細には、開示のＡＤＣ内に組み込まれたリンカーは、好ましくは細胞外で安定で
あり、ＡＤＣ分子の凝集を防止し、水性媒体中の単量体状態でのＡＤＣの溶けやすさを維
持する。細胞内への輸送または送達前に、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、好ま
しくは、安定且つインタクトなままである（すなわち、抗体は薬物部分に連結したままで
ある）。リンカーは標的細胞外で安定である一方で、リンカーを、細胞の内側でいくらか
有効な速度で切断されるようにデザインされる。したがって、有効なリンカーは、以下で
あろう：（ｉ）抗体の特異的結合性を維持し；（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分を
細胞内送達可能であり；（ｉｉｉ）安定且つインタクトなままであり（すなわち、コンジ
ュゲートがその標的部位に送達または輸送されるまで切断されない）；（ｉｖ）ＰＢＤ薬
物部分の細胞傷害性効果、細胞死滅効果、または細胞増殖抑制効果を維持する。ＡＤＣの
安定性を、標準的な分析技術（質量分析、ＨＰＬＣ、および分離／分析技術であるＬＣ／
ＭＳなど）によって測定することができる。抗体および薬物部分の共有結合的な結合には
、リンカーが２つの反応性官能基を有する（すなわち、反応性という意味で二価である）
ことが必要である。２つ以上の機能的または生物学的に活性な部分（ペプチド、核酸、薬
物、毒素、抗体、ハプテン、およびレポーター基など）への結合に有用な二価のリンカー
試薬が公知であり、コンジュゲートを得る方法が記載されている（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，
Ｇ．Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ ２３４−２４２）。
この目的を達成するために、本発明のＤＬＬ３ ＡＤＣは、細胞内環境（例えば、リソ
ソーム内、エンドソーム内、またはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能なリ
ンカーを含む。ＡＤＣ１〜５の場合、リンカーは、細胞内ペプチダーゼ酵素またはプロテ
アーゼ酵素（リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼが含まれるが、これらに限定
されない）によって切断されるペプチジルリンカーを含む。一定の実施形態では、ペプチ
ジルリンカーは、好ましくは、少なくとも２アミノ酸長であるか、他の実施形態では、少
なくとも３アミノ酸長である。切断剤には、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが
含まれ得、それぞれ、ジペプチド薬誘導体を加水分解して活性薬物を標的細胞内に放出さ
せることが公知である。開示の薬物−リンカー部分ＤＬ１〜ＤＬ５では、細胞内プロテア
ーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、バリン−アラニンジペプチド部分である
。治療薬の細胞内タンパク質分解性放出使用の１つの利点は、薬剤が典型的にはコンジュ
ゲートした場合に弱毒化し、コンジュゲートの血清安定性が典型的には高いことである。
酵素切断性ジペプチド単位に加えて、ＡＤＣ１〜５（またはＤＬ１〜ＤＬ５）中にそれ
ぞれ見出される開示のリンカーは、スペーサー単位、薬物−リンカーを細胞結合剤に連結
するための結合部分、および、少なくともＤＬ４およびＤＬ５の場合、リンカーの切断時
にＰＢＤ薬を巧みに切断する自壊性（ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）部分を含む。自壊性基に関
して、ＤＬ４およびＤＬ５の両方は、同一部分を組み込んでいる。そのために、自壊性リ
ンカーおよびジペプチドが共に以下：
Figure 2019069983
（式中、アスタリスクは選択されたＰＢＤ細胞傷害性部分への結合点を示し、波線は抗体
にコンジュゲートすることができるリンカー残部（例えば、スペーサー−抗体結合セグメ
ント）の結合点を示す）に例示の−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を
形成する。ジペプチドの酵素切断の際に、自壊性リンカーにより、遠隔部位が活性化され
た場合に保護された化合物（すなわち、有毒ＰＢＤ二量体）が巧みに放出されて、以下に
示す反応経路：
Figure 2019069983
 （式中、Ｌ＊は、新規に切断されたペプチジル単位を含むリンカー残部の活性化形態であ
る）に沿って進行することが可能である。ＰＢＤ４およびＰＢＤ５の巧みな放出により、
ＰＢＤ４およびＰＢＤ５の所望の有毒活性が確実に維持されるであろう。
以下により詳細に考察され、且つ実施例７に記載のように、本発明の薬物リンカーは、
反応性チオール求核試薬に連結するであろう。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）な
どの還元剤での処理によってリンカー試薬とのコンジュゲート化に反応性を示すようにす
ることができる。したがって、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール
求核試薬を形成するであろう。米国特許第７，５２１，５４１号は、反応性システインア
ミノ酸の導入による操作抗体を教示している。
ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、およびＤＬ５では、細胞結合剤と薬物−リンカー部分との間
は、細胞結合剤のチオール残基およびリンカー上に存在する末端マレイミド基によって連
結する。かかる実施形態では、細胞結合剤と薬物−リンカーとの間の連結は、以下：
Figure 2019069983
 （式中、アスタリスクは、薬物−リンカーの残部への結合点を示し、波線は、細胞結合剤
の残部への結合点を示す）である。この実施形態では、Ｓ原子は、典型的には、ＤＬＬ３
抗体に由来する。
ＤＬ４に関して、結合部分は、活性化チオールと反応して所望のＡＤＣ４を得ることが
できる末端ヨードアセトアミドを含む。以下の実施例７に記載のように、ＤＬ４に好まし
いコンジュゲート化手順は、他の実施形態で見出されるマレイミド結合基に好ましいコン
ジュゲート化手順とわずかに異なる。任意の事象では、当業者は、本開示を考慮して、開
示の各薬物−リンカー化合物を適合するＤＬＬ３モジュレーターと容易にコンジュゲート
することができる。
２．ＰＢＤ化合物
上記で考察され、且つ以下の実施例で示すように、開示の各ＰＢＤ化合物（真下に示す
）は、潜在的な候補を本発明のＡＤＣ中に組み込ませる細胞傷害性を示す。各ＤＬ１〜５
の成分としての各ＰＢＤ１〜５の合成を、以下の実施例１に示す。本開示を考慮して、本
発明のＡＤＣのペイロードを含む有毒化合物を、本明細書中に記載のように容易に生成し
、使用することができる。リンカーの切断の際にＡＤＣ１〜５から放出されるＰＢＤ化合
物を、直下に記載する。
Figure 2019069983
腫瘍部位でのかかる化合物の送達および放出は、本開示にしたがった増殖性障害の処置
または管理で臨床的に有効であることを証明することができる。化合物に関して、開示の
各ＰＢＤが各Ｃ環内に２つのｓｐ２中心を有し、各Ｃ環中にたった１つのｓｐ２中心しか
持たない化合物よりＤＮＡの副溝中に強力に結合することが可能である（それ故、毒性が
より高い）と認識されるであろう。したがって、本明細書中に記載のＤＬＬ３ ＡＤＣを
使用する場合、開示のＰＢＤは、増殖性障害の処置に特に有効であると証明することがで
きる。
３．薬物−リンカー部分
本明細書中の教示によれば、開示のＰＢＤを、上記のリンカーと組み合わせて直下に記
載の薬物−リンカー化合物ＤＬ１〜ＤＬ５が得られるであろう。各開示の薬物−リンカー
の詳細な合成プロトコールを、以下の実施例１に記載する。
Figure 2019069983
Figure 2019069983
薬物−リンカーＤＬ１〜５に関して、ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、およびＤＬ５はそれぞ
れ、化合物を選択されたＤＬＬ３抗体とコンジュゲートするために使用することができる
末端マレイミド基を含むと認識されるであろう。逆に、ＤＬ４は、ＰＢＤペイロードを標
的化抗体にコンジュゲートするために使用される末端ヨードアセトアミド基を含む。一定
の条件下でのヨードアセトアミド部分の使用によって一定の望ましくない副反応が回避さ
れ、ＡＤＣ安定性が強化されるかもしれない。さらに、ＤＬ４およびＤＬ５がＢ環上のＮ
１０位を介してＤＬＬ３モジュレーターに連結するＰＢＤを含む一方で、ＤＬ１、ＤＬ２
、およびＤＬ３は、Ｃ環上のＣ２位を介して選択された抗体に連結すると認識されるであ
ろう。Ｎ１０位を介して連結する化合物に関して、リンカーはペイロードの精巧な分離を
確実にするためにＰＡＢＣ自壊性部分を含むことがさらに留意されるであろう。本教示を
考慮して、当業者は、どのＤＬ（および会合したＡＤＣ）が選択された増殖性障害の処置
の有効性を示すかを容易に決定することができる。
４．化合物の特徴
以下の実施形態および直下に記載の変形形態は、開示のＡＤＣ、薬物リンカー、および
／またはＰＢＤに適用可能であり、本発明の範囲内であることを明確に意図する。
ａ．溶媒和物
薬物リンカー、ＡＤＣ、またはＰＢＤの対応する溶媒和物を調製、精製、および／また
は取り扱うことが、都合が良いまたは望ましい場合がある。用語「溶媒和物」を、従来の
意味で溶質（例えば、活性化合物、活性化合物の塩）と溶媒の複合体をいうために本明細
書中で使用する。溶媒が水である場合、溶媒和物を、便宜上、水和物（例えば、一水和物
、二水和物、三水和物など）ということができる。
本発明は、ＰＢＤ部分のイミン結合を介して溶媒が付加された化合物を含み、溶媒が水
またはアルコールである化合物を以下に例示する（ＲＡＯＨ、式中、ＲＡはＣ１〜４アル
キルである）：
Figure 2019069983
これらの形態を、ＰＢＤのカルビノールアミン形態およびカルビノールアミンエーテル
形態と呼ぶことができる（上記のＲ１０に関する節に記載）。これらの平衡状態のバラン
スは、化合物が見出される条件および化合物部分自体の性質に依存する。
ｂ．異性体
本発明の一定の化合物は、１つ以上の特定の幾何異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジ
アステレオマー、エピマー、アトロプ異性体、立体異性体、互変異性体、配座異性体、ま
たはアノマー型（シス型およびトランス型；Ｅ型およびＺ型；ｃ型、ｔ型、およびｒ型；
エンド型およびエクソ型；Ｒ型、Ｓ型、およびメソ型；Ｄ型およびＬ型；ｄ型およびｌ型
；（＋）型および（−）型；ケト型、エノール型、およびエノラート型；シン型およびア
ンチ型；シンクリナル型およびアンチクリナル型；α型およびβ型；アキシアル型および
エクアトリアル型；舟型、椅子型、ツイスト型、エンベロープ型、および半椅子型、なら
びにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）で存在することができ、
以後、集合的に「異性体」（または「異性体型」）という。
用語「キラル」は、鏡像パートナーとの重なり合わない性質を有する分子をいう一方で
、用語「アキラル」は、その鏡像パートナーと重なり合う分子をいう。
用語「立体異性体」は、同一の化学構造を有するが、原子または基の空間的配置が異な
る化合物をいう。
「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラル中心を有し、その分子が相互に鏡像ではな
い立体異性体をいう。ジアステレオマーは、異なる物理的性質（例えば、融点、沸点、ス
ペクトル特性、および反応性）を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動および
クロマトグラフィなどの高分解能分析手順下で分離することができる。
「鏡像異性体」は、相互に重なり合わない鏡像である化合物の２つの立体異性体をいう
。
本明細書中で使用される立体化学的な定義および慣習は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅ
ｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に従う。本発明の化合物は、不斉
中心またはキラル中心を含むことができ、したがって、異なる立体異性体型で存在する。
本発明の化合物の全ての立体異性体型（ジアステレオマー、鏡像異性体、およびアトロプ
異性体、ならびにその混合物（ラセミ混合物など）が含まれるが、これらに限定されない
）が本発明の一部を形成することを意図する。多数の有機化合物は、光学活性形態で存在
する（すなわち、平面偏光面が回転する能力を有する）。光学活性化合物の記述では、接
頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳを、そのキラル中心についての分子の絶対配置を表示
するために使用する。接頭辞ｄおよびｌまたは（＋）および（−）を、化合物による平面
偏光の回転の徴候を命名するために使用し、（−）またはｌは化合物が左旋性であること
を意味する。（＋）またはｄの接頭辞を有する化合物は右旋性である。所与の化学構造に
ついて、これらの立体異性体は、相互に鏡像であることを除いて同一である。特定の立体
異性体を鏡像異性体ともいうことができ、かかる異性体の混合物をしばしば鏡像異性体混
合物と呼ぶ。鏡像異性体の５０：５０混合物をラセミ混合物またはラセミ体といい、化学
反応または化学的過程において立体選択性や立体特異性を示さなかった場合に生じ得る。
用語「ラセミ混合物」および「ラセミ体」は、光学活性を欠く２つの鏡像異性体種の等モ
ル混合物をいう。
互変異性型についての以下の考察を除き、本明細書中で使用する場合、具体的には、構
造（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）（または構造（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ））異性体（
すなわち、単なる原子の空間的位置よりもむしろ原子間の連結が相違する異性体）は、用
語「異性体」から排除されることに留意のこと。例えば、メトキシ基−ＯＣＨ３という言
及において、ヒドロキシメチル基−ＣＨ２ＯＨという言及はその構造異性体であると見な
されない。同様に、オルソ−クロロフェニルという言及において、メタ−クロロフェニル
という言及はその構造異性体であると見なされない。しかし、構造クラスという言及には
、そのクラスの範囲に入る構造的に異性体の形態が十分に含まれ得る（例えば、Ｃ１〜７
アルキルには、ｎ−プロピルおよびイソ−プロピルが含まれ；ブチルには、ｎ−、イソ−
、ｓｅｃ−、およびｔｅｒｔ−ブチルが含まれ；メトキシフェニルには、オルソ−、メタ
−、およびパラ−メトキシフェニルが含まれる）。
上記の除外には、互変異性型（例えば、ケト型、エノール型、およびエノラート型（例
えば、以下の互変異性体対：ケト／エノール（以下に例示）、イミン／エナミン、アミド
／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオ
ール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ、およびニトロ／ａｃｉ−ニトロなど））は関与し
ない。
Figure 2019069983
用語「互変異性体」または「互変異性型」は、低エネルギー障壁を介して相互変換可能
な異なるエネルギーの構造異性体をいう。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピー
互変異性体としても公知）には、プロトン移動による相互変換（ケト−エノール異性化お
よびイミン−エナミン異性化など）が含まれる。原子価互変異性体には、いくつかの結合
電子の再編成による相互変換が含まれる。
１つ以上の同位体置換を有する化合物が用語「異性体」に明確に含まれることに留意の
こと。例えば、Ｈは任意の同位体形態（１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、および３Ｈ（Ｔ）が含まれる
）で存在することができ；Ｃは任意の同位体形態（１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃが含ま
れる）で存在することができ；Ｏは任意の同位体形態（１６Ｏおよび１８Ｏが含まれる）
で存在することができる。
本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リ
ン、フッ素、および塩素の同位体（２Ｈ（重水素、Ｄ）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、
１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、および１２５Ｉ
などであるが、これらに限定されない）が含まれる。本発明の種々の同位体標識された化
合物（例えば、３Ｈ、１３Ｃ、および１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）
。かかる同位体標識された化合物は、代謝研究、反応速度研究、検出または画像化技術（
陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣ
Ｔ）など）（薬物または基質の組織分布アッセイが含まれる）、または患者の放射性処置
で有用であり得る。本発明の重水素標識されたまたは置換された治療化合物は、分布、代
謝、および排出（ＡＤＭＥ）に関するＤＭＰＫ（薬物代謝および薬物動態学的）性を改善
することができる。重水素などのより重い同位体との置換により、代謝安定性の向上に起
因する一定の治療上の利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増大または必要用量の減少
）を得ることができる。１８Ｆ標識化合物は、ＰＥＴ研究またはＳＰＥＣＴ研究に有用で
あり得る。本発明の同位体標識した化合物およびそのプロドラッグを、一般に、スキーム
および実施例に開示の手順ならびに下記の容易に利用可能な同位体標識した試薬を同位体
非標識試薬の代わりに使用することによる調製を行うことによって調製することができる
。さらに、より重い同位体、特に重水素（すなわち、２ＨまたはＤ）との置換により、代
謝安定性の向上に起因する一定の治療上の利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増大ま
たは必要用量の減少または治療指数の改善）を得ることができる。この文脈において重水
素を置換基と見なすと理解される。かかるより重い同位体、特に重水素の濃度を、同位体
濃縮因子によって定義することができる。本発明の化合物では、特定の同位体として特に
指摘しない任意の原子は、その原子の任意の安定同位体を示すことを意味する。
他で規定しない限り、特定の化合物の言及には、全てのかかる異性体型が含まれ、この
異性体型には（完全または部分的に）ラセミ体およびその混合物が含まれる。かかる異性
体型の調製（例えば、不斉合成）および分離（例えば、分別晶出およびクロマトグラフィ
手段）の方法は当該分野で公知であるか、公知の様式における本明細書中で教示の方法ま
たは公知の方法の適応によって容易に得ることができる。
５．コンジュゲートおよび薬物負荷
上記で考察するように、本発明によって以下の抗体薬物コンジュゲートを提供する。
Figure 2019069983
Figure 2019069983
一旦本発明のモジュレーターおよび薬物−リンカーが本明細書中の教示にしたがって生
成および／または作製され、選択されると、これらを連結またはコンジュゲートして開示
のＡＤＣを得ることができる。本明細書中で使用する場合、用語「コンジュゲート」、「
モジュレーターコンジュゲート」、「抗体コンジュゲート」、「ＤＬＬ３コンジュゲート
」、または「ＡＤＣ」は、交換可能に使用され、ＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤＣ３、ＡＤＣ
４、またはＡＤＣ５のいずれかを意味するものとする。当該分野で認識されている技術を
使用して選択した抗体および薬物−リンカーをコンジュゲートし、所望のＡＤＣを得るこ
とができる。好ましいコンジュゲート化方法は、以下の実施例７に記載されている。さら
に、当該分野で公知のようにコンジュゲート化条件を変化させるか、特定の抗体構築物を
選択することにより、種々の化学量論的モル比の薬物−抗体比を示すＡＤＣを生成するこ
とができ、これは、本発明の範囲内に明確に含まれる。
より一般的には、当業者は、いくつかの異なる反応が開示の薬物−リンカーのＤＬＬ３
結合剤への結合または会合に利用可能であると認識するであろう。例として、抗体上の求
核性基には、側鎖チオール基（例えば、システイン）が含まれるが、これらに限定されな
い。チオール基は求核性を示し、反応してリンカー部分（本発明のリンカー部分など）上
の求電子性基と共有結合を形成することができる。本発明の好ましい抗体は、還元性鎖間
ジスルフィド（例えば、かかる求核性基が提供されるシステイン架橋）を有するであろう
。したがって、一定の実施形態では、モジュレーターシステインの遊離スルフヒドリル基
と開示の薬物−リンカーの末端マレイミド基またはヨードアセトアミド基との反応により
、所望のコンジュゲートが得られるであろう。このような場合、ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）または（ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤
での処理によって、抗体はリンカー試薬とのコンジュゲートに反応性を示すようになり得
る。したがって、各システインジスルフィド架橋は、理論的には、２つの反応性チオール
求核試薬を形成するであろう。他の実施形態では、さらなる求核性基を、リジンの試薬（
２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、またはＳＡＴ（ＰＥＧ）
４が含まれるが、これらに限定されない）との反応によって抗体に導入し、それにより、
アミンをチオールに変換することができる。かかる試薬が好ましいが、開示の薬物−リン
カーおよびＤＬＬ３モジュレーターを、抗体または細胞結合剤の求核性基が薬物−リンカ
ー試薬と共有結合する当業者に公知の種々の反応、条件、または試薬を使用してコンジュ
ゲートすることができると認識されるであろう。示したように、特に好ましい方法を以下
の実施例７により詳細に記載する。
本発明のＡＤＣおよびＡＤＣ組成物は、コンジュゲート化のために使用した方法に少な
くとも一部依存する種々の化学量論的モル比で薬物および抗体部分を含むことができる。
本明細書中で使用する場合、化学量論的モル比を、「薬物抗体比」、「ＤＡＲ」、または
「薬物負荷」の観点から定義する。言い換えれば、薬物負荷またはＤＡＲは、細胞結合剤
（例えば、組成物中の抗体）あたりの加重平均ＰＢＤ薬物数である。本発明のＰＢＤ化合
物がＩｇＧ１中の天然に存在するシステインにコンジュゲートする場合、薬物負荷は、細
胞結合剤あたり１〜８個の薬物の範囲であり得る（すなわち、１、２、３、４、５、６、
７、または８個の薬物部分が各細胞結合剤に共有結合的に結合する）。好ましくは、本発
明の組成物のＤＡＲはおよそ２、４、または６であり、特に好ましい実施形態では、ＤＡ
Ｒはおよそ２を含むであろう。
より具体的には、本発明のコンジュゲート組成物は、一定範囲のＰＢＤ化合物（１〜８
個）（ＩｇＧ１の場合）とコンジュゲートした細胞結合剤（例えば、抗体）を含む。その
ようなものとして、開示の抗体薬物コンジュゲート組成物には、ほとんどの構成抗体が１
つ以上のＰＢＤ薬部分に共有結合的に連結し、薬物部分が抗体の種々のアミノ酸残基に連
結することができる抗体薬物コンジュゲート化合物の混合物が含まれる。すなわち、コン
ジュゲート化後、本発明のＡＤＣ組成物は、種々の濃度の異なる薬物負荷（例えば、Ｉｇ
Ｇ１抗体あたり１〜８個の薬物）を有するＤＬＬ３コンジュゲートの混合物を含むであろ
う。選択的なコンジュゲート化条件および精製方法を使用して、コンジュゲート組成物を
、コンジュゲート組成物が単一の望ましいＡＤＣ種（例えば、薬物負荷２）を主に含み、
比較的低レベルの他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６の薬物負荷など）を含むようにする
ことができる。ＤＡＲ値は、全体としての（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめた）組成
物についての薬物負荷の加重平均を示す。使用した定量方法における特有の不確実性およ
び商業的環境における非支配的なＡＤＣ種の完全な除去が困難であることにより、許容可
能なＤＡＲ値または仕様を、しばしば、ある範囲または分布として示す（すなわち、２＋
／−０．５のＤＡＲ）。好ましくは、ＤＡＲの測定値が範囲内（すなわち、１．５〜２．
５）の組成物が薬学的環境下で使用されるであろう。
したがって、一定の好ましい実施形態では、本発明は、ＤＡＲが１、２、３、４、５、
６、７、または８（それぞれ、＋／−０．４）の組成物を含むであろう。他の好ましい実
施形態では、本発明は、２、４、６、または８＋／−０．４のＤＡＲを含むであろう。最
終的に、選択された好ましい実施形態では、本発明は、２＋／−０．４のＤＡＲを含むで
あろう。一定の好ましい実施形態では範囲または偏差が０．４未満であり得ると認識され
るであろう。したがって、他の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、
または８（それぞれ、＋／−０．３）のＤＡＲ、２、４、６、または８＋／−０．３のＤ
ＡＲ、さらにより好ましくは２＋／−０．３のＤＡＲを含むであろう。他の実施形態では
、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７
、または８（それぞれ、＋／−０．４）であり、且つ非支配的なＡＤＣ種が比較的低レベ
ル（すなわち、３０％未満）の組成物を含むであろう。他の好ましい実施形態では、ＡＤ
Ｃ組成物は、ＤＡＲが２、４、６、または８（それぞれ、＋／−０．４）であり、且つ非
支配的なＡＤＣ種が比較的低レベル（３０％未満）であろう。特に好ましい実施形態では
、ＡＤＣ組成物は、ＤＡＲが２＋／−０．４であり、且つ非支配的なＡＤＣ種が比較的低
レベル（３０％未満）であろう。
コンジュゲート化反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布を、ＵＶ
、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および電気泳動などの従来の
手段によって特徴づけることができる。抗体あたりの薬物に関するＡＤＣの定量的分布も
決定することができる。ＥＬＩＳＡにより、特定のＡＤＣ調製物中の抗体あたりの薬物の
平均値を決定することができる（Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら（２００５）Ｃｌｉｎ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２）。しかし、抗体価あたりの薬物の分布は
、抗体−抗原結合およびＥＬＩＳＡの検出限界によって識別できない。また、抗体−薬物
コンジュゲート検出のためのＥＬＩＳＡアッセイでは、薬物部分が抗体のどこに結合する
かが決定されない（重鎖フラグメントまたは軽鎖フラグメントまたは特定のアミノ酸残基
など）。いくつかの例では、ＤＡＲが他の薬物負荷を有するＡＤＣ由来の一定の十分に定
義された値を含む均一なＡＤＣの分離、精製、および特徴付けを、逆相ＨＰＬＣまたは電
気泳動などの手段によって行うことができる。かかる技術を、他のコンジュゲート型に適
用することも可能である。
１つを超える抗体の求核性基または求電子性基が、薬物−リンカー中間体と反応するか
、リンカー試薬との反応後に薬物部分試薬に反応する場合、得られた生成物は、薬物部分
が抗体にある分布で結合した（例えば、１、２、３など）ＡＤＣ化合物の混合物である。
液体クロマトグラフィ法（ポリマー系逆相（ＰＬＲＰ）クロマトグラフィおよび疎水性相
互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィなど）は、薬物負荷値によって混合物中の化合物を分
離することができる。単一の薬物負荷値を有するＡＤＣの調製物を単離することができる
が、リンカーを介して薬物部分を抗体上の異なる部位に結合させることができるので、こ
れらの単一負荷値を有するＡＤＣは、不均一な混合物を依然として含み得る。
いくつかの抗体−薬物コンジュゲートについて、薬物負荷数を、抗体上の結合部位数に
よって制限することができる。例えば、抗体は、たった１つまたは数個のシステインチオ
ール基を有することができるか、たった１つまたは数個のリンカーを結合することができ
る反応性が十分なチオール基を有することができる。薬物負荷がより高いと（例えば、５
超）、一定の抗体−薬物コンジュゲートが凝集するか、不溶になる、有毒になるか、細胞
透過性を喪失し得る。
典型的には、理論的最大値より少ない薬物部分を、コンジュゲート化反応中に抗体にコ
ンジュゲートする。抗体は、例えば、薬物−リンカー中間体やリンカー試薬と反応しない
多数のリジン残基を含み得る。最も反応性が高いリジン基のみがアミン反応性リンカー試
薬と反応し得る。また、最も反応性が高いシステインチオール基のみがチオール反応性リ
ンカー試薬と反応し得る。一般に、抗体は、存在する場合、薬物部分に連結することがで
きる遊離反応性システインチオール基をあまり含まない。化合物の抗体中のほとんどのシ
ステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在し、部分的または完全な還元条件
下でジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤で還元されなければなら
ない。ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）を、いくつかの異なる様式で調節することができ、
この様式には以下が含まれる：（ｉ）抗体と比較したモル過剰の薬物−リンカー中間体ま
たはリンカー試薬の制限、（ｉｉ）コンジュゲート化反応の時間または温度の制限、およ
び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための還元条件の部分的制限または制限。
１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるシステイン残基の操作（例えば、１つ以
上の外来システインアミノ酸残基を含む変異抗体の調製）によって反応性チオール基を抗
体（またはそのフラグメント）に導入することができるとさらに認識されるであろう。す
なわち、システインアミノ酸を抗体内の反応部位で操作することができ、それにより、鎖
内または分子間にジスルフィド結合を形成しない（Ｊｕｎｕｔｕｌａら，２００８ｂ Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２；Ｄｏｒｎａｎら（２００
９）Ｂｌｏｏｄ １１４（１３）：２７２１−２７２９；ＵＳ７５２１５４１；ＵＳ７７
２３４８５；ＷＯ２００９／０５２２４９）。操作されたシステインチオールは、マレイ
ミドまたはα−ヨードアミドなどのチオール反応性求電子性基を有する本発明のリンカー
試薬または薬物−リンカー試薬と反応してシステイン操作抗体およびＰＢＤ薬物部分を有
するＡＤＣを形成することができる。したがって、薬物部分の位置をデザインし、調節し
、知ることができる。操作されたシステインチオール基は、典型的にはチオール反応性の
リンカー試薬または薬物−リンカー試薬と高収率で反応するので、薬物負荷を調節するこ
とができる。重鎖または軽鎖上の単一の部位の置換によってシステインアミノ酸を導入す
るためのＩｇＧ抗体の操作により、対称的な抗体上に２つの新規のシステインが得られる
。ほぼ均一なコンジュゲート化生成物ＡＤＣを使用してほぼ２の薬物負荷を達成すること
ができる。
ＶＩ．薬学的調製物および治療用途
１．処方物および投与経路
選択されたコンジュゲートの形態、意図する送達様式、処置またはモニタリングされる
疾患、および多数の他の変数に依存して、本発明の組成物を、必要に応じて当該分野で認
識されている技術を使用して処方することができる。いくつかの実施形態では、本発明の
治療組成物を、そのままか最少量のさらなる成分と共に投与することができる一方で、他
の組成物を当該分野で周知の賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容され得るキャ
リアを含むように任意選択的に処方することができる（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍ
ａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ
Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ ｅｄ．（２００３）；Ａｎｓｅｌら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ， ７ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋ
ｉｎｓ（２００４）；Ｋｉｂｂｅら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒ
ｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含む種々
の薬学的に許容され得るキャリアは、多数の商業的供給者から容易に入手可能である。さ
らに、一連の薬学的に許容され得る補助剤（ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定
剤、および湿潤薬など）も入手可能である。一定の非限定的な例示的キャリアには、生理
食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそ
の組み合わせが含まれる。
より詳細には、いくつかの実施形態では、本発明の治療組成物をそのままか最少量のさ
らなる成分と共に投与することができると認識されるであろう。逆に、本発明のＤＬＬ３
ＡＤＣを、任意選択的に、当該分野で周知であり、且つコンジュゲートの投与を容易に
する比較的不活性の物質であるか、活性化合物を反応部位への送達のために薬学的に最適
化された調製物に加工するのを補助する賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容さ
れ得るキャリアを含むように処方することができる。例えば、賦形剤は、形態または堅さ
を与えるか、ＡＤＣの薬物動態学的または安定性を改善するための希釈剤として作用し得
る。適切な賦形剤または添加剤には、安定剤、湿潤剤および乳化剤、容量オスモル濃度を
変動させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透増強剤が含まれるが、これ
らに限定されない。一定の好ましい実施形態では、薬学的組成物を、凍結乾燥形態で提供
し、例えば、投与前に緩衝化生理食塩水で再構成することができる。かかる再構成した組
成物を、好ましくは静脈内投与する。
開示の全身投与用ＡＤＣを、腸内投与、非経口投与、または局所投与のために処方する
ことができる。実際、３つの全処方物型を、有効成分を全身投与するために同時に使用す
ることができる。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤および処方物は、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載され
ている。非経口投与に適切な処方物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液（例えば、水
溶性塩）が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液（必要に応じて油性注射懸濁液）を投
与することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ヘキシ
ル置換ポリ（ラクチド）、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エ
チルまたはトリグリセリド）が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる
物質を含むことができ、この物質には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム
、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる。任意選択的に、懸濁液は安定
剤も含むことができる。リポソームを使用して、細胞内送達のための薬剤をカプセル化す
ることもできる。
腸内投与に適切な処方物には、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル、丸薬、
錠剤（コーティングされた錠剤が含まれる）、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸
入薬、およびその制御放出形態が含まれる。
非経口投与（例えば、注射による）に適切な処方物には、有効成分が、溶解されたか、
懸濁されたか、そうでなければ（例えば、リポソームまたは他の微粒子中に）提供された
水性または非水性の等張で発熱物質を含まず無菌の液体（例えば、溶液、懸濁液）が含ま
れる。かかる液体は、他の薬学的に許容され得る成分（抗酸化剤、緩衝液、防腐剤、安定
剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、および意図されるレシピエントの血液（または他の関連す
る体液）と処方物を等張にする溶質など）をさらに含むことができる。賦形剤の例には、
例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、および植物油などが含まれる。か
かる処方物で用いる適切な等張キャリアの例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、
または乳酸加リンゲル注射液が含まれる。
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合する処方物は、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００
ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＤＣを含むであろう。一定の選択された実施形態では、ＡＤＣ濃度
は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／
ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６
００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、または１ｍ
ｇ／ｍｌを含むであろう。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３
ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍ
ｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍ
ｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍ
ｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍ
ｌ、または１００ｍｇ／ｍｌを含むであろう。
一般に、ＤＬＬ３ ＡＤＣを含む本発明の化合物および組成物を、種々の経路（経口、
静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、口
内、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、および髄腔内、または移植もしくは吸入が含まれ
るが、これらに限定されない）によって必要とする被験体にｉｎ ｖｉｖｏで投与するこ
とができる。本組成物を、固体、半固体、液体、気体の調製物（錠剤、カプセル、粉末、
顆粒、軟膏、溶液、坐剤、浣腸、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルが含まれるが、これ
らに限定されない）に処方することができる。適切な処方物および投与経路を、意図する
適用および治療レジメンにしたがって選択することができる。特に好ましい実施形態では
、本発明の化合物を、静脈内に送達させるであろう。
２．投薬量
同様に、特定の投薬レジメン（すなわち、用量、タイミング、および反復）は、特定の
個体およびその個体の病歴ならびに薬物動態学的（例えば、半減期、クリアランス速度な
ど）などの経験的検討事項に依存するであろう。治療過程にわたって投与頻度を決定し、
調整することができ、投与頻度は、増殖性細胞数または腫瘍形成性細胞数の減少、かかる
新生物細胞の減少の維持、新生物細胞の増殖の減少、または転移の進行の遅延に基づく。
他の実施形態では、投薬量を、潜在的な副作用および／または毒性を管理するために調整
または減少させることができる。あるいは、本治療組成物の持続性の連続放出処方物が適
切であり得る。
コンジュゲート化合物およびコンジュゲート化合物を含む組成物の適切な投薬量は患者
によって異なり得ると当業者に認識されるであろう。至適投薬量の決定は、一般に、任意
のリスクまたは副作用に対して治療効果レベルのバランスを取ることを含む。選択された
投薬量レベルは、種々の要因（特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排出
率、処置の持続期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、
容態の重症度、ならびに患者の種、性別、年齢、体重、容態、全体的な健康状態、および
病歴が含まれるが、これらに限定されない）に依存するであろう。化合物の量および投与
経路は、最終的に、医師、獣医師、または臨床医の判断によるであろうが、一般に、投薬
量を、実質的な有害または危険な副作用を生じること無く所望の効果が得られる局所濃度
が作用部位で得られるように選択するであろう。
一般に、本発明のＡＤＣを、種々の範囲で決定することができる。これらの範囲には、
約５μｇ／ｋｇ体重／用量〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量；約５０μｇ／ｋｇ体重／用
量〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／用量；約１００μｇ／ｋｇ体重／用量〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重
／用量が含まれる。他の範囲には、約１００μｇ／ｋｇ体重／用量〜約２０ｍｇ／ｋｇ体
重／用量および約０．５ｍｇ／ｋｇ体重／用量〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量が含まれる
。一定の実施形態では、投薬量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２
５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体
重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
選択された実施形態では、ＡＤＣを、およそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７
０、８０、９０、または１００μｇ／ｋｇ体重／用量で（好ましくは、静脈内）投与する
であろう。他の実施形態は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８０
０、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００
、１７００、１８００、１９００、または２０００μｇ／ｋｇ体重／用量でのＡＤＣの投
与を含むであろう。他の好ましい実施形態では、開示のコンジュゲートを、２．５、３、
３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、９、または１０ｍｇ／
ｋｇで投与するであろう。さらなる他の実施形態では、コンジュゲートを、１２、１４、
１６、１８、または２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量で投与することができる。さらなる他の実
施形態では、コンジュゲートを、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量で投与することができ
る。本明細書中の教示を用いて、当業者は、前臨床動物研究、臨床所見、ならびに標準的
な医学的および生化学的技術および測定値に基づいて種々のＡＤＣに適切な投薬量を容易
に決定することができる。特に好ましい実施形態では、かかるＤＬＬ３コンジュゲートの
投薬量を、一定期間にわたって静脈内に投与するであろう。さらに、かかる投薬量を、規
定された処置過程にわたって複数回投与することができる。
他の投与レジメンは、米国特許第７，７４４，８７７号に開示の体表面積（ＢＳＡ）計
算に基づいて予測することができる。周知のように、被験体の身長および体重を使用して
ＢＳＡを計算し、このＢＳＡは患者の表面積によって示される被験体のサイズの基準であ
る。一定の実施形態では、コンジュゲートを、１ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍ
ｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投薬量、および１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２
００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ
／ｍ２、または４５０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与することができる。当該分野で認識され
ている技術および経験的技術を使用して適切な投薬量を決定することができるとも認識さ
れるであろう。
いずれにしても、ＤＬＬ３ ＡＤＣを、必要とする患者に必要に応じて投与することが
好ましい。投与頻度を、処置される容態、処置される被験体の年齢、処置される容態の重
症度、および処置される被験体の一般的な健康状態などを考慮して主治医などの当業者が
決定することができる。一般に、有効用量のＤＬＬ３コンジュゲートを１回以上被験体に
投与する。より詳細には、有効用量のＡＤＣを、被験体に、１ヶ月に１回、１ヶ月に１回
超、または１ヶ月に１回未満投与する。一定の実施形態では、有効用量のＤＬＬ３ ＡＤ
Ｃを、複数回（少なくとも１ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくと
も２年間、または少なくとも数年間が含まれる）投与することができる。さらに他の実施
形態では、開示のモジュレーターの投与の間隔を、数日間（２、３、４、５、６、または
７日間）、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）、または数ヶ月間（１
、２、３、４、５、６、７、または８ヶ月間）、またはさらに１年間もしくは数年間あけ
ることができる。
一定の好ましい実施形態では、コンジュゲートしたモジュレーターに関する治療単位は
、数週間または数年にわたる選択された製剤の複数回の投与を含むであろう。より具体的
には、本発明のコンジュゲートしたモジュレーターを、１日毎に１回、２日毎に１回、４
日毎に１回、１週間毎に１回、１０日毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１ヶ
月毎に１回、６週間毎に１回、２ヶ月毎に１回、１０週間毎に１回、または３ヶ月毎に１
回投与することができる。これに関して、患者の応答および臨床プラクティスに基づいて
、投薬量を変更することができるか、間隔を調整することができると認識されるであろう
。
１回以上投与された個体における開示の治療組成物についての投薬量およびレジメンを
、経験的に決定することもできる。例えば、個体に、本明細書中に記載の治療組成物を漸
増投薬量で投与することができる。選択された実施形態では、投薬量を、経験的に決定さ
れたか認められた副作用または毒性にそれぞれ基づいて、段階的に増加または減少または
低下させることができる。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障
害、または容態のマーカーを、以前に記載のように追跡することができる。癌について、
これらには、触診または目視観測による腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線または他の画像が技
術による腫瘍サイズの間接的な測定；腫瘍サンプルの直接腫瘍生検および顕微鏡検査によ
って評価した場合の改善；本明細書中に記載の方法によって同定された間接的な腫瘍マー
カー（例えば、前立腺癌のＰＳＡ）または腫瘍形成性抗原の測定値、疼痛または麻痺の減
少；発語、視力、呼吸、または腫瘍に関連する他の能力障害の改善；食欲亢進；または許
容された試験によって測定された生活の質の向上または延命が含まれる。投薬量が個体、
新生物容態のタイプ、新生物容態の病期、新生物容態が個体内の他の位置に転移し始めた
かどうか、ならびに過去および現在に使用された処置に応じて変化することが当業者に明
らかであろう。
３．併用療法
本発明によれば、併用療法は、望ましくない新生物細胞増殖の減少もしくは阻害、癌発
生の減少、癌再発の減少もしくは防止、または癌の拡大もしくは転移の減少もしくは防止
で特に有用であり得る。かかる場合、本発明のＡＤＣは、腫瘍塊を支えて永続化させるＣ
ＳＣを除去し、それにより、現在の標準的な減量剤または抗癌剤によるケアをより有効に
使用可能にする増感剤または化学増感剤としての機能を果たすことができる。すなわち、
開示のＡＤＣにより、一定の実施形態では、効果が強化され（例えば、事実上、相加作用
または相乗作用）、別の投与した治療薬の作用様式を増強し得る。本発明の文脈では、「
併用療法」は、広義に解釈されるものとし、ＤＬＬ３ ＡＤＣおよび１つ以上の抗癌剤（
細胞毒性薬、細胞増殖抑制薬、抗血管新生薬、減量剤、化学療法薬、放射線療法および放
射線治療薬、標的抗癌剤（モノクローナル抗体および小分子物質の両方が含まれる）、Ｂ
ＲＭ、治療抗体、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法および抗転移薬
、および免疫治療薬（特異的アプローチおよび非特異的アプローチの両方が含まれる）が
含まれるが、これらに限定されない）の投与を単にいう。
結果の組み合わせが各処置（例えば、ＡＤＣおよび抗癌剤）を個別に行った場合に認め
られる効果の和である必要はない。少なくとも相加効果が得られるのが一般に望ましいが
、各治療の１つを超える抗腫瘍効果のいかなる増加も有利である。さらに、本発明は、処
置の組み合わせによって相乗効果を示す必要はない。しかし、当業者は、好ましい実施形
態を含む一定の選択された組み合わせを使用して相乗効果が認められ得ると認識するであ
ろう。
併用療法の実施において、ＤＬＬ３コンジュゲートおよび抗癌剤を、被験体に、単一の
組成物または同一または異なる投与経路を使用した２つ以上の個別の組成物として同時に
投与することができる。あるいは、ＡＤＣは、例えば、数分から数週間の範囲の間隔で抗
癌剤処置の前または後に投与することができる。各送達の間の時間は、抗癌剤およびコン
ジュゲートが腫瘍に組み合わせ効果を発揮することができる時間である。少なくとも１つ
の実施形態では、抗癌剤およびＡＤＣの両方を、相互に約５分〜約２週間以内に投与する
。さらに他の実施形態では、ＤＬＬ３ ＡＤＣと抗癌剤との間の投与を、数日間（２、３
、４、５、６、または７日間）、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）
、または数ヶ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８ヶ月間）あけることができる
。
併用療法を、１回、２回、または少なくとも容態が処置、軽減、または治癒されるまで
の期間施すことができる。いくつかの実施形態では、併用療法を、複数回（例えば、１日
３回から６ヶ月毎に１回まで）施す。スケジュール通りに（１日３回、１日２回、１日１
回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月毎に１回、２
ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回など）投与することができ、ミニポンプ
を介して連続的に投与することができる。併用療法を、前述のように任意の経路で施すこ
とができる。併用療法を、腫瘍部位から離れた部位に施すことができる。
１つの実施形態では、ＡＤＣを、１つ以上の抗癌剤と組み合わせて短い処置サイクルに
て必要とする被験体に投与する。本発明はまた、不連続な投与またはいくつかの部分的投
与に分割された１日量を意図する。コンジュゲートおよび抗癌剤を、隔日または隔週で交
換可能に投与することができるか、一連の抗体処置を行い、その後に抗癌剤治療の１つ以
上の処置を行うことができる。いずれにしても、当業者によって理解されるように、化学
療法薬および開示のコンジュゲートの適切な用量は、一般に、およそ、化学療法薬を単独
または他の化学療法薬と組み合わせて投与する臨床治療で既に使用されている用量であろ
う。
別の好ましい実施形態では、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートを維持療法で使用して、
疾患の初期症状後の腫瘍再発の機会を軽減または排除することができる。好ましくは、障
害が処置されて最初の腫瘍塊が排除、軽減、または改善され、それにより、患者が無症候
期にあるか、寛解期にあるであろう。そのような時に標準的な診断手順を使用して疾患が
ほとんどまたは全く示されない場合でさえ被験体に薬学的有効量の開示のＤＬＬ３コンジ
ュゲートを１回以上投与することができる。いくつかの実施形態では、ＡＤＣを、標準的
なスケジュール通りに一定期間（毎週、２週間毎、毎月、６週間毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎
、６ヶ月毎、または毎年など）にわたって投与するであろう。本明細書中の教示を考慮す
ると、当業者は、疾患の再発可能性を低下させるのに好ましい投薬量および投与レジメン
を容易に決定することができる。さらに、かかる処置を、患者の応答ならびに臨床パラメ
ータおよび診断パラメータに応じて、数週間、数ヶ月、数年、または不確定の期間にわた
って継続することができる。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣを予防的またはアジュバント治療と
して使用して、減量手順後の腫瘍転移の可能性を防止または低下させることができる。本
開示で使用する場合、「減量手順」を広義で定義し、腫瘍または腫瘍増殖を排除、軽減、
処置、または改善する任意の手順、技術、または方法を意味するものとする。例示的な減
量手順には、手術、放射線処置（すなわち、ビーム放射）、化学療法、免疫療法、または
切除が含まれるが、これらに限定されない。本開示を考慮して当業者によって容易に決定
された適切な回数で、開示のＡＤＣを、腫瘍転移を軽減するための臨床的手順、診断的手
順、またはセラグノスティック手順によって提案されるように投与することができる。コ
ンジュゲートを、標準的な技術を使用して決定された薬学的に有効な投薬量で１回以上投
与することができる。好ましくは、投与レジメンを、修正が可能な適切な診断技術または
モニタリング技術によって実施するであろう。
本発明のさらに他の実施形態は、無症候性であるが増殖性障害の発症リスクのある被験
体に開示のＤＬＬ３コンジュゲートを投与する工程を含む。すなわち、本発明のコンジュ
ゲートを、真に防止の意味で使用し、検査または試験されて１つ以上の顕著なリスク因子
（例えば、ゲノム上の表示、家族歴、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験結
果など）を有するが、新形成を発症していない患者に投与することができる。そのような
場合、当業者は、経験的観察または許可された臨床行為によって有効な投与レジメンを決
定することができるであろう。
４．抗癌剤
本出願と通して考察されるように、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートを、抗癌剤と組み
合わせて使用することができる。用語「抗癌剤」または「抗増殖剤」は、癌などの細胞増
殖性障害を処置するために使用することができる任意の薬剤を意味し、細胞毒性薬、細胞
増殖抑制薬、抗血管新生薬、減量剤、化学療法薬、放射線療法および放射線治療薬、標的
抗癌剤、ＢＲＭ、治療抗体、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法薬、
抗転移薬、ならびに免疫治療薬が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、用語「細胞毒性薬」は、細胞に有毒であり、細胞の機能を
低下または阻害し、そして／または細胞を破壊する物質を意味する。一定の実施形態では
、物質は生きている生物由来の天然に存在する分子である。細胞毒性薬の例には、以下由
来の小分子毒素または酵素活性毒素が含まれるが、これらに限定されない：細菌（例えば
、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ
）、真菌（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシ
ン、モデッシン、ビスキュミン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、
ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄ
ｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａタン
パク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリインヒビター、クルシン
、クロチン、サボンソウインヒビター、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、フェ
ノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物（例えば、細胞傷害性Ｒ
Ｎアーゼ（細胞外膵ＲＮアーゼなど）；ＤＮアーゼＩ（そのフラグメントおよび／または
バリアントが含まれる））。
本発明の目的のために、「化学療法薬」は、癌細胞の成長、増殖、および／または生存
を非特異的に減少または阻害する化合物（例えば、細胞傷害薬または細胞増殖抑制薬）を
含む。かかる化学物質は、しばしば、細胞の成長または分裂に必要な細胞内プロセスに関
連し、したがって、一般に成長および分裂が急速な癌性細胞に対して特に有効である。例
えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合し、したがって、細胞が有糸分裂に入るのを阻
害する。一般に、化学療法薬には、癌性細胞または癌性になるか腫瘍形成性の子孫（例え
ば、ＴＩＣ）を生成する可能性が高い細胞を阻害するか阻害するようにデザインされた任
意の化学物質が含まれ得る。かかる薬剤をしばしば投与し、かかる薬剤は、しばしば、組
み合わせて（例えば、ＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンで）最も有効である
。
本発明のＤＬＬ３ ＡＤＣと組み合わせて使用することができる抗癌剤の例には、アル
キル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチラメラミン、ア
セトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプ
トフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エロイテロビン、パンクラチスタチン
、サルコジクチイン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジ
イン抗生物質、ジネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジ
イン抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシ
ン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カク
チノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、
ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノル
ロイシン、アドリアマイシン（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン
、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシ
ン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマ
イシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニ
メクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、エルロチニブ、ベムラフェニブ、ク
リゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸アナログ、プリンアナ
ログ、アンドロゲン、抗副腎剤、葉酸補充物（フォリン酸など）、アセグラトン、アルド
ホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラ
ブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン
、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルニチン、エリプチニウムアセタート、エポチ
ロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、マイ
タンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペン
トスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エ
チルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカリド複合体（ＪＨＳ
Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；
シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−ト
リクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジン
Ａ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミ
トブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ
−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａ
ｎｂｕｃｉｌ）；ジェムザール（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプ
トプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ
−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（登録商
標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；ア
ミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰ
Ｔ−１１）、トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチル（ｍｅｔ
ｌｈｙｌ）オルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン
；オキサリプラチン；ＰＫＣ−αのインヒビター、細胞増殖を減少させるＲａｆ、Ｈ−Ｒ
ａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ−Ａ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る
塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍のホルモン作用を調節
または阻害するように作用する抗ホルモン剤（抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン
受容体調節因子、酵素アロマターゼを阻害し、副腎内でのエストロゲン産生を調節するア
ロマターゼインヒビター、ならびに抗アンドロゲンなど）；ならびにトロキサシタビン（
１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド、リボザイム（ＶＥＧＦ発現インヒビターおよびＨＥＲ２発現インヒビターなど）；ワ
クチン、プロリュウキン（登録商標）ｒＩＬ−２；ルルトテカン（登録商標）トポイソメ
ラーゼ１インヒビター；アバレリクス（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペ
ラミシン、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体もこの
定義に含まれる。
特に好ましい抗癌剤は、エルロチニブ（タルセバ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／
ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（タキソテール（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａ
ｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１
−２１−８）、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２
５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ
−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチ
ン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂ
ｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ
．Ｊ．）、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾ
ロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ（ｐｅｎｔ
ａｚａｂｉｃｙｃｌｏ）［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミ
ド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、テモダール（ＴＥＭＯＤＡＲ）（登録商標）、テ
モダル（ＴＥＭＯＤＡＬ）（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシ
フェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブト−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ
，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ノルバデックス（登録商標）、イツバル（登録商標）、バ
ロデックス（登録商標））、およびドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））な
どの市販されているまたは臨床的に利用可能な化合物を含む。さらなる市販されているか
臨床的に利用可能な抗癌剤は、オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標）、Ｓａｎｏ
ｆｉ）、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．
）、スーテント（スニチニブ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾ
ール（フェマラ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（グリベック（
登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋインヒビター、Ｅｘｅｌｉｘｉ
ｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋインヒビター、ＡＺＤ６
２４４、Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２
６（ＰＩ３Ｋインヒビター、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｂ
ＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋインヒビター、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋイ
ンヒビター、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉ
ｓ）、フルベストラント（ファスロデックス（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、
ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ラパミューン（登録商標）、
Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（タイカーブ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ
Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（サラサル（商標）、ＳＣＨ ６６３３６
、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標）、ＢＡ
Ｙ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、Ａ
ｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（カンプトサー（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐ
ｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ザルネストラ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ）、アブラキサン（商標）（クレモフォールフリー）、パクリタキセルのアルブミ
ン操作ナノ粒子処方物（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎ
ｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ザク
チマ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｍｂｕ
ｃｉｌ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリム
ス（トーリセル（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉ
ｎｅ）、カンフォスファミド（テルシタ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパおよびシ
クロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（サイトキサン（登録商標）
、ネオサル（登録商標））；ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））；カペシタビン（
ゼローダ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標）が
含まれる）；クエン酸タモキシフェン、フェアストン（登録商標）（クエン酸トレミフェ
ン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ））、メガセ（登録商標）（酢酸メゲストロ
ール）、アロマシン（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン（ｆ
ｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、リビサー（登録商標）（ボロゾール）、フェ
マラ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、およびアリミデックス（登録商
標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
他の実施形態では、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートを、現在臨床試験で利用可能であ
るか市販されている多数の抗体（または免疫治療薬）のいずれか１つと組み合わせて使用
することができる。この目的を達成するために、開示のＤＬＬ３コンジュゲートを、アバ
ゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシ
マブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、
ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セ
ツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツム
マブ、ドロジツマブ、ズリゴツマブ、ズシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツ
ズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタ
ラシズマブ、ファーレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、
フツキジマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブ
リツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツ
ムマブ、イプリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、
ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモ
マブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモ
ツズマブ、ノフェツモマブン、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナル
ツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマ
ブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラムシ
ルマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブ
ロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマ
ブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツ
コツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツム
マブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、およびその組み合わせからなる群から選択される抗体と組み合
わせて使用することができる。
さらなる他の特に好ましい実施形態は、試験においてか癌治療のために承認された抗体
（リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガムシン、アレムツズマブ、イブリ
ツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ラ
ムシルマブ、オファツムマブ、イプリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンが含まれ
るが、これらに限定されない）の使用を含むであろう。当業者は、本明細書中の教示に適
合するさらなる抗癌剤を容易に同定する事ができるであろう。
５．放射線療法
本発明はまた、ＤＬＬ３コンジュゲートの放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内の局所的
なＤＮＡ損傷の任意の誘導機構（γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、および電子放
出など）との組み合わせを提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達を使用した
併用療法も意図し、開示のコンジュゲートを、標的抗癌剤または他の標的手段と併せて使
用することができる。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間にわたってパルスを施
す。放射線療法を、頭頸部癌を有する被験体に約６〜７週間施すことができる。任意選択
的に、放射線療法を、単回線量としてか、複数回線量としてか、連続的線量として施すこ
とができる。
ＶＩＩ．適応症
本発明のＡＤＣを使用して、任意のＤＬＬ３関連障害の発症または再発を処置、防止、
管理、または阻害することができると認識されるであろう。したがって、単独で投与する
か抗癌剤または放射線療法と組み合わせて、本発明のＡＤＣは、患者または被験体におけ
る新生物容態（良性腫瘍または悪性腫瘍（例えば、副腎、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、腎臓、膀
胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、甲状腺、肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）、
子宮頸部、子宮内膜、食道、および子宮の癌腫；肉腫；膠芽細胞腫；および種々の頭頸部
腫瘍）；白血病およびリンパ系悪性疾患；他の障害（ニューロン、膠細胞、星状膠細胞、
視床下部および他の腺、貪食細胞、上皮、間質、および肺胞腔の障害など）；ならびに炎
症性障害、血管新生障害、免疫学的障害、および病原体に原因する障害が含まれ得る）の
一般的な処置に特に有用である。特に、処置のための重要な標的は固形腫瘍を含む新生物
容態であるが、血液悪性疾患が本発明の範囲内に含まれる。
用語「処置」は、本明細書中の容態処置の文脈で使用する場合、一般に、いくつかの所
望の治療効果（例えば、容態進行の抑制（進行速度の低下、進行速度の停止、容態の退行
、容態の改善、および容態の治癒が含まれる））が達成されるヒトまたは動物（例えば、
獣医学的適用における）のいずれかにおける処置または治療に関連する。予防的手段（す
なわち、予防、防止）としての処置も含まれる。
用語「治療有効量」は、本明細書中で使用する場合、所望の治療レジメンに従って投与
した場合に妥当な利益／リスク比に見合ういくつかの所望の治療効果を得るのに有効な活
性化合物（すなわち、材料）の量、活性化合物の組成、または活性化合物を含む投薬量に
関連する。
同様に、用語「予防有効量」は、本明細書中で使用する場合、所望の治療レジメンに従
って投与した場合に妥当な利益／リスク比に見合ういくつかの所望の予防効果を得るのに
有効な活性化合物（すなわち、材料）の量、活性化合物の組成、または活性化合物を含む
投薬量に関連する。
より具体的には、本発明の処置を受ける新生物容態を、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連癌、胞
状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱癌（扁平上皮癌および移行上皮癌）、骨の癌（アダマン
チノーマ、静脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳
癌、頚動脈小体腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸
癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング
腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉ
ｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、骨の線維性異形成、胆嚢および胆管の癌、消化管
絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部癌、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌（腎芽腫、乳頭状腎
細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓癌（
肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺腫、扁平上皮癌、大細胞癌など）、
髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ
ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌
腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細
胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後ブドウ膜黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ ｕｎｖｅａｌ
ｍｅｌａｎｏｍａ）、希少な血液学的障害、腎転移癌、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、
肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、睾丸癌、胸腺癌、胸腺腫、
甲状腺転移癌、および子宮癌（子宮頸部、子宮内膜癌、および平滑筋腫の腺癌）が含まれ
るが、これらに限定されない群から選択することができる。
一定の好ましい実施形態では、増殖性障害は、固形腫瘍（副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳
房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞および非小
細胞の両方）、甲状腺、腺癌、肉腫、膠芽細胞腫、および種々の頭頸部の腫瘍が含まれる
が、これらに限定されない）を含むであろう。他の好ましい実施形態では、以下の実施例
に示すように、開示のＡＤＣは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ
Ｃ）（例えば、扁平細胞非小細胞肺癌または扁平細胞小細胞肺癌）の処置に特に有効であ
る。１つの実施形態では、肺癌は、難治性を示すか、再発性を示すか、または白金ベース
の薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）およ
び／またはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、またはカ
バジタキセル）に抵抗性を示す。
特に好ましい実施形態では、開示のＡＤＣを使用して小細胞肺癌を処置することができ
る。かかる実施形態に関して、コンジュゲートされたモジュレーターを、限局期疾患を示
す患者に投与することができる。他の実施形態では、開示のＡＤＣを、進行期疾患を示す
患者に投与するであろう。他の好ましい実施形態では、開示のＡＤＣを、難治性患者（す
なわち、一連の初期治療中または完了直後に再発した患者）または再発性小細胞肺癌患者
に投与するであろう。さらに他の実施形態は、感受性患者（すなわち、一次治療後２〜３
ヶ月を超えてから再発する患者）への開示のＡＤＣの投与を含む。いずれの場合にも、適
合するＡＤＣを、選択した投与レジメンおよび臨床診断に応じて他の抗癌剤と組み合わせ
て使用することができると認識されるであろう。
上記で考察するように、開示のＡＤＣをさらに使用して、神経内分泌性の特徴または表
現型を有する腫瘍（神経内分泌腫瘍が含まれる）を防止、処置、または診断することがで
きる。分散内分泌系から生じる真性またはカノニカルな神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は比較
的稀であり、発生頻度は１００，０００人あたり２〜５人であるが、侵襲性が高い。神経
内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、胃
腸管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺癌）、および肺（小細胞性肺癌および大細胞神経
内分泌癌）で生じる。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として公知の消耗性の症状を
生じ得るいくつかのホルモン（セロトニンおよび／またはクロモグラニンＡが含まれる）
を分泌し得る。かかる腫瘍を、陽性免疫組織化学的マーカー（ニューロン特異性エノラー
ゼ（ＮＳＥ、γエノラーゼとしても公知、遺伝子記号＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６（またはＮ
ＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、およびシナプトフィシン（ＳＹＰ）など）
または発現の増加が公知の遺伝子（ＡＳＣＬ１など）によって示すことができる。不運な
ことに、伝統的な化学療法は、ＮＥＴ処置において特に有効というわけではなく、肝臓転
移が一般的な結果である。
神経内分泌腫瘍の処置のために開示のＡＤＣを有利に使用することができる一方で、開
示のＡＤＣを、カノニカルな神経内分泌腫瘍に共通の形質を遺伝子型的または表現型的に
模倣するか、似ているか、示す偽神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）を処置、防止、または診断
するために使用することもできる。偽神経内分泌腫瘍または神経内分泌性の特徴を有する
腫瘍は、広範性神経内分泌系の細胞または神経内分泌分化カスケードが発癌過程中に異常
に再活性化された細胞から生じる腫瘍である。かかるｐＮＥＴは、伝統的に定義された神
経内分泌腫瘍と一定の表現型の特徴または生化学的な特徴（生物学的に活性なアミン、神
経伝達物質、およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力が含まれる）を共有す
る。組織学的に、かかる腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、細胞病理が緩和な最小の細胞
質および円形から卵形の斑点のある核を有する密接に連結した小細胞をしばしば示す外観
を共有する。本発明の目的のために、神経内分泌腫瘍および偽神経内分泌腫瘍を定義する
ために使用することができる共通に発現する組織学的マーカーまたは遺伝子マーカーには
、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１、および
ニューロン特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本発明のＡＤＣを、偽神経内分泌腫瘍およびカノニカルな神経内分泌腫瘍
の両方を処置するために有利に使用することができる。これに関して、ＡＤＣを、本明細
書中に記載のように、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜
）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺癌）、および肺（小細胞性肺癌および大細
胞神経内分泌癌）に生じる神経内分泌腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴの両方）を処置するた
めに使用することができる。さらに、本発明のＡＤＣを、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフ
ィシン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１、およびＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）からなる群
から選択される１つ以上のマーカーを発現する腫瘍を処置するために使用することができ
る。すなわち、本発明を、ＮＳＥ＋、ＣＤ５６＋、ＰＧＰ９．５＋、ＡＳＣＬ１＋、ＳＹ
Ｐ＋、ＣＨＧＡ＋、またはそのいくつかの組み合わせである腫瘍を罹患した被験体を処置
するために使用することができる。
血液悪性疾患に関して、本発明の化合物および方法が、種々のＢ細胞リンパ腫（低悪性
度／ＮＨＬ濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大
細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中
悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪
性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ワルデンシュトレームマクログロブリ
ン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞
性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ
）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、小リン
パ球性、濾胞性、びまん性巨大細胞、びまん性小開裂細胞、大細胞型免疫芽球性リンパ芽
球腫、小型非開裂細胞性・バーキット型および非バーキット型、濾胞性大細胞優位型；濾
胞性・小開裂細胞優位型；および濾胞性・小開裂細胞大細胞混合型のリンパ腫が含まれる
）の処置で特に有効であり得ることがさらに認識されるであろう。Ｇａｉｄｏｎｏら，“
Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ”，ＩＮ ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＆ ＰＲＡＣＴＩ
ＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２：２１３１−２１４５（ＤｅＶｉｔａら，ｅ
ｄｓ．，５．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．１９９７）を参照のこと。これらのリンパ腫がしばし
ば分類系の変更によって異なる名称を有すること、および、異なる名称に分類されたリン
パ腫患者も本発明の併用治療レジメンから利益を得ることができることが当業者に明白な
はずである。
本発明はまた、良性腫瘍または前癌性腫瘍を有する被験体の防止的または予防的な処置
を提供する。ＤＬＬ３関連障害の範囲外で、腫瘍または増殖性障害の任意の特定のタイプ
が本発明を使用した処置から除外されると考えるべきではない。しかし、腫瘍細胞型は、
二次治療薬、特に、化学療法薬および標的抗癌剤と組み合わせた本発明の使用に関連し得
る。
好ましくは、処置すべき「被験体」または「患者」はヒトであるが、本明細書中で使用
する場合、この用語は、明確に全ての哺乳動物が含まれる任意の種を含むものとする。し
たがって、被験体／患者は、動物、哺乳動物、有胎盤哺乳動物、有袋類（例えば、カンガ
ルー、ウォンバット）、単孔類（例えば、カモノハシ）、げっ歯類（例えば、モルモット
、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えば、マウス）、ウサギ目（例えば、ウ
サギ）、鳥類（例えば、トリ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科の動物（例えば、
ネコ）、ウマ属（例えば、ウマ）、イノシシ科（例えば、ブタ）、ヤギ亜科（例えば、ヒ
ツジ）、ウシ科（例えば、ウシ）、霊長類、類人猿（例えば、サルまたは類人猿）、サル
目（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウ
ータン、テナガザル）、またはヒトであり得る。
ＶＩＩＩ．製品
１つまたは複数の容器を含み、１つまたは複数の用量のＤＬＬ３ ＡＤＣを含む薬学的
パックおよびキットも提供する。一定の実施形態では、単位投薬量を提供し、前記単位投
薬量は、所定量の、例えば、１つ以上のさらなる薬剤を含むか含まない抗ＤＬＬ３コンジ
ュゲートを含む組成物を含む。他の実施形態について、かかる単位投薬量を、注射用の使
い捨ての予め充填したシリンジで供給する。さらなる他の実施形態では、単位投薬量に含
まれる組成物は、生理食塩水またはスクロースなど；リン酸緩衝液などの緩衝液を含むこ
とができ、そして／または安定且つ有効なｐＨ範囲内で処方することができる。あるいは
、一定の実施形態では、コンジュゲート組成物を、適切な液体（例えば、滅菌水または生
理食塩水）の添加によって再構成することができる凍結乾燥粉末として提供することがで
きる。一定の好ましい実施形態では、組成物は、タンパク質凝集を阻害する１つ以上の物
質（スクロースおよびアルギニンが含まれるが、これらに限定されない）を含む。容器上
または容器に付随する任意のラベルは、封入したコンジュゲート組成物が選択した新生物
疾患の処置のために使用されることを示す。
本発明はまた、ＤＬＬ３コンジュゲートおよび、任意選択的に、１つ以上の抗癌剤の単
回投与単位または複数回投与単位を得るためのキットを提供する。キットは、容器および
容器上または容器に付随されたラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、
ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の種
々の材料から形成することができ、コンジュゲート化形態または非コンジュゲート化形態
の薬学的有効量の開示のＤＬＬ３コンジュゲートを含むことができる。他の好ましい実施
形態では、容器は、滅菌アクセスポートを含む（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまた
は皮下組織注射針によって突き刺すことができるストッパーを有するバイアルであり得る
）。かかるキットは、一般に、適切な容器中にＤＬＬ３コンジュゲートの薬学的に許容さ
れ得る処方物を含み、そして、任意選択的に、同一または異なる容器中に１つ以上の抗癌
剤を含むであろう。キットはまた、診断または併用治療のいずれかのための他の薬学的に
許容され得る処方物を含むことができる。例えば、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートに加
えて、かかるキットは、任意の１つ以上の一定範囲の抗癌剤（化学療法薬または放射線療
法薬など）；抗血管新生薬；抗転移薬；標的抗癌剤；細胞毒性薬；および／または他の抗
癌剤を含むことができる。
より詳細には、キットは、さらなる成分を含むか含まずにＤＬＬ３ ＡＤＣを含む単一
の容器を有することができるか、キットは、所望の各薬剤のための個別の容器を有し得る
。コンジュゲート化のために組み合わせ治療を提供する場合、モル当量の組み合わせまた
は一方の成分が他方の成分を超えた組み合わせのいずれかで単一の溶液に予め混合するこ
とができる。あるいは、キットのＤＬＬ３コンジュゲートおよび任意の選択的抗癌剤を、
患者への投与前に個別の容器内に分けて維持することができる。キットはまた、無菌の薬
学的に許容され得る緩衝液または他の希釈剤（静菌性の注射用蒸留水（ＢＷＦＩ）、リン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、およびデキストロース溶液など）を含めるた
めの第２／第３の容器手段を含むことができる。
キットの構成要素が１つ以上の溶液で提供される場合、溶液は水溶液であることが好ま
しく、滅菌の水溶液または生理食塩水が特に好ましい。しかし、キットの構成要素を、乾
燥粉末として提供することができる。試薬または構成要素を乾燥粉末として提供する場合
、粉末を、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒を別の容器中に提供
することもできることが想定される。
上記で簡潔に示されるように、キットはまた、動物または患者に抗体コンジュゲートお
よび任意の選択的な成分を投与する手段（例えば、処方物を動物に注射または導入するか
身体の罹患領域に適用することができる１つ以上の針、Ｉ．Ｖ．バッグもしくはシリンジ
、さらには点眼器、ピペット、または他の類似の装置）を含むことができる。本発明のキ
ットはまた、典型的には、バイアルまたはそれに類似するものおよび他の構成要素を販売
のために厳重に封じ込めるための手段（例えば、所望のバイアルおよび他の装置を入れて
保持する射出成形または吹出し成形されたプラスチック製容器など）を含むであろう。任
意のラベルまたは添付文書は、ＤＬＬ３コンジュゲート組成物を癌（例えば、小細胞肺癌
）の処置のために使用することを示す。
他の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、増殖性障害の防止または処置
に有用な診断用または治療用のデバイスと併せて使用することができるか、含むことがで
きる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の化合物および組成物を、増殖性障害の病
因学または発現に関与する細胞またはマーカー化合物を検出、モニタリング、定量、また
はプロファイリングするために使用することができる一定の診断用のデバイスまたは装置
と組み合わせることができる。選択された実施形態のために、マーカー化合物は、ＮＳＥ
、ＣＤ５６、シナプトフィシン、クロモグラニンＡ、およびＰＧＰ９．５を含むことがで
きる。
特に好ましい実施形態では、デバイスを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏのいずれかで循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量することがで
きる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１（本明細書中で参考として援用される）を
参照のこと）。さらなる他の好ましい実施形態では、上記で考察するように、循環腫瘍細
胞は癌幹細胞を含み得る。
ＩＸ．配列表のまとめ
いくつかの核酸およびアミノ酸配列を含む配列表を本出願に添付する。以下の表２は、
配列表内に含まれる配列のまとめである。
Figure 2019069983
Figure 2019069983
Ｘ．雑則
本明細書中で別途定義がない限り、本発明と併せて使用される科学用語および技術用語
は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、他で文脈に
よって必要とされない限り、単数形の用語には複数形の用語が含まれ、複数形の用語には
単数形の用語が含まれるものとする。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の
範囲で使用する場合、文脈上そうでないと明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ
」、および「ｔｈｅ」には、複数形が含まれる。したがって、例えば、「タンパク質」と
いう言及には複数のタンパク質が含まれ、「細胞」には細胞混合物などが含まれる。さら
に、本明細書および添付の特許請求の範囲で提供した範囲には、両方の終点および終点の
間の全てのポイントが含まれる。したがって、２．０〜３．０の範囲には、２．０、３．
０、および２．０と３．０との間の全てのポイントが含まれる。
一般に、本明細書中に記載の細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、
遺伝学、タンパク質化学、核酸化学、およびハイブリッド形成と併せて使用される命名法
およびこれらの技術は、当該分野で周知であり、且つ一般に使用されている。本発明の方
法および技術は、一般に、他で示さない限り、当該分野で周知の従来の方法にしたがって
、本明細書全体で引用および考察された種々の一般的およびより詳細な文献に記載のよう
に行う。例えば、Ａｂｂａｓら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（２０
１０）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２
）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）
；およびＣｏｌｉｇａｎら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照の
こと。酵素反応および精製技術を、製造者の仕様書にしたがって、当該分野で一般に実施
されているか本明細書中に記載のように行う。本明細書中に記載の分析化学、合成有機化
学、医薬品化学、ならびに製薬化学と合わせて使用した命名法、およびこれらの実験手順
および実験技術は当該分野で周知であり、一般に使用されている。さらに、本明細書中で
使用した任意の見出しは、整理のみを目的とし、記載の主題を制限すると解釈すべきでは
ない。
以下の一定の略語を本明細書中で使用する。
Ａｃ アセチル
Ａｃｍ アセトアミドメチル
Ａｌｌｏｃ アリルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート
ｔ−Ｂｕ ｔｅｒｔ−ブチル
Ｂｚｌ ベンジル。ここで、Ｂｚｌ−ＯＭｅはメトキシベンジルであり、Ｂｚ
ｌ−Ｍｅはメチルベンゼンである。
ＣｂｚまたはＺ ベンジルオキシ−カルボニル。ここで、Ｚ−ＣｌおよびＺ−Ｂｒは、
それぞれ、クロロ−およびブロモベンジルオキシカルボニルである。
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｄｎｐ ジニトロフェニル
ＤＴＴ ジチオトレイトール
Ｆｍｏｃ ９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル
ｉｍｐ Ｎ−１０イミン保護基：３−（２−メトキシエトキシ）プロパノアート
−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ ＭＣ−ＯＳｕマレイミドカプロイル−Ｏ−Ｎ−スクシンイミ
ド
Ｍｏｃ メトキシカルボニル
ＭＰ マレイミドプロパンアミド
Ｍｔｒ ４−メトキシ−２，３，６−トリメチル（ｔｒｉｍｅｔｈｔｙｌ）ベン
ゼンスルホニル
ＰＡＢ ｐａｒａ−アミノベンジルオキシカルボニル
ＰＥＧ エチレンオキシ
ＰＮＺ ｐ−ニトロベンジルカルバマート
Ｐｓｅｃ ２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル
ＴＢＤＭＳ ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＢＤＰＳ ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
Ｔｅｏｃ ２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル
Ｔｏｓ トシル
Ｔｒｏｃ ２，２，２−トリクロルエトキシカルボニルクロリド
Ｔｒｔ トリチル
Ｘａｎ キサンチル
したがって、上に一般に記載される本発明は、以下の実施例を参照してより深く理解さ
れるであろう。実施例は、例示として提供され、本発明の制限を意図しない。実施例は、
以下の実験が全てであることや以下の実験のみを行ったことを示すことを意図しない。他
の意味を示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏
であり、圧力は大気圧または大気圧の近似値である。
実施例１
ＰＢＤ薬物−リンカー化合物の作製
ＰＢＤ薬物−リンカー化合物ＤＬ１〜ＤＬ５を以下のように合成した。
Ａ．一般的な実験方法
旋光度をＡＤＰ２２０旋光計（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｌｔｄ．）で
測定し、濃度（ｃ）をｇ／１００ｍＬで示す。融点を、デジタル融点装置（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｔｈｅｒｍａｌ）を使用して測定した。ＩＲスペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ １０００ ＦＴ ＩＲ分光計で記録した。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲ
スペクトルを、それぞれ４００ＭＨｚおよび１００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ
ＮＭＲ分光計を使用して３００Ｋで得た。化学シフトをＴＭＳ（δ＝０．０ｐｐｍ）と
比較して報告し、シグナルをｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット
）、ｄｔ（ダブルトリプレット）、ｄｄ（ダブレットオブダブレット）、ｄｄｄ（ダブル
ダブレットオブダブレット）、またはｍ（マルチプレット）と命名し、結合定数をＨｅｒ
ｔｚ（Ｈｚ）で示す。質量分析（ＭＳ）データを、Ｗａｔｅｒｓ ２９９６ ＰＤＡを備
えたＷａｔｅｒｓ ２６９５ ＨＰＬＣに接続したＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ
ＺＱ装置を使用して取得した。使用したＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱパラメ
ータは以下であった：キャピラリ（ｋＶ）、３．３８；コーン（Ｖ）、３５；エキストラ
クタ（Ｖ）、３．０；ソース温度（℃）、１００；脱溶媒和温度（℃）、２００；コーン
流速（Ｌ／ｈ）、５０；脱溶媒和流速（Ｌ／ｈ）、２５０。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ
）データを、装置内にサンプルを導入するための金属コーティングした硼珪酸ガラスチッ
プを使用したＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＱＴＯＦ Ｇｌｏｂａｌにてポジティ
ブＷ−モードで記録した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）をシリカゲルアルミニウムプ
レート（Ｍｅｒｃｋ６０、Ｆ２５４）上で行い、フラッシュクロマトグラフィにはシリカ
ゲル（Ｍｅｒｃｋ６０、２３０−４００メッシュＡＳＴＭ）を利用した。ＨＯＢｔ（Ｎｏ
ｖａＢｉｏｃｈｅｍ）および固体支持試薬（Ａｒｇｏｎａｕｔ）を除き、全ての他の化学
物質および溶媒をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく供給
されたままで使用した。無水溶媒を、適切な乾燥剤の存在における乾燥窒素雰囲気下での
蒸留によって調製し、４Åモレキュラーシーブまたはナトリウムワイヤーによって保存し
た。石油エーテルは、沸点４０〜６０℃の画分をいう。
開示の化合物の生成では、ＬＣ／ＭＳを、２つのわずかに異なる手順を使用して行った
。デフォルト手順は、最初に記載した方法であり、他で示さない限り、これを使用した。
方法１（デフォルト法、他で示さない限りこれを使用した）−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５）を、水（Ａ）（ギ酸０．１％）およびアセトニトリル（Ｂ
）（ギ酸０．１％）の移動相を使用して運転した。勾配：最初の組成５％Ｂを１．０分間
にわたって保持し、次いで、５％Ｂから９５％Ｂに３分間にわたって増加させる。組成を
９５％Ｂで０．１分間保持し、ついで、５％Ｂに０．０３分間戻し、この組成で０．８７
分間保持する。総勾配時間運転時間は、５分間である。
方法２−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５）を、水（Ａ）（ギ酸
０．１％）およびアセトニトリル（Ｂ）（ギ酸０．１％）の移動相を使用して運転した。
勾配：最初の組成５％Ｂを１．０分間にわたって保持し、次いで、５％Ｂから９５％Ｂに
２．５分間にわたって増加させる。組成を０．５分間９５％Ｂで保持し、次いで、５％Ｂ
に０．１分間戻し、その組成で０．９分間保持する。総勾配時間運転時間は、５分間であ
る。
両方の方法について、流速は３．０ｍＬ／分であり、ゼロデッドボリュームのＴ字型の
部品によって４００μＬに分割し、質量分析計を通過させた。波長検出範囲：２２０〜４
００ｎｍ。ファンクションタイプ：ダイオードアレイ（５３５スキャン）。カラム：Ｐｈ
ｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｏｎｙｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃ１８ ５０×４．６０ｍｍ。
逆相フラッシュ精製条件は以下であった：Ｆｌａｓｈ精製システム（Ｖａｒｉａｎ ９
７１−Ｆｐ）を、水（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）の移動相を使用して運転した。勾
配：最初の組成５％Ｂを２０Ｃ．Ｖ．（カラム体積）、次いで、５％Ｂから７０％Ｂを６
０Ｃ．Ｖ．以内。組成を９５％Ｂで１５Ｃ．Ｖ．で保持し、次いで、５％Ｂに５Ｃ．Ｖ．
戻し、５％Ｂで１０Ｃ．Ｖ．保持した。総勾配運転時間は１２０Ｃ．Ｖ．である。流速６
．０ｍＬ／分。波長検出範囲：２５４ｎｍ。カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＡＸ１３７２−１
ＳＦ１０−５．５ｇＣ８。
分取ＨＰＬＣを以下のように行った：逆相超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）を
、以下の寸法のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ５μＣ−１８カラムにて行っ
た：１５０×４．６ｍｍ（分析用）および１５０×２１．２０ｍｍ（分取用）。全ＵＰＬ
Ｃ実験を、勾配条件を使用して行った。使用した溶離液は、溶媒Ａ（０．１％ギ酸水溶液
）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸のＣＨ３ＣＮ溶液）であった。使用した流速は、１．０ｍ
ｌ／分（分析用）および２０．０ｍｌ／分（分取ＨＰＬＣ用）であった。２５４ｎｍおよ
び２８０ｎｍで検出した。
Ｂ．薬物−リンカーＤＬ１の合成（経路１）
Figure 2019069983
（ａ）１’，３’−ビス［２−メトキシ−４−（メトキシカルボニル）フェノキシ］プ
ロパン（３）
ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（７１．３ｍＬ、７３．２ｇ、３６２ｍｍｏｌ
）を、６０分間にわたってバニリン酸メチル２（６０．０ｇ、３２９ｍｍｏｌ）およびＰ
ｈ３Ｐ（１２９．４ｇ、４９４ｍｍｏｌ）を含む無水ＴＨＦ（８００ｍＬ）のオーバーヘ
ッドスタラーで撹拌した溶液に０〜５℃（氷／アセトン）で窒素雰囲気下にて滴下した。
反応混合物を、０〜５℃でさらに１時間撹拌し、その後に１，３−プロパンジオール（１
１．４ｍＬ、１２．０ｇ、１５８ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１２ｍＬ）の溶液を、２０分
間にわたって滴下した。反応混合物を室温に加温し、５日間撹拌した。得られた白色沈殿
３を、真空濾過によって回収し、ＴＨＦで洗浄し、真空デシケーターで恒量まで乾燥させ
た。収量＝５４．７ｇ（１，３−プロパンジオールに基づいて８４％）。ＬＣ／ＭＳによ
って満足な純度を得た（３．２０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）４２７（［Ｍ＋Ｎａ］
＋．，１０）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．６４（ｄｄ，
２Ｈ， Ｊ ＝ １．８， ８．３ Ｈｚ）， ７．５４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １
．８ Ｈｚ）， ６．９３（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ４．３０（ｔ，
４Ｈ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ）， ３．９０（ｓ， ６Ｈ）， ３．８９（ｓ， ６
Ｈ）， ２．４０（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．
（ｂ）１’，３’−ビス［２−メトキシ−４−（メトキシカルボニル）−５−ニトロフ
ェノキシ］プロパン（４）
固体Ｃｕ（ＮＯ３）２．３Ｈ２Ｏ（８１．５ｇ、３３７．５ｍｍｏｌ）を、ビス−エス
テル３（５４．７ｇ、１３５ｍｍｏｌ）を含む無水酢酸（６５０ｍＬ）のオーバーヘッド
スタラーで撹拌したスラリーに０〜５℃（氷／アセトン）でゆっくり添加した。反応混合
物を０〜５℃で１時間撹拌し、次いで、室温に加温した。混合物の濃縮に伴って穏やかに
発熱し（約４０〜５０℃）、この段階でＮＯ２発生が認められた。さらなる無水酢酸（３
００ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を氷（約１．５
Ｌ）上に注ぎ、撹拌し、室温に戻した。得られた黄色沈殿を真空濾過によって回収し、デ
シケーターで乾燥させて、所望のビス−ニトロ化合物４を黄色固体として得た。収量＝６
６．７ｇ（１００％）。ＬＣ／ＭＳによって満足な純度を得た（３．２５分（ＥＳ＋）ｍ
／ｚ（相対強度）５１７（［Ｍ＋Ｎａ］＋．，４０）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）δ ７．４９（ｓ， ２Ｈ）， ７．０６（ｓ， ２Ｈ）， ４．３２（
ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）， ３．９５（ｓ， ６Ｈ）， ３．９０（ｓ，
６Ｈ）， ２．４５−２．４０（ｍ， ２Ｈ）．
（ｃ）１’，３’−ビス（４−カルボキシ−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）プ
ロパン（５）
メチルエステル４（６６．７ｇ、１３５ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（７００ｍＬ）のスラ
リーを１Ｎ ＮａＯＨ（７００ｍＬ）で処理し、反応混合物を室温で強く撹拌した。撹拌
４日後、スラリーは暗色溶液になり、これを減圧下での回転蒸発に供してＴＨＦを除去し
た。得られた水性残渣を濃ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、無色沈殿物５を回収し、真空オー
ブン（５０℃）で完全に乾燥させた。収量＝５４．５ｇ（８７％）。ＬＣ／ＭＳによって
満足な純度を得た（２．６５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）４８９（［Ｍ＋Ｎａ］＋．
，３０））；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．６２（ｓ，
２Ｈ）， ７．３０（ｓ， ２Ｈ）， ４．２９（ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ
）， ３．８５（ｓ， ６Ｈ）， ２．３０−２．２６（ｍ， ２Ｈ）．
（ｄ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス［（５−メトキシ
−２−ニトロ−１，４−フェニレン）カルボニル］］ビス［（２Ｓ，４Ｒ）−メチル−４
−ヒドロキシピロリジン−２−カルボキシラート］（６）
塩化オキサリル（２４．５ｍＬ、３５．６ｇ、２８１ｍｍｏｌ）を、ニトロ安息香酸５
（４３ｇ、９２．３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（６ｍＬ）を含む無水ＤＣＭ（６００ｍＬ）
の撹拌懸濁液に添加した。最初の発泡後、反応懸濁液は溶液になり、混合物を室温で１６
時間撹拌した。酸塩化物への変換を、反応混合物のサンプルのＭｅＯＨでの処理によって
確認し、得られたビス−メチルエステルがＬＣ／ＭＳによって認められた。溶媒の大部分
を減圧蒸発によって除去し、得られた濃縮液を、最少量の乾燥ＤＣＭに再溶解し、ジエチ
ルエーテルでトリチュレートした。得られた黄色沈殿物を濾過によって回収し、冷ジエチ
ルエーテルで洗浄し、真空オーブンにて４０℃で１時間乾燥させた。固体酸塩化物を、（
２Ｓ，４Ｒ）−メチル−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボキシラートヒドロクロリ
ド（３８．１ｇ、２１０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（６４．５ｍＬ、ｇ、４６３ｍｍｏｌ）
を含むＤＣＭ（４００ｍＬ）の撹拌懸濁液に−４０℃で（ドライアイス／ＣＨ３ＣＮ）２
５分間にわたって少しずつ添加した。ＬＣ／ＭＳによって判断したところ直ちに反応が完
了していた（２．４７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）７２１（［Ｍ＋Ｈ］＋．、１００
）。混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＨ
ＣＯ３（３００ｍＬ）、ブライン（４００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾
過し、溶媒を真空中で蒸発させて、純粋な生成物６を橙色固体として得た（６６．７ｇ、
１００％）。［α］２２ Ｄ ＝ −４６．１°（ｃ ＝ ０．４７， ＣＨＣｌ３）；１
Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）（回転異性体）δ ７．６３（ｓ， ２Ｈ
）， ６．８２（ｓ， ２Ｈ）， ４．７９−４．７２（ｍ， ２Ｈ）， ４．４９−４
．２８（ｍ， ６Ｈ）， ３．９６（ｓ， ６Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．
４６−３．３８（ｍ， ２Ｈ）， ３．０２（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １１．１ Ｈｚ）
， ２．４８−２．３０（ｍ， ４Ｈ）， ２．２９−２．０４（ｍ， ４Ｈ）；１３Ｃ
ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）（回転異性体）δ １７２．４， １６６．
７， １５４．６， １４８．４， １３７．２， １２７．０， １０９．７， １０
８．２， ６９．７， ６５．１， ５７．４， ５７．０， ５６．７， ５２．４，
３７．８， ２９．０；ＩＲ（ＡＴＲ， ＣＨＣｌ３）３４１０（ｂｒ）， ３０１０
， ２９５３， １７４１， １６２２， １５７７， １５１９， １４５５， １４
２９， １３３４， １２７４， １２１１， １１７７， １０７２， １０５０，
１００８， ８７１ ｃｍ−１；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）７２１（［Ｍ＋Ｈ］
＋．，４７），３８８（８０）；ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋．理論値Ｃ３１Ｈ３６Ｎ４Ｏ１６
ｍ／ｚ ７２１．２１９９，実測値（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ７２１．２２２７。
（ｅ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス（１１ａＳ，２Ｒ
）−２−（ヒドロキシ）−７−メトキシ−１，２，３，１０，１１，１１ａ−ヘキサヒド
ロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン−５，１１−ジオン］（
７）
方法Ａ：ニトロ−エステル６（４４ｇ、６１．１ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（２．８Ｌ
）の溶液を、新たに購入したＲａｎｅｙ（登録商標）ニッケル（約５０ｇの約５０％の水
性スラリー）および突沸防止顆粒を含む５Ｌの３口丸底フラスコに添加した。混合物を加
熱還流し、次いで、ヒドラジン水和物（２１．６ｍＬ、２２．２ｇ、６９３ｍｍｏｌ）を
含むＭｅＯＨ（２００ｍＬ）の溶液を滴下して処理し、この時点で激しい発泡が認められ
た。添加の完了後（約４５分）、さらなるＲａｎｅｙ（登録商標）ニッケルを発泡が終わ
るまで慎重に添加し、反応混合物の最初の黄色が脱色された。混合物をさらに５分間加熱
還流し、この時点でＴＬＣ（９０：１０ ｖ／ｖ ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）およびＬＣ／
ＭＳ（２．１２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５９７（［Ｍ＋Ｈ］＋．、１００））に
よって反応が完了していると考えられた。反応混合物を、直ちに真空吸引したセライトを
含む焼結漏斗によって加熱濾過した。濾液の体積を真空蒸発によって減少させ、その時点
で無色沈殿が形成され、これを濾過によって回収し、真空デシケーター中で乾燥させて７
を得た（３１ｇ、８５％）。［α］２７Ｄ ＝ ＋４０４°（ｃ ＝ ０．１０， ＤＭ
Ｆ）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １０．２（ｓ， ２Ｈ，
ＮＨ）， ７．２６（ｓ， ２Ｈ）， ６．７３（ｓ， ２Ｈ）， ５．１１（ｄ，
２Ｈ， Ｊ ＝ ３．９８ Ｈｚ， ＯＨ）， ４．３２−４．２７（ｍ， ２Ｈ），
４．１９−４．０７（ｍ， ６Ｈ）， ３．７８（ｓ， ６Ｈ）， ３．６２（ｄｄ，
２Ｈ， Ｊ ＝ １２．１， ３．６０ Ｈｚ）， ３．４３（ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
１２．０， ４．７２ Ｈｚ）， ２．６７−２．５７（ｍ， ２Ｈ）， ２．２６（
ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．９０ Ｈｚ）， １．９９−１．８９（ｍ， ２Ｈ）；１３
Ｃ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １６９．１， １６４．０， １
４９．９， １４４．５， １２９．８， １１７．１， １１１．３， １０４．５，
５４．８， ５４．４， ５３．１， ３３．５， ２７．５；ＩＲ（ＡＴＲ， ｎｅ
ａｔ）３４３８， １６８０， １６５４， １６１０， １６０５， １５１６， １
４９０， １４３４， １３７９， １２６３， １２３４， １２１６， １１７７，
１１５６， １１１５， １０８９， １０３８， １０１８， ９５２， ８７０
ｃｍ−１；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）６１９（［Ｍ＋Ｎａ］＋．，１０），５９
７（［Ｍ＋Ｈ］＋．，５２），４４５（１２），３２６（１１）；ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋
．理論値Ｃ２９Ｈ３２Ｎ４Ｏ１０ ｍ／ｚ ５９７．２１９１，実測値（ＥＳ＋）ｍ／ｚ
５９７．２２０５。
方法Ｂ：１０％Ｐｄ／Ｃ（７．５ｇ、１０％ｗ／ｗ）を含むＤＭＦ（４０ｍＬ）の懸濁
液を、ニトロ−エステル６（７５ｇ、１０４ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３６０ｍＬ）の溶
液に添加した。懸濁液を、Ｐａｒｒ水素化装置中で８時間にわたって水素化した。水素取
り込みの停止後、反応の進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。固体Ｐｄ／Ｃを濾
過によって除去し、濾液を４０℃での真空下での回転蒸発（１０ｍｂａｒ未満）によって
濃縮して、微量のＤＭＦおよび残存炭を含む暗色オイルを得た。残渣を水浴（ロータリー
エバポレーター浴）上でＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中にて４０℃で温浸し、得られた懸濁液
をセライトで濾過し、エタノール（５００ｍＬ）で洗浄して透明な濾液を得た。ヒドラジ
ン水和物（１０ｍＬ、３２１ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、反応混合物を加熱還流した。２
０分後、白色沈殿物の形成が認められ、還流をさらに３０分間継続した。混合物を室温に
冷却し、沈殿物を濾過によって回収し、ジエチルエーテル（沈殿物との体積比２：１）で
洗浄し、真空デシケーターで乾燥させて７を得た（５０ｇ、８１％）。方法Ｂの分析デー
タ：方法Ａで得られたデータ（旋光度、１Ｈ ＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳ、およびＴＬＣ）と同
一。
（ｆ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス（１１ａＳ，２Ｒ
）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−７−メトキシ−１，２，３，１０
，１１，１１ａ−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼ
ピン−５，１１−ジオン］（８）
ＴＢＳＣｌ（２７．６ｇ、１８２．９ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（２９．９ｇ、４
３８．８ｍｍｏｌ）を、テトララクタム７（２１．８ｇ、３６．６ｍｍｏｌ）を含む無水
ＤＭＦ（４００ｍＬ）の濁った溶液に０℃（氷／アセトン）で添加した。混合物を窒素雰
囲気下で３時間撹拌し、その後、ＬＣ／ＭＳ（３．９０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）
８２５（［Ｍ＋Ｈ］＋．、１００）によって判断したところ反応は完了しているようであ
った。反応混合物を氷上（約１．７５Ｌ）に注ぎ、撹拌しながら室温に加温した。得られ
た白色沈殿物を真空濾過によって回収し、Ｈ２Ｏ、ジエチルエーテルで洗浄し、真空デシ
ケーターで乾燥させて純粋な８を得た（３０．１ｇ、９９％）。［α］２３ Ｄ ＝ ＋２
３４°（ｃ ＝ ０．４１， ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣ
ｌ３）δ ８．６５（ｓ， ２Ｈ， ＮＨ）， ７．４４（ｓ， ２Ｈ）， ６．５４（
ｓ， ２Ｈ）， ４．５０（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．３８ Ｈｚ）， ４．２１−４
．１０（ｍ， ６Ｈ）， ３．８７（ｓ， ６Ｈ）， ３．７３−３．６３（ｍ， ４Ｈ
）， ２．８５−２．７９（ｍ， ２Ｈ）， ２．３６−２．２９（ｍ， ２Ｈ）， ２
．０７−１．９９（ｍ， ２Ｈ）， ０．８６（ｓ， １８Ｈ）， ０．０８（ｓ， １
２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ １７０．４， １６５．
７， １５１．４， １４６．６， １２９．７， １１８．９， １１２．８， １０
５．３， ６９．２， ６５．４， ５６．３， ５５．７， ５４．２， ３５．２，
２８．７， ２５．７， １８．０， −４．８２ ａｎｄ −４．８６；ＩＲ（ＡＴ
Ｒ， ＣＨＣｌ３）３２３５， ２９５５， ２９２６， ２８５５， １６９８， １
６９５， １６０３， １５１８， １４９１， １４４６， １３８０， １３５６，
１２５１， １２２０， １１２０， １０９９， １０３３ ｃｍ−１；ＭＳ（ＥＳ
＋）ｍ／ｚ（相対強度）８２５（［Ｍ＋Ｈ］＋．，６２），７２１（１４），４４０（３
８）；ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋．理論値Ｃ４１Ｈ６０Ｎ４Ｏ１０Ｓｉ２ ｍ／ｚ ８２５．
３９２１，実測値（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ８２５．３９４８。
（ｇ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス（１１ａＳ，２Ｒ
）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−７−メトキシ−１０−（（２−（
トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，２，３，１０，１１，１１ａ−ヘキサヒド
ロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン−５，１１−ジオン］（
９）
ｎ−ＢｕＬｉ（６８．３ｍＬの１．６Ｍヘキサン溶液、１０９ｍｍｏｌ）の溶液を、テ
トララクタム８（３０．０８ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を含む無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）の
撹拌懸濁液に窒素雰囲気下にて−３０℃（ドライアイス／エチレングリコール）で滴下し
た。反応混合物をこの温度で１時間撹拌し（ここで、赤橙色になる）、その時点でＳＥＭ
Ｃｌ（１９．３ｍＬ、１８．２ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を含む無水ＴＨＦ（１２０ｍＬ）の
溶液を滴下した。反応混合物を室温にゆっくり加温し、窒素雰囲気下で１６時間撹拌した
。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）およびＬＣ／ＭＳ（４．７７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１
０８５（［Ｍ＋Ｈ］＋．、１００）で判断したところ、反応は完了しているようであった
。ＴＨＦを真空蒸発によって除去し、得られた残渣をＥｔＯＡｃ（７５０ｍＬ）に溶解し
、Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）、ブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、
濾過し、真空中で蒸発させて粗Ｎ１０−ＳＥＭ保護テトララクタム９をオイルとして得た
（ｍａｘｍ ３９．５ｇ、１００％）。生成物を精製せずに次の工程で使用した。［α］
２３ Ｄ ＝ ＋１６３°（ｃ ＝ ０．４１， ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲ（４００
ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．３３（ｓ， ２Ｈ）， ７．２２（ｓ， ２Ｈ）， ５
．４７（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ９．９８ Ｈｚ）， ４．６８（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
９．９９ Ｈｚ）， ４．５７（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．７７ Ｈｚ）， ４．２
９−４．１９（ｍ， ６Ｈ）， ３．８９（ｓ， ６Ｈ）， ３．７９−３．５１（ｍ，
８Ｈ）， ２．８７−２．８１（ｍ， ２Ｈ）， ２．４１（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝
５．８１ Ｈｚ）， ２．０３−１．９０（ｍ， ２Ｈ）， １．０２−０．８１（ｍ，
２２Ｈ）， ０．０９（ｓ， １２Ｈ）， ０．０１（ｓ， １８Ｈ）；１３Ｃ ＮＭ
Ｒ（１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ １７０．０， １６５．７， １５１．２，
１４７．５， １３３．８， １２１．８， １１１．６， １０６．９， ７８．１，
６９．６， ６７．１， ６５．５， ５６．６， ５６．３， ５３．７， ３５．
６， ３０．０， ２５．８， １８．４， １８．１， −１．２４， −４．７３；
ＩＲ（ＡＴＲ， ＣＨＣｌ３）２９５１， １６８５， １６４０， １６０６， １５
１７， １４６２， １４３３， １３６０， １２４７， １１２７， １０６５ ｃ
ｍ−１；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１１３（［Ｍ＋Ｎａ］＋．，４８），１０
８５（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００），１００９（５），８１３（６）；ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］
＋．理論値Ｃ５３Ｈ８８Ｎ４Ｏ１２Ｓｉ４ ｍ／ｚ １０８５．５５４８，実測値（ＥＳ
＋）ｍ／ｚ １０８５．５５４２。
（ｈ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス（１１ａＳ，２Ｒ
）−２−ヒドロキシ−７−メトキシ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メ
チル）−１，２，３，１０，１１，１１ａ−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］
［１，４］−ベンゾジアゼピン−５，１１−ジオン］（１０）
ＴＢＡＦ（１５０ｍＬの１．０Ｍ ＴＨＦ溶液、１５０ｍｍｏｌ）の溶液を、粗ビス−
シリルエーテル９［８４．０ｇ（ｍａｘｍ ５６．８ｇ）、５２．４ｍｍｏｌ］を含むＴ
ＨＦ（８００ｍＬ）の撹拌溶液に室温で添加した。１時間の撹拌後、ＴＬＣ（９５：５
ｖ／ｖ ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）による反応混合物の分析の分析により、反応完了が明ら
かとなった。ＴＨＦを室温での減圧蒸発によって除去し、得られた残渣をＥｔＯＡｃ（５
００ｍＬ）に溶解し、ＮＨ４Ｃｌ（３００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をブライン
（６０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で蒸発させて粗生成物
を得た。フラッシュクロマトグラフィ（勾配溶離：１００％ＣＨＣｌ３→９６：４ｖ／ｖ
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）による精製により、純粋なテトララクタム１０を白色泡として
得た（３６．０ｇ、７９％）。ＬＣ／ＭＳ ３．３３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）８
７９（［Ｍ＋Ｎａ］＋．，１００），８５７（［Ｍ＋Ｈ］＋．，４０）；［α］２３ Ｄ
＝ ＋２０２°（ｃ ＝ ０．３４， ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）δ ７．２８（ｓ， ２Ｈ）， ７．２０（ｓ， ２Ｈ）， ５．４４（
ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ）， ４．７２（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．
０ Ｈｚ）， ４．６１−４．５８（ｍ， ２Ｈ）， ４．２５（ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝
５．８３ Ｈｚ）， ４．２０−４．１６（ｍ， ２Ｈ）， ３．９１−３．８５（ｍ
， ８Ｈ）， ３．７７−３．５４（ｍ， ６Ｈ）， ３．０１（ｂｒ ｓ， ２Ｈ，
ＯＨ）， ２．９６−２．９０（ｍ， ２Ｈ）， ２．３８（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５
．７７ Ｈｚ）， ２．１１−２．０５（ｍ， ２Ｈ）， １．００−０．９１（ｍ，
４Ｈ）， ０．００（ｓ， １８Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３
）δ １６９．５， １６５．９， １５１．３， １４７．４， １３３．７， １２
１．５， １１１．６， １０６．９， ７９．４， ６９．３， ６７．２， ６５．
２， ５６．５， ５６．２， ５４．１， ３５．２， ２９．１， １８．４， −
１．２３；ＩＲ（ＡＴＲ， ＣＨＣｌ３）２９５６， １６８４， １６２５， １６０
４， １５１８， １４６４， １４３４， １３６１， １２３８， １０５８， １
０２１ ｃｍ−１；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）８８５（［Ｍ＋２９］＋．，７０
），８５７（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００），７１１（８），４４８（１７）；ＨＲＭＳ［Ｍ
＋Ｈ］＋．理論値Ｃ４１Ｈ６０Ｎ４Ｏ１２Ｓｉ２ ｍ／ｚ ８５７．３８１９，実測値（
ＥＳ＋）ｍ／ｚ ８５７．３８２６。
（ｉ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス（１１ａＳ）−７
−メトキシ−２−オキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１
，２，３，１０，１１，１１ａ−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］
−ベンゾジアゼピン−５，１１−ジオン］（１１）
ジオール１０（２５．６ｇ、３０ｍｍｏｌ、１当量）、ＮａＯＡｃ（６．９ｇ、８４ｍ
ｍｏｌ、２．８当量）、およびＴＥＭＰＯ（１８８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、０．０４当量
）を、Ａｒ下でＤＣＭ（３２６ｍＬ）に溶解した。これを−８℃（内部温度）に冷却し、
ＴＣＣＡ（９．７ｇ、４２ｍｍｏｌ、１．４当量）を１５分間にわたって少しずつ添加し
た。３０分後のＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）およびＬＣ／ＭＳ［３．６０分．（ＥＳ＋）ｍ／ｚ
（相対強度）８５４．２１（［Ｍ＋Ｈ］＋．、４０）、（ＥＳ−）ｍ／ｚ（相対強度）８
８７．０７（［Ｍ−Ｈ＋Ｃｌ］−．、１０）］は反応完了を示していた。冷ＤＣＭ（２０
０ｍＬ）を添加し、混合物をセライトパッドで濾過後、飽和炭酸水素ナトリウム／チオ硫
酸ナトリウムの溶液（１：１ｖ／ｖ；２００ｍＬ×２）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４
で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去して、黄色／橙色スポンジを得た（２５．４ｇ
、９９％）。ＬＣ／ＭＳ［３．６０分．（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）８５４．２１（［
Ｍ＋Ｈ］＋．，４０）；［α］２０Ｄ ＝ ＋２９１°（ｃ ＝ ０．２６， ＣＨＣｌ
３）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．３２（ｓ， ２Ｈ），
７．２５（ｓ， ２Ｈ）， ５．５０（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．１ Ｈｚ）， ４
．７５（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．１ Ｈｚ）， ４．６０（ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ
＝ ９．８５， ３．０７ Ｈｚ）， ４．３１−４．１８（ｍ， ６Ｈ）， ３．８９
−３．８４（ｍ， ８Ｈ）， ３．７８−３．６２（ｍ， ４Ｈ）， ３．５５（ｄｄ，
２Ｈ， Ｊ ＝ １９．２， ２．８５ Ｈｚ）， ２．７６（ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ
＝ １９．２， ９．９０ Ｈｚ）， ２．４２（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．７７ Ｈ
ｚ）， ０．９８−０．９１（ｍ， ４Ｈ）， ０．００（ｓ， １８Ｈ）；１３Ｃ Ｎ
ＭＲ（１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ２０６．８， １６８．８， １６５．９，
１５１．８， １４８．０， １３３．９， １２０．９， １１１．６， １０７．
２， ７８．２， ６７．３， ６５．６， ５６．３， ５４．９， ５２．４， ３
７．４， ２９．０， １８．４， −１．２４；ＩＲ（ＡＴＲ， ＣＨＣｌ３）２９５
７， １７６３， １６８５， １６４４， １６０６， １５１６， １４５７， １
４３４， １３６０， １２４７， １２０９， １０９８， １０６６， １０２３
ｃｍ−１；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）８８１（［Ｍ＋２９］＋．，３８），８５
３（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００），７０７（８），５４２（１２）；ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋
．理論値Ｃ４１Ｈ５６Ｎ４Ｏ１２Ｓｉ２ ｍ／ｚ ８５３．３５０６，実測値（ＥＳ＋）
ｍ／ｚ ８５３．３５０２。
（ｊ）１，１’−［［（プロパン−１，３−ジイル）ジオキシ］ビス（１１ａＳ）−７
−メトキシ−２−［［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ］−１０−（（２−（
トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ
−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン−５，１１−ジオン］（１２）
無水２，６−ルチジン（５．１５ｍＬ、４．７４ｇ、４４．２ｍｍｏｌ）を、ビス−ケ
トン１１（６．０８ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＣＭ（１８０ｍＬ）の強く撹拌し
た溶液に窒素雰囲気下にて−４５℃（ドライアイス／アセトニトリル）で一度に注入した
。新たに開封したアンプルから取り出したトリフルオロメタンスルホン酸無水物（７．２
ｍＬ、１２．０８ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）を、−４０℃以下に維持しながら直ちに滴下し
た。反応混合物を−４５℃で１時間撹拌し、その時点でＴＬＣ（５０／５０ｖ／ｖ ｎ−
ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって出発物質の完全な消費が明らかとなった。強く震盪しな
がら冷反応混合物を直ちにＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、水（１×１００ｍＬ）、５％
クエン酸溶液（１×２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）、ブライン（１００
ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。濾過および減圧下での溶媒の蒸発によって
粗生成物を得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフィ（勾配溶離：９０：１０ ｖ
／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ→７０：３０ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によ
って精製してビス−エノールトリフラート１２を黄色泡として得た（５．５ｇ、７０％）
。ＬＣ／ＭＳ ４．３２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１３９（［Ｍ＋Ｎａ］＋．，
２０）；［α］２４Ｄ ＝ ＋２７１°（ｃ ＝ ０．１８， ＣＨＣｌ３）；１Ｈ Ｎ
ＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．３３（ｓ， ２Ｈ）， ７．２６（ｓ，
２Ｈ）， ７．１４（ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １．９７ Ｈｚ）， ５．５１（ｄ，
２Ｈ， Ｊ ＝ １０．１ Ｈｚ）， ４．７６（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．１ Ｈ
ｚ）， ４．６２（ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １１．０， ３．６９ Ｈｚ）， ４．３
２−４．２３（ｍ， ４Ｈ）， ３．９４−３．９０（ｍ， ８Ｈ）， ３．８１−３．
６４（ｍ， ４Ｈ）， ３．１６（ｄｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １６．３， １１．０，
２．３６ Ｈｚ）， ２．４３（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８５ Ｈｚ）， １．２
３−０．９２（ｍ， ４Ｈ）， ０．０２（ｓ， １８Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００
ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ １６７．１， １６２．７， １５１．９， １４８．０，
１３８．４， １３３．６， １２０．２， １１８．８， １１１．９， １０７．
４， ７８．６， ６７．５， ６５．６， ５６．７， ５６．３， ３０．８， ２
９．０， １８．４， −１．２５；ＩＲ（ＡＴＲ， ＣＨＣｌ３）２９５８， １６９
０， １６４６， １６０５， １５１７， １４５６， １４２８， １３６０， １
３２７， １２０７， １１３６， １０９６， １０６０， １０２２， ９３８，
９１３ ｃｍ−１；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１４４（［Ｍ＋２８］＋．，１
００），１１１７（［Ｍ＋Ｈ］＋．，４８），１０４１（４０），５７８（８）；ＨＲＭ
Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋．理論値Ｃ４３Ｈ５４Ｎ４Ｏ１６Ｓｉ２Ｓ２Ｆ６ ｍ／ｚ １１１７．２
４９１，実測値（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １１１７．２４６５。
Figure 2019069983
（ａ）（Ｓ）−８−（３−（（（Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）−７−メトキシ−
５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１
０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］
ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１
０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テト
ラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イルト
リフルオロメタンスルホナート（１３）
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１１６．９ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を、ビス−エノールトリ
フラート１２（５．６５ｇ、５．０６ｍｍｏｌ）、４−アミノフェニルボロン酸ピナコー
ルエステル（１ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２．４６ｇ、２３．２ｍｍｏｌ
）、ＭｅＯＨ（３７ｍＬ）、トルエン（７４ｍＬ）、および水（３７ｍＬ）の撹拌混合物
に添加した。反応混合物を窒素雰囲気下にて３０℃で２４時間撹拌し、その後に全てのボ
ロン酸エステルが消費された。次いで、反応混合物を蒸発乾固した後、残渣をＥｔＯＡｃ
（１５０ｍＬ）に取り出し、Ｈ２Ｏ（２×１００ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄
し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。フラッシュ
クロマトグラフィ（勾配溶離：８０：２０ｖ／ｖヘキサン／ＥｔＯＡｃ→６０：４０ｖ／
ｖヘキサン／ＥｔＯＡｃ）による精製により、生成物１３を黄色がかった泡として得た（
２．４ｇ、４５％）。ＬＣ／ＭＳ ４．０２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１０６０．
２１（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）δ
７．４０（ｓ， １Ｈ）， ７．３３（ｓ， １Ｈ）， ７．２７（ｂｓ， ３Ｈ），
７．２４（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ７．１５（ｔ， １Ｈ， Ｊ
＝ ２．０ Ｈｚ）， ６．６６（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ５．５２
（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ）， ４．７７（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０
．０ Ｈｚ）， ４．７６（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ）， ４．６２（
ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．７， １１．０ Ｈｚ）， ４．５８（ｄｄ， １Ｈ，
Ｊ ＝ ３．４， １０．６ Ｈｚ）， ４．２９（ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈ
ｚ）， ４．００−３．８５（ｍ， ８Ｈ）， ３．８０ − ３．６０（ｍ， ４Ｈ）
， ３．１６（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．４， １１．０， １６．３ Ｈｚ），
３．１１（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．２， １０．５， １６．１ Ｈｚ），
２．４３（ｐ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ）， １．１−０．９（ｍ， ４Ｈ），
０．２（ｓ， １８Ｈ）． １３Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３， １００ ＭＨｚ）δ
１６９．８， １６８．３， １６４．０， １６２．７， １５３．３， １５２．６
， １４９．２８， １４９．０， １４７．６， １３９．６， １３４．８， １３
４．５， １２７．９， １２７．５， １２５．１， １２３．２１， １２１．５，
１２０．５， １２０．１， １１６．４， １１３．２， １０８．７， ７９．８
， ７９．６， ６８．７， ６８．５， ６７．０， ６６．８， ５８．８， ５８
．０， ５７．６， ３２．８， ３２．０， ３０．３， １９．７， ０．２５．
（ｂ）（Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）−８−（３−（（（Ｓ）−２−シクロプロ
ピル−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキ
シ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１
，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−１
０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１
，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５，１１（１０Ｈ，１１ａＨ）−ジオン（１４）
トリフェニルアルシン（０．２４ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、酸化銀（Ｉ）（１．０２ｇ、
４．４ｍｍｏｌ）、シクロプロピルボロン酸（０．４７ｇ、５．５ｍｍｏｌ）、および出
発物質１３（１．１５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下でジオキサン（３０ｍ
Ｌ）に溶解した。第三リン酸カリウム（２．８ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を乳棒および乳鉢
ですり潰し、直ちに反応混合物に添加した。反応混合物を排気し、アルゴンで３回フラッ
シングし、７１℃に加熱した。パラジウム（ＩＩ）ビス（ベンゾニトリルクロリド）（８
４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を排気し、アルゴンで３回フラッシング
した。１０分後、ＴＬＣ（８０：２０ ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）およびＬＣ／ＭＳ
による分析のために少量のサンプルを取り出した。３０分後、反応は完了しており（ＬＣ
／ＭＳ分析が出発物質の消費を示していた）、反応物をセライトで濾過し、フィルターパ
ッドを酢酸エチル（４００ｍＬ）で洗浄した。濾液を、水（２×２００ｍＬ）およびブラ
イン（２×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真
空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（３０：７０ｖ／ｖヘキサン／酢酸
エチル）による精製により、生成物１４を橙色（ｏｒａｎｇｅｙ）／黄色固体として得た
（０．６６ｇ、６３％）。方法１、ＬＣ／ＭＳ（３．８５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度
）９５２．１７（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣ
ｌ３）δ ７．３６（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ７．３０（ｓ， １Ｈ
）， ７．２５ − ７．１９（ｍ， ４Ｈ）， ６．６８（ｓ， １Ｈ）， ６．６２
（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ５．４９（ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．
６， １０．０ Ｈｚ）， ４．７３（ａｐｐ．ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ
）， ４．５４（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．２， １０．４ Ｈｚ）， ４．４０（
ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．２， １０．４ Ｈｚ）， ４．２９ − ４．２３（ｍ
， ４Ｈ）， ３．９１ − ３．８５（ｍ， ７Ｈ）， ３．８０ − ３．７１（ｍ
， ２Ｈ）， ３．７０ − ３．６１（ｍ， ２Ｈ）， ３．３８ − ３．３２（ｍ
， １Ｈ）， ３．１２ − ３．０１（ｍ， １Ｈ）， ２．５０ − ２．６９（ｍ
， １Ｈ）， ２．４０（ｑ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， １．５０ − １
．４３（ｍ， １Ｈ）， ０．９９ − ０．７１（ｍ， ６Ｈ）， ０．５４ − ０
．５９（ｍ， ２Ｈ）， ０．００（ｓ， １８Ｈ）ｐｐｍ．
（ｃ）（Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）−８−（３−（（（Ｓ）−２−シクロプロ
ピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［
１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−
１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン
（１５）
ＳＥＭジラクタム１４（０．６６ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２３ｍＬ）に溶解
し、アルゴン雰囲気下で−７８℃に冷却した。温度をモニタリングしながら、Ｓｕｐｅｒ
−Ｈｙｄｒｉｄｅ（登録商標）溶液（１．７ｍＬ、１Ｍ ＴＨＦ溶液）を５分間にわたっ
て滴下した。２０分後、ＬＣ／ＭＳ分析のために少量のサンプルを取り出し、水で洗浄し
た。水（５０ｍＬ）を添加し、冷浴を除去した。有機層を抽出し、ブライン（６０ｍＬ）
で洗浄した。合わせた水層を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９０／１０ｖ／ｖ）（２×５０
ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で溶媒を除
去した。粗生成物をＭｅＯＨ（４８ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１８ｍＬ）、および水（６ｍ
Ｌ）に溶解し、十分なシリカゲルを添加して高濃度の懸濁液を得た。撹拌５日後、懸濁液
を焼結漏斗で濾過し、生成物が溶離しなくなるまでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１）（
約２００ｍＬ）で洗浄した。有機層をブライン（２×７０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で
乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１０
０％ＣＨＣｌ３→９６／４ ｖ／ｖ ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）による精製により、生成物
１５を黄色固体として得た（３０２ｍｇ、６６％）。方法１、ＬＣ／ＭＳ（２．４２分（
ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）６６０．７４（［Ｍ＋Ｈ］＋．，３０）．１Ｈ ＮＭＲ（４
００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．８６（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ），
７．７８（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ）， ７．５８ − ７．４４（ｍ，
３Ｈ）， ７．３４ − ７．２０（ｍ， ３Ｈ）， ６．８８ − ６．６６（ｍ，
４Ｈ）， ４．３５ − ４．１５（ｍ， ６Ｈ）， ３．９５ − ３．７５（ｍ，
７Ｈ）， ３．３９ − ３．２２（ｍ， １Ｈ）， ３．１４ − ３．０４（ｍ，
１Ｈ）， ２．９３ − ２．８５（ｍ， １Ｈ）， ２．４６ − ２．３６（ｍ，
２Ｈ）， １．４９ − １．４１（ｍ， １Ｈ）， ０．８０ − ０．７２（ｍ，
２Ｈ）， ０．５８ − ０．５１（ａｐｐ．ｓ， ２Ｈ）ｐｐｍ．
（ｄ）アリル（（２Ｓ）−１−（（（２Ｓ）−１−（（４−（８−（３−（（２−シク
ロプロピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピ
ロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メト
キシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［
１，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）
アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバマート（１６）
アルゴンを充填した脱気丸底フラスコ中で、ＨＯ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ａｌｌｏｃ（１４
９．６ｍｇ、０．５４９ｍｍｏｌ）およびＥＥＤＱ（１３５．８ｍｇ、０．５４９ｍｍｏ
ｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（５ｍＬ）の９：１混合物に溶解した。フラスコを
アルミニウム箔で包み、反応混合物を室温で１時間撹拌後、出発物質１５（３０２ｍｇ、
０．４５７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をさらに室温で４０時間撹拌し続けた後、
揮発物質を減圧下での回転蒸発によって除去した（反応後にＬＣ／ＭＳを行った。出発物
質のＲＴ２．３２分、（ＥＳ＋ ６６０．２９（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００））。粗生成物
をシリカゲルクロマトグラフィカラム（１００％ＣＨＣｌ３→９０／１０ｖ／ｖ ＣＨＣ
ｌ３／ＭｅＯＨ）によって直接精製して、純粋な生成物（１６）を収率４２％で得た（１
７４ｍｇ）。方法２ ＬＣ／ＭＳ（２．７０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９１４．７
３（［Ｍ＋Ｈ］＋．，６０），６６０．４３（６０），１８４．３１（１００））。
（ｅ）（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（４−（８−（３−（（２−シ
クロプロピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］
ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メ
トキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］
［１，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル
）−３−メチルブタンアミド（１７）
出発物質１６（１７０ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を
含むアルゴン充填した丸底フラスコに溶解後、ピロリジン（４１μＬ、０．２１ｍｍｏｌ
）を添加した。フラスコをアルゴンで３回パージ／再充填後、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１４
ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を添加し、フラッシング操作を繰り返した。１時間後、出発
物質の完全な消費が認められ（反応後ＬＣ／ＭＳを行った）、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）を反
応混合物に添加し、全生成物が溶液から析出するまで撹拌した。固体を焼結漏斗で濾過し
、Ｅｔ２Ｏ（２×２５ｍＬ）で２回洗浄した。回収フラスコに交換し、単離した固体をＣ
ＨＣｌ３（１００ｍＬまたは全ての生成物が焼結漏斗を通過するまで）に溶解した。次い
で、揮発物質を減圧下での回転蒸発によって除去して粗生成物１７を得た。これを次の工
程で直接使用した（１６８ｍｇ）。ＬＣ／ＭＳ法２（２．７０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対
強度）８３０．２７（［Ｍ＋Ｈ］＋．，５０），６６０．１３（８０），１７１．１５（
１００））。
（ｆ）Ｎ−（（Ｒ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−８−（３−（（（Ｓ）
−２−シクロプロピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベン
ゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）
−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，
２−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−
２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−１−（３−（２，５
−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）−３，６
，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−アミド（１８
またはＤＬ１）
出発物質１７（１５４ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１１０ｍ
ｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を含むアルゴンをパージして
充填した丸底フラスコ中で可溶化した。混合物を室温で１時間撹拌後、ＰＥＧ８−マレイ
ミド（３５．６ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をさらに１６時間（ま
たはＬＣ／ＭＳによるモニタリングによって反応が完了するまで）撹拌した。反応溶液を
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、有機物をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）およびブライン（５０
ｍＬ）で洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下での回転蒸発によって除
去して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１００％ＣＨＣｌ３→８５
／１５ ｖ／ｖ ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）での精製により所望の生成物（１３５ｍｇ）が
得られたが、微量の残存する未反応のＰＥＧ８−マレイミドが認められた（ＬＣ／ＭＳに
よる、２．２１分、方法２）。自動化逆相シリカゲルクロマトグラフィ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３
ＣＮ）（条件についての一般的情報を参照のこと）によって夾雑物が首尾よく除去されて
、純粋な最終生成物を得た（１８、１１０ｍｇから出発した３７ｍｇの純粋な生成物、３
３％）。全収量＝１７％。方法２ ＬＣ／ＭＳ（２．５８分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度
）１４０４．０３（［Ｍ＋Ｈ］＋．，２０），７０２．６３（１００））． １Ｈ ＮＭ
Ｒ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．９１（ｔ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， １
Ｈ）， ７．８０（ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７５（ｄ， Ｊ ＝
８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６９（ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７
．５４ − ７．５０（ｍ， ２Ｈ）， ７．４５（ｓ， １Ｈ）， ７．３９ − ７
．３１（ｍ， ２Ｈ）， ６．８７（ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．
７６（ｓ， １Ｈ）， ６．７２ − ６．６８（ｍ， ２Ｈ）， ４．７４ − ４．
６２（ｍ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．１７（ｍ， ７Ｈ）， ３．９５（ｓ， ３
Ｈ）， ３．９４（ｓ， ３Ｈ）， ３．６７ − ３．５８（ｍ， ３４Ｈ）， ３．
５４（ｍ， ２Ｈ）， ３．４２（ｄｄ， Ｊ ＝ １０．２， ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ
）， ３．１６ − ３．０７（ｍ， １Ｈ）， ２．９２（ｄｄ， Ｊ ＝ １６．１
， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６２ − ２．４９（ｍ， ４Ｈ）， ２．４８
− ２．３９（ｍ， ２Ｈ）， ２．３７ − ２．２５（ｍ， １Ｈ）， １．９２（
ｓ， １Ｈ）， １．５２ − １．４４（ｍ， ３Ｈ）， １．１０ − ０．９３（
ｍ， ６Ｈ）， ０．７９（ｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０
．５７（ｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ＮＨは認められなかっ
た。
Ｃ．薬物−リンカーＤＬ１の合成（経路２）
Figure 2019069983
（ａ）（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）
カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）プロパン酸（２０ｂ）
ＨＯ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｈ ２０ａ（３５０ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）およびＮａ２Ｃ
Ｏ３（４９３ｍｇ、４．６５ｍｍｏｌ）を蒸留水（１５ｍＬ）に溶解し、混合物を０℃に
冷却後、ジオキサン（１５ｍＬ）を添加した（アミノ酸塩の部分沈殿が生じた）。Ｆｍｏ
ｃ−Ｃｌ（５０４ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を含むジオキサン（１５ｍＬ）の溶液を、１
０分間にわたって強く撹拌しながら滴下した。得られた混合物を０℃で２時間撹拌後、氷
浴を除去し、１６時間撹拌し続けた。溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去し、残渣を
水（１５０ｍＬ）に溶解した。ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで９から２に調整し、水層をその後に
ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（１００ｍＬ）で
洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、揮発物質を減圧下での回転蒸発によって除去し
て純粋なＨＯ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ２０ｂを得た（７４６ｍｇ、収率９７％）。Ｌ
Ｃ／ＭＳ ２．８５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）４１０．６０；１Ｈ−ＮＭＲ（４０
０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．７９（ｄ， Ｊ＝７．７７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７
．６０（ｄ， Ｊ＝７．７７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３（ｄ， Ｊ＝７．５ Ｈｚ，
２Ｈ）， ７．３４（ｄ， Ｊ＝７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．３０（ｂｓ， １Ｈ
）， ５．３０（ｂｓ， １Ｈ）， ４．７１−７．５６（ｍ， １Ｈ）， ４．５４−
４．３６（ｍ， ２Ｈ）， ４．０８−３．９１（ｍ， １Ｈ）， ２．２１−２．０７
（ｍ， １Ｈ）， １．５０（ｄ， Ｊ＝７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０６−０．９
０（ｍ， ６Ｈ）．
（ｂ）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１
−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２
−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）アミノ）プロパン−２−イル）アミノ）ブタ
ン−２−イル）カルバマート（２０）
４−アミノフェニルボロン酸ピナコールエステル（１４６．９ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ
）を、アルゴンをフラッシングしたフラスコ中にて室温で３０分間予め撹拌していたＨＯ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ２０ｂ（３３０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１６６ｍ
ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（約５ｍｇ）を含む乾燥ＤＣＭ（８ｍＬ）の溶液
に添加した。次いで、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応後にＬＣＭＳおよびＴＬＣ
を行った。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、有機物をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄後
、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下での回転蒸発で除去した。粗生成物をシ
リカゲルクロマトグラフィカラム（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６：４）に乾燥状態でロード
して、純粋な生成物２０を、白色固体として収率８８％で得た（３６０ｍｇ）。
（ｃ）８−（３−（（２−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオ
レン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）プロパン
アミド）フェニル）−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチル
シリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［
ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７
−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチ
ル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ
］［１，４］ジアゼピン−２−イルトリフルオロメタンスルホナート（２１）
ビス−トリフラート１２（２．０３ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）、ボロン酸ピナコールエス
テル（１ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）、およびＮａ２ＣＯ３（８８１ｍｇ、８．３１ｍｍｏｌ
）を、トルエン／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの２：１：１混合物（４０ｍＬ）に溶解した。反応フ
ラスコをアルゴンで３回パージおよび充填後、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パ
ラジウム（０）（４１ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３０℃に一晩
加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）中に取り出し、ＥｔＯＡ
ｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、
ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、揮発物質を減圧下での回転蒸発によって除去した。粗生
成物をシリカゲルクロマトグラフィカラム（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、８：２→２５：７５
）によって精製して純粋な２１を収率３３％で得た（８８５ｍｇ）。ＬＣ／ＭＳ ３．８
５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１４５２．９０；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）δ ７．７８ − ７．１６（ｍ， １７Ｈ）， ７．１３（ｓ， １Ｈ）
， ６．５１ − ６．２４（ｍ， １Ｈ）， ５．５１（ｄｄ， Ｊ ＝ １０．０，
５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．３６ − ５．１１（ｍ， １Ｈ）， ４．７４（ｄ
ｄ， Ｊ ＝ １０．１， ４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．７０ − ４．５３（ｍ，
２Ｈ）， ４．４７（ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３７（ｄ， Ｊ
＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２７（ｍ， ４Ｈ）， ４．２０ − ４．１４
（ｍ， １Ｈ）， ３．９０（ｓ， ３Ｈ）， ３．８９（ｓ， ３Ｈ）， ３．７７（
ｄｄｄ， Ｊ ＝ １６．７， ９．０， ６．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７１ −
３．６１（ｍ， ２Ｈ）， ３．２４ − ２．９１（ｍ， ３Ｈ）， ２．５５ −
２．３３（ｍ， ２Ｈ）， ２．２２ − ２．０７（ｍ， １Ｈ）， １．５２ −
１．３７（ｍ， ３Ｈ）， １．０４ − ０．８６（ｍ， １０Ｈ）， ０．００（
ｓ， １８Ｈ）．
（ｄ）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（２Ｓ）−１−（（（２Ｓ）−１−（
（４−（８−（３−（（２−シクロプロピル−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０
−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラ
ヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オ
キシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチル
シリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［
ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−
オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カル
バマート（２２）
トリフェニルアルシン（４２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を、ＰＢＤ−トリフラート２
１（２５０ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）、シクロプロピルボロン酸（７３．９ｍｇ、０．
８６ｍｍｏｌ）、酸化銀（１５９ｍｇ、０．６８８ｍｍｏｌ）、および第三リン酸カリウ
ム（４３８ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジオキサン（１０ｍＬ）の混合物にアル
ゴン雰囲気下で添加した。反応物をアルゴンで３回フラッシングし、ビス（ベンゾニトリ
ル）パラジウム（ＩＩ）クロリド（１３．２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を添加した。反
応物をアルゴンでさらに３回フラッシング後、７５℃に加温し、１０分間撹拌した。反応
混合物をセライトパッドで濾過し、その後に酢酸エチルでリンスした。溶媒を減圧下での
回転蒸発によって除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカ
ゲル；１％メタノール／クロロホルム）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な
溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して、所望の生成物２２を得た（１３２ｍｇ、
収率５０％）。ＬＣ／ＭＳ ３．８３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１３４５．９１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．８８ − ７．１４（ｍ， １
７Ｈ）， ６．６９（ｓ， １Ｈ）， ６．４５ − ６．２５（ｍ， １Ｈ）， ５．
５７ − ５．４１（ｍ， ２Ｈ）， ５．３４ − ５．１４（ｍ， １Ｈ）， ４．
７８ − ４．６７（ｍ， ２Ｈ）， ４．６２ − ４．５５（ｍ， １Ｈ）， ４．
５０ − ４．４５（ｍ， ２Ｈ）， ４．５１ − ４．４４（ｍ， １Ｈ）， ４．
３１ − ４．２１（ｍ， ４Ｈ）， ４．１６（ｍ， １Ｈ）， ３．９２（ｓ， ３
Ｈ）， ３．８６（ｓ， ３Ｈ）， ３．８２ − ３．７１（ｍ， ２Ｈ）， ３．６
６（ｍ， ３Ｈ）， ３．４０ − ３．２８（ｍ， １Ｈ）， ３．０７（ｍ， １Ｈ
）， ２．７０ − ２．５７（ｍ， １Ｈ）， ２．４７ − ２．３６（ｍ， ２Ｈ
）， ２．１５（ｍ， １Ｈ）， １．５１ − １．４０（ｍ， ３Ｈ）， １．０３
− ０．８７（ｍ， １１Ｈ）， ０．７７ − ０．７１（ｍ， ２Ｈ）， ０．６
０ − ０．５４（ｍ， ２Ｈ）， ０．００（ｔ， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， １８Ｈ
）．
（ｅ）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（２Ｓ）−１−（（（２Ｓ）−１−（
（４−（８−（３−（（２−シクロプロピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−
ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）
オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベン
ゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−
１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）
カルバマート（２３）
Ｓｕｐｅｒ−Ｈｙｄｒｉｄｅ（登録商標）溶液（０．５ｍＬ、１Ｍ ＴＨＦ溶液）を、
ＳＥＭジラクタム２２（２６５ｍｇ ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）
の溶液に−７８℃でアルゴン雰囲気下にて滴下した。反応混合物の内部温度を一定に保持
するために、５分間にわたって添加した。２０分後、ＬＣ／ＭＳ分析のためにアリコート
を水で反応停止させ、ＬＣ／ＭＳ分析によって反応完了が明らかとなった。水（２０ｍＬ
）を反応混合物に添加し、冷浴を除去した。有機層をＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出
し、合わせた有機物をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、
溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去した。粗生成物を、ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）、ＣＨ
２Ｃｌ２（６ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解し、十分なシリカゲルによって濃厚な撹拌懸濁
液が形成された。５日後、懸濁液を焼結漏斗で濾過し、生成物の溶離が完了するまでＣＨ
２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１）（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層をブライン（２×７０
ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下での回転蒸発によって除
去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１００％ＣＨＣｌ３→９６％ＣＨＣｌ３／
４％ＭｅＯＨ）による精製により、生成物２３を黄色固体として得た（１６２ｍｇ、７８
％）。ＬＣ／ＭＳ ３．０２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１０５２．３７。
（ｆ）（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（４−（８−（３−（（２−シ
クロプロピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］
ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メ
トキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］
［１，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル
）−３−メチルブタンアミド（１７）
過剰量のピペリジン（０．２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を、ＳＥＭ−ジラクタム２３（７６ｍ
ｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液に添加した。混合物を室温で２
０分間撹拌し、その時点で、反応が完了していた（ＬＣ／ＭＳによってモニタリングした
場合）。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）で希釈し、完全にピペリジンが除去され
るまで有機相をＨ２Ｏ（３×７５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾
過し、過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物１７を得た。これをそ
のま次の工程で使用した。ＬＣ／ＭＳ ２．３２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）８３０
．００。
（ｇ）Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（（２Ｓ）−１−（（４−（８−（３−（（２−シクロ
プロピル−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロ
ロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキ
シ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１
，４］ジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ア
ミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−１−（３−（２，５−ジオキソ−
２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）−３，６，９，１２，
１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−アミド（１８またはＤＬ１
）
ＥＤＣＩヒドロクロリド（１４ｍｇ、０．０７３２ｍｍｏｌ）を、マレイミド−ＰＥＧ
８−酸（４３．４ｍｇ、０．０７３２ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）の懸
濁液にアルゴン雰囲気下で添加した。混合物を室温で１時間撹拌後、ＰＢＤ１７（６０．
７ｍｇ、０．０７３２ｍｍｏｌ）を添加した。反応が完了するまで（通常、５時間）撹拌
し続けた。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、有機相をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄後、Ｍ
ｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去した。生成
物を慎重なシリカゲルクロマトグラフィ（１００％ＣＨＣｌ３から出発して９：１ ＣＨ
Ｃｌ３／ＭｅＯＨまでのゆっくりした溶離）によって精製後、逆相クロマトグラフィによ
って精製して、未反応のマレイミド−ＰＥＧ８−酸を除去した。生成物１８（ＤＬ１）を
収率１７．６％で単離した（２１．８ｍｇ）。ＬＣ／ＭＳ ２．５７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ
（相対強度）１４０５．３０；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．
９１（ｔ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８０（ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈ
ｚ， １Ｈ）， ７．７５（ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６９（ｄ，
Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５４ − ７．５０（ｍ， ２Ｈ）， ７．
４５（ｓ， １Ｈ）， ７．３９ − ７．３１（ｍ， ２Ｈ）， ６．８７（ｄ， Ｊ
＝ １０．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７６（ｓ， １Ｈ）， ６．７２ − ６．６
８（ｍ， ２Ｈ）， ４．７４ − ４．６２（ｍ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．１
７（ｍ， ７Ｈ）， ３．９５（ｓ， ３Ｈ）， ３．９４（ｓ， ３Ｈ）， ３．６７
− ３．５８（ｍ， ３４Ｈ）， ３．５４（ｍ， ２Ｈ）， ３．４２（ｄｄ， Ｊ
＝ １０．２， ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１６ − ３．０７（ｍ， １Ｈ）
， ２．９２（ｄｄ， Ｊ ＝ １６．１， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６２ −
２．４９（ｍ， ４Ｈ）， ２．４８ − ２．３９（ｍ， ２Ｈ）， ２．３７ −
２．２５（ｍ， １Ｈ）， １．９２（ｓ， １Ｈ）， １．５２ − １．４４（ｍ
， ３Ｈ）， １．１０ − ０．９３（ｍ， ６Ｈ）， ０．７９（ｄｄ， Ｊ ＝
９．２， ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．５７（ｄｄ， Ｊ ＝ ９．２， ５．３
Ｈｚ， ２Ｈ）， ＮＨは認められなかった。
Ｄ．薬物−リンカーＤＬ２の合成（経路１）
Figure 2019069983
 （ａ）（Ｓ）−７−メトキシ−８−（３−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−（４−（４
−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（ト
リメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−
ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−
５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１
０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼ
ピン−２−イルトリフルオロメタンスルホナート（２４）
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２０．６ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を、ビス−エノールトリフ
ラート１２（５００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルピペラジンボロン酸エステル
（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２１８ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）、Ｍ
ｅＯＨ（２．５ｍＬ）、トルエン（５ｍＬ）、および水（２．５ｍＬ）の撹拌混合物に添
加した。反応混合物を窒素雰囲気下にて３０℃で２４時間撹拌し、その後に全てのボロン
酸エステルが消費された。次いで、反応混合物を蒸発乾固後、残渣をＥｔＯＡｃ（１００
ｍＬ）中に取り出し、Ｈ２Ｏ（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥さ
せ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で蒸発させて、粗生成物を得た。フラッシュクロマト
グラフィ（勾配溶離：８０：２０ｖ／ｖヘキサン／ＥｔＯＡｃ→６０：４０ｖ／ｖヘキサ
ン／ＥｔＯＡｃ）による精製により、生成物２４を黄色がかった泡として得た（１２２．
６ｍｇ、２５％）。
ＬＣ／ＭＳ ３．１５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１４４（［Ｍ＋Ｈ］＋．，２
０％）。
（ｂ）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４
−（（Ｓ）−７−メトキシ−８−（３−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−（４−（４−メ
チルピペラジン−１−イル）フェニル）−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメ
チルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロ
ロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−５，
１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，
１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン
−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチ
ル−１−オキソブタン−２−イル）カルバマート（２５）
ＰＢＤ−トリフラート２４（３５９ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）、ボロン酸ピナコール
エステル２０（２５０ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．３５
ｍＬ、２．５１ｍｍｏｌ）を、トルエン／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの２：１：１混合物（３ｍＬ
）に溶解した。マイクロ波容器をアルゴンで３回パージおよび充填後、テトラキス（トリ
フェニルホスフィン）パラジウム（０）（２１．７ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を添加し
、反応混合物をマイクロ波に８０℃で１０分間入れた。その後に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００
ｍＬ）を添加し、有機物を水（２×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄後、Ｍ
ｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、揮発物質を減圧下での回転蒸発によって除去した。粗生成
物を、シリカゲルクロマトグラフィカラム（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、１００％→９：１）
によって精製して、純粋な２５を得た（２００ｍｇ、収率４３％）。ＬＣ／ＭＳ ３．２
７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１４７８（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００％）。
（ｃ）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４
−（（Ｓ）−７−メトキシ−８−（３−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−（４−（４−メ
チルピペラジン−１−イル）フェニル）−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピ
ロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−５
−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼ
ピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−
メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバマート（２６）
Ｓｕｐｅｒ−Ｈｙｄｒｉｄｅ（登録商標）溶液（０．３４ｍＬ、１Ｍ ＴＨＦ溶液）を
、ＳＥＭ−ジラクタム２５（２００ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（５ｍＬ）
の溶液にアルゴン雰囲気下にて−７８℃で滴下した。反応混合物の内部温度を一定に保持
するために、５分間にわたって添加した。２０分後、ＬＣ／ＭＳ分析のためにアリコート
を水で反応停止させ、ＬＣ／ＭＳ分析によって反応完了が明らかとなった。水（２０ｍＬ
）を反応混合物に添加し、冷浴を除去した。有機層をＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出
し、合わせた有機物をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、
溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去した。粗生成物を、ＭｅＯＨ（６ｍＬ）、ＣＨ２
Ｃｌ２（３ｍＬ）、水（１ｍＬ）に溶解し、十分なシリカゲルによって濃厚な撹拌懸濁液
が形成された。５日後、懸濁液を焼結漏斗で濾過し、生成物の溶離が完了するまでＣＨ２
Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１）（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をブライン（２×５０ｍ
Ｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去
した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１００％ＣＨＣｌ３→９６％ＣＨＣｌ３／４
％ＭｅＯＨ）による精製により、生成物２６を黄色固体として得た（１００ｍｇ、６３％
）。ＬＣ／ＭＳ ２．６７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１８６（［Ｍ＋Ｈ］＋．，
５％）．
（ｄ）（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｒ）−７−メトキシ−８
−（３−（（（Ｒ）−７−メトキシ−２−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フ
ェニル）−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］
ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒド
ロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２−イル）フェニル）ア
ミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−３−メチルブタンアミド（２７）
過剰量のピペリジン（０．１ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を、ＰＢＤ２６（３６．４ｍｇ、０．
０３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（０．９ｍＬ）の溶液に添加した。混合物を室温で２０分間
撹拌し、その時点で、反応が完了していた（ＬＣ／ＭＳによってモニタリングした場合）
。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、完全にピペリジンが除去されるまで
有機相をＨ２Ｏ（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、
過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物２７を得た。これをそのま次
の工程で使用した。ＬＣ／ＭＳ ２．２０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９６４（［Ｍ
＋Ｈ］＋．，５％）。
（ｅ）６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ
−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−７−メトキシ−８−（３−（（（
Ｓ）−７−メトキシ−２−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−５−
オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピ
ン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロ
ロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オ
キソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）ヘキサ
ンアミド（２８またはＤＬ２）。
ＥＤＣＩヒドロクロリド（４．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を、６−マレイミドヘキサ
ン酸（６．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）の懸濁液にア
ルゴン雰囲気下で添加した。混合物を室温で１時間撹拌後、ＰＢＤ２７（３４ｍｇ、粗生
成物）を添加した。反応が完了するまで（６時間）撹拌し続けた。反応物をＣＨ２Ｃｌ２
で希釈し、有機相をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、過
剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去した。生成物を慎重なシリカゲルクロマトグ
ラフィ（１００％ＣＨＣｌ３から出発して９：１ ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨまでのゆっくり
した溶離）によって精製後、逆相クロマトグラフィによって精製して、未反応のマレイミ
ド−ＰＥＧ８−酸を除去した。生成物２８を２工程にて収率４１％で単離した（１４．６
ｍｇ）。ＬＣ／ＭＳ ２．４０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１５７（［Ｍ＋Ｈ］＋
．，５％）
Ｅ．薬物−リンカーＤＬ２の合成（経路２）
Figure 2019069983
ＰＢＤ−トリフラート２１（４６９ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ）、ボロン酸ピナコール
エステル（１４６．５ｍｇ、０．４８４ｍｍｏｌ）、およびＮａ２ＣＯ３（１５７ｍｇ、
１．４８ｍｍｏｌ）を、トルエン／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの２：１：１混合物（１０ｍＬ）に
溶解した。反応フラスコをアルゴンで３回パージ後、テトラキス（トリフェニルホスフィ
ン）パラジウム（０）（７．４１ｍｇ、０．００６４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を
３０℃に一晩加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）中に取り出し
、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（１００ｍＬ）で
洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、揮発物質を減圧下での回転蒸発によって除去し
た。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨＣｌ３ １００％→ＣＨＣｌ
３／ＭｅＯＨ ９５％：５％）によって精製して純粋な２５を収率３３％で得た（８８５
ｍｇ）。ＬＣ／ＭＳ ３．２７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１４７８（［Ｍ＋Ｈ］＋
．，１００％）．
Ｆ．薬物−リンカーＤＬ３の合成（経路１）
Figure 2019069983
（ａ）（Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）−８−（３−（（（Ｓ）−２−（ベンゾ［
ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０−
（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒ
ドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プ
ロポキシ）−７−メトキシ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−
１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５，１１（１０Ｈ，１１ａＨ
）−ジオン（２９）
３，４−（メチレンジオキシ）フェニルボロン酸（３５６ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、１．
３当量）、ＴＥＡ（１．８ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ、８当量）、およびトリフラート／ア
ニリン１３（１．７５ｇ、１．７ｍｍｏｌ、１当量）を、エタノール（７ｍＬ）、トルエ
ン（１３ｍＬ）、および水（２ｍＬ）の混合物にＡｒ雰囲気下で溶解した。反応混合物を
排気し、Ａｒで３回フラッシング後、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
（０）（１１４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．０６当量）を添加した。フラスコを再度排気
し、Ａｒで３回フラッシングし、３０秒間予め撹拌してマイクロ波にて８０℃で８分間加
熱した。ＴＬＣ（８０：２０ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）による分析により、出発物質
の完全な消費が示された。反応混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０
ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィ（６０：４０→２０：８０ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチ
ル）による精製により、生成物２９を黄色固体として得た（１．２１ｇ、７１％）。ＬＣ
／ＭＳ（３．９２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１０３２．４４（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１
００）。
（ｂ）（Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）−８−（３−（（（Ｓ）−２−（ベンゾ［
ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジ
ヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）
プロポキシ）−７−メトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン
−５（１１ａＨ）−オン（３０）
ＳＥＭジラクタム２９（０．２５ｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（８ｍＬ）
に溶解し、Ａｒ雰囲気下で−７８℃に冷却した。温度をモニタリングしながら、Ｓｕｐｅ
ｒ−Ｈｙｄｒｉｄｅ（登録商標）（０．６ｍＬ、１Ｍ ＴＨＦ溶液、２．５当量）を５分
間にわたって滴下した。２０分後、ＬＣＭＳ分析のために少量のサンプルを取り出し、ワ
ークアップ作業を施した。水（５０ｍＬ）を添加し、冷浴を除去し、溶液を酢酸エチル（
５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を抽出し、ブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で
乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をＥｔＯＨ（１５ｍＬ）、ＣＨ２
Ｃｌ２（７．５ｍＬ）、および水（２．５ｍＬ）に溶解し、高濃度の懸濁液になるまで十
分なシリカゲルを添加した。撹拌５日後、懸濁液を焼結漏斗で濾過し、生成物が溶離しな
くなるまでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１）（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をブラ
イン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去し
た。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１％→４％ＭｅＯＨ勾配を使用したＣＨＣｌ３
）による精製により、生成物３０を黄色固体として得た（９４ｍｇ、５３％）。ＬＣ／Ｍ
Ｓ（２．５３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）７３９．６４（［Ｍ］＋．，７０）。
（ｃ）アリル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−８−（３−（（（Ｓ
）−２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−７−メトキシ−５−オキ
ソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−
８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−
１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ
）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イ
ル）カルバマート（３１）
Ａｒ雰囲気下で、アラニン−バリン−Ａｌｌｏｃ（１８０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１
．２当量）を、ＥＥＤＱ（１６３ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１．２当量）を含む無水ＣＨ
２Ｃｌ２（２１ｍＬ）およびメタノール（１ｍＬ）と１時間撹拌した。ＰＢＤ３０（４０
７ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２１ｍＬ）およびメタノー
ル（１ｍＬ）に溶解し、反応物に添加した。室温で撹拌５日後のＬＣ／ＭＳは、主な生成
物の形成を示した。溶媒を真空中で除去後、カラムクロマトグラフィ（１％→６％ＭｅＯ
Ｈ勾配を使用したＣＨ２Ｃｌ２）による精製により、生成物３１を黄色固体として得た（
１８４ｍｇ、３４％）。ＬＣ／ＭＳ（２．９５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９９４．
９５（［Ｍ＋Ｈ］＋．，６０）。
（ｄ）（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−８−（３−（（（
Ｓ）−２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−７−メトキシ−５−オ
キソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン
−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ
−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２−イル）フェニル）アミ
ノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−３−メチルブタンアミド（３２）
イミン３１（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）を、Ａｒ雰囲気下で無水ＤＣＭ（
１０ｍＬ）（溶解を補助するために１滴のメタノールを使用する）に溶解した。ピロリジ
ン（３０μＬ、０．１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下後、フラスコを排気し、Ａｒで３
回フラッシングした。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７ｍｇ、６μｍｏｌ、０．０６当量）を添加
し、フラスコを排気し、Ａｒで３回フラッシングした。１時間後のＬＣ／ＭＳ分析は、生
成物の形成および出発物質の完全な喪失を示していた。Ｅｔ２Ｏ（６０ｍＬ）を反応混合
物に添加し、全生成物が溶液から析出するまで撹拌した。沈殿物を焼結漏斗で濾過し、Ｅ
ｔ２Ｏ（２×２０ｍＬ）で２回洗浄した。回収フラスコに交換し、単離した固体を溶解し
、焼結漏斗を介してＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で洗浄した。溶媒を真空中で除去して粗生
成物３２を黄色固体として得た。これを次の工程で直接使用した。ＬＣ／ＭＳ（１．１４
分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９１０．４０（［Ｍ＋Ｈ］＋．，６７）。
（ｅ）Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−８−（３−（（（Ｓ）
−２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−７−メトキシ−５−オキソ
−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８
−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１
Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２−イル）フェニル）アミノ）
−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル
）−１−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プ
ロパンアミド）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサ
ン−２７−アミド（３３またはＤＬ３）
イミン３２（９２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を、溶解を補助するための１滴
の無水ＭｅＯＨを含むＣＨＣｌ３（６ｍＬ）に溶解した。マレイミド−ＰＥＧ８−酸（５
３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１当量）を添加後、ＥＥＤＱ（３３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ
、１．５当量）を添加した。これを、ＬＣ／ＭＳ分析が大部分の生成物の形成を示すまで
、４日間Ａｒ下にて室温で強く撹拌し続けた。溶媒を真空中で除去し、粗生成物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィ（１％→１０％ＭｅＯＨ勾配を使用したＣＨＣｌ３）によっ
て部分的に精製して３３を得た（８１ｍｇ）。この材料を分取ＨＰＬＣによってさらに精
製して３３を黄色固体として得た（２６．３ｍｇ、１８％）。高速ギ酸運転：ＬＣ／ＭＳ
（１．３９分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１４８５．００（［Ｍ＋Ｈ］＋．，６４）。
Ｇ．薬物−リンカーＤＬ３の合成（経路２）
Figure 2019069983
（ａ）９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−
（（Ｓ）−８−（３−（（（Ｓ）−２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イ
ル）−７−メトキシ−５，１１−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキ
シ）メチル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［
１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５，１１
−ジオキソ−１０−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−５，１０，１１
，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２
−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−
１−オキソブタン−２−イル）カルバマート（３４）
トリフラート２１（０．５ｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）、３，４−（メチレンジオ
キシ）フェニルボロン酸（７５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびＮａ２Ｃ
Ｏ３（０．１７ｇ、１．６ｍｍｏｌ、４．５当量）を、Ａｒ雰囲気下でトルエン（１１ｍ
Ｌ）、ＥｔＯＨ（５．５ｍＬ）、および水（５．５ｍＬ）に溶解した。フラスコを排気し
、Ａｒで３回フラッシングした。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０
．０６当量）を添加し、フラスコを再度排気し、Ａｒで３回フラッシングした。これを３
０℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。ＬＣ／ＭＳによる分析は、出発物質の完全な喪失を示
していた。溶媒を真空中で除去し、残渣を水（６０ｍＬ）に溶解後、酢酸エチル（６０ｍ
Ｌ×３）で洗浄した。合わせた有機層を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で
乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィ（５０：５０→２
５：７５ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）による精製により、生成物３４を黄色固体として
得た（３１０ｍｇ、６４％）。ＬＣ／ＭＳ（１．４４分（ＥＳ−）ｍ／ｚ（相対強度）１
４２３．３５（［Ｍ−Ｈ］−．，７９）。
（ｂ）（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４
−（（Ｓ）−８−（３−（（（Ｓ）−２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−
イル）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ
］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５−
オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピ
ン−２−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メ
チル−１−オキソブタン−２−イル）カルバマート（３５）
ＳＥＭジラクタム３４（０．３１ｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（１０ｍＬ
）に溶解し、Ａｒ雰囲気下で−７８℃に冷却した。温度をモニタリングしながら、Ｓｕｐ
ｅｒ−Ｈｙｄｒｉｄｅ（登録商標）（０．５ｍＬ、１Ｍ ＴＨＦ溶液、２．５当量）を５
分間にわたって滴下した。３０分後、ＬＣ／ＭＳ分析のために少量のサンプルを取り出し
、ワークアップ作業を施した。水（５０ｍＬ）を添加し、冷浴を除去し、溶液を酢酸エチ
ル（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を抽出し、ブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ
４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をＥｔＯＨ（１３．２ｍＬ）
、ＣＨ２Ｃｌ２（６．６ｍＬ）、および水（２．２ｍＬ）に溶解し、高濃度の懸濁液にな
るまで十分なシリカゲルを添加した。撹拌５日後、懸濁液を焼結漏斗で濾過し、生成物が
溶離しなくなるまでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１）（１００ｍＬ）で洗浄した。有機
層をブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中
で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１％→４％ＭｅＯＨ勾配を使用したＣ
ＨＣｌ３）による精製により、純粋な生成物３５を黄色固体として得た（１８５ｍｇ、７
５％）。ＬＣ／ＭＳ（１．７０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１３２．８５（［Ｍ＋
Ｈ］＋．，６０）。
（ｃ）（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−８−（３−（（（
Ｓ）−２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−７−メトキシ−５−オ
キソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン
−８−イル）オキシ）プロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ
−１Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２−イル）フェニル）アミ
ノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−３−メチルブタンアミド（３２）
イミン３５（８２ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解後、ピ
ペリジン（０．２ｍＬ、２ｍｍｏｌ、過剰量）をゆっくり添加した。この溶液を、ＬＣ／
ＭＳ分析が出発物質の完全な消費を示すまで室温で２０分間撹拌し続けた。反応混合物を
、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ×４）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥
させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。生成物３３を、さらに精製せずに次の工程で使
用した。ＬＣ／ＭＳ（１．１５分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９１０．６０（［Ｍ＋Ｈ
］＋．，５８）。
Ｈ．薬物−リンカーＤＬ５の合成
（ｉ）（Ｓ）−（２−アミノ−５−メトキシ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ
）フェニル）（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メ
チル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メタノン（４９）
Figure 2019069983
（ａ）５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）ベンズ
アルデヒド（４２）
原液のトリイソプロピルシリルクロリド（５６．４ｍＬ、２６２ｍｍｏｌ）を、イミダ
ゾール（４８．７ｇ、７１５．２３ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−５−メトキシ−２
−ニトロベンズアルデヒド４１（４７ｇ、２３８ｍｍｏｌ）（共に粉砕する）の混合物に
添加した。フェノールおよびイミダゾールが融解して溶液になるまで混合物を加熱した（
１００℃）。反応混合物を１５分間撹拌し、次いで、冷却し、その際に固体がフラスコ底
部に形成されることが認められた（イミダゾールクロリド）。反応混合物を５％ＥｔＯＡ
ｃ／ヘキサンで希釈し、シリカゲル上に直接ロードし、パッドを５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサ
ンで溶離し、その後に１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離した（低過剰のため、未反応の
ＴＩＰＳＣｌは生成物中にほとんど認められなかった）。所望の生成物を、５％酢酸エチ
ルを含むヘキサンで溶離した。過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去し、その
後に高真空下で乾燥させて結晶性の感光性固体を得た（７４．４ｇ、８８％）。ＬＣ／Ｍ
Ｓによって満足な純度を得た（４．２２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）３５３．８８（
［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００））；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ １０
．４３（ｓ， １Ｈ）， ７．６０（ｓ， １Ｈ）， ７．４０（ｓ， １Ｈ）， ３．
９６（ｓ， ３Ｈ）， １．３５ − １．２４（ｍ， ３Ｈ）， １．１０（ｍ， １
８Ｈ）．
（ｂ）５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）安息香
酸（４３）
亜塩素酸ナトリウム（４７．３ｇ、５２３ｍｍｏｌ、８０％テクニカルグレード）およ
びモノ塩基性リン酸二水素ナトリウム（３５．２ｇ、２９３ｍｍｏｌ）（ＮａＨ２ＰＯ４
）の水溶液（８００ｍＬ）を、化合物２（７４ｇ、２０９ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロ
フラン（５００ｍＬ）の溶液に室温で添加した。過酸化水素（６０％ｗ／ｗ、１４０ｍＬ
、２．９３ｍｏｌ）を、直ちに強く撹拌した二相性混合物に添加した。反応混合物はガス
（酸素）を発生し、出発物質が溶解し、反応混合物の温度は４５℃に上昇した。３０分後
、ＬＣ／ＭＳにより、反応の完了が明らかとなった。反応混合物を氷浴中で冷却し、塩酸
（１Ｍ）を添加してｐＨ３に低下させた（多くの場合反応終了時のｐＨが既に酸性である
ので、この工程は不必要と考えられる。抽出前にｐＨをチェックすること）。次いで、反
応混合物を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出し、有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し
、硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機相を濾過し、過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発に
よって除去して、生成物４３を定量的収率で黄色固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（３．９３
分（ＥＳ−）ｍ／ｚ（相対強度）３６７．７４（［Ｍ−Ｈ］−．，１００））；１Ｈ Ｎ
ＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．３６（ｓ， １Ｈ）， ７．２４（ｓ，
１Ｈ）， ３．９３（ｓ， ３Ｈ）， １．３４ − １．２２（ｍ， ３Ｈ）， １
．１０（ｍ， １８Ｈ）．
（ｃ）（（２Ｓ，４Ｒ）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチ
ル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（ト
リイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）メタノン（４５）
ＤＣＣ（２９．２ｇ、１４１ｍｍｏｌ、１．２当量）を、酸３（４３．５ｇ、１１７．
８ｍｍｏｌ、１当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１９．８ｇ、１２９
．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を含むジクロロメタン（２００ｍＬ）の溶液に０℃で添加し
た。冷浴を除去し、反応を室温で３０分間進行させ、その時点で、（２Ｓ，４Ｒ）−２−
ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル−４−ヒドロキシピロリジン４４（３０ｇ、１２
９．６ｍｍｏｌ、１．１当量）およびトリエチルアミン（２４．６６ｍＬ、１７６ｍｍｏ
ｌ、１．５当量）を含むジクロロメタン（１００ｍＬ）の溶液を、アルゴン下にて−１０
℃で迅速に添加した（大量の場合、反応混合物をさらに冷却することによって添加時間を
短縮することができる）。反応混合物を室温で４０分間〜１時間撹拌し、ＬＣ／ＭＳおよ
びＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によってモニタリングした。固体をセライトでの濾過によって除
去し、ｐＨが４または５と測定されるまで有機相を冷０．１Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄した
。次いで、有機相を水で洗浄し、その後に飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで
洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な溶媒を減圧下での回転
蒸発によって除去した。残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル；勾配４
０／６０酢酸エチル／ヘキサン→８０／２０酢酸エチル／ヘキサン）に供した。過剰な溶
媒を減圧下での回転蒸発によって除去して純粋な生成物４５を得た（４５．５ｇの純粋な
生成物６６％および１７ｇのわずかに夾雑物を含む生成物、全部で９０％）．ＬＣ／ＭＳ
４．４３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５８２．９２（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．６６（ｓ， １Ｈ）， ６．７
４（ｓ， １Ｈ）， ４．５４（ｓ， １Ｈ）， ４．４０（ｓ， １Ｈ）， ４．１３
（ｓ， １Ｈ）， ３．８６（ｓ， ３Ｈ）， ３．７７（ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ
， １Ｈ）， ３．３６（ｄｄ， Ｊ ＝ １１．３， ４．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３
．１４ − ３．０２（ｍ， １Ｈ）， ２．３８ − ２．２８（ｍ， １Ｈ）， ２
．１０（ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．３， ８．４， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．３
６ − １．１９（ｍ， ３Ｈ）， １．１５ − １．０５（ｍ， １８Ｈ）， ０．
９１（ｓ， ９Ｈ）， ０．１７ − ０．０５（ｍ， ６Ｈ）， （回転異性体の存在
）。
（ｄ）（Ｓ）−５−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−１−
（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）ベンゾイル）
ピロリジン−３−オン（４６）
ＴＣＣＡ（８．８２ｇ、４０ｍｍｏｌ、０．７当量）を、４５（３１．７ｇ、５４ｍｍ
ｏｌ、１当量）およびＴＥＭＰＯ（０．８５ｇ、５．４ｍｍｏｌ、０．１当量）を含む乾
燥ジクロロメタン（２５０ｍＬ）の撹拌溶液に０℃で添加した。反応混合物を２０分間強
く撹拌し、その時点で、ＴＬＣ（５０／５０酢酸エチル／ヘキサン）によって出発物質の
完全な消費が明らかであった。反応混合物をセライトで濾過し、濾液を飽和重炭酸ナトリ
ウム水溶液（１００ｍＬ）、チオ硫酸ナトリウム（３００ｍＬ中に９ｇ）、ブライン（１
００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。減圧下での回転蒸発により生成物
４６を定量的収率で得た。ＬＣ／ＭＳ ４．５２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５８１
．０８（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．７８ − ７．６０（ｍ， １
Ｈ）， ６．８５ − ６．６２（ｍ， １Ｈ）， ４．９４（ｄｄ， Ｊ ＝ ３０．
８， ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ − ４．１６（ｍ， １Ｈ）， ３．９９
− ３．８２（ｍ， ３Ｈ）， ３．８０ − ３．３４（ｍ， ３Ｈ）， ２．９２
− ２．１７（ｍ， ２Ｈ）， １．４０ − １．１８（ｍ， ３Ｈ）， １．１１
（ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， １８Ｈ）， ０．９７ − ０．７５（ｍ， ９Ｈ）
， ０．１５ − −０．０６（ｍ， ６Ｈ）， （回転異性体の存在）。
（ｅ）（Ｓ）−５−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−１−
（５−メトキシ−２−ニトロ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）ベンゾイル）
−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イルトリフルオロメタンスルホナート（４７
）
トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２７．７ｍＬ、４６．４ｇ、１６５ｍｍｏｌ、
３当量）を、ケトン４６（３１．９ｇ、５５ｍｍｏｌ、１当量）を含む乾燥ジクロロメタ
ン（９００ｍＬ）の強く撹拌した懸濁液に、２，６−ルチジン（２５．６ｍＬ、２３．５
ｇ、２２０ｍｍｏｌ、４当量、シーブで乾燥）の存在下で−５０℃（アセトン／ドライア
イス浴）にて（温度制御して）注入した。反応混合物を１．５時間撹拌し、その時点で小
規模のワークアップ（水／ジクロロメタン）後のＬＣ／ＭＳによって反応が完全であるこ
とが明らかとなった。水を静置した冷反応混合物に添加し、有機層を分離し、飽和重炭酸
ナトリウム、ブライン、および硫酸マグネシウムで洗浄した。有機相を濾過し、過剰な溶
媒を減圧下での回転蒸発によって除去した。残渣をカラムフラッシュクロマトグラフィ（
シリカゲル；１０／９０ ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）に供し、過剰な溶離液を除去し
て生成物４７を得た（３７．６ｇ、９６％）ＬＣ／ＭＳ、方法２、４．３２分（ＥＳ＋）
ｍ／ｚ（相対強度）７１２．８９（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；１Ｈ ＮＭＲ（４００
ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．７１（ｓ， １Ｈ）， ６．７５（ｓ， １Ｈ）， ６
．０５（ｄ， Ｊ ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７８（ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８
， ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１５ − ３．７５（ｍ， ５Ｈ）， ３．１７（
ｄｄｄ， Ｊ ＝ １６．２， １０．４， ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９９（ｄ
ｄｄ， Ｊ ＝ １６．３， ４．０， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４５ − １
．１９（ｍ， ３Ｈ）， １．１５ − １．０８（ｍ， １８Ｈ）， １．０５（ｓ，
６Ｈ）， ０．９５ − ０．８７（ｍ， ９Ｈ）， ０．１５ − ０．０８（ｍ，
６Ｈ）．
（ｆ）（Ｓ）−（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４
−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）（５−メトキシ−２−ニトロ
−４−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）メタノン（４８）
トリフェニルアルシン（１．７１ｇ、５．６０ｍｍｏｌ、０．４当量）を、トリフラー
ト４７（１０．００ｇ、１４ｍｍｏｌ、１当量）、メチルボロン酸（２．９４ｇ、４９．
１ｍｍｏｌ、３．５当量）、酸化銀（１３ｇ、５６ｍｍｏｌ、４当量）、および第三リン
酸カリウム（１７．８ｇ、８４ｍｍｏｌ、６当量）を含む乾燥ジオキサン（８０ｍＬ）の
混合物にアルゴン雰囲気下で添加した。反応物をアルゴンで３回フラッシングし、ビス（
ベンゾニトリル）パラジウム（ＩＩ）クロリド（５４０ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ、０．１
当量）を添加した。反応物をアルゴンでさらに３回フラッシング後、即時的に１１０℃に
加温した（ｄｒｙｓｙｎ加熱ブロックをフラスコへの添加前に予め１１０℃に加温してお
く）。１０分後、反応物を室温に冷却し、パッドセライトで濾過した。溶媒を減圧下での
回転蒸発によって除去した。得られた残渣を、カラムフラッシュクロマトグラフィ（シリ
カゲル；１０％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な
溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物４８を得た（４．５ｇ、５５％）
。ＬＣ／ＭＳ，４．２７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５７９．１８（［Ｍ＋Ｈ］＋．
，１００）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．７０（ｓ， １Ｈ
）， ６．７７（ｓ， １Ｈ）， ５．５１（ｄ， Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ， １Ｈ），
４．７７ − ４．５９（ｍ， １Ｈ）， ３．８９（ｓ， ３Ｈ）， ２．９２ −
２．６５（ｍ， １Ｈ）， ２．５５（ｄ， Ｊ ＝ １４．８ Ｈｚ， １Ｈ），
１．６２（ｄ， Ｊ ＝ １．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．４０ − １．１８（ｍ，
３Ｈ）， １．１１（ｓ， ９Ｈ）， １．１０（ｓ， ９Ｈ）， ０．９０（ｓ， ９
Ｈ）， ０．１１（ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， ６Ｈ）．
（ｇ）（Ｓ）−（２−アミノ−５−メトキシ−４−（（トリイソプロピルシリル）オキ
シ）フェニル）（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−
メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メタノン（４９）
亜鉛粉末（２８ｇ、４３０ｍｍｏｌ、３７当量）を、化合物４８（６．７ｇ、１１．５
８ｍｍｏｌ）を含む５％ギ酸を含むエタノールｖ／ｖ（７０ｍＬ）の溶液におよそ１５℃
で添加した。生じた発熱を、氷浴を使用して反応混合物の温度を３０℃未満に維持するよ
うに制御した。３０分後、反応混合物を、セライトパッドで濾過した。濾液を酢酸エチル
で希釈し、有機相を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、およびブラインで洗浄した。有機
相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって除
去した。得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル；１０％酢酸
エチルを含むヘキサン）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶媒を減圧下で
の回転蒸発によって除去して、生成物４９を得た（５．１ｇ、８０％）。ＬＣ／ＭＳ、４
．２３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５５０．２１（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；１Ｈ
ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．２８（ｓ， １Ｈ）， ６．６７（
ｓ， １Ｈ）， ６．１９（ｓ， １Ｈ）， ４．６４ − ４．５３（ｍ， Ｊ ＝
４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１７（ｓ， １Ｈ）， ３．８７（ｓ， １Ｈ）， ３
．７７ − ３．６９（ｍ， １Ｈ）， ３．６６（ｓ， ３Ｈ）， ２．７１ − ２
．６０（ｍ， １Ｈ）， ２．５３ − ２．４３（ｍ， １Ｈ）， ２．０４ − １
．９７（ｍ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６２（ｓ， ３Ｈ）， １．
２６ − １．１３（ｍ， ３Ｈ）， １．０８ − ０．９９（ｍ， １８Ｈ）， ０
．８２（ｓ， ９Ｈ）， ０．０３ − −０．０３（ｍ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ，
６Ｈ）．
（ｉｉ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）
オキシ）−８−（（５−ヨードペンチル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オ
キソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジ
アゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート
Figure 2019069983
（ａ）（Ｓ）−アリル（２−（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）
メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メ
トキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバマート（５０）
クロロギ酸アリル（０．３０ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ、１．１当量）を、アミン４９（
１．５ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、乾燥ピリジン（０．４８ｍＬ、６．００ｍｍｏ
ｌ、２．２当量）を含む乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）の存在下にて−７８℃で（アセ
トン／ドライアイス浴）添加した。３０分後、浴を除去し、反応混合物を室温に加温した
。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和硫酸銅水溶液を添加した。次いで、有機層
を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を硫酸マグ
ネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去して生成物
５０を得た。これを、次の工程で直接使用した。ＬＣ／ＭＳ、４．４５分（ＥＳ＋）ｍ／
ｚ（相対強度）６３２．９１（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）
（ｂ）（Ｓ）−アリル（２−（２−（ヒドロキシメチル）−４−メチル−２，３−ジヒ
ドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシ
リル）オキシ）フェニル）カルバマート（５１）
粗生成物５０を、酢酸／メタノール／テトラヒドロフラン／水の７：１：１：２混合物
（２８：４：４：８ｍＬ）に溶解し、室温で撹拌した。３時間後、ＬＣ／ＭＳによって出
発物質の完全な消滅が認められた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水（２×５００ｍ
Ｌ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）、およびブラインで連続的に洗浄した
。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸
発によって除去した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、
２５％酢酸エチルを含むヘキサン）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離
液を減圧下での回転蒸発によって除去して、所望の生成物５１を得た（１ｇ、７１％）。
ＬＣ／ＭＳ、３．７０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５１９．１３（［Ｍ＋Ｈ］＋．，
９５）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．３４（ｓ， １Ｈ），
７．６９（ｓ， １Ｈ）， ６．７８（ｓ， １Ｈ）， ６．１５（ｓ， １Ｈ），
５．９５（ｄｄｔ， Ｊ ＝ １７．２， １０．５， ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ５
．３３（ｄｑ， Ｊ ＝ １７．２， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２３（ｄｄｄ，
Ｊ ＝ １０．４， ２．６， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７３（ｔｔ， Ｊ
＝ ７．８， ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６３（ｄｔ， Ｊ ＝ ５．７， １．
４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５４（ｓ， １Ｈ）， ３．８９ − ３．７０（ｍ， ５
Ｈ）， ２．８７（ｄｄ， Ｊ ＝ １６．５， １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１
９（ｄｄ， Ｊ ＝ １６．８， ４．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７０（ｄ， Ｊ ＝
１．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３８ − １．２３（ｍ， ３Ｈ）， １．１２（ｓ
， １０Ｈ）， １．１０（ｓ， ８Ｈ）．
（ｃ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−
５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１
Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキ
シラート（５２）
ジメチルスルホキシド（０．３５ｍＬ、４．８３ｍｍｏｌ、２．５当量）を、塩化オキ
サリル（０．２ｍＬ、２．３２ｍｍｏｌ、１．２当量）を含む乾燥ジクロロメタン（１０
ｍＬ）の溶液に、−７８℃（ドライアイス／アセトン浴）にてアルゴン雰囲気下で滴下し
た。１０分後、５１（１ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（８ｍＬ）の
溶液を、−７８℃のままでゆっくり添加した。１５分後、トリエチルアミン（１．３５ｍ
Ｌ、４Åモレキュラーシーブで乾燥、９．６５ｍｍｏｌ、５当量）を滴下し、ドライアイ
ス／アセトン浴を除去した。反応混合物を室温に到達させ、冷塩酸（０．１Ｍ）、飽和重
炭酸ナトリウム水溶液、およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥さ
せ、濾過し、過剰なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発によって除去して生成物５２を
得た（６５８ｍｇ、６６％）。ＬＣ／ＭＳ、３．５２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）５
１７．１４（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３
）δ ７．２０（ｓ， １Ｈ）， ６．７５ − ６．６３（ｍ， Ｊ ＝ ８．８，
４．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．８９ − ５．６４（ｍ， Ｊ ＝ ９．６， ４．１
Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．２３ − ５．０３（ｍ， ２Ｈ）， ４．６８ − ４．３
８（ｍ， ２Ｈ）， ３．８４（ｓ， ３Ｈ）， ３．８３ − ３．７７（ｍ， １Ｈ
）， ３．４０（ｓ， １Ｈ）， ３．０５ − ２．８３（ｍ， １Ｈ）， ２．５９
（ｄ， Ｊ ＝ １７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７８（ｄ， Ｊ ＝ １．３ Ｈｚ
， ３Ｈ）， １．３３ − １．１６（ｍ， ３Ｈ）， １．０９（ｄ， Ｊ ＝ ２
．２ Ｈｚ， ９Ｈ）， １．０７（ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， ９Ｈ）．
（ｄ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オ
キシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オ
キシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］
ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（５３）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフラート（０．７０ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ、３
当量）を、化合物５２（５２０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（０．
４６ｍＬ、４．００ｍｍｏｌ、４当量）を含む乾燥ジクロロメタン（４０ｍＬ）の溶液に
０℃にてアルゴン下で添加した。１０分後、冷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間撹
拌した。反応混合物を、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、およびブラインで抽出した。
有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰物を減圧下での回転蒸発によって除
去した。得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル；勾配、１０
％酢酸エチルを含むヘキサン→２０％酢酸エチルを含むヘキサン）に供した。純粋な画分
を回収し、合わせ、過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物５３を
得た（５４０ｍｇ、８５％）。ＬＣ／ＭＳ，４．４２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）６
５３．１４（［Ｍ＋Ｎａ］＋．，１００）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ
３）δ ７．２０（ｓ， １Ｈ）， ６．７１ − ６．６４（ｍ， Ｊ ＝ ５．５
Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．８３（ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８０ −
５．６８（ｍ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１４ − ５．０６（ｍ，
２Ｈ）， ４．５８（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．２， ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．
３６（ｄｄ， Ｊ ＝ １３．３， ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８４（ｓ， ３Ｈ
）， ３．７１（ｔｄ， Ｊ ＝ １０．１， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９１（
ｄｄ， Ｊ ＝ １６．９， １０．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３６（ｄ， Ｊ ＝
１６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７５（ｓ， ３Ｈ）， １．３１ − １．１６（ｍ
， ３Ｈ）， １．１２ − １．０１（ｍ， Ｊ ＝ ７．４， ２．１ Ｈｚ， １
８Ｈ）， ０．８９ − ０．８１（ｍ， ９Ｈ）， ０．２５（ｓ， ３Ｈ）， ０．
１９（ｓ， ３Ｈ）．
（ｅ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オ
キシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒ
ドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−
カルボキシラート（５４）
酢酸リチウム（８７ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を、化合物５３（５４０ｍｇ、０．８５
ｍｍｏｌ）を含む湿性ジメチルホルムアミド（６ｍＬ、５０：１ ＤＭＦ／水）の溶液に
添加した。４時間後、反応が完了し、反応混合物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、ク
エン酸水溶液（約ｐＨ３）、水、およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム
で乾燥させ、濾過し、過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発によって除去した。得られ
た残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル；勾配、２５％→７５％酢酸
エチルを含むヘキサン）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離液を減圧下
での回転蒸発によって除去して、生成物５４を得た（４００ｍｇ、定量的）。ＬＣ／ＭＳ
，（３．３３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）４７５．２６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００）。
（ｆ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オ
キシ）−８−（（５−ヨードペンチル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキ
ソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジア
ゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（５５）
ジヨードペンタン（０．６３ｍＬ、４．２１ｍｍｏｌ、５当量）および炭酸カリウム（
１１６ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、１当量）を、フェノール５４（４００ｍｇ、０．８４ｍ
ｍｏｌ）を含むアセトン（４ｍＬ、モレキュラーシーブで乾燥）の溶液に添加した。次い
で、反応混合物を６０℃に加温し、６時間撹拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発によ
って除去した。得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル；５０
／５０、ｖ／ｖ、ヘキサン／酢酸エチル）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰
な溶離液を除去して５５を収率９０％で得た。ＬＣ／ＭＳ，３．９０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ
（相対強度）６７０．９１（［Ｍ］＋，１００）．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， Ｃ
ＤＣｌ３）δ ７．２３（ｓ， １Ｈ）， ６．６９（ｓ， １Ｈ）， ６．６０（ｓ，
１Ｈ）， ５．８７（ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８３ − ５．
６８（ｍ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１５ − ５．０１（ｍ， ２Ｈ
）， ４．６７ − ４．５８（ｍ， １Ｈ）， ４．４５ − ４．３５（ｍ， １Ｈ
）， ４．０４ − ３．９３（ｍ， ２Ｈ）， ３．９１（ｓ， ３Ｈ）， ３．７３
（ｔｄ， Ｊ ＝ １０．０， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．２５ − ３．１４（
ｍ， Ｊ ＝ ８．５， ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９２（ｄｄ， Ｊ ＝ １６
．８， １０．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８（ｄ， Ｊ ＝ １６．８ Ｈｚ， １
Ｈ）， １．９５ − １．８１（ｍ， ４Ｈ）， １．７７（ｓ， ３Ｈ）， １．６
４ − １．４９（ｍ， ２Ｈ）， ０．８８（ｓ， ９Ｈ）， ０．２５（ｓ， ３Ｈ
）， ０．２３（ｓ， ３Ｈ）．
（ｉｉｉ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−
メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イ
ル）ヒドラジニル）ベンジル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８
−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ
−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシ
ラート（７０）
Figure 2019069983
（ａ）アリル３−（２−（２−（４−（（（（２−（（Ｓ）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブ
チルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロー
ル−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェ
ニル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）ヒドラジニル）プロパンアミド）−４
−メチル−２−オキソペンタノアート（５６）
トリエチルアミン（２．２３ｍＬ、１８．０４ｍｍｏｌ、２．２当量）を、アミン４９
（４ｇ、８．２０ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（７７８ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ、０．
３６当量）を含む乾燥テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）の撹拌溶液に５℃で（氷浴）添加
した。イソシアナート反応の進行を、反応混合物からアリコートを定期的に取り出し、メ
タノールで反応停止させ、ＬＣ／ＭＳ分析を行うことによってモニタリングした。一旦イ
ソシアナート形成が完了すると、ａｌｌｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＯＨ（４．１２ｇ
、１２．３０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびトリエチルアミン（１．５２ｍＬ、１２．３
０ｍｍｏｌ、１．５当量）を含む乾燥テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）の溶液を、新たに
調製したイソシアナートに注入することによって迅速に添加した。反応混合物を４０℃で
４時間撹拌した。過剰な溶媒を、減圧下での回転蒸発によって除去した。得られた残渣を
、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル；勾配、１％メタノール→５％メタノ
ールを含むジクロロメタン）に供した。（ＥｔＯＡｃおよびヘキサンを使用した代替クロ
マトグラフィ条件もうまくいった）。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離液を減圧
下での回転蒸発によって除去して、生成物５６を得た（３．９ｇ、５０％）。ＬＣ／ＭＳ
，４．２３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９５２．３６（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．６２（ｂｒ ｓ， １Ｈ），
８．４６（ｓ， １Ｈ）， ７．７７（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．５３（ｄ， Ｊ ＝
８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３２（ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６
．７６（ｓ， １Ｈ）， ６．５７（ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．１
７（ｓ， １Ｈ）， ６．０３ − ５．８３（ｍ， １Ｈ）， ５．２６（ｄｄ， Ｊ
＝ ３３．８， １３．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ５．１０（ｓ， ２Ｈ）， ４．７０
− ４．６０（ｍ， ２Ｈ）， ４．５８（ｄｄ， Ｊ ＝ ５．７， １．３ Ｈｚ
， ２Ｈ）， ４．０６ − ３．９９（ｍ， １Ｈ）， ３．９２（ｓ， １Ｈ），
３．８２ − ３．７１（ｍ， １Ｈ）， ３．７５（ｓ， ３Ｈ）， ２．７９ −
２．６４（ｍ， １Ｈ）， ２．５４（ｄ， Ｊ ＝ １２．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２
．１６（ｄｑ， Ｊ ＝ １３．５， ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６７（ｓ， ３
Ｈ）， １．４６（ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３５ − １．２４
（ｍ， ３Ｈ）， １．１２（ｓ， ９Ｈ）， １．１０（ｓ， ９Ｈ）， ０．９７（
ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９４（ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ，
３Ｈ）， ０．８７（ｓ， ９Ｈ）， ０．０７ − −０．０２（ｍ， ６Ｈ）．
（ｂ）アリル３−（２−（２−（４−（（（（２−（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル
）−４−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ
−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）メチル
）フェニル）ヒドラジニル）プロパンアミド）−４−メチル−２−オキソペンタノアート
（５７）
ＴＢＳエーテル５６（１．３２ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を、酢酸／メタノール／テトラ
ヒドロフラン／水（１４：２：２：４ｍＬ）の７：１：１：２混合物に溶解し、室温で撹
拌した。３時間後、ＬＣ／ＭＳによって出発物質はもはや認められなかった。反応混合物
を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、およびブライン
で連続的に洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な酢酸エチル
を減圧下での回転蒸発によって除去した。得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグ
ラフィ（シリカゲル、２％メタノールを含むジクロロメタン）に供した。純粋な画分を回
収し、合わせ、過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して、所望の生成物５７
を得た（９２０ｍｇ、８０％）。ＬＣ／ＭＳ，３．６０分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）
８３８．１８（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ
３）δ ８．５５（ｓ， １Ｈ）， ８．３５（ｓ， １Ｈ）， ７．６８（ｓ， １Ｈ
）， ７．５２（ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１（ｄ， Ｊ ＝
８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７７（ｓ， １Ｈ）， ６．７１（ｄ， Ｊ ＝ ７．
５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．１３（ｓ， １Ｈ）， ５．９７ − ５．８２（ｍ， Ｊ
＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．４１ − ５．１５（ｍ， ３Ｈ）， ５．１０
（ｄ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．７６ − ４．４２（ｍ， ５Ｈ），
４．０３（ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７７（ｓ， ５Ｈ）， ２
．８４（ｄｄ， Ｊ ＝ １６．７， １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．２６ − ２
．０８（ｍ， ２Ｈ）， １．６８（ｓ， ３Ｈ）， １．４４（ｄ， Ｊ ＝ ７．０
Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３０（ｄｔ， Ｊ ＝ １４．７， ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）
， １．１２（ｓ， ９Ｈ）， １．１０（ｓ， ９Ｈ）， ０．９６（ｄ， Ｊ ＝
６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９３（ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）．
（ｃ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチ
ル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）
ヒドラジニル）ベンジル１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−８
−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ
］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（５８
）
ジメチルスルホキシド（０．２ｍＬ、２．７５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、塩化オキサ
リル（０．１１ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ、１．２当量）を含む乾燥ジクロロメタン（７ｍ
Ｌ）の溶液に、−７８℃（ドライアイス／アセトン浴）にてアルゴン雰囲気下で滴下した
。１０分後、５７（９２０ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ
）の溶液を、−７８℃のままでゆっくり添加した。１５分後、トリエチルアミン（０．７
７ｍＬ、４Åモレキュラーシーブで乾燥、５．５０ｍｍｏｌ、５当量）を滴下し、ドライ
アイス／アセトン浴を除去した。反応混合物を室温に到達させ、冷塩酸（０．１Ｍ）、飽
和重炭酸ナトリウム水溶液、およびブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾
燥させ、濾過し、過剰なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発によって除去した。得られ
た残渣を、カラムフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル；勾配２％メタノール→５％
メタノールを含むジクロロメタン）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、減圧下での
回転蒸発による過剰な溶離液の除去によって生成物５８を得た（５５０ｍｇ、６０％）。
ＬＣ／ＭＳ，３．４３分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）８３６．０１（［Ｍ］＋．，１０
０）．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．３９（ｓ， １Ｈ），
７．５２ − ７．４０（ｍ， ２Ｈ）， ７．２１ − ７．０８（ｍ， Ｊ ＝ １
１．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６７（ｓ， １Ｈ）， ６．６０ − ６．４７（ｍ，
Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．９７ − ５．８３（ｍ， １Ｈ）， ５．
７９ − ５．６６（ｍ， １Ｈ）， ５．３８ − ４．９０（ｍ， ６Ｈ）， ４．
６８ − ４．５２（ｍ， Ｊ ＝ １８．４， ５．５ Ｈｚ， ４Ｈ）， ４．０４
− ３．９４（ｍ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７ − ３．７６（
ｍ， ５Ｈ）， ３．００ − ２．８８（ｍ， １Ｈ）， ２．６６ − ２．４９（
ｍ， ２Ｈ）， ２．２１ − ２．０８（ｍ， ２Ｈ）， １．７６（ｓ， ３Ｈ），
１．４５（ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０９ − ０．９８（ｍ，
Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， １８Ｈ）， ０．９６（ｄ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３
Ｈ）， ０．９３（ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ３Ｈ）．
（ｄ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチ
ル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）
ヒドラジニル）ベンジル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メ
トキシ−２−メチル−５−オキソ−８−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）−１１，
１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１
０（５Ｈ）−カルボキシラート（５９）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフラート（０．３８ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ、３
当量）を、化合物５８（４５０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（０．
２５ｍＬ、２．１６ｍｍｏｌ、４当量）を含む乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）の溶液に０
℃にてアルゴン下で添加した。１０分後、冷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間撹拌
した。反応混合物を、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、およびブラインで抽出した。有
機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な溶媒を減圧下での回転蒸発によって
除去した。得られた残渣を、カラムフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル；５０／５
０ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離液
を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物５９を得た（３３４ｍｇ、６５％）。Ｌ
Ｃ／ＭＳ，４．１８分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）９５０．５０（［Ｍ］＋．，１００
）．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．５３（ｓ， １Ｈ）， ８
．０２（ｓ， １Ｈ）， ７．４４（ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２
１（ｓ， １Ｈ）， ７．０８（ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７２
− ６．６１（ｍ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．１６（ｓ， １Ｈ），
５．９７ − ５．７９（ｍ， Ｊ ＝ ２４．４， ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．
４１ − ５．０８（ｍ， ５Ｈ）， ４．８６（ｄ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， １
Ｈ）， ４．６９ − ４．６０（ｍ， １Ｈ）， ４．５７（ｓ， １Ｈ）， ４．０
３（ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７（ｓ， ３Ｈ）， ３．７４（
ｔｄ， Ｊ ＝ ９．６， ３．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４３ − ２．０９（ｍ，
Ｊ ＝ ３４．８， １９．４， １１．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．７６（ｓ， ３
Ｈ）， １．４３（ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３０ − １．２１
（ｍ， ３Ｈ）， ０．９７（ｄ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９２（ｔ
， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８４（ｓ， ９Ｈ）， ０．２３（ｓ，
３Ｈ）， ０．１２（ｓ， ３Ｈ）．
（ｅ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（２−（１−（（１−（アリルオキシ）−４−メチ
ル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）
ヒドラジニル）ベンジル１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−８−ヒ
ドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベ
ンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラー
ト（６０）
酢酸リチウム（５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を、化合物５９（４７０ｍｇ、０．４９
ｍｍｏｌ）を含む湿性ジメチルホルムアミド（４ｍＬ、５０：１ ＤＭＦ／水）の溶液に
添加した。４時間後、反応が完了し、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、クエン酸（約ｐ
Ｈ３）、水、およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し
、過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発によって除去した。得られた残渣を、カラムフ
ラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル；勾配、５０／５０→２５／７５ ｖ／ｖヘキサ
ン／酢酸エチル）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離液を減圧下での回
転蒸発によって除去して、生成物６０を得た（４００ｍｇ、定量的）。ＬＣ／ＭＳ，３．
３２分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）７９４．１８（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）．１Ｈ
ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．５３（ｓ， １Ｈ）， ８．０２（ｓ
， １Ｈ）， ７．４４（ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２１（ｓ，
１Ｈ）， ７．０８（ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７２ − ６．６
１（ｍ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．１６（ｓ， １Ｈ）， ５．９７
− ５．７９（ｍ， Ｊ ＝ ２４．４， ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．４１ −
５．０８（ｍ， ５Ｈ）， ４．８６（ｄ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４
．６９ − ４．６０（ｍ， １Ｈ）， ４．５７（ｓ， １Ｈ）， ４．０３（ｔ，
Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７（ｓ， ３Ｈ）， ３．７４（ｔｄ， Ｊ
＝ ９．６， ３．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４３ − ２．０９（ｍ， Ｊ ＝
３４．８， １９．４， １１．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．７６（ｓ， ３Ｈ）， １
．４３（ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３０ − １．２１（ｍ， ３
Ｈ）， ０．９７（ｄ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９２（ｔ， Ｊ ＝
８．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８４（ｓ， ９Ｈ）， ０．２３（ｓ， ３Ｈ），
０．１２（ｓ， ３Ｈ）．
（ｉｖ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２Ｓ，５Ｓ）−３７−（２，５−ジオキソ−
２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−イソプロピル−２−メチル−４，
７，３５−トリオキソ−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−オクタオキ
サ−３，６，３４−トリアザヘプタトリアコンタンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ−
７−メトキシ−８−（（５−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，
１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８
−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒド
ロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カ
ルボキシラート（６４）
Figure 2019069983
（ａ）（１１Ｓ）−アリル８−（（５−（（（１１Ｓ）−１０−（（（４−（２−（１
−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミ
ノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル）オキシ）カルボニル）
−１１−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−
５−オキソ−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，
２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−１１−（（ｔ
ｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−１
１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン
−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（６１）
炭酸カリウム（７０ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ、１当量）を、５５（３７０ｍｇ、０．
５５２ｍｍｏｌ、１．２当量）およびフェノール６０（４００ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ
）を含む乾燥アセトン（２５ｍＬ）の溶液に添加した。反応物を７０℃で８時間撹拌した
。ＬＣ／ＭＳは出発物質が消費されていないことを示したので、反応物を室温で一晩撹拌
し、翌日にさらに２時間撹拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発によって除去した。得
られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル；８０％酢酸エチルを含
むヘキサン→１００％酢酸エチル）に供した。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離
液を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物６１を得た（３８５ｍｇ、５７％）。
ＬＣ／ＭＳ，４．０７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１３３６．５５（［Ｍ＋Ｈ］＋．
，５０）。
（ｂ）（１１Ｓ）−アリル８−（（５−（（（１１Ｓ）−１０−（（（４−（２−（１
−（（１−（アリルオキシ）−４−メチル−１，２−ジオキソペンタン−３−イル）アミ
ノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル）オキシ）カルボニル）
−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１０，１１，１１ａ
−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−
イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−２−メチル−５
−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４
］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（６２）
テトラ−ｎ−ブチルフッ化アンモニウム（１Ｍ、０．３４ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ、２
当量）を、６１（２３０ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）を含む乾燥テトラヒドロフラン（３
ｍＬ）の溶液に添加した。出発物質は１０分後に完全に消費された。反応混合物を、酢酸
エチル（３０ｍＬ）で希釈し、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を硫酸マグ
ネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発によって除去した
。得られた残渣６２を、粗混合物として次の反応のために使用した。ＬＣ／ＭＳ，２．８
７分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１１０８．１１（［Ｍ＋Ｈ］＋．，１００）。
（ｃ）（１１Ｓ）−４−（２−（１−（（１−アミノ−３−メチル−１−オキソブタン
−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ヒドラジニル）ベンジル１１−
ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（（５−（（７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−
５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン
−８−イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジ
ヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）
−カルボキシラート（６３）
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１２ｍｇ、０．０１ｍｍｏ
ｌ、０．０６当量）を、粗生成物６２（０．１７２ｍｍｏｌ）およびピロリジン（３６μ
Ｌ、０．４３ｍｍｏｌ、２．５当量）を含む乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）の溶液に添
加した。反応混合物を２０分間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウム
水溶液およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過
し、過剰なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発によって除去した。得られた残渣６３を
、粗混合物として次の反応のために使用した。ＬＣ／ＭＳ，２．３８分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ
（相対強度）９２２．１６（［Ｍ＋Ｈ］＋．，４０）。
（ｄ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２Ｓ，５Ｓ）−３７−（２，５−ジオキソ−２
，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５−イソプロピル−２−メチル−４，７
，３５−トリオキソ−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−オクタオキサ
−３，６，３４−トリアザヘプタトリアコンタンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ−７
−メトキシ−８−（（５−（（（Ｓ）−７−メトキシ−２−メチル−５−オキソ−５，１
１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−
イル）オキシ）ペンチル）オキシ）−２−メチル−５−オキソ−１１，１１ａ−ジヒドロ
−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カル
ボキシラート（６４またはＤＬ５）
１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、３３
ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）を、粗生成物６３（０．１７２ｍｍｏｌ）およびＭａｌ−（
ＰＥＧ）８−酸（１００ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（１０ｍ
Ｌ）の溶液にに添加した。反応物を２時間撹拌し、出発物質の存在はＬＣ／ＭＳによって
もはや認められなかった。反応物をジクロロメタンで希釈し、水およびブラインで連続的
に洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、過剰なジクロロメタンを減
圧下での回転蒸発によって除去した。得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフ
ィ（シリカゲル；１００％クロロホルム→１０％メタノールを含むクロロホルム）に供し
た。純粋な画分を回収し、合わせ、過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して
、６４またはＤＬ５を得た（３工程で６０ｍｇ、２５％）。
Ｉ．薬物−リンカーＤＬ４の合成（経路１）
Figure 2019069983
化合物６５は、ＷＯ２０１１／１３０５９８の化合物７９である。
（１１Ｓ）−４−（１−ヨード−２０−イソプロピル−２３−メチル−２，１８，２１
−トリオキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−３，１９，２２−トリアザテトラコ
サンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（３−（（７−メトキシ−
５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エン−１−イル）−５，１１ａ−ジヒドロ−１
Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロ
ポキシ）−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エン−１−イル）−１１，１１ａ−
ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ
）−カルボキシラート（６６またはＤＬ４）
Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、４．７１μＬ、０．０３０４ｍｍ
ｏｌ）を、アミン６５（０．０２７６ｍｍｏｌ）およびヨード−（ＰＥＧ）４−酸（１３
．１ｍｇ、０．０３０４ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（０．８ｍＬ）の溶液に添
加した。反応物を３時間撹拌し、出発物質の存在はＬＣ／ＭＳによってもはや認められな
かった。反応混合物を、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレートに直接ロードし、分取
−ＴＬＣ（１０％メタノールを含むクロロホルム）によって精製した。純粋なバンドをＴ
ＬＣプレートから削り取り、１０％メタノールを含むクロロホルム中に取り出し、濾過し
、過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して６６（Ｄ）を得た（２０．９ｍｇ
、５６％）。ＬＣ／ＭＳ，方法２，３．０８分（ＥＳ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１３６１．
１６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００）。
Ｊ．薬物−リンカーＤＬ４の合成（経路２）
以下の方法を本実施例Ｊで使用した。
ＬＣＭＳデータを、エレクトロスプレーイオン化を使用したＡｇｉｌｅｎｔ６１１０四
重極ＭＳを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣ／ＭＳを使用して得た。移動相Ａ
−０．１％酢酸水溶液。移動相Ｂ−０．１％アセトニトリル溶液。流速１．００ｍｌ／分
。３分間にわたって５％Ｂから９５％Ｂに漸増し、９５％Ｂで１分間維持し、次いで、６
秒間で５％Ｂに戻る勾配。総運転時間は５分間である。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ
Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ ３μｍ Ｃ１８、３０×２．００ｍｍ。２５４ｎｍでのＵＶ検出に
基づいたクロマトグラム。質量スペクトルを、ポジティブモードのＭＳを使用して得た。
プロトンＮＭＲ化学シフト値を、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ４００を使用した４００ＭＨｚでの
δスケールにて測定した。以下の略語を使用した：ｓ、シングレット；ｄ、ダブレット；
ｔ、トリプレット；ｑ、カルテット；ｍ、マルチプレット；ｂｒ、ブロード。結合定数を
Ｈｚで報告する。他で示さない限り、カラムクロマトグラフィ（フラッシュ手順による）
を、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌシリカ（Ａｒｔ．９３８５）で行った。質量分析（
ＭＳ）データを、Ｗａｔｅｒｓ２７９５ＨＰＬＣ分離モジュールを接続したＷａｔｅｒｓ
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ装置を使用して回収した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ
）を、シリカゲルアルミニウムプレート（Ｍｅｒｃｋ６０、Ｆ２５４）で行った。全ての
他の化学物質および溶媒をＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃから購入し、さらに精製することなく供給されたままで使用した。
旋光度をＡＤＰ２２０旋光計（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｌｔｄ．）で
測定し、濃度（ｃ）をｇ／１００ｍＬで示す。融点を、デジタル融点装置（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｔｈｅｒｍａｌ）を使用して測定した。ＩＲスペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ １０００ ＦＴ ＩＲ分光計で記録した。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲ
スペクトルを、それぞれ４００ＭＨｚおよび１００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ
ＮＭＲ分光計を使用して３００Ｋで得た。化学シフトをＴＭＳ（□＝０．０ｐｐｍ）と
比較して報告し、シグナルをｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット
）、ｄｔ（ダブルトリプレット）、ｄｄ（ダブレットオブダブレット）、ｄｄｄ（ダブル
ダブレットオブダブレット）、またはｍ（マルチプレット）と命名し、結合定数をＨｅｒ
ｔｚ（Ｈｚ）で示す。質量分析（ＭＳ）データを、Ｗａｔｅｒｓ ２９９６ ＰＤＡを備
えたＷａｔｅｒｓ ２６９５ ＨＰＬＣに接続したＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ
ＺＱ装置を使用して取得した。使用したＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱパラメ
ータは以下であった：キャピラリ（ｋＶ）、３．３８；コーン（Ｖ）、３５；エキストラ
クタ（Ｖ）、３．０；ソース温度（℃）、１００；脱溶媒和温度（℃）、２００；コーン
流速（Ｌ／ｈ）、５０；脱溶媒和流速（Ｌ／ｈ）、２５０。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ
）データを、装置内にサンプルを導入するための金属コーティングした硼珪酸ガラスチッ
プを使用したＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＱＴＯＦ Ｇｌｏｂａｌにてポジティ
ブＷ−モードで記録した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）をシリカゲルアルミニウムプ
レート（Ｍｅｒｃｋ６０，Ｆ２５４）上で行い、フラッシュクロマトグラフィにはシリカ
ゲル（Ｍｅｒｃｋ６０，２３０−４００メッシュＡＳＴＭ）を利用した。ＨＯＢｔ（Ｎｏ
ｖａＢｉｏｃｈｅｍ）および固体支持試薬（Ａｒｇｏｎａｕｔ）を除き、全ての他の化学
物質および溶媒をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく供給
されたままで使用した。無水溶媒を、適切な乾燥剤の存在における乾燥窒素雰囲気下での
蒸留によって調製し、４Åモレキュラーシーブまたはナトリウムワイヤーによって保存し
た。石油エーテルは、沸点４０〜６０℃の画分をいう。
一般的なＬＣ／ＭＳ条件：ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５）を
、水（Ａ）（ギ酸０．１％）およびアセトニトリル（Ｂ）（ギ酸０．１％）の移動相を使
用して運転した。勾配：最初の組成５％Ｂを１．０分間、次いで、５％Ｂから９５％Ｂに
３分以内。組成を０．５分間９５％Ｂで保持し、次いで、５％Ｂに０．３分間戻した。総
勾配時間運転時間は、５分間である。流速３．０ｍＬ／分、ゼロデッドボリュームのＴ字
型の部品によって４００μＬに分割し、質量分析計を通過させた。波長検出範囲：２２０
〜４００ｎｍ。ファンクションタイプ：ダイオードアレイ（５３５スキャン）。カラム：
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｏｎｙｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃ１８ ５０×４
．６０ｍｍ。
最初に、以下の中間体を調製した。
Figure 2019069983
（ａ−ｉ）（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタン酸（Ｉ
２）
クロロギ酸アリル（３６．２ｍｌ、３４０．５９ｍｍｏｌ、１．２当量）を、Ｌ−バリ
ン（Ｉ１）（３３．２５ｇ、２８３．８２ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸カリウム（
５９．２７ｇ、４２５．７４ｍｍｏｌ、１．５当量）を含む水（６５０ｍＬ）およびＴＨ
Ｆ（６５０ｍＬ）の撹拌溶液に滴下した。反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、
溶媒を減圧下で濃縮し、残存溶液をジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。水
性部分を濃ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、ＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた
有機物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、生成物
を無色オイルとして得た（５７．１ｇ、推定収率１００％）。ＬＣ／ＭＳ（１．９６６分
（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：２０２．１［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， Ｄ
ＭＳＯ−ｄ６）δ １２．５７（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．４３（ｄ， １Ｈ， Ｊ
＝ ８．６ Ｈｚ）， ５．９６ − ５．８６（ｍ， １Ｈ）， ５．３０（ｄｄｄ，
１Ｈ， Ｊ ＝ １７．２， ３．４， １．７ Ｈｚ）， ５．１８（ｄｄｄ， １
Ｈ， Ｊ ＝ １０．４， ２．９， １．６ Ｈｚ）， ４．４８（ｄｔ， ２Ｈ，
Ｊ ＝ ５．３， １．５ Ｈｚ）， ３．８５（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．６，
６．０ Ｈｚ）， ２．０３（ｏｃｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ０．８９
（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， ０．８７（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．５
Ｈｚ）．
（ａ−ｉｉ）（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（アリルオキシカル
ボニルアミノ）−３−メチルブタノアート（Ｉ３）
保護した酸Ｉ２（６０．６ｇ、３０１．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド（３４．６６ｇ、３０１．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥Ｔ
ＨＦ（８００ｍＬ）の撹拌溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（６２．１４ｇ、３
０１．１６ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応物を室温で１８時間撹拌した。次いで、
反応混合物を濾過し、固体をＴＨＦで洗浄し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残渣を
ＤＣＭに再溶解し、０℃で３０分間静置した。懸濁液を濾過し、冷ＤＣＭで洗浄した。減
圧下での濾液の濃縮により、生成物を粘稠性の無色オイルとして得た（８４．７ｇ、推定
収率１００％）。これをさらに精製せずに次の工程で使用した。ＬＣ／ＭＳ（２．１９４
分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：３２１．０［Ｍ＋Ｎａ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ）， ５．９７
− ５．８７（ｍ， １Ｈ）， ５．３０（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １７．２， ３
．０， １．７ Ｈｚ）， ５．１９（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０．４， ２．７
， １．４ Ｈｚ）， ４．５２（ｄｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．３， １．４ Ｈｚ）
， ４．３２（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．３， ６．６ Ｈｚ）， ２．８１（ｍ，
４Ｈ）， ２．１８（ｏｃｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ）， １．００（ｄ，
６Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ），
（ａ−ｉｉｉ）（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−３−
メチルブタンアミド）プロパン酸（Ｉ４）
スクシンイミドエステルＩ３（１２．９９ｇ、４３．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）を含
むＴＨＦ（５０ｍＬ）の溶液を、Ｌ−アラニン（４．０７ｇ、４５．７３ｍｍｏｌ、１．
０５当量）およびＮａＨＣＯ３（４．０２ｇ、４７．９０ｍｍｏｌ、１．１当量）を含む
ＴＨＦ（１００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１００ｍＬ）の溶液に添加した。混合物を室温で７
２時間撹拌し、この時点でＴＨＦを減圧下で除去した。クエン酸を使用してｐＨ３〜４に
調整して白色ゴムを沈殿させた。酢酸エチル（６×１５０ｍＬ）での抽出後、合わせた有
機物をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し
た。ジエチルエーテルでのトリチュレーションによって白色粉末が得られ、これを濾過に
よって回収し、ジエチルエーテル（５．７８ｇ、４９％）で洗浄した。
ＬＣ／ＭＳ（１．９２５分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：２７３．１［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ Ｎ
ＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １２．４７（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８
．１７（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ７．１６（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
９．０ Ｈｚ）， ５．９５ − ５．８５（ｍ， １Ｈ）， ５．２９（ｄｄ， １Ｈ
， Ｊ ＝ １７．２， １．７ Ｈｚ）， ５．１７（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０
．４， １．５ Ｈｚ）， ４．４６（ｍ， ２Ｈ）， ４．１８（ｑｕｉｎ， １Ｈ，
Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ３．８７（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．０， ７．１
Ｈｚ）， １．９５（ｏｃｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， １．２６（ｄ，
３Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ０．８８（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）
， ０．８３（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．
（ａ−ｉｖ）アリル（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル
アミノ）−１−オキソプロパン−２−イルアミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２
−イルカルバマート（Ｉ５）
ＥＥＤＱ（５．５１ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ、１．０５当量）を、ｐ−アミノベンジル
アルコール（２．７４ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ、１．０５当量）および酸Ｉ４（５．７８
ｇ、２１．２３ｍｍｏｌ、１当量）を含む乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）の溶液に添加し、室
温で７２時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた褐色固体をジエ
チルエーテルでトリチュレートし、濾過し、その後に過剰なジエチルエーテルで洗浄して
生成物をオフホワイト色の固体として得た（７．１ｇ、８８％）。ＬＣ／ＭＳ（１．９８
０分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：３７８．０［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ９．８９（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．１３（ｄ， １Ｈ， Ｊ
＝ ７．０ Ｈｚ）， ７．５２（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ７．２
６（ｍ， １Ｈ）， ７．２３（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ５．９１（
ｍ， １Ｈ）， ５．３０（ｍ， １Ｈ）， ５．１７（ｍ， １Ｈ）， ４．４６（ｍ
， ２Ｈ）， ５．０９（ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， ４．４８（ｍ，
２Ｈ）， ４．４２（ｍ， ３Ｈ）， ３．８９（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．６，
６．８ Ｈｚ）， １．９７（ｍ， １Ｈ）， １．３０（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．
１ Ｈｚ）， ０．８８（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．８３（ｄ，
３Ｈ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ）．
Figure 2019069983
１−ヨード−２−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−３−アザオクタデカン
−１８−酸（Ｉ７）
ヨード無水酢酸（０．２５０ｇ、０．７０６ｍｍｏｌ、１．１当量）を含む乾燥ＤＣＭ
（１ｍＬ）の溶液を、アミノ−ＰＥＧ（４）−酸Ｉ６（０．１７０ｇ、０．６４２ｍｍｏ
ｌ、１．０当量）を含むＤＣＭ（１ｍＬ）に添加した。混合物を、暗所にて室温で一晩撹
拌した。反応混合物を、０．１Ｍ ＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し
、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、３％ＭｅＯＨ、
および０．１％ギ酸を含むクロロホルム→１０％ＭｅＯＨおよび０．１％ギ酸を含むクロ
ロホルム）によって精製して、生成物を橙色オイルとして得た（０．１１８ｇ、４２％）
。ＬＣ／ＭＳ（１．６２３分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：４３３．．９８［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ
ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．０６９（ｓ， １Ｈ）， ７．２２
（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ３．７９（ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ）， ３．７
４（ｓ， ２Ｈ）， ３．７２ − ３．５８（ｍ， １４Ｈ）， ３．５０ − ３．
４６（ｍ， ２Ｈ）， ２．６２（ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ）．
（ｉｉ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキ
シ）−８−（３−ヨードプロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロ
プ−１−エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］
［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７４）
Figure 2019069983
（ａ）（Ｓ）−５−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル）−１−（５
−メトキシ−２−ニトロ−４−（トリイソプロピルシリルオキシ）ベンゾイル）−４，５
−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イルトリフルオロメタンスルホナート（４７）
トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２８．４ｇ、１００．０ｍｍｏｌ、３．０当量
）を、２，６−ルチジン（１４．４ｇ、１３０．０ｍｍｏｌ、４．０当量）を含有するケ
トン４６（１９．５ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含むＤＣＭ（５５０ｍＬ）の
強く撹拌した溶液に２５分間にわたって−５０℃で滴下した。反応混合物を１．５時間撹
拌し、この時点で、ＬＣ／ＭＳは完全な反応を示していた。有機相を水（１００ｍＬ）、
飽和重炭酸ナトリウム（１５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、有機相
をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフ
ィ（シリカゲル、９０／１０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、
生成物を淡黄色オイルとして得た（１９．５ｇ、８２％）。ＬＣ／ＭＳ（４．３９１分（
ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：７１３．２５［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， Ｃ
ＤＣｌ３）δ ７．６８（ｓ， １Ｈ）， ６．７２（ｓ， １Ｈ）， ６．０２（ｔ，
１Ｈ， Ｊ ＝ １．９ Ｈｚ）， ４．７５（ｍ， １Ｈ）， ４．０５（ｍ， ２
Ｈ）， ３．８７（ｓ， ３Ｈ）， ３．１５（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．２，
１０．３， ２．３ Ｈｚ）， ２．９６（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．２，
４．０， １．６ Ｈｚ）， １．２８ − １．２１（ｍ， ３Ｈ）， １．０７（ｄ
， １８Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ０．８８（ｓ， ９Ｈ）， ０．０９（ｓ，
３Ｈ）， ０．０８（ｓ， ３Ｈ）．
（ｂ）（Ｓ，Ｅ）−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル）−４
−（プロプ−１−エニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）（５−メト
キシ−２−ニトロ−４−（トリイソプロピルシリルオキシ）フェニル）メタノン（６７）
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．４１ｇ、０．３５ｍｍ
ｏｌ、０．０３当量）を、トリフラート４７（８．４ｇ、１１．８ｍｍｏｌ、１．０当量
）、Ｅ−１−プロペン−１−イルボロン酸（１．４２ｇ、１６．５ｍｍｏｌ、１．４当量
）およびリン酸カリウム（５．０ｇ、２３．６ｍｍｏｌ、２．０当量）を含む乾燥ジオキ
サン（６０ｍＬ）の混合物に窒素雰囲気下で添加した。混合物を２５℃で１２０分間撹拌
し、その時点で、ＬＣ／ＭＳは完全な反応を示していた。酢酸エチル（１２０ｍＬ）およ
び水（１２０ｍＬ）を添加し、有機相を除去し、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳ
Ｏ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリ
カゲル、９５／５ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ→９０／１０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキ
サン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を黄色泡として得た（４．９６ｇ、７０％
）。ＬＣ／ＭＳ（４．４７７分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：６０５．０［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ
ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．６７（ｓ， １Ｈ）， ６．７４（ｓ
， １Ｈ）， ５．９３（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．４ Ｈｚ）， ５．６７（ｓ，
１Ｈ）， ４．６５（ｍ， １Ｈ）， ４．０４（ｍ， ２Ｈ）， ３．８６（ｓ，
３Ｈ）， ２．８５（ｍ， １Ｈ）， ２．７１（ｍ， １Ｈ）， １．７２（ｄｄ，
３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， １．０ Ｈｚ）， １．３０ − １．２２（ｍ， ３Ｈ）
， １．０７（ｄ， １８Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ０．８７（ｓ， ９Ｈ），
０．０８（ｓ， ３Ｈ）， ０．０７（ｓ， ３Ｈ）．
（ｃ）（Ｓ，Ｅ）−（２−アミノ−５−メトキシ−４−（トリイソプロピルシリルオキ
シ）フェニル）（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル）−４−（プ
ロプ−１−エニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メタノン（６８）
亜鉛粉（２２．０ｇ、０．３３ｍｏｌ、３７当量）を、２５〜３０℃に維持するために
氷浴を使用して、プロペニル中間体６７（５．５ｇ、９．１ｍｍｏｌ、１．０当量）を含
む５％ｖ／ｖギ酸／エタノール（５５ｍＬ）の溶液に２０分間にわたって少しずつ添加し
た。３０分後、反応混合物を、セライト（登録商標）のショートベッドにて濾過した。セ
ライト（登録商標）を酢酸エチル（６５ｍＬ）で洗浄し、合わせた有機物を、水（３５ｍ
Ｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（３５ｍＬ）、およびブライン（１０ｍＬ）で連続的に洗浄
した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュク
ロマトグラフィ（シリカゲル、９０／１０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によっ
て精製して、生成物を淡黄色オイルとして得た（３．６ｇ、６９．０％）。ＬＣ／ＭＳ（
４．４３９分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：５７５．２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００
ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ６．７５（ｍ， １Ｈ）， ６．４０（ｂｒ ｓ， １Ｈ）
， ６．２８（ｍ， １Ｈ）， ６．１１（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．４ Ｈｚ），
５．５３（ｍ， １Ｈ）， ４．６７（ｍ， １Ｈ）， ４．３６（ｍ， ２Ｈ），
３．９３（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ３．８４（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ３．７３（ｓ，
３Ｈ）， ２．８６（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．７， １０．４ Ｈｚ）， ２．
７３（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．９， ４．５ Ｈｚ）， １．８０（ｄｄ， ３
Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， １．３ Ｈｚ）， １．３５ − １．２３（ｍ， ３Ｈ），
１．１２（ｄ， １８Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ０．８９（ｓ， ９Ｈ），
０．０８（ｓ， ３Ｈ）， ０．０７（ｓ， ３Ｈ）．
（ｄ）（Ｓ，Ｅ）−アリル２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メ
チル）−４−（プロプ−１−エニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボ
ニル）−４−メトキシ−５−（トリイソプロピルシリルオキシ）フェニルカルバマート（
６９）
クロロギ酸アリル（０．８３ｇ、６．８８ｍｍｏｌ、１．１当量）を、乾燥ピリジン（
１．０９ｇ、１３．７７ｍｍｏｌ、２．２当量）を含有するアミン６８（３．６ｇ、６．
２６ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥ＤＣＭ（８０ｍＬ）溶液に−７８℃で添加した。
ドライアイスを除去し、反応混合物を室温に加温した。さらなる１５分間の撹拌後、ＬＣ
／ＭＳは完全な反応を示した。有機相を、０．０１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬ）、飽和重炭酸
ナトリウム（５０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥さ
せ、濾過し、減圧下で濃縮して淡黄色オイルを得た。これを、さらに精製せずに次の工程
で使用した（４．１２ｇ、推定収率１００％）。ＬＣ／ＭＳ（４．８６２分（ＥＳ＋））
，ｍ／ｚ：６５９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
（ｅ）（Ｓ，Ｅ）−アリル２−（２−（ヒドロキシメチル）−４−（プロプ−１−エニ
ル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（ト
リイソプロピルシリルオキシ）フェニルカルバマート（７０）
粗中間体６９（推定収率１００％、４．１２ｇ、６．２５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、
酢酸（７０ｍＬ）、メタノール（１０ｍＬ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）、および水（２０ｍＬ
）の混合物に溶解し、室温で撹拌した。６時間後、反応混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ
）で希釈し、水（２×５００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（３００ｍＬ）、およびブラ
イン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下
で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、１／９９ ｖ／ｖメタノ
ール／ＤＣＭ→５／９５ ｖ／ｖメタノール／ＤＣＭ）によって精製して、生成物を黄色
オイルとして得た。さらに１ｇの未反応出発物質が回収された。この材料を上記と同一の
反応条件に供したが、１６時間撹拌した。ワークアップおよび精製後、さらなる生成物を
単離した（２．７ｇ、７９％、２工程）ＬＣ／ＭＳ（３．７４２分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ
：５４５．２［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．３
８（ｍ， １Ｈ）， ７．７２（ｍ， １Ｈ）， ６．８１（ｓ， １Ｈ）， ６．３７
（ｍ， １Ｈ）， ６．１０（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．８ Ｈｚ）， ５．９７（
ｍ， １Ｈ）， ５．５３（ｍ， １Ｈ）， ５．３６（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １
７．２， ３．１， １．５ Ｈｚ）， ５．２５（ｄｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０．
４， ２．５， １．３ Ｈｚ）， ４．７８（ｍ， １Ｈ）， ４．６５（ｄｔ， ２
Ｈ， Ｊ ＝ ５．７， １．３ Ｈｚ）， ３．８４（ｍ， ３Ｈ）， ３．７９（ｓ
， ３Ｈ）， ３．０４（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．７， １０．５ Ｈｚ），
２．４０（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．０， ４．５ Ｈｚ）， １．８２（ｄｄ，
３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， １．０ Ｈｚ）， １．３６ − １．２６（ｍ， ３Ｈ
）， １．１４（ｄ， １８Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）．
（ｆ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−
２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−８−（トリイソプロピルシリルオキシ）−１１，
１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１
０（５Ｈ）−カルボキシラート（７１）
乾燥ジメチルスルホキシド（１．１６ｇ、１４．８７ｍｍｏｌ、３．０当量）を、塩化
オキサリル（０．９４ｇ、７．４３ｍｍｏｌ、１．５当量）を含むＤＣＭ（２５ｍＬ）の
溶液に−７８℃にて窒素雰囲気下で滴下した。−７８℃に保持し、１０分後、第一級アル
コール７０（２．７ｇ、４．９６ｍｍｏｌ、１．０当量）を含むＤＣＭ（２０ｍＬ）の溶
液を滴下した。さらに１５分後、乾燥トリエチルアミン（２．５ｇ、２４．７８ｍｍｏｌ
、５．０当量）を添加し、反応混合物を室温に加温した。反応混合物を、０．１Ｎ冷ＨＣ
ｌ（５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）、およびブライン（１０ｍＬ）で
連続的に洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、生成物を
黄色オイルとして得た。これをさらに精製せずに次の工程で使用した（２．６８ｇ、推定
収率１００％）。ＬＣ／ＭＳ（３．５４８分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：５４３．２［Ｍ＋Ｈ
］＋。
（ｇ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ
）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−８−（トリイソ
プロピルシリルオキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２
−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７２）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート（３．９３ｇ、１４
．８７ｍｍｏｌ、３．０当量）を、カルビノールアミン７１（推定収率１００％、２．６
８ｇ、４．９６ｍｍｏｌ、１．０当量）および２，６−ルチジン（２．１２ｇ、１９．８
３ｍｍｏｌ、４．０当量）を含む乾燥ＤＣＭ（４０ｍＬ）の溶液に０℃にて窒素雰囲気下
で添加した。１０分後、反応混合物を室温に加温し、さらに６０分間撹拌した。有機相を
、水（１０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（１０ｍＬ）、およびブライン（５ｍＬ）で連
続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュク
ロマトグラフィ（シリカゲル、クロロホルム→２／９８ ｖ／ｖメタノール／クロロホル
ム）によって精製して、生成物を黄色オイルとして得た（２．０ｇ、６３％、２工程）。
ＬＣ／ＭＳ（４．７４８分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：６５７．２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭ
Ｒ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．１９（ｓ， １Ｈ）， ６．８６（ｍ，
１Ｈ）， ６．６６（ｓ， １Ｈ）， ６．２２（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．４ Ｈ
ｚ）， ５．８１（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ５．７８（ｍ， １Ｈ）
， ５．４８（ｍ， １Ｈ）， ５．１１（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ），
５．０８（ｍ， １Ｈ）， ４．５８（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １３．４， ５．４
Ｈｚ）， ４．３５（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １３．２， ５．７ Ｈｚ）， ３．８
３（ｓ， ３Ｈ）， ３．７６（ｓ， １Ｈ）， ３．００（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
１５．６， １１．０ Ｈｚ）， ２．５３（ｍ， １Ｈ）， １．８１（ｄｄ， ３Ｈ
， Ｊ ＝ ６．８， ０．９ Ｈｚ）， １．３０ − １．１８（ｍ， ３Ｈ），
１．０８（ｄ， ９Ｈ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ）， １．０６（ｄ， ９Ｈ， Ｊ ＝
２．３ Ｈｚ）， ０．８６（ｓ， ９Ｈ）， ０．２５（ｓ， ３Ｈ）， ０．１８
（ｓ， ３Ｈ）．
（ｈ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ
）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）
−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼ
ピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７３）
酢酸リチウム二水和物（０．３１ｇ、３．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ジアゼピン
７２（２．０ｇ、３．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む湿性ＤＭＦ（２０ｍＬ）の溶液
に２５℃で添加し、４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、
０．１Ｍクエン酸（５０ｍＬ、ｐＨ３）、水（５０ｍＬ）、およびブライン（１０ｍＬ）
で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシ
ュクロマトグラフィ（シリカゲル、５０／５０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ→２
５／７５ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を淡黄色固体
として得た（０．６８ｇ、４５％）。ＬＣ／ＭＳ（３．３５２分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：
５０１．１［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．０２
（ｓ， １Ｈ）， ６．６６（ｍ， １Ｈ）， ６．５３（ｓ， １Ｈ）， ６．０３（
ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．５ Ｈｚ）， ５．８０（ｓ， １Ｈ）， ５．６３（ｄ
， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ）， ５．５５（ｍ， １Ｈ）， ５．２９（ｍ，
１Ｈ）， ４．８７（ｍ， ２Ｈ）， ４．３９（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １３．５，
４．２ Ｈｚ）， ４．２０（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １３．２， ５．７ Ｈｚ）
， ３．７３（ｓ， ３Ｈ）， ３．５９（ｍ， １Ｈ）， ２．８１（ｄｄ， １Ｈ，
Ｊ ＝ １６．１， １０．５ Ｈｚ）， ２．３５（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．
７ Ｈｚ）， １．６１（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， ０．６７（ｓ，
９Ｈ）， ０．０５（ｓ， ３Ｈ）， ０．００（ｓ， ３Ｈ）．
（ｉ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル１１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ
）−８−（３−ヨードプロポキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ
−１−エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［
１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７４）
ジヨードプロパン（０．２９５ｇ、１．００ｍｍｏｌ、５．０当量）および炭酸カリウ
ム（０．０２８ｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、フェノール３３（０．１００ｇ
、０．０２０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥アセトン（５ｍＬ）の溶液に添加した。
反応混合物を６０℃で６時間加熱し、その時点で、ＬＣ／ＭＳは完全な反応を示した。反
応混合物を減圧下で濃縮乾固し、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、７５
／２５ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ→５０／５０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／Ｅｔ
ＯＡｃ）によって精製して、生成物を無色オイルとして得た（０．０７４ｇ、５６％）。
ＬＣ／ＭＳ（３．８５３分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：６６９．０［Ｍ＋Ｈ］＋． １Ｈ Ｎ
ＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ７．２６（ｓ， １Ｈ）， ６．９０（ｓ，
１Ｈ）， ６．６８（ｓ， １Ｈ）， ６．２４（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．３
Ｈｚ）， ５．８７（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ）， ５．７８（ｍ， １Ｈ
）， ５．５３（ｍ， １Ｈ）， ５．１２（ｍ， ２Ｈ）， ４．６５（ｍ， ２Ｈ）
， ４．４１（ｍ， １Ｈ）， ４．１１（ｍ， １Ｈ）， ３．９３（ｓ， ３Ｈ），
３．８１（ｍ， １Ｈ）， ３．４０（ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ）， ３
．０５（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．３， １０．１ Ｈｚ）， ２．５７（ｍ，
１Ｈ）， ２．３４（ｍ， ２Ｈ）， １．８４（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ
）， ０．９２（ｓ， ９Ｈ）， ０．２８（ｓ， ３Ｈ）， ０．２６（ｓ， ３Ｈ）
．
（ｉｉｉ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（アリルオキシ
カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル１１−（ｔｅ
ｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２
−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロ
ロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７９）
Figure 2019069983
（ａ）アリル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（２−（（Ｓ）−２−（
（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−（（Ｅ）−プロプ−１−
エン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキ
シ−５−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）メチ
ル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−
オキソブタン−２−イル）カルバマート（７５）
トリエチルアミン（０．２５６ｍＬ、１．８４ｍｍｏｌ、２．２当量）を、アミン６８
（０．４８０ｇ、０．８３５ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリホスゲン（０．０８９ｇ
、０．３０１ｍｍｏｌ、０．３６当量）を含む乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）の撹拌懸濁液に５
℃で（氷浴）添加した。イソシアナート反応の進行を、反応混合物からアリコートを定期
的に取り出し、メタノールで反応停止させ、ＬＣＭＳ分析を行うことによってモニタリン
グした。一旦イソシアナート反応が完了すると、Ａｌｌｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＯ
Ｈ Ｉ５（０．４７３ｇ、１．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）およびトリエチルアミン（０
．１７４ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）を含む乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）の溶液を
、新たに調製したイソシアナートに注入することによって迅速に添加した。反応物を４０
℃で４時間撹拌し、その後に室温で一晩撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュ
クロマトグラフィ（シリカゲル、２０／８０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ→５０
／５０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、次いで、１／９９ ｖ／ｖ ＤＣＭ／Ｍｅ
ＯＨ→５／９５ ｖ／ｖ ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって精製して、生成物を黄色固体とし
て得た（０．５７９ｇ、７１％）。ＬＣ／ＭＳ（４．４６８分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：９
７８．５５［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．６３
（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．４２（ｓ， １Ｈ）， ７．７８（ｂｒ ｓ， １Ｈ），
７．５３（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ）， ７．３１（ｄ， ２Ｈ， Ｊ
＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．７６（ｓ， １Ｈ）， ６．５９（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
７．６ Ｈｚ）， ６．３６（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．０４（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
１５．９ Ｈｚ）， ５．９０（ｍ， １Ｈ）， ５．５５（ｍ， １Ｈ）， ５．３
３ − ５．２１（ｍ， ３Ｈ）， ５．１０（ｓ， ２Ｈ）， ４．６６（ｍ， ２Ｈ
）， ４．５７（ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．６， １．０ Ｈｚ）， ３．９８（ｄ
ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．３， ６．８ Ｈｚ）， ３．９０（ｍ， １Ｈ）， ３．
８１（ｍ， １Ｈ）， ３．７８（ｓ， ３Ｈ）， ２．８２（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
１５．４， ９．６ Ｈｚ）， ２．７２（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．９， ３
．５ Ｈｚ）， ２．１７（ｍ， １Ｈ）， １．７８（ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．
５， ０．８ Ｈｚ）， １．４６（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， １．２
９（ｍ， ３Ｈ）， １．１１（ｄ， １８Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， ０．９７
（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．９２（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８
Ｈｚ）， ０．８３（ｓ， ９Ｈ）， ０．０４（ｓ， ３Ｈ）， ０．０１（ｓ，
３Ｈ）．
（ｂ）アリル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（２−（（Ｓ）−２−（
ヒドロキシメチル）−４−（（Ｅ）−プロプ−１−エン−１−イル）−２，３−ジヒドロ
−１Ｈ−ピロール−１−カルボニル）−４−メトキシ−５−（（トリイソプロピルシリル
）オキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ
プロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバマー
ト（７６）
シリルエーテル７５（１．４９ｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）を、酢酸／メタノ
ール／テトラヒドロフラン／水の７：１：１：２混合物（１４：２：２：４ｍＬ）に溶解
し、室温で撹拌した。２時間後、反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水、重炭
酸ナトリウム水溶液、次いで、ブラインで連続的に洗浄した。次いで、有機相をＭｇＳＯ
４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカ
ゲル、１００／０、次いで９９／１→９２／８ ｖ／ｖ ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって精
製して、生成物を橙色固体として得た（１．２ｇ、９２％）。ＬＣ／ＭＳ（３．６４９分
（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：８６５．４４［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）δ ８．４４（ｓ， １Ｈ）， ８．３５（ｓ， １Ｈ）， ７．６９（ｂ
ｒ ｓ， １Ｈ）， ７．５３（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ７．３２（
ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ）， ６．７８（ｓ， １Ｈ）， ６．５６（ｍ，
２Ｈ）， ６．３２（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．０５（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １４
．９ Ｈｚ）， ５．９０（ｍ， １Ｈ）， ５．５６（ｍ， １Ｈ）， ５．３０（ｍ
， ２Ｈ）， ５．２２（ｍ， １Ｈ）， ５．１０（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ３．１
Ｈｚ）， ４．７３（ｍ， １Ｈ）， ４．６４（ｍ， １Ｈ）， ４．５７（ｄ， ２
Ｈ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ）， ４．０１（ｍ， １Ｈ）， ３．７９（ｍ， ２Ｈ）
， ３．７６（ｓ， ３Ｈ）， ２．９８（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．３， １０
．２ Ｈｚ）， ２．３８（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １６．６， ４．１ Ｈｚ），
２．１６（ｍ， １Ｈ）， １．７８（ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， ０．９ Ｈ
ｚ）， １．４６（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， １．２９（ｍ， ３Ｈ）
， １．１１（ｄ， １８Ｈ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）， ０．９７（ｄ， ３Ｈ，
Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ）， ０．９２（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．
（ｃ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカル
ボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ
−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−８−（トリイソプ
ロピルシリルオキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−
ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７７）
乾燥ジメチルスルホキシド（０．１８０ｇ、２．３ｍｍｏｌ、３．０当量）を、塩化オ
キサリル（０．１４７ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１．５当量）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶
液に−７８℃にて窒素雰囲気下で滴下した。−７８℃に保持し、２０分後、第一級アルコ
ール７６（０．６６６ｇ、０．７７ｍｍｏｌ、１．０当量）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の
溶液を滴下した。さらに１５分後、乾燥トリエチルアミン（０．３９０ｇ、３．８５ｍｍ
ｏｌ、５．０当量）を添加し、反応混合物を室温に加温した。反応混合物を、０．１Ｎ冷
ＨＣｌ（１０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（１０ｍＬ）、およびブライン（５ｍＬ）
で連続的に洗浄した。次いで、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し
た。次いで、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、５０／５０ ｖ／ｖ ｎ
−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ→２５／７５ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精
製して、生成物を白色固体として得た（０．３５６ｇ、５４％）。ＬＣ／ＭＳ（３．４８
７分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：８６２．２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）δ ８．３４（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．４７（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
７．６ Ｈｚ）， ７．１７（ｓ， １Ｈ）， ７．１４（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７
．５ Ｈｚ）， ６．８６（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．６５（ｂｒ ｓ， １Ｈ），
６．４２（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ６．２２（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
１４．４ Ｈｚ）， ５．８０（ｍ， １Ｈ）， ５．４０（ｍ， １Ｈ）， ５．５
３（ｍ， １Ｈ）， ５．３２（ｍ， １Ｈ）， ５．２１（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ９
．６ Ｈｚ）， ５．０６（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １２．３ Ｈｚ）， ４．９０（ｍ
， １Ｈ）， ４．５８（ｍ， ３Ｈ）， ３．９８（ｍ， １Ｈ）， ３．８４（ｍ，
１Ｈ）， ３．８１（ｓ， ３Ｈ）， ３．５０（ｍ， １Ｈ）， ３．０５（ｄｄ，
１Ｈ， Ｊ ＝ １６．０， １０．３ Ｈｚ）， ２．７６（ｍ， １Ｈ）， ２．
１５（ｍ， １Ｈ）， １．８０（ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．７， ０．８ Ｈｚ）
， １．４４（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， １．１６（ｍ， ３Ｈ），
１．０１（ｄ， １８Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ０．９６（ｄ， ３Ｈ， Ｊ
＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．９２（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．
（ｄ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカル
ボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル１１−（ｔｅｒｔ
−ブチルジメチルシリルオキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−
１−エニル）−８−（トリイソプロピルシリルオキシ）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ
−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシ
ラート（７８）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート（０．４６ｇ、１．
７４ｍｍｏｌ、３．０当量）を、第二級アルコール７７（０．５ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、
１．０当量）および２，６−ルチジン（０．２５ｇ、２．３２ｍｍｏｌ、４．０当量）を
含む乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に０℃にて窒素雰囲気下で添加した。１０分後、反応
混合物を室温に加温し、さらに１２０分間撹拌した。次いで、有機相を、水（１０ｍＬ）
、飽和重炭酸ナトリウム（１０ｍＬ）、およびブライン（５ｍＬ）で連続的に洗浄し、Ｍ
ｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（
シリカゲル、５０／５０ ｖ／ｖ ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成
物を白色固体として得た（０．３２０ｇ、５７％）。ＬＣ／ＭＳ（４．４１５分（ＥＳ＋
）），ｍ／ｚ：９７６．５２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ
３）δ ８．３１（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．４８（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．０
Ｈｚ）， ７．２１（ｓ， １Ｈ）， ７．１４（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ
）， ６．８９（ｓ， １Ｈ）， ６．６５（ｓ， １Ｈ）， ６．３８（ｄ， １Ｈ，
Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ６．２５（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １４．６ Ｈｚ），
５．９３（ｍ， １Ｈ）， ５．８５（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ５．
５０（ｍ， １Ｈ）， ５．３４（ｍ， １Ｈ）， ５．２４（ｍ， ２Ｈ）， ５．１
５（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ）， ４．８６（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １
２．２ Ｈｚ）， ４．６２（ｍ， ３Ｈ）， ４．０１（ｍ， １Ｈ）， ３．８６（
ｓ， ３Ｈ）， ３．７８（ｍ， １Ｈ）， ３．０４（ｍ， １Ｈ）， ２．５６（ｍ
， １Ｈ）， ２．２０（ｍ， １Ｈ）， １．８４（ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．６
， ０．７ Ｈｚ）， １．４８（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， １．２０
（ｍ， ３Ｈ）， １．０５（ｄ， ９Ｈ， Ｊ ＝ ２．９ Ｈｚ）， １．０３（ｄ
， ９Ｈ， Ｊ ＝ ２．９ Ｈｚ）， ０．９９（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈ
ｚ）， ０．９５（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．８８（ｓ， ９Ｈ）
， ０．２７（ｓ， ３Ｈ）， ０．１４（ｓ， ３Ｈ）．
（ｅ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（アリルオキシカル
ボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル１１−（ｔｅｒｔ
−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２−（
（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［
１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（７９）
酢酸リチウム二水和物（０．０１０ｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、シリルエ
ーテル７８（０．１００ｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む湿性ＤＭＦ（２ｍＬ
）の溶液に２５℃で３時間添加した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希
釈し、０．１Ｍクエン酸（２０ｍＬ、ｐＨ３）、水（２０ｍＬ）、およびブライン（５ｍ
Ｌ）で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラ
ッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、５／９５ ｖ／ｖメタノール／ＤＣＭ）によって
精製して、生成物を淡黄色オイルとして得た（０．０７０ｇ、８３％）。ＬＣ／ＭＳ（３
．３６２分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：８２０．２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（４００ Ｍ
Ｈｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．３９（ｓ， １Ｈ）， ７．４８（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
８．２ Ｈｚ）， ７．２５（ｓ， １Ｈ）， ７．１２（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８
．１ Ｈｚ）， ６．８８（ｓ， １Ｈ）， ６．６８（ｓ， １Ｈ）， ６．４７（ｄ
， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ６．２４（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １５．２
Ｈｚ）， ６．０３（ｓ， １Ｈ）， ５．９２（ｍ， １Ｈ）， ５．８４（ｄ， １
Ｈ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ）， ５．５０（ｍ， １Ｈ）， ５．３４（ｍ， １Ｈ）
， ５．２６（ｍ， ２Ｈ）， ５．１８（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １２．３ Ｈｚ），
４．８０（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ）， ４．６６ − ４．６０（ｍ
， ３Ｈ）， ４．０２（ｍ， １Ｈ）， ３．９５（ｓ， ３Ｈ）， ３．８１（ｍ，
１Ｈ）， ３．０３（ｍ， １Ｈ）， ２．５７（ｍ， １Ｈ）， ２．１９（ｍ，
１Ｈ）， １．８４（ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， ０．８ Ｈｚ）， １．４８
（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， １．００（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８
Ｈｚ）， ０．９５（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．８７（ｓ， ９
Ｈ）， ０．２６（ｓ， ３Ｈ）， ０．１２（ｓ， ３Ｈ）．
（ｉｖ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２０Ｓ，２３Ｓ）−１−ヨード−２０−イソ
プロピル−２３−メチル−２，１８，２１−トリオキソ−６，９，１２，１５−テトラオ
キサ−３，１９，２２−トリアザテトラコサンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ−７−
メトキシ−８−（３−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１
−エニル）−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４
］ジアゼピン−８−イルオキシ）プロポキシ）−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１
−エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，
４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（６６またはＤＬ４）
Figure 2019069983
（ａ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル８−（３−（（１１Ｓ，１１ａＳ）−１０−（（
４−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタ
ンアミド）プロパンアミド）ベンジルオキシ）カルボニル）−１１−（ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリルオキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニ
ル）−５，１０，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ
］［１，４］ジアゼピン−８−イルオキシ）プロポキシ）−１１−（ｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリルオキシ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル
）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジア
ゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（８０）
炭酸カリウム（０．０３０ｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、フェノール７９（
０．１７５ｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヨードリンカー７４（０．２１４
ｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）を含むアセトン（１０ｍＬ）の溶液に添加した。反
応混合物を、窒素雰囲気下で密栓フラスコ中にて７５℃で１７時間加熱した。反応混合物
を減圧下で濃縮乾固し、フラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、２／９８ ｖ／ｖメ
タノール／ＤＣＭ→５／９５ ｖ／ｖメタノール／ＤＣＭ）によって精製して、生成物を
淡黄色固体として得た（０．１００ｇ、３５％）。ＬＣ／ＭＳ（４．２９３分（ＥＳ＋）
），ｍ／ｚ：１３５９．１３［Ｍ］＋．
（ｂ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−アリル８−（３−（（１１Ｓ，１１ａＳ）−１０−（（
４−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタ
ンアミド）プロパンアミド）ベンジルオキシ）カルボニル）−１１−ヒドロキシ−７−メ
トキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−５，１０，１１，１１ａ−
テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イ
ルオキシ）プロポキシ）−１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）
−プロプ−１−エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２
−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（８１）
テトラ−ｎ−ブチルフッ化アンモニウム（１Ｍ、０．２２ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ、２
．０当量）を、シリルエーテル８０（０．１５０ｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．０当量）を
含む乾燥ＴＨＦ（２ｍＬ）の溶液に添加した。反応混合物を室温で２０分間撹拌し、その
後に、ＬＣ／ＭＳは完全な反応を示した。反応混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し
、水（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾
燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して黄色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（シリ
カゲル、６／９４ ｖ／ｖメタノール／ＤＣＭ→１０／９０ ｖ／ｖメタノール／ＤＣＭ
）による精製により、生成物を淡黄色固体として得た（０．０９０ｇ、７３％）。ＬＣ／
ＭＳ（２．９４７分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：１１５４．０［Ｍ＋Ｎａ］＋． １Ｈ ＮＭ
Ｒ（４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ ８．３９（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．３９（
ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ７．１８（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．６
Ｈｚ）， ７．１０（ｍ， ３Ｈ）， ６．８６（ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １０．０
Ｈｚ）， ６．７４（ｓ， １Ｈ）， ６．５５（ｓ， １Ｈ）， ６．２２（ｄｄ，
２Ｈ， Ｊ ＝ １５．３， ６．６ Ｈｚ）， ５．８５（ｍ， ２Ｈ）， ５．７４
（ｍ， ３Ｈ）， ５．５２（ｍ， ２Ｈ）， ５．２２（ｍ， １Ｈ）， ５．００（
ｍ， ２Ｈ）， ４．５７（ｍ， ６Ｈ）， ４．４１（ｍ， ２Ｈ）， ４．０９（ｍ
， ４Ｈ）， ３．８５（ｍ， １１Ｈ）， ３．０６（ｍ， ２Ｈ）， ２．７６（ｍ
， ２Ｈ）， ２．２０（ｍ， ２Ｈ）， ２．０８（ｍ， １Ｈ）， １．７９（ｄ，
６Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， １．４０（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ
）， ０．９０（ｍ， ６Ｈ）．
（ｃ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−アミノ−３−メチル
ブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ−７−メトキシ−８−（３−
（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−５，１１
ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イ
ルオキシ）プロポキシ）−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−エニル）−１１，１
１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１０
（５Ｈ）−カルボキシラート（６５）
テトラキス（トリフェニルホスフェン（ｐｈｏｓｐｅｎｅ））パラジウム（０）（０．
００５ｇ、０．００５ｍｍｏｌ、０．０６当量）を、ビス−カルビノールアミン８１（０
．０９０ｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびピロリジン（１６μＬ、０．２０ｍ
ｍｏｌ、２．５当量）を含む乾燥ＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に添加した。２０分後、反応混
合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム（５ｍＬ）およびブライン（
５ｍＬ）で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去して粗
生成物を淡黄色固体として得た。これを、さらに精製せずに次の工程で使用した（０．０
７５ｇ、推定収率１００％）。ＬＣ／ＭＳ（２．０６０分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：９４７
．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
（ｄ）（１１Ｓ，１１ａＳ）−４−（（２０Ｓ，２３Ｓ）−１−ヨード−２０−イソプ
ロピル−２３−メチル−２，１８，２１−トリオキソ−６，９，１２，１５−テトラオキ
サ−３，１９，２２−トリアザテトラコサンアミド）ベンジル１１−ヒドロキシ−７−メ
トキシ−８−（３−（（Ｓ）−７−メトキシ−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−
エニル）−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］
ジアゼピン−８−イルオキシ）プロポキシ）−５−オキソ−２−（（Ｅ）−プロプ−１−
エニル）−１１，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４
］ジアゼピン−１０（５Ｈ）−カルボキシラート（６６またはＤＬ４）
ＥＤＣＩ（０．０１５ｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、アミン６５（推定収率
１００％ ０．０７５ｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヨードアセトアミド−
ＰＥＧ４−酸Ｉ７（０．０３４ｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥ジクロロ
メタン（５ｍＬ）の溶液に添加し、反応物を暗所で撹拌した。５０分後、さらなる量のヨ
ードアセトアミド−ＰＥＧ４−酸Ｉ７（０．００７ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、０．２当量
）を、さらなる量のＥＤＣＩ（０．００３ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、０．２当量）と共に
添加した。全部で２．５時間後、反応混合物をジクロロメタン（１５ｍＬ）で希釈し、水
（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾
燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（シ
リカゲル、クロロホルム１００％→９０：１０ ｖ／ｖ クロロホルム：メタノール）に
よって精製した。純粋な画分を合わせて生成物を得た（０．０２５４ｇ、２３％、２工程
）。粗画分を回収し、分取ＴＬＣ（シリカゲル、９０：１０ ｖ／ｖ クロロホルム：メ
タノール）によって精製して、第２の生成物バッチを得た（０．００３６ｇ、３％、２工
程）。ＬＣ／ＭＳ（２．６８９分（ＥＳ＋）），ｍ／ｚ：６８１．０ １／２［Ｍ＋２Ｈ
］＋。
この実施例１で合成した化合物を本明細書中に開示の抗ＤＬＬ３抗体とコンジュゲート
して開示のＡＤＣ１〜５を得ることができると認識されるであろう。
実施例２
抗ＤＬＬ３抗体の生成
抗ＤＬＬ３マウス抗体を以下のように産生した。第１の免疫キャンペーンでは、３匹の
マウス（それぞれ、以下の系統由来の１匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等体
積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはミョウバンアジュバントで乳化したヒトＤＬＬ
３−ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物を、
Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カタログ番号ＡＧ−４０Ａ−０１１３
）から購入した。１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃ／マウスを含むＴｉｔｅｒＭａｘの乳濁液
を使用して初回免疫を行った。次いで、マウスに、２週間毎に５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃ
／マウスを含むミョウバンアジュバントで追加免疫した。融合前の最終注射を、５μｇの
ｈＤＬＬ３−Ｆｃ／マウスを含むＰＢＳを使用して行った。
第２の免疫キャンペーンでは、６匹のマウス（それぞれ、以下の系統由来の２匹：Ｂａ
ｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはミョウ
バンアジュバントで乳化したヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を
接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質を、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現する
ように操作したＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製した。初回免疫を、１０μｇのｈＤＬＬ３
−Ｈｉｓ／マウスを含むＴｉｔｅｒＭａｘの乳濁液を用いて行った。次いで、マウスに、
２週間毎に５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ／マウスを含むミョウバンアジュバントで追加免
疫した。最終注射を、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作した２×１０５個のＨＥＫ−
２９３Ｔ細胞を使用して行った。
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＤＬＬ３に特異的なマウスＩｇＧ抗体のマウ
ス血清をスクリーニングした。バックグラウンドを超える陽性シグナルは、ＤＬＬ３に特
異的な抗体を示した。簡潔に述べれば、９６ウェルプレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ，カタログ番号６１０７４４）を、組換えＤＬＬ３−Ｈｉｓを０．５μｇ／ｍ
ｌで含むＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中で一晩コーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ
）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでの洗浄後、ウェルを、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓを２００μＬ／ウェルで使用して室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。マウス血清
を用量設定し（１：１００、１：２００、１：４００、および１：８００）、ＤＬＬ３コ
ーティングしたプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、ＲＴで１時間インキュベートした
。プレートを洗浄し、次いで、３％ＢＳＡ−ＰＢＳまたは２％ＦＣＳを含むＰＢＳで１０
，０００倍希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧとＲＴで１時間イ
ンキュベートした。再度プレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３４０２８）を、ＲＴで１５分間添加した。発色後、等
体積の２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して基質発色を停止させ、プレートを分光光度計によって
ＯＤ４５０で分析した。
血清陽性免疫マウスを屠殺し、排出リンパ節（膝窩、鼠径部、および内側腸骨）を切り
出し、抗体産生細胞の供給源として使用した。Ｂ細胞の細胞懸濁液（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免
疫マウス由来のおよそ２２９×１０６細胞およびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫マウス由来の５
１０×１０６細胞）を、モデルＢＴＸ Ｈｙｂｒ免疫系（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐ
ｐａｒａｔｕｓ）を使用した電気細胞融合によって１：１の比率で非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａ
ｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合した。細胞を、アザセリン、１５％胎児クローンＩ血清、
１０％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１
ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン
、および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリ
ドーマ選択培地に再懸濁し、１００ｍＬ選択培地／フラスコを含む４つのＴ２２５フラス
コ中で培養した。フラスコを、５％ＣＯ２および９５％大気を含む加湿した３７℃のイン
キュベーターに６〜７日間入れた。
融合６日目または７日目に、ハイブリドーマライブラリー細胞をフラスコから回収し、
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫キャンペーン用の６４枚のＦａｌｃｏｎ９６ウェルプレートおよ
び４８枚の９６ウェルプレート中の２００μＬの補足ハイブリドーマ選択培地（上記）中
にウェルあたり１細胞をプレートした（ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｉセルソーターを使用）。ラ
イブラリーの残りを液体窒素中で保存した。
ハイブリドーマを１０日間培養し、上清を、以下のように実施したフローサイトメトリ
ーを使用してｈＤＬＬ３に特異的な抗体についてスクリーニングした。ヒトＤＬＬ３、マ
ウスＤＬＬ３（色素で染色済み）、またはカニクイザルＤＬＬ３（Ｄｙｌｉｇｈｔ８００
で染色済み）を過剰発現するように操作した１×１０５／ウェルのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞
を、２５μＬハイブリドーマ上清と共に３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／
２％ＦＣＳで洗浄し、次いで、２５μＬ／サンプルのＤｙｅＬｉｇｈｔ ６４９標識ヤギ
−抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３００倍希釈したＦｃフラグメント特異的二次
抗体）とインキュベートした。インキュベーション１５分後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳ
で２回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁し、アイソタイプコントロー
ル抗体で染色した細胞の蛍光を超える蛍光についてフローサイトメトリーによって分析し
た。残りの未使用のハイブリドーマライブラリー細胞を、今後のライブラリー試験および
スクリーニングのために液体窒素中で凍結した。
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫キャンペーンによっておよそ５０のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体が
得られ、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫キャンペーンによっておよそ９０のマウス抗ｈＤＬＬ３抗
体が得られた。
実施例３
抗ＤＬＬ３の配列決定
前述に基づいて、見かけ上高親和性の固定したヒトＤＬＬ３またはｈ２９３−ｈＤＬＬ
３細胞に結合するいくつかの例示的な個別のモノクローナル抗体を、配列決定およびさら
なる分析のために選択した。図３Ａおよび３Ｂでの表形式に示すように、実施例２で生成
した選択されたモノクローナル抗体由来の軽鎖可変領域（図３Ａ）および重鎖可変領域（
図３Ｂ）の配列分析は、多数が新規の相補性決定領域を有し、しばしば、新規のＶＤＪ配
置を示すことが確認された。図３Ａおよび３Ｂに記載の相補性決定領域およびフレームワ
ーク領域がＡｂｙｓｉｓデータベースの専売バージョンを使用してＫａｂａｔら（前出）
のように定義されることに留意のこと。
所望の抗体を発現する最初に選択したハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標
）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙ
ｓｔｅｍ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解して抗体をコードするＲＮＡを
調製した。１０４個と１０５個との間の細胞を１ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌに再懸濁し、２００
μＬクロロホルムの添加後に強く震盪した。次いで、サンプルを４℃で１０分間遠心分離
し、水相を新しいマイクロチューブに移し、等体積の７０％エタノールを添加した。サン
プルをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラム上にロードし、２ｍＬコレクションチューブ
に入れ、製造者の説明書に従って処理した。総ＲＮＡを、１００μＬの無ＲＮアーゼ水を
使用した溶離によってスピンカラムメンブレンに直接抽出した。ＲＮＡ調製物を、１％ア
ガロースゲル中での３μＬの分画によって定性分析後、使用するまで−８０℃で保存した
。
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、全マウスＩｇアイソタイプに特異的な３’
マウスＣγプライマーと組み合わせた完全マウスＶＨレパートリーを標的化するようにデ
ザインされた３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックス
を使用して増幅させた。同様に、κ軽鎖を増幅および配列決定するために、各Ｖκマウス
ファミリーを増幅するようにデザインした３２の５’Ｖκリーダー配列を含むプライマー
ミックスを、マウスκ定常領域に特異的な単一の逆プライマーと組み合わせて使用した。
λ軽鎖を含む抗体について、マウスλ定常領域に特異的な１つの逆プライマーと組み合わ
せて３つの５’ＶＬリーダー配列を使用して増幅を行った。ＶＨおよびＶＬ転写物を、Ｑ
ｉａｇｅｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して１００ｎｇ
の総ＲＮＡから増幅した。全部で８回のＲＴ−ＰＣＲ反応を、各ハイブリドーマ（４回を
Ｖκ軽鎖、４回をＶγ重鎖）について行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、０
．５μＬの１００μＭの重鎖またはκ軽鎖のプライマーのいずれか（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ
ｄ Ｄａｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで注文合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝
液、１μＬ ｄＮＴＰ、１μＬの逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む酵素ミック
ス、および０．４μＬのリボヌクレアーゼインヒビターＲＮａｓｉｎ（１単位）を含んで
いた。サーマルサイクラーのプログラムは、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間のＲＴ
工程、その後の３０サイクルの（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間
）であった。次いで、７２℃で１０分間最後のインキュベーションを行った。
抽出したＰＣＲ産物について、同一の特異的可変領域プライマーを可変領域の増幅のた
めに上記のように使用して配列決定を行った。直接ＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ産物を調製
するために、ＰＣＲ産物を、製造者のプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｐ
ＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡを、５０μＬの滅菌水を使
用してスピンカラムから溶離し、次いで、両鎖から直接配列決定した。ヌクレオチド配列
を、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅ
ｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析して配列
相同性が最も高い生殖系列Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子メンバーを同定した。専売の抗体配列
データベースを使用してＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースとア
ラインメントすることによって誘導された配列をＩｇＶ領域およびＪ領域の既知の生殖系
列ＤＮＡ配列と比較した。
より具体的には、図３Ａは、抗ＤＬＬ３抗体由来の多数の新規のマウス軽鎖可変領域お
よび代表的なマウス軽鎖から誘導された例示的なヒト化軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列
を示す。同様に、図３Ｂは、同一の抗ＤＬＬ３抗体由来の多数の新規のマウス重鎖可変領
域およびヒト化軽鎖を提供する同一のマウス抗体から誘導された例示的なヒト化重鎖可変
領域の連続アミノ酸配列を示す。マウス軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列
を、配列番号２１〜３８７の奇数番号で提供し、一方、ヒト化軽鎖可変領域および重鎖可
変領域のアミノ酸配列を、配列番号３８９〜４０７の奇数番号で提供する。
したがって、図３Ａおよび３Ｂをまとめて、いくつかの作動可能なマウス抗ＤＬＬ３抗
体（ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１
６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１
６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１
６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１
６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１
６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１
６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１
６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１
６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１
６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ
１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１
０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、Ｓ
Ｃ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．
１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、
ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６
．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３
、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１
６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４
２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ
１６．１４９、およびＳＣ１６．１５０と命名）ならびに例示的なヒト化抗体（ｈＳＣ１
６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６
．５６と命名）の注釈付きの配列を提供する。これらの同一の命名は、本抗体を産生する
クローンをいうことができ、そのようなものとして、任意の特定の命名の使用をその周辺
の開示の文脈で解釈すべきであることに留意のこと。
本出願の目的のために、各特定の抗体の配列番号は連続する奇数番号である。従って、
ｍＡｂ ＳＣ１６．３は、それぞれ軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列番号
２１および２３を含む。これに関して、例えば、ＳＣ１６．４は配列番号２５および２７
を含み、ＳＣ１６．５は配列番号２９および３１を含む。各抗体アミノ酸配列の対応する
核酸配列は、添付の配列表に含まれ、対応するアミノ酸配列番号の直前にその配列番号を
有する。したがって、例えば、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨの配列番号はそれぞれ
２１および２３であり、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨの核酸配列の配列番号はそれ
ぞれ配列番号２０および２２である。
報告した配列に関して、配列決定の例外により、一定の重鎖可変領域および軽鎖可変領
域の配列は手順の最中に時期尚早に短縮されるとことに留意すべきである。これにより、
報告したフレームワーク４配列中の１つ以上のアミノ酸が脱落した。このような場合、本
可変領域配列を本質的に完成させるために適合するアミノ酸（他のクローン由来の対応す
る配列の再検討によって決定）を供給した。例えば、残基「ＩＫ」を図３Ａ中のＳＣ１６
．２２軽鎖配列（配列番号７３）の末端に付加して完全なフレームワーク４を有する作動
可能な軽鎖可変領域を得た。付加したアミノ酸をコードする塩基を、同様に対応する核酸
配列（配列番号７２）に付加して矛盾しないようにした。図３Ａおよび３Ｂ（添付の配列
表ではない）のそれぞれの場合、容易に区別できるように、付加したアミノ酸に下線を引
いて太字で示す。
実施例４
キメラおよびヒト化した抗ＤＬＬ３抗体の生成
上記で示すように、実施例２由来の一定のマウス抗体（ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１
５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４、およびＳＣ１６．５６）を使用して、マウス可変
領域を有するヒト定常領域を含むキメラ抗体およびヒトアクセプター抗体にグラフティン
グされたマウスＣＤＲを含むヒト化抗体を誘導した。好ましい実施形態では、これらの誘
導された抗体（キメラ抗体またはヒト化抗体）を、開示のＤＬＬ３コンジュゲートに組み
込むことができる。
より具体的には、キメラ抗ＤＬＬ３抗体を、以下の当該分野で認識されている技術を使
用して生成した。総ＲＮＡを、ハイブリドーマから抽出し、実施例３に記載のように増幅
させた。マウス抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントに関する
データを、誘導した核酸配列から得た。抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のリーダー配列に特異
的なプライマーセットを、以下の制限部位を使用してデザインした：ＶＨフラグメントの
ためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬフラグメントのためのＸｍａＩおよびＤｒａ
ＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し
て精製し、その後にＶＨフラグメントのための制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびに
ＶＬフラグメントのための制限酵素ＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩを使用して消化した。Ｖ
ＨおよびＶＬ消化したＰＣＲ産物をそれぞれ精製し、ヒトＩｇＧ１（配列番号６）重鎖定
常領域の発現ベクターまたはκＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域の発現ベクターにラ
イゲーションした。
ライゲーション反応を、２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物、および２
５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡを使用して総体積１０μＬで以下のように行った。コンピ
テント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬライゲ
ーション産物を使用した４２℃での熱ショックによって形質転換し、１００μｇ／ｍＬを
アンピシリンプレートにプレートした。増幅したライゲーション産物の精製および消化後
、ＶＨフラグメントを、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅ
Ｉ−ＸｈｏＩ制限部位にクローン化し、ＶＬフラグメントをｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐ
ｐａ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローン化した。
キメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現
ベクターを使用したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって発現した
。トランスフェクション前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、標準的な条件下にて１０％熱失
活ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧを
補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む１５０ｍｍプレート中で培養し
た。一過性トランスフェクションのために、細胞を細胞密度８０％まで成長させた。１２
．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−ＫａｐｐａベクターＤ
ＮＡのそれぞれを、５０μＬのＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクション試薬を含む１．５
ｍＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに添加した。ミックスを室温で３０分間インキュベートし、プレ
ートした。トランスフェクションの３〜６日後に上清を回収した。組換えキメラ抗体を含
む培養上清を、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞デブリを除去し、４℃で保
存した。組換えキメラ抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製
した。
同一のマウス抗ＤＬＬ３抗体（例えば、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．
２５、ＳＣ１６．３４、およびＳＣ１６．５６）も使用して、ＣＤＲグラフティング抗体
またはヒト化抗体を誘導した。これに関して、マウス抗体を、専売のコンピュータ支援Ｃ
ＤＲグラフティング法（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）
および標準的な分子操作技術を以下のように使用してヒト化した。可変領域のヒトフレー
ムワーク領域を、ヒト生殖系列の抗体配列のフレームワーク配列およびＣＤＲカノニカル
構造と関連するマウス抗体のフレームワーク配列およびＣＤＲとの間の最も高い相同性に
基づいてデザインした。分析のために、各ＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当てを、Ｋ
ａｂａｔらのナンバリングにしたがって行った。一旦可変領域が選択されると、合成遺伝
子セグメントから可変領域を生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）。キメラ抗体のための上記の分子的方法を使用して、ヒト化抗体をクローン
化し、発現させた。
各ヒト化抗体についての選択されたヒトアクセプター可変領域の遺伝子組成を、直下の
表３に示す。表３に示した配列は、本クローンについての図３Ａおよび３Ｂに記載の注釈
付き重鎖および軽鎖の配列に対応する。より具体的には、以下の表３中のエントリーは、
配列番号３８９および３９１（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号３９３および３９５（ｈＳ
Ｃ１６．１５）、配列番号３９７および３９９（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号４０１お
よび４０３（ｈＳＣ１６．３４）、ならびに配列番号４０５および４０７（ｈＳＣ１６．
５６）に記載の連続可変領域配列に対応する。遺伝子組成に加えて、表３は、これらの選
択された実施形態では、選択された抗体の好ましい結合特性を維持するのにフレームワー
クの変化や逆変異が必要ないことを示す。勿論、他のＣＤＲグラフティング構築物ではか
かるフレームワークの変化または逆変異が好ましいかもしれず、そのようなものとして、
本発明の範囲内に含まれることが明確に意図されると認識されるであろう。
Figure 2019069983
ヒト化クローン（ｈＳＣ１６．１３）のフレームワーク領域の残基が変化しなかったに
も関わらず、安定性の懸念に対処するために重鎖ＣＤＲ２に変異を導入した。改変したＣ
ＤＲを有する抗体の結合親和性を、対応するキメラ抗体またはマウス抗体のいずれかに等
しいことを確実にするためにチェックした。
ＣＤＲグラフティングによる全ての選択された抗体のヒト化後、得られた軽鎖可変領域
および重鎖可変領域のアミノ酸配列を分析して、マウスドナーおよびヒトアクセプターの
軽鎖可変領域および重鎖可変領域に関するその相同性を決定した。直下の表４に示す結果
は、ヒト化構築物はマウスドナー配列よりもヒトアクセプター配列に対する相同性が高い
ことを一貫して示すことが明らかである。より詳細には、マウス重鎖可変領域および軽鎖
可変領域は、ヒト化抗体およびドナーハイブリドーマのタンパク質配列の相同性（７４％
〜８３％）と比較して、最も密接に適合したヒト生殖系列遺伝子に対して全体的に類似の
相同性（８５％〜９３％）を示す。
Figure 2019069983
試験の際、以下により詳細に考察するように、誘導された各ヒト化構築物はマウス親抗
体によって示される結合特性におよそ匹敵する好ましい結合特性を示した。
実施例５
抗ＤＬＬ３抗体の特徴
種々の方法を使用して、上記のように生成した選択されたＤＬＬ３抗体モジュレーター
の結合特性および免疫化学的特性を分析した。具体的には、いくつかの抗体モジュレータ
ーを、当該分野で認識されている方法（フローサイトメトリーが含まれる）によってヒト
、カニクイザル、ラット、およびマウスの抗原認識（すなわち、細胞およびＤＬＬ３タン
パク質構築物を使用）に関する親和性、動態学、ビニング、結合の位置、および交差反応
性について特徴付けた。選択されたモジュレーターの親和性および速度定数ｋｏｎおよび
ｋｏｆｆを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）でのバイオレイ
ヤー干渉分析またはＢｉａｃｏｒｅ２０００を使用した表面プラズモン共鳴をそれぞれ製
造者の説明書にしたがって使用して測定した。
特徴付けの結果を、図５中の表に示し、選択されたモジュレーターが一般にナノモル範
囲で比較的高い親和性を示し、多くの場合に交差反応性を示すことが認められた。図５は
、さらに、経験的に決定した抗体ｂｉｎおよび酵母媒介性の抗原フラグメント発現（直下
の実施例６でより詳細に記載のものなど）を使用して決定した場合の本抗体によって結合
されたＤＬＬ３ドメインを列挙している。
抗体ビニングに関して、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤを製造者の説明書に従って使用して
、同一または異なるｂｉｎに結合した競合抗体を同定した。簡潔に述べれば、基準抗体（
Ａｂ１）を抗マウス捕捉チップ上に捕捉し、次いで、高濃度の非結合抗体を使用してチッ
プをブロッキングし、ベースラインを得た。次いで、単量体の組換えヒトＤＬＬ３−Ｆｌ
ａｇ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、特異的抗体（Ａｂ１）によ
って捕捉させ、チップをコントロールとしての同一の抗体（Ａｂ１）を有するウェルまた
は異なる試験抗体（Ａｂ２）を有するウェルに浸漬した。新規の抗体とのさらなる結合が
認められた場合、Ａｂ１およびＡｂ２は、異なるｂｉｎにあると判断した。コントロール
Ａｂ１との結合レベルの比較によって判断した場合にさらなる結合が生じない場合、Ａｂ
２は同一ｂｉｎにあると判断した。当該分野で公知のように、この過程を、９６ウェルプ
レート内の固有のｂｉｎを示す全列の抗体を使用した固有の抗体の巨大なライブラリーが
スクリーニングされるように拡大することができる。この場合、このビニング過程は、Ｄ
ＬＬ３タンパク質上の少なくとも９種の異なるｂｉｎ（図５中でｂｉｎＡ〜Ｉと命名）に
結合したスクリーニング抗体を示した。ＤＬＬ３抗原の見かけ上のサイズ（ＥＣＤはおよ
そ５６ｋＤである）および使用したビニング法の精度に基づいて、９種の同定されたｂｉ
ｎがＤＤＬ３細胞外抗原上に存在するｂｉｎの大部分を示すと考えられる。
上記の例示的なモジュレーターの評価に加えて、選択されたＳＣ１６抗体モジュレータ
ーがヒトＤＬＬ３と免疫特異的に会合することができるかどうかを確認し、同一の抗体が
カニクイザル、ラット、および／またはマウスのＤＬＬ３と交差反応するかどうかを決定
するために、フローサイトメトリーを行った。より具体的には、例示的なマウス抗体を、
ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩおよびマウス、ラット、カニクイザル、またはヒトのＤＬＬ３を
過剰発現する２９３細胞を使用したフローサイトメトリーによって分析した。いくつかの
場合、例示的なマウスモジュレーターを、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩおよびＣｏｃｈｒａｎ
らによって記載された方法（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８７（１−２）：
１４７−１５８（２００４）を使用したカニクイザルＤＬＬ３をディスプレイする酵母細
胞を使用したフローサイトメトリーによって分析した。
フローサイトメトリーに基づいて、全ての選択された抗体モジュレーターが２９３細胞
上に過剰発現したヒトＤＬＬ３に結合することが見出され（データ示さず）、一方、いく
つかの試験した抗体がカニクイザルおよび／またはマウスのＤＬＬ３と交差反応すること
が見出された（マウスと反応する全抗体はラットとも反応した）。これに関して、図５に
列挙するように、ヒトＤＬＬ３と免疫特異的に反応する１３種のモジュレーターのうちの
８種もマウス（またはラット）ＤＬＬ３と反応することが見出された。具体的には、ｍＡ
ｂｓであるＳＣ１６．４、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．
３９、ＳＣ１６．４６、ＳＣ１６．５１、およびＳＣ１６．５６はマウスＤＬＬ３と多か
れ少なかれ交差反応することが見出された一方で、ｍＡｂｓであるＳＣ１６．７、ＳＣ１
６．１０、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．２５、およびＳＣ１６．６５はマウスＤＬＬ３と
あまり会合しなかった。マウスＤＬＬ３がヒトＤＬＬ３のイソ型２とおよそ８３％相同で
あることを考慮すると、かかる結果は予想外ではない。創薬および医薬品開発における動
物モデルの使用による本発明の文脈においてこの交差反応性を有利に活用することができ
ると認識されるであろう。
前述のアッセイに加えて、実施例４のヒト化構築物であるｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１
６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６を分析して、
ＣＤＲグラフティング過程によってその結合特性が顕著に変化するかどうかを判断した。
これに関して、ヒト化構築物（ＣＤＲグラフティングした）を、ヒト化構築物で使用した
ものと実質的に等価なマウス親（またはドナー）重鎖および軽鎖の可変ドメインならびに
ヒト定常領域を含む「伝統的な」キメラ抗体と比較した。これらの構築物を使用して、表
面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、ヒト化過程で生じた速度定数のいかなる僅かな変化も同
定されるようにＢｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行
った。
一連の２５ｎＭおよび１２．５ｎＭのヒトＤＬＬ３抗原に基づき、且つ１：１ Ｌａｎ
ｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して、ヒトＤＬＬ３抗原へのＳＣ１６．１５抗体結合のＫＤ
は０．２ｎＭであると評価された。次いで、他のヒト化構築物およびキメラ構築物を使用
して類似の実験を行い、これらが治療親和性値を保持することを証明した（データ示さず
）。かかる結果は、ヒト化過程がモジュレーターの親和性に実質的に影響を及ぼさず、モ
ジュレーターが開示のＤＬＬ３ ＡＤＣで用いる実行可能な候補であることを示すことを
証明している。
実施例６
抗ＤＬＬ３抗体のドメインおよびエピトープマッピング
開示のＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートが会合または結合するエピトープを特徴付けて
位置づけるために、Ｃｏｃｈｒａｎら，２００４（前出）に記載のプロトコールの修正形
態を使用して多数の例示的な抗体においてドメインレベルのエピトープマッピングを行っ
た。簡潔に述べれば、特異的アミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個別のドメインを酵母表面上
に発現させ、選択されたＤＬＬ３抗体による結合をフローサイトメトリーによって決定し
た。
より具体的には、酵母ディスプレイプラスミド構築物を、以下の構築物の発現のために
作製した：ＤＬＬ３細胞外ドメイン（アミノ酸２７〜４６６）；ＤＬＬ１−ＤＬＬ３キメ
ラ、Ｎ末端領域およびＤＬＬ３のＥＧＦ様ドメイン１〜６（アミノ酸２２０〜４６６）に
融合したＤＬＬ１のＤＳＬドメイン（アミノ酸２２〜２２５）からなる；ＤＬＬ３−ＤＬ
Ｌ１キメラ、Ｎ末端領域およびＤＬＬ１のＥＧＦ様ドメイン１〜８（アミノ酸２２２〜５
１８）に融合したＤＬＬ３のＤＳＬドメイン（アミノ酸２７〜２１４）からなる；ＥＧＦ
様ドメイン番号１（アミノ酸２１５〜２４９）；ＥＧＦ様ドメイン番号２（アミノ酸２７
４〜３１０）；ＥＧＦ様ドメイン番号１および番号２（アミノ酸２１５〜３１０）；ＥＧ
Ｆ様ドメイン番号３（アミノ酸３１２〜３５１）；ＥＧＦ様ドメイン番号４（アミノ酸３
５３〜３８９）；ＥＧＦ様ドメイン番号５（アミノ酸３９１〜４２７）；およびＥＧＦ様
ドメイン番号６（アミノ酸４２９〜４６５）（ドメイン情報については、一般に、Ｕｎｉ
ＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＹＪ７（本明細書中
で参考として援用される）を参照のこと。アミノ酸ナンバリングが配列番号１などに記載
のリーダー配列を有する非プロセシングＤＬＬ３タンパク質を参照することに留意のこと
）。Ｎ末端領域またはＥＧＦドメインの全体としての分析のために、タンパク質折り畳み
に関する潜在的な問題を最小限にするためのフラグメントとは対照的に、ファミリーメン
バーＤＬＬ１とのキメラ（ＤＬＬ１−ＤＬＬ３およびＤＬＬ３−ＤＬＬ１）を使用した。
ドメインマッピングした抗体は、以前に、ＤＬＬ１と交差反応しないことが示されており
、このことは、これらの構築物への任意の結合が構築物のＤＬＬ３部分との会合によって
起こることを示していた。これらのプラスミドを酵母に形質転換し、次いで、Ｃｏｃｈｒ
ａｎらに記載のように成長および誘導した。
特定の構築物への結合を試験するために、２００，０００個の所望の構築物を発現する
誘導された酵母細胞を、ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）で２回洗浄し、０．
１μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ）および５０ｎＭの精製抗体または７日間培養したハイブリドーマ由来の非精製上清の
２倍希釈物のいずれかを含む５０μＬのＰＢＳＡ中でインキュベートした。細胞を氷上で
９０分間インキュベートし、その後にＰＢＳＡで２回洗浄した。次いで、細胞を、適切な
二次抗体（マウス抗体については、Ａｌｅｘａ ４８８コンジュゲート化ストレプトアビ
ジンおよびＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート化ヤギ抗マウス（共にＬｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬで添加し、ヒト化抗体またはキメラ抗体につ
いては、Ａｌｅｘａ ６４７コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化ヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬで添加した）を有する
５０μＬのＰＢＳＡ中でインキュベートした。氷上で２０分間のインキュベーション後、
細胞をＰＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。ＤＬＬ３−ＤＬ
Ｌ１キメラに結合した抗体を、Ｎ末端領域＋ＤＳＬへの結合と命名した。特定のＥＧＦ様
ドメイン上に存在するエピトープに特異的に結合した抗体を、その各ドメインへの結合と
命名した。
エピトープを高次構造（例えば、不連続）または線状と分類するために、ＤＬＬ３細胞
外ドメインをディスプレイする酵母を８０℃で３０分間熱処理し、次いで、氷冷ＰＢＳＡ
で２回洗浄した。次いで、変性抗原をディスプレイする酵母（変性酵母）を、上記のよう
に同一の染色プロトコールおよびフローサイトメトリー分析に供した。変性酵母および未
変性酵母の両方に結合した抗体を線状エピトープへの結合と分類したのに対して、未変性
酵母に結合したが、変性酵母に結合しなかった抗体を高次構造特異的と分類した。
試験した抗体のドメインレベルエピトープマッピングデータの模式的なまとめを図４に
示し、図中で、線状エピトープに結合する抗体に下線を引き、決定された場合、対応する
ｂｉｎを括弧書きで示した。図４の再考により、大部分のモジュレーターがＤＬＬ３のＮ
末端／ＤＳＬ領域中または第２のＥＧＦ様ドメインのいずれかに見出されたエピトープを
マッピングする傾向があったことを示す。前に示したように、図５は、いくつかの選択さ
れたモジュレーターのｂｉｎ決定およびドメインマッピングに関する類似のデータを表形
式で示す。
２つの方法のうちの１つを使用して選択された抗体の精巧なエピトープマッピングをさ
らに行った。第１の方法は、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ
ーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｅ８１１０Ｓ）を製造者の説明書
に従って使用した。簡潔に述べれば、エピトープマッピングのための抗体を５０μｇ／ｍ
Ｌを含む３ｍＬの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８）で、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏ
ｒｐチューブ（Ｎｕｎｃ）上を一晩コーティングした。チューブを、３％ＢＳＡ溶液を含
む重炭酸溶液でブロッキングした。次いで、１０１１個のインプットファージを含むＰＢ
Ｓ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を結合させ、その後に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回
連続して洗浄して非結合ファージを洗い流した。残存するファージを、１ｍＬの０．２Ｍ
グリシンを使用して室温で１０分間穏やかに震盪しながら溶離し、その後に１５０μＬの
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和した。溶離したファージを増幅し、洗浄工程中
に０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して１０１１個のインプットファージで再度パニング
して選択の厳密さを増大させた。第２ラウンド由来の溶離ファージの２４プラーク由来の
ＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｍ１３ Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し
、配列決定した。クローンファージの結合を、マッピングした抗体またはコントロール抗
体をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、ブロッキングし、各ファージクローンに曝
露するＥＬＩＳＡアッセイを使用して確認した。ファージ結合を、抗Ｍ１３抗体（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にコンジュゲートしたセイヨウワサビペルオキシダーゼおよび１
−Ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した
。特異的に結合するファージ由来のファージペプチド配列を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抗原ＥＣＤペプチド配列とアラインメン
トして結合のエピトープを決定した。
あるいは、酵母ディスプレイ法（Ｃｈａｏら，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１（２）：７５
５−７６８，２００７）を使用して、選択した抗体をエピトープマッピングした。簡潔に
述べれば、ＤＬＬ３ ＥＣＤ変異体のライブラリーを、標的変異誘発率をクローンあたり
の１つのアミノ酸変異にするためにヌクレオチドアナログである８−オキソ−２’デオキ
シグアノシン−５’−三リン酸および２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’三リン酸
（共にＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ）を使用したエラープローンＰＣＲを使用して生成した。
これらを酵母ディスプレイ形式に形質転換した。ドメインレベルマッピングのための上記
の技術を使用して、ライブラリーを５０ｎＭでのＨＡおよび抗体結合について染色した。
ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型ＤＬＬ３ ＥＣＤと比較して結合が喪失
したクローンを選別した。これらのクローンを再成長させ、標的抗体への結合の喪失につ
いて別ラウンドのＦＡＣＳ選別に供した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドＭｉｎｉｐｒ
ｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個別のＥＣＤクローンを単離し
、スクリーニングした。必要に応じて、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット
（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して変異を単変異ＥＣＤクローンとして再編成した。
個別のＥＣＤクローンを、次に、結合の喪失がエピトープの変異または誤折り畳みを生
じる変異に起因するかどうかを決定するためにスクリーニングした。誤折り畳み変異の可
能性が高いので、システイン、プロリン、および終止コドンに関与する変異を自動的に破
棄した。次いで、残りのＥＣＤクローンを、非競合性の高次構造特異的抗体への結合につ
いてスクリーニングした。非競合性の高次構造特異的抗体への結合を喪失したＥＣＤクロ
ーンを誤折り畳み変異を含むと結論づけたのに対して、野生型ＤＬＬ３ ＥＣＤへの等価
な結合を保持したＥＣＤクローンを適切に折りたたまれていると結論づけた。後者の群の
ＥＣＤクローンの変異を、エピトープ中に存在すると結論づけた。結果を、直下の表５に
列挙する。
Figure 2019069983
より具体的には、抗体結合に関与するアミノ酸残基を含む誘導されたエピトープを有す
る選択された抗体のまとめを、表５に列挙する。これに関して、抗体ＳＣ１６．３４およ
びＳＣ１６．５６は、共通のアミノ酸残基と見かけ上相互作用し、これは、ビニング情報
および図４に示すドメインマッピングの結果と異位置する。さらに、ＳＣ１６．２３は、
個別の連続エピトープと相互作用することが見出され、ＳＣ１６．３４またはＳＣ１６．
５６のｂｉｎではないことが見出された。
実施例７
ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートの調製
本発明の多用途性をさらに証明するために、ＡＤＣ１〜５に実質的に記載の抗ＤＬＬ３
抗体薬物コンジュゲートを、ＤＬＬ３抗体へのＤＬ１〜ＤＬ５の化合物のコンジュゲート
化によって調製する（本明細書中に開示のコンジュゲートなど）。これに関して、ＤＬ４
のために選択したリンカーのために、２つのわずかに異なるコンジュゲート化手順を使用
して開示のコンジュゲートを得ると認識されるであろう。より具体的には、ＡＤＣ１〜３
および５を、以下の第１の方法手順を使用して調製することが好ましく、ＡＤＣ４を、以
下の第２の手順を使用して調製することが好ましい。
（ａ）マレイミドコンジュゲート化
より具体的には、開示の抗体に共有結合的に結合させたＤＬ１〜ＤＬ３およびＤＬ５に
記載のリンカーおよびピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体を含むＤＬＬ３抗体薬物
コンジュゲートを調製する（一般に、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号お
よび同第２０１２／００７８０２８号および米国特許第６，２１４，３４５号（それぞれ
、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
実質的に上記の実施例１に記載のように当該分野で認識されている技術を使用してＤＬ
１〜ＤＬ３およびＤＬ５の薬物−リンカー組み合わせを合成および精製する。調製後、末
端マレイミド部分を含む薬物−リンカー単位を、選択されたＤＬＬ３抗体上の遊離スルフ
ヒドリルにコンジュゲートする。これに関して、選択されたＤＬＬ３抗体をトリス（２−
カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）で部分的に還元し、その後に還元されたＣ
ｙｓ残基をマレイミド−リンカーペイロードとの反応させることによってＤＬＬ３コンジ
ュゲートを調製する。
より具体的には、選択されたＤＬＬ３抗体モジュレーターを、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（
ｐＨ７．５）および３２ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中にて１ｍｏｌのｍＡｂあたり１．３ｍｏ
ｌのトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）で２０℃にて９０分間還
元する。反応物を１５℃に冷却し、リンカーペイロードをＤＭＡに溶解し、次いで、３．
２ｍｏｌ／ｍｏｌの比でｍＡｂを添加後、さらなる量のＤＭＡを最終濃度６％（ｖ／ｖ）
まで添加する。反応を３０分間進行させる。未反応の薬物−リンカーを、等モル過剰のＮ
−アセチルシステインの添加によってキャッピングする。次いで、コンジュゲートを、Ａ
ＤＣ１〜３および５に実質的に記載のように、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシ
ステム（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したイオン交換カラムによって精製して
、凝集した高分子量抗体、共溶媒、および小分子を除去する。次いで、溶離したコンジュ
ゲートを、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によって処方用緩衝液
中へ緩衝液交換し、その後に濃度を調整し、界面活性剤を添加する。最終コンジュゲート
を、タンパク質濃度（ＵＶ測定による）、凝集（ＳＥＣ）、薬物抗体比（ＤＡＲ）（逆相
（ＲＰ）ＨＰＬＣによる）、非コンジュゲート化抗体の存在（疎水性相互作用クロマトグ
ラフィ（ＨＩＣ）ＨＰＬＣによる）、非タンパク質材料（ＲＰ ＨＰＬＣによる）、およ
びｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性（ＤＬＬ３発現細胞株を使用）について分析する。
（ｂ）ヨードアセトアミドコンジュゲート化
ＡＤＣ４を、実質的に以下のように調製する。実施例１に記載のようにＤＬ４を合成し
、準備する。調製後、末端ヨードアセトアミド部分を含む細胞毒素−リンカー単位を、選
択されたＤＬＬ３抗体上の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートする。これに関して、Ｄ
ＬＬ３コンジュゲートを、選択されたＤＬＬ３抗体のトリス（２−カルボキシエチル）−
ホスフィン（ＴＣＥＰ）での部分的還元、その後の還元されたＣｙｓ残基のヨードアセト
アミド−リンカーペイロードとの反応によって調製する。
より具体的には、選択されたＤＬＬ３抗体モジュレーターを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）お
よび５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中にて１ｍｏｌのｍＡｂあたり１．８ｍｏｌのＴＣＥＰで２
０℃にて９０分間還元する。次いで、還元された抗体溶液を、１００ｍＭホウ酸ナトリウ
ムでｐＨ８．５に調整し、ＤＭＳＯ中のリンカーペイロードを少なくとも５ｍｏｌ／ｍｏ
ｌ ｍＡｂの比で添加後、さらなる量のＤＭＳＯを最終濃度６％（ｖ／ｖ）まで添加する
。次いで、反応を２０℃で一晩進行させる。次いで、コンジュゲートを、タンジェンシャ
ルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によってダイアフィルトレーション緩衝液中へ緩
衝液交換し、その後に濃度を調整し、界面活性剤を添加する。次いで、最終コンジュゲー
トを、タンパク質濃度（ＵＶ測定による）、凝集（ＳＥＣ）、薬物抗体比（ＤＡＲ）（逆
相（ＲＰ）ＨＰＬＣによる）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性（ＤＬＬ３発現細胞株
を使用）について分析する。
前述の手順または当該分野で公知の実質的に類似の方法を使用して、本明細書中に記載
のように種々のＤＬＬ３抗体モジュレーターとＤＬ部分との組み合わせを含むいくつかの
コンジュゲートを生成し、特徴付ける。これに関して、図６は、特異的抗体（例えば、Ｓ
Ｃ１６．３）を選択された薬物−リンカー（例えば、ＤＬ１）とコンジュゲートして対応
するＡＤＣ（すなわち、ＳＣ１６．３−ＤＬ１またはＳＣ１６．３−ＡＤＣ１）を得るこ
とによる、本開示にしたがって生成することができるＡＤＣのまとめを提供する。当業者
は、図６の例示的構築物中の各抗体の名称は、ヒト化と同定された抗体（例えば、ｈＳＣ
１６．３４−ＤＬ４）を除き、任意の抗体タイプ（同定されたマウスクローンのキメラ、
ヒト化、ヒト、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３などのバージョン）またはその免疫反応性フラグメン
トを示すことができると認識するであろう。さらに、例示的なＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤ
Ｃ３、およびＡＤＣ５化合物を、実施例７（ａ）に記載のプロトコールを使用してコンジ
ュゲートする一方で、例示的なＡＤＣ４化合物を、実施例７（ｂ）に記載のプロトコール
を使用してコンジュゲートすると認識されるであろう。選択された態様では、本発明が図
６に記載のコンジュゲートを含むと認識されるであろう。
実施例８
ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを使用した腫瘍細胞死滅のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明のＤＬＬ３ ＡＤＣが細胞毒性薬の生細胞への送達を媒介することができること
を証明するために、前述の実施例のように調製した選択されたＤＬＬ３コンジュゲートを
使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死滅アッセイを行う。
いくつかのＰＢＤペイロード（すなわち、ＰＢＤ１〜ＰＢＤ５）のうちの１つを備えた
ＤＬＬ３標的化されたＡＤＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、このＡＤＣは、ヒトＤＬＬ
３を過剰発現するように操作されたヒト２９３細胞上のＤＬＬ３にナノモル親和性で特異
的に結合するが、ナイーブ親２９３細胞ではそうでない。選択されたＡＤＣ１〜５のｉｎ
ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性を調査するために、ヒトＤＬＬ３を過剰発現する２９３細胞
を死滅させる能力を評価する。具体的には、親２９３Ｔ細胞またはＤＬＬ３を発現するよ
うに操作された２９３Ｔ細胞を、選択されたＡＤＣ１〜５の希釈物と４８〜７２時間イン
キュベート後、製造者の説明書に従ってＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を評価する。０．１〜１００ｐＭのＩＣ５０でＤＬ
Ｌ３を過剰発現する２９３細胞を死滅させるが、ナイーブ親２９３細胞を死滅させる能力
は皆無かそれに近いことが証明されているＡＤＣを、前臨床候補として選択する。
２９３細胞傷害性アッセイに基づいて、腫瘍細胞を用いたさらなる試験のためのコンジ
ュゲートを選択する。最初に、２，５００細胞／ウェルのヒトＫＤＹ６６（内因性ＤＬＬ
３を発現する腎臓ＮＥＴ ＮＴＸ）を単一細胞懸濁液に分離し、当該分野で公知の成長因
子を補足した無血清培地を含むＢＤ Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プレート（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にプレートする。２４時間後、種々の濃度（０．ｌ〜１００ｐＭ）
の精製ＤＬＬ３抗体コンジュゲート（例えば、ＳＣ１６．２６−ＤＬ１、ＳＣ１６．８１
−ＤＬ２、ＳＣ１６．１１８−ＤＬ４、およびＳＣ１６．６７−ＤＬ５）を、適切なコン
トロール（例えば、非結合ＩｇＧ１−ＤＬコンジュゲート）と共に、培養物に添加する。
７日後、プレートを試験して細胞生存度に及ぼすＤＬＬ３抗体の影響を決定する。抗体薬
物コンジュゲートが腫瘍細胞を内在化して死滅させる能力を、製造者の説明書に従ってＣ
ｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）を使用した生存細胞の計数によって決定する。
アイソタイプ抗体コンジュゲートコントロールに曝露した細胞を含む培養物を使用した未
加工の発光カウントを１００％基準値に設定し、全ての他のカウントをそれに従って計算
する。いくらかまたは全てのＤＬＬ３コンジュゲートが０．１ｐＭと１００ｐＭとの間の
ＩＣ５０でＫＤＹ６６腫瘍細胞を死滅させ、アイソタイプコンジュゲートコントロールが
非常に高いＩＣ５０値を示すと予想される。
活性なＤＬＬ３抗体コンジュゲートを希釈アッセイで試験して、活性のＥＣ５０値を決
定する。直前に記載のアッセイと同一のアッセイを使用して、選択された抗体コンジュゲ
ートおよび適切なコンジュゲートコントロールを、プレートした卵巣腫瘍細胞（例えば、
ＯＶ２６、卵巣ＮＥＴ ＮＴＸ腫瘍）とインキュベートする。いくつかのまたは全てのコ
ンジュゲートがピコモルまたはピコモル以下の実測ＥＣ５０値で卵巣腫瘍細胞を有効に死
滅させると予想される。逆に、コントロールＡＤＣは、比較的高いＥＣ値を示すと予想さ
れ、これは、コントロールＡＤＣが有効に内在化されず、コンジュゲートされた薬物が不
活性状態のままであることを示す。
本発明の多用途性をさらに証明するために、大細胞神経内分泌肺癌（ＬＵ３７）由来の
腫瘍細胞を、本明細書中の教示に従って選択されたコンジュゲート（例えば、ＳＣ１６．
２６−ＤＬ１、ＳＣ１６．８１−ＤＬ２、およびＳＣ１６．６７−ＤＬ５）に曝露する。
より具体的には、ウェルあたり２，５００個のＬＵ３７ ＮＴＸ細胞を、コンジュゲート
されたＤＬＬ３抗体およびコンジュゲートされたアイソタイプコントロールの添加１日前
に、成長因子補足無血清培地にプレートする（ＢＤ Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プレート
）。プレートした細胞を、種々の濃度のＤＬＬ３コンジュゲートおよびコントロールコン
ジュゲートに数日間曝露する。曝露後、細胞生存度を、上記のようにＣｅｌｌ Ｔｉｔｅ
ｒ Ｇｌｏ（登録商標）を使用した生存細胞数の計数によって決定する。ＤＬＬ３コンジ
ュゲートは、臨床関連濃度で腫瘍細胞を有効に排除すると予想される。例えば、ＤＬＬ３
コンジュゲートは、５０％のＬＵ３７細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにて約１００ｐＭ未満の濃
度で死滅させる能力を有すると予想される一方で、アイソタイプコントロールコンジュゲ
ートには５０％の腫瘍細胞を死滅させるために１ｎＭを超える濃度が必要である。
かかる結果は、開示のコンジュゲートが種々の新生物障害の処置に有用であることを示
すであろう。
実施例９
ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを使用した腫瘍成長抑制のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
前述のｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を考慮して、開示のＤＬＬ３ ＡＤＣがＤＬＬ３発現ヒ
ト腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで収縮するか成長を抑制する能力を評価するための実験を行う。
より具体的には、マウスモジュレーターおよびヒト化モジュレーターの両方を含む選択さ
れたＤＬＬ３コンジュゲートに、免疫無防備状態のマウスにおけるヒトＮＴＸ腫瘍成長を
抑制する能力を証明するための試験を行う。
実験を準備するために、当該分野で認識されている技術を使用して、患者由来のＮＴＸ
腫瘍（ＬＵ３７、ＬＵ７３、およびＯＶ２６）を、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウ
スの側腹部に皮下で成長させる。腫瘍容積およびマウスの体重を、１週間に２回モニタリ
ングする。腫瘍容積が１５０〜２５０ｍｍ３に到達した時点で、マウスを無作為に処置群
に割り当て、種々の用量のＤＬＬ３コンジュゲート（例えば、ＳＣ１６．２１−ＤＬ２、
ＳＣ１６．１４４−ＤＬ４、ｈＳＣ１６．３４−ＤＬ５、ｈＳＣ１６．５６−ＤＬ１）ま
たは同一ＤＬを含むアイソタイプコントロール（それぞれ、上の実施例７に実質的に記載
のように産生）を腹腔内注射によって投与する。マウスに等しく７日間の間隔で３回の０
．１〜１ｍｇ／ｋｇでの等しいＡＤＣ注射を行う。処置後、腫瘍容積およびマウスの体重
を、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるか、マウスが疾患を発症するまでモニタリングする。
多かれ少なかれ、選択されたＤＬＬ３コンジュゲートは、腫瘍容積を減少させるか腫瘍
成長を抑制する能力を示すと予想される。いくつかの例では、３つの異なる腫瘍細胞株の
それぞれに関して、腫瘍成長の抑制が継続的であり、例えば、３０日間、４０日間、５０
日間、６０日間、またはそれを超えて持続すると予想される。いくつかのコンジュゲート
されたモジュレーター（ヒト化コンジュゲートが含まれる）がｉｎ ｖｉｖｏで長期間腫
瘍成長を遅延させるか抑制する能力により、増殖性障害処置のための治療薬としての開示
のＤＬＬ３コンジュゲートの使用がさらに確証されるであろう。
実施例１０
ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを使用した癌幹細胞頻度低下のアッセイ
前の実施例に記載のように、開示のＤＬＬ３コンジュゲートは、腫瘍成長の抑制で有効
であると予想される。さらに、上記で考察されるように、ＤＬＬ３発現は、一般に薬物耐
性を示し、腫瘍の再発および転移を促進することが公知の癌幹細胞に関連する。したがっ
て、ＤＬＬ３−ＡＤＣでの処置がＮＴＸ株の再発可能性を低下させることを証明するため
に、ｉｎ ｖｉｖｏ限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を行って、ＤＬＬ３コンジュゲート（例
えば、ｈＳＣ１６．１３−ＤＬ２またはｈＳＣ１６．３４−ＤＬ５）での処置後の小細胞
肺癌腫瘍中の癌幹細胞の頻度を決定する。
患者由来の小細胞肺癌の異種移植片腫瘍（ＬＵ９５）および患者由来の乳頭状腎細胞癌
（ＫＤＹ６６）由来の異種移植片を、免疫無防備状態の宿主マウス内で皮下成長させる。
腫瘍容積が平均して１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３になった時点で、マウスを、７匹のマウ
スを含む２群に無作為に分ける。腹腔内注射により、マウスに、０、４、および７日目に
、ネガティブコントロールとしてのヒトＩｇＧ１−ＤＬ２またはヒトＩｇＧ１−ＤＬ５（
１ｍｇ／ｋｇ；それぞれｎ＝７マウス）またはＤＬＬ３コンジュゲート（例えば、ｈＳＣ
１６．１３−ＤＬ２またはｈＳＣ１６．３４−ＤＬ５（１ｍｇ／ｋｇ；それぞれｎ＝７マ
ウス））のいずれかを注射する。８日目に、各群由来の２匹の代表的なマウス（全部で４
匹）を安楽死させ、その腫瘍を回収し、単一細胞懸濁液に分散させる。アイソタイプコン
トロールコンジュゲートで処置した腫瘍が５匹の残りのマウスにおいて成長し続ける一方
で、ＤＬＬ３コンジュゲートで処置した腫瘍の体積は５匹の残りのマウスにおいてゼロま
たはゼロ付近に減少すると予想される。
標準的なフローサイトメトリー技術および標識した抗ＤＬＬ３抗体を使用して、４つの
各処置群から回収した腫瘍を評価して陽性ＤＬＬ３発現を確認する。次いで、各処置群由
来の腫瘍細胞をプールし、ヒト生細胞を、製造者の説明書に従ってＦＡＣＳＡｒｉａ Ｉ
ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用したＦＡＣＳおよび当該分野で認識さ
れている技術によって単離する。簡潔に述べれば、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート化抗マ
ウスＨ２Ｋｄおよび抗マウスＣＤ４５抗体（共にＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｉｎｃ．）で標識
し、次いで、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩに再懸濁する。次いで、得られた懸濁液を標準的条
件下で選別し、ＤＡＰＩ−、ｍＨ２Ｋｄ−、およびｍＣＤ４５−ヒト細胞を回収し、マウ
ス細胞を破棄する。
次いで、５匹のレシピエントマウスのコホートに、ＤＬＬ３コンジュゲートで処置され
た腫瘍由来の２０００、５００、１２０、または３０個の選別されたヒト生細胞のいずれ
かを移植する。比較のために、５匹のレシピエントマウスのコホートに、各アイソタイプ
コンジュゲートコントロールで処置された腫瘍由来の１０００、２５０、６０、または１
５個の選別されたヒト生細胞のいずれかを移植する。レシピエントマウス中の腫瘍を毎週
測定し、腫瘍が１５００ｍｍ３に到達する前に個別のマウスを安楽死させる。腫瘍成長の
開始後、いかなるさらなるマウスにおいても新規の腫瘍が出現することなく４週間が経過
した後に研究を終了した。その時点で、レシピエントマウスについて、腫瘍成長について
陽性または陰性を記録する。ここで、陽性成長は１００ｍｍ３を超えることを示す。ＤＬ
Ｌ３コンジュゲートで処置したＬＵ９５細胞またはＫＤＹ６６細胞のレシピエントがＤＬ
２アイソタイプコントロールで処置したＬＵ９５細胞またはＫＤＹ６６細胞のレシピエン
トと比較して腫瘍産生が少ないと予想される。
ポアソン分布統計学（Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）を使用して、移植１８週間後に腫瘍を有するレシピエントおよび腫瘍を持た
ないレシピエントの注入細胞量を使用して、各集団における腫瘍開始細胞の頻度を計算す
る。ＬＵ９５サンプルまたはＫＤＹ６６サンプル中の１０，０００個のヒト生細胞あたり
のＴＩＣ数は、ＤＬＬ３コンジュゲートで処置した動物において有意に減少すると予想さ
れる（例えば、少なくとも約１／１０の減少、１／２０の減少、１／５０の減少、または
１／１００の減少）。癌幹細胞頻度の実質的な低下は、本発明のモジュレーターが癌幹細
胞集団および潜在的な腫瘍の拡大、再発、転移、または再成長を有意且つ特異的に低下す
ることができることが示唆される。
本明細書中に引用した全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可
能な資料（例えば、ヌクレオチド配列提出物（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅ
ｑ）、アミノ酸配列提出物（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤ）、
ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑ内の注釈付きコード領域由来の翻訳物が含ま
れる）の完全な開示は、本明細書中で参考として援用される。前述の詳細な説明および実
施例は、本発明の理解を明確にすることのみを目的として示した。これらによって本発明
が不必要に制限されると理解すべきではない。表示および記載の詳細が本発明を厳格に制
限せず、変形形態が特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内に含まれることが
当業者に明らかであろう。

Claims (57)

  1. 以下：
    Figure 2019069983
    Figure 2019069983
     からなる群から選択されるコンジュゲートであって、ここで、Ａｂが抗ＤＬＬ３抗体また
    はその免疫反応性フラグメントを含む、コンジュゲート。
  2. 前記抗ＤＬＬ３抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から
    選択される、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記モノクローナル抗体が枯渇抗体を含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
  5. 前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
  6. 前記抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントが、３つの相補性決定領域を有
    する軽鎖可変領域および３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含み、ここで、少
    なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が図３Ａ中に記載されており、少なくとも１つの重鎖
    相補性決定領域が図３Ｂ中に記載されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコン
    ジュゲート。
  7. 前記抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントが軽鎖可変領域および重鎖可変
    領域を含み、ここで、前記軽鎖可変領域が、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９
    、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号
    ５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列
    番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、
    配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、
    配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、
    配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、
    配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、
    配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９３、配列番号１９７、
    配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、
    配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、
    配列番号２４１、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、
    配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７７、
    配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、
    配列番号３０１、配列番号３０５、配列番号３０９、配列番号３１３、配列番号３１７、
    配列番号３２１、配列番号３２５、配列番号３２９、配列番号３３３、配列番号３３７、
    配列番号３４１、配列番号３４５、配列番号３４９、配列番号３５３、配列番号３５７、
    配列番号３６１、配列番号３６５、配列番号３６９、配列番号３７３、配列番号３７７、
    配列番号３８１、および配列番号３８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なく
    とも６０％相同であるアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号２３、配列番
    号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配
    列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１
    、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号
    ９５、配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１
    ５、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３
    ５、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５
    ５、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７
    ５、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９
    ５、配列番号１９９、配列番号２０３、配列番号２０７、配列番号２１１、配列番号２１
    ５、配列番号２１９、配列番号２２３、配列番号２２７、配列番号２３１、配列番号２３
    ５、配列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５
    ５、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２７１、配列番号２７
    ５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９
    ５、配列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３０７、配列番号３１１、配列番号３１
    ５、配列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２７、配列番号３３１、配列番号３３
    ５、配列番号３３９、配列番号３４３、配列番号３４７、配列番号３５１、配列番号３５
    ５、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７
    ５、配列番号３７９、配列番号３８３、および配列番号３８７からなる群から選択される
    アミノ酸配列と少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれ
    か１項に記載のコンジュゲート。
  8. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、
    ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、Ｓ
    Ｃ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、Ｓ
    Ｃ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、Ｓ
    Ｃ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、Ｓ
    Ｃ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、Ｓ
    Ｃ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、Ｓ
    Ｃ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、Ｓ
    Ｃ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、Ｓ
    Ｃ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、Ｓ
    Ｃ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．
    １０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、
    ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６
    ．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１
    、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１
    ６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３
    ２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ
    １６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１
    ４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、Ｓ
    Ｃ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９、およびＳＣ１６．１５０からなる群から選択される
    抗体に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  9. 前記抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントが軽鎖可変領域および重鎖可変
    領域を含み、ここで、前記軽鎖可変領域が、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９
    、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号
    ５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列
    番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、
    配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、
    配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、
    配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、
    配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、
    配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９３、配列番号１９７、
    配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、
    配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、
    配列番号２４１、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、
    配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７７、
    配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、
    配列番号３０１、配列番号３０５、配列番号３０９、配列番号３１３、配列番号３１７、
    配列番号３２１、配列番号３２５、配列番号３２９、配列番号３３３、配列番号３３７、
    配列番号３４１、配列番号３４５、配列番号３４９、配列番号３５３、配列番号３５７、
    配列番号３６１、配列番号３６５、配列番号３６９、配列番号３７３、配列番号３７７、
    配列番号３８１、および配列番号３８５からなる群から選択されるアミノ酸配列に由来す
    るアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３
    １、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番
    号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配
    列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９５、配列番号９９
    、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、配列番号１１９
    、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３９
    、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９
    、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９
    、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１９５、配列番号１９９
    、配列番号２０３、配列番号２０７、配列番号２１１、配列番号２１５、配列番号２１９
    、配列番号２２３、配列番号２２７、配列番号２３１、配列番号２３５、配列番号２３９
    、配列番号２４３、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５５、配列番号２５９
    、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２７１、配列番号２７５、配列番号２７９
    、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９９
    、配列番号３０３、配列番号３０７、配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号３１９
    、配列番号３２３、配列番号３２７、配列番号３３１、配列番号３３５、配列番号３３９
    、配列番号３４３、配列番号３４７、配列番号３５１、配列番号３５５、配列番号３５９
    、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７５、配列番号３７９
    、配列番号３８３、および配列番号３８７からなる群から選択されるアミノ酸配列に由来
    するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  10. 前記抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントが、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．
    ４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、Ｓ
    Ｃ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、Ｓ
    Ｃ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、Ｓ
    Ｃ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、Ｓ
    Ｃ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、Ｓ
    Ｃ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、Ｓ
    Ｃ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、Ｓ
    Ｃ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、Ｓ
    Ｃ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、Ｓ
    Ｃ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０
    ４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ
    １６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１
    １４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、Ｓ
    Ｃ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．
    １２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、
    ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６
    ．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９
    、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１
    ６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９、およびＳＣ１６
    ．１５０からなる群から選択される基準抗体とＤＬＬ３タンパク質への結合を競合し、こ
    こで、前記ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントの前記ＤＬＬ３タンパク質へ
    の結合が前記基準抗体によって少なくとも３０％阻害される、請求項１〜５のいずれか１
    項に記載のコンジュゲート。
  11. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ｂｉｎＡ、ｂｉｎＢ、ｂｉｎＣ、ｂｉｎＤ、ｂｉｎＥ、ｂｉｎ
    Ｆ、ｂｉｎＧ、ｂｉｎＨ、およびｂｉｎＩからなる群から選択されるｂｉｎ中に存在する
    、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  12. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質Ｎ末端ドメインに付随するエピトープに結
    合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  13. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質ＤＳＬドメインに付随するエピトープに結
    合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  14. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質ＥＧＦ１ドメインに付随するエピトープに
    結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  15. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質ＥＧＦ２ドメインに付随するエピトープに
    結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  16. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質ＥＧＦ３ドメインに付随するエピトープに
    結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  17. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質ＥＧＦ４ドメインに付随するエピトープに
    結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  18. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質ＥＧＦ５ドメインに付随するエピトープに
    結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  19. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号２１〜３８７の奇数番号のうちのいずれか１つ由来の
    ＣＤＲを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  20. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号２１〜３８７の奇数番号のうちのいずれか１つ由来の
    複数のＣＤＲを含む、請求項１９に記載のコンジュゲート。
  21. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸Ｑ９３、Ｐ９４、Ｇ９５、Ａ９
    ６、およびＰ９７を含むエピトープ（配列番号３）に結合する、請求項１〜５のいずれか
    １項に記載のコンジュゲート。
  22. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸Ｑ９３、Ｐ９４、Ｇ９５、Ａ９
    ６、およびＰ９７を含むエピトープ（配列番号３）に結合する抗体と競合する、請求項１
    〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  23. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸Ｇ２０３、Ｒ２０５、およびＰ
    ２０６を含むエピトープ（配列番号４）に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載
    のコンジュゲート。
  24. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸Ｇ２０３、Ｒ２０５、およびＰ
    ２０６を含むエピトープ（配列番号４）に結合する抗体と競合する、請求項１〜５のいず
    れか１項に記載のコンジュゲート。
  25. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈ
    ＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６からなる群から選択される抗体含む、請求項１
    〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  26. 前記抗ＤＬＬ３抗体が軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、ここで、前記軽鎖可変
    領域が、配列番号３８９、配列番号３９３、配列番号３９７、配列番号４０１、および配
    列番号４０５に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記
    重鎖可変領域が、配列番号３９１、配列番号３９５、配列番号３９９、配列番号４０３、
    および配列番号４０７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含
    む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  27. 前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、
    ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、Ｓ
    Ｃ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、Ｓ
    Ｃ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、Ｓ
    Ｃ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、Ｓ
    Ｃ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、Ｓ
    Ｃ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、Ｓ
    Ｃ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、Ｓ
    Ｃ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、Ｓ
    Ｃ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、Ｓ
    Ｃ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．
    １０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、
    ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６
    ．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１
    、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１
    ６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３
    ２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ
    １６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１
    ４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、Ｓ
    Ｃ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９、およびＳＣ１６．１５０からなる群から選択される
    基準抗体によって定義されるｂｉｎ中に存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    コンジュゲート。
  28. 前記コンジュゲートがＡＤＣ１を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のコンジ
    ュゲート。
  29. 前記コンジュゲートがＡＤＣ２を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のコンジ
    ュゲート。
  30. 前記コンジュゲートがＡＤＣ３を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のコンジ
    ュゲート。
  31. 前記コンジュゲートがＡＤＣ４を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のコンジ
    ュゲート。
  32. 前記コンジュゲートがＡＤＣ５を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のコンジ
    ュゲート。
  33. 図６中に記載のコンジュゲート。
  34. 請求項１〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む薬学的組成物。
  35. 薬物抗体比（ＤＡＲ）が２＋／−０．４、４＋／−０．４、６＋／−０．４、または８
    ＋／−０．４である、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記ＤＡＲが２＋／−０．４である、請求項３５に記載の組成物。
  37. ＤＬＬ３関連障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項３４〜３６のいずれか
    １項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
  38. 前記ＤＬＬ３関連障害が増殖性障害を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記増殖性障害が新生物障害を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記新生物障害が神経内分泌性の特徴を示す腫瘍を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞
    肺癌、大細胞肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、および乳癌からなる群から
    選択される障害を含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 腫瘍開始細胞の頻度の低下を必要とする被験体において腫瘍開始細胞の頻度を低下させ
    る方法であって、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記被験体に
    投与する工程を含む、方法。
  44. 前記頻度の低下を、腫瘍開始細胞で富化されることが知られている腫瘍細胞表面マーカ
    ーのフローサイトメトリー分析または腫瘍開始細胞で富化することが公知の腫瘍細胞表面
    マーカーの免疫組織化学的検出を使用して決定する、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記頻度の低下をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの限界希釈分析を使用して
    決定する、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記頻度の低下を、ヒト腫瘍生細胞の免疫無防備状態のマウスへの移植を含むｉｎ ｖ
    ｉｖｏ限界希釈分析を使用して決定する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記頻度の低下を、ｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー支持条件へのヒト腫瘍生細胞の限界希釈
    沈着を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ限界希釈分析を使用して決定する、請求項４５に記載の方法
    。
  48. 抗癌剤を使用した処置のために被験体の腫瘍を感作する方法であって、請求項３４〜３
    ６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
  49. 転移の阻害または防止を必要とする被験体において転移を阻害または防止する方法であ
    って、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記被験体に投与する工
    程を含む、方法。
  50. 前記被験体が前記コンジュゲートの投与前または投与後に減量手順を受ける、請求項４
    ９に記載の方法。
  51. 維持療法を必要とする被験体に維持療法を行う方法であって、請求項３４〜３６のいず
    れか１項に記載の薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
  52. 増殖性障害を罹患した被験体において腫瘍開始細胞を枯渇させる方法であって、請求項
    ３４〜３６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方
    法。
  53. 請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を含む癌
    の処置方法。
  54. 小細胞肺癌を罹患した被験体を処置する方法であって、請求項３４〜３６のいずれか１
    項に記載の薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
  55. 抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法で用いるための医薬の調製における請求
    項３４〜３６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の使用。
  57. 請求項１〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲートを調製する方法であって、抗Ｄ
    ＬＬ３抗体またはその免疫反応性フラグメントを、
    Figure 2019069983
    Figure 2019069983
     からなる群から選択される化合物とコンジュゲートする工程を含む、方法。
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