JP5378795B2 - 抗hb−egf抗体を有効成分として含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
Iwamoto R,Yamazaki S,Asakura M et al.Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential for heart function.Proc NatlAcad Sci USA 2003;100:3221-6. Abraham JA,Damm D,Bajardi A,Miller J,Klagsbrun M,Ezekowitz RA.Heparin-binding EGF-like growth factor:characterization of rat and mouse cDNA clones,protein domain conservation across species,and transcript expression in tissues.Biochem Biophys Res Commun 1993;190:125-33. Karen M.,Frontiers in Bioscinece 3,288-299,1998 Raab G,Klagsbrun M.Heparin-binding EGF-like growth factor.Biochim Biophys Acta 1997;1333:F179-99. Yamazaki S,Iwamoto R,Saeki K et al.Mice with defects in HB-EGF ectodomain shedding show severe developmental abnormalities.J Cell Biol 2003;163:469-75. Ongusaha P.,Cancer Res(2004)64,5283-5290. Iwamoto R.,Higashiyama S.,EMBO J.13,2322-2330.(1994) Naglich JG.,Metherall JE.,Cell 69,1051-1061.(1992) Iwamoto R,Handa K,Mekada E.Contact-dependent growth inhibition and apoptosis of epidermal growth factor(EGF)receptor-expressing cells by the membrane-anchored form of heparin-binding EGF-like growth factor.J Biol Chem 1999;274:25906-12. Miyamoto S,Cancer Sci.97,341-347(2006) Blotnick S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91,2890-2894 Hashimoto K.,J.Biol.Chem.(1994)269,20060-20066. Mishima K.,Act Neuropathol.(1998)96,322-328. Wang YD.Oncogene(2002)21,2584-2592. Miyamoto S.,Cancer Res.(2004)64,5720- Buzzi S.,Cancer Immunol Immunother(2004)53,1041-1048.
(1)インターナライズ活性を有する抗HB-EGF抗体。
(2)細胞障害物質が結合した抗HB-EGF抗体。
(3)インターナライズ活性を有することを特徴とする(2)の抗体。
(4)ADCC活性またはCDC活性を有することを特徴とする抗HB-EGF抗体。
(5)中和活性をさらに有することを特徴とする(1)から(4)いずれかの抗体。
(6)以下の[1]〜[13]のいずれかに記載の抗体。
[1] CDR1として配列番号14に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号16に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体;
[2] CDR1として配列番号20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号22に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号24に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[3] [1]に記載のH鎖、および[2]に記載のL鎖を含む抗体;
[4] CDR1として配列番号26に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号28に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体;
[5] CDR1として配列番号32に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号34に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[6] [4]に記載のH鎖、および[5]に記載のL鎖を含む抗体;
[7] CDR1として配列番号76に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号77に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号78に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体;(HE-39H鎖)
[8] CDR1として配列番号79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号80に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号81に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;(HE-39L鎖-1)
[9] CDR1として配列番号82に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号84に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;(HE-39L鎖-2)
[10] [7]に記載のH鎖、および[8]に記載のL鎖を含む抗体;
[11] [7]に記載のH鎖、および[9]に記載のL鎖を含む抗体;
[12] [1]〜[11]いずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体;
[13] [1]〜[12]いずれかに記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体;
(7)(1)から(6)いずれかに記載の抗体を含有する医薬組成物;
(8)(1)から(6)いずれかに記載の抗体に結合した細胞障害性物質を含有する医薬組成物;
(9)細胞増殖抑制剤である(7)または(8)の医薬組成物;
(10)抗癌剤である(9)の医薬組成物;
(11)癌が膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍または血液癌である(10)の医薬組成物;
(12)抗HB-EGF抗体を用いて細胞障害性物質を細胞内に送達する方法;
(13)抗HB-EGF抗体に結合した細胞障害性物質により細胞の増殖を抑制する方法;
(14)細胞が癌細胞である(13)に記載の方法;
(15)細胞障害物質が化学療法剤、放射性同位元素、または毒性ペプチドである(12)〜(14)いずれかに記載の方法;
(16)細胞障害物質を細胞内へ送達する為の抗HB-EGF抗体の使用;
(17)細胞の増殖を抑制する為の、インターナライズ活性を有する抗HB-EGF抗体の使用;
(18)抗HB-EGF抗体が中和活性をさらに有することを特徴とする(17)の使用;
(19)抗HB-EGF抗体がADCC活性またはCDC活性をさらに有することを特徴とする(18)の使用;
(20)細胞が癌細胞である(16)〜(19)いずれかに記載の使用;
(21)抗HB-EGF抗体に細胞障害性物質が結合していることを特徴とする(16)〜(20)いずれかに記載の使用;
(22)以下の工程を含む医薬組成物の製造方法:
(a) 抗HB-EGF抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する抗体を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に細胞障害性物質を結合する工程;
(23)医薬組成物が抗癌剤である(22)に記載の製造方法;
(24)抗HB-EGF抗体を用いた癌の診断方法;
(25)標識物質が結合した抗HB-EGF抗体を用いることを特徴とする(24)の診断方法;
(26)細胞内に取り込まれた抗HB-EGFを検出することを特徴とする(24)または(25)の診断方法;
(27)標識物質が結合した抗HB-EGF抗体;
(28)インターナライズ活性を有することを特徴とする(27)の抗体。
HB-EGFは、EGFリガンドファミリーに属する増殖因子であり、ヒトHB-EGFをコードする遺伝子配列およびHB-EGFのアミノ酸配列は、それぞれGenBank登録番号NM_001945(配列番号49)、及びNP_001936(配列番号50)に開示されている。本発明において、HB-EGFタンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。本発明において断片とは、HB-EGFタンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、断片は天然のHB-EGFタンパク質の機能を有していなくてもよい。
本発明の抗HB-EGF抗体は、HB-EGFタンパク質に結合する抗体であればよく、その由来(マウス、ラット、ヒト、等)、種類(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体)および形状(改変抗体、低分子化抗体、修飾抗体、など)等は問われない。
本発明で用いられる抗体の好ましい他の態様の一つとして、細胞障害性物質が結合した抗体を挙げることができる。細胞障害性物質が結合した抗体が細胞内に取り込まれた場合、細胞障害性物質によって該抗体を取り込んだ細胞に細胞死を誘導することが可能である。従って、細胞障害性物質が結合した抗体は、さらにインターナライズ活性を有することが好ましい。
本発明で用いられる抗HB-EGF抗体は中和活性を有していてもよい。
本発明で用いられる抗HB-EGF抗体は抗体依存性細胞介在性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性および/または補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性を有していてもよい。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10%FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
(3)標的細胞の調製
HB-EGFタンパク質を発現する細胞を0.2mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10%FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。HB-EGFタンパク質を発現する細胞としては、HB-EGFタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、癌細胞(卵巣癌細胞など)等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10%FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
本発明の抗HB-EGFモノクローナル抗体は、公知の手段を用いて取得できる。本発明の抗HB-EGF抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
ヒトHB-EGFのアミノ酸配列より化学合成によって取得されたペプチド;
ヒトHB-EGF遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド;
ヒトHB-EGFタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をHB-EGFに接触させる工程、
(2)HB-EGFと抗体との結合を検出する工程、および
(3)HB-EGFに結合する抗体を選択する工程。
パパイン消化:F(ab)2またはFab;
ペプシン消化:F(ab’)2またはFab’;
プラスミン消化:Facb。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
[1] CDR1として配列番号14に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号16に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体;
[2] CDR1として配列番号20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号22に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号24に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[3] [1]に記載のH鎖、および[2]に記載のL鎖を含む抗体;
[4] CDR1として配列番号26に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号28に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体;
[5] CDR1として配列番号32に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号34に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[6] [4]に記載のH鎖、および[5]に記載のL鎖を含む抗体;
[7] CDR1として配列番号76に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号77に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号78に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体;(HE-39H鎖)
[8] CDR1として配列番号79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号80に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号81に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;(HE-39L鎖-1)
[9] CDR1として配列番号82に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号84に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;(HE-39L鎖-2)
[10] [7]に記載のH鎖、および[8]に記載のL鎖を含む抗体;
[11] [7]に記載のH鎖、および[9]に記載のL鎖を含む抗体;
[12] [1]〜[11]いずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体;
[13] [1]〜[12]いずれかに記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。
抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。更に、細胞に発現する抗原に対する抗体の結合活性を測定する手法としては、例えば、前記Antibodies A Laboratory Manual中の359-420ページに記載されている方法が挙げられる。
抗HB-EGF抗体に基づく細胞増殖抑制効果を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、培地中に添加した[3H]ラベルしたチミジンの生細胞による取り込みをDNA複製能力の指標として測定する方法が用いられる。より簡便な方法としてトリパンブルー等の色素を細胞外に排除する能力を顕微鏡下で計測する色素排除法や、MTT法が用いられる。後者は、生細胞がテトラゾリウム塩であるMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)を青色のホルマザン産物へ転換する能力を有することを利用している。より具体的には、被検細胞の培養液にリガンドと共に被検抗体を添加して一定時間を経過した後に、MTT溶液を培養液に加えて一定時間静置することによりMTTを細胞に取り込ませる。その結果、黄色の化合物であるMTTが細胞内のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により青色の化合物に変換される。この青色生成物を溶解し呈色させた後にその吸光度を測定することにより生細胞数の指標とするものである。MTT以外に、MTS、XTT、WST−1、WST−8等の試薬も市販されており(nacalai tesqueなど)好適に使用することができる。活性の測定に際しては、対照抗体として抗HB-EGF抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞増殖抑制活性を有しない結合抗体を、抗HB-EGF抗体と同様に使用して、抗HB-EGF抗体が対照抗体よりも強い細胞増殖抑制活性を示すことにより活性を判定することができる。
本発明は、HB-EGFを発現する細胞と本発明の抗体とを接触させることにより当該細胞の増殖を抑制する方法を提供する。本発明の抗体は、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるHB-EGFタンパク質に結合する抗体として上述したとおりである。抗HB-EGF抗体と接触させる細胞はHB-EGFが発現している細胞であれば特に限定されないが、疾患に関連した細胞であることが好ましい。疾患に関連した細胞の好ましい例として癌細胞を挙げることができる。癌は好ましくは膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍または血液癌である。血液癌には骨髄腫、リンパ腫、白血病などが含まれる。
本発明は抗HB-EGF抗体を用いて細胞障害性物質を細胞内に送達する方法に関する。本方法に用いられる抗体は上述の細胞障害活性が結合した抗HB-EGF抗体である。細胞障害活性物質の送達は細胞障害性物質が結合した抗HB-EGF抗体とHB-EGFを発現する細胞を接触させることにより行なうことができる。本発明において細胞障害性物質が送達される細胞は特に限定されないが、好ましくは疾患に関連した細胞である。疾患に関連した細胞の例としては癌細胞を挙げることができる。癌は好ましくは膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍または血液癌である。血液癌には骨髄腫、リンパ腫、白血病などが含まれる。
別の観点においては、本発明は、HB-EGFタンパク質に結合する抗体を含有する医薬組成物を特徴とする。又、本発明はHB-EGFタンパク質に結合する抗体を含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤を特徴とする。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
本発明はさらに、以下の工程を含む医薬品、特に抗癌剤の製造方法を提供する:
(a) 抗HB-EGF抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する抗体を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に細胞障害性物質を結合する工程。
HB-EGFの発現は、正常組織に比べて膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍および血液癌など広範な癌種で上昇していることから、本発明の別の態様においては、本発明は抗HB-EGF抗体を用いた疾患の診断方法、特に癌の診断方法を提供する。
(a) 被検者から採取された試料を提供する工程、
(b) (a)の試料と標識物質が結合した抗HB-EGF抗体を接触させる工程、
(c) 細胞内に取り込まれた抗体を検出する工程。
(a) 標識物質が結合した抗HB-EGF抗体を被験者に投与する工程、
(b) 癌細胞内に取り込まれた抗体を検出する工程。
(a) 抗HB-EGF抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する抗体を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に標識物質を結合する工程。
1−1.免疫原の調整
1−1−1.HB-EGF発現ベクターの作成
HB-EGF発現ベクターを構築するため、まずHB-EGF遺伝子のクローニングを以下のとおり行った。まずヒト心臓cDNA(human marathon ready cDNA,クロンテック)を鋳型にしてPyrobest Taq polymerase(タカラ)を用いて以下の条件でRT-PCRを行い、全長HB-EGF遺伝子をクローニングした。
EGF-1:ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(配列番号51)
EGF-2:TCAGTGGGAATTAGTCATGCCC(配列番号52)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒:35サイクル)
次に、得られたPCR産物を鋳型にして、以下の条件で再度PCRを行い、5'端、3'端にそれぞれSalI、NotI切断配列が付加された全長HB-EGF cDNA断片を得た。
EGF-3:TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(配列番号53)
EGF-4:TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(配列番号54)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒 :25サイクル)
これをSalI、NotIで切断し、同じくSalI、NotIで切断した動物細胞用発現ベクター(pMCN)に挿入し、HB-EGF発現ベクター(pMCN_HB-EGF)を構築した。
HB-EGF中和抗体を取得するための免疫原として、HB-EGFの細胞外領域とマウスIgG2a Fc領域との融合タンパク質(HB-EGF_Fc)を用いた。図1に免疫用融合タンパク質の構造を示す。
EGF-5:AAAGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTC(配列番号55)
EGF-6:TATCGGTCCGCGAGGTTCGAGGCTCAGCCCATGACACCTC(配列番号56)
(94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 30秒:25サイクル)
次に、得られたPCR産物をEcoRI、CpoIで切断した。このDNA断片を、マウスIgG2a_Fcを有する動物細胞用発現ベクター(pMCDN_mIgG2a_Fc)のEcoRI、CpoI間に挿入し、HB-EGF-Fc発現ベクター(pMCDN_HB-EGF-Fc)を構築した。
pvuIで切断することにより直鎖化したHB-EGF-Fc発現ベクター(pMCDN_HB-EGF-Fc)15μgを、PBS(-)に懸濁したDG44細胞(1x107細胞/mL,800μL)に1.5kV,25μFDでエレクトロポレーション(Gene Pulser;BioRad)により導入した。ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)を含む生育培地(CHO-S-SFM II,invitrogen)で適当な細胞数に希釈
した後、96 ウェルプレートに撒き、翌日G418(geneticin,invitrogen)を500μg/mLになるように添加した。約2週間後に単一クローンからなるウェルを顕微鏡下で選別し、培養上清10μLずつを用いてSDS-PAGEを行った。PVDF膜にブロッティング後、ヤギ抗HB-EGF抗体(R&D:AF-259-NA)、HRP-抗ヤギ抗体(BIOSOURCE:ACI3404)でウエスタンブロットを行い、HB-EGF-Fcを産生する細胞株のスクリーニングを行った。最も産生量の高い株を選び拡大培養を行った。
得られたHB-EGF_Fc産生株の培養上清からHi Trap Protein G HP 1mLカラム(AmershamBiosciences #17-0404-01)を用いてHB-EGF_Fcタンパク質の精製を行った。培養上清を流速1mL/minで吸着させ、20mLの20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、3.5mLの0.1M Glycine-HCl(pH2.7)で溶出した。溶出分画は、あらかじめ1MTris-HCl(pH9.0)を50μLずつ加えたエッペンドルフチューブに0.5mLずつ回収した。OD280nmを測定し、目的タンパク質が含まれている分画をまとめ、PBS(-)を加えて全量2.5mLとした後、PD-10カラム(Amersham Biosciences #17-0851-01)を用いてPBS(-)にバッファー置換した。精製したタンパク質は0.22μmフィルター(MILLIPORE #SLGV033RS)を通し、4℃で保存した。
初回免疫ではCOMPLETE ADJUBANT(DIFCO:DF263810)で、二回目以降はIMCOMPLETE ADJUBANT(DIFCO:DF263910)によりHB-EGF_Fcタンパク質のエマルジョンを作成し、これを50μg/mouseで各マウス[(MRL/lpr,オス,4週齢)(balb/c,メス,6週齢):いずれも日本チャールスリバーより購入]3匹ずつに皮下注射により免疫した(テルモシリンジ1mL、針26G)。初回免疫から2週間後に2回目の免疫を実施し、以降1週間おきに計4〜5回免疫を行った。最終免疫では、HB-EGF_Fc(50μg)を100μlのPBSに懸濁し、尾静脈注射により免疫を行い、その3日後に細胞融合を実施した。
細胞融合は以下のように行った。マウスより脾臓を無菌的に摘出し、medium 1(RPMI1640+PS)中ですりつぶして単一細胞懸濁液にした。これを70μmのナイロンメッシュ(Falcon)に通して脂肪組織等を取り除き、細胞数をカウントした。得られたB細胞をマウスミエローマ細胞(P3U1細胞)と、およそ2:1の細胞数比になるように混合し、1mLの50% PEG(Roche,cat #:783 641)を加えて、細胞融合を行った。融合した細胞をmedium 2[RPMI1640+PS,10% FCS,HAT(Sigma,H0262),5% BM condimed H1(Roche:#1088947)]に懸濁し、適当枚数(10枚)の96ウェルプレートに200μL/ウェルで分注し、37℃で培養した。1週間後に培養上清を用いて、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。なお、2匹のBalb/cマウス由来のハイブリドーマをそれぞれHAシリーズ、HBシリーズとし、Mrl/lprマウス(1匹)由来のハイブリドーマをHCシリーズとし、解析を行った。
2−1.ヒトHB-EGF発現細胞株の樹立
2−1−1.HB-EGF_DG44株の樹立
HB-EGFを発現するDG44細胞株の樹立を以下のとおり行った。まず、1-1-1で構築したHB-EGF発現ベクター(pMCN_HB-EGF)15μgをpvuIで切断し、1-1-3と同様の手法によりDG44細胞にエレクトロポレーションにより導入した。その後、G418耐性株をピックアップし、各細胞をヤギ抗HB-EGF抗体(R&D)、FITC標識抗ヤギIgG抗体で染色した。FACSキャリバー(ベクトンディッキンソン)で、細胞表面に発現するHB-EGFを解析し、発現量の高いクローンを選択した。
HB-EGFを細胞膜上で発現するBa/F3細胞株の樹立を以下のとおり行った。細胞膜上に発現するHB-EGFはプロテアーゼによってプロセッシングを受け、培養液中に切り出されることが知られている。そこでまず、プロテアーゼ切断部位に変異を持つ、proHB-EGF発現ベクターの構築を行った。
PCR反応1
EGF-3:TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(配列番号53)
EGF-7:CGATTTTCCACTGTGCTGCTCAGCCCATGACACCTCTC(配列番号57)
(94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 30秒:20サイクル)
PCR反応2
EGF-8:TGGGCTGAGCAGCACAGTGGAAAATCGCTTATATACCTA(配列番号58)
EGF-4:TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(配列番号54)
(94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 30秒:20サイクル)
EGF-3:TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(配列番号53)
EGF-4:TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(配列番号54)
(94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 60秒:22サイクル)
HB-EGFを発現するSKOV-3細胞株の樹立を以下のとおり行った。卵巣癌細胞株であるSKOV-3(ATCCより購入)は10% FCS,ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含有する生育培地( Mc'Coy 5A medium,invitrogen)で培養を行った。
2−3−1.pCV-hEGFR/G-CSFRの構築
本発明の抗体の活性を評価するために、ヒトEGFRの細胞外領域とマウスG-CSFRの細胞内領域のキメラ受容体(hEGFR/mG-CSFR)を発現するベクターを構築した。図2aに、HB-EGFがこのキメラ受容体を発現する細胞に結合したときの当該細胞に及ぼす影響を模式的に示す。
EGFR-1:ATGCGACCCTCCGGGACGGC(配列番号61)
EGFR-2:CAGTGGCGATGGACGGGATCT(配列番号62)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 2分:35サイクル)
EGFR-5
TTGCGGCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGC(配列番号63)
EGFR-6
ACCAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAGTCAGATGGATCGGACGGGATCTTAGGCCCATTCGT(配列番号64)
(94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 2分:25サイクル)
pvuIで切断することにより直鎖化したキメラ受容体(hEGFR/mG-CSFR)発現ベクター(pCV_hEGFR/mG-CSFR)15ugを、0.33kV,950μFDでBa/F3細胞にエレクトロポレーション(Gene Pulser;BioRad)により導入した。この細胞を10ng/ml HB-EGF、500μg/ml G418を含む培地(RPMI1640,10% FCS,PS)で2週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。
2−4−1.HB-EGF結合抗体のスクリーニング(一次スクリーニング)
抗HB-EGF中和抗体を取得するため、まずHB-EGFに結合する抗体のスクリーニングを行った。結合抗体のスクリーニングにはELISA,FACSを用いた。
HB-EGFタンパク質(R&D,259-HE)を1μg/mlでコーティングしたELISA用プレート(NUNC)に、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、1時間インキュベートした。その後、アルカリフォスファターゼ(AP)標識抗マウスIgG(ZYMED:#62-6622)で1時間反応後、1mg/mlの基質(SIGMA:S0942-50TAB)を加え発色させた。プレートリーダー(BioRad社)によりOD405を測定し、ELISA陽性ウェルを選抜した。
HB-EGF_Ba/F3細胞(約1x105細胞)にハイブリドーマの培養上清を加え、4℃で1時間インキュベートした。その後FITC標識抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER:PN IM0819)を加え、4℃で30分インキュベートした。その後、各ハイブリドーマ培養上清の細胞表面のHB-EGFへの結合活性をFACS(ベクトンディッキンソン)にて解析した。
ELISA、または、FACS解析でHB-EGFへの結合活性を有するクローンを単一クローン化するため、限界希釈(LD)を行った。陽性ウェルの細胞数を測定し、3細胞/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種した。約10日間培養し、コロニーが出現したウェルの培養上清について、再びELISAあるいはFACSにより結合活性を解析した。これら一連の作業により、HAシリーズでは5種類の、HBシリーズでは4種類の、そしてHCシリーズでは5種類のHB-EGF結合活性を有する単一クローンを得た。
抗体のサブタイプ決定はIsoStrip(Roche #1 493 027)を用いて行った。サブタイプ決定にはPBS(-)で10倍希釈したハイブリドーマの培養上清を用いた。
得られた単一クローンのハイブリドーマの培養上清80mLからHi Trap Protein G HP 1mLカラム(Amersham Biosciences #17-0404-01)を用いて抗体を精製した。ハイブリドーマ上清を流速1 mL/minで吸着させ、20mLの20mM Phosphate buffer(pH7.0)で洗浄した後、3.5 mLの0.1M Glycine-HCl(pH2.7)で溶出した。溶出分画は、あらかじめ1M Tris-HCl(pH9.0)を50μLずつ加えたエッペンドルフチューブに0.5mlずつ回収した。OD280nmを測定し、抗体が含まれている分画をまとめ、PBS(-)を加えて全量2.5mLとした後、PD-10カラム(Amersham Biosciences #17-0851-01)を用いてPBS(-)にバッファー置換した。精製した抗体は0.22μmフィルター(MILLIPORE #SLGV033RS)を通し、以下詳細に各精製抗体の性質について検討を行った。
各精製抗体を用いて、EGFR_Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する中和活性を解析した。EGFR_Ba/F3細胞をHB-EGF(80ng/ml)存在下で2x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒き、各精製抗体を0〜200ng/mlで添加した。3日間培養後、WST-8(cell counting kit-8)を用いて細胞数を測定した。
3−1.HA-20、HB-20、HC-15の可変領域のクローニングとアミノ酸配列の解析
ハイブリドーマ約5x106個からTrizol(#15596-018,Life technologies)を用いてtotal RNAを精製した。得られたtotal RNA 1μgよりSMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH #PT3269-1)を用い、添付のマニュアルにしたがって全長cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にして、Advantage 2 PCR Enzyme System(CLONTECH #PT3281-1)を用い、以下の条件でPCRを行って各抗体の重鎖(VH)、および軽鎖(VL)の可変領域をコードする遺伝子を増幅した。
軽鎖可変領域のクローニング用プライマー
UPM⇔k(VL-k)
UPM:Kitに添付
VL-k:GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (配列番号69)
重鎖可変領域のクローニング用プライマー
HA-20:UPM⇔VH-G1
HB-20,HC-15 : UPM⇔VH-2a
UPM:Kitに添付
VH-G1:GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG(配列番号70)
VH-2a:CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG(配列番号71)
94℃ 5秒,72℃ 2分,5サイクル
94℃ 5秒,70℃ 10秒,72℃ 2分,5サイクル
94℃ 5秒,68℃ 10秒,72℃ 2分,27サイクル
得られた3種類の抗体(HA-20,HB-20,HC-15)の活性型HB-EGFタンパク質への結合活性を比較するため、以下の実験を行った。HB-EGFタンパク質(R&D,259-HE)を1μg/mlでコーティングしたELISA用プレート(NUNC)に、HA-20、HB-20、HC-15抗体を各濃度で反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ(AP)標識抗マウスIgG(ZYMED:#62-6622)で1時間反応後、1mg/mlの基質(SIGMA:S0942-50TAB)を加え発色した。その後、プレートリーダーでOD405を測定し、得られた各抗体の結合曲線をもとに、50%の結合を示す抗体濃度(ED50)を算出した。その結果、活性型HB-EGFへの結合活性は、ED50値が0.2〜1.4nMであり、いずれも強い結合活性を有することが分かった(図5)。
次に、得られた3つの抗体のproHB-EGFに対する結合活性を解析した。内在性にHB-EGFを発現していることが知られている卵巣癌細胞株RMG1細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より購入)は、10% FCSを含む生育培地( Ham's F12 medium,invitrogen)で培養した。HB-EGFを強制発現させた細胞である、Ba/F3細胞(HB-EGF_Ba/F3)、HB-EGF発現DG44細胞(HB-EGF_DG44)、及びSKOV-3細胞(HB-EGF_SKOV-3)並びにHB-EGFを内示的に発現しているRMG1細胞に対し、各抗体(10μg/ml)を4℃で1時間反応させ、さらにFITC標識抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER:PN IM0819)で染色を行った。その後、各抗体の細胞表面のHB-EGFへの結合をFACS(ベクトンディッキンソン)にて解析した。
3−4−1.EGFR/HB-EGF結合阻害作用の固相解析
3−4−1−1.EGFR-Fcタンパク質の調整
HB-EGFとその受容体であるEGFRとの結合を固相条件で確認できるELISA系を構築するため、まず受容体タンパク質としてEGFRの細胞外領域とヒトIgG1のFc領域との融合タンパク質(EGFR-Fc)の調整を行った。図7にHB-EGFとEGFRとの結合をHB-EGF抗体が固相上で阻害する状態を模式的に示す。
EGFR-7:GTTAAGCTTCCACCATGCGACCCTCCGGGAC(配列番号72)
EGFR-8:GTTGGTGACCGACGGGATCTTAGGCCCATTCGTTG(配列番号73)
(94℃ 30秒、72℃ 30秒:25サイクル)
増幅したEGFR細胞外領域をコードする遺伝子断片を、BstEIIとHindIIIで切断し、これを、pMCDN2-FcのBstEII-HindIII間に挿入した。挿入された遺伝子断片の塩基配列を確認し、ヒトEGFRの細胞外領域とヒトIgG1のFc領域との融合タンパク質(EGFR-Fc)を発現するベクター(pMCDN2_EGFR-Fc)の構築を終了した。本発現ベクターが発現するタンパク質、すなわちEGFR-Fcの塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号74および75に示す。
抗ヒトIgG抗体をコートしたELISAプレートに、精製したEGFR-Fcを0.5μg/mlで1時間反応させた。これに、HB-EGF(R&D,259-HE)を、0〜250ng/mlで1時間反応させ、その後、ビオチン標識抗HB-EGF抗体(R&D,BAF259)とAP標識ストレプトアビジン(ZYMED,#43-8322)によりEGFR-Fcに結合したHB-EGFタンパク質を検出した。図8にELISAによるEGFRとHB-EGFとの結合様式の解析モデルを示す。その結果、この固相系により、EGFRに結合するHB-EGFをおよそ4ng/mlの濃度から検出できることが分かった(図9)。
2-4-2で得られた抗体の、HB-EGFとEGFRとの結合阻害活性に関して、上記固相評価系を用いた解析を行った。EGFR-Fcを固相化したELISAプレートに、HB-EGF(50ng/ml)と各抗体を添加し、室温で1時間反応した。プレートをTBS-Tで洗浄し、EGFRに結合しているHB-EGFを上記手法により検出した(図10)。
HA-20、HB-20、HC-15についてEGFR_Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する中和活性を比較した。上記と同様にEGFR_Ba/F3細胞をHB-EGF(80ng/ml)存在下で2x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒き、各精製抗体を添加した。3日間培養後、WST-8(cell counting kit-8)を用いて細胞数を測定し、増殖曲線を作成した。そしてこの結果をもとに、最大抑制効果の50%の抗体濃度(EC50値)を算出した。
RMG-1細胞に対する中和活性の解析は以下のとおり行った。96ウェルプレートにRMG-1細胞を、6x103細胞/ウェルで、8%あるいは2% FCS を含むHam's F12 medium 中に撒き、そこへ各抗体を添加した。1週間培養後に、WST-8試薬により細胞数を測定した。
3−5−1.インターナライズ活性を利用した細胞死誘導評価系
抗体のインターナライズによる細胞死誘導活性の評価は、Saporin(トキシン)標識抗マウスIgG抗体(Mab-ZAP,Advanced Targeting Systems社)を用いて行った。まず、一次抗体とMab-ZAPを混合し室温で15分反応させることにより、間接的なトキシン標識抗体を形成させた。これを標的細胞に添加した。添加した抗体が細胞内にインターナライズされれば、Mab-ZAPも一次抗体とともに細胞内に取り込まれるため、細胞内でリリースされたSaporinにより細胞死が誘導される。図13にその模式図を示す。
HC-15を用いて、そのインターナライズ活性により細胞死を誘導できるかについて解析を行った。SKOV-3細胞、および、HB-EGFを強制発現させたSKOV-3細胞(HB-EGF_SKOV3)を、2x103細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒いた。一晩培養後、得られた抗HB-EGF抗体(100ng/ウェル)に対し、Mab-ZAPを100ng/ウェルになるように反応させ、これを細胞に添加した。抗体添加から4日後、WST-8により生細胞数を測定した。その結果、HB-EGFをわずかしか発現していない親株のSKOV-3細胞に対しては、いずれの抗体においても細胞死誘導活性は見出されなかったが、HB-EGFを強制発現させたSKOV-3細胞では、各抗体ともMab-ZAP存在下で細胞死誘導活性が認められた。特に、proHB-EGFに結合するHB-20、HC-15で強い細胞死誘導活性が認められた(図14)。
3−5−3−1.卵巣癌株(ES-2)に対する細胞障害活性の解析
3−5−3−1−1.ES-2に対する各抗体の結合活性
次に、内因的にHB-EGFを発現する卵巣癌細胞株(ES-2)に対する細胞死誘導活性を解析した。卵巣癌細胞株であるES-2細胞(ATCCより購入)は10% FCS,ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含有する生育培地(Mc’Coy 5A medium,invitrogen )で培養を行った。
次に、ES-2細胞に対する各抗体のインターナライズ活性を利用した細胞障害活性について解析を行った。ES-2細胞を2x103細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒いた。一晩培養後、各抗体(100ng/well)とMab-ZAP(100ng/well)を反応させこれを細胞に添加した。3日後にWST-8により生細胞数を測定した。その結果、図16に示したとおり、最もHB-EGFへの結合活性の強いHC-15でMab-ZAP存在下で細胞死誘導活性が確認された。
3−5−3−2−1.MCAS,RMG-1に対するHC-15の結合活性
次に、別の卵巣癌細胞株(RMG-1、MCAS)を使って、抗体の増殖抑制能を調べた。MCAS細胞(JCRBより購入)は20% FCS,を含有する生育培地(Eagle’s minimal essential medium,invitrogen)で培養を行った。
次に、RMG-1およびMCAS細胞の足場非依存的な増殖に対する抗体の活性を、軟寒天コロニー形成アッセイにより解析した。軟寒天コロニー形成アッセイは以下のとおり実施した。
3−5−4−1.血液癌株におけるHB-EGFの発現解析
次に、HC-15のインターナライズ活性を利用した抗腫瘍効果が血液癌に対しても認められるか解析を行った。RPMI8226(多発性骨髄腫,ATCCより購入)、Jurkat(急性T細胞白血病,ATCCより購入)、HL-60(急性骨髄性白血病,JCRBより購入)、THP-1(急性単球性白血病,JCRBより購入)、U937(単球性白血病,JCRBより購入)は、10% FCSを含むRPMI1640(Invitogen)で培養した。
各血液癌細胞株を1〜2x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒いた。その後、各抗HB-EGF抗体(100ng/ウェル)に対し、Mab-ZAPを100ng/ウェルになるように反応させ、これを細胞に添加した。抗体添加から5日後、WST-8により生細胞数を測定した。その結果、U937細胞とTHP-1細胞に対して、HC-15抗体とMabZAPの同時添加によって増殖抑制が観察された。この結果より、いくつかの血液癌に対して、HC-15抗体のインターナライズ活性が抗腫瘍剤として有用であることが示された。
4−1.抗体のサポリン標識
次に、直接毒素(サポリン)を標識したHA-20抗体(HA-SAP)、HC-15抗体(HC-SAP)を使って、抗体のインターナライズ活性による細胞障害活性の解析を行った。
4−2−1.サポリン標識抗体による固形癌細胞株の細胞障害活性の解析
解析に用いた癌細胞は、以下のとおりである。
ES-2、MCAS(卵巣癌)、Capan-2(膵臓癌、ヒューマンサイエンス振興財団より購入)、BxPC-3、22Rv1(前立腺癌、ATCCより購入)、HUVEC(ヒト血管内皮細胞、タカラバイオより購入)
これらはそれぞれ購入元の指南書に指示された培養条件で培養を行った。
RPMI8226(多発性骨髄腫,ATCCより購入)、HL-60(急性骨髄性白血病,JCRBより購入)、SKM-1、THP-1(急性単球性白血病,JCRBより購入)、U937(単球性白血病,JCRBより購入)は、10% FCSを含むRPMI1640(Invitogen)で培養した。
5−1.分泌型HB-EGF発現ベクターの構築
分泌型HB-EGF発現ベクターの構築を以下のとおり行った。まずHB-EGF発現ベクター(pMCN_HB-EGF)を鋳型にしてPyrobest Taq polymerase(タカラバイオ)を用いて以下の条件でPCRを行い、HB-EGFの細胞外領域(アミノ酸1-148)をコードする断片を増幅した。
EGF-9:TCC GAA TTC CAC CAT GAA GCT GCT GCC GTC GGT G(配列番号91)
EGF-10:TTT GCG GCC GCT AGA GGC TCA GCC CAT GAC ACC T(配列番号92)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 30秒:25サイクル)
分泌型HB-EGF発現ベクター(pMCDN_sHB-EGF,50μg)をバイオラッド社の指南書(#165-2431)に従って、金粒子にコートした。ここで得られたDNAが結合した金粒子を、Tubing Prep Station(バイオラッド社)を用いてチューブ内にコートし、tubing cutter を用いて適当な長さに切断し、免疫用DNAとして4℃に保存した。
6−1.HE-39の活性型HB-EGFに対する結合活性の解析
得られたHE-39の活性型HB-EGFタンパク質への結合活性を、既に得られている3種類の抗体(HA-20,HB-20,HC-15)と比較するため、以下の実験を行った。HB-EGFタンパク質(R&D,259-HE)を1μg/mlでコーティングしたELISA用プレート(NUNC)に、HA-20、HB-20、HC-15、HE-39抗体を各濃度で反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ(AP)標識抗マウスIgG(ZYMED:#62-6622)で1時間反応後、1mg/mlの基質(SIGMA:S0942-50TAB)を加え発色した。その後、プレートリーダーでOD405を測定し、得られた各抗体の結合曲線をもとに、50%の結合を示す抗体濃度(ED50)を算出した。その結果、HE-39の活性型HB-EGFへの結合活性は、ED50値が約0.016nMであることが明らかになり、他の3つの抗体と比較して非常に強い結合活性を有することが分かった(図24)。
次に、HE-39のproHB-EGFに対する結合活性を、既に得られている3種類の抗体(HA-20,HB-20,HC-15)と比較するため、以下の実験を行った。
6−3−1.HB-EGFのEGFRへの結合阻害活性
3-4-1に記載の固相評価系を用いて、HE-39抗体と既に得られている3種類の抗体(HA-20,HB-20,HC-15)のHB-EGFとEGFRとの結合阻害活性の比較を行った。EGFR-Fcを固相化したELISAプレートに、HB-EGF(50ng/ml)と段階的に希釈した各抗体を添加し、室温で1時間反応した。プレートをTBS-Tで洗浄し、EGFRに結合しているHB-EGFを3-4-1に記載の手法により検出した(図26)。
次に、HE-39抗体のEGFR_Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する中和活性を解析し、HA-20、HB-20、HC-15の中和活性と比較した。3-4-2に記載の方法と同様に、EGFR_Ba/F3細胞をHB-EGF(80ng/ml)存在下で2x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒き、各精製抗体を添加した。3日間培養後、WST-8(cell counting kit-8)を用いて細胞数を測定し、増殖曲線を作成した。そしてこの結果をもとに、最大抑制効果の50%の抗体濃度(EC50値)を算出した。
7−1.可変領域のクローニング
3−1に記載の方法で、HE-39抗体の可変領域のクローニングとアミノ酸配列の解析を行った。HE-39は、IgG1であったため、軽鎖可変領域はVL-kプライマー(配列番号69)を、重鎖可変領域は、VH-G1プライマー(配列番号70)を用いてクローニングを実施した。
可変領域をクローニングした結果、HE-39ハイブリドーマ由来軽鎖可変領域は2つの異なる遺伝子(VL-1,VL-2)が存在した。このことから、HE-39ハイブリドーマが完全にモノクローン化できていない可能性が推測された。そこで、HE-39を再度限界希釈しモノクローン化を試みた。HE-39を1細胞/ウェルになるように96穴プレートに播種した。約10日間培養後、コロニーが出現したウェルの培養上清について、HB-EGF発現Ba/F3細胞を用いてFACS解析を行った。これにより図29aに示すとおり、HB-EGF結合活性を有する単一クローンを3クローン(HE39-1,HE39-5,HE39-14)得た。
VH-G1:GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG(配列番号70)
HE39VH:CTG GGT CTT TCT CTT CCT CCT GTC A (配列番号93)
HE-39軽鎖可変領域特異的プライマー
VL-1
VL-k:GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (配列番号69)
HE39VL1:TGA GAT TGT GAT GAC CCA GAC TCC A(配列番号94)
VL-2
VL-k:GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (配列番号69)
HE39VL2:TTC TCA CCC AGT CTC CAG CAA TCA(配列番号95)
94℃ 5秒,72℃ 2分,5サイクル
94℃ 5秒,70℃ 10秒,72℃ 2分,5サイクル
94℃ 5秒,68℃ 10秒,72℃ 2分,27サイクル
8−1.HE-39抗体インターナライズ活性による細胞障害活性の解析
DNA免疫によって得られたHE-39抗体においても、インターナライズ活性による細胞障害作用を有しているか解析を行った。
その結果、抗HB-EGF抗体とMab-ZAPを両方添加した群において、細胞死誘導活性が認められた。特に、HC-15、HE-39で強い細胞死誘導活性が認められた(図30)。
9−1.HE-39抗体の結合ドメインの解析
HB-EGFは図31aに示す構造から成る。成熟型(mature form)のHB-EGFは、ヘパリン結合ドメインとEGF様ドメインの2つの異なるドメインで構成されており、この2つのドメインのうちHE-39抗体がどちらのドメインを認識しているかを解析することを目的として、まずは以下のGST融合蛋白の大腸菌発現ベクターの構築を行った。
9−1−1−1.GST-HBEGF mature発現ベクターの構築
GST蛋白と成熟型のHB-EGFとの融合蛋白発現ベクターを以下のとおり作成した。まずHB-EGF発現ベクター(pMCN_HB-EGF)を鋳型にしてPyrobest Taq polymerase(タカラバイオ)を用いて以下の条件でPCRを行い、成熟型のHB-EGFをコードする断片を増幅した。
EGF11:TTGGATCCGTCACTTTATCCTCCAAGCCACA(配列番号96)
EGF12:TTCTCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCT(配列番号97)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 30秒:30サイクル)
GST蛋白とHB-EGFのヘパリン結合ドメイン(HBD)との融合蛋白発現ベクターを以下のとおり作成した。まずHB-EGF発現ベクター(pMCN_HB-EGF)を鋳型にしてPyrobest Taq polymerase(タカラバイオ)を用いて以下の条件でPCRを行い、ヘパリン結合ドメインをコードする断片を増幅した。
EGF11:TTGGATCCGTCACTTTATCCTCCAAGCCACA(配列番号96)
EGF13:TTCTCGAGCCGAAGACATGGGTCCCTCTT(配列番号98)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 30秒:30サイクル)
GST蛋白とHB-EGFのEGF様ドメイン(EGFD)との融合蛋白発現ベクターを以下のとおり作成した。まずHB-EGF発現ベクター(pMCN_HB-EGF)を鋳型にしてPyrobest Taq polymerase(タカラバイオ)を用いて以下の条件でPCRを行い、EGF様ドメインをコードする断片を増幅した。
EGF14:TAGGATCCAAGAGGGACCCATGTCTTCGG(配列番号99)
EGF12:TTCTCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCT(配列番号97)
(94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 30秒:30サイクル)
これら構築した各大腸菌発現ベクターを用いて、それぞれ大腸菌BL21株にトランスフォームした。これら大腸菌をLB培地(各1ml)で培養し、対数増殖期にIPTG(final 1mM)を添加し、蛋白発現を誘導した。4〜5時間後に大腸菌を回収し、SDS sample buffer(0.5 ml)に溶解してlysateとし、このうち5μlを定法に従ってSDS-PAGE、続いてPVDF膜にブロットし、ウエスタンブロットに用いた。
上記で調整した、mature HB-EGF蛋白の各領域(ヘパリン結合ドメイン、EGF様ドメイン)とのGST融合蛋白を用いて、ウエスタンブロットを行い、HE-39抗体が、mature HB-EGF蛋白のどちらの領域を認識するか調べた。図31bのウエスタンブロットの結果より、HE-39抗体はmature HB-EGF蛋白のEGF様ドメインを認識していることが明らかになった。
HE-39が、mature HB-EGF蛋白のEGF様ドメインを認識していることから、EGF様ドメインを、図32aに示すとおりさらに細かく分割し、エピトープ配列の同定を試みた。
3分割したEGFドメイン(EGFD5、EGFD6、EGFD7)とGST蛋白との融合蛋白の大腸菌発現ベクターを以下のとおり作成した。
EGFD5合成用オリゴマー
HEP9:
GAT CCA AGA GGG ACC CAT GTC TTC GGA AAT ACA AGG ACT TCT GCA TCC ATG GAG AAT GCA AAT ATC(配列番号100)
HEP10:
TCG AGA TAT TTG CAT TCT CCA TGG ATG CAG AAG TCC TTG TAT TTC CGA AGA CAT GGG TCC CTC TTG(配列番号101)
EGFD6合成用オリゴマー
HEP11:
GAT CCT GCA TCC ATG GAG AAT GCA AAT ATG TGA AGG AGC TCC GGG CTC CCT CCT GCA TCT GCC ACC CGC(配列番号102)
HEP12:
TCG AGC GGG TGG CAG ATG CAG GAG GGA GCC CGG AGC TCC TTC ACA TAT TTG CAT TCT CCA TGG ATG CAG(配列番号103)
EGFD7合成用オリゴマー
HEP13:
GAT CCG CTC CCT CCT GCA TCT GCC ACC CGG GTT ACC ATG GAG AGA GGT GTC ATG GGC TGA GCC TCC(配列番号104)
HEP14:
TCG AGG AGG CTC AGC CCA TGA CAC CTC TCT CCA TGG TAA CCC GGG TGG CAG ATG CAG GAG GGA GCG(配列番号105)
これら構築した各大腸菌発現ベクターを用いて、それぞれ大腸菌BL21株にトランスフォームした。これら大腸菌をLB培地(各1ml)で培養し、対数増殖期にIPTG(final 1mM)を添加し、蛋白発現を誘導した。4〜5時間後に大腸菌を回収し、SDS sample buffer(0.5 ml)に溶解してlysateとし、このうち5μlを定法に従ってSDS-PAGE、続いてPVDF膜にブロットし、ウエスタンブロットに用いた。
上記で調整した、EGF様ドメインを3分割したGST融合蛋白(GST-EGFD5、GST-EGFD6、GST-EGFD7)を用いて、ウエスタンブロットを行い、HE-39抗体の認識配列を調べた。図32bのウエスタンブロットの結果が示すとおり、HE-39抗体はGST-EGFD7に結合したことから、HE-39抗体はEGFドメインの中の[APSCICHPGYHGERCHGLSL]配列を認識していることが明らかになった。
10−1.各抗体の膜発現HB-EGFに対する結合活性の解析
これまで得られた抗体の膜発現HB-EGFに対する結合活性をFACS解析により比較した。HB-EGFを強制発現させた細胞である、Ba/F3細胞(HB-EGF_Ba/F3)に対し、各抗体(10μg/ml)を4℃で1時間反応させ、さらにFITC標識抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER:PN IM0819)で染色を行った。その後、各抗体の細胞表面のHB-EGFへの結合をFACS(ベクトンディッキンソン)にて解析した。
HB-EGF_Ba/F3に対して結合活性を示した抗体(HB-10、HB20、HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58)について、HB-EGF_Ba/F3に対するADCC活性の解析をクロム放出法により実施した。
なお、特異的クロム遊離率は以下の式から算出した。
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
ここで、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞溶解して培地へ放出される放射活性平均値、Cは培地のみ添加した場合における放射活性平均値である。
HB-EGF_Ba/F3細胞を遠心分離(1000rpm、5分間、4℃)により回収し、細胞ペレットを約200μLの培地および3.7MBqのChromium-51(Code No.CJS4、Amersham Pharmacia Biotech)に懸濁し、5%CO2インキュベーター中で37℃にて1時間培養した。前記細胞を培地にて3回洗浄した後に、培地にて細胞密度が1×104/mLに調製し、96ウェル平底プレートに100μLずつ添加した。
Claims (13)
- インターナライズ活性を有し、細胞障害性物質が結合した抗HB-EGF抗体。
- 中和活性をさらに有することを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体であって、以下の[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体:
[1] CDR1として配列番号14に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号16に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、およびCDR1として配列番号20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号22に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号24に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[2] CDR1として配列番号76に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号77に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号78に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、およびCDR1として配列番号79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号80に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号81に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[3] CDR1として配列番号76に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号77に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号78に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、およびCDR1として配列番号82に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号84に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[4] [1]〜[3]いずれかに記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。 - 請求項1から3いずれかに記載の抗体を含有する医薬組成物。
- 抗癌剤である請求項4記載の医薬組成物。
- 癌が膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、または血液癌である請求項5記載の医薬組成物。
- 抗癌剤の製造の為のインターナライズ活性を有し、細胞障害性物質を結合した抗HB-EGF抗体の使用。
- 抗HB-EGF抗体がADCC活性またはCDC活性をさらに有することを特徴とする請求項7に記載の使用。
- 抗HB-EGF抗体が中和活性をさらに有することを特徴とする請求項7または8に記載の使用。
- 抗体が以下の[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体である、請求項7〜9いずれかに記載の使用:
[1] CDR1として配列番号14に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号16に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号18に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、およびCDR1として配列番号20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号22に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号24に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[2] CDR1として配列番号76に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号77に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号78に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、およびCDR1として配列番号79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号80に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号81に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[3] CDR1として配列番号76に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号77に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号78に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、およびCDR1として配列番号82に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号84に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体;
[4] [1]〜[3]いずれかに記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。 - 癌が膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍または血液癌である請求項7〜10いずれかに記載の使用。
- 以下の工程を含む医薬組成物の製造方法:
(a) 抗HB-EGF抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する抗体を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に細胞障害性物質を結合する工程。 - 医薬組成物が抗癌剤である請求項12に記載の製造方法。
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