JP5992480B2 - 抗ereg抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents
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Description
更に白澤らはEREGがケラチノサイトのみならず組織中マクロファージにも発現すること、及びEREG欠損マウスが慢性皮膚炎の症状をきたすことを明らかにした。本マウスの解析における諸検討を通じて、EREGが外部環境とのバリアにおいて、ケラチノサイトおよびマクロファージによる免疫及び炎症関連応答で重要な役割を果たしていることが示されていた(非特許文献5)。
別の態様においては、本発明は、癌診断マーカーとしてのEREGタンパク質の使用を提供する。
(a) 被検者から試料を採取する工程;
(b) 採取された試料に含まれるEREGタンパク質を、EREGタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。本発明において上記試料は被検者から採取できるものであればいかなるものでも使用することができる。一の態様においては被検者から採取した血液試料が使用される。本発明における好ましい血液試料は血清である。また別の態様では被検者から外科的に、あるいは生検(バイオプシー)により採取された試料も使用される。該診断方法に係る癌は、対象とする癌細胞がEREGタンパク質を発現する癌であればいずれの癌でもよい。本発明における好ましい癌は、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、および腎癌である。本発明に基づいて、これらの癌の原発性病巣、および転移性病巣のいずれをも診断することができる。特に好ましい癌は原発性大腸癌、転移性大腸癌、および膵癌である。
本発明において、被験者から試料を採取する工程は被験者から採取された試料を提供する工程と言うこともできる。
さらに別の態様においては、本発明は、本発明の診断方法に用いるための診断薬やキットを提供する。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
〔1〕EREGタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物、
〔2〕EREGタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、
〔3〕EREGタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤、
〔4〕EREGタンパク質に結合する抗体が細胞増殖阻害活性を有する抗体である、〔3〕に記載の抗癌剤、
〔5〕EREGタンパク質に結合する抗体が、以下(1)から(57)のいずれかに記載の抗体である、〔3〕または〔4〕に記載の抗癌剤;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列の117から452位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:49に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:57に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:59に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)CDR1として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:63に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(20)(19)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(21)(19)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(22)CDR1として配列番号:67に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:71に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(23)(22)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(24)(22)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(25)(19)に記載のH鎖、および(22)に記載のL鎖を含む抗体、
(26)(20)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体、
(27)(21)に記載のH鎖、および(24)に記載のL鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:73に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(31)CDR1として配列番号:79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(32)(31)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(33)(31)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(34)(28)に記載のH鎖、および(31)に記載のL鎖を含む抗体、
(35)(29)に記載のH鎖、および(32)に記載のL鎖を含む抗体、
(36)(30)に記載のH鎖、および(33)に記載のL鎖を含む抗体、
(37)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(38)(37)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(39)(37)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(40)CDR1として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:93に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(41)(40)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(42)(40)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(43)(37)に記載のH鎖、および(40)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(38)に記載のH鎖、および(41)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(39)に記載のH鎖、および(42)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)CDR1として配列番号:97に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:99に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(47)(46)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(48)(46)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(49)CDR1として配列番号:103に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:105に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(50)(49)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(51)(49)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(52)(46)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(53)(47)に記載のH鎖、および(50)に記載のL鎖を含む抗体、
(54)(48)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(55)(1)から(54)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(54)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(56)(1)から(55)のいずれかに記載の抗体が結合するEREGタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
(57)(1)から(56)のいずれかに記載の抗体の低分子化抗体。
〔6〕EREGタンパク質に結合する抗体が、配列番号:21に記載のアミノ酸配列において、29番目のAlaから69番目のSer、又は63番目のValから108番目のLeuを認識することを特徴とする、〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の抗癌剤、
〔7〕癌が、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、および腎癌からなる群から選択されるいずれかの癌である、〔3〕から〔6〕のいずれかに記載の抗癌剤、
〔8〕癌が、原発性の癌である〔7〕に記載の抗癌剤、
〔9〕癌が、転移性の癌である〔7〕に記載の抗癌剤、
〔10〕EREGタンパク質に結合し、かつEREGタンパク質を発現する細胞に対して細胞増殖阻害活性を有する抗体、
〔11〕細胞増殖阻害活性が細胞障害活性である〔10〕に記載の抗体、
〔12〕細胞障害活性がADCC活性である〔11〕に記載の抗体、
〔13〕細胞障害活性がCDC活性である〔11〕に記載の抗体、
〔14〕更に付加的にEREGタンパク質に対する中和活性を有することを特徴とする〔10〕から〔13〕のいずれかに記載の抗体、
〔15〕細胞増殖阻害活性が中和活性である〔10〕に記載の抗体、
〔16〕〔10〕に記載の抗体から作成される低分子化抗体、
〔17〕化学療法剤、または、毒性ペプチドを結合した〔10〕から〔16〕のいずれかに記載の抗体、
〔18〕EREGタンパク質に結合する抗体であって、化学療法剤、毒性ペプチド、および放射性同位元素からなる群から選択されたいずれかの細胞障害性物質が結合された抗体、
〔19〕以下(1)から(57)のいずれかに記載の抗体である、〔10〕から〔18〕のいずれかに記載の抗体;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列の117から452位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:49に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:57に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:59に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)CDR1として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:63に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(20)(19)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(21)(19)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(22)CDR1として配列番号:67に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:71に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(23)(22)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(24)(22)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(25)(19)に記載のH鎖、および(22)に記載のL鎖を含む抗体、
(26)(20)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体、
(27)(21)に記載のH鎖、および(24)に記載のL鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:73に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(31)CDR1として配列番号:79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(32)(31)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(33)(31)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(34)(28)に記載のH鎖、および(31)に記載のL鎖を含む抗体、
(35)(29)に記載のH鎖、および(32)に記載のL鎖を含む抗体、
(36)(30)に記載のH鎖、および(33)に記載のL鎖を含む抗体、
(37)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(38)(37)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(39)(37)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(40)CDR1として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:93に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(41)(40)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(42)(40)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(43)(37)に記載のH鎖、および(40)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(38)に記載のH鎖、および(41)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(39)に記載のH鎖、および(42)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)CDR1として配列番号:97に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:99に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(47)(46)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(48)(46)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(49)CDR1として配列番号:103に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:105に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(50)(49)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(51)(49)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(52)(46)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(53)(47)に記載のH鎖、および(50)に記載のL鎖を含む抗体、
(54)(48)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(55)(1)から(54)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(54)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(56)(1)から(55)のいずれかに記載の抗体が結合するEREGタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
(57)(1)から(56)のいずれかに記載の抗体の低分子化抗体。
〔20〕配列番号:21に記載のアミノ酸配列において、29番目のAlaから69番目のSer、又は63番目のValから108番目のLeuを認識することを特徴とする、〔10〕から〔20〕のいずれかに記載の抗体、
〔21〕癌診断マーカーとしてのEREGタンパク質およびEREGのmRNAのいずれか、または両方の使用、
〔22〕EREGタンパク質に結合する抗体をEREGタンパク質に結合させる工程を含む癌の診断方法、
〔23〕以下の工程:
(a) 被検者から試料を採取する工程;
(b) 採取された試料に含まれるEREGタンパク質を、EREGタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程
を含む癌の診断方法、
〔24〕(1)放射性同位元素で標識されたEREGタンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程、および(2)前記放射性同位元素の集積を検出する工程を含む癌の診断方法、
〔25〕放射性同位元素が、陽電子放出核種である〔22〕に記載の診断方法、
〔26〕陽電子放出核種が11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、および124Iからなる群から選択されるいずれかの核種である〔25〕に記載の診断方法、
〔27〕EREGタンパク質をコードする遺伝子の発現を検出することを特徴とする癌の診断方法、
〔28〕癌が、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、および腎癌からなる群から選択されるいずれかの癌である〔22〕から〔27〕のいずれかに記載の診断方法、
〔29〕癌が、原発性の癌である〔28〕に記載の診断方法、
〔30〕癌が、転移性の癌である〔28〕に記載の診断方法、
〔31〕EREGタンパク質に結合する抗体を含む、癌の診断方法に用いるための診断薬、
〔32〕EREGタンパク質に結合する抗体と、EREGタンパク質を含む生体試料を含む、癌の診断方法に用いるためのキット、
〔33〕次の工程を含む、癌の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法;
(1)EREG発現細胞に被験化合物を接触させる工程、
(2)EREG発現細胞におけるEREGの発現レベルを測定する工程、および
(3)対照と比較して、EREGの発現レベルを低下させる化合物を癌の治療剤の候補化合物として選択する工程、
〔34〕EREGの発現レベルが、培養上清中に分泌されるEREG蛋白質のレベルによって評価される〔33〕に記載の方法、および
〔35〕次の工程を含む、癌の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法;
(1)EREG依存的に増殖する細胞を、EREGと被験化合物の存在下で培養する工程、
(2)細胞増殖レベルを測定する工程、および
(3)対照と比較して細胞増殖を抑制した被験化合物を癌の治療剤の候補化合物として選択する工程。
本発明において、抗EREG抗体の、EREG発現細胞に対する細胞障害作用が確認された。EREGの発現レベルは、正常細胞で非常に低い一方、癌細胞では亢進している。このことは、抗EREG抗体の投与によって、たとえば生体内において、癌細胞特異的な細胞障害作用が得られることを裏付けている。
更に、本発明において、EREG依存性の細胞増殖が、抗EREG抗体によって中和されることが確認された。したがって、抗EREG抗体は、好ましい態様において、細胞障害作用に加えて、EREGの細胞増殖作用の中和を通じて、癌細胞の増殖抑制をもたらす。
EREGは、膜結合型上皮細胞成長因子蛋白質である。そのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれGenBank登録番号NP_001423(配列番号:22)及びNM_001432(配列番号:21)に開示されている。本発明において、EREGタンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、EREGタンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のEREGタンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例として、EREGタンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。EREGタンパク質の細胞外領域は配列番号:22のアミノ酸配列において29−122番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号:22のアミノ酸配列において123−140番目が相当する。
本発明においては、臨床検体および癌細胞株の解析から、原発性大腸癌、転移性大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、腎癌組織において、非常に高頻度でEREGが遺伝子レベルで発現していることが示された。また、癌細胞株においては更に蛋白質レベルでも高発現していることが示された。すなわち、EREGタンパク質は癌の診断マーカーとして有用である。
本発明による癌の診断方法は、EREG遺伝子発現を検出する工程を含む。本発明の方法の1つの態様においては、EREGタンパク質の発現を検出する。
本発明において検出とは、定量的または定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
単にEREGタンパク質が存在するか否かの測定
EREGタンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
EREGタンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
一方、定量的な検出とは、EREGタンパク質の濃度の測定、EREGタンパク質の量の測定などを挙げることができる。
(1)被検者から採取された生体試料中のEREG発現レベルを検出する工程、および
(2)(1)で検出されたEREGの発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有することが示される工程
得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法は、前記工程(2)において、(1)で検出されたEREGの発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたEREGの発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。
ラジオイムノアッセイ(RIA)、
エンザイムイムノアッセイ(EIA)、
蛍光イムノアッセイ(FIA)、
発光イムノアッセイ(LIA)、
免疫沈降法(IP)、
免疫比濁法(TIA)、
ウエスタンブロット(WB)、
免疫組織化学(IHC)法、
免疫拡散法(SRID)
不溶性の多糖類:アガロース、セルロースなど、
合成樹脂:シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂など
ガラスなどの不溶性の支持体
これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いられる。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート(96穴マルチウェルプレート等)やバイオセンサーチップなどが使用できる。抗EREG抗体と支持体との結合においては、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により抗EREG抗体が支持体に結合できる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。
抗EREG抗体は通常知られている方法により標識することができる。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることができる。具体的には、次のような標識物質が抗体の標識に利用されている。
蛍光色素:フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロンなど
酵素:ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなど
結合親和性物質:ビオチンなど
本発明のEREGタンパク質を検出する方法の他の態様として、EREGタンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
疎水性表面を有するラテックス粒子は、抗体と混合することによって、抗体を物理的に吸着する。あるいはラテックス粒子が官能基を有するときは、抗体を化学的に結合することもできる。抗体を結合した粒子を試料と混合させ、一定時間攪拌させる。試料中にEREGタンパク質が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、該凝集度を肉眼で見積もることによりEREGタンパク質が検出できる。また、凝集による濁度や散乱光の増加を分光光度計等により測定することによってもEREGタンパク質が検出できる。
単にEREGのmRNAが存在するか否かの測定、
EREGのmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
EREGのmRNAの量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
一方、定量的な検出とは、EREGのmRNAの濃度の測定、EREGのmRNAの量の測定などを挙げることができる。
mRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を本発明に利用することができる。
上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、一度に大量の試料を検査することができる。
本発明は、被検試料中のEREGタンパク質を検出するための試薬を含む癌の診断のための診断薬またはキットの提供をも目的とする。本発明の診断薬は、少なくとも抗EREG抗体を含む。本発明の診断薬またはキットがELISA法等のEIA法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含むことができる。あるいはあらかじめ担体に結合させた抗体を供給することもできる。本発明の診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含むことができる。
ここで「相補鎖」とは、A:T(ただしRNAの場合はU)、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpである。好ましいプライマーの長さは17bp〜30bpである。プライマーは、EREGをコードするDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうる任意のプライマーを利用することができる。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
本発明において、オリゴヌクレオチドは、適宜標識してプローブとすることができる。オリゴヌクレオチドを標識する方法は公知である。たとえば、32Pで標識したATPを基質として、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの5'端をリン酸化することにより標識することができる。あるいは、DNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして標識された基質塩基を取り込ませる方法(ランダムプライム法等)を例示することができる。ランダムプライム法には、クレノウ酵素等がDNAポリメラーゼとして利用される。また塩基は、32P等のラジオアイソトープ、蛍光色素、ビオチン、あるいはジゴキシン等によって標識することができる。
上記の診断薬やキットにおいては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤(BSAやゼラチンなど)、保存剤、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等が必要に応じて混合されていてもよい。
本発明で用いられる抗EREG抗体はEREGタンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類および形状は問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルな抗体として利用することができる。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。
本発明で使用される抗EREG抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗EREG抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
ヒトEREGのアミノ酸配列より化学合成によって取得されたペプチド
EREG遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによっても取得されたペプチド
EREGタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド
部分ペプチドとして用いるEREGの領域および大きさは限定されない。好ましい領域はEREGの細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列(配列番号:22のアミノ酸配列において29−122番目)から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノの数は、少なくとも3以上、たとえば、5以上、あるいは6以上であることが好ましい。より具体的には、8〜50、好ましくは10〜30残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる(あるいはできない)形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(以下HGPRT欠損と省略する)、あるいはチミジンキナーゼ欠損(以下TK欠損と省略する)などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性(以下HAT感受性と省略する)を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)
NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519)
MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415)
SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270)
FO(de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21)
S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148, 313-323)、
R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133)等
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウイルス(HVJ)等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を培養液に添加することができる。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている(例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.(1990)192, 767-775参照)。
グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)
AGPC法(Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をEREGに接触させる工程、
(2)EREGと抗体との結合を検出する工程、および
(3)EREGに結合する抗体を選択する工程
抗体とEREGとの結合を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定したEREGに対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に担体上の標識抗体が検出されたときには、当該被験抗体のEREGへの結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性蛋白質、あるいはFITC等の蛍光物質を利用することができる。抗体の結合活性を評価するためにEREGを発現する細胞の固定標本を利用することもできる。
本発明で使用される抗EREG抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗EREG抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
(1)哺乳類細胞、:CHO、COS、ミエローマ、BHK (baby hamster kidney )、Hela、Veroなど
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus )属、
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌(E. coli )、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
これらの細胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターを形質転換により導入する。形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、該形質転換細胞の培養物から所望の抗体を取得できる。
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体を言う。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体をを発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。
例えばH鎖においては、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、およびCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾することができる。
たとえば本発明に基づいて作成された抗EREGモノクローナル抗体B3#18の可変領域と、ヒト定常領域を構成するアミノ酸配列と連結することによって得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、本発明におけるモノクローナル抗体として好ましい。すなわち本発明は、次のアミノ酸配列を含むH鎖とL鎖とを含む、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体を提供する。
H鎖:配列番号:10に記載のアミノ酸配列中1〜446位のアミノ酸配列(シグナル配列:−19〜―1を除いた配列)
L鎖:配列番号:20に記載のアミノ酸配列中1〜213位のアミノ酸配列(シグナル配列:−20〜―1を除いた配列)
さらに、本発明のキメラ抗体の好ましい他の例として、以下の抗体を挙げることができる。
配列番号:129に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するH鎖、および配列番号:131に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するL鎖を含む抗体。
配列番号:133に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するH鎖、および配列番号:135に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するL鎖を含む抗体。
配列番号:137に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するH鎖、および配列番号:139に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するL鎖を含む抗体。
配列番号:141に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するH鎖、および配列番号:143に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するL鎖を含む抗体。
配列番号:145に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するH鎖、および配列番号:147に記載のアミノ酸配列においてシグナル配列(−19〜−1)を除いた配列を有するL鎖を含む抗体。
具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは4つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において遊離であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
パパイン消化:F(ab)2またはFab
ペプシン消化:F(ab’)2またはFab’
プラスミン消化:Facb
前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
前記抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:23)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:24)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:25)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:26)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:27)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:28)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:29)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:30)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:31))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:32))n
[nは1以上の整数である]
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば前記ペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常1〜5、好ましくは1〜3、より好ましくは1または2である。
[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]
あるいは、合成化学物リンカー(化学架橋剤)を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、
エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、
ジスクシンイミジル酒石酸塩(DST)、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩(スルホ−DST)、
ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、および
ビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)など
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列(B3#18抗体のH鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列(B3#18抗体のH鎖CDR2の配列)、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列(B3#18抗体のH鎖CDR3の配列)を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CH(H鎖定常領域)として配列番号:8に記載のアミノ酸配列の117から452位のアミノ酸配列(B3#18抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列(DF151マウス−ヒトキメラ抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列(B3#18抗体のL鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列(B3#18抗体のL鎖CDR2の配列)、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列(B3#18抗体のL鎖CDR3の配列)を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CL(L鎖定常領域)として配列番号:18に記載のアミノ酸配列の107から213(B3#18抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列(B3#18マウス−ヒトキメラ抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:49に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:57に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:59に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)CDR1として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:63に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(20)(19)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(21)(19)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(22)CDR1として配列番号:67に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:71に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(23)(22)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(24)(22)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(25)(19)に記載のH鎖、および(22)に記載のL鎖を含む抗体、
(26)(20)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体、
(27)(21)に記載のH鎖、および(24)に記載のL鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:73に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(31)CDR1として配列番号:79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(32)(31)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(33)(31)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(34)(28)に記載のH鎖、および(31)に記載のL鎖を含む抗体、
(35)(29)に記載のH鎖、および(32)に記載のL鎖を含む抗体、
(36)(30)に記載のH鎖、および(33)に記載のL鎖を含む抗体、
(37)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(38)(37)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(39)(37)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(40)CDR1として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:93に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(41)(40)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(42)(40)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(43)(37)に記載のH鎖、および(40)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(38)に記載のH鎖、および(41)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(39)に記載のH鎖、および(42)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)CDR1として配列番号:97に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:99に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(47)(46)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(48)(46)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(49)CDR1として配列番号:103に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:105に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(50)(49)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(51)(49)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(52)(46)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(53)(47)に記載のH鎖、および(50)に記載のL鎖を含む抗体、
(54)(48)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(55)(1)から(54)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(54)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(56)(1)から(55)のいずれかに記載の抗体が結合するEREGタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
(57)(1)から(56)のいずれかに記載の抗体の低分子化抗体。
CDR1:配列番号:2に記載のアミノ酸配列(B3#18(EP27)抗体のH鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:4に記載のアミノ酸配列(B3#18(EP27)抗体のH鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:6に記載のアミノ酸配列(B3#18(EP27)抗体のH鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:12に記載のアミノ酸配列(B3#18(EP27)抗体のL鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:14に記載のアミノ酸配列(B3#18(EP27)抗体のL鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:16に記載のアミノ酸配列(B3#18(EP27)抗体のL鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:49に記載のアミノ酸配列(C7(EP03)抗体のH鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:51に記載のアミノ酸配列(C7(EP03)抗体のH鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:53に記載のアミノ酸配列(C7(EP03)抗体のH鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:55に記載のアミノ酸配列(C7(EP03)抗体のL鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:57に記載のアミノ酸配列(C7(EP03)抗体のL鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:59に記載のアミノ酸配列(C7(EP03)抗体のL鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:61に記載のアミノ酸配列(#15(EP08)抗体のH鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:63に記載のアミノ酸配列(#15(EP08)抗体のH鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:65に記載のアミノ酸配列(#15(EP08)抗体のH鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:67に記載のアミノ酸配列(#15(EP08)抗体のL鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:69に記載のアミノ酸配列(#15(EP08)抗体のL鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:71に記載のアミノ酸配列(#15(EP08)抗体のL鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:73に記載のアミノ酸配列(B2#30(EP20)抗体のH鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:75に記載のアミノ酸配列(B2#30(EP20)抗体のH鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:77に記載のアミノ酸配列(B2#30(EP20)抗体のH鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:79に記載のアミノ酸配列(B2#30(EP20)抗体のL鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:81に記載のアミノ酸配列(B2#30(EP20)抗体のL鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:83に記載のアミノ酸配列(B2#30(EP20)抗体のL鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:85に記載のアミノ酸配列(B3#8(EP24)抗体のH鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:87に記載のアミノ酸配列(B3#8(EP24)抗体のH鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:89に記載のアミノ酸配列(B3#8(EP24)抗体のH鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:91に記載のアミノ酸配列(B3#8(EP24)抗体のL鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:93に記載のアミノ酸配列(B3#8(EP24)抗体のL鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:95に記載のアミノ酸配列(B3#8(EP24)抗体のL鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:97に記載のアミノ酸配列(B3#41(EP29)抗体のH鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:99に記載のアミノ酸配列(B3#41(EP29)抗体のH鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:101に記載のアミノ酸配列(B3#41(EP29)抗体のH鎖CDR3の配列)
CDR1:配列番号:103に記載のアミノ酸配列(B3#41(EP29)抗体のL鎖CDR1の配列)、
CDR2:配列番号:105に記載のアミノ酸配列(B3#41(EP29)抗体のL鎖CDR2の配列)、および
CDR3:配列番号:107に記載のアミノ酸配列(B3#41(EP29)抗体のL鎖CDR3の配列)
このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内)である。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)
被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
更に被験抗体が本発明の抗EREG抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウエルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウエルに結合した抗体を測定することができる。
また、上記(1)から(57)に記載の抗体には、上述の通り、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
azaribine、anastrozole、azacytidine、bleomycin、bortezomib、bryostatin-1、busulfan、camptothecin、10-hydroxycamptothecin、carmustine、celebrex、chlorambucil、cisplatin、irinotecan、carboplatin、cladribine、cyclophosphamide、cytarabine、dacarbazine、docetaxel、dactinomycin、daunomycin glucuronide、daunorubicin、dexamethasone、diethylstilbestrol、doxorubicin、doxorubicin glucuronide、epirubicin、ethinyl estradiol、estramustine、etoposide、etoposide glucuronide、floxuridine、fludarabine、flutamide、fluorouracil、fluoxymesterone、gemcitabine、hydroxyprogesterone caproate、hydroxyurea、idarubicin、ifosfamide、leucovorin、lomustine、mechlorethamine、medroxyprogesterone acetate、megestrol acetate、melphalan、mercaptopurine、methotrexate、mitoxantrone、mithramycin、mitomycin、mitotane、phenylbutyrate、prednisone、procarbazine、paclitaxel、pentostatin、semustine streptozocin、tamoxifen、taxanes、taxol、testosterone propionate、thalidomide、thioguanine、thiotepa, teniposide、topotecan、uracil mustard、vinblastine、vinorelbine、vincristine
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる2種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する1/2分子であっても良いし、H鎖のみからなる1/4分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
また、その他に、ウイルスプロモーター/エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α(HEF1α)などの哺乳類細胞由来のプロモーター/エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター/エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40(SV40)等を示すことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法(Nature(1989)341, 544-546 ; FASEBJ.(1992)6, 2422-2427)を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法(Science(1988)240, 1041-1043)により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、
チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
抗体の抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明で使用される抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞障害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である。
グリコシル化が修飾された抗体(WO99/54342など)、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO00/61739、WO02/31140など))、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO02/79255など)など
本発明における細胞障害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、補体依存性細胞障害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞(免疫細胞等)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
抗EREG抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる(例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等)。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
(3)標的細胞の調製
EREGタンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。EREGタンパク質を発現する細胞としては、EREGタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、原発性大腸癌、転移性大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、腎癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、膵癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
こうした細胞内のシグナルカスケードは細胞種毎に異なるため、目的とする標的細胞毎に適宜標的分子を設定することができ、上記の因子に限定されるものではない。生体内シグナルの活性化の測定キットは市販のものを適宜使用することができる(例えば、プロテインキナーゼC活性測定システム(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)等)。
より簡便な方法としてトリパンブルー等の色素を細胞外に排除する能力を顕微鏡下で計測する色素排除法や、MTT法が用いられる。後者は、生細胞がテトラゾリウム塩であるMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)を青色のホルマザン産物へ転換する能力を有することを利用している。より具体的には、被検細胞の培養液に被験抗体を添加して一定時間を経過した後に、MTT溶液を培養液に加えて一定時間静置することによりMTTを細胞に取り込ませる。その結果、黄色の化合物であるMTTが細胞内のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により青色の化合物に変換される。この青色生成物を溶解し呈色させた後にその吸光度を測定することにより生細胞数の指標とするものである。
MTT以外に、MTS、XTT、WST-1、WST-8等の試薬も市販されており(nacalai tesqueなど)好適に使用することができる。更に、細胞のATPや細胞培養物のインピーダンスを指標として細胞増殖活性を評価する方法も公知である。活性の測定に際しては、対照抗体として抗EREG抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で当該中和活性を有しない結合抗体を、抗EREG抗体と同様に使用して、抗EREG抗体が対照抗体よりも強い中和活性を示すことにより活性を判定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)等の塩基または塩基対からなる重合体である。本発明のポリヌクレオチドは、天然以外の塩基を含んでいてよい。
別の観点においては、本発明は、EREGタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明はEREGタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
本発明において、EREGタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤は、EREGタンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む細胞増殖を抑制する方法、または、細胞増殖抑制剤の製造におけるEREGタンパク質に結合する抗体の使用と表現することもできる。
本発明において、「EREGに結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗EREG抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗EREG抗体の含有率を制限するものではない。
本発明の医薬組成物(例えば、細胞増殖抑制剤、抗癌剤。以下同様。)に含有される抗体はEREGタンパク質と結合する限り特に制限はなく、本明細書中に記載された抗体が例示できる。
すなわち本発明は、次の態様を含む。
−EREGタンパク質を発現する細胞とEREGタンパク質に結合する抗体とを接触させる工程を含む該EREG発現細胞に細胞障害を引き起こす方法。
−EREGタンパク質を発現する細胞とEREGタンパク質に結合する抗体とを接触させる工程を含む該EREG発現細胞の増殖を抑制する方法。
−EREGタンパク質に結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、前記方法。
−EREGタンパク質に結合する抗体が中和活性を有する抗体である、前記方法。
−EREGタンパク質に結合する抗体が、以下(1)から(57)のいずれかに記載の抗体である、前記方法;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列の117から452位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:49に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:53に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:57に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:59に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)CDR1として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:63に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:65に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(20)(19)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(21)(19)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(22)CDR1として配列番号:67に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:69に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:71に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(23)(22)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(24)(22)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(25)(19)に記載のH鎖、および(22)に記載のL鎖を含む抗体、
(26)(20)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体、
(27)(21)に記載のH鎖、および(24)に記載のL鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:73に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(31)CDR1として配列番号:79に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(32)(31)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(33)(31)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(34)(28)に記載のH鎖、および(31)に記載のL鎖を含む抗体、
(35)(29)に記載のH鎖、および(32)に記載のL鎖を含む抗体、
(36)(30)に記載のH鎖、および(33)に記載のL鎖を含む抗体、
(37)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(38)(37)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(39)(37)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(40)CDR1として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:93に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(41)(40)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(42)(40)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(43)(37)に記載のH鎖、および(40)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(38)に記載のH鎖、および(41)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(39)に記載のH鎖、および(42)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)CDR1として配列番号:97に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:99に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(47)(46)に記載のH鎖であって、CHとしてマウスIgG1由来のCHを有するH鎖を含む抗体、
(48)(46)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列の117から446位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(49)CDR1として配列番号:103に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:105に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(50)(49)に記載のL鎖であって、CLとしてマウスκ鎖由来のCLを有するL鎖を含む抗体、
(51)(49)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列の107から213位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(52)(46)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(53)(47)に記載のH鎖、および(50)に記載のL鎖を含む抗体、
(54)(48)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(55)(1)から(54)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(54)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(56)(1)から(55)のいずれかに記載の抗体が結合するEREGタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
(57)(1)から(56)のいずれかに記載の抗体の低分子化抗体。
−EREGタンパク質を発現する細胞が癌細胞である、前記方法。
抗EREG抗体の接触によるEREG発現細胞の増殖に対する抑制効果を評価又は測定する方法としては、前記の中和活性測定法と同様の方法を好適に用いることができる。
また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、上記記載の生体内において細胞障害活性を評価又は測定する方法と同じ方法を好適に用いることができる。
本発明者らによって、細胞が分泌したEREGが、EREG依存的に増殖する細胞の細胞増殖を誘導していることが明らかにされた。またEREGが癌細胞において特異的に発現が亢進していることも確認された。したがって、EREG発現細胞におけるEREGの発現レベルを抑制することによって、癌の治療を実現できる。すなわち、本発明によって、癌細胞のEREGの発現レベルを抑制する化合物が、癌の治療剤の候補化合物として有用であることが示された。これらの知見に基づいて、本発明は、次の工程を含む、癌の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
(1)EREG発現細胞に被験化合物を接触させる工程、
(2)EREG発現細胞におけるEREGの発現レベルを測定する工程、および
(3)対照と比較して、EREGの発現レベルを低下させる化合物を癌の治療剤の候補化合物として選択する工程。
食道癌細胞株:TE2
胃癌細胞株 :GT3
:MKN45
:2M
:2MD3
大腸癌細胞株:CACO2
:DLD1
:hCT116
:LOVO
肝癌細胞株 :Alexander
膵癌細胞株 :Capan1
:Paca2
:PK-1
腎癌細胞株 :Caki1
:Caki2
肺癌細胞株 :A549
:H157
:H1648
:H2009
:H23
:H2347
:H522
(1)EREG依存的に増殖する細胞を、EREGと被験化合物の存在下で培養する工程、
(2)細胞増殖レベルを測定する工程、および
(3)対照と比較して細胞増殖を抑制した被験化合物を癌の治療剤の候補化合物として選択する工程。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例1.各癌種におけるヒトEREGの遺伝子発現解析
1-1. Gene chip を用いたヒトEREG遺伝子発現解析
大腸癌や膵癌といった癌組織で特異的に発現亢進する遺伝子を探索するため、GeneChip U133A(アフィメトリクス社製)を用いて、正常組織、癌組織及び癌細胞株の網羅的遺伝子発現解析が実施された。
はじめに、表1および表2に示す正常組織、癌組織及び癌細胞株からISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて常法により全RNAが調製された。そしてそれらの全RNAを各10 μgずつ用いて、GeneChip U-133A(アフィメトリクス社製)を用いた転写解析に供することにより遺伝子発現解析を行った。当該方法はExpression Analysis Technical Manual(アフィメトリクス社製)に準じて実施された。全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、癌組織あるいは癌細胞において発現が亢進する遺伝子の探索が行われた。
以上より、ヒトEREG遺伝子(プローブID:205767_at HG-U133A)は正常組織で発現量が非常に低いのに対し、原発性大腸癌、転移性大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、腎癌、大腸癌、膵癌、胃癌及び腎癌と広範な癌種で発現亢進していることが明らかとなった。
2-1. 全長ヒトEREG発現細胞の樹立
その配列が配列番号:21で示される全長ヒトEREG cDNA(NM_001432)は定法より単離され、その遺伝子断片が哺乳細胞発現用ベクター(pMCN)にクローニングされ、hEREG/pMCNと命名された。pMCNは、mouse CMVプロモータ(ACCESSION No. U68299)下で外来遺伝子を発現誘導させることが可能であり、かつ、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたベクターである。hEREG/pMCNが CHO細胞DG44株(Invitrogen社)へエレクトロポレーションにより導入され、500μg/mL Geneticin での選抜により、全長ヒトEREG定常発現CHO細胞が樹立されEREG_DGと命名された。
次に、抗EREG抗体作製のための免疫抗原として可溶型ヒトEREG/マウスIgG2a Fc融合蛋白質(以下、sEREG-mFc)が作製された。
発現ベクターpMCNにDHFR遺伝子を組み込んだpMCDNベクターに、ヒトEREG細胞外領域(7−122アミノ酸)とマウスIgG2a定常領域をヒンジ部位のCpoI認識配列で連結した、sEREG-mFcが構築され、sEREG-mFc/ pMCDNと命名された。配列番号:33で表される配列はsEREG-mFc遺伝子の塩基配列を、配列番号:34で表される配列はsEREG-mFcのアミノ酸配列を示す。sEREG-mFc / pMCDNはCHO細胞DG44株(Invitrogen社)へエレクトロポレーションにより導入され、500μg/mL Geneticin での選抜により、sEREG-mFc発現CHO細胞が樹立された。
次に培養上清よりsEREG-mFcの精製が実施された。培養上清がHi Trap ProteinG HP(Amersham社 CAT#17-0404-01)カラムにアプライされ、結合バッファー(20mM リン酸ナトリウム (pH7.0))にて洗浄後、溶出バッファー(0.1M グリシン-HCl (pH2.7))で目的とするsEREG-mFcが溶出された。溶出液は中和バッファー(1M Tris-HCl(pH9.0))を加えたチューブに回収し直ちに中和された。次に溶出されたsEREG-mFcは Superdex 200 HR 10/30(Amersham社)によるゲルろ過に供され、その溶液がPBSに置換された。精製蛋白の定量はDC protein assay (BIO-RAD社)を用いて実施され、添付のウシIgGをスタンダードとしてその含有タンパク質量が換算された。
Balb/cおよびMRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crljマウス(日本チャールス・リバー)が免疫動物として用いられた。5〜8週齢より免疫が開始され、初回免疫にはsEREG-mFcが100μg/headとなるように調製され、フロイント完全アジュバント(FCA、ベクトンディッキンソン社)を用いてエマルジョン化したものが皮下に投与された。2週間後に50μg/headとなるように調製されたsEREG-mFcがフロイント不完全アジュバント(FIA、ベクトンディッキンソン社)でエマルジョン化され、皮下に投与された。以降1週間間隔で追加免疫が2〜3回行われ、最終免疫として50μg/headとなるようにsEREG-mFcがPBSにより希釈され、尾静脈内に投与された。
更にHelios Gene Gunシステム(バイオラッド)を用いたDNA免疫法により、マウスを免疫してモノクローナル抗体を取得した。金-DNA(ヒトEREG全長発現ベクター)粒子のカートリッジチューブへのコーティングは、Helios Gene Gun操作マニュアルにしたがった。1.0μm金粒子50mgを測り取り、0.1ml の0.05Mスペルミジン溶液で懸濁して混和し、1mg/ml の0.1mlのプラスミド溶液を加えてvortexした。さらに、1M CaCl2を0.1ml加え、10分間放置し、軽く遠心後、上清を取り除き、エタノールで懸濁、遠心した。エタノール脱水の操作を3回繰り返したのち、最終的に6mlの0.05mg/ml polyvinylpyrollidone・エタノール溶液に懸濁した。この溶液をコート用チューブに吸い上げ、チューブをコート、乾燥させ、チューブカッターで0.5インチの長さに切断した。
4〜5週令に達したマウスMRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crljに、1〜3回/週の間隔でDNA免疫(〜200psiヘリウム圧)を行い、この間、断続的に血清中の抗EREG抗体価のモニターを行った。血清抗体価上昇が確認された個体に対し、EREG強制発現細胞株(5xE6 cells/head)を尾静脈内もしくは腹空内に投与した。2〜3日飼育後、脾臓を摘出し、抗体産生細胞を含む単核細胞を単離した。sEREG-mFc免疫の場合と同様の方法にて細胞融合およびクローン化をおこなった。
その結果、表3に示したクローンB2#30(IgG1, Kappa)、B3#18(IgG2b, Kappa)、そしてB3#41(IgG1, Kappa)等が成功裏に単離された。
前記に記載の方法により取得された抗体を用いて、EREG_DGに対する結合がフローサイトメトリーにより評価された。FACS Buffer (1% FBS/PBS)に1x105 cells/mLの密度で懸濁されたEREG_DGに対して適切な濃度に希釈した抗EREG抗体が添加され、氷上にて60分間反応させた。細胞はFACS Bufferにて1回洗浄された後に、FITC標識抗マウスIgG抗体が添加され、氷上にて30分間反応させた。反応後、遠心により上清が除かれた後に、細胞はFACS Buffer 150μLに懸濁され、フローサイトメトリーによる解析に供された。
図3に示すように、ハイブリドーマが産生する抗EREGモノクローナル抗体(B2#30、B3#18、そしてB3#41)はEREG_DGに強く結合し、親株であるDG44細胞には結合しなかった。これらの試験結果から、これらのモノクローナル抗体が細胞膜上に提示されたEREGに特異的に結合する事が判明した。
ヒトEREG遺伝子が発現亢進することは、これまで膀胱癌(Thogersen,Vら、Cancer Res. 61:6227-6233, 2001)、膵臓癌(Zhu. Z.,ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 273:1019-1024, 2000)、前立腺癌(Torring, N.,ら、Anticancer Res. 20:91-95, 2000)、大腸癌(Baba, I.,ら、Cancer Res. 60:6886-6889, 2000)等で報告されているが、ヒトEREG遺伝子の発現亢進とヒトEREGタンパク質の発現亢進とが相関することは、本発明において初めて示された。
3-1. 抗EREGモノクローナル抗体のCDC活性の測定
標的細胞としてはヒト大腸癌細胞株DLD1が用いられた。DLD1の培養には10% FBSを含むRPMI1640培地(GIBCO BRL社)が用いられた。DLD1細胞5×105個が遠心分離(1000 rpm、5分間、4℃)により回収され、細胞ペレットが約200 μLの培地および3.7 MBqのChromium-51 (Code No. CJS4、Amersham Pharmacia Biotech)に懸濁され、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて1時間培養された。前記細胞が培地で3回洗浄された後に、培地にて細胞密度が1 ×104/mLに調製され、96ウェル平底プレートに100 μLずつ添加された。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
式中、A:各ウェルにおける放射活性(cpm)、
B:100 μLの細胞に対して、2% NP-40溶液(Nonidet P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、そして
C:100 μLの細胞に対して、培地を100 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。測定はduplicateにて実施され、各ウェルから由来する上清の特異的クロム遊離率の平均値及び標準偏差が算出された。
ADCC活性の測定にはCDCの場合と同様にヒト大腸癌細胞株DLD1を用いて実施された。すなわち、細胞が96ウェル平底プレートにて培養し Chromium-51と反応させた後、10% FBSを含むRPMI1640培地(Invitrogen社)にて洗浄され、100 μLの培地が添加された。次に、抗EREGモノクローナル抗体(B2#30、B3#18及びB3#41)を培地にて希釈した後に当該プレートの各ウェルに50μLずつ添加された。抗体は終濃度1μg/mLで添加された。続いて、エフェクター細胞溶液(1×107個/mL)が各ウェルに50μLずつ添加され、当該プレートが5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間静置され、特異的クロム遊離率が決定された。Balb/cマウス(日本チャールス・リバー株式会社)の脾臓細胞を50 ng/mLリコンビナントヒトinterleukin-2 (Cat. No. 200-02, Peprotech)を含む培地で5日間培養したもの、もしくは同マウスの骨髄細胞を50 ng/mLリコンビナントヒトinterleukin-2、および10 ng/mLリコンビナントマウスGM-CSF (Cat. No. 315-03, Peprotech)を含む培地で6日間培養したものが、エフェクター細胞として使用された。
その結果、試験に用いられた全ての抗EREGモノクローナル抗体がDLD1に対してADCCを誘導することが明らかとなった(図6)。
4-1. EGFR-mG-CSFキメラレセプターを発現するBa/F3細胞株(EGFR_BAF)の樹立
常法により、その配列が配列番号:35(GeneBank Acc.No. NM_005228)で示されるヒトEGFレセプター(以下、「EGFR」と記載する。)が単離された後に、ヒトEGFレセプターとmG-CSFRとを融合させたキメラレセプターを発現できるベクターが作製された。即ち、ヒトEGFRの細胞外領域(Met7-Ser645)とマウスG-CSFR(NM_007782)の細胞内領域のキメラ受容体(hEGFR/mG-CSFR)を発現するベクター(pCV_ hEGFR/mG-CSFR)が作製された。当該キメラ受容体であるhEGFR/mG-CSFRの塩基配列を配列番号:39に、そのアミノ酸配列を配列番 号:40に示す。
4-1.に記載の方法により単離されたEGFR_BAFのヒトEREGの濃度に依存した細胞増殖を測定する試験が実施された。培養時のヒトEREGを除去するため細胞が洗浄され、再びRPMI1640+10% FBS培地に懸濁された後に、2×104 細胞/100 μL/wellの密度にて96穴プレートに播種された。ヒトEREG(R&Dシステムズ社)は、培地を用いて各濃度(7.8〜250 ng/ml)に希釈し調製後に細胞に添加され、その後、細胞が37 ℃、5 % CO2インキュベーター内で3日間培養が行われた。培養後、指示書に従い、Cell Count Reagent SF(ナカライテスク社)の測定試薬を加えて2時間発色を行い、反応液の吸光度(450/655 nm)がBenchmark Plus (Bio-Rad社)を用いて測定された。
また、同様に、ヒト膵癌細胞株AsPC1及びヒト大腸癌細胞株DLD1のヒトEREGに対する依存性増殖が前記と同様に測定された。培地としてCHO-S-SFMII(GIBCO社)が使用された。
樹立したEGFR_BAFを用いて、ヒトEREGに対する依存性増殖に対する抗EREGモノクローナル抗体の中和活性の測定が実施された。ヒトEREG (終濃度125 ng/mL)を含むRPMI1640+10% FBS培地にEGFR_BAFが懸濁され、1ウエル当たり2 x 104細胞の密度にて96穴プレートに播種された。抗EREGモノクローナル抗体が各濃度(0.008〜25 μg/ml)にて培地により希釈された後に細胞に添加され、その後、細胞は37 ℃、5 % CO2インキュベーター内で3日培養された。培養後、測定キットCell Count Reagent SF(ナカライテスク社)の測定試薬を加えて2時間発色を行い、反応液の450nmにおける吸光度を655 nmを参照波長としてBenchmark Plus(Bio-Rad社)により測定した。
また、標的細胞としてAsPC1を用いた抗EREGモノクローナル抗体の中和活性も前記と同じ方法によって実施され、抗体濃度は25, 2.5, 0.25 μg/mLの3条件で測定された。
それぞれの結果を図10と図11に示す。
以上により、B2#30及びB3#18は、EREG依存的な中和活性を有し、膵癌細胞株AsPC1の増殖を抑制することが明らかとなった。
今回単離した抗EREGモノクローナル抗体(B2#30及びB3#18)は、ADCC活性あるいはCDC活性による殺細胞効果と、ヒトEREG依存的な 細胞増殖抑制効果(中和活性)を併せ持ち、ヒトEREG遺伝子が発現亢進している癌細胞に対する新規メカニズムの抗体医薬品であることが、本研究にて証明された。
EREG依存的な中和活性を保持し、かつ、DLD1細胞株に対しADCC活性、及びCDC活性を示したB3#18(EP27)を産生するハイブリドーマより、抗体可変領域遺伝子の配列を決定した。当該抗体可変領域遺伝子は、抗EREG抗体B3#18産生ハイブリドーマより抽出したTotal RNAを用いて、RT-PCR法によって増幅された。Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社)を用いて1×107細胞のハイブリドーマより抽出された。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix(以上、CLONTECH社製)、
2.5μLの逆転写反応産物、および
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2bまたはkappa
更にPCR及び反応条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間/94℃にて5秒間/72℃にて3分間のサイクルを5回、
94℃にて5秒間/70℃にて10秒間/72℃にて3分間のサイクルを5回、さらに
94℃にて5秒間/68℃にて10秒間/72℃にて3分間のサイクルを25回
最後に反応産物は72℃で7分間加熱された。各PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製された後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングされ、その塩基配列が決定された。B3#18のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:43、アミノ酸 配列を配列番号:44、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:45、そしてアミノ酸配列を配列番号:46に示す。
C7(EP03)、#15(EP08)、B2#30(EP20)、B3#8(EP24)、B3#41(EP29)に関して同様な方法にて可変領域配列の決定を行った。重鎖可変領域の増幅には、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1(配列番号:47、5’-ccatggagttagtttgggcagcagatcc-3’)を用いた。決定された可変領域塩基配列を配列番号:108(EP03、重鎖)、110(EP03、軽鎖)、112(EP08、重鎖)、114(EP08、軽鎖)、116(EP20、重鎖)、118(EP20、軽鎖)、120(EP24、重鎖)、122(EP24、軽鎖)、124(EP29、重鎖)、126(EP29、軽鎖)に示した。また、可変領域翻訳配列を配列番号:109(EP03、重鎖)、111(EP03、軽鎖)、113(EP08、重鎖)、115(EP08、軽鎖)、117(EP20、重鎖)、119(EP20、軽鎖)、121(EP24、重鎖)、123(EP24、軽鎖)、125(EP29、重鎖)、127(EP29、軽鎖)に示した。それぞれ抗体の可変領域配列表番号、CDR1、CDR2、CDR3アミノ酸配列を表4にまとめた。
単離された抗体可変領域配列とヒトIgG1/IgK定常領域配列を持つ組換えキメラ抗体がEREGに対して結合性を保持することを以下の方法で確認した。それぞれの重鎖可変領域配列をPCR増幅し、ヒトキメラ抗体発現ベクター重鎖クローニングサイトに組み込んだ。つづいて軽鎖可変領域配列をPCR増幅し、上述の重鎖を組み込んだヒトキメラ抗体発現ベクターの軽鎖クローニングサイトに組み込んだ。構築した細胞発現ベクターにおいて重鎖、軽鎖ともに抗体遺伝子はマウスCMVプロモータ下で転写されるように設計されている。各ヒトキメラ抗体の塩基配列およびその翻訳配列の配列番号の対応を表5にまとめた。
[表5]
各ヒトキメラ抗体の配列番号
キメラ化抗体のヒトPBMCを用いたin vitro ADCC活性を図13に示した。1000単位/mLのヘパリン溶液(ノボ・ヘパリン注5千単位,ノボ・ノルディスク社)をあらかじめ200 μL注入した注射器を用い,健常人より末梢血50 mLを採取した。この末梢血をPBS(-)で2倍希釈した後,4等分し,15 mLのFicoll-Paque PLUS(GEヘルスケア社)をあらかじめ注入して遠心操作を行なったLeucosepリンパ球分離管(Cat. No. 227290,Greiner bio-one社)に加えた。これを遠心分離(2150 rpm,10分間,室温)した後,単核球画分層を分取した。10%FBSを含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(SIGMA社製)(以下10%FBS/D-MEM)で1回細胞を洗浄した後,10%FBS/D-MEMで細胞密度を5×106 /mLに調整し,ヒトPBMC溶液とした。
実施例3と同様の方法にて、DLD-1およびMIA-PaCa2細胞をChromium-51ラベルした。標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液を添加し、室温にて15分間反応させた後に、ヒトPBMC溶液(5x105細胞/ウェル)を加え、5%炭酸ガスインキュベーター中約4時間培養し、培養後の上清中の放射活性をガンマカウンターで測定、実施例3に記載した方法でクロム遊離率を算出した。すべてのキメラ化抗体でADCC誘導が認められ、キメラ化抗体EP20, EP27, EP08が特に強い活性を持っていた。各々の抗体のADCC誘導の強さに関して、膵臓癌細胞株MIA-PaCa2と大腸癌細胞株DLD-1で同様な傾向を示した。
単離した抗体のマウスEREGおよびサルEREGに対する交叉反応性を解析した。全長マウスEREG cDNA(NM_007950)およびサルEREG cDNA(XM_001102069)はcDNAライブラリを鋳型にPCR増幅し、クローニングした。単離された配列を、それぞれ、配列番号148および149に示した。実施例2に示した方法で、可溶型マウスEREG/マウスIgG2a Fc融合蛋白質 (以下マウスEREG-mFc)および可溶型サルEREG/マウスIgG2a Fc融合蛋白質 (以下サルEREG-mFc)が調製された。マウスEREG-mFcおよびサルEREG-mFcの配列を、それぞれ、配列番号150および151に示した。ヒトEREG-mFc、マウスEREG-mFc、サルEREG-mFcそれぞれをnuncイムノプレートにコートし、BSAを含む溶液でブロッキングした。その後、精製キメラ抗体の結合反応性を解析した。キメラ抗体を添加して一時間インキュベーション後、プレート洗浄、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒトIgG抗体(BIOSOURCE, AHI0305)を添加、反応させた。洗浄を行ったあと、検出試薬Sigma104を加えることによりキメラ抗体結合量を測定した(図14)。同一抗体濃度における各種EREGへの結合を、横軸[ヒトEREG-mFc] 対 縦軸[マウスEREG-mFc]、横軸[ヒトEREG-mFc] 対 縦軸[サルEREG-mFc]とプロットすることで、同一抗体濃度におけるEREGに対する抗体の結合飽和度の相違を展開表示した。横軸に沿うプロットは、ヒトEREGに対する結合選択性を示し、EP08はヒトEREGに結合するが、マウスEREGには結合しないことを表す。放物線状のプロットを示したEP27は、マウス分子に対しても結合するが、結合飽和に到達するにはより高濃度の抗体が必要であること、つまりヒトEREGに比べマウスEREGに対する結合アフィニティは弱いことを示す。対角線状のプロットを与える抗体は異なる種のEREGに対してヒトと同等のアフィニティを示すことを表している。ハイブリドーマ産生マウス抗体を用いて同様の解析を行った結果を(表3)にまとめた。反応しない(-)、非常に弱い反応性(+)、ヒトに比べやや弱い(++)、ヒト分子同等の反応性(+++)の4段階で表示した。
可溶型EREGは、低親和性EGFファミリーリガンドとして報告されている(参考文献:Shelly et al. (1998) J Biol Chem 273, 10496-505; Jones et al. (1999) FEBS Lett 447, 227-31)。EGFR_BaFを用いた作用比較から、EREGはEGFに比べてEGF受容体に対して100倍以下の低い活性(親和性)しか示さないことが確認された(図15)。生理的条件下でEREGは血中に多量に存在する因子ではない。また癌化に伴い、遺伝子レベルでの発現上昇が起こるとの報告はあるものの、癌患者で血中高濃度のEREG蛋白質を検出したという報告はない。可溶型としてではなく、むしろ細胞膜上に発現した膜型のEREGが近傍に存在するEGF受容体を刺激する局所的な活性化機構が存在するのではないかとの仮説のもと、以下の検証を行った。まず、EREG強制発現細胞とEGFR_BaFを共培養することで、可溶型EREGなしで、EGFR_BaFの増殖が促進されるかを確認した。EREG発現細胞EREG_DG、陰性対照となるDG44細胞を5x103/ウェルで96ウェルプレートにまき込み、FCS存在下で終夜培養した。翌日1x104のEGFR_BaF、陰性対照となるBa/F3細胞を添加し3日間を続けた。図16に示したようにEREGを発現しないDG44細胞と共培養してもEGFR_BaFの増殖は全く刺激されない一方で、EREG強制発現細胞EREG_DGとの共培養で顕著なEGFR_BaF増殖促進が観察された。EREG_DGによる増殖促進は、抗EREG抗体EP20(10μg/ml)の添加により抑制された。EGFR_BaF細胞増殖をWST-8試薬添加により定量化した(図17)。Ba/F3細胞をEREG_DG細胞と共培養しても増殖刺激はおこらないこと、EREG_DGとEGFR_BaFの共培養によって促進された細胞増殖は抗EREG抗体添加によりほぼ完全に抑制できることが示された。
EREGによるEGF受容体活性化が細胞間相互作用を通じて効率よく起こることを示す結果は、本発明が最初の発見であり、これを抗体で抑制できることもまた最初の発見である。
癌組織におけるEREG蛋白質発現、癌細胞膜上への局在を免疫組織染色で確認した。免疫組織染色は臨床癌組織より作製されたTissue Arrayを用いて行い、組織標本の作製は以下のように行った。術後摘出された組織を4%パラホルムアルデヒドで一夜固定後、0.01Mリン酸緩衝液で2時間洗浄し、AMeX法(参考文献:Sato et al. (1986) Am J Pathol 125, 431-5)によりパラフィン包埋した。このブロックから、直径1.5mmの癌組織を切り出し、約2.5 x 3.0 cmの新しいブロックに移植し、異なる組織を配列し、Tissue Arrayとした。Tissue Arrayを薄切して脱パラフィンした後、Ventana HX Discovery System (Ventana Medical Systems, Inc)を用いて免疫組織染色を行った。50μg/mlの抗EREGマウスモノクローナル抗体(EP27)を薄切した組織に添加して反応させた。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgG抗体を加え、その後DABで発色反応を行った。その結果、大腸癌原発部においてEREG蛋白質の発現、細胞膜へ局在性が認められた(図20)。一方、非癌部組織において同染色条件でEREG蛋白質は全く検出されてなかった。癌組織における蛋白質レベルでの発現検出、膜への局在性の確認は、本発明において初めて示された。
実施例8で多くの抗体の認識エピトープがEREGの成熟型EGFドメイン内にあることを明らかにした。さらに詳細に、同一抗原分子に対して結合競合を起こさない、エピトープの異なる抗体の組み合わせをサンドイッチELISA法で解析した。マウス抗EREG抗体を1μg/mlに希釈しnuncイムノプレートへと固層化した。ブロッキングを行った後、50μg/mlの成熟型EGFドメイン構造の可溶型ヒトEREG断片(配列番号:21の63Valから108Leu)もしくは100μg/mlヒトEREG-mFc(配列番号:34)を100μl/ウェル添加し、マウス抗体に抗原分子を捕捉させた。洗浄後、抗EREGキメラ抗体を添加(抗体濃度: 1, 0.33, 0.11, 0.037μg/ml)し、キメラ抗体の捕捉抗原分子への結合反応性をアルカリホスファターゼ標識抗ヒトIgG抗体およびSigma104発色で検出した。得られたデータ(図21−1〜図21−3)を統計解析ソフトウェアR(URL http://www.R-project.org.)を用いてクラスタリング解析し、デンドログラムを図22に示した。図22で横軸の分岐点までの距離が遠いほどサンドイッチELISA系での反応パターンが違うこと、抗原認識様式が異なることを示す。EP20は、EP27等多くの抗体とサンドイッチ可能であり、特徴的なエピトープを有することがわかる。図22のEP29からEP25までのクラスターに属する抗体は、別抗体との同時結合をほとんど許容せず、これら抗体により抗原分子が深く捕捉されている様子が推測される。
また、本願発明に係る細胞障害活性を有する抗EREG抗体は、EREGタンパク質を発現する癌の治療あるいは予防に有用である。具体的には、本発明に基 づいて、大腸癌、肺腺癌、膵癌、胃癌、腎癌などの各種の癌細胞の細胞障害剤あるいは細胞増殖抑制剤が提供される。本発明による癌細胞の細胞障害剤あるいは細胞増殖抑制剤は、原発性、および転移性のいずれの癌に対しても適用することができる。
加えて、本願発明に係る抗体をコードする遺伝子及び当該遺伝子により形質転換された組換え細胞は上記記載の効果、あるいはより好適な効果を奏する組換え抗体を作製するために使用することができる。
更に、本発明の知見に基づいて、癌の治療薬として有用な候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明によって、癌のEREG依存性の増殖が明ら かにされた。したがって、本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物は、癌のEREG依存的な増殖を抑制する化合物といえる。本発明によって選 択された化合物は、安全性や癌に対する特異性の評価を通じて、抗癌剤としての有用性を明らかにするための候補化合物として有用である。
Claims (3)
- EREGタンパク質に結合し、抗体依存性細胞障害活性または補体依存性細胞障害活性を有する抗体を有効成分として含有する抗癌剤であって、当該癌は大腸癌であり、
当該抗体は、配列番号:21に記載のアミノ酸配列において、29番目のAlaから69番目のSer、又は63番目のValから108番目のLeuのうち、63番目のValから108番目のLeuのみを認識することを特徴とする、抗癌剤。 - 癌が、原発性の癌である請求項1に記載の抗癌剤。
- 癌が、転移性の癌である請求項1に記載の抗癌剤。
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