KR20090079214A

KR20090079214A - 항 ｅｒｅｇ 항체를 이용하는 암의 진단 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20090079214A
Application number: KR1020097008620A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 아부라타니; 히로타카 이토; 켄지 요시다
Original assignee: 가부시키가이샤 미라이 소오야쿠 켄큐죠; 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2007-10-12
Publication date: 2009-07-21
Also published as: NZ576855A; AU2007312367B2; RU2537245C2; US20090324491A1; BRPI0719202A2; CA2665528C; CN103396486A; EP2070548B1; CN101594883B; RU2014141151A3; IL197914A0; CN101594883A; CA2665528A1; IL197914A; JP5687822B2; WO2008047723A1; JP5992480B2; IL225386A0; MY162056A; RU2009117669A

Abstract

암 진단용 에피레귤린(EREG) 단백질의 검출을 수반하는 방법이 기재되었다. 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암에서, EREG의 유전자 및 단백질 발현이 증가되는 것이 자주 발견되었다. EREG 단백질을 인식하는 항체는 본 발명에서 암을 진단 또는 치료하기 위해 사용되었다. 또한, EREG에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 세포 증식 억제제 및 항암제도 포함되었다. 또한, EREG를 발현하는 세포에서 세포 손상을 유도하는 방법 및 EREG 결합 항체를 EREG를 발현하는 세포를 접촉함으로써 EREG를 발현하는 세포의 증식을 억제하는 방법도 제공된다.

Description

항 ＥＲＥＧ 항체를 이용하는 암의 진단 및 치료 방법{DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER USING ANTI-EREG ANTIBODY}

본 발명은 암의 진단 및 치료 방법 및 세포 증식 억제제 및 항암제에 관한 것이다.

토요타 등이 정제한 상피세포성장인자(epidermal growth factor, 이하, EGF) 패밀리의 구성요소를 에피레귤린(Epiregulin: EREG)으로 명명하였다. EREG는 HeLa 세포의 형태 변화를 유도하는 암증식 저해 인자로서 역할을 하는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 1). 토요타 등에 의해 정제된 마우스 유래의 EREG(성숙 단백질)의 아미노산 서열은 46개의 아미노산 잔기로 구성되고, EGF 패밀리의 다른 구성요소의 서열과 대략 24% 내지 50% 정도의 동일성을 나타낸다. 또한 마우스 EREG는 인간 상피암 세포주 A431 세포 상의 EGF 수용체에 대해서 낮은 친화성을 나타냈다. 토요타 등에 의한 인간 EREG 유전자의 클로닝과 발현 분석 결과, 여러 인간 조직에서 다른 EGF 패밀리 구성요소들이 동시에 발현하는 데 비해, EREG의 발현은 대식세포, 태반 및 각종의 암 세포에서 검출 가능한 것을 나타내었다(비특허 문헌 2). 또한, 수용성 EREG는 몇 개의 유형의 암 세포에 대해서 증식 억제 효과가 있는 것으로 나타났다(국제공개특허 제94/29340호).

타카하시 등은, 래트의 분화형 동맥 혈관평활근 세포(vascular smooth muscle cell, 이하, VSMC)에서 Erk(MPK3) 및 p38(MAPK14)의 활성화가 세포의 탈분화를 유도하는 것을 나타냈다. 또한, VSMC에서 분비되는 EREG가 자가분비성(autocrine) 및/또는 주변분비성(paracrine) 분화 인자로서 작용하는 것을 증명했다. 또한, VSMC의 분화 인자로서 작용할 가능성이 있는 불포화 리소포스파티딘산 및 PDGFB 동형이량체는 Erk- 및 p38 Mapk-의존형으로 EREG mRNA 발현을 급속히 상향조절했다. 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction: 이하, RT-PCR) 분석 및 조직 면역화학(immunohistochemical 또는 immunohistochemistry: 이하, IHC) 분석은 죽상 동맥경화증 혈관이나 풍선 손상(balloon-injured) 래트 동맥에서 국소적인 EREG의 발현을 나타낸다. 이러한 결과로부터, 타카하시들은 EREG가 죽상 동맥경화증과 같은 혈관 재구축의 진행에 관여하고 있다고 추측하고 있다(비특허 문헌 3).

Minn등은 in vivo 선별, 전사체 분석, 기능 분석 및 임상 연구에 근거하여, 유방암의 폐전이에 관련하는 몇 개의 유전자군을 분류했고, 상기 유전자 중의 하나의 분자가 EREG일 것을 밝혔다(비특허 문헌 4).

또한, Shirasawa등은 EREG가 케라티노사이트 뿐만 아니라 조직중 대식세포에서도 발현하고, EREG 녹아웃 마우스가 만성 피부염의 증상을 초래할 것을 밝혔다. 상기 마우스의 분석 실험을 통해서, EREG가 외부 환경과의 경계에서 케라티노사이 트 및 대식세포에 의한 면역 및 염증 관련 반응에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타났다(비특허 문헌 5).

상기 설명한 바와 같이, 피부염, 암의 전이, 죽상 동맥경화증과 EREG와의 관련성이 지시되었다. 그러나 EREG 발현 암세포에 결합하여 중화 활성 및 세포독성 활성을 가지는 EREG-결합 항체의 영향에 대해서는 지금까지 구체적인 기재는 이루어지지 않았었다.

[비특허 문헌 1] J. Biol. Chem. 270: 7495-7500, 1995

[비특허 문헌 2] Biochem. J. 326: 69-75, 1997

[비특허 문헌 3] Circulation 108: 2524-2529, 2003

[비특허 문헌 4] Nature 436: 518-524, 2005

[비특허 문헌 5] Proc. Nat. Acad. Sci. 101: 13921-13926, 2004

[발명이 해결하려고 하는 과제]

본 발명의 목적은 항 EREG 항체와 그 용도를 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는, 항 EREG 항체를 이용해 암을 진단 및 치료하는 신규 방법, 항 EREG 항체를 포함하는 신규 세포 증식 억제제 및 항암제 및 신규 항 EREG 항체를 제공하는 것이다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명자들은 EREG가 대장암 등의 암 세포에서 고발현한 것을 발견하였다. 또한, 항 EREG 항체의 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성 및 항체 의존성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성을 측정했는데, 항 EREG 항체는 EREG 발현 세포에서 CDC 활성 및 ADCC 활성을 가지는 것을 찾아냈다. 또한, 항 EREG 항체가 암 세포주에 대해 중화 작용에 의한 증식 억제 효과를 갖는 것을 밝혔다. 또한 상기 발견에 의해, 본 발명자들은 항 EREG 항체가 다양한 유형의 원발성 및 전이성 암의 진단, 예방 및 치료에 유효한 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 보다 구체적으로는, 본 발명자들은 EREG가 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암을 포함하는 EREG 발현이 증가한 암을 치료 또는 진단하기 위한 툴로서 유용한 것을 발견함으로써 본 발명을 완성했다.

본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포 증식 억제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다. 바람직하게는, EREG 단백질에 결합하는 항체는 세포독성 활성을 가지는 항체이다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 중화 활성도 가진다. 본 발명의 바람직한 구체화에 대해, 치료의 대상으로 할 수 있는 암은 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암이다. 본 발명의 항 EREG 항체를 포함한 항암제는 원발성 또는 전이성 암 및 EREG의 발현이 증가한 암의 치료에 유용하다. 본 발명에서, 특히 바람직한 치료의 대상은 원발성 대장암, 전이성 대장암 및 췌장암이다.

또한, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 EREG의 발현이 증가한 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 즉, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방용 약학적 조성물의 제조에 있어서 EREG 단백질에 결합하는 항체의 용도에 관한 것이다.

다른 구체화에서, 본 발명은 EREG 발현 세포와 EREG 단백질에 결합하는 항체를 접촉시킴으로써, EREG 단백질을 발현하는 세포에서 세포 장애를 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 EREG 단백질을 발현하는 세포와 EREG 단백질에 결합하는 항체를 접촉시킴으로써 EREG 단백질을 발현하는 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, EREG 단백질에 결합하는 항체는 세포독성 활성을 가지는 항체이다. 바람직하게는, EREG 단백질을 발현하는 세포는 암 세포이다.

더욱 다른 구체화에서, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하고, EREG 단백질을 발현하는 세포에 대해서 세포독성 활성을 가지는 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포독성 활성은 ADCC 활성이다. 바람직하게는, 상기 세포독성 활성은 CDC 활성이다. 또한, 본 발명은 세포독성 물질이 결합한 항체를 제공한다. 본 발명에서, 항체에 결합되는 세포독성 물질로는 화학요법제, 방사성 동위 원소 및 독성 펩티드를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 항체 자신이 세포독성 활성을 가지는 항체일 수 있다.

추가로, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하고, EREG 단백질을 발현하는 세포에 대해서 세포독성 활성 및 중화 활성을 가지는 항체를 제공한다.

다른 구체화에서, 본 발명은 암진단 마커로서의 EREG 단백질의 용도를 제공한다.

더욱 다른 구체화에서, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체를 이용해 EREG 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 바람직하게는 EREG 단백질의 세포외 영역이 검출된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 EREG 단백질을 인식하는 항체를 이용하여 수행된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 혈액, 혈중, 또는 혈장 중의 EREG 단백질, 또는 세포로부터 분리한 EREG 단백질이 검출된다.

다른 구체화에서, 본 발명은

(a) 피검사체로부터 시료를 채취하는 단계; 및,

(b) EREG 단백질에 결합하는 항체를 이용하여 채취된 시료에 포함된 EREG 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 시료는 피검사체로부터 채취할 수 있는 것이면 무엇이든 사용할 수 있다. 하나의 구체화에서, 피검사체로부터 채취한 혈액 시료가 사용된다. 본 발명에 있어서 바람직한 혈액 시료는 혈청이다. 다른 구체화에서, 피검사체로부터 외과적으로 또는 생검에 의해 채취된 시료가 사용될 수 있다. 상기 진단 방법과 관련되는 암은 대상으로 하는 암 세포가 EREG 단백질을 발현하는 암이면 어느 암도 사용될 수 있다. 본 발명에서, 바람직한 암은 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암이다. 본 발명에 근거해, 이러한 암의 원발성 병소 및 전이성 병소도 진단될 수 있다. 특히 바람직한 암은 원발성 대장암, 전이성 대장암 및 췌장암이다.

본 발명에서, 피검자로부터 시료를 채취하는 단계는 피검자로부터 채취된 시료를 제공하는 단계라고 할 수 있다.

추가의 다른 구체화에서, 본 발명은 (1) 방사성 동위 원소로 표지 된, EREG 단백질에 결합하는 항체를 피검사체에게 투여하는 단계; 및 (2) 상기 방사성 동위 원소의 축적을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다. 어느 구체화에서, 방사성 동위 원소는 양전자 방출 핵종이다. 본 발명에서, 바람직한 양전자 방출 핵종은 예를 들면 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ⁴⁵Ti, ⁵⁵Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁶Br, ⁸⁹Zr 및 ¹²⁴I로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 구체화에서, 본 발명은 EREG 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법을 제공한다.

추가의 다른 구체화에서, 본 발명은 본 발명의 진단 방법에 이용하기 위한 진단제나 키트를 제공한다.

추가로, 본 발명은 암 치료제로서 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에서는 예를 들어, EREG의 발현 레벨을 지표로서 암 치료제의 후보 화합물을 선택할 수 있다. 또는, EREG의 세포 증식 자극 작용에 대한 중화 작용을 지표로서 암 치료제 후보 화합물을 선택할 수도 있다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 제공한다.

[1] EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물;

[2] EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포 증식 억제제;

[3] EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 항암제;

[4] EREG 단백질에 결합하는 항체가 세포 증식 저해 활성을 가지는 항체인 것을 특징으로 하는 [3]에 기재된 항암제;

[5] EREG 단백질에 결합하는 항체가 이하 (1) 내지 (57) 중 어느 하나의 항체인 것을 특징으로 하는 [3] 또는 [4]에 기재된 항암제;

(1) CDR1로서 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 항체;

(2) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 452번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(3) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(4) CDR1로서 서열번호 12로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 16으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(5) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 18로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(6) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(7) (1)의 H 사슬 및 (4)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(8) (2)의 H 사슬 및 (5)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(9) (3)의 H 사슬 및 (6)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(10) CDR1로서 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 51로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 53으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(11) (10)에 있어서, CH로서 서열번호 149로 기재된 아미노산 서열의 118 내지 441번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(12) (10)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(13) CDR1로서 서열번호 55로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 57로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 59로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(14) (13)에 있어서, CL로서 서열번호 151로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(15) (13)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(16) (10)의 H 사슬 및 (13)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(17) (11)의 H 사슬 및 (14)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(18) (12)의 H 사슬 및 (15)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(19) CDR1로서 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(20) (19)에 있어서, CH로서 서열번호 153으로 기재된 아미노산 서열의 116 내지 439번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(21) (19)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(22) CDR1로서 서열번호 67로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 71로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(23) (22)에 있어서, CL로서 서열번호 155로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(24) (22)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(25) (19)의 H 사슬 및 (22)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(26) (20)의 H 사슬 및 (23)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(27) (21)의 H 사슬 및 (24)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(28) CDR1로서 서열번호 73으로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 75로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 77로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(29) (28)에 있어서, CH로서 서열번호 157로 기재된 아미노산 서열의 119 내지 442번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(30) (28)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(31) CDR1로서 서열번호 79로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 81로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 83으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(32) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 159로 기재된 아미노산 서열의 109 내지 215번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(33) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(34) (28)의 H 사슬 및 (31)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(35) (29)의 H 사슬 및 (32)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(36) (30)의 H 사슬 및 (33)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(37) CDR1로서 서열번호 85로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 87로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 89로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(38) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 161로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 440번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(39) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(40) CDR1로서 서열번호 91로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 93으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 95로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(41) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 163으로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(42) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(43) (37)의 H 사슬 및 (40)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(44) (38)의 H 사슬 및 (41)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(45) (39)의 H 사슬 및 (42)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(46) CDR1로서 서열번호 97로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 99로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 101로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(47) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 165로 기재된 아미노산 서열의 113 내지 436번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(48) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(49) CDR1로서 서열번호 103으로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 105 에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 107로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(50) (49)에 있어서, CL로서 서열번호 167로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(51) (49)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(52) (46)의 H 사슬 및 (49)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(53) (47)의 H 사슬 및 (50)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(54) (48)의 H 사슬 및 (51)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(55) (1) 내지 (54) 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체를 포함하는, (1) 내지 (54) 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체;

(56) (1) 내지 (55) 중 어느 하나의 항체로서, 동일한 EREG 단백질의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체;

(57) (1) 내지 (56) 중 어느 하나의 항체의 저분자화 항체;

[6] [3] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, EREG 단백질에 결합하는 항체가 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열에서 29번째의 Ala로부터 69번째의 Ser까지, 또는 63번째의 Val로부터 108번째의 Leu까지를 인식하는 것을 특징으로 하는 항암제,

[7] [3] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제;

[8] [7]에 있어서, 상기 암은 원발성인 것을 특징으로 하는 항암제;

[9] [7]에 있어서, 상기 암은 전이성인 것을 특징으로 하는 항암제;

[10] EREG 단백질에 결합하고, EREG 단백질을 발현하는 세포에 대해서 세포 증식 저해 활성을 가지는 항체;

[11] [10]에 있어서, 상기 세포 증식 저해 활성이 세포독성 활성인 것을 특징으로 하는 항체;

[12] [11]에 있어서, 상기 세포독성 활성은 ADCC 활성인 것을 특징으로 하는 항체;

[13] [11]에 있어서, 세포독성 활성이 CDC 활성인 것을 특징으로 하는 항체;

[14] [10] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, EREG 단백질에 대한 중화 활성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 항체;

[15] [10]에 있어서, 상기 세포 증식 저해 활성이 중화 활성인 것을 특징으로 하는 항체;

[16] [10]의 항체로부터 제조되는 저분자화 항체;

[17] [10] 내지 [16] 중 어느 하나에 있어서, 화학요법제 또는 독성 펩티드가 상기 항체에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체;

[18] 화학요법제, 독성 펩티드 및 방사성 동위 원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성 물질이 결합된 것을 특징으로 하는, EREG 단백질에 결합하는 항체;

[19] [10] 내지 [18] 중 어느 하나에 있어서, 하기 (1) 내지 (57)의 항체인 것을 특징으로 하는 항체:

(1) CDR1로서 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(4) CDR1로서 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(19) CDR1로서 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열을 유H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(33) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107에서 213위의 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(57) (1) 내지 (56) 중 어느 하나의 항체의 저분자화 항체;

[20] [10] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열에서 29번째의 Ala로부터 69번째의 Ser까지, 또는 63번째의 Val로부터 108번째의 Leu까지를 인식하는 것을 특징으로 하는 항체,

[21] 암진단 마커로서 EREG 단백질 또는 EREG mRNA의 용도;

[22] EREG 단백질에 결합하는 항체를 EREG 단백질에 결합시키는 단계를 포함하는 암 진단 방법;

[23] (a) 피검사체로부터 시료를 채취하는 단계; 및,

(b) EREG 단백질에 결합하는 항체를 이용하여 채취된 시료에 포함된 EREG 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법;

[24] (1) 방사성 동위 원소로 표지 된, EREG 단백질에 결합하는 항체를 피검사체에게 투여하는 단계; 및 (2) 상기 방사성 동위 원소의 축적을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법;

[25] [22]에 있어서, 방사성 동위 원소는 양전자 방출 핵종인 것을 특징으로 하는 진단 방법;

[26] [25]에 있어서, 양전자 방출 핵종은 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ⁴⁵Ti, ⁵⁵Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁶Br, ⁸⁹Zr 및 ¹²⁴I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법;

[27] EREG 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법;

[28] [22] 내지 [27] 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법;

[29] [28]에 있어서, 상기 암은 원발성인 것을 특징으로 하는 진단 방법;

[30] [28]에 있어서, 상기 암은 전이성인 것을 특징으로 하는 진단 방법;

[31] EREG 단백질에 결합하는 항체를 포함하는, 암 진단 방법으로 이용하기 위한 진단제;

[32] EREG 단백질에 결합하는 항체와 EREG 단백질을 포함하는 생체 시료를 포함하는 암 진단 방법으로 이용하기 위한 키트;

[33] (1) EREG 발현 세포에 피검화합물을 접촉시키는 단계;

(2) EREG 발현 세포에서의 EREG의 발현 레벨을 측정하는 단계; 및,

(3) 대조군과 비교하여 EREG의 발현 레벨을 저하시키는 화합물을 후보 암 치료제로서 선택하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 후보 화합물의 스크리닝 방법;

[34] [33]에 있어서, EREG의 발현 레벨은 배양 상등액 중에 분비되는 EREG 단백질의 레벨에 의해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법;

[35] (1) EREG와 피검화합물의 존재하에서 EREG 의존적으로 증식하는 세포를 배양하는 단계;

(2) 세포 증식 레벨을 측정하는 단계; 및,

(3) 대조군과 비교하여 세포 증식을 억제한 피검화합물을 후보 암 치료제로서 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료제 후보 화합물의 스크리닝 방법.

[발명의 효과]

다양한 암조직 또는 암 세포주의 유전자 발현 분석에 근거하여, 암세포에서 EREG 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것이 확인되었다. 한편, 정상세포에 있어서의 EREG의 발현 레벨은 매우 낮았다. 따라서, EREG는 암을 특이적으로 검출하기 위한 마커로서 유용하다.

본 발명에 있어서, 항 EREG 항체의 EREG 발현 세포에 대한 세포독성 효과가 확인되었다. EREG의 발현 레벨은 정상세포에서는 매우 낮았지만, 암 세포에서는 증가되었다. 이것은 예를 들어 항 EREG 항체의 투여에 의해, 생체내에서 암 세포 특이적인 세포독성 작용을 얻을 수 있는 것을 증명한다.

추가로, 본 발명에서 EREG 의존성 세포 증식이 항 EREG 항체에 의해 중화되는 것이 확인되었다. 따라서, 바람직한 구체화에서 항 EREG 항체는 세포독성 작용에 추가로 EREG의 세포 증식 작용의 중화를 통해서, 암 세포의 증식을 억제한다.

도 1은 정상 조직 및 암조직에서 EREG mRNA의 전사량을 나타낸다. 세로축은 프로브 ID: 205767_at HG-U133A의 신호 강도(GeneChip U133A의 모든 유전자의 발현 점수의 평균을 100으로 하는 상대치)를 나타낸다.

도 2는 암 세포주에서 EREG mRNA의 전사량을 나타낸다. 세로축은 프로브 ID: 205767_at HG-U133A의 신호 강도(GeneChip U133A의 모든 유전자의 발현 점수의 평균을 100으로 하는 상대치)를 나타낸다.

도 3은 유세포 분석기를 이용해 항 EREG 단일클론 항체의 EREG-DG세포에 대 한 결합 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 세로축은 세포수(형광 계수치), 가로축은 형광 강도치를 나타낸다.

도 4는 유세포 분석기를 이용해 항 EREG 단일클론 항체의 대장암 세포주 DLD1에 대한 결합 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 세로축은 세포수(형광 계수치), 가로축은 형광 강도치를 나타낸다.

도 5는 대장암 세포주 DLD1에 대한 항 EREG 단일클론 항체의 CDC 활성을 나타낸다. 세로축은 크롬 방출율(%), 가로축은 항체의 종류를 나타낸다.

도 6은 항 EREG 단일클론 항체의 대장암 세포주 DLD1에 대한 ADCC 활성을 나타낸다. 세로축은 크롬 방출율(%), 가로축은 항체의 종류를 나타낸다.

도 7은 인간 EREG에 대한 EGFR-BAF 세포의 증식 의존성을 나타낸다. 세로축은 450 ㎚(배경 파장 655 ㎚)에서 흡광도, 가로축은 EREG의 농도(ng/㎖)를 나타낸다.

도 8은 인간 EREG에 대한 AsPC1 췌장암 세포의 증식 의존성을 나타낸다. 세로축은 450 ㎚(배경 파장 655 ㎚)에서 흡광도, 가로축은 EREG의 농도(ng/㎖)를 나타낸다.

도 9는 인간 EREG에 대한 DLD1 대장암 세포의 증식 의존성을 나타낸다. 세로축은 450 ㎚(배경 파장 655 ㎚)에서 흡광도, 가로축은 EREG의 농도(ng/㎖)를 나타낸다.

도 10은 EGFR-BAF 세포에서 항-인간 EREG 단일클론 항체의 중화 활성을 나타낸다. 세로축은 세포 증식율(각 항체 농도에서 흡광도/대조군의 흡광도 × 100%) 및 가로축은 항체의 농도(㎍/㎖)를 나타낸다.

도 11은 AsPC1 췌장암 세포주에서 항-인간 EREG 단일클론 항체의 중화 활성을 나타낸다. 세로축은 세포 증식율(각 항체 농도에서 흡광도/대조군의 흡광도 × 100%) 및 가로축은 항체의 농도(㎍/㎖)를 나타낸다.

도 12는 EREG에 대한 다양한 영역의 서열을 확인함으로써 재구성되는 키메라 항체의 결합을 나타낸다.

도 13은 암세포주에 대한 키마레 항체의 ADCC-유도 활성을 나타낸다.

도 14는 EREG 종 교차성에 대한 키메라 항체의 결합을 나타낸다.

도 15는 재조합 수용성 EREG 및 EGF에 의한 EGFR 수용체의 활성을 비교한 결과는 나타낸다.

도 16은 강제로 EREG를 발현하는 세포의 공동배양에 의한 EGF 수용체의 활성화를 나타낸다. 상기 활성을 항 EREG 항체에 의해 억제되었다.

도 17은 강제로 EREG를 발현하는 세포의 공동배양에 의한 EGF 수용체의 활성 및 항 EREG 항체에 의한 상기 활성의 억제를 나타낸다.

도 18은 DLD-1 세포의 공동배양에 의한 EGFR 수용체의 활성 및 항 EREG 항체의 추가에 의한 상기 활성화의 억제를 나타낸다.

도 19는 항 EREG 항체를 이용해 샌드위치 ELISA에 의한 수용성 EREG 단백질의 검출을 나타낸다.

도 20은 항 EREG 마우스 단일클론 항체(EP27)에 의한 면역 염색 결과를 나타낸다.

도 21a는 마우스 항 EREG 항체와 인간 키메라 항 EREG 항체를 이용한 항원 단백질에 대한 샌드위치 ELISA의 결과를 나타낸다.

도 21b는 도 21a의 연속을 나타낸다.

도 21c는 도 21b의 연속을 나타낸다.

도 22는 샌드위치 ELISA의 데이터를 바탕으로 항체의 결합 반응성 패턴을 클러스터링 분석한 결과를 나타낸다.

EREG는 막결합형 상피세포성장인자 단백질이다. 이의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자 서열은 각각 GenBank 등록 번호 NP_001423(서열번호 22) 및 NM_001432(서열번호 21)로 기재되었다. 본 발명에서, EREG 단백질은 전장 단백질 및 그 단편을 포함하는 것을 나타낸다. "단편"은 EREG 단백질의 임의의 영역을 포함하는 폴리펩티드를 나타내며, 자연 발생의 EREG 단백질의 기능을 가지지 않을 수도 있다. 그 단편의 예로서 EREG 단백질의 세포외 영역을 포함하는 단편이 될 수 있고, 이에 제한되지 않는다. EREG 단백질의 세포외 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열에서 29-122번째에 상응한다. 또한, 막관통 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열에서 123-140번째에 상응한다.

본 발명에서, 임상 시료 및 암 세포주의 분석으로부터 원발성 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암 조직에서 매우 고빈도로 EREG 유전자가 발현하고 있는 것으로 나타났다. 또한, 암 세포주에서도 EREG 단백질이 고발현하고 있는 것으로 나타났다. 즉, EREG 단백질은 암의 진단 마커로서 유용하다.

EREG 유전자 발현의 검출

본 발명에 의한 암 진단 방법은 EREG 유전자 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법의 하나의 구체화에서, EREG 단백질의 발현을 검출한다.

본 발명에서, 검출은 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 예를 들면, 정성적인 검출의 예로서는 하기 측정법을 포함한다;

EREG 단백질의 존재 여부만을 측정;

EREG 단백질이 일정량 이상으로 존재하는지를 측정;

EREG 단백질의 양을 다른 시료(예를 들면, 대조군 시료)와 비교하는 측정.

한편, 정량적인 검출은 EREG 단백질 농도의 측정, EREG 단백질 양의 측정 등을 포함한다.

본 발명에서, 피검시료는 EREG 단백질이 포함될 가능성이 있는 시료이면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 포유류등의 생물의 몸으로부터 채취된 시료가 바람직하다. 인간으로부터 채취된 시료가 더욱 바람직하다. 피검시료의 구체적인 예로는, 예를 들면, 혈액, 간질액(interstitial fluid), 혈장(plasma), 혈관외액(extravascular fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 활액(synovial fluid), 흉수(pleural fluid), 혈청, 림프액(lymphatic fluid), 타액(saliva) 및 오줌(urine)을 포함한다. 바람직한 시료는 혈액 시료이다. 혈액 시료는 혈청, 혈장 및 전혈을 포함한다. 상기 혈액 시료 중 혈청이 바람직하다. 피검시료는 생물의 몸으로부터 채취된 조직 또는 세포가 고정화된 견본 등이 시료로부터 수득하였고, 본 발명의 피검시료에 세포 배양액도 포함될 수 있다.

본 발명은 특별히 제한되는바 없이 모든 암에 대해 진단될 수 있다. 구체적으로는, 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 또는 신장암 등을 포함한다. 본 발명에서는 이러한 암의 원발성 병소 및 전이성 병소도 진단될 수 있다. 본 발명에서, 특히 바람직한 암은 원발성 대장암, 전이성 대장암 및 췌장암이다.

본 발명에서, 피검시료 중에 EREG 단백질이 검출되었을 경우에 암이 검출된다. 구체적으로는, 피검시료 중에서 검출되는 피검시료 중의 EREG 단백질의 양이 음성 대조군 또는 정상인보다 많은 경우, 피검사체는 암에 걸렸거나 장래에 암에 걸릴 가능성이 있다고 결정된다. 즉, 본 발명은

(1) 피검사체로부터 채취된 생체 시료 중에서 EREG의 발현 레벨을 검출하는 단계; 및,

(2) 단계 (1)에서 검출된 EREG의 발현 레벨이, 대조군과 비교하여 높은 경우에 피검사체가 암에 걸린 것으로 결정하는 단계

를 포함하는 암의 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 대조군이란 음성 대조군 및 정상인의 생체 시료를 포함한다. 음성 대조군은 정상인의 생체 시료를 채취하여, 필요에 따라서 혼합하는 것에 의해 얻을 수 있다. 대조군에서 EREG의 발현 레벨은 피검사체의 생체 시료에서의 EREG 의 발현 레벨과 함께 검출될 수 있다. 또는, 미리 다수의 정상인의 생체 시료에서의 EREG의 발현 레벨을 검출한 후, 정상인에게서의 표준적인 발현 레벨이 통계학적으로 결정될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 평균값±2×표준편차(S.D.) 또는 평균값±3×표준편차(S.D.)를 기준치로 이용할 수도 있다. 통계학적으로, 정상인 의 80%는 평균값±2×표준편차(S.D.) 범위 안에 있고, 90%는 평균값±3×표준편차(S.D.) 범위 안에 있다.

또는, 대조군에서 EREG의 발현 레벨을 ROC 곡선을 이용해 결정할 수 있다. ROC 곡선(receiver operating characteristic curve: 수신자 조작 특성 곡선)은 세로축에 검출 감도를, 횡축에 의양성율(false positive rate: 즉, "1-특이도")을 나타낸 그래프이다. 본 발명에서, 생체 시료 중의 EREG의 발현 레벨을 판정하기 위한 기준치를 연속적으로 변화시켰을 때의 감도와 의양성율의 변화를 도면에 작성함으로써 ROC 곡선을 수득할 수 있다.

또한 ROC 곡선을 수득하기 위한 "기준치"는, 통계학적인 분석 위해 일시적으로 이용되는 수치이다. 일반적으로 ROC 곡선을 얻기 위한 "기준치"는 선택가능한 모든 기준치를 포함하는 범위 내에서 연속적으로 변화된다. 예를 들어, 분석되는 집단의 EREG의 측정치의 최소치와 최대치의 사이에서 기준치를 변화시킬 수 있다.

수득된 ROC 곡선에 근거하여, 원하는 검출 감도 및 정밀도를 기대할 수 있는 표준치를 선택할 수 있다. ROC 곡선에 의해 통계학적으로 설정된 표준치는 절단치(cut-off value)라고도 불린다. 절단치에 근거하는 암의 검출 방법의 단계 (2)에서 단계 (1)에서 검출된 EREG 발현 레벨은 단계 절단치와 비교된다. 단계 (1)에서 EREG 발현 레벨이 절단치보다 높은 것은 개체가 암에 걸린 것을 의미한다.

본 발명에서, EREG의 발현 레벨은 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로는, EREG mRNA의 양, EREG 단백질의 양 및 EREG 단백질의 생물학적인 활성을 평가하여 EREG의 발현 레벨을 결정할 수 있다. EREG mRNA 및 단백질의 양은 본 명세서에 기재한 것 같은 방법에 따라 결정할 수 있다. 또는, EREG 의존적으로 세포 증식이 유도되는 세포를 사용하여, EREG의 생물학적인 활성으로서 세포 증식 유도 활성을 평가할 수도 있다.

본 발명에서, 피검사체는 EREG 단백질을 발현하는 임의의 동물 종일 수 있다. 예를 들어, 원숭이, 소, 양, 마우스, 개, 고양이 및 햄스터 등의 많은 인간 이외의 포유류에서 EREG 단백질을 발현하고 있는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명에서 상기 동물들은 피검사체에게 포함된다. 특히 바람직한 피검사체는 인간이다. 또한 인간 이외의 동물을 피검사체로 할 경우에도, 상기 동물 종에서 EREG 단백질이 검출되는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명의 진단 방법의 바람직한 구체화에서, 상기 암에 걸린 환자에게서 채취한 조직 또는 세포를 고정화한 절편 상에서, EREG 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 포함한다. 추가의 본 발명의 다른 구체화에서, 세포로부터 방출되어 혈중에 존재하는 EREG 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법을 포함한다. 특히 바람직하게는, 본 발명은 혈중에 존재하는 EREG 단백질의 세포외 영역을 포함하는 단편을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법이다.

피검시료에 함유된 EREG 단백질의 검출 방법은 특히 제한되지 않는다. 항 EREG 항체를 이용한 면역학적 방법에 의해 검출하는 것이 바람직하다. 면역학적 방법으로서는, 예를 들어 다음과 같은 기술을 이용할 수 있다:

방사선면역분석법(radioimmunoassay: RIA);

효소면역분석법(enzyme immunoassay: EIA);

형광면역분석법(fluorescence immunoassay: FIA);

발광면역분석법(luminescence immunoassay: LIA);

면역침강법(immunoprecipitation: IP);

면역비탁법(turbidimetric immunoassay: TIA);

웨스턴 블롯팅(Western blotting: WB);

면역 조직화학 염색법(immunohistochemical staining: IHC): 및,

단일면역확산법(single radial immunodiffusion: SRID).

상기 기술 중에서, 효소면역분석법은 바람직한 면역학적 분석법이다. 보다 구체적으로는, 효소결합 면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)이 바람직한 효소면역분석법이다. ELISA의 한 구체화는, 예를 들면, 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)이다. ELISA 등의 상술한 면역학적 방법은 당업자에게 공지의 방법이다.

항 EREG 항체를 이용한 일반적인 검출 방법으로서는 이하의 방법을 예로 들 수 있다. 우선 항 EREG 항체를 지지체에 고정한 후에, 지지체에 대한 단백질의 비특이적인 결합을 막기 위해 상기 지지체를 차단하였다. 예를 들면 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA), 젤라틴, 알부민 등이 블로킹에 이용된다. 항체를 지지체에 결합하기 위한 여러 가지의 방법이 공지이다. 예를 들어, 폴리스티렌 수지 등의 합성 수지는 항체를 물리적으로 흡착한다. 또는 작용기가 도입된 지지체에 항체를 화학적으로 결합할 수도 있다. 항체를 화학적으로 결합하기 위해서 이중기능성 링커(Bifunctional linker)를 이용할 수도 있다.

다음에 지지체에 피검시료를 첨가하고 인큐베이션 한다. 이때, 지지체에 결합한 항 EREG 항체가 피검시료 중의 EREG 단백질과 결합한다. 이어서, 항 EREG 항체를 개입시켜 지지체에 결합한 EREG가 검출된다. 지지체에 결합한 EREG의 검출에 앞서, 지지체를 세척할 수 있다. 예를 들어 EREG를 인식하는 제2의 항체를 이용하여 지지체에 결합한 EREG를 검출할 수 있다. 상기 제2의 항체는 표지 물질에 의해 표지할 수 있다. 또는, 상기 제2의 항체를 인식하는 3차 항체(2차 항체)를 이용하여 제2의 항체를 간접적으로 표지할 수도 있다. 상기 기술한 바와 같이, 지지체 상의 항 EREG 항체에 결합한 EREG 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출함으로써 피검시료 중의 EREG 단백질이 검출될 수 있다. 추가로 하기에서 여러 구체적인 예가 설명되었다.

본 발명에서, 항 EREG 항체를 고정하기 위해서 이용되는 지지체에는 다음과 같은 소재를 이용할 수 있다:

불용성의 다당류: 아가로스, 셀룰로오스 등;

합성 수지: 실리콘 수지, 폴리스티렌 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 나일론 수지, 폴리카보네이트 수지 등; 및,

유리 등의 불용성의 지지체.

이러한 지지체는, 비드(bead) 또는 플레이트의 형태로 이용된다. 비드의 경우, 이것들이 충전된 컬럼 등을 사용할 수 있다. 플레이트의 경우, 멀티-웰 플레이트(96-웰 멀티-웰 플레이트 등) 또는 바이오센서 칩 등이 사용된다. 항 EREG 항체와 지지체와의 결합에 대해서는, 화학 결합이나 물리적인 흡착 등의 통상적으로 이용되는 방법에 의해 항 EREG 항체가 지지체에 결합할 수 있다. 이러한 지지체는 모두 시판의 것이 적합하게 사용할 수 있다.

항 EREG 항체와 EREG 단백질과의 결합은 통상적으로 완충액에서 수행된다. 완충액으로서는 예를 들면, 인산 완충액, Tris 완충액, 구연산 완충액, 붕산염 완충액, 탄산염 완충액 등이 사용된다. 또한, 인큐베이션은 일반적으로 사용되는 조건, 예를 들면, 4℃ 및 실온에서 1 내지 24시간 동안 배양하는 조건에서 적절하게 수행될 수 있다. EREG단백질과 항 EREG 항체의 결합을 방해하지 않는다면 인큐베이션 후의 세척에 어떤 것도 사용될 수 있고, 예를 들면, Tween 20등의 계면활성제를 포함하는 완충액 등이 매우 적합하게 사용될 수 있다.

본 발명의 EREG 단백질 검출 방법에서, EREG 단백질 함유량이 검출될 피검시료에 추가로 대조군 시료가 적절히 제조될 수 있다. 대조군 시료로서는 EREG 단백질을 포함하지 않는 음성 대조군 시료나 EREG 단백질을 포함하는 양성 대조군 시료 등을 예로 들 수 있다. 이 경우, EREG 단백질을 포함하지 않는 음성 대조군 시료에서 수득한 결과와 EREG 단백질을 포함하는 양성 대조군 시료에서 수득한 결과를 비교함으로써, 피검시료 중의 EREG 단백질의 존재 여부를 확인할 수 있다. 또한, 단계적으로 농도를 변화시킨 일련의 대조군 시료를 제조하여, 각 대조군 시료에 대한 검출 결과를 수치화 한 후에, EREG 단백질의 농도와 대응하는 측정치를 기반으로 표준 곡선을 수득할 수 있다. 피검시료에 포함된 EREG 단백질의 측정 결과와 표준 곡선으로부터 피검시료에 포함된 EREG 단백질을 정량적으로 검출할 수 있다.

항 EREG 항체를 개입시켜 지지체에 결합된 EREG 단백질의 검출의 바람직한 구체화에서, 표지 물질로 표지 된 항 EREG 항체를 이용하는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 지지체에 고정된 항 EREG 항체에 피검시료를 접촉시킨 후, 필요에 따라서 세척한 후에, EREG 단백질을 특이적으로 인식하는 표지 항체를 결합시킴으로써 상기 EREG 단백질을 검출할 수 있다.

항 EREG 항체는 통상적으로 알려져 있는 방법에 의해 표지될 수 있다. 표지 물질로서는 형광 색소, 효소, 조효소, 화학 발광 물질, 방사성 물질 등의 당업자에게 공지의 표지 물질을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 다음과 같은 표지 물질이 항체의 표지에 이용된다:

방사성 동위 원소: ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I 등;

형광 색소: 플루오레세인, 로다민, 단실 클로라이드(dansyl chloride), 움벨리페론(umbelliferone) 등

효소: 루시퍼라아제, 페록시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 호스래디쉬 페록시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 마이크로 페록시다아제 등; 및,

결합 친화성 물질: 비오틴 등.

표지 물질로서 비오틴을 이용하는 경우에는, 알칼리 포스파타아제 등의 효소를 결합시킨 아비딘을 이용하여, 비오틴 표지 항체를 검출할 수 있다. 표지 물질과 항 EREG 항체와의 결합을 위해서는, 글루탈알데히드(glutaraldehyde)법, 말레이미드(maleimide)법, 피리딜 이황화물(pyridyl disulfide)법, 과요오드산(periodic acid)법 등의 공지의 방법을 사용할 수 있다.

표지 물질의 검출 방법도 공지이다. 예를 들면, 방사성 물질에 의해 표지 된 항 EREG 항체를 검출하는 경우에는, 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용해 방사 활성을 검출할 수 있다. 효소로 표지 된 항 EREG 항체는 상기 표지 된 항 EREG 항체에 기질을 첨가한 후에, 기질의 효소적 변화에 의해 검출할 수 있다. 발색 반응이나 발광 반응을 촉매 하는 효소와 기질의 조합은 공지이다. 예를 들어 페록시다아제의 검출용 기질의 구체적인 예로서는, 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)디암모늄염[2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid) diammonium salt; ABTS], 1,2-페닐렌디아민 (오르소-페닐렌디아민)[1,2-phenylenediamine (ortho-phenylenediamine)], 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘[3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; TMB] 등을 들 수 있다. 이러한 발색 기질을 이용할 경우에는, 흡광 광도계에 의해 반응을 추적할 수 있다. 기질이 형광 발광 물질일 경우에는 기질의 효소적 변화를 형광 광도계를 이용해 검출할 수 있다.

본 발명의 EREG 단백질의 검출 방법의 특히 바람직한 구체화에서, 비오틴으로 표지 된 항 EREG 항체 및 아비딘을 이용하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 비오틴이 표지된 항 EREG 항체는 효소가 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하여 검출할 수 있다. 알칼린 인산화 효소 또는 페록시다아제 등의 효소에 결합된 아비딘 및 스트렙타비딘은 공지이다.

본 발명의 EREG 단백질을 검출하는 방법의 다른 구체화에서, 일종 이상의 EREG 단백질을 특이적으로 인식하는 일차 항체 및 일종 이상의 상기 일차 항체를 특이적으로 인식하는 2차 항체를 이용하는 방법을 들 수 있다.

2차 항체를 이용할 경우에는, 지지체에 결합한 항체(고상화 항체)와는 다른 동물 종에서 유래한 항 EREG 항체가 액상항체로서 이용된다. 고상화 항체에 포착된 EREG 단백질에 액상항체가 결합하고, 2차 항체는 액상항체에 결합한다. 상기 2차 항체는 액상항체에 결합할 수 있으나, 고상화 항체에는 결합할 수 없다. 따라서, 지지체에 남아있는 2차 항체의 양은 EREG 단백질을 개입시켜 지지체에 결합하고 있는 액상항체의 양에 의존한다. 상기 조작 결과, 결합한 2차 항체를 정성적 또는 정량적으로 검출함으로써 피검시료 중의 EREG 단백질을 검출할 수 있다. 이 경우, 상기 2차 항체는 표지 물질에 의해 매우 적합하게 표지 될 수 있다.

본 발명의 EREG 단백질의 검출 방법의 다른 구체화에서, 응집 반응을 이용한 검출 방법을 들 수 있다. 상기 방법에서, 항 EREG 항체를 흡착한 담체를 이용하여 EREG 단백질을 검출할 수 있다. 항체를 흡착하기 위해 사용되는 담체로서는 불용성이고, 안정적이며, 비특이적인 반응을 일으키지 않는 한, 어떠한 담체도 사용할 수 있다. 예를 들면, 라텍스 입자, 벤토나이트, 콜로디온(collodion), 카올린, 고정된 양 적혈구(sheep erythrocytes) 등을 사용할 수 있다. 라텍스 입자는 균일성이나 안정성이 뛰어난 바람직한 담체이다. 예를 들면, 라텍스 입자로는 폴리스틸렌 라텍시 입자, 스틸렌-부타딘(styrene-butadiene) 공중합체 라텍스 입자 또는 폴리비닐 톨루엔 라텍스 입자 등을 사용할 수 있다. 또는 카복실기 등의 작용기가 도입된 라텍스 입자도 공지이다. 예를 들면, 폴리스틸렌 라텍스 입자는 바람직한 라텍스 입자이다.

항체와 혼합될 경우, 소수성 표면을 갖는 라텍스 입자는 항체를 물리적으로 흡착한다. 또는, 라텍스 입자가 작용기를 가질 경우, 상기 항체는 화학적으로 결합할 수도 있다. 항체를 결합한 입자는 시료와 혼합시켜, 일정 시간 동안 교반시킨다. 시료 중의 EREG 단백질의 농도에 따라 입자의 응집도가 커지므로, 상기 응집도를 육안으로 추측함으로써 상기 EREG 단백질을 검출할 수 있다. 또한, 응집에 의한 탁도나 산란 빛의 증가를 분광 광도계 등을 이용하여 측정하는 것에 의해서도 EREG 단백질을 검출할 수 있다.

본 발명의 EREG 단백질의 검출 방법의 다른 구체화에서는, 예를 들면, 표면 프라즈몬 공명 현상을 이용한 바이오센서를 이용한 방법을 들 수 있다. 표면 프라즈몬 공명 현상을 이용한 바이오센서를 사용하면, 단백질과 단백질 간의 상호작용을 상기 단백질을 표지할 필요없이 표면 플라스몬 공명 신호로써 실시간으로 관찰할 수 있다. 예를 들면, BIAcore(Biacore 사) 등의 바이오센서를 이용하여 EREG 단백질과 항 EREG 항체의 결합이 검출될 수 있다. 구체적으로는, 항 EREG 항체가 고정화된 센서 칩에 피검시료를 접촉시킴으로써, 항 EREG 항체에 결합하는 EREG 단백질을 공명 신호의 변화로서 검출될 수 있다.

EREG는 암 세포에 대해 특이적으로 발현량이 증강하는 막단백질이다. 따라서, 항 EREG 항체에 의해 암 세포 또는 암조직을 검출할 수 있다. 예를 들어 항 EREG 항체를 사용한 면역 조직학적 분석에 의해, 생체로부터 채취된 세포나 조직에 포함된 암 세포가 검출된다. 또는 생체내의 암조직을 항 EREG 항체에 의해 검출할 수도 있다. 즉, 본 발명은 (1) 방사성 동위 원소로 표지 된, EREG 단백질에 결합 하는 항체를 피검사체에게 투여하는 단계; 및 (2) 상기 방사성 동위 원소의 축적을 검출하는 단계를 포함하는 암 검출 방법에 관한 것이다. 생체내로 투여된 항체를 추적하기 위해서, 상기 항체는 검출 가능하게 표지 될 수 있다. 예를 들어 형광 물질, 발광 물질 또는 방사성 동위 원소로 표지 된 항체의 생체내 거동을 추적할 수 있다. 형광 물질 또는 발광 물질로 표지 된 항체는 내시경이나 복강거울을 이용해 관찰할 수 있다. 방사성 동위 원소의 방사 활성을 추적함으로써 항체의 국재를 영상화할 수 있다. 본 발명에서, 생체내 항 EREG 항체의 국재는 암 세포의 존재를 나타내고 있다.

생체내의 암을 검출하기 위해서 항체를 표지하는 방사성 동위 원소로서 양전자 방출 핵종을 이용할 수 있다. 예를 들어, ¹⁸F, ⁵⁵Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁶Br, ⁸⁹Zr, 및 ¹²⁴I 등의 양전자 방출 핵종으로 항체를 표지할 수 있다. 이러한 양전자 방출 핵종에 의한 항 EREG 항체의 표지는 공지의 방법을 이용할 수 있다(Acta Oncol. 32, 825-830, 1993).

양전자 방출 핵종으로 표지 된 항 EREG 항체를 인간이나 동물에 투여한 후, PET 스캐너(positron emission tomography scanner)를 이용하여 상기 방사성 핵종이 방사하는 방사선을 체외에서 계측한 후에, 컴퓨터 단층촬영 방법으로 영상으로 변환하였다. PET는 약물의 생체내 거동 등에 관한 데이터를 비침습적으로 얻기 위한 장치이다. PET를 이용하여 방사 강도를 신호 강도로서 정량적으로 영상화할 수 있다. 상기와 같은 PET를 사용하여 환자로부터 시료를 채취하지 않고도, 특정 암 에서 고발현하는 항원 분자를 검출할 수 있다. 항 EREG 항체는 상기 핵종 외에 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F 및 ⁴⁵Ti 등의 양자 전자 방출 핵종을 이용한 단수명 핵종으로 방사표지될 수 있다.

의료용 이온가속기에 의한 상기 핵종을 이용한 단수명 핵종의 제조, 단수명 방사 표지 화합물의 제조 기술 등에 관한 연구 및 개발이 진행되고 있다. 이러한 기술을 이용하여 항 EREG 항체를 여러 가지의 방사성 동위 원소로 표지 될 수 있다. 환자에게 투여된 항 EREG 항체는 병리 조직의 각각의 영역에 대한 항 EREG 항체의 특이성에 따라 원발성 병소 및 전이성 병소에 집적한다. 상기 항 EREG 항체가 양전자 방출 핵종으로 표지 되었으면, 방사 활성을 검출함으로써 방사 활성의 국재로부터 상기 원발성 병소 및 전이성 병소의 존재가 검출될 수 있다. 상기 진단 용도에 이용하는 경우에는 25-4000 keV의 감마 입자 또는 양전자의 방사 활성값을 적절히 사용할 수 있다. 또한, 적절한 핵종을 선택하여, 게다가 대량으로 투여하면 치료 효과도 기대할 수 있다. 방사선에 의한 항암 효과를 얻기 위해서는, 70-700 keV의 감마 입자 또는 양전자의 방사량치를 제공하는 핵종을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 구체화에서, EREG mRNA의 발현을 검출할 수 있다. 본 발명에서 검출이란 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 예를 들면, 정성적인 검출로서 다음과 같은 측정 기작을 예로 들 수 있다:

EREG mRNA의 존재 여부의 단순 측정;

EREG mRNA의 일정양 이상 존재 여부의 측정; 및,

EREG mRNA의 양을 다른 시료(예를 들면, 대조군 시료 등)와 비교하는 측정 등.

한편, 정량적인 검출에는 EREG mRNA 농도의 측정, EREG mRNA 양의 측정 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에서 피검시료로서는 EREG mRNA가 포함될 가능성이 있는 임의의 시료를 이용할 수 있다. 포유류 등의 생물의 신체에서 채취된 시료가 바람직하고 , 한층 더 바람직하게는 인간으로부터 채취된 시료이다. 피검시료의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 혈액, 간질액, 혈장, 혈관외액, 뇌척수액, 활액, 흉수, 혈청, 림프액, 타액 및 오줌 등을 포함한다. 바람직한 시료는 혈액 시료이다. 혈액 시료에는 혈청, 혈장 및 전혈이 포함된다. 또한, 생물의 신체로부터 채취된 조직 또는 세포가 고정화된 표본 또는 세포 배양액 등의 피검시료로부터 수득 된 시료도 본 발명의 피검시료에 포함된다.

진단되는 암은 특히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 또는 신장암 등을 들 수 있다. 본 발명에서, 이러한 암의 원발성 병소 및 전이성 병소도 진단할 수 있다. 특히 원발성 대장암, 전이성 대장암 및 췌장암이 바람직하다.

본 발명에서는 EREG 단백질을 발현하는 임의의 동물 종은 피검사체일 수 있다. 예를 들어, 원숭이, 소, 양, 마우스, 개, 고양이, 햄스터 등 인간 이외의 많은 포유류가 EREG를 발현하고 있는 것으로 알려져 있다. 특히 매우 적합한 피검사 체는 인간이다. 인간 이외의 동물 종이 피검사체로 이용될 경우, 상기 동물 종의 EREG mRNA가 검출된다.

이하에 검출 방법의 구체적인 구체화를 기재한다. 우선, 피검사체로부터 시료를 제조한다. 이후, 시료에 포함된 EREG mRNA가 검출된다. 본 발명에서, mRNA로부터 합성된 cDNA를 검출하는 것도 가능하다. 본 발명에서, 피검시료 중의 EREG mRNA 또는 EREG를 암호화하는 cDNA의 검출은 환자에서 암의 검출을 의미한다. 예를 들면, 피검시료 중에서 검출되는 피검시료 중의 EREG mRNA 또는 EREG를 암호화하는 cDNA의 양이 음성 대조군 또는 정상인보다 많은 경우, 상기 피검체는 암에 걸렸거나, 장래에 암에 걸릴 가능성이 있다고 결정될 수 있다.

mRNA 검출 방법은 공지이다. 구체적으로는, 노던 블랏팅법, RT-PCR 방법, DNA 어레이 방법 등을 본 발명에 이용할 수 있다.

상기 본 발명의 검출 방법은 여러 가지 자동 검사 장치를 이용하여 자동화할 수도 있다. 자동화를 통해 한 번에 대량의 시료를 검사할 수 있다.

본 발명의 목적은 피검시료 중의 EREG 단백질을 검출하기 위한 시약을 포함하는 암 진단을 위한 진단제 또는 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 진단제는 적어도 항 EREG 항체를 포함한다. 본 발명의 진단제 또는 키트가 ELISA법 등의 EIA법에 기반할 경우, 항체를 고정화하는 담체가 포함될 수 있다. 또는, 미리 담체에 결합한 항체를 공급할 수도 있다. 본 발명의 진단제 또는 키트가 라텍스 등의 담체를 이용한 응집법에 근거하는 경우에는, 항체가 흡착된 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 암 진단제와 EREG의 검출에 이용되는 그 외의 요소를 조합함으로써, 암의 진단을 위한 키트가 제조될 수 있다. 즉, 본 발명은 EREG에 결합하는 항체 및 EREG를 포함한 생체 시료를 포함하는 대조군 시료를 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 부가적으로 EREG의 면역분석을 위한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어 ELISA용 시약으로서 효소 표지를 검출하기 위한 발색 기질이나, 고상을 세척하기 위한 세척액을 조합할 수 있다. 또한, 측정 조작을 설명하기 위한 지시서를 키트에 첨부할 수 있다.

또한, 본 발명은 피검시료 중의 EREG mRNA 또는 EREG를 암호화하는 cDNA를 검출하기 위한 시약을 포함하는 암 진단용 진단제 또는 키트를 제공한다. 본 발명의 진단제는 적어도 EREG를 암호화하는 DNA(서열번호 21: NM_001423에 기재된 염기서열로 구성된 DNA) 또는 상기 DNA의 상보 가닥에 상보적인 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 명세서에서 "상보 가닥"이란, A:T(RNA의 경우는 U) 및 G:C 염기쌍으로 구성된 이중 가닥 핵산 중 하나의 가닥에 관해서 다른 가닥을 가리킨다. 또한, "상보적"이란, 적어도 15개의 연속한 뉴클레오티드 영역에서 완전하게 상보적인 서열인 경우에 한정되지 않고, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 90% 및 한층 더 바람직하게는 95% 이상의 염기 서열의 상동성을 가진다. 상동성은 본 명세서에 기재된 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 EREG를 암호화하는 DNA의 검출 또는 증폭에 이용하는 프로브나 프라이머 및 상기 DNA의 발현을 검출하기 위한 프로브나 프라이머로 서 사용될 수 있다. 또한, 상기 프로브는 DNA 어레이의 기판의 형태로 사용할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 이용하는 경우, 그 길이는 통상적으로 15 bp 내지 100 bp이다. 바람직한 프라이머의 길이는 17 bp 내지 30 bp이다. EREG를 암호화하는 DNA 또는 그의 상보가닥의 적어도 일부를 증폭할 수 있는 임의의 프라이머를 이용할 수 있다. 또한, 프라이머로 이용하는 경우, 3'-말단의 영역은 5' 말단에 상보적으로 제작될 수 있고, 제한 효소 인식 서열이나 태그 등을 부가할 수 있다.

또한, EREG를 암호화하는 DNA 또는 그의 상보가닥의 적어도 일부에 특이적으로 혼상화하는 임의의 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 이용할 수 있다. mRNA 검출용 프로브의 염기서열은 EREG의 센스 가닥에 상보적인 염기서열로부터 선택된다. 상기 프로브의 길이는, 통상 적어도 15 bp 이상이다.

본 발명에서, 올리고뉴클레오티드는 적당 표지에 의해 프로브로 제작될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 표지하는 방법은 공지이다. 예를 들어, ³²P-로 표지 한 ATP를 기질로서 T4 폴리뉴클레오티드 인산화 효소를 이용하여, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 인산화함으로써 표지할 수 있다. 또는, DNA 폴리머라제를 이용해 랜덤 헥사커 올리고뉴클레오티드 등을 프라이머로서 표지 된 기질 염기를 도입하는 방법(랜덤 프라임법 등)을 예시할 수 있다. 랜덤 프라임법에는 크레노우 효소(Klenow enzyme) 등이 DNA 폴리머라제로서 이용된다. 또한 염기는 ³²P 등의 방사 성 동위 원소, 형광 색소, 비오틴 또는 디곡신 등에 의해 표지 될 수 있다.

본 발명에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 시판의 올리고뉴클레오티드 합성기에 의해 제작할 수 있다. 프로브는 제한 효소 처리 등에 의해 수득되는 이중 가닥 DNA 단편으로 제작할 수도 있다.

상기 진단제 또는 키트에서, 유효성분인 올리고뉴클레오티드나 항체 이외에, 예를 들면, 멸균수, 생리 식염수, 식물유, 계면활성제, 지방질, 용해 보제조, 완충제, 단백질 안정제(BSA나 젤라틴 등), 보존제, 차단 용액, 반응 용액, 반응 정지액, 시료를 처리하기 위한 시약 등이 필요에 따라서 혼합될 수 있다.

항 EREG 항체의 제작

본 발명에 이용되는 항 EREG 항체는 EREG 단백질에 특이적으로 결합하는 한, 그 유래, 종류 및 형태는 거론되지 않는다. 구체적으로는, 비인간 동물의 항체(예를 들면, 마우스 항체, 래트 항체 및 낙타 항체), 인간 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 등의 공지의 항체를 사용할 수 있다. 본 발명에서, 단일클론 또는 다클론 항체가 이용될 수 있다. 바람직한 항체는, 단일클론 항체이다

본 발명에서 사용되는 항 EREG 항체는 공지의 수단을 이용해 다클론 또는 단일클론 항체로서 수득될 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용되는 항 EREG 항체로서 포유류 유래의 단일클론 항체가 바람직하다. 포유류 유래의 단일클론 항체는 하이브리도마에 의해 제조되는 항체 및 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 유전자 공학적 수법에 의해 형질전환된 숙주에 의해 제조된 항체를 포함한다.

단일클론 항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 하기 공지 기술을 사용하 여 제조될 수 있다. 우선, EREG 단백질을 감작 항원으로서 사용하여, 통상의 면역 방법에 따라 면역화가 수행된다. 면역화된 동물로부터 수득된 면역세포를 통상의 세포 융합법에 따라 공지의 부모세포(parent cell)와 융합시켜 하이브마리드마를 얻을 수 있다. 추가로, 항 EREG 항체를 제조하는 하이브리도마를 통상의 스크리닝법에 의해 목적으로 하는 항체를 제조하는 세포의 스크리닝 법으로 선택될 수 있다.

구체적으로는, 단일클론 항체는 하기와 같이 제조된다. 우선, EREG 유전자는 항체 제조용 감작 항원으로서 사용되는 EREG 단백질을 수득하기 위해 발현될 수 있다. EREG 유전자의 염기서열은 GenBank 등록 번호 NM_00143 2(서열번호 21) 등에 기재되어 있다. 즉, EREG를 암호화하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입한 후, 적당한 숙주세포에 형질전환시킨다. 이후, 상기 숙주세포 또는 배양 상등액에서 목적의 인간 EREG 단백질을 공지의 방법으로 정제할 수 있다. 또한, 정제한 천연의 EREG 단백질도 유사하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용되는 바와 같이, EREG 단백질의 원하는 일부 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드와 융합하여 제조된 융합 단백질을 면역원으로서 이용할 수 있다. 면역원으로 하는 융합 단백질을 제조하기 위해서, 예를 들면, 항체의 Fc 단편, 펩티드 태그 등을 이용할 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는 원하는 2종류 이상의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 유전자를 하나의 프레임(in frame)에 융합시키고, 상기 융합 유전자를 앞에서 기술한 발현 벡터에 삽입하여 제작할 수 있다. 융합 단백질의 제작 방법은 Molecular Cloning 2판(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47- 9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)에 기재되어 있다.

이와 같이 정제된 EREG 단백질을 포유류의 면역화에 사용하는 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 또한, EREG의 부분 펩티드도 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 하기 펩티드를 감작 항원으로 할 수 있다:

화학 합성에 의해 인간 EREG의 아미노산 서열로부터 수득된 펩티드;

EREG 유전자의 일부를 발현 벡터에 도입하고 이를 발현함으로써 수득된 펩티드; 및,

EREG 단백질을 단백질 분해 효소로 분해하여 수득된 폴리펩티드.

부분 펩티드로서 이용하는 EREG의 영역 및 크기는 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 EREG의 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열(서열번호 22의 아미노산 서열에 대해 29-122 번째)로부터 선택될 수 있다. 감작 항원으로 사용하는 펩티드를 구성하는 아미노의 수는, 적어도 3개 이상, 예를 들어, 5개 이상 또는 6개 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 8~50개의 잔기, 바람직하게는 10~30개의 잔기를 포함하는 펩티드를 감작 항원으로 이용할 수 있다.

상기 감작 항원으로 면역되는 포유류는 특히 한정되지 않는다. 단일클론 항체를 세포 융합법에 따라 수득기 위해서는, 세포 융합에 사용하는 부모세포와의 적합성을 고려하여 면역 동물을 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 설치류가 면역 동물로서 바람직하다. 구체적으로는, 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼를 면역 동물로 이용할 수 있다. 그외, 원숭이 등을 면역 동물로 이용할 수 있다.

공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역화될 수 있다. 예를 들면, 일반적 방법으로서 감작 항원을 복강내 또는 피하 주사함으로써 포유류를 면역화할 수 있다. 구체적으로는, 상기 감작 항원이 포유류에 4일 내지 21일 마다 몇차례 투여된다. 감작 항원은 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리 식염수 등으로 적당한 희석 배율로 희석해 면역에 사용된다. 추가로, 감작 항원을 아쥬반트와 함께 투여할 수 있다. 예를 들면 프로인트 완전 아쥬반트와 혼합한 후, 유화하여 감작 항원으로 제조될 수 있다. 또한, 감작 항원의 면역시에는 적당한 담체를 사용할 수 있다. 특히 저분자량의 부분 펩티드가 감작 항원으로서 이용되는 경우, 상기 감작 항원 펩티드를 알부민 또는 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 등의 담체 단백질과 결합시켜 면역화하는 것이 바람직하다.

이와 같이 포유류가 면역화되어 혈청 중의 원하는 항체량의 증가가 확인된 후에, 포유류로부터 면역세포를 채취하여 세포 융합에 첨가한다. 특히 바람직한 면역세포는 비장림프구(splenocyte)이다.

포유류 골수종 세포는 상기 면역세포와 융합된 세포로 사용된다. 상기 골수종 세포는 바람직하게는 적당한 스크리닝용 선택 마커를 포함한다. 선택 마커는 세포에 특정 배양 조건에서 생존하는(또는 생존하지 않는) 특성을 수여한다. 하이포쟌틴-구아닌 인산리보실전이효소(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase: 이하, HGPRT) 결핍성 및 티미딘 인산화효소(thymidine kinase: 이하, TK) 결핍성은 선택 마커로 알려져 있다. HGPRT 또는 TK 결핍성을 갖는 세포는 하이포쟌틴-아미노프테린-티미딘(이하, HAT) 민감성을 갖는다. HAT-민감성 세포는 HAT 선택 배지에서 DNA 합성을 수행할 수 없어서 사멸한다. 그러나 상기 세포가 정상 세포와 융합되면 상기 정상 세포의 재사용 대사 경로(salvage pathway)를 이용하여 DNA를 합성하는 데에 기여할 수 있고, 따라서 HAT 선택 배지에서 성장할 수 있다.

HGPRT-결핍성 및 TK-결핍성 세포는 6-티오구아닌(6-thioguanine) 또는 8-아카구아닌(8-azaguanine: 이하, 8AG) 및 5'-브로모데옥시우리딘(5'-bromodeoxyuridine)을 각각 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 정상 세포는 상기 피리미딘 유사체를 DNA에 도입함으로써 사멸된다. 그러나 상기 효소가 결핍된 세포는 상기 피리미딘 유사체를 도입할 수 없어서 선택 배지에서 생존할 수 있다. 또한, G418 저항성에 관련된 선택 마커는 네오마이신 저항성 유전자로부터 2-데옥시스트렙타민 형태(2-deoxystreptamine-type) 항생제(젠타마이신 유사체)에 대한 저항성을 제공한다. 세포 융합에 적합한 다양한 종류의 골수종 세포는 공지이다. 예를 들면, 하기 세포를 포함하는 골수종 세포는 본 발명의 단일 클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다:

P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550);

P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology And Immunology (1978) 81, 1-7);

NS-1 (Kohler. G. 및 Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519);

MPC-11 (Margulies. D.H. et al ., Cell (1976) 8, 405-415);

SP2/0 (Shulman, M. et al ., Nature (1978) 276, 269-270);

FO (de St. Groth, S. F. et al ., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21);

S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323); 및,

R210 (Galfre, G. et al ., Nature (1979) 277, 131-133).

상기 면역세포와 골수종 세포의 세포 융합은 공지의 방법, 예를 들면, Kohler 및 Milstein 등(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)의 방법에 따라 일반적으로 수행될 수 있다.

보다 구체적으로는, 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서 상기 세포 융합을 수행할 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등을 사용할 수 있다. 더욱 융합 효율을 높이기 위해서, 원하는 경우 디메틸설폭사이드 등의 보제조를 첨가할 수도 있다.

면역세포와 골수종 세포의 비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해서 면역세포는 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 이용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI 1640 배양액 및 MEM 배양액 또는 그외, 이런 종류의 세포 배양에 이용되는 통상의 표준 배양액을 이용할 수 있다. 게다가 소태아 혈청(fetal calf serum: FCS) 등의 혈청 보충액을 배양액에 첨가할 수 있다.

세포 융합은 상기 면역세포와 골수종 세포와의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 대략 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액을 첨가 및 혼합하는 것에 의해 목적으로 하는 융합 세포(하이브리도마)가 형성된다. 세포 융합법에 대해서는 예를 들면 평균 분자량 1000 내지 6000 정도의 PEG를 통상 30 내지 60%(w/v)의 농 도로 첨가할 수 있다. 이어서, 상기 적당한 배양액을 순서대로 첨가하고, 원심분리로 상등액을 제거하는 과정을 반복하는 것으로 하이브리도마의 성장에 바람직하지 않은 세포 융합제 등이 제거된다.

이와 같은 방법으로 수득한 하이브리도마는 세포 융합에 이용된 골수종이 가지는 선택 마커에 적당한 선택 배양액을 이용하는 것에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT 및 TK이 결손된 세포는 HAT 배양액[하이포쟌틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 디미딘을 포함하는 배지]으로 배양함으로써 선택할 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포 융합에 이용했을 경우, HAT 배양액 중에서 정상세포와의 세포 융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식할 수 있다. 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데 충분한 시간 동안 상기 HAT 배양액을 이용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로 며칠 내지 몇 주간의 배양에 의해, 목적으로 하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 이후, 통상의 한계 희석법을 실시함으로써, 목적으로 하는 항체를 제조하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다. 또는, EREG를 인식하는 항체를 국제 공개특허 제 03/104453호에서 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

목적으로 하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이, 공지의 항원 항체 반응에 기반한 스크리닝 방법에 따라 매우 적합하게 실시될 수 있다. 예를 들면, 폴리스틸렌 비드 등으로 완성된 비드나 시판의 96 웰의 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 등의 담체에 항원을 결합시키고, 하이브리도마의 배양 상등액과 반응된다. 이후 담체를 세척한 후에 효소로 표지 한 2차 항체 등을 반응시킨다. 만약 배양 상등액 중에 감작 항원과 반응하는 목적으로 하는 항체가 포함되는 경우, 2차 항체는 상기 항체를 개입시켜 담체에 결합한다. 최종적으로 담체에 결합하는 2차 항체를 검출하는 것에 의해, 목적으로 하는 항체가 배양 상등액 중에 존재하고 있는지가 결정될 수 있다. 항원에 대해 결합할 수 있는 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 한계 희석법 등에 의해 클로닝 될 수 있다. 이때, 항원으로서는 면역화에 이용한 항원 및 실질적으로 동일한 EREG 단백질이 매우 적합하게 사용할 수 있다. 예를 들어 EREG의 세포외 도메인 영역 또는 상기 영역을 포함하는 부분 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드를 항원으로 이용할 수 있다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역화하는 것에 의해 상기 하이브리도마를 얻는 방법 이외에, 인간 림프구를 항원으로 감작하여 목적으로 하는 항체를 얻을 수도 있다. 구체적으로는, 우선 in vitro에 대해 인간 림프구를 EREG 단백질로 감작하였다. 이후 면역 감작 된 림프구를 적당한 융합 파트너와 융합시킨다. 예를 들어 영구 분열 가능성을 가지는 인간 유래 골수종 세포를 융합 파트너로 이용할 수 있다(일본 공개특허 1 59878호 공보 참조). 상기 방법에 따라 얻을 수 있는 항 EREG 항체는 EREG 단백질에 결합 활성을 가지는 인간 항체이다.

게다가 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 가지는 트랜스제닉(transgenic) 동물에 대해서 항원이 되는 EREG 단백질을 투여함으로써, 항 EREG 인간 항체를 얻을 수도 있다. 면역화된 동물의 항체를 생산하는 세포는 적당한 융합 파트너와의 세포 융합이나 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스 감염 등의 처리에 의해 불사화 될 수 있다. 이와 같이 얻을 수 있던 불사화 세포로부터 EREG 단백질에 대한 인간 항체를 분리하는 것에 의해도 할 수 있다(국제 공개특허 제 94/25585호, 국제 공개특허 제 93/12227호, 국제 공개특허 제 92/03918호, 국제 공개특허 제 94/02602호 참조). 또한, 불사화된 세포를 클로닝 함으로써, 목적의 반응 특이성을 가지는 항체를 제조하는 세포를 클로닝할 수 있다. 트랜스제닉(transgenic) 동물을 면역화될 동물로 이용할 경우에는, 상기 동물의 면역 시스템은 인간 EREG를 외부 물질로 인식한다. 따라서 인간 EREG에 대한 인간 항체를 용이하게 얻을 수 있다.

이와 같이 제작되는 단일클론 항체를 제조하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양할 수 있다. 또한, 상기 하이브마리드마를 액체 질소 중에서 장기간에 걸쳐 보존할 수 있다.

상기 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하여, 그 배양 상등액으로부터 목적으로 하는 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 또는 상기 하이브리도마를 적합성이 있는 포유류에 투여한 후 증식시켜서, 복수(ascites)로부터 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 상기 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합하다.

본 발명에서, 항체를 생산하는 세포로부터 클로닝 된 항체 유전자에 의해 암호화되는 항체를 이용할 수도 있다. 클로닝 한 항체 유전자는 적당한 벡터에 삽입되어 숙주에 도입하여 항체를 발현하도록 할 수 있다. 항체 유전자의 분리와 벡터로의 도입 및 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 이미 확립되어 있다(예를 들면, Vandamme, A. M. et al ., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775 참조).

예를 들어, 항 EREG 항체를 제조하는 하이브리도마 세포로부터, 항 EREG 항체의 가변영역(V 영역)을 암호화하는 cDNA를 수득할 수 있다. 이를 위해, 통상적 으로 우선 하이브리도마로부터 전체 RNA를 수득하였다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서 예를 들어 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다:

구아니딘 초원심분리 방법(guanidine ultracentrifugation method; Chirgwin, J. M. et al ., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299); 및,

AGPC 방법(Chomczynski, P. et al ., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).

추출된 mRNA는 mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bio-Sciences) 등을 사용해 정제할 수 있다. 또는, QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bio-Sciences)등과 같이, 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 이용하여 하이브리도마로부터 전체 mRNA를 얻을 수도 있다. 수득한 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체의 V 영역을 암호화하는 cDNA를 합성할 수 있다. AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(SEIKAGAKU CORPORATION) 등을 이용하여 cDNA를 합성할 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 위해서, 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002: Belyavsky, A. et al ., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)을 이용할 수 있다. 또한, 이러한 cDNA의 합성의 과정에 대해 cDNA의 양 말단에 후술하는 적절한 제한 효소 사이트를 도입할 수 있다.

수득된 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편을 정제한 후, 벡터 DNA와 연결되었다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되어 대장균 등에 도입되고 콜로니가 선택된 후에, 상기 콜로니를 형성한 대장균으로부터 원하는 재조합 벡터가 제조될 수 있다. 상기 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열이 있는지 여부에 대해서, 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 방법(dideoxynucleotide chain termination method) 등에 의해 확인할 수 있다.

가변영역을 암호화하는 유전자를 얻기 위해서, 가변영역 유전자 증폭용의 프라이머를 사용한 PCR법을 이용할 수 있다. 우선 추출된 mRNA를 주형으로서 cDNA를 합성하여, cDNA 라이브러리를 수득하였다. cDNA 라이브러리의 합성에는 시판의 키트를 이용하는 것이 편리하다. 실제로, 소수의 세포만으로부터 얻을 수 있는 mRNA는 지극히 미량이므로, 그것을 직접 정제 하면 수율이 낮다. 따라서 통상적으로 항체 유전자를 포함하지 않는 것이 분명한 캐리어 RNA를 첨가한 후에 정제된다. 또는 일정량의 RNA를 추출할 수 있는 경우에는, 항체를 생산하는 세포의 RNA만을 이용하더라도 효율적으로 추출할 수 있다. 예를 들어 10 이상, 30 이상, 바람직하게는 50 이상의 항체를 생산하는 세포로부터의 RNA 추출에는, 캐리어 RNA를 첨가할 필요는 없다.

수득한 cDNA 라이브러리를 주형으로서 PCR법에 따라 항체 유전자가 증폭된다. 항체 유전자를 PCR법에 따라 증폭하기 위한 프라이머가 공지이다. 예를 들어, 논문(J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597) 등에 기재된 내용에 근거하여 인간 항체 유전자 증폭용 프라이머를 디자인할 수 있다. 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 면역글로불린의 서브클래스에 따라 다르다. 따라서, 서브클래스가 알려지지 않은 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용할 경우에는, 모든 가능성을 고려해 PCR법을 실시할 필요가 있다.

구체적으로는, 예를 들어 인간 IgG를 암호화하는 유전자의 수득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1 내지 γ5, 경쇄로서 κ 사슬 및 λ 사슬을 암호화하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머를 이용할 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3' 말단의 프라이머로는 경첩 영역에 해당하는 부분에 어닐링(anneal) 되는 프라이머가 이용된다. 한편 5' 말단의 프라이머로는 각 서브클래스에 해당하는 프라이머를 이용할 수 있다.

중쇄와 경쇄의 각 서브클래스의 유전자 증폭용 프라이머에 의한 PCR 산물은 각각 독립의 라이브러리로 한다. 이렇게 합성된 라이브러리를 이용하여, 중쇄와 경쇄의 조합을 포함하는 면역글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 면역글로불린의 활성을 이용함으로써, EREG에 대한 결합 활성을 지표로서 목적으로 하는 항체를 스크리닝할 수 있다.

예를 들어 EREG에 대한 항체의 수득을 목적으로 할 때, 항체의 EREG에 대한 결합은 특이적인 것이 더욱 바람직하다. EREG에 결합하는 항체는 예를 들어 다음과 같이 스크리닝할 수 있다:

(1) 하이브리도마로부터 수득한 cDNA에 의해 암호화되는 V 영역을 포함하는 항체를 EREG에 접촉시키는 단계;

(2) EREG와 상기 항체와의 결합을 검출하는 단계; 및,

(3) EREG에 결합하는 항체를 선택하는 단계.

항체와 EREG 사이의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 담체에 고정한 EREG에 대해서 피검항체를 반응시킨 후, 상기 피검항체를 인식하는 표지 항체를 반응시킨다. 세척 후에 담체 상의 표지 항체가 검출되었을 때에는, 해당 피검항체의 EREG에의 결합을 증명할 수 있다. 표지로는, 페록시다아제 또는 β-갈락토시다아제 등의 효소 활성 단백질 또는 FITC 등의 형광 물질을 이용할 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해서 EREG를 발현하는 세포의 고정된 표본을 이용할 수 있다.

결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝 방법으로서 파지 벡터를 이용한 패닝법(panning)을 이용할 수도 있다. 상기와 같이 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리으로서 수득했을 경우에는, 파지 벡터를 이용한 스크리닝 방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 암호화하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결함으로써 단쇄 Fv(single-chain Fv: scFv)로 제조된다. scFv를 암호화하는 유전자를 파지 벡터에 삽입하면, scFv를 표면에 발현하는 파지를 얻을 수 있다. 상기 파지를 목적으로 하는 항원과 접촉시키고, 항원에 결합한 파지를 수집함으로써, 목적으로 하는 결합 활성을 갖는 scFv를 암호화하는 DNA를 수득할 수 있다. 목적으로 하는 결합 활성을 갖는 scFv는 필요에 따라 상기 과정을 반복함으로써 농축될 수 있다.

본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전장 항체 또는 항체의 일부를 암호화할 수 있다. "항체의 일부"는 항체 분자의 모든 부분을 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "항체 단편:은 항체의 일부를 나타낸다. 바람직한 본 발명의 항체 단편은 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determination region: CDR)을 포함한다. 즉, 본 발명의 항체 단편은 가변 영역을 구성하는 세 개의 모든 CDR 을 포함한다.

본 발명의 항 EREG 항체의 V 영역을 암호화하는 cDNA를 수득하면, 상기 cDNA의 말단에 도입된 제한효소 위치를 인식하는 제한 효소로 처리된다. 바람직한 제한효소는 상기 항체 유전자를 구성하는 뉴클레오티드 서열에서 나타나지 않는 것을 인식 및 제한한다. 또한, 맞는 방향으로 벡터에 상기 제한처리된 단편의 단일 카피를 삽입하기 위해서, 점착 말단을 제공하는 제한 효소가 바람직하다. 항 EREG 항체 V 영역을 암호화하는, 상기 기술된 대로 제한처리된 cDNA는 항체 발현벡터를 수득하기 위한 적합한 발현 벡터에 도입된다. 상기 단계에서, 키메라 항체는 상기 항체의 보존영역(C 영역)을 암호화하는 유전자를 상기 V 영역을 암호화하는 유전자와 인프레임으로 융합함으로써 수득될 수 있다. 본 명세서에서, "키메라 항체"는 보존영역 및 가변영역이 다른 기원에서 유래한 항체를 나타낸다. 따라서, 마우스-인간 키메라 항체 등의 종간 키메라 항체에 추가로, 인간-인간 종간 키메라 항체도 본 발명의 키메라 항체에 포함된다. 또한 키메라 항체 발현 벡터는 보존영역의 유전자가 도입된 발현벡터에 상기 V 영역의 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있다.

즉, 예를 들면, 상기 V 영역의 유전자를 제한하는 제한 효소 인식 서열은 목적하는 항체의 보존영역(C 영역)을 암호화하는 DNA를 운반하는 발현벡터의 5' 말단에 위치할 수 있다. 상기 키메라 항체 발현 벡터는 상기 제한 효소의 동일한 조압을 이용하여 두 개의 유전자를 제한처리 한 후, 인프레임으로 융합함으로써 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되기 위한 항 EREG 항체를 제조하기 위해, 상기 항체 유전 자는 발현 벡터에 도입되어, 발현 제어 영역의 조절하에서 발현될 수 있다. 상기 항체 발현을 위한 발현 제어 영역은 예를 들어 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 이후, 상기 발현 벡터로 적당한 숙주세포를 형질전환함으로써 항 EREG 항체를 암호화하는 DNA를 발현하는 재조합 세포를 얻을 수 있다.

항체 유전자의 발현하기 위해, 항체 중쇄(H 사슬) 및 경쇄(L 사슬)를 암호화하는 DNA는 각각 다른 발현 벡터에 도입될 수 있다. 동일한 숙주세포에 H 사슬과 L 사슬도입된 벡터를 동시에 형질전환(co-transfect)함으로써 H 사슬과 L 사슬을 포함하는 항체 분자를 발현할 수 있다. 또한, H 사슬 및 L 사슬을 암호화하는 DNA 를 단일 발현 벡터에 도입된 숙주세포를 형질전환시켜서도 발현될 수 있다(국제 공개특허 제 94/11523호 참조).

항체 유전자를 분리하고 이후, 적당한 숙주에 도입하여 상기 유전자를 도입하기 위한 상기 항체를 제조하기 위한 숙주와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이러한 발현계는 본 발명에 적용될 수 있다. 진핵세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포 및 진균류 세포를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용할 수 있는 동물세포로서는 다음과 같은 세포를 예시할 수 있다:

(1) CHO, COS, 골수종, 아기 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK), HeLa 및 Vero 세포 등의 포유동물 세포;

(2) 제노푸스 미숙란(Xenopus oocytes) 등의 양서류 세포; 및,

(3) sf9, sf21, Tn5 등의 곤충 세포.

또는 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아 나 속 유래 세포를 이용한 항체 유전자 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양된 세포를 이용할 수 있다.

또한, 진균류 세포로서는 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다:

효모: 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 사카로마이세스 속 및 예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 및,

사상균; 예를 들면, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스 속.

또는 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들어, 세균 세포를 이용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균(Bacillus subtilis) 등의 세균 세포를 본 발명에 이용할 수 있다.

목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이러한 세포에 형질전환에 의해 도입한다. 형질전환된 세포를 in vitro로 배양함으로써, 상기 형질전환 세포의 배양액으로부터 원하는 항체를 수득할 수 있다.

또한, 상기 숙주세포 외에 재조합형 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물을 이용할 수도 있다. 즉, 목적으로 하는 항체를 암호화하는 유전자가 도입된 동물로부터 상기 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자는 젖 중에서 고유하게 생산되는 단백질을 암호화하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입하는 것에 의해 융합 유전자로서 구축할 수 있다. 젖 중에 분비되는 단백질로서 예를 들어, 염소 β-카세인 등을 이용할 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배아에 주입되고, 상기 배아는 암컷의 염소에 도입된다. 상기 배아 가 수용된 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소(또는 그 자손)가 제조하는 젖으로부터, 원하는 항체를 젖 단백질과의 융합 단백질로서 수득 될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 염소로부터 생산하는 되는 원하는 항체를 포함하는 젖의 량을 증가시키기 위해서, 트랜스제닉 염소에 호르몬을 필요에 따라 사용될 수 있다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

본 발명의 재조합 항체의 C 영역으로서 동물 항체 유래의 C 영역을 사용할 수 있다. 예를 들면 마우스 항체의 H 사슬 C 영역으로서는 Cγ1, Cγ2a, Cγ2b, Cγ3, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2 및 Cε, L 사슬 C 영역으로서는 Cκ 및 Cλ을 사용할 수 있다. 또한, 마우스 항체 이외의 동물 항체로서 래트, 토끼, 염소, 양, 낙타, 원숭이 등의 동물 항체가 사용될 수 있다. 이러한 서열은 공지이다. 또한, 항체의 안정성 또는 그 생산을 개선하기 위해서 C 영역을 변형할 수 있다.

본 발명에서 항체가 인간에 투여되는 경우, 인간에 대한 이종 항원성(xenoantigenicity)을 저하하는 것을 목적으로 인위적으로 변형된 유전자 재조합형 항체 등을 이용할 수 있다. 유전자 재조합형 항체는 예를 들면, 키메라(Chimeric) 항체 및 인간화(Humanized) 항체 등을 포함한다. 이러한 변형된 항체는 공지의 방법을 이용해 제조할 수 있다.

키메라 항체는 서로 유래가 다른 가변영역과 보존영역을 연결한 항체를 말한다. 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 보존영역을 포함하는 항체는 마우스 인간 이종 키메라 항체이다. 마우스 항체의 가변영역을 암호화하는 DNA를 인간 항체의 보존영역을 암호화하는 DNA와 연 결시켜, 이것을 발현 벡터에 삽입하여, 키메라 항체를 발현하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다. 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 세포를 배양하여, 도입된 DNA를 발현시킴으로써 배양 중에 제조되는 상기 키메라 항체를 수득할 수 있다. 키메라 항체 및 인간화 항체의 C 영역에는 인간 항체의 C 영역이 사용된다.

예를 들면 H 사슬의 C 영역에 대해서는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2 및 Cε 영역이 이용될 수 있다. 또한, L 사슬 C 영역으로서는 Cκ 및 Cλ을 사용할 수 있다. 이러한 C 영역의 아미노산 서열 및 그것을 암호화하는 염기서열은 공지이다. 또한, 항체의 안정성 또는 그 생산을 개선하기 위해서 C 영역을 변형할 수 있다.

일반적으로 키메라 항체는 인간 이외의 동물 유래 항체의 V 영역과 인간 항체 유래의 C 영역으로 구성된다. 반면에 인간화 항체는 인간 이외의 동물 유래 항체의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)과 인간 항체 유래의 구조형성 영역(FR: framework region) 및 인간 항체 유래의 C 영역으로 구성된다. 인간화 항체는 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하하였기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로 유용하다.

예를 들어, 본 발명에 근거해 제조된 항 EREG 단일클론 항체(B3#18)의 가변영역과 인간 항체의 보존영역을 구성하는 아미노산 서열을 연결하여 수득할 수 있는 마우스-인간 키메라 항체는 본 발명에서 단일클론 항체로서 바람직하다. 즉 본 발명은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬과 L 사슬을 포함하는 마우스-인간 키메라 단일클론 항체를 제공한다.

H 사슬: 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열 중 1~446번째의 아미노산 서열(-19 내지 -1 위치의 신호서열을 제외한 서열)

L 사슬: 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열 중 1~213번째의 아미노산 서열(-20 내지 -1 위치의 신호서열을 제외한 서열)

또한 본 발명의 키메라 항체의 바람직한 다른 예로서 이하의 항체를 들 수 있다.

서열번호 129로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 H 사슬 및 서열번호 131로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 항체.

서열번호 133으로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 H 사슬 및 서열번호 135로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 항체.

서열번호 137로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 H 사슬 및 서열번호 139로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 항체.

서열번호 141로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 H 사슬 및 서열번호 143으로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 항체.

서열번호 145로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 H 사슬 및 서열번호 147로 기재된 아미노산 서열에 대해 신호서 열(-19 내지 -1)을 제외한 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 항체.

항체의 가변영역은 통상적으로 4개의 구조형성 영역(FR)에 의해 분리되는 3개의 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은 다른 결합 특이성을 가지는 항체 사이에서도 높은 상동성을 나타내는 것이 많다. 그 때문에, 일반적으로 CDR의 이식에 의해 특정 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식할 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리운다. 구체적으로는, 인간 이외의 동물, 예를 들어 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 수득하기 위한 일반적인 유전자 재조합 기법도 알려져 있다.

구체적으로는, 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서 예를 들어 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에서는, 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에 이식해야 할 마우스 항체의 CDR을 암호화하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR에 대해 각각 준비된다. 일반적으로, 마우스 CDR이 인간 FR에 이식되는 경우는, 마우스의 FR과 상동성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이 CDR의 기능의 유지에 유리하다. 즉, 일반적으로 이식해야 할 마우스 CDR에 인접하고 있는 FR의 아미노산 서열과 상동성이 높은 아미노산 서열을 포함하는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.

또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임(in frame)으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머를 이용하여 인간 FR이 개별적으로 합성되었다. 그 결과, 마우스 CDR을 암호화하는 DNA가 각 FR을 암호화하는 DNA에 부가된 산물을 수득하였다. 각 산물의 마우스 CDR을 암호화하는 염기서열은 서로 오버랩하도록 디자인되었다. 이후, 인간 항체 유전자를 주형으로서 합성된 산물의 오버랩 CDR 부분을 서로 어닐링 하여 상보가닥 합성 반응을 하였다. 상기 반응에 의해, 인간 FR에 마우스 CDR의 서열을 개입시켜 연결되었다.

최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V 영역 유전자는, 그 5' 말단 및 3' 말단에 연결되는, 적당한 제한 효소 인식 서열이 부가된 프라이머에 의해 그 전장이 증폭된다. 상기 수득된 DNA와 인간 항체 C 영역을 암호화하는 DNA를 인프레임으로 연결하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간 항체 발현용 벡터를 제조할 수 있다. 상기 통합(integration) 벡터를 숙주에 도입해 재조합 세포를 제조한 후에, 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 인간화 항체를 암호화하는 DNA를 발현시킴으로써 상기 인간화 항체가 상기 배양 세포의 배양액 중에 제조되었다(유럽 공개특허 제 239,400호 및 국제 공개특허 제 96/02576호 참조).

상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에 대한 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정 및 평가하여, CDR을 개입시켜 연결되었을 때에 상기 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하도록 하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환할 수도 있다. 예를 들어, 마우스 CDR과 인간 FR의 융합을 이용한 PCR법을 적용하여, FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머를 이용하여 합성된 FR에는 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 돌연변이형 항체의 항원에 대한 결합 활성을 상기의 방법으로 측정 및 평가하여 원하는 성질을 가지는 변이 FR 서열을 선택할 수 있다(Sato, K. et al ., Cancer Res. 1993, 53, 851-856).

또한, 인간 항체의 수득 방법도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 림프구를 in vitro로 원하는 항원 또는 원하는 항원을 발현하는 세포로 감작 한다. 이후, 감작된 림프구를 인간 골수종 세포 융합하여, 항원에 대한 결합 활성을 가지는 원하는 인간 항체를 수득할 수 있다(일본공개특허 제1-59878호 참조). 융합 파트너로 인간 골수종 세포에는, 예를 들면 U266 등을 이용할 수 있다.

또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 가지는 트랜스제닉 동물을, 원하는 항원으로 면역화하여 원하는 인간 항체를 수득할 수 있다(국제 공개특허 제 93/12227호, 제 92/03918호, 제 94/02602호, 제 94/25585호, 제 96/34096호 및 제 96/33735호 참조). 또한, 인간 항체 라이브러리를 패닝하여 인간 항체를 수득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 V 영역을 단쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이 방법을 이용하여 파지 표면에 발현하고, 상기 항원에 결합하는 파지를 선별할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 분석하여, 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA 서열이 결정될 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 상기 V 영역 서열을 원하는 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임 으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조하였다. 상기 발현 벡터를 상기 기술된 것 중 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 상기 인간 항체를 암호화하는 유전자를 발현시켜 상기 인간 항체를 수득할 수 있다. 이러한 방법은 이미 공지이다(국제 공개특허 제 92/01047호, 제 92/20791호, 제 93/06213호, 제 93/11236호, 제 93/19172호, 제 95/01438호 및 제 95/15388호 참조).

본 발명에서 사용되는 항체에는 EREG 단백질에 결합하는 한, IgG로 대표되는 2가항체(bivalent antibodies) 뿐만이 아니라, 단가 항체(monovalent antibodies) 및 IgM으로 대표되는 다가 항체(multivalent antibodies)도 포함한다. 본 발명의 다가 항체에는 모두 같은 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체 또는 일부 또는 모두 다른 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체가 포함된다. 본 발명으로 사용되는 항체는 항체의 전장 분자에 한정되지 않고, EREG 단백질에 결합하는 한, 저분자화 항체 또는 그 수식물도 포함한다.

저분자화 항체는 전장 항체(예를 들면 전장 IgG 등)의 일부분이 결손하고 있는 항체 단편을 포함한다. EREG 항원에 결합 활성을 가지는 한, 항체 분자의 부분적인 결손은 허용된다. 본 발명에서 항체 단편은 중쇄가변영역(VH) 및/또는 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 것이 바람직하다. VH 또는 VL의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입이 포함될 수 있다. 또한, EREG 항원에 결합 활성을 가지는 한, VH 및/또는 VL의 일부를 결손 시킬 수도 있다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화될 수 있다. 항체 단편의 구체적인 예로서는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 또한, 저분자화 항체의 구체적인 예로서는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (단쇄 Fv), 다이아바디(diabody) 및 sc(Fv)2(단쇄 (Fv)2) 등을 들 수 있다. 이것들 항체의 다량체(예를 들면, 이량체, 삼량체, 사량체 및 다량체)도 본 발명의 저분자화 항체에 포함된다.

항체의 단편은 항체를 효소로 처리하여 항체 단편을 생성시킴으로써 수득될 수 있다. 항체 단편을 생성하는 효소로서 예를 들면 파파인(papain), 펩신 또는 프라스민(plasmin) 등이 공지이다. 또는, 상기 항체 단편을 암호화하는 유전자를 구축하여, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킬 수 있(예를 들면, Co, M. S. et al ., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976: Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989)178, 476-496: Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989)178, 476-496 Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663: Rousseaux, J. et al ., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669: 및 Bird, R. E. et al ., TIBTECH (1991) 9, 132-137 참조).

소화 효소는 항체 단편의 특정 위치를 절단하여, 다음과 같은 특정 구조의 항체 단편을 제공한다. 이러한 효소적으로 제조된 항체 단편에 대해서, 유전자 공학적 기법을 이용하면, 항체의 임의의 부분을 결실할 수 있다.

파파인(papain) 소화: F(ab)2 또는 Fab

펩신(pepsin) 소화: F(ab')2 또는 Fab'

프라스민(plasmin) 소화: Facb

따라서, 본 발명에서 저분자화 항체는 EREG에 대한 결합 친화성을 가지는 한, 임의의 영역을 결실한 항체 단편일 수 있다. 추가로, 본 발명에 따라, 암 등 의 세포 증식성 질환의 치료에 대해서 항체는 이펙터 활성을 유지하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서 바람직한 저분자화 항체는, EREG에 대한 결합 친화도와 이펙터 기능을 가진다. 항체의 이펙터 기능에는 ADCC 활성 및 CDC 활성이 포함된다. 본 발명의 치료용 항체는 특히 바람직하게는, ADCC 활성 및 CDC 활성을 이펙터(effector) 기능으로서 가진다.

다이아바디는 유전자 융합에 의해 구축된 이가 항체의 단편을 나타낸다(Hollinger P. et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); 유럽 공개특허 제 404,097호; 국제 공개특허 제 93/11161호 등). 다이아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 이량체로, 유전적으로 이량체를 구성하는 각 폴리펩티드 사슬은 각각 같은 사슬에서 VL 및 VH가 링커에 의해 결합된다. 다이아바디에 있어서의 링커는, 일반적으로 VL와 VH 사이의 결합을 억제하도록 충분이 짧다. 구체적으로는, 링커를 구성하는 아미노산 잔기는 예를 들면 5개 잔기 정도이다. 따라서, 동일 폴리펩티드 사슬에 의해 암호화되는 VL와 VH는 단쇄 가변영역 단편을 형성하지 못하고, 다른 단쇄 가변영역 단편과 2량체를 형성한다. 그 결과, 다이아바디는 2개의 항원 결합 부위를 가지게 된다.

scFv는 항체의 H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역을 연결하여 수득할 수 있다. scFv에서, H 사슬 V 영역과 L 사슬 V 영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 개입시켜 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 5879-5883). scFv의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역은 본 명세서에 기재된 모든 항체에서 유래할 수 있다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커에는 특히 제한은 없다. 예를 들면 3 내지 25 잔기 정도로 구성되는 임의의 단쇄 펩티드를 링커로서 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 하기 기재될 펩티드 링커 등을 이용할 수 있다.

V 영역은 예를 들어 상기와 같은 PCR법에 따라 연결될 수 있다. PCR법에 의한 V 영역의 연결을 위해서, 우선 하기 DNA 중에서 선택된, 전체 DNA 또는 원하는 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA가 주형으로서 이용된다:

상기 항체의 H 사슬 또는 H 사슬 V 영역을 암호화하는 DNA 서열; 및,

상기 항체의 L 사슬 또는 L 사슬 V 영역을 암호화하는 DNA 서열.

증폭해야 할 DNA의 양단의 서열에 대응하는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용한 PCR법에 따라 H 사슬과 L 사슬의 V 영역을 암호화하는 DNA를 각각 증폭한 후, 상기 펩티드 링커 일부분을 암호화하는 DNA를 제조하였다. 상기 펩티드 링커를 암호화하는 DNA도 PCR을 이용해 합성할 수 있다. 이때 이용하는 프라이머의 5' 말단에 합성된 각 V 영역의 증폭 산물과 연결할 수 있는 염기서열을 부가해 둔다. 이후, "H 사슬 V 영역 DNA", "펩티드 링커 DNA" 및 "L 사슬 V 영역 DNA"와 어셈블리 PCR용 프라이머를 이용해 PCR 반응을 한다.

어셈블리 PCR용의 프라이머는 "H 사슬 V 영역 DNA"의 5' 끝에 어닐링 하는 프라이머와 "L 사슬 V 영역 DNA"의 3' 끝에 어닐링 하는 프라이머의 조합으로 구성된다. 즉 어셈블리 PCR용 프라이머란 합성해야 할 scFv의 전장 서열을 암호화하는 DNA를 증폭하는 프라이머 셋트로, 한편 "펩티드 링커 DNA"에 각 V 영역 DNA와 연결할 수 있는 염기서열이 부가되고 있다. 그 결과, 이러한 DNA가 연결되어 어셈블리 PCR 용 프라이머를 사용하여 최종적으로 scFv의 전장이 증폭 산물로서 생성된다. 일단 scFv를 암호화하는 DNA가 제작되면, 상기 DNA를 함유하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 세포가 일반적인 방법에 따라 수득될 수 있다. 또한, 그 결과 수득한 재조합 세포를 배양하고, 상기 scFv를 암호화하는 DNA를 발현시켜 상기 scFv가 수득될 수 있다.

sc(Fv)2는 2개의 VH 및 2개의 VL을 링커 등으로 결합하여 단쇄로 형성한 저분자화 항체이다(Hudson et al., J. Immunol. Methods 1999: 231: 177-189). sc(Fv)2는 예를 들면, scFv를 링커로 연결하여 제작될 수 있다.

또한 2개의 VH 및 2개의 VL을 단쇄 폴리펩티드의 N 말단을 기점으로서 VH, VL, VH 및 VL([VH]-링커-[VL]-링커-[VH]-링커-[VL])의 순서로 정렬하는 것을 특징으로 하는 항체가 바람직하다.

2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특히 상기 배치로 한정되지 않고, 어떠한 순서로도 정렬될 수 있다. 예를 들면 이하와 같은 배치도 포함된다:

[VL]-링커-[VH]-링커-[VH]-링커-[VL]

[VH]-링커-[VL]-링커-[VL]-링커-[VH]

[VH]-링커-[VH]-링커-[VL]-링커-[VL]

[VL]-링커-[VL]-링커-[VH]-링커-[VH]

[VL]-링커-[VH]-링커-[VL]-링커-[VH]

항체의 가변영역을 결합하는 링커로서는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커 또는 합성 화합물 링커(예를 들면, Protein Engineering, 9(3), 29 9-305, 1996 참조)에 개시되는 링커 등을 이용할 수 있다. 본 발명에서, 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적당히 선택할 수 있다. 통상적으로 펩티드 링커를 구성하는 아미노산 잔기는 1에서 100개의 아미노산, 바람직하게는 3에서 50개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5에서 30개의 아미노산, 특히 바람직하게는 12에서 18개의 아미노산(예를 들면, 15개의 아미노산)이다.

펩티드 링커를 구성하는 아미노산 서열은 scFv의 결합 활성을 저해하지 않는 한 임의의 서열일 수 있다. 예를 들면, 펩티드 링커의 경우 다음과 같은 아미노산 서열을 이용할 수 있다:

Ser

Gly-Ser

Gly-Gly-Ser

Ser-Gly-Gly

Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 23)

Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호 24)

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 25)

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열번호 26)

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 27)

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열번호 28)

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 29)

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열번호 30)

[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 31)]n

[Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열번호 32)]n

[n은 1 이상의 정수이다]

펩티드 링커의 아미노산 서열은 목적에 따라 당업자가 적당히 선택할 수 있다. 예를 들어 상기 펩티드 링커의 길이를 결정하는 n은 통상적으로 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3, 더욱 바람직하게는 1 또는 2이다.

따라서 본 발명에서 sc(Fv)2의 특히 바람직한 구체화에서는, 예를 들면 이하의 sc(Fv)2가 있다:

[VH]-펩티드 링커(15개의 아미노산)-[VL]-펩티드 링커(15개의 아미노산)-[VH]-펩티드 링커(15개의 아미노산)-[VL]

또는, 합성 화합물 링커(화학 가교제)를 이용해 V 영역을 연결할 수도 있다. 펩티드 화합물 등의 가교에 통상적으로 이용되고 있는 가교제를 본 발명에 이용할 수 있다. 예를 들면 다음과 같은 화학 가교제가 공지이다. 이러한 가교제는 시판되고 있다:

N-하이드록시 숙신아마이드(N-hydroxy succinimide: NHS);

디숙신이니미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate: DSS);

비스(설포숙시니미딜) 수페레이트[bis(sulfosuccinimidyl) suberate: BS3];

디티오비드(숙시니미딜 프로피오네이트)[dithiobis(succinimidyl propionate): DSP];

디티오비스(숙시니미딜 프로피오네이트)[dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate): DTSSP];

에틸렌글리콜비스(숙시니미딜 숙시네이트)[ethylene glycol bis(succinimidyl succinate): EGS];

에틸렌글리콜비스(설포숙시니미딜 숙시네이트)[ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate): sulfo-EGS];

디숙시니미딜 타트레이트(disuccinimidyl tartrate: DST);

디설포숙시니미딜 타트레이트(disulfosuccinimidyl tartrate: sulfo-DST);

비스[2-(숙시니미드옥시카보닐옥시)에틸] 설폰{bis[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl] sulfone: BSOCOES}; 및,

비스[2-(설포숙시니미드옥시카보닐옥시)에틸] 설폰{bis[2-(sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl] sulfone; sulfo-BSOCOES}.

4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는, 통상적으로 3개의 링커가 필요하다. 복수의 링커는 같거나 다른 링커를 이용할 수 있다. 본 발명에서, 바람직한 저분자화 항체는 다이아바디 또는 sc(Fv)2로, 상기 저분자화 항체를 얻으려면 항체를 효소, 예를 들면, 파파인, 펩신 등으로 처리하여 항체 단편을 제조할 수 있다. 또는 상기 항체 단편을 암호화하는 DNA를 구축하여, 이것을 발현 벡터에 도입하고 적당한 숙주세포에서 발현함으로써 제조할 수 있다(예를 들면, Co, M. S. et al ., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976: Better, M. & Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496: Pluckthun, A. & Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515: Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663: Rousseaux, J. et al ., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669: 및 Bird, R. E. & Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 참조).

모든 EREG 인식 항체는 본 발명의 항체로 이용될 수 있다. 바람직한 항체에는 하기 (1) 내지 (57)의 항체를 포함한다. 예를 들어, 상기 항체는 전장 항체, 저분자화 항체, 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다:

(1) CDR1로서 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 H 사슬CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 H 사슬 CDR2의 서열) 및 CDR3으로서 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 H 사슬 CDR3의 서열)을 가지는 H 사슬을 포함하는 항체;

(2) (1)에 있어서, CH(H 사슬의 보존영역)로서 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 CH의 서열)의 117 내지 452번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(3) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열(마우스-인간 키메라 DF151 항체의 CH 서열)을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(4) CDR1로서 서열번호 12로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 L 사슬 CDR1의 서열), CDR2로서 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 L 사슬 CDR2의 서열) 및 CDR3으로서 서열번호 16으로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 L 사슬 CDR3의 서열)을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(5) (4)에 있어서, CL(L 사슬의 보존영역)로서 서열번호 18로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 CL의 서열)의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(6) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열(마우스-인간 키메라 B3#18 항체의 CL의 서열)의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(32) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 159로 기재된 아미노산 서열의 109 내 지 215번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(41) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 163으로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 체;

(57) (1) 내지 (56) 중 어느 하나의 항체의 저분자화 항체;

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (1)의 H 사슬에 있어서 VH의 예로서는, 서열번호 44로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 VH의 서열)을 가지는 VH가 있다:

CDR1: 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열[B3#18(EP27) 항체의 H 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열[B3#18(EP27) 항체의 H 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열[B3#18(EP27) 항체의 H 사슬 CDR3의 서열].

또한, 상기 (4)의 L 사슬에 있어서 VL의 예로서는, 서열번호 46으로 기재된 아미노산 서열(B3#18 항체의 VL의 서열)을 가지는 VL이 있다:

CDR1: 서열번호 12로 기재된 아미노산 서열[B3#18(EP27) 항체의 L 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열[B3#18(EP27) 항체의 L 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 16으로 기재된 아미노산 서열[B3#18(EP27) 항체의 L 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (10)의 H 사슬에 있어서 VH의 예로서는, 서열번호 109로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 VH의 서열]을 가지는 VH가 있다:

CDR1: 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 H 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 51로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 H 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 53으로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 H 사슬 CDR3 의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (13)의 L 사슬에 있어서 VL의 예로서는, 서열번호 111로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 VL의 서열]을 가지는 VL이 있다:

CDR1: 서열번호 55로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 L 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 57로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 L 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 59로 기재된 아미노산 서열[C7(EP03) 항체의 L 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (19)의 H 사슬에 있어서 VH의 예로서는, 서열번호 113으로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 VH의 서열]을 가지는 VH가 있다:

CDR1: 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 H 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 H 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 H 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (22)의 L 사슬에 있어서 VL의 예로서는, 서 열번호 115로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 VL의 서열]을 가지는 VL이 있다:

CDR1: 서열번호 67로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 L 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 L 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 71로 기재된 아미노산 서열[#15(EP08) 항체의 L 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (28)의 H 사슬에 있어서 VH의 예로서는, 서열번호 117로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 VH의 서열]을 가지는 VH가 있다:

CDR1: 서열번호 73으로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 H 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 75로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 H 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 77로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 H 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (31)의 L 사슬에 있어서 VL의 예로서는, 서열번호 119로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 VL의 서열]을 가지는 VL이 있다:

CDR1: 서열번호 79로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 L 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 81로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 L 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 83으로 기재된 아미노산 서열[B2#30(EP20) 항체의 L 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (37)의 H 사슬에 있어서 VH의 예로서는, 서열번호 121로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 VH의 서열]을 가지는 VH가 있다:

CDR1: 서열번호 85로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 H 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 87로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 H 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 89로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 H 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (40)의 L 사슬에 있어서 VL의 예로서는, 서열번호 123으로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 VL의 서열]을 가지는 VL이 있다:

CDR1: 서열번호 91로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 L 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 93으로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 L 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 95로 기재된 아미노산 서열[B3#8(EP24) 항체의 L 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (46)의 H 사슬에 있어서 VH의 예로서는, 서열번호 125로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 VH의 서열]을 가지는 VH가 있다:

CDR1: 서열번호 97로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 H 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 99로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 H 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 101로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 H 사슬 CDR3의 서열].

아래와 같은 CDR을 가지는, 상기 (49)의 L 사슬에 있어서 VL의 예로서는, 서열번호 127로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 VL의 서열]을 가지는 VL이 있다:

CDR1: 서열번호 103으로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 L 사슬 CDR1의 서열];

CDR2: 서열번호 105로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 L 사슬 CDR2의 서열]; 및,

CDR3: 서열번호 107로 기재된 아미노산 서열[B3#41(EP29) 항체의 L 사슬 CDR3의 서열].

또한, 상기 (1) 내지 (57)의 항체에는, 단가 항체뿐만 아니라 2가 이상의 항체도 포함된다. 본 발명의 다가 항체에는 모두 같은 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체 또는 일부 또는 모두 다른 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체가 포함된다.

상기 (55)의 항체의 바람직한 구체화는, CDR에 변형이 생기지 않은 항체이다. 일례로서 상기 (55)의 항체 가운데, "(1)의 항체에 대해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체 및 (1)의 항체와 동등한 활성을 가지는 항체"의 바람직한 구체화는, "(1)의 항체와 동등의 활성을 가지고, (1)의 항체에 대해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로, CDR1로서 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 항체"이다. 상기 (55)의 항체 가운데, 그 외의 항체의 바람직한 구체화도 이와 같이 표현할 수 있다.

폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법은, 특정 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제조하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법 중 하나이다. 예를 들면, 당업자이면 부위 특이적 돌연변이 유발법(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413) 등을 이용해, 본 발명의 항체에 적당 변이를 도입함으로써, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 제조할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연적으로 발생할 수도 있다. 이와 같이, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산이 변이한 아미노산 서열을 가지고 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체도 본 발명의 항체에 포함된다.

이러한 변이체에 있어서의, 변이되는 아미노산수는, 통상적으로 50개의 아미노산 이내이며, 바람직하게는 30개의 아미노산 이하이며, 더욱 바람직하게는 10개의 아미노산 이하(예를 들면, 5개의 아미노산 이하)이다.

아미노산 측쇄의 성질이 보존되면서 아미노산 잔기에 있어서, 아미노산에 돌연변이 되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질에 의존적으로, 다음과 같은 분류가 확립돼 있다:

소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y 및 V);

친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S 및 T);

지방족 측쇄를 가지는 아미노산(G, A, V, L, I 및 P);

수산기 함유 측쇄를 가지는 아미노산(S, T 및 Y);

유황 원자 함유 측쇄를 가지는 아미노산(C 및 M);

카복실 산 및 아미드 함유 측쇄를 가지는 아미노산(D, N, E 및 Q);

염기성 측쇄를 가지는 아미노산(R, K 및 H); 및.

방향족 환 함유 측쇄를 가지는 아미노산(H, F, Y 및 W)

(괄호 내는 모두 아미노산의 한 글자 표기를 나타낸다).

특정 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산 잔기로 치환된, 변형된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. et al ., Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413). 즉, 일반적으로 특정 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열 중 각 군으로 분류된 아미노산은 서로 치환했을 때에, 상기 폴리펩티드의 활성이 유지될 가능성이 크다고 여겨지고 있다. 본 발명에서, 상기 아미노산 군 내에서 아미노산 간의 치환을 보존적 치환으로 나타낸다.

또한 본 발명에서 개시된 항 EREG 항체에 대해 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 즉 본 발명은 상술의 (l) 내지 (57)의 몇 개의 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 항체와 그 용도에 관한 것이다. 이러한 항체는 예를 들면 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다.

두 개의 항체가 동일한 에피토프와 경쟁하는 것을 확인함으로써, 피검항체가 어느 항체와 특정 항체의 에프토프를 공유하는 지를 확인할 수 있다. 항체 사이의 경쟁은 교차 차단 분석법(cross-blocking assay) 등에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면 경쟁적 ELISA 분석은 바람직한 교차 차단 분석법이다.

구체적으로는, 교차 차단 분석법에 대해서 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅한 EREG 단백질을 후보의 경쟁 항체가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 사전 인큐베이션된 후에, 본 발명의 항 EREG 항체를 첨가하였다. 웰 중의 EREG 단백질에 결합한 본 발명의 항 EREG 항체의 양은 동일한 에피토프와 결합을 경쟁하는 후보의 경쟁 항체(피검항체)의 결합력에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일한 에피토프에 대한 피검항체의 친화성이 커질수록, 본 발명의 항 EREG항체의 EREG 단백질을 코팅한 웰에서의 결합 활성은 저하된다. 또는 반대로 동일한 에피토프에 대한 피검항체의 친화성이 커질수록, 피검항체의 EREG단백질을 코팅한 웰에의 결합 활성은 증가한다.

웰에 결합한 항체량은 미리 항체를 표지해 두는 것에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 예를 들어, 비오틴 표지 된 항체는 아비딘 페록시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용하여 측정할 수 있다. 페록시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 차단 분석법을 특히 경쟁적 ELISA 분석이라고 말한다. 항체는 검출 또는 측정가능한 다른 표지 물질로 표지할 수 있다. 구체적으로는, 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.

더욱 피검항체가 본 발명의 항 EREG 항체와 다른 종에 유래하는 보존영역을 가지는 경우에는, 웰에 결합한 항체 중 하나는 보존영역을 인식하는 표지 항체에 의해 측정될 수 있다. 또는 동종 유래의 항체에서, 클래스가 상위한 경우에는 각 클래스를 식별하는 항체에 의해 웰에 결합한 항체를 측정할 수 있다.

후보의 경쟁 항체가 없는 조건에서 실시되는 대조군 실험에서 수득한 결합 활성과 비교하여, 후보 항체는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20-50%, 한층 더 바람직하게는 적어도 50%의, EREG 항체의 결합을 차단한다면, 상기 후보의 경쟁 항체는 본 발명의 항 EREG 항체와 실질적으로 같은 에피토프에 결합하거나 같은 에피토프에의 결합에 대해서 경쟁하는 항체이다. 항 EREG 항체가 결합하는 에피토프와 같은 에피토프에 결합하는 항체로서는, 예를 들면, 상기 (57)의 항체를 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 (1) 내지 (57)의 항체에는, 상술한 대로 단가 항체 및 다가 항체를 포함한다. 본 발명의 다가 항체에는 모두 같은 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체 또는 일부 또는 모두 다른 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체가 포함된다.

항체의 수식물로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 또한, 항체에 화학요법제, 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등을 결합하는 것도 가능하다. 이러한 항체 수식물(이하, 항체 콘쥬게이트)은 수득된 항체를 화학적으로 변형하여 수득할 수 있다. 항체의 변형 방법은 당 분야에 있어 이미 확립되어 있다. 하기에 기재할 것처럼, EREG 단백질뿐만 아니라, 화학요법제, 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등을 인식하도록 유전자 재조합 기술을 이용하여 설계한 이중 특이성 항체(bispecific antibody)와 같은 분자형으로서 수득될 수도 있다. 본 발명에서, "항체"에는 이러한 항체도 포함된다.

항 EREG 항체에 결합시켜 세포독성 활성을 우도시키는 화학요법제로서는, 예를 들어 다음과 같은 화학요법제를 예시할 수 있다:

아자리빈(azaribine), 아나스트로졸(anastrozole), 아자시티딘(azacytidine), 블레오마이신(bleomycin), 볼테조닙(bortezomib), 브리오스태틴-1(bryostatin-1), 부설판(busulfan), 캠토테신(camptothecin), 10-하이드록시캠토테신(10-hydroxycamptothecin), 카뮤스틴(carmustine), 셀레브렉스(celebrex), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 카보플라틴(carboplatin), 클라드리빈(cladribine), 싸이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카바진(dacarbazine), 도세탁셀(docetaxel), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노마이신 글루쿠로니드(daunomycin glucuronide), 다우노루비신(daunorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 독소루비신(doxorubicin), 독소루비신 글루쿠로니드(doxorubicin glucuronide), 에피루비신(epirubicin), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 에스트라무스틴(estramustine), 에도폽시드(etoposide), 에도폽시드 글루쿠로니드(etoposide glucuronide), 플록수리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 플루타미드(flutamide), 플루오로우라실(fluorouracil), 플록시메스테론(fluoxymesterone), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 루코보린(leucovorin), 로무스틴(lomustine), 메클로레타민(mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate), 메게스테롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜 팔란(melphalan), 머캡토푸린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미톡쟌트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토테인(mitotane), 페닐부틸레이트(phenylbutyrate), 프레드니손(prednisone), 프로카르바진(procarbazine), 파클리탁셀(paclitaxel), 펜토스타틴(pentostatin), 세무스틴 스트렙토조신(semustine streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 탁사네스(taxanes), 택솔(taxol), 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate), 탈리도마이드(thalidomide), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 우라실 머스타드(uracil mustard), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine) 및 빈크리스틴(vincristine).

본 발명에서, 바람직한 화학요법제는 저분자량의 화학요법제이다. 저분자량의 화학요법제는 항체와 결합한 후에 항체의 기능을 방해하지 않을 것이다. 본 발명에서 저분자량의 화학요법제는 일반적으로 100 내지 200의 분자량, 바람직하게는 200 내지 1000의 분자량을 갖는다. 본 명세서에서 설명한 화학요법제의 예로는 분자량이 낮은 화학요법제는 모두 가능하다. 본 발명의 화학요법제는 in vivo에서 활성형 화학요법제로 전환되는 프로드럭(prodrug)을 포함한다. 프로드럭 활성화는 효소적 전환 또는 비-효소적 전환일 수 있다.

또한, 상기 항체는 리신(ricin), 아브린(abrin), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 온코나아제(onconase), DNase I, 스타필로코칼 엔테로독신-A(Staphylococcal enterotoxin-A), 포크위드 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein), 겔로닌(gelonin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonas exotoxin), 슈도모나스 엔도톡신(Pseudomonas endotoxin), L-아스파라기아나제(L-asparaginase) 및 PEG L-아스파라기아나제 등의 독성 펩티드를 이용하여 변형될 수 있다. 다른 구체화에서, 하나 이상의 저분자량 화학요법제 및 독성 펩티드를 조합하여 항체를 변형하는 데에 사용할 수 있다. 항 EREG 항체 및 상기 저분자량 화학요법제 사이의 결합은 공유 결합 또는 비 공유결합일 수 있다. 상기 화학요법제 등에 결합한 항체의 제조 방법은 공지이다.

또한, 단백질성(proteinaceous) 약제 또는 독소는 유전자 재조합 기술에 의해 항체에 결합될 수 있다. 구체적으로, 예를 들면 상기 독소 펩티드를 암호화하는 DNA를 항 EREG 항체를 암호화하는 DNA와 인프레임으로 융합하고 이를 발현 벡터에 도입함으로써 재조합 벡터를 구축하는 것이 가능하다. 상기 벡터는 적당한 숙주에 도입되고, 상기 형질전환된 세포를 배양하여 도입된 DNA를 발현한다. 따라서, 독소 펩티드에 결합한 항 EREG 항체는 융합 단백질로 수득될 수 있다. 융합 단백질로서의 항체를 수득할 때, 상기 단백질성 약제 또는 독소는 일반적으로 항체의 C 말단에 위치한다. 펩티드 링커는 상기 항체 및 상기 단백질성 약제 또는 독소 사이에 위치할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 이중 특이성 항체일 수 있다. 이중 특이성 항체란, 다른 에피토프를 인식하는 가변영역을 하나의 항체 분자 내에 가지는 항체를 말한다. 본 발명에서 이중 특이성 항체는 EREG 분자 상의 다른 에피토프를 인식하는 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 이러한 이중 특이성 항체는 1 분자의 EREG에 대해서 2 분자의 항체 분자를 결합할 수 있다. 그 결과, 더욱 강력한 세포독성 작용을 기대할 수 있다.

또는, 한편의 항원 결합 부위가 EREG를 인식하여, 다른 편의 항원 결합 부위가 세포독성 물질을 인식하는 이중 특이성 항체일 수도 있다. 구체적으로는, 세포독성 물질에는 화학요법제, 독성 펩티드 및 방사성 화학물질 등이 포함된다. 이러한 이중 특이성 항체는 EREG를 발현하고 있는 세포에 결합하는 한편, 세포독성 물질을 포획한다. 그 결과, 세포독성 물질을 EREG 발현 세포에 직접 작용시킬 수 있다. 즉 세포독성 물질을 인식하는 이중 특이성 항체에 의해 종양 세포를 특이적으로 방해하여 종양 세포의 증식을 억제할 수 있다.

또한 본 발명에서, EREG 이외의 항원을 인식하는 이중 특이성 항체를 조합할 수도 있다. 예를 들어, EREG와 유사하게 표적으로 하는 암 세포의 세포 표면에 특이적으로 발현하는 EREG 이외의 항원을 인식하는 이중 특이성 항체를 조합할 수 있다.

이중 특이성 항체를 제조하기 위한 방법은 공지이다. 예를 들어, 인식 항원이 다른 2 종류의 항체를 결합시켜 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다. 결합되는 항체는 각각 H 사슬과 L 사슬을 가지는 1/2 분자일 수 있고, 또는 H 사슬만으로 구성되는 1/4 분자일 수 있다. 또는, 다른 단일클론 항체를 제조하는 하이브리도마를 융합시켜, 이중 특이성 항체를 생산하는 융합 세포를 제작할 수도 있다. 또한, 유전자 공학적 기법에 의해 이중 특이성 항체를 제작할 수 있다.

앞서 기술된 대로 제조된 항체 유전자는 공지의 방법에 따라 발현될 수 있 다. 포유동물 세포의 경우, 발현될 항체 유전자를 상용되는 유용한 프로모터 및 상기 항체 유전자의 3' 하류에 폴리A 신호를 작동가능하게 연결함으로써 발현될 수 있다. 상기 프로모타/인핸서의 예로는, 인간 사이토메갈로바이러스 초기 프로모타/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.

또한, 그 외에 바이러스 프로모터/인핸서 또는 포유동물 세포 유래 인간 신장 인자 1α(human elongation factor 1α: HEF1α) 등을 항체 발현에 사용할 수 있다. 프로모터/인핸서를 이용할 수 있는 바이러스로의 구체적인 예로는, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스 및 유인원 바이러스 40(simian virus 40: SV40) 등을 포함하는 것들이 사용될 수 있다.

SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우 Mulligan 등의 방법(Nature (1979) 277, 108)을 이용할 수 있다. 또한, HEF1α 프로모터/인핸서는 Mizushima등의 방법(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 의해, 용이하게 목적 유전자의 발현에 이용할 수 있다.

대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터 및 항체 분비를 위한 신호서열을 발현될 항체 유전자와 작동가능하게 연결함으로써 상기 유전자를 발현할 수 있다. 프로모터로서는 예를 들면 lacZ 프로모터 및 araB 프로모터를 포함한다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우는 Ward등의 방법(Nature (1989) 341, 544-546: FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)을 이용할 수 있다. 또는 araB 프로모터는 Better등의 방법(Science (1988) 240, 1041-1043)에 의해 목적 유전자의 발현에 이용할 수 있다.

항체 분비를 위한 신호서열로서는, 대장균의 세포질(periplasm)에 제조시키는 경우, pelB 신호서열(Lei, S. P. et al ., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용할 수 있다. 세포질에 제조된 항체를 분리한 후, 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 우레아 등의 단백질 변성체를 사용하여 항체 구조를 재접힘시킴으로써, 상기 항체가 원하는 결합 활성을 가지도록 한다.

발현 벡터에 삽입되는 복제 기원으로서는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 또는 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus: BPV) 등의 유래의 것을 이용할 수 있다. 게다가 숙주세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위해, 발현 벡터 중에 선택 마커를 삽입할 수 있다. 구체적으로는, 다음과 같은 선택 마커를 이용할 수 있다:

아미노글리코시드 전이효소(aminoglycoside transferase: APH) 유전자;

티미딘 인산화효소(thymidine kinase: TK) 유전자;

대장균 쟌틴 구아닌 인산리보실 전이효소(E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase: Ecogpt) 유전자;

디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase: dhfr) 유전자 등.

본 발명에 사용되는 항체의 제조를 위해서, 임의의 발현계, 예를 들면 진핵세포 또는 원핵세포계를 사용할 수 있다. 진핵세포로는 수립된 포유류 세포계, 곤충 세포계, 사상균 세포 및 효모 세포 등의 동물세포를 예로 들 수 있다. 원핵세포로는 대장균 세포 등의 세균 세포를 예로 들 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 항체는, 포유류 세포를 이용하여 발현된다. 포유류 세포로는 CHO, COS, 골수종, BHK, Vero, HeLa 세포 등을 예로 들 수 있다.

이후, 형질전환된 숙주세포를 in vitro 또는 in vivo로 배양하여 목적으로 하는 항체의 생산을 유도한다. 숙주세포의 배양은 공지의 방법에 따라 실시한다. 예를 들면, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI 1640 또는 IMDM를 사용할 수가 있다. 소태아 혈청(fetal calf serum: FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다.

상기 기술된 대로 발현 및 생산된 항체는 단백질 정제에 사용되는 통장의 알려진 방법을 단독으로 또는 적당히 조합하여 사용함으로써 정제될 수 있다. 예를 들면, 단백질 A 컬럼 등의 친화도 컬럼, 크로마토그래피 컬럼, 여과, 초여과(ultrafiltration), 염 침전, 투석 등의 방법을 적절히 선택 및 조합하여 분리 및 정제될 수 있다(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

항체의 항원 결합 활성의 측정에는 공지의 수단을 쓸 수 있다(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 예를 들면, 효소 결합 면역 흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay: EIA), 방사 면역 측정법(radioimmunoassay: RIA) 또는 형광 면역법(fluoroimmunoassay) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체는 변형된 당쇄를 갖는 항체일 수 있다. 항체의 당쇄를 변형함으로써 항체의 세포독성이 증가될 수 있는 것은 공지이다. 변형된 당쇄를 갖는 공지의 항체로는 하기를 포함한다:

당화가 수식된 항체(예를 들면, 국제공개특허 제 99/54342호);

당쇄에 부착된 푸코스가 결손한 항체(예를 들면, 국제공개특허 제 00/61739 및 국제공개특허 제 02/31140호);

이등분한 GlcNAc를 갖는 당쇄를 가지는 항체(예를 들면, 국제공개특허 제 02/79255호) 등.

본 발명으로 사용되는 항체는 바람직하게는 세포독성 활성을 가지는 항체이다.

본 발명에서 세포독성 활성으로는 항체 의존성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성, 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성 등을 예로 들 수 있다. 본 발명에서 CDC 활성은 보체계에 의한 세포독성 활성을 의미한다. ADCC 활성은 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적 항체가 부착했을 때, 표적 세포에 장해를 주는 활성을 의미한다. Fcγ 수용체 보유 세포(면역세포 등)가 Fcγ 수용체를 매개로 항원의 Fc 부분에 결합하면 상기 표적세포는 손상된다.

항 EREG 항체가 ADCC 활성을 또는 CDC 활성을 가지는지 여부는 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Coligan et al ., John Wiley & Sons, Inc., (1993) 등).

우선, 구체적으로는 이펙터 세포, 보체 용액 및 표적 세포가 제조된다.

(1) 이펙터 세포의 제조

CBA/N 마우스 등에서 비장을 적출해, RPMI 1640 배양액(Invitrogen사)에서 비장세포를 분리하였다. 10% 소 태아 혈청(FBS, HyClone사)을 포함하는 동일한 배양액에서 세척 후, 세포 농도를 5 x 10⁶ /㎖에 조정하여 이펙터 세포를 제조하였다.

(2) 보체 용액의 제조

토끼 새끼의 보체(Baby Rabbit Complement; CEDARLANE사)를 10% FBS 함유 배양액(Invitrogen사)에서 10배 희석하여 보체 용액을 제조하였다.

(3) 표적 세포의 제조

EREG 단백질을 발현하는 세포를 0.2 mCi의 ⁵¹Cr-크롬산나트륨(GE Healthcare Bio-Science사)과 함께, 10% FBS 함유 DMEM 배양액에서 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써 상기 표적 세포를 방사성 표지할 수 있다. EREG 단백질을 발현하는 세포로는, EREG 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 세포, 원발성 대장암 , 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암 세포, 대장암 세포, 식도암 세포, 위암 세포, 췌장암 세포 등을 이용할 수 있다. 방사성 표지 후, 세포를 10% FBS 함유 RPMI 1640 배양액에서 3회 세척하고, 세포 농도를 2 x 10⁵ /㎖로 조정하여 상기 표적 세포를 제조할 수 있다.

ADCC 활성 또는 CDC 활성은 아래와 같은 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCC 활성의 측정의 경우, 96웰 U형 바닥 플레이트(Becton Dickinson사)에 표적 세포와 항 EREG 항체를 50 ㎕씩 더해 얼음에서 15분간 반응시켰다. 그 후, 이펙터 세포 100 ㎕를 더해 이산화탄소 인큐베이터 내에서, 4시간 동안 배양하였다. 항체의 최 종농도는 0 또는 10 ㎍/㎖로 조정하였다. 배양 후, 100 ㎕의 상등액을 회수해, 감마 카운터(COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL 05005, Packard Instrument Company사)에서 방사 활성을 측정하였다. 세포독성 활성(%)은 수득된 값을 사용해 하기 계산식에 따라 계산될 수 있다:

(A-C) / (B-C) x 100

이중, A는 각 시료에 있어서의 방사 활성(cpm), B는 1% NP-40(Nacalai Tesque사)를 첨가한 시료에서의 방사 활성(cpm) 및 C는 표적 세포만을 포함한 시료의 방사 활성(cpm)을 나타낸다.

한편, CDC 활성의 측정의 경우 96웰 평편한 바닥의 플레이트(Becton Dickinson사)에 표적 세포와 항 EREG 항체를 50 ㎕씩 첨가하고, 얼음에서 15분간 반응시킨다. 그 후, 보체 용액 100 ㎕를 더해 이산화탄소 인큐베이터 내에서, 4시간 동안 배양하였다. 항체의 최종농도는 0 또는 3 ㎍/㎖이다. 배양 후, 100 ㎕의 상등액을 회수해, 감마 카운터에서 방사 활성을 측정한다. 세포독성 활성은 ADCC 활성의 측정과 같게 계산할 수 있다.

한편, 항체 콘쥬게이트에 의한 세포독성 활성의 측정의 경우, 96웰 평편한 바닥의 플레이트(Becton Dickinson사)에 표적 세포와 항 EREG 항체 콘쥬게이트를 50 ㎕씩 첨가하고, 얼음에서 15분간 반응시킨다. 이산화탄소 인큐베이터 내에서, 1 내지 4시간 동안 배양한다. 항체의 최종농도는 0 또는 3 ㎍/㎖이다. 배양 후, 100 ㎕의 상등액을 회수해, 감마 카운터에서 방사 활성을 측정한다. 세포독성 활성은 ADCC 활성의 측정과 같게 계산할 수 있다.

본 발명의 세포독성 활성을 가지는 항체는 더욱 바람직하게는 중화 활성을 가지는 항체이다. 일반적으로 "중화 활성"이란 바이러스나 독소 등, 세포에 대해서 생물학적 활성을 가지는 리간드의 상기 생물학적 활성을 저해하는 활성을 말한다. 즉, "중화 활성을 갖는 물질"이란 상기 리간드 또는 상기 리간드가 결합하는 수용체에 결합하여 상기 리간드와 수용체의 결합을 저해하는 물질을 가리킨다. 중화 활성에 의해 리간드와의 결합이 저지된 수용체는, 상기 수용체를 통한 생물학적 활성을 발휘할 수가 없게 된다. 이러한 중화 활성을 가지는 항체는 일반적으로 중화 항체로 불린다. 상기 중화 활성은 대상으로 하는 리간드의 존재하에서, 중화활성이 평가될 피검 물질의 존재 또는 비존재시의 생물학적 활성을 비교함으로써 측정할 수 있다.

본 발명에서, EREG의 주요한 수용체로서 고려되는 EGF 수용체의 리간드 결합에 의해, 수용체의 이량체를 형성하고, 상기 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인을 활성화한다. 활성화된 티로신 키나제는 자기 인산화에 의해 인산화 티로신을 포함하는 펩티드를 형성하고, 상기 펩티드는 여러 신호전달 부가 분자와 관련된다. 그것들은 주로 PPLCγ(phospholipase Cγ), Shc, Grb2 등이다. 이러한 부가 분자 가운데, 전자는 EGF 리셉터의 티로신 키나제에 의해 더욱 인산화된다. EGF 리셉터로부터의 주요한 신호전달경로는 Shc, Grb2, Sos, Ras, Raf/MAPK 키나제/MAP 키나제의 순서로 인산화가 전달되는 경로이다. 또한, PLCγ에서 PKC로의 부경로 존재한다고 생각되고 있다.

이러한 세포 내의 신호 캐스케이드(cascade)는 세포종마다 다르기 때문에, 목적으로 하는 표적 세포마다 적당한 표적 분자를 설정할 수가 있고, 상기 기재된 인자로 한정되는 것은 아니다. 생체 내 신호 활성화의 측정용 키트는 시판의 것을 적당히 사용될 수 있다(예를 들면, 단백질 키나제 C 활성 분석 시스템(GE Healthcare Bio-Science사) 등).

또한, 생체내 신호 캐스케이드의 하류에 존재하는 표적 유전자에 대한 전사 유도 작용을 지표로서 생체내 신호전달의 활성화를 검출할 수 있다. 전사 활성의 변화는 리포터 분석의 원리에 의해 검출될 수 있다. 구체적으로는, 표적 유전자의 전사 인자 또는 프로모터 영역의 하류에 GFP(Green Fluorescence Protein)나 루시퍼라아제 등의 리포터 유전자를 배치하여, 상기 리포터 활성을 측정함으로써, 전사 활성의 변화를 리포터 활성으로서 측정할 수 있다.

추가로, EGF 리셉터는 통상은 세포 증식을 촉진하는 기능을 수행하기 때문에, 표적 세포의 증식 활성을 측정함으로써 생체내 신호전달의 활성화를 평가할 수 있다. 본 발명에서는, 세포 증식 활성을 평가함으로써 본 발명의 중화 항체의 중화 활성을 평가하지만, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니고, 선택한 표적 세포마다 상기 방법을 매우 적합하게 적용해 평가할 수 있다.

즉, 예를 들면 이하와 같은 세포 증식 활성을 측정함으로써, 항 EREG 항체의 중화 활성을 평가 또는 측정할 수 있다. 예를 들면, 배양액 속에 첨가한 [³H]-표지한 티미딘의 생세포에 의한 혼입을 DNA 복제 능력의 지표로서 측정하는 방법이 이용된다.

더욱 간편한 방법으로서, 세포가 트리판 블루 등의 색소를 세포외로 방출하는 능력을 현미경하에서 계측하는 색소 배제법이나, MTT법이 이용된다. 후자는 생세포가 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 청색의 포르마잔 산물로 전환하는 능력을 가지는 것을 이용하고 있다. 보다 구체적으로는, 피검세포의 배양액에 피검항체를 첨가하여 일정시간 지난 후에, MTT 용액을 배양액에 첨가하여 일정시간 정치하여 MTT를 세포에 혼입하게 한다. 그 결과, 황색 화합물인 MTT가 세포 내의 미토콘드리아 내의 숙신산 탈수소효소에 의해 청색의 화합물로 변환된다. 이 청색 생성물을 용해하여 발색한 후에 그 흡광도를 측정하여 생세포수의 지표로 하는 것이다.

MTT 이외에, MTS, XTT, WST-1 및 WST-8 등의 시약도 시판되어 있어서((Nacalai Tesque 등), 매우 적합하게 사용할 수 있다. 추가로, 세포의 ATP나 세포 배양물의 임피던스(impedance)를 지표로서 세포 증식 활성을 평가하는 방법도 공지이다. 활성 측정의 경우, 항 EREG 항체와 동일한 아이소타입(isotype)을 갖지만 상기 중화 활성을 가지지 않는 결합 항체를 대조군 항체로서 항 EREG 항체와 같은 방식으로 사용될 수 있고, 항 EREG 항체가 대조군 항체보다 강한 중화 활성을 나타내는 것으로 활성을 판정할 수 있다.

항 EREG 항체가 증식을 억제하는 세포는 EREG 단백질을 발현하고 있는 세포이면 특히 한정되지 않는다. 바람직한 EREG 발현 세포는 예를 들어 암 세포이다. 구체적으로는, 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암에서 유래하는 세포는 본 발명에서 EREG 발현 세포로서 적합하다. 본 발명에 의하면 이러한 암의 원발성 병소 및 전이성 병소에 대해서도 유효한 세포 증식의 억제 효과를 얻을 수 있다. 더욱 바람직한 암 세포는, 원발성 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암이다. 따라서, 항 EREG 항체는 세포 증식에 기인하는 질환, 예를 들면, 대장암, 폐선암, 췌장암 , 위암, 신장암 등의 치료 또는 예방을 목적으로 사용할 수 있다. 이러한 암은 원발성 병소 또는 전이성 병소에 관계없이, 치료 또는 예방의 대상으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 원발성 대장암, 전이성 대장암, 췌장암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 항 EREG 항체를 이용할 수 있다. 추가로, 이러한 암 중에서 EREG 의존성으로 증식하는 암은 본 발명에서 치료 및/또는 예방의 대상으로 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 본 발명의 항체와 동등의 활성을 가지는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체(형질전환 세포를 포함)를 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체를 암호화하는 한 특히 한정되지 않고, 다중 뉴클레오티드 또는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 등의 염기쌍을 포함하는 중합체이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 이외의 염기를 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 공학적인 기법에 의해 항체를 발현시킬 때에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와 동등한 기능을 가지는 항체를 스크리닝 할 때에 프로브로서 이용할 수도 있다. 즉, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부를 프로브로서 이용해 혼성화 및 유전자 증폭 기술(예를 들면 PCR) 등의 기술에 의해, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 본 발명의 항체와 동등의 활성을 가지는 항체를 암호화하는 DNA를 얻을 수 있다. 상기 DNA도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 혼성화 기술(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)은 당업자에게 잘 알려진 기술이다.

혼성화의 조건으로서는 예를 들면 낮은 엄격한 조건을 들 수 있다. 낮은 엄격한 조건이란, 혼성화 후의 세척시, 예를 들면 42℃에서 0.1x SSC 및 0.1% SDS의 조건, 바람직하게는 50℃에서 0.1x SSC 및 0.1% SDS의 조건이다. 더욱 바람직한 혼성화의 조건으로서는, 높은 엄격한 조건이 있다. 높은 엄격한 조건이란 예를 들면 65℃에서 5x SSC 및 0.1% SDS의 조건이다. 이러한 조건에 대해, 온도를 올릴수록 높은 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 효율적으로 얻을 수 있는 것을 기대할 수 있다. 단, 혼성화의 엄격성에 영향을 주는 요소로서는 온도 및 염 농도 등 복수의 요소가 생각되고, 당업자는 유사한 엄격성을 달성하기 위해 상기 요소들을 적당히 선택할 수 있다.

상기 혼성화 기술 및 유전자 증폭 기술에 의해 수득한 폴리뉴클레오티드가 암호화하는, 본 발명의 항체와 기능적으로 동등한 항체는 통상적으로 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 대해 높은 상동성을 가진다. 본 발명의 항체에는 본 발명의 항체와 기능적으로 동등하고, 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가 지는 항체도 포함된다. "높은 상동성"이란 아미노산 레벨에 대해 통상적으로 적어도 50%이상의 동일성, 바람직하게는 75%이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 85%이상의 동일성, 한층 더 바람직하게는 95%이상의 동일성을 나타낸다. 폴리펩티드의 상동성을 결정하려면 문헌(Wilbur, W. J. 및 Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)의 알고리즘에 따르면 좋다.

약학적 조성물

다른 관점에서, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포 증식 억제제, 특히 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 세포 증식 억제제 및 항암제는 암에 걸린 개체 또는 암에 걸렸을 가능성이 있는 개체로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포 증식 억제제는 EREG 단백질에 결합하는 항체를 개체로 투여하는 단계를 포함하는 세포 증식을 억제하는 방법 또는 세포 증식 억제제의 제조에 EREG 단백질에 결합하는 항체를 이용하는 용도로 기재된다.

또한, 본 발명에서 EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 항암제는 EREG 단백질에 결합하는 항체를 개체로 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법 또는 항암제의 제조에 EREG 단백질에 결합하는 항체를 이용하는 용도로 기재된다.

본 발명에서, "EREG에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는"이란 항 EREG 항체를 주요한 활성 성분으로서 포함하며, 항 EREG 항체의 함유율을 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물(예를 들면, 세포 증식 억제제 및 항암제: 이하 같음)에 함유되는 항체는 EREG 단백질과 결합하는 한 특히 제한은 없고, 본 명세서에 기재된 항체를 예시할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 구체적으로는, 투여 방법으로서는 주사 투여, 경비투여, 경폐 투여 또는 경피 투여 등을 예로 들 수 있다. 주사 투여의 예로서는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 본 발명의 약학적 조성물을 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 환자의 연령 및 증상에 의해 적당한 투여 방법을 선택할 수 있다. 투여량은 예를 들면 1회의 투여에 대해 체중 1 kg 당 0.0001 ㎎ 내지 1000 ㎎의 범위에서 선택될 수 있다. 또는, 예를 들면 환자당 투여량은 0.001 내지 100,000 ㎎/body의 범위에서 선택될 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 투여량에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 일반적인 방법(Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A 참조)에 따라 제재화될 수 있고, 또한 약학적으로 허용되는 담체나 첨가물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 착향료 등을 들 수 있다. 이것들에 제한되지 않고, 그 외 상용의 담체를 적당히 사용할 수 있다. 구체적으 로는, 경질무수 규산, 유당, 크리스탈라인 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로스 칼슘(carmellose calcium), 카르멜로스 소듐(carmellose sodium), 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오수, 폴리비닐아세탈 디에틸아미노아세테이트(polyvinylacetal diethylaminoacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 젤라틴, 중쇄지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자기름 60, 사카로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기 염류 등을 담체로 들 수 있다.

또한, 본 발명은 EREG 발현 세포와 EREG 단백질에 결합하는 항체를 접촉시켜서 EREG 발현 세포에 장해를 일으키는 방법 또는 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

즉, 본 발명은 하기 구체화를 포함한다.

- EREG 단백질을 발현하는 세포와 EREG 단백질에 결합하는 항체를 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 EREG 발현 세포에 세포독성을 일으키는 방법.

- EREG 단백질을 발현하는 세포와 EREG 단백질에 결합하는 항체를 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 EREG 발현 세포의 증식을 억제하는 방법.

- EREG 단백질에 결합하는 항체가 세포독성 활성을 가지는 항체로, 있다, 상기 방법

- 상기 방법에 있어서, EREG 단백질에 결합하는 항체가 중화 활성을 가지는 방법.

- 상기 방법에 있어서, EREG 단백질에 결합하는 항체가, 이하 (1) 내지 (57) 중의 어느 하나의 항체인 방법:

(38) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 161로 기재된 아미노산 서열의 117 내 지 440번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(47) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 165로 기재된 아미노산 서열의 113 내 지 436번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(57) (1) 내지 (56) 중 어느 하나의 항체의 저분자화 항체;

- 상기 방법에 있어서, EREG를 발현하는 세포는 암세포인 방법.

상기 기술된 것처럼, 상기 (1) 내지 (5)의 항체는 단가 항체 및 두 개 이상의 원자가를 갖는 다가 항체를 포함한다. 본 발명의 다가 항체에는 모두 같은 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체 또는 일부 또는 모두 다른 항원 결합 부위를 가지는 다가 항체가 포함된다.

상기 EREG 단백질 결합 항체는 본 발명의 세포 증식 억제제에 포함되는 EREG 단백질 경합 항체로 기술된다. 항 EREG 항체에 의해 결합되는 세포는 EREG 발현 세포로 한정되지 않는다. 바람직한 본 발명의 EREG 발현 세포는 암세포이다. 즉, 상기 세포는 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암 세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법은 암의 원발성 병소 및 전이성 병소에 대해서도 적용될 있다. 더욱 바람직한 암세포는 원발성 대장암, 전이성 대장암, 췌장암 세포이다.

본 발명에서 "접촉시키는"은 예를 들면, 검사 튜브내 배양된 EREG 발현 세포의 배양액에 항체를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 상기 경우에, 상기 항체는 예를 들면, 동결건조 등으로 수득된 용액 또는 고형물의 형태로 첨가될 수 있다. 항체를 수용액 상태로 첨가할 경우, 상기 수용액은 항체만 포함하는 용액, 또는 예를 들면, 상기 언급된 계면활성제, 부형제, 착색료, 향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 착향료 등도 포함하는 용액일 수 있다. 첨가 농도는 제한되지 않으나, 배양액 내 최종 농도는 바람직하 게는 1 pg/㎖ 내지 1 g/㎖, 더욱 바람직하게는 1 ng/㎖ 내지 1 ㎎/㎖ 및 한층 더 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 범위에서 적절하게 사용될 수 있다.

또한, 다른 구체화에서 본 발명의 "접촉시키는" 것은 EREG를 발현하는 세포가 몸에 이식된 인간 이외의 동물 또는 EREG를 내재적으로 발현하는 암세포를 갖는 동물에 투여함으로써 수행될 수 있다. 상기 투여 방법은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 상기 투여 방법은 바람직하게는 비경우 투여이며, 구체적으로는, 투여 방법으로서는 주사 투여, 경비투여, 경폐 투여 또는 경피 투여 등을 예로 들 수 있다. 주사 투여의 예로서는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 본 발명의 약학적 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 피검동물의 연령 및 증상에 의해 적당한 투여 방법을 선택할 수 있다. 수용액 상태로 첨가할 경우, 상기 수용액은 항체만 포함하는 용액, 또는 예를 들면, 상기 언급된 계면활성제, 부형제, 착색료, 향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 착향료 등도 포함하는 용액일 수 있다. 투여량은 예를 들면 1회의 투여에 대해 체중 1 kg 당 0.0001 ㎎ 내지 1000 ㎎의 범위에서 선택될 수 있다. 또는, 예를 들면 환자당 투여량은 0.001 내지 100,000 ㎎/body의 범위에서 선택될 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체 투여량은 상기 투여량에 제한되는 것은 아니다.

하기 방법은 EREG 발현 세포에 항 EREG 항체를 접촉시킴으로써 유도된 세포 손상을 평가 또는 측정하기 위한 방법으로 적절하게 사용된다. 검사 튜브에서 세포 독성을 평가 또는 측정하기 위한 방법의 예로는 상기 언급된 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성, 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성 등을 측정하는 방법을 포함한다. 항 EREG 항체가 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 갖는지 여부는 공지의 방법으로 측정될 수 있다(예를 들면, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Coligan et al ., John Wiley & Sons, Inc., (1993) 등을 참조). 활성 측정의 경우, 항 EREG 항체와 동일한 아이소타입(isotype)을 갖지만 상기 중화 활성을 가지지 않는 결합 항체를 대조군 항체로서 항 EREG 항체와 같은 방식으로 사용될 수 있고, 항 EREG 항체가 대조군 항체보다 강한 중화 활성을 나타내는 것으로 활성을 판정할 수 있다.

항체의 아이소타입(isotype)은 항체 아미노산 서열의 H 사슬 보존영역의 서열에 의해 규정된다. 생체내에 항체를 생산하는 B 세포의 성숙화 시에 일어나는 염색체 상의 유전자 재조합에 의해 생기는 클래스 변환(class switching)에 의해 항체의 아이소타입이 최종적으로 결정된다. 아이소타입이 다른 것은 항체의 생리적 및 병리적 기능이 다른 것을 반영된다. 구체적으로는, 예를 들면 세포독성 활성의 강도는 항원의 발현량과 함께, 항체의 아이소타입에 의해도 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 기재의 세포독성 활성의 측정시, 대조군으로 이용되는 항체는 피검항체와 동일한 아이소타입를 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 생체내에서 세포독성 활성을 평가 또는 측정하기 위해서, 예를 들면 EREG를 발현하는 암 세포를 인간 이외의 피검동물의 피내 또는 피하에 이식 후, 당일 또는 다음날부터 매일 또는 며칠 간격으로 피검항체를 정맥 또는 복강 내에 투 여된다. 매일 측정된 종양의 크기에 의해 세포독성 활성이 규정될 수 있다. 시험관 내에서의 평가와 유사하게, 동일한 아이소타입를 가지는 대조군 항체를 투여하여, 항 EREG 항체 투여군에 있어서의 종양의 크기가 대조군 항체 투여군에 있어서의 종양의 크기보다 의미가 있게 작은 것을 관찰함으로써 세포 상해 활성을 판정할 수 있다. 인간 이외의 피검동물로서 마우스를 이용하는 경우에는, 흉선을 유전적으로 결손하여 T 림프구의 기능이 결실된 누드 마우스(nu/nu)를 매우 적합하게 이용할 수 있다. 상기 마우스를 사용하여 투여된 항체에 의한 세포독성 활성의 평가 또는 측정시, 피검동물 중의 T 림프구가 관여하는 것을 제외할 수 있다.

항 EREG 항체의 접촉에 의한 EREG 발현 세포의 증식에 대한 억제 효과를 평가 또는 측정하는 방법으로서, 상기 중화 활성 측정법과 같은 방법을 적절하게 이용할 수 있다.

또한, 생체내에서 세포 증식 억제 활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서 상기 기재의 생체내에 있어 세포독성 활성을 평가 또는 측정하는 방법과 같은 방법을 적절하게 이용할 수 있다.

스크리닝 방법

본 발명자들에 의해, 세포가 분비한 EREG가 EREG 의존적으로 증식하는 세포의 세포 증식을 유도하고 있는 것으로 나타났다. 또한 EREG가 암 세포에 대해 특이적으로 발현이 증가하고 있는 것도 확인되었다. 따라서, EREG 발현 세포에 있어서 EREG의 발현 레벨을 억제하여 암의 치료를 달성할 수 있다. 즉, 본 발명에서 암 세포의 EREG의 발현을 억제하는 화합물이 암 치료제의 후보 화합물로서 유용한 것으로 나타났다. 이러한 발견에 근거해, 본 발명은

(1) EREG 발현 세포에 피검화합물을 접촉시키는 단계;

(3) 대조군과 비교하여 EREG의 발현 레벨을 저하시키는 화합물을 후보 암 치료제로서 선택하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 후보 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서, EREG 발현 세포로서는 예를 들어 EREG를 발현하고 있는 암 세포를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 도 2에서 EREG의 증가된 발현을 나타내는 모든 암세포주가 본 발명의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 스크리닝 방법으로 이용할 수 있는 세포로서 다음과 같은 암 세포주를 포함한다. 이하에 예시한 세포주는 세포주 은행으로부터 입수할 수 있다. 이러한 세포주의 배양 조건은 이미 확립되어 있다. 구체적으로는, 예를 들어 표 2에 나타낸 것 같은 조건으로 배양할 수 있다.

식도암 세포주 : TE2

위암 세포주 : GT3

MKN45

2M

2MD3

대장암 세포주 CAC02

DLDl

hCT116

LOVO

간암 세포주: Alexander

췌장암 세포주 Capan1

Paca2

PK-1

신장암 세포주: Caki1

Caki2

폐암 세포주 A549

H157

H1648

H2009

H23

H2347

H522

상기 세포주를 피검화합물의 존재하에서 배양하여, 상기 세포주에 있어서의 EREG의 발현 레벨이 측정된다. 상기 EREG의 발현 레벨은 세포내의 mRNA의 양이나, 세포내, 세포 표면 또는 세포외로 분비되는 EREG 단백질의 양을 측정하여 평가할 수 있다. EREG mRNA나 단백질의 측정 방법으로서는 본 명세서에 기재한 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명자들에 의해 분비된 EREG의 EREG 의존적으로 증식하 는 세포의 세포 증식 유도 작용이 확인되고 있다. 따라서, 세포외에 분비되는 EREG의 양을 지표로 하는 항암제 후보 화합물의 스크리닝 방법은 본 발명의 바람직한 구체화이다.

본 발명에서, 대조군과 비교하여 EREG의 발현 레벨이 낮은 피검화합물을 목적 후보 화합물로서 선택된다. 본 발명에서, 대조군으로서는 예를 들어 피검화합물이 존재하지 않는 상태에서 배양된 동일한 세포주를 이용할 수 있다. 또는, EREG의 발현 레벨에 영향을 주는 것이 미리 알려진 화합물의 존재하에서 배양한 세포주를 대조군으로 이용할 수도 있다. 이러한 대조군을 이용하여, 특정 화합물보다 보다 작용이 큰 화합물을 선택할 수도 있다.

본 발명에서, 피검화합물의 EREG에 대한 중화 작용을 지표로서 암의 치료약을 스크리닝할 수 있다. 즉, 본 발명은

(1) EREG와 피검화합물의 존재하에서 EREG 의존적으로 증식하는 세포를 배양하는 단계;

(2) 세포 증식 레벨을 측정하는 단계; 및,

(3) 대조군과 비교하여 세포 증식을 억제한 피검화합물을 후보 암 치료제로서 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료제 후보 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, "EREG 의존적으로 증식하는 세포"란 EREG에 대해서 용량 의존성의 세포 증식을 나타내는 세포를 말한다. 예를 들어 하기에 기재하는 실시예에 대해, 췌장암 세포주 AsPC1은 EREG에 의한 용량 의존적인 세포 증식을 나타낸다. 또는, 본 발명자들의 발견에 의하면 EGF 리셉터/G-CSF 리셉터의 키메라 리셉터를 발현시켜서 EREG 의존성을 부여할 수 있는 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, EGF 리셉터의 세포외 도메인과 G-CSF 리셉터의 세포내 도메인으로 구성되는 키메라 수용체를 암호화하는 DNA로 형질전환된 마우스는 인간 EREG에 대한 농도 의존적 세포 증식을 나타내었다. 따라서, 이와 같이 EGFR 의존성이 인위적으로 유도된 세포도 본 발명의 스크리닝 방법에 이용될 수 있다.

EREG와 피검화합물의 존재하에서 배양된 EREG 의존적으로 증식하는 세포는 이후, 그 증식 레벨이 측정되었다. 세포 증식은 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어 실시예에 나타내는 바와 같이, 시판의 생존 세포의 계수용 시약을 이용하여 생존 세포수를 비교할 수 있다. 또는, 보다 대규모 스크리닝을 효율적으로 실시하기 위한 시스템도 시판되고 있다. 예를 들어, 멀티-웰 플레이트를 이용하여 각 웰의 생존 세포수를 평가할 수 있는 시스템이 실용화되고 있다. 생존 세포수의 비교 결과, 대조군과 비교하여 세포수의 증가를 억제한 피검화합물을 암의 치료약의 후보 화합물로서 선택할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 대해, 대조군으로서는 예를 들어 피검화합물이 존재하지 않는 상태에서 배양된 동일한 세포주를 이용할 수 있다. 또는, EREG의 분비에 의한 세포 증식 유도 작용에 영향을 주는 것이 미리 알려진 화합물의 존재하에서 배양한 세포주를 대조군으로 이용할 수도 있다. 이러한 대조군을 이용하여, 특정 화합물보다 보다 작용이 큰 화합물을 선택할 수도 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따라 선택된 후보 화합물은, EREG의 작용을 억제 하는 기작을 하는 항암제의 후보 화합물로서 유용하다. 본 발명에서 EREG에 대한 항체의 암의 치료 효과가 확인되었다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선택되는 화합물에서도 항체와 같은 효과가 기대될 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 선택된 후보 화합물은 추가로 필요에 따라서 다른 암 세포주 또는 초대 배양 세포에 대한 작용 및 또한, 정상세포에 대한 독성 등에 대한 영향이 평가된다. 이러한 평가를 통해서, 암의 치료약으로서 유용한 화합물을 선택할 수 있다. 일련의 암의 치료약으로서의 평가방법은 이미 확립되어 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 천연의 또는 인위적으로 합성된 모든 화합물을 피검화합물로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 단백질 라이브러리나 항체 라이브러리는 피검화합물의 라이브러리로서 바람직하다. 또는, 단백질이나 항체를 제시하는 파이 라이브러리를 피검화합물로 사용될 수도 있다. 추가로, 조합 라이브러리 등의 인위적으로 합성된 화합물의 라이브러리를 피검화합물로서 이용할 수도 있다.

또한 본 명세서에 대해 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 넣어질 수 있다.

실시예

이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 이하 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1] 각 암종에 있어서의 인간 EREG의 유전자 발현 분석

1-1. Gene chip을 이용한 인간 EREG 유전자 발현 분석

대장암 및 췌장암 등의 암 조직에서 특이적으로 발현이 증가된 유전자를 탐색하기 위해, GeneChip U133A(Affymetrix사)를 이용하여, 정상 조직, 암조직 및 암 세포주에 대해 종합적인 유전자 발현 분석이 실시되었다.

표 1 및 표 2에 나타낸 정상 조직, 암조직 및 암 세포주로부터 ISOGEN(Nippon Gene 사)를 이용하여 관습적인 방법에 의해 전체 RNA를 제조하였다. 상기 전체 RNA의 10 ㎍ 씩을 이용하여 GeneChip U-133A(Affymetrix사)를 전사 분석에 제공함으로써 유전자 발현 분석을 하였다. 상기 방법은 Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix사)에 따라 수행되었다. 모든 유전자의 발현의 평균값을 100으로 표준화되었고, 암조직 또는 암 세포에서 발현이 증가한 유전자의 탐색을 했다.

그 결과, 인간 EREG mRNA(프로브 ID: 205767_at HG-U133A)는 정상 조직에 대해 현저한 발현이 인정되지 않고, 원발성 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암조직; 및 대장암 세포주(CACO2, DLD1, HCT116 및 LOVO), 위암 세포주(2M, 2MD3), 간암 세포주(Alexander), 췌장암 세포주(Capan1 및 Paca2), 신장암 세포주(Caki1 및 Caki2) 및 원발성 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암 세포주(H157, H1648, H2009, H23 및 H2347)에 대해, 발현량이 증가한 것을 발견하였다(도 1 및 도 2).

이상으로부터, 인간 EREG 유전자(프로브 ID: 205767_at HG-U133A)는 정상 조직에서 발현량이 매우 낮은데 대해, 원발성 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 췌장암, 위암 및 신장암을 포함하는 광범위한 암종에서 발현량이 증가하였다.

EREG 유전자 발현 분석에 이용한 조직

조직	입수처
뇌 전체	Clontech 64020-1
폐	임상시료 케이스 1
기관(Trachea)	Clontech 64091-1
심장	Ambion 7966
신장	Ambion 7976
간	임상시료(수술)
췌장	Ambion 7954
위	임상시료(수술)
소장	Ambion 7984
대장	Ambion 7986
골수	Clontech 64106-1
말초혈 단핵구	임상시료 케이스 1
정소	Clontech 64027-1
전립선	Ambion 7988
난소	Ambion 7974
피부	Stratagene 735031
폐선암 1	임상시료 케이스 1
폐선암 2	임상시료 케이스 1
폐선암 3	임상시료 케이스 1
폐선암 4	임상시료 케이스 1
폐선암 5	임상시료 케이스 1
원발성 대장암 1	임상시료 케이스 1
원발성 대장암 2	임상시료 케이스 1
원발성 대장암 3	임상시료 케이스 1
원발성 대장암 4	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 1	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 2	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 3	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 4	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 5	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 6	임상시료 케이스 1
전이성 대장암 7	임상시료 케이스 1
췌장암 1	임상시료 케이스 1
췌장암 2	임상시료 케이스 1
췌장암 3	임상시료 케이스 1

[실시예 2] 항 EREG 단일클론 항체의 제조

2-1. 전장 인간 EREG 발현 세포의 설립

서열번호 21로 기재되는 서열을 포함하는 전장 인간 EREG cDNA(NM_001432)는 일반적인 방법으로 분리하였다. 상기 유전자 단편을 포유동물 세포용 발현벡터(pMCN)에 클로닝 하였고, hEREG/pMCN으로 명명하였다. pMCN은 마우스 CMV 프로모터(접근번호 U68299)의 조절하에서 외래 유전자의 발현을 유도시키는 것이 가능하고, 네오마이신 내성 유전자가 삽입된 벡터이다. 전장 인간 EREG를 안정적으로 발현하는 CHO 세포주는 CHO DG44 세포주(Invitrogen사)에 hEREG/pMCN을 전기충격법으로 도입한 후, 500 ㎍/㎖의 제네티신의 존재하에서 상기 세포를 선별하였다. 상기 선별된 세포주는 EREG_DG라고 명명해졌다.

2-2. 수용성 인간 EREG/마우스 IgG2a Fc 융합 단백질(sEREG-mFc)의 제조

항 EREG 항체 제조를 위한 면역 항원으로서 수용성 인간 EREG/마우스 IgG2a Fc 융합 단백질(이하, sEREG-mFc)이 제조되었다.

인간 EREG의 세포외 영역(7 내지 122 아미노산)과 마우스 IgG2a의 보존영역을 경첩 부위(hinge region)에 CpoI 인식 서열로 연결하여 구축된 sEREG-mFc를, 발현벡터 pMCN에 DHFR 유전자를 삽입하여 제조한 pMCDN 벡터에 클로닝 하였고, 이를 sEREG-mFc/pMCDN라고 명명하였다. 서열번호 33으로 기재된 서열은 sEREG-mFc 유전자의 염기서열을, 서열번호 34로 기재된 서열은 sEREG-mFc의 아미노산 서열을 나타낸다. sEREG-mFc/pMCDN을 CHO DG44 세포주(Invitrogen사)에 전기충격으로 도입함으로써 제조된 sEREG-mFc-발현 CHO 세포주를 500 ㎍/㎖의 제네티신의 존재하에서 상기 세포를 선별하였다.

이후, 배양 상등액에서 sEREG-mFc를 정제하였다. 배양 상등액을 HiTrap Protein G HP(Amersham사 CAT# 17-0404-01) 컬럼에 적용한 후, 결합 완충액(20 mM 인산 나트륨(pH 7.0)]에서 결합하지 않은 물질을 세척한 후, 용출 완충액(O.l M 글리신-HCl(pH 2.7)으로 목적으로 하는 sEREG-mFc를 용출하였다. 용출액은 중화 완충액[1 M Tris-HCl(pH 9.0)]을 포함하는 튜브에 회수하여 즉시 중화되었다. 이후, 용리된 sEREG-mFc는 Suerdex 200 HR 10/30(Amersham사)을 이용하여 겔 여과법으로 분리되어, PBS로 상기 용액의 용매로 치환되었다. 상기 정제된 단백질은 DC 단백질 분석키트(BIO-RAD사)를 이용하여 정량하였고, 첨부된 소 IgG를 표준물질로 하여 단백질의 농도를 환산하였다.

2-3. 항 EREG 단일클론 항체의 제조

Balb/c 마우스 및 MRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crlj 마우스(Charles River Japan사)를 면역 동물로서 이용하였다. 5 내지 8주령에서 면역화를 시작하였다. 첫 번째 면역화에서, 프로인트 완전 아쥬반트(FCA, Beckton Dickinson)를 이용하여 sEREG-mFc를 에멀젼화 한 후, 피하에 주사하였다(100 ㎍/머리). 2주일 후에 프로인트 완전 아쥬반트(FCA, Beckton Dickinson)를 이용하여 sEREG-mFc를 에멀젼화 한 후, 피하에 주사하였다(50 ㎍/머리). 이후 1주 간격으로 추가 면역을 2~3회 수행하였고, 최종 면역으로서 sEREG-mFc를 PBS에 의해 희석하여 꼬리 정맥내에 투여되었다(50 ㎍/머리).

최종 면역 4일 후, 비장 세포를 적출한 후, 마우스 골수종 세포 P3-X63Ag8U1(P3U1, ATCC에서 구입)와 2:1의 비율로 혼합하였고, PEG 1500(Roche Diagnostics)을 단계적으로 첨가함으로써 세포융합을 수행하였다. PEG 1500을 희석하기 위해, RPMI 1640 배지(GIBCO BRL)을 주의하여 첨가한 후, 원심분리로 PEG 1500을 제거하였다. 이후, 상기 세포를 10% FBS, 1x HAT 배지 첨가제(SIGMA) 및 0.5x BM-Condimed H1 하이브리도마 클로닝 첨가제(Roche Diagnostics)(이하: HAT 배지)를 포함하는 RPMI 1640에 재현탁한 후, 96웰 플레이트에 200 ㎕/웰의 농도로 접종하였다. 인간 EREG_DG에 대한 결합 활성을 유세포 분석기로 평가함으로써 스크리닝을 수행하였다. 상기 분석법으로 수득한 양성 결합 활성을 나타내는 클론들은 제한적 희석 방법(limiting dilution method)에 의해 단일클로닝되었다.

또한, 단일클론 항체를 Helios 유전자 건 시스템(Bio-Rad)를 이용한 DNA 접종 방법에 의해 마우스에 면역화함으로써 수득하였다. 상기 카트리지 튜빙을 Helios 유전자 건 작동법에 따라 금-DNA(전당 인간 EREG 발현 벡터) 입자로 코팅하였다. 1.0 ㎜ 금 입자 50 ㎎의 무게를 측정한 후, 현탁하여 0.05 M 스퍼미딘(spermidine) 0.1 ㎖과 혼합하였다. 1 ㎎/㎖의 플라스미드 용액 0,1 ㎖를 상기 용액에 첨가한 후, 볼텍싱 하였다. 이어서, 1 M CaCl₂ 0.1 ㎖을 첨가한 후, 이를 10분 동안 방치하였다. 간단히 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다. 펠렛을 에탄올에 현탁한 후, 원심분리하였다. 에탄올 탈수 단계를 세 차례 반복한 후, 마지막에 0.05 ㎎/㎖의 폴리피닐피롤리돈-에탄올 용액 6 ㎖에 현탁하였다. 상기 용액을 코팅을 위해 상기 튜빙에 흘려준 후, 상기 튜빙을 코팅 및 건조 후, 튜브 커터를 이용하여 0.5 인치 길이의 구획으로 잘라주었다.

4 내지 5주령 MRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crlj 마우스(대략 200 psi 헬륨 압력)를 대상으로 1주일에 1 내지 3차례의 간격으로 DNA 면역화를 수행하였고, 혈청에 적정한 항-EREG 항체를 상기 기간 동안 간헐적으로 모니터하였다. EREG를 강제로 발현하는 세포주(5 x 10⁶ 세포/머리)를 복강내 투여하거나, 혈청의 항체 역가가 증가한 것이 확인된 개체군의 꼬리 정맥에 투여하였다. 2 내지 3일 후, 상기 비장을 적출한 후, 항체를 생산하는 세포를 포함하는 단핵세포를 분리하였다. 세포 융합과 클로닝은 sEREG-mFc의 면역화의 경우와 동일한 방법으로 수행하였다.

혈청이 보충된 HAT 배지에서 배양된 하이브리도마의 배양 상등액으로부터 항체를 정제하였다. 상기 배지에 첨가된 상기 혈청은 FBS(Ultra 저 IgG)(GIBCO BRL)이다. 실시예 2-2에서 기재된 sEREG_mFc의 정제방법과 동일한 방법으로 HiTrap Protein G HP를 이용하여 배양 상등액으로부터 항체를 정제했다. HiTrap Protein G HP의 용출 분획은 PD-10 컬럼(Amersham사)을 이용하여 PBS로 치환한 후, 4℃에 보관되었다. 정제된 항체의 정량은 DC 단백질 분석키트(BIO-RAD사)를 이용하여 정량하였고, 첨부된 소 IgG를 표준물질로 하여 단백질의 농도를 환산하였다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 클론 B2#30(IgG1, Kappa), B3#18(IgG2b, Kappa), B3#41(IgG1, Kappa) 등을 성공적으로 분리하였다.

2-4. 유세포 분석기에 의한 결합 활성의 평가

상기 기재 방법에 의해 수득한 항체의 EREG_DG에 대한 결합활성을 유세포 분석기를 이용하여 평가하였다. FACS 완충액(1% FBS/PBS)에 1 x 10⁵ 세포/㎖의 밀도로 현탁한 EREG_DG에 대해서 적절한 농도로 희석한 항 EREG 항체를 첨가하였고, 이후 얼음에서 60분간 반응시켰다. FACS 완충액에 세포를 1회 세척한 후에, FITC가 표지된 항 마우스 IgG 항체를 첨가하였고, 이후 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, 원심분리로 상등액을 제거하였다. 상기 세포를 FACS 완충액 150 ㎕에 현탁한 후, 유세포 분석을 수행하였다.

FACS Calibur(Becton Dickinson) 유세포 분석기를 이용하였다. 전방 산란빛(forward scatter) 및 측방 산란빛(side scatter)의 막대그래프를 이용하여, 생세포 집단에 대해서 게이트가 설정되었다. EREG_DG에 대한 결합 활성에 추가로, 인간 대장암 세포주 DLD1에 대한 결합 활성의 평가도 실시되었다. 도 2에서 나타난 결과에 의해 확인되는 바와 같이, 인간 EREG 유전자의 발현량은 EREG_DG 세포에서처럼 인간 대장암 세포주 DLD1에서도 유사하게 향상되었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 하이브리도마에 의해 제조된 항 EREG 단일클론 항체(B2#30, B3#18 및 B3#41)는 EREG_DG에 강하게 결합하였고, 부모 DG44 세포에는 결합하지 않았다. 상기 결과로부터 상기 단일클론 항체가 세포막 상에 제시된 EREG에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.

또한, 상기 기술된 본 발명의 항 EREG 단일클론 항체가 인간 EREG 유전자의 발현량이 증가한 DLD1에 대해서도, EREG_DG와 유사하게 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다(도 4).

인간 EREG 유전자의 발현량이 증가한 것은, 지금까지 방광암(Thogersen, V. et al ., Cancer Res. 61:6227-6233, 2001), 췌장암(Zhu. Z., et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun. 273: 1019-1024, 2000), 전립선암(Torring, N., et al ., Anticancer Res. 20: 91-95, 2000), 대장암(Baba, I., et al ., Cancer Res. 60: 6886-6889, 2000), 등으로 보고되고 있지만, 인간 EREG 유전자 발현량의 증가는 인간 EREG 단백질 발현량의 증가와 관련된 것을 본 발명자들에 의해 처음으로 나타났다.

[실시예 3] 항 EREG 단일클론 항체의 보체 의존적 독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 활성의 측정

3-1. 항 EREG 단일클론 항체의 CDC 활성의 측정

표적 세포로서 인간 대장암 세포주 DLD1가 이용되었다. DLD1의 배양에는 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배양(GIBCO BRL사)이 이용되었다. DLD1 세포 5 x 10⁵개가 원심분리(1000 rpm, 5분간, 4℃)로 회수되었다. 세포 펠렛을 3.7 MBq의 Chromium-51(Code No. CJS4, Amersham Pharmacia Biotech)을 포함하는 대략 200 ㎕의 배양액에 현탁하였고, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 배양액에서 3회 세척한 후에, 배양액에서 세포 밀도를 1 x 10⁴ 세포/㎖로 조정한 후, 96웰 바닥이 평편한 플레이트에 100 ㎕/웰 씩 첨가하였다.

이후, 항 EREG 단일클론 항체(B3#18_IgG2b) 및 대조군 마우스 IgG2a 항체(Cat. No. 553453, BD Biosciences Pharmingen)가 배양액에 희석한 후에, 각 웰에 50 ㎕씩 첨가되었다. 항체의 최종농도는 10 ㎍/㎖으로 조정한 후, 배양액에 5배 희석된 아기 토끼 보체(baby rabbit complement; Cat. No. CL3441, Cederlane)를 50 ㎕/웰 씩 첨가한 후, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃에서 1.5시간 동안 정치하였다. 이후, 상기 플레이트를 원심분리(1000 rpm, 5분간, 4℃)하였고, 100 ㎕의 상등액을 상기 플레이트의 각 웰에서 회수하여, 상기 회수된 상등액의 방사 활성을 감마 카운터(1480 WIZARD 3", Wallac)를 이용하여 측정하였다. 상기 특이적 크롬 방출율은 하기 수학식에 근거하여 결정되었다:

특이적 크롬 방출율(%) = (A - C) x 100/(B - C)

상기 식 중,

A: 각 웰에 있어서의 방사 활성;

B: 100 ㎖의 세포에 100 ㎕의 2% NP-40 용액(Nonidet P-40, Code No. 252-23, Nacalai Tesque)를 첨가한 웰에서의 방사 활성의 평균값; 및,

C: 100 ㎕의 세포에 100 ㎕의 배양액을 첨가한 웰에서의 방사 활성의 평균값. 상기 측정은 두 번씩 반복수행되었고, 각 웰의 상등액의 크롬 방출율의 평균값 및 표준 편차가 산출되었다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 실험에 사용된 항 EREG 단일클론 항체에 대한 CDC 활성이 확인되었다. 한편 대조군으로서 이용한 마우스 IgG2a 항체는 같은 농도에서 CDC 활성을 나타내지 않았다.

3-2. 항 EREG 단일클론 항체의 ADCC 활성의 측정

ADCC 활성의 측정은 CDC의 경우와 마찬가지로 인간 대장암 세포주 DLD1을 이용해 실시되었다. 즉, 세포를 96웰 바닥이 평편한 플레이트에서 배양한 후, Chromium-51으로 반응시켰다. 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배양액(Invitrogen사)에서 각 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 배양액을 첨가하였다. 이후, 각 항 EREG 단일클론 항체(B2#30, B3#18 및 B3#41) 50 ㎕을 배양액에 희석한 후, 각 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 최종 농도 1 ㎍/㎖으로 첨가하였다. 이후, 각 웰에 이펙터 세포 용액(effector cell: 1 x 10⁷ 세포/㎖) 50 ㎕을 첨가한 후, 상기 플레이트를 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃에서 한 시간 동안 정치하였고, 이후, 특이적 크롬 방출율을 결정하였다. 이펙터 세포는 50 ng/㎖의 재조합 인간 인터루킨-2(Cat. No. 200-02, Peprotech)를 포함하는 배지에서 Balb/c 마우스(Charles River Japan)의 비장 세포를 5일 동안 배양함으로써 수득하거나, 50 ng/㎖의 재조합 인간 인터루킨-2 및 10 ng/㎖의 재조합 마우스 GM-CSF(Cat. No. 315-03, Peprotech)를 포함하는 배지에서, 동일한 마우스 유래의 골수 세포를 6일간 배양함으로써 수득하였다.

상기 결과는 실험에서 사용된 모든 항 EREG 단일클론 항체에서 DLD1에 대한 ADCC 활성이 유도된 것을 나타내었다(도 6).

[실시예 4] 인간 EREG에 의해 증가된 세포 증식에 대한 항 EREG 단일클론 항체의 중화 활성의 측정

4-1. EGFR-mG-CSF 키메라 수용체(EGFR_BAF)를 발현하는 Ba/F3 세포주의 제작

표준 방법을 이용하여, 서열번호 35로 기재된 서열(GenBank Acc. No. NM_005228)을 갖는 상기 인간 EGF 수용체(이하, "EGFR")를 분리하였고, 이후 mG-CSFR와 인간 EGF 수용체가 융합된 키메라 수용체를 발현할 수 있는 벡터를 제조하였다. 간략하게, 상기 벡터(pCV_hEGFR/mG-CSFR)는 인간 EGFR의 세포외 도메인(Met7 - Ser645) 및 마우스 G-CSFR의 세포내 도메인(NM_007782)을 포함하는 키메라 수용체(hEGFR/mG-CSFR)를 발현한다. hEGFR/mG-CSFR 키메라 수용체의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 39 및 서열번호 40에 기재되었다.

PvuI으로 제한처리하여 수득한 15 ㎍의 선형화된 키메라 수용체(hEGFR/mG-CSFR)의 발현 벡터(pCV_hEGFR/mG-CSFR)를 Ba/F3 세포에 0.33 kV 및 950 mFD의 전기충격법(Gene Pulser: BioRad)으로 형질도입하였다. 10% FBS(GIBCO), 200 ㎍/㎖ 제네티신 및 재조합 인간 EREG(R&D Systems, Cat: 1195-EP/CF, 200 ng/㎖)를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 형질전환된 세포를 선별한 후, EGFR_BAF 세포주를 분리하였다.

4-2. EGFR_BAF의 EREG 의존성의 평가

실시예 4-1에 기재된 방법으로 분리된 EGFR_BAF의 인간 EREG 농도 의존성 세포 증식을 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 배양액으로부터 인간 EREG를 제거하기 위해, 상기 세포를 원심분리 한 후, RPMI 1640 + 10% FBS 배지에 현탁하였고, 이후 상기 세포를 2 x 10⁴ 세포/100 ㎕의 밀도로 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 배지에 희석된 인간 EREG(R&D Systems)를 여러 농도(7.8 내지 250 ng/㎖)로 세포에 첨가한 후, 상기 세포를 37℃에서 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 3일간 배양한 후, Cell Count Reagent SF 시약(Nacalai Tesque)을 첨가한 후, 제조사의 지시에 따라 2시간 동안 발색반응 한 후, 상기 반응액의 흡광도(450/655 ㎚)를 Benchmark Plus(Bio-Rad)를 이용하여 측정되었다.

유사하게는, AsPC1 인간 췌장암 세포주 및 DLD1 인간 대장암 세포주의 인간 EREG 의존성 증식도 상기 방법과 동일한 방법으로 검사되었다. CHO-S-SFMII(GIBCO)를 배지로 사용하였다.

EGFR_BAF(도 7) 및 AsPC1(도 8)은 인간 EREG 농도 의존성 방식으로 증폭된 것으로 나타났다. 그러나 DLD1은 인간 EREG 의존성을 나타내지 않았다(도 9).

4-3. 인간 EREG 의존성 증식에 대한 항 EREG 단일클론 항체의 중화 활성의 측정

인간 EREG에 의존적인 EGFR_BAF 증식에 대해, 항 EREG 단일클론 항체의 중화 활성을 검사하였다. EGFR_BAF를 인간 EREG(최종 농도 125 ng/㎖)를 포함하는 RPMI 1640 + 10% FBS 배지에 현탁한 후, 상기 세포를 웰 당 2 x 10⁴ 세포의 밀도로 96웰에 접종하였다. 배지에 희석한 항 EREG 단일클론 항체를 다양한 농도(0.008 내지 25 ㎍/㎖)로 세포에 첨가한 후, 상기 세포를 37℃에서 5% CO₂의 조건에서 3일간 배양하였다. 배양 후, Cell Count Reagent SF 시약(Nacalai Tesque)을 첨가한 후, 제조사의 지시에 따라 2시간 동안 발색반응 하였다. 이후, 450 ㎚에서 상기 반응액의 흡광도를 655 ㎚를 배경으로 하여 Benchmark Plus(Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다.

세포 증식율은 항체 농도가 0 ㎍/㎖인 경우를 배경으로 하여 상기 측정된 값을 이용하여 계산되었다[각 항체 농도에서의 OD 수치/배경에서의 OD 수치 × 100(%)]. 억제 효과를 갖는 것으로 알려진 항 인간 EREG 염소 다클론 항체(R&D Systems, Cat: AF1195)를 양성 대조군으로 이용하였다. 상기 항체 제품의 참조된 문헌은 Balb/3T3 섬유아 세포주의 인간 EREG 의존성 증식에 대한 중화활성을 나타낸다. 그러나 상기 참조된 문헌은 암 세포주에서 증식 억제 효과에 관해서는 어떠한 정보도 기술하지 않는다.

또한, 표적 세포로서 AsPC1을 이용한 항 EREG 단일클론 항체의 중화 활성은 상기 방법과 동일하게 세 가지 항체 농도 25, 2.5 및 0.25 ㎍/㎖에서 측정되었다.

각각의 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

EGFR_BAF 및 AsPC1에서, B2#30 및 B3#18은 중화활성을 나타내었고, B3#41은 매우 약한 중화활성을 나타내었다. 또한, B2#30 및 B3#18과 비교하여, 공지의 항 hEREG 염소 다클론 항체는 중화활성이 매우 약했다.

따라서, B2#30 및 B3#18은 EREG에 대해 중화활성을 가지고, 췌장암 세포주 AsPC1의 증식을 억제하는 것이 분명해졌다.

본 연구에서 분리된 항 EREG 단일클론 항체(B2#30 및 B3#18)가 ADCC 활성 및 CDC 활성과 관련된 세포 사멸 효과 및 인간 EREG 의존성 세포 증식(중화 활성)에 대한 억제 효과를 나타내고, 상기 항체는 인간 EREG 유전자의 발현이 증가된 암세포주에 대한 신규 메커니즘의 항체 의약품으로서 사용될 수 있는 것이 본 연구에서 증명되었다.

[실시예 5] 항 EREG 단일클론 항체의 가변영역 유전자 서열의 결정

EREG에 대한 중화 활성 및 DLD1 세포주에 대한 ADCC 활성 및 CDC 활성을 나타낸 B3#18(EP27) 하이브리도마 항체의 가변영역 유전자의 서열을 결정했다. 상기 항체 가변영역 유전자는 항 EREG 항체를 제조하는 하이브리도마 B3#18의 전체RNA를 이용하여, RT-PCR법에 따라 증폭되었다. 전체 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN사)를 이용하여 1 x 10⁷하이브리도마 세포에서 추출되었다.

SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH사)를 이용해 1 ㎍의 전체 RNA로부터 RACE 라이브러리를 구축했다. 한 시간 30분 동안 42℃에서 역전사 반응을 수행한 후, 마우스 IgG2b의 보존영역 서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG2b(서열번호 41) 또는 마우스 k 사슬의 보존영역 염기서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드인 카파(kappa; 서열번호 42)를 이용하여 5' 말단 cDNA를 증폭하였다. PCR 용액(50 ㎕)의 조성을 이하에 나타낸다:

5 ㎕의 10x Advantage 2 PCR 완충액;

5 ㎕의 10x Universal Primer A Mix;

0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP);

1 ㎕의 Advantage 2 Polymerase Mix(CLONTECH사);

2.5 ㎕의 역전사 반응 산물; 및,

10 pmole의 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG2b 또는 카파.

또한, PCR 및 반응 조건은 다음과 같다.

94℃의 초기 온도에서 30초간 한 후, /94℃에서 5초간/72℃에서 3분간의 사이클을 5회;

94℃에서 5초간/70℃에서 10초간/72℃에서 3분간의 사이클을 5회; 및,

94℃에서 5초간/68℃에서 10초간/72℃에서 3분간의 사이클을 25회.

마지막에 반응 산물은 72℃에서 7분간 가열되었다. 각 PCR 산물은 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사)를 이용하여 아가로스겔로부터 정제된 후, pGEM-T Easy 벡터(Promega사)에 클로닝 되어 그 염기서열이 결정되었다. B3#18의 H 쇠사슬 가변영역의 염기서열을 서열번호 43, 아미노산 서열을 서열번호 44, L 사슬 가변영역의 염기서열을 서열번호 45, 및 아미노산 서열을 서열번호 46에 각각 나타내었다.

C7(EP03), #15(EP08), B2#30(EP20), B3#8(EP24) 및 B3#41(EP29)의 가변영역 서열을 동일한 방법으로 결정하였다. 중쇄 가변영역의 증폭에는, 마우스 IgG1 보존영역 서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드인 MHC-IgG1(서열번호 47, 5'-ccatggagttagtttgggcagcagatcc-3')을 이용했다. 결정된 가변영역 염기서열을 서열번호 108(EP03, 중쇄), 110(EP03, 경쇄), 112(EP08, 중쇄), 114(EP08, 경쇄), 116(EP20, 중쇄), 118(EP20, 경쇄), 120(EP24, 중쇄), 122(EP24, 경쇄), 124(EP29, 중쇄) 및 126(EP29, 경쇄)에 나타냈다. 또한, 가변영역의 번역된 서열을 서열번호 109(EP03, 중쇄), 111(EP03, 경쇄), 113(EP08, 중쇄), 115(EP08, 경쇄), 117(EP20, 중쇄), 119(EP20, 경쇄), 121(EP24, 중쇄), 123(EP24, 경쇄), 125(EP29, 중쇄) 및 127(EP29, 경쇄)에 나타냈다. 각각 항체의 가변영역 서열 및 CDR1, CDR2, CDR3 아미노산 서열의 서열번호를 표 4에 기재했다.

[실시예 6] 재조합 키메라 항체의 EREG에 대한 결합 활성의 확인

분리된 항체 가변영역 서열과 인간 IgG1/IgK의 보존영역 서열을 가지는 재조합 키메라 항체가 EREG에 결합하는 것을 하기 방법으로 확인했다. 각각의 중쇄 가변영역 서열을 PCR로 증폭하여, 인간 키메라 항체 발현 벡터의 중쇄 클로닝 사이트에 삽입하였다. 이어서, 경쇄 가변영역 서열을 PCR로 증폭하여, 상기 중쇄 서열이 도입된, 인간 키메라 항체 발현 벡터의 경쇄 클로닝 사이트에 삽입하였다. 구축한 포유동물 세포 발현 벡터에 대해, 중쇄 및 경쇄의 항체 유전자는 마우스 CMV 프로모터의 조절하에서 전사되도록 설계되었다. 각 인간 키메라 항체의 염기서열 및 그 번역 서열의 서열번호를 표 5에 요약했다.

인간 키메라 항체 발현 벡터를 이용하여, 전기충격법으로 DG44 세포를 형질전환했다. 인간 키메라 항체 발현 벡터 상에 존재하는 선택 마커에 의해 획득되는 제네티신 내성을 지표로 재조합 세포 클론을 선택하였다. 재조합 클론의 세포 배양 상등액 중의 항체량을 항 인간 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법으로 정량하였고, 재조합 항체 발현 세포를 선택하였다. 선택한 재조합 세포의 배양 상등액에서 HiTrap Protein A 컬럼(Amersham Bioscience)을 이용하여 첨부 메뉴얼에 따라 인간 키메라 항체를 정제하였다.

sEREG-mFc를 Nunc-Immuno 플레이트로 코팅한 후, BSA를 포함하는 용액으로 차단한 후에 EREG에 대한 정제된 키메라 항체의 결합 반응성을 분석했다. 키메라 항체를 첨가해 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 플레이트를 세척하였다. 이어서, 알칼린 인산화효소로 표지된 항 인간 IgG 항체(BIOSOURCE, AHI0305)를 첨가하여 반응시켰다. 세척 후, 발색 시약 Sigma 104를 첨가함으로써 키메라 항체 결합량을 측정했다. 도 12에 나타낸 것처럼, 키메라 항체는 EREG에 대해서 농도 의존적인 결합을 나타냈다. 이상의 결과로부터, 분리된 항체 가변영역 서열이 정말로 항 EREG 항체에 유래하는 것인 것이 확인되었다.

[실시예 7] 키메라 항 EREG 항체의 in vitro ADCC 활성

항 EREG 키메라 항체의 인간 PBMC를 이용한 in vitro ADCC 활성을 도 13에 나타냈다. 1000 유닛/㎖의 헤파린 용액(주사용 Novo Heparin, 5000 단위, Novo Nordisk) 200 ㎕이 주입된 주사기를 이용해 정상인으로부터 말초혈액 50 ㎖을 채취하였다. 상기 말초혈액을 PBS(-)로 2배로 희석한 후, 4등분하여 15 ㎖의 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)를 미리 주입하였고, 원심분리 한 후 Leucosep 튜브(Cat. No. 227290, Greiner Bio-One) 에 첨가하여 림파구를 분리하였다. 원심분리(2150 rpm, 10분간, 실온)한 후, 단핵구 분획을 채취하였다. 10% FBS를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(SIGMA사)(이하, 10% FBS/D-MEM)로 1회 세포를 세척한 후, 10% FBS/D-MEM으로 세포 밀도를 5 x 10⁶/㎖에 조정함으로써, 인간 PBMC 용액을 제조하였다.

실시예 3과 유사한 방법으로, DLD-1 및 MIA-PaCa2 세포를 Chromium-51으로 표지하였다. 각 농도로 조정한 항체 용액을 표적 세포에 첨가한 후, 실온에서 15분간 반응시킨 후에, 인간 PBMC 용액(5 x 10⁵ 세포/웰)을 첨가하여 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 약 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액 중의 방사 활성을 감마 카운터를 이용하여 측정하였고, 실시예 3에 기재한 방법으로 크롬 방출율을 계산하였다. 모든 키메라 항체에 대해 ADCC 활성이 유도되었고, 키메라 항체 EP20, EP27 및 EP08는 특히 강한 활성이 있었다. 각각의 항체의 ADCC 유도의 강함에 관해서, 췌장암 세포주 MIA-PaCa2와 대장암 세포주 DLD-1에서 동일한 경향을 나타냈다.

[실시예 8] 항 EREG 항체의 종 교차성 및 에피토프 분석

분리된 항체의 마우스 EREG 및 유인원 EREG에 대한 교차 반응성을 분석하였다. 전장 마우스 EREG cDNA(NM_007950) 및 유인원 EREG cDNA(XM_001102069)는 cDNA 라이브러리를 주형으로 PCR에 증폭 및 클로닝 했다. 분리된 서열을 각각 서열번호 168 및 169로 기재했다. 실시예 2에 나타낸 방법으로, 수용성 마우스 EREG/마우스 IgG2a Fc 융합 단백질(이하, 마우스 EREG-mFc) 및 수용성 유인원 EREG/마우스 IgG2a Fc 융합 단백질(이하, 유인원 EREG-mFc)을 제조하였다. 마우스 EREG-mFc및 유인원 EREG-mFc의 서열을 각각 서열 번호 170 및 171로 기재했다. 인간 EREG-mFc, 마우스 EREG-mFc, 유인원 EREG-mFc 각각을 Nunc-Immuno 플레이트에 코팅한 후, BSA 를 포함하는 용액으로 차단하였다. 이후, 정제된 키메라 항체의 결합 반응성을 분석했다. 키메라 항체를 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하였다. 이어서, 알칼린 인산화효소로 표지된 항 인간 IgG 항체(BIOSOURCE, AHI0305)를 첨가하여 반응시켰다. 세척 후, 발색 시약 Sigma 104를 첨가함으로써 키메라 항체 결합량을 측정했다(도 14). 동일 항체 농도에 있어서의 각종 EREG에 대한 결합을, 횡축 "인간 EREG-mFc" 및 세로축 "마우스 EREG-mFc", 또는 횡축 "인간 EREG-mFc" 및 세로축 "유인원-EREG -mFc"로 도표화 함으로써, 동일 항체 농도에서의 EREG에 대한 항체의 결합 포화도의 차이를 확인하였다. 횡축에 따르는 도표는 인간 EREG에 대한 결합 선택성을 나타내고, EP08는 인간 EREG에 결합하지만, 마우스 EREG에는 결합하지 않는 것을 나타낸다. 포물선의 도표로 나타낸 EP27은 마우스 분자에 대해서 결합하지만, 결합 포화에 도달하려면 보다 고농도의 항체가 필요하고, 즉 인간 EREG에 비해 마우스 EREG에 대한 결합 친화도가 더 낮은 것을 나타낸다. 대각선상의 도표를 제공하는 항체는 다른 종의 EREG에 대해서 인간 EREG와 동등의 친화도를 나타내고 있다. 하이브리도마 생산 마우스 항체를 이용해 같은 분석을 한 결과를 표 3에 정리했다. 반응하지 않는 경우(-), 매우 낮은 반응성(+), 인간 분자에 비해 약간 약한 반응성(++), 인간 분자와 동등의 반응성(+++)의 4 단계로 표시했다.

항체의 에피토프 부위 분석을 목적으로, 인간 EREG 세포외 도메인 부분 단편에의 결합 반응성을 분석했다. 서열번호 21의 인간 EREG의 ²⁹A1a로부터 ⁶⁹Ser까지 의 N-말단 부분 서열을 GST 융합 단백질로서 발현 및 정제했다. 수득한 재조합 단백질의 서열을 서열번호 172로 기재했다. 성숙형 구조를 포함하는 수용성 인간 EREG 단편(서열번호 21의 ²⁹A1a로부터 ⁶⁹Ser까지 EGF 도메인에 해당)을 R&D Systems(cat. no. 1195-EP/CF)에서 구입했다. EREG 단백질의 단편을 이뮤노 플레이트에 고정화한 후, 상기 항체의 결합 반응성을 ELISA법으로 조사하여 그 결과를 표 3에 정리했다. 대부분이 EGF 도메인을 포함하는 수용성 EREG 단편(표 3에서, "ereg"로 표시)에 결합했다. EP25 및 EP32는 N-말단 부분 서열("Nterm")에 결합했다. 분리된 모든 항체가 펩티드 단편의 어느 쪽이든지 결합하였고, 109개 잔기 이후의 서열을 인식하지 못했다

[실시예 9] EREG 발현 세포에 의한 EGF 수용체 신호전달의 활성화

수용성 EREG는 EGF 수용체에 대한 낮은 친화도의 리간드로 보고되었다(참고문헌: Shelly et al .(1998) J. Biol. Chem. 273, 10496-505: Jones et al . (1999) FEBS Lett 447, 227-31). EGFR_BaF에 대한 효과 비교로부터, EREG는 EGF에 비해 EGF 수용체에 대해서 100배 이하의 낮은 활성(친화성)을 갖는 것이 확인되었다(도 15). 생리적 조건하에서 EREG는 혈중에 다량으로 존재하는 인자는 아니다. 암화에 수반하여 증가된 EREG 유전자 발현이 보고되었지만, 암환자의 혈액에서 고농도로 EREG 단백질이 검출된 보고는 없었다. 본 발명은 수용성 EREG 보다는 오히여 세포 막상에 발현된 막형의 EREG가 근처에 존재하는 EGF 수용체를 자극하는 것을 가설하였고, 국소적인 활성화 메커니즘이 존재할 수 있는 것을 하기처럼 검증하였다. 우선, EREG를 강제로 발현하는 세포와 EGFR_BaF를 공배양하여, 수용성 EREG 없이 EGFR_BaF의 증식이 촉진되는지를 확인했다. EREG 발현 세포 EREG_DG 및 음성 대조군인 DG44 세포를 5 x 10³ 세포/웰로, 96 웰 플레이트에 접종한 후, FCS를 포함하는 배지에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 1 x 10⁴의 EGFR_BaF, 음성 대조군인 Ba/F3 세포를 첨가해 3일간을 계속 배양했다. 도 16에 나타낸 것처럼 EREG를 발현하지 않는 DG44 세포와 공배양해도 EGFR_BaF의 증식은 전혀 자극되지 않는 한편, EREG 강제 발현 세포 EREG_DG와의 공배양으로 현저한 EGFR_BaF 증식 촉진이 관찰되었다. EREG_DG에 의한 증식 촉진은 항 EREG 항체 EP20(10 ㎍/㎖)의 첨가에 의해 억제되었다. EGFR_BaF 세포 증식을 WST-8 시약 첨가에 의해 정량하였다(도 17). Ba/F3 세포를 EREG_DG 세포와 공배양해도 증식 자극은 일어나지 않았고, EREG_DG와 EGFR_BaF의 공배양에 의해 촉진된 세포 증식은 항 EREG 항체 첨가에 의해 거의 완전하게 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

대장암 세포주 DLD-1에서는 EREG 이외에도, 암피레귤린(amphiregulin: EGF 리간드 패밀리의 구성원) mRNA 발현도 증가하는 것이 GeneChip 분석에 의해 확인되었다. EGF 수용체 시그널에 대해, 수용체를 활성화하는 리간드 패밀리 분자에 중복성이 존재하여, 하나의 리간드를 저해하는 것은 수용체 시그널 활성화 저해와 논리적으로 동일하지는 않다. DLD-1으로 EGFR_BaF를 공배양했을 경우, Ba/F3의 그것과 비교하여 현저하게 증식이 향상되었고, 상기 증식 자극은 항 EREG 중화 항체 EP20 또는 EP27의 첨가로 억제되는 것이 나타났다(도 18).

EREG_DG 및 DLD-1 세포 배양 상등액 중의 수용성 EREG 단백질량을 샌드위치 ELISA법으로 정량했다. 마우스 EP30를 이뮤노 플레이트에 고정화한 후, 차단하였다. 농도 계산을 위한 표준으로 수용성 재조합 인간 EREG(R&D Systems)사용하였고, 배양 3일 후에 세포 배양 상등액을 첨가했다. 인큐베이션 후, 키메라 EP20 항체 및 알칼린 인산화효소로 표지된 항 인간 IgG 항체로 EREG를 검출했다.

알칼린 인산화효소로 표지된 항 인간 IgG 항체(BIOSOURCE, AHI0305)를 첨가하여 반응시켰다. 세척 후, 발색 시약 Sigma 104를 첨가함으로써 키메라 항체 결합량을 측정했다(도 14). 표준품을 이용한 수용성 EREG 검출 결과를 도 19에 나타냈다. 배양 상등액 중의 EREG량은 검출 한도(1 ng/㎖)보다 낮았다. A405/655 검출치는 EREG_DG(0.157) 및 DLD-1(0.184)이었다. 상기 결과는 EREG에 의한 EGF 수용체 신호전달의 활성화는 근접한 세포 사이에서 일어나고, 막형 EREG가 활성화에 관여하고 있을 가능성이 매우 높은 것을 나타낸다.

EREG에 의한 EGF 수용체 활성화가 세포간 상호작용을 통해서 효율적으로 일어나는 것을 나타내는 결과는, 본 발명이 최초의 발견이며, 또한 상기 활성을 항 EREG 항체로 억제할 수 있는 것도 최초의 발견이다.

[실시예 10] 면역 조직 염색에 의한 대장암조직에서의 EREG 검출

암 조직에 있어서의 EREG 단백질 발현, 암 세포막 상에의 국재를 면역 조직 염색으로 확인했다. 면역 조직 염색은 임상암 조직으로부터 제작된 Tissue Array를 이용해 실시했고, 조직 표본의 제조는 하기와 같다. 수술 후 적출한 조직을 4% 파라포름알데히드로 하룻밤 고정한 후, O.O1 M 인산 완충액으로 2시간 동안 세척하였고, AMeX법(참고 문헌: Sato et al . (1986) Am. J. Pathol. 125, 431-5)에 의해 파라핀 포매하였다. 상기 블록으로부터 직경 1.5 ㎜의 암조직을 잘라내서, 약 2.5 x 3.0 ㎝의 새로운 블록으로 이식하였고, Tissue Array를 제조하기 위해 어레이 상에 여러 가지 조직을 배치하였다. 상기 Tissue Array를 박절한 후 파라핀을 제거하였고, 상기 섹션을 Ventana HX Discovery System(Ventana Medical Systems, Inc.)을 이용해 면역조직화학적으로 염색하였다. 50 ㎍/㎖의 항 EREG 마우스 단일클론 항체(EP27)를 박절한 조직에 첨가해 반응시켰다. 2차 항체로서 페록시다아제로 표지 한 항 마우스 IgG 항체를 첨가한 후, DAB을 이용하여 발색 반응을 하였다. 그 결과, 원발성 대장암에 있어 EREG 단백질의 발현 및 세포막에 국재가 검출되었다(도 20). 한편, 비암부 조직에 대해 같은 염색 조건에서 EREG 단백질은 전혀 검출되지 않았다. 암조직에 있어서의 단백질 발현 검출 및 막에서의 국재의 검출은, 본 발명에서 처음으로 발견됐다.

[실시예 11] 샌드위치 ELISA로 에피토프 인식에 따른 항 EREG 단일클론 항체의 분류

실시예 8에서, 항체 인식 에피토프는 주로 EREG의 성숙 EGF 도메인에 위치하는 것이 발견되었다. 즉, 항체 에피토프는 샌드위치 ELISA로 동일한 항원 분자에 대해 경쟁적으로 결합하지 않을 수 있는 항체의 조합을 확인함으로써 분류되었다. 마우스 항 EREG 항체를 1 ㎍/㎖으로 희석한 후, Nunc-Immuno 플레이트에 고정화하였다. 차단 후, 50 ㎍/㎖의 성숙한 EGF 도메인을 포함하는 수용성 인간 EREG 단편(서열번호 21의 ²⁹A1a로부터 ⁶⁹Ser까지) 또는 100 ㎍/㎖의 인간 EREG-mFc(서열번호 34)를 100 ㎕/웰의 농도로 첨가한 후, 상기 항원 분자를 마우스 항체로 포획하였다. 세척 후, 항 EREG 키메라 항체를 첨가하였고(항체 농도: 1, 0.33, 0.11 또는 0.037 ㎍/㎖), 항원을 포획한 상기 키메라 항체의 결합도는 알칼린 인산화효소로 표지된 항 인간 IgG 항체 및 발색 시약 Sigma 104를 첨가함으로써 정량되었다. 수득한 결과(도 21a 내지 도 21c)는 R 통계분석 소프트웨어(URL http://www.R-project.org.)를 이용하여 클러스터링 분석을 수행한 결과를 나타내고, 덴도그램은 도 22에 나타내었다. 도 22에서, 샌드위치 ELISA에서 더욱 다양한 반응 양성이 있었고, 더욱 다양한 항원 인식 방법이 있었다. EP20은 EP27을 포함하는 많은 항체와 동시에 EREG에 결합할 수 있고, EP20 에피토프가 독특한 것을 나타낸다. 도 22에서 EP29 내지 EP25의 클러스터에 속하는 항체는 다른 항체와 동시에 EREG에 결합하는 것을 차단하고, 이에 상기 항원 분자는 상기 항체에 의해 강하게 포획되는 것으로 사료된다.

본 발명의 상기 EREG 단백질 특이적 항체는 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암 등의 진단제로 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 진단제는 원발성 또는 전이성 암의 진단에 유용하다. 즉, 환자로부터 수집한 생물학적 시료에 포함된 EREG 단백질 또는 EREG를 암호화하는 mRNA를 검출함으로써 암이 검출될 수 있다. 또한, 원발성 대장암, 전이성 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 또는 신장암의 존재는 생체내에서 EREG를 발현하는 세포의 위치를 검출함으로써 검출될 수 있다.

또한, 본 발명에서 세포독성 활성을 갖는 항 EREG 항체는 EREG 단백질을 발현하는 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 즉, 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 또는 신장암의 세포와 같은 여러 종류의 암세포에 대한 세포독성제 또는 세포 증식 억제제는 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명에서 암세포에 대한 세포독성제 또는 세포 증식 억제제는 원발성 및 전이성 암에 모두 적용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 세포독성 활성을 갖는 항 EREG 항체는 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 또는 신장암의 세포와 같은 여러 종류의 암에 대한 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 항 EREG 항체는 원발성 및 전이성 암에 대한 치료제로 적용될 수 있다.

추가로, 본 발명의 항체를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자로 형질도입된 재조합 세포는 상기 언급된 효과 또는 더욱 바람직한 효과를 나타내는 재조합 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 발견에 근거하여, 암 치료제로 유용한 후보 화합물을 스크리닝 될 수 있다. 본 발명은 암의 EREG-의존성 증식을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선택된 화합물은 암의 EREG-의존성 증식을 억제하는 화합물로 고려될 수 있다. 본 발명에 의해 선택된 화합물은 안전성 및 암 특이성의 평가에 의해 항암제의 유용성을 평가하기 위한 후보 화합물로서 유용하다.

<110> FORERUNNER PHARMA RESEARCH CO., LTD. THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER USING ANTI-EREG ANTIBODY <130> 9fpi-03-09 <150> JP 2006-278819 <151> 2006-10-12 <150> PCT/JP2007-069988 <151> 2007-10-12 <160> 152 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 1 gacacctata tacag 15 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Asp Thr Tyr Ile Gln 1 5 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 3 aggattgatc ctctgaatgg taatactaaa tatgtcccga agttccaggg c 51 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Arg Ile Asp Pro Leu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 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12 Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 13 tacacatcta cattacagcc a 21 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 14 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 15 ctacagtatg ataatcttcg gacg 24 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 16 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 17 <211> 702 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(699) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> mat_peptide <222> (61)..(702) <220> <221> V_region <222> (61)..(378) <220> <221> C_region <222> (379)..(702) <400> 17 atg aga ccg tct att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 ggt gct cag tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct 96 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gca tct ctg gga ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac 144 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att cac aag tat ata gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct 192 Ile His Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 agg ctg ctc ata cag tac aca tct aca tta cag cca ggc atc cca tca 240 Arg Leu Leu Ile Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 aac ctg gag cct gaa gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gat 336 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 aat ctt cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg gct 384 Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 115 120 125 gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag cag tta 432 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 130 135 140 aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac ccc 480 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa aat 528 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 165 170 175 ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc acc tac 576 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga cat 624 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 195 200 205 aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca ccc att 672 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 210 215 220 gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt t ag 702 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 18 <211> 233 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile His Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 115 120 125 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 165 170 175 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 195 200 205 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 210 215 220 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 19 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(699) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> mat_peptide <222> (61)..(702) <220> <221> V_region <222> (61)..(378) <220> <221> C_region <222> (379)..(702) <400> 19 atg aga ccg tct att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 ggt gct cag tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct 96 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gca tct ctg gga ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac 144 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att cac aag tat ata gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct 192 Ile His Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 agg ctg ctc ata cag tac aca tct aca tta cag cca ggc atc cca tca 240 Arg Leu Leu Ile Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 aac ctg gag cct gaa gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gat 336 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 aat ctt cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgt acg 384 Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg 432 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc 480 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt 528 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac 576 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac 624 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc 672 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt t ga 702 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 20 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile His Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 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Cys Arg Trp Tyr 130 135 140 aga aat cga aaa agt aaa gaa cca aag aag gaa tat gag aga gtt acc 480 Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr 145 150 155 160 tca ggg gat cca gag ttg ccg caa gtc tga 510 Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val 165 <210> 22 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Thr Ala Gly Arg Arg Met Glu Met Leu Cys Ala Gly Arg Val Pro 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Cys Leu Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser 20 25 30 Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys 35 40 45 Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser 50 55 60 Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln 65 70 75 80 Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val 85 90 95 Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Thr Val His Gln 100 105 110 Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val Ala Leu Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu 115 120 125 Phe Leu Ile Thr Val Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Cys Arg Trp Tyr 130 135 140 Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr 145 150 155 160 Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val 165 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 23 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 24 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 26 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 27 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 28 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> 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atc cca gga gag tcc agt gat aac tgc aca gct tta gtt cag aca 144 Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys Thr Ala Leu Val Gln Thr 35 40 45 gaa gac aat cca cgt gtg gct caa gtg tca ata aca aag tgt agc tct 192 Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser 50 55 60 gac atg aat ggc tat tgt ttg cat gga cag tgc atc tat ctg gtg gac 240 Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp 65 70 75 80 atg agt caa aac tac tgc agg tgt gaa gtg ggt tat act ggt gtc cga 288 Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg 85 90 95 tgt gaa cac ttc ttt tta acc gtc cac caa cct tta agc aaa gag tat 336 Cys Glu His Phe Phe Leu Thr Val His Gln Pro Leu Ser Lys Glu Tyr 100 105 110 gtg gct cgc gga ccg aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca 384 Val Ala Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 115 120 125 gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag 432 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 130 135 140 atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg 480 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 145 150 155 160 gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg ttt 528 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 165 170 175 gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag 576 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 180 185 190 gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac 624 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 195 200 205 cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa 672 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 210 215 220 gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca 720 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 225 230 235 240 gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg 768 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 245 250 255 act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct 816 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 260 265 270 gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac 864 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 275 280 285 tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc atg 912 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 290 295 300 tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat agc 960 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 305 310 315 320 tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg act 1008 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 325 330 335 aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga 1038 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 340 345 <210> 34 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 34 Met Glu Met Leu Cys Ala Gly Arg Val Pro Ala Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu 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Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 ctc agc ctc cag agg atg ttc aat aac tgt gag gtg gtc ctt ggg aat 192 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 ttg gaa att acc tat gtg cag agg aat tat gat ctt tcc ttc tta aag 240 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 acc atc cag gag gtg gct ggt tat gtc ctc att gcc ctc aac aca gtg 288 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 gag cga att cct ttg gaa aac ctg cag atc atc aga gga aat atg tac 336 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 tac gaa aat tcc tat gcc tta gca gtc tta tct aac tat gat gca aat 384 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 aaa acc gga ctg aag gag ctg ccc atg aga aat tta cag gaa atc ctg 432 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 cat ggc gcc gtg cgg ttc agc aac aac cct gcc ctg tgc aac gtg gag 480 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn 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Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 acc acg tac cag atg gat gtg aac ccc gag ggc aaa tac agc ttt ggt 864 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 gcc acc tgc gtg aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat cac 912 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 ggc tcg tgc gtc cga gcc tgt ggg gcc gac agc tat gag atg gag gaa 960 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 gac ggc gtc cgc aag tgt aag aag tgc gaa ggg cct tgc cgc aaa gtg 1008 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata aat 1056 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc gat 1104 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat act 1152 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag gaa 1200 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg gac 1248 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag caa 1296 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc ttg 1344 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att tca 1392 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa ctg 1440 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt gaa 1488 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc ccc 1536 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg aat 1584 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag ggt 1632 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac cca 1680 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga cca 1728 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc gtc 1776 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc tgg 1824 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac tgc 1872 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat ggg 1920 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 cct aag atc ccg tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc ttg 1968 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg cga agg cgc cac 2016 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 atc gtt cgg aag cgc acg ctg cgg agg ctg ctg cag gag agg gag ctt 2064 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 gtg gag cct ctt aca ccc agt gga gaa gct ccc aac caa gct ctc ttg 2112 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 agg atc ttg aag gaa act gaa ttc aaa aag atc aaa gtg ctg ggc tcc 2160 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 ggt gcg ttc ggc acg gtg tat aag gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag 2208 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 aaa gtt aaa att ccc gtc gct atc aag gaa tta aga gaa gca aca tct 2256 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 ccg aaa gcc aac aag gaa atc ctc gat gaa gcc tac gtg atg gcc agc 2304 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 gtg gac aac ccc cac gtg tgc cgc ctg ctg ggc atc tgc ctc acc tcc 2352 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 acc gtg cag ctc atc acg cag ctc atg ccc ttc ggc tgc ctc ctg gac 2400 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 tat gtc cgg gaa cac aaa gac aat att ggc tcc cag tac ctg ctc aac 2448 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu 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Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala 1025 1030 1035 1040 acc agc aac aat tcc acc gtg gct tgc att gat aga aat ggg ctg caa 3168 Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055 agc tgt ccc atc aag gaa gac agc ttc ttg cag cga tac agc tca gac 3216 Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp 1060 1065 1070 ccc aca ggc gcc ttg act gag gac agc ata gac gac acc ttc ctc cca 3264 Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro 1075 1080 1085 gtg cct gaa tac ata aac cag tcc gtt ccc aaa agg ccc gct ggc tct 3312 Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser 1090 1095 1100 gtg cag aat cct gtc tat cac aat cag cct ctg aac ccc gcg ccc agc 3360 Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser 1105 1110 1115 1120 aga gac cca cac tac cag gac ccc cac agc act gca gtg ggc aac ccc 3408 Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro 1125 1130 1135 gag tat ctc aac act gtc cag ccc acc tgt gtc aac agc aca ttc gac 3456 Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp 1140 1145 1150 agc cct gcc cac tgg gcc cag aaa ggc agc cac caa att agc ctg gac 3504 Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp 1155 1160 1165 aac cct gac tac cag cag gac ttc ttt ccc aag gaa gcc aag cca aat 3552 Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn 1170 1175 1180 ggc atc ttt aag ggc tcc aca gct gaa aat gca gaa tac cta agg gtc 3600 Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 gcg cca caa agc agt gaa ttt att gga gca tga 3633 Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 36 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly 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Pro Pro Val Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ala Ser Cys Thr Ile 35 40 45 agc cca aac tgc agc aaa ctg gac caa cag gca aag atc tta tgg aga 192 Ser Pro Asn Cys Ser Lys Leu Asp Gln Gln Ala Lys Ile Leu Trp Arg 50 55 60 ctg caa gat gag ccc atc caa cct ggg gac aga cag cat cat ctg cct 240 Leu Gln Asp Glu Pro Ile Gln Pro Gly Asp Arg Gln His His Leu Pro 65 70 75 80 gat ggg acc caa gag tcc ctc atc act ctg cct cac ttg aac tac acc 288 Asp Gly Thr Gln Glu Ser Leu Ile Thr Leu Pro His Leu Asn Tyr Thr 85 90 95 cag gcc ttc ctc ttc tgc tta gtg cca tgg gaa gac agc gtc caa ctc 336 Gln Ala Phe Leu Phe Cys Leu Val Pro Trp Glu Asp Ser Val Gln Leu 100 105 110 ctg gat caa gct gag ctt cac gca ggc tat ccc cct gcc agc ccc tca 384 Leu Asp Gln Ala Glu Leu His Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser 115 120 125 aac cta tcc tgc ctc atg cac ctc acc acc aac agc ctg gtc tgc cag 432 Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln 130 135 140 tgg gag cca ggt cct gag acc cac ctg ccc acc agc ttc atc cta aag 480 Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys 145 150 155 160 agc ttc agg agc cgc gcc gac tgt cag tac caa ggg gac acc atc ccg 528 Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro 165 170 175 gat tgt gtg gca aag aag agg cag aac aac tgc tcc atc ccc cga aaa 576 Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys 180 185 190 aac ttg ctc ctg tac cag tat atg gcc atc tgg gtg caa gca gag aat 624 Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn 195 200 205 atg cta ggg tcc agc gag tcc cca aag ctg tgc ctc gac ccc atg gat 672 Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp 210 215 220 gtt gtg aaa ttg gag cct ccc atg ctg cag gcc ctg gac att ggc cct 720 Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro 225 230 235 240 gat gta gtc tct cac cag cct ggc tgc ctg tgg ctg agc tgg aag cca 768 Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro 245 250 255 tgg aag ccc agt gag tac atg gaa cag gag tgt gaa ctt cgc tac cag 816 Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln 260 265 270 cca cag ctc aaa gga gcc aac tgg act ctg gtg ttc cac ctg cct tcc 864 Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr Leu Val Phe His Leu Pro Ser 275 280 285 agc aag gac cag ttt gag ctc tgc ggg ctc cat cag gcc cca gtc tac 912 Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly Leu His Gln Ala Pro Val Tyr 290 295 300 acc cta cag atg cga tgc att cgc tca tct ctg cct gga ttc tgg agc 960 Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser 305 310 315 320 ccc tgg agc ccc ggc ctg cag ctg agg cct acc atg aag gcc ccc acc 1008 Pro Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg Pro Thr Met Lys Ala Pro Thr 325 330 335 atc aga ctg gac acg tgg tgt cag aag aag caa cta gat cca ggg aca 1056 Ile Arg Leu Asp Thr Trp Cys Gln Lys Lys Gln Leu Asp Pro Gly Thr 340 345 350 gtg agt gtg cag ctg ttc tgg aag cca acg ccc ctg cag gaa gac agt 1104 Val Ser Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Thr Pro Leu Gln Glu Asp Ser 355 360 365 gga cag atc cag ggc tac ctg ctg tcc tgg aat tcc cca gat cat caa 1152 Gly Gln Ile Gln Gly Tyr Leu Leu Ser Trp Asn Ser Pro Asp His Gln 370 375 380 ggg cag gac ata cac ctt tgc aac acc acg cag ctc agc tgt atc ttc 1200 Gly Gln Asp Ile His Leu Cys Asn Thr Thr Gln Leu Ser Cys Ile Phe 385 390 395 400 ctc ctg ccc tca gag gcc cag aac gtg acc ctt gtg gcc tac aac aaa 1248 Leu Leu Pro Ser Glu Ala Gln Asn Val Thr Leu Val Ala Tyr Asn Lys 405 410 415 gca ggg acc tct tca cct act aca gtg gtt ttc ctg gag aac gaa ggt 1296 Ala Gly Thr Ser Ser Pro Thr Thr Val Val Phe Leu Glu Asn Glu Gly 420 425 430 cca gct gtg acc gga ctc cat gcc atg gcc caa gac ctt aac acc atc 1344 Pro Ala Val Thr Gly Leu His Ala Met Ala Gln Asp Leu Asn Thr Ile 435 440 445 tgg gta gac tgg gaa gcc ccc agc ctt ctg cct cag ggc tat ctc att 1392 Trp Val Asp Trp Glu Ala Pro Ser Leu Leu Pro Gln Gly Tyr Leu Ile 450 455 460 gag tgg gaa atg agt tct ccc agc tac aat aac agc tat aag tcc tgg 1440 Glu Trp Glu Met Ser Ser Pro Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Lys Ser Trp 465 470 475 480 atg ata gaa cct aac ggg aac atc act gga att ctg tta aag gac aac 1488 Met Ile Glu Pro Asn Gly Asn Ile Thr Gly Ile Leu Leu Lys Asp Asn 485 490 495 ata aat ccc ttt cag ctc tac aga att aca gtg gct ccc ctg tac cca 1536 Ile Asn Pro Phe Gln Leu Tyr Arg Ile Thr Val Ala Pro Leu Tyr Pro 500 505 510 ggc atc gtg gga ccc cct gta aat gtc tac acc ttc gct gga gag aga 1584 Gly Ile Val Gly Pro Pro Val Asn Val Tyr Thr Phe Ala Gly Glu Arg 515 520 525 gct cct cct cat gct cca gcg ctg cat cta aag cat gtt ggc aca acc 1632 Ala Pro Pro His Ala Pro Ala Leu His Leu Lys His Val Gly Thr Thr 530 535 540 tgg gca cag ctg gag tgg gta cct gag gcc cct agg ctg ggg atg ata 1680 Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Ala Pro Arg Leu Gly Met Ile 545 550 555 560 ccc ctc acc cac tac acc atc ttc tgg gcc gat gct ggg gac cac tcc 1728 Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Ala Asp Ala Gly Asp His Ser 565 570 575 ttc tcc gtc acc cta aac atc tcc ctc cat gac ttt gtc ctg aag cac 1776 Phe Ser Val Thr Leu Asn Ile Ser Leu His Asp Phe Val Leu Lys His 580 585 590 ctg gag ccc gcc agt ttg tat cat gtc tac ctc atg gcc acc agt cga 1824 Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Val Tyr Leu Met Ala Thr Ser Arg 595 600 605 gca ggg tcc acc aat agt aca ggc ctt acc ctg agg acc cta gat cca 1872 Ala Gly Ser Thr Asn Ser Thr Gly Leu Thr Leu Arg Thr Leu Asp Pro 610 615 620 tct gac tta aac att ttc ctg ggc ata ctt tgc tta gta ctc ttg tcc 1920 Ser Asp Leu Asn Ile Phe Leu Gly Ile Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser 625 630 635 640 act acc tgt gta gtg acc tgg ctc tgc tgc aaa cgc aga gga aag act 1968 Thr Thr Cys Val Val Thr Trp Leu Cys Cys Lys Arg Arg Gly Lys Thr 645 650 655 tcc ttc tgg tca gat gtg cca gac cca gcc cac agt agc ctg agc tcc 2016 Ser Phe Trp Ser Asp Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Ser Ser 660 665 670 tgg ttg ccc acc atc atg aca gag gaa acc ttc cag tta ccc agc ttc 2064 Trp Leu Pro Thr Ile Met Thr Glu Glu Thr Phe Gln Leu Pro Ser Phe 675 680 685 tgg gac tcc agc gtg cca tca atc acc aag atc act gaa ctg gag gaa 2112 Trp Asp Ser Ser Val Pro Ser Ile Thr Lys Ile Thr Glu Leu Glu Glu 690 695 700 gac aag aaa ccg acc cac tgg gat tcc gaa agc tct ggg aat ggt agc 2160 Asp Lys Lys Pro Thr His Trp Asp Ser Glu Ser Ser Gly Asn Gly Ser 705 710 715 720 ctt cca gcc ctg gtt cag gcc tat gtg ctc caa gga gat cca aga gaa 2208 Leu Pro Ala Leu Val Gln Ala Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Glu 725 730 735 att tcc aac cag tcc cag cct ccc tct cgc act ggt gac cag gtc ctc 2256 Ile Ser Asn Gln Ser Gln Pro Pro Ser Arg Thr Gly Asp Gln Val Leu 740 745 750 tat ggt cag gtg ctt gag agc ccc acc agc cca gga gta atg cag tac 2304 Tyr Gly Gln Val Leu Glu Ser Pro Thr Ser Pro Gly Val Met Gln Tyr 755 760 765 att cgc tct gac tcc act cag ccc ctc ttg ggg ggc ccc acc cct agc 2352 Ile Arg Ser Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser 770 775 780 cct aaa tct tat gaa aac atc tgg ttc cat tca aga ccc cag gag acc 2400 Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Ile Trp Phe His Ser Arg Pro Gln Glu Thr 785 790 795 800 ttt gtg ccc caa cct cca aac cag gaa gat gac tgt gtc ttt ggg cct 2448 Phe Val Pro Gln Pro Pro Asn Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro 805 810 815 cca ttt gat ttt ccc ctc ttt cag ggg ctc cag gtc cat gga gtt gaa 2496 Pro Phe Asp Phe Pro Leu Phe Gln Gly Leu Gln Val His Gly Val Glu 820 825 830 gaa caa ggg ggt ttc tag 2514 Glu Gln Gly Gly Phe 835 <210> 38 <211> 837 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Met Val Gly Leu Gly Ala Cys Thr Leu Thr Gly Val Thr Leu Ile Phe 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Arg Ser Leu Glu Ser Cys Gly His Ile Glu Ile Ser 20 25 30 Pro Pro Val Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ala Ser Cys Thr Ile 35 40 45 Ser Pro Asn Cys Ser Lys Leu Asp Gln Gln Ala Lys Ile Leu Trp Arg 50 55 60 Leu Gln Asp Glu Pro Ile Gln Pro Gly Asp Arg Gln His His Leu Pro 65 70 75 80 Asp Gly Thr Gln Glu Ser Leu Ile Thr Leu Pro His Leu Asn Tyr Thr 85 90 95 Gln Ala Phe Leu Phe Cys Leu Val Pro Trp Glu Asp Ser Val Gln Leu 100 105 110 Leu Asp Gln Ala Glu Leu His Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser 115 120 125 Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln 130 135 140 Trp Glu Pro Gly Pro Glu 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Trp Lys Pro Thr Pro Leu Gln Glu Asp Ser 355 360 365 Gly Gln Ile Gln Gly Tyr Leu Leu Ser Trp Asn Ser Pro Asp His Gln 370 375 380 Gly Gln Asp Ile His Leu Cys Asn Thr Thr Gln Leu Ser Cys Ile Phe 385 390 395 400 Leu Leu Pro Ser Glu Ala Gln Asn Val Thr Leu Val Ala Tyr Asn Lys 405 410 415 Ala Gly Thr Ser Ser Pro Thr Thr Val Val Phe Leu Glu Asn Glu Gly 420 425 430 Pro Ala Val Thr Gly Leu His Ala Met Ala Gln Asp Leu Asn Thr Ile 435 440 445 Trp Val Asp Trp Glu Ala Pro Ser Leu Leu Pro Gln Gly Tyr Leu Ile 450 455 460 Glu Trp Glu Met Ser Ser Pro Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Lys Ser Trp 465 470 475 480 Met Ile Glu Pro Asn Gly Asn Ile Thr Gly Ile Leu Leu Lys Asp Asn 485 490 495 Ile Asn Pro Phe Gln Leu Tyr Arg Ile Thr Val Ala Pro Leu Tyr Pro 500 505 510 Gly Ile Val Gly Pro Pro Val Asn Val Tyr Thr Phe Ala Gly Glu Arg 515 520 525 Ala Pro Pro His Ala Pro Ala Leu His Leu Lys His Val Gly Thr Thr 530 535 540 Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Ala Pro Arg Leu Gly Met Ile 545 550 555 560 Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Ala Asp Ala Gly Asp His Ser 565 570 575 Phe Ser Val Thr Leu Asn Ile Ser Leu His Asp Phe Val Leu Lys His 580 585 590 Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Val Tyr Leu Met Ala Thr Ser Arg 595 600 605 Ala Gly Ser Thr Asn Ser Thr Gly Leu Thr Leu Arg Thr Leu Asp Pro 610 615 620 Ser Asp Leu Asn Ile Phe Leu Gly Ile Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser 625 630 635 640 Thr Thr Cys Val Val Thr Trp Leu Cys Cys Lys Arg Arg Gly Lys Thr 645 650 655 Ser Phe Trp Ser Asp Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Ser Ser 660 665 670 Trp Leu Pro Thr Ile Met Thr Glu Glu Thr Phe Gln Leu Pro Ser Phe 675 680 685 Trp Asp Ser Ser Val Pro Ser Ile Thr Lys Ile Thr Glu Leu Glu Glu 690 695 700 Asp Lys Lys Pro Thr His Trp Asp Ser Glu Ser Ser Gly Asn Gly Ser 705 710 715 720 Leu Pro Ala Leu Val Gln Ala Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Glu 725 730 735 Ile Ser Asn Gln Ser Gln Pro Pro Ser Arg Thr Gly Asp Gln Val Leu 740 745 750 Tyr Gly Gln Val Leu Glu Ser Pro Thr Ser Pro Gly Val Met Gln Tyr 755 760 765 Ile Arg Ser Asp Ser Thr Gln 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Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 gcc acc tgc gtg aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat cac 912 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 ggc tcg tgc gtc cga gcc tgt ggg gcc gac agc tat gag atg gag gaa 960 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 gac ggc gtc cgc aag tgt aag aag tgc gaa ggg cct tgc cgc aaa gtg 1008 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata aat 1056 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc gat 1104 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat act 1152 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag gaa 1200 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg gac 1248 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag caa 1296 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc ttg 1344 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att tca 1392 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa ctg 1440 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt gaa 1488 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc ccc 1536 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg aat 1584 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag ggt 1632 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac cca 1680 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga cca 1728 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc gtc 1776 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc tgg 1824 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac tgc 1872 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat ggg 1920 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 cct aag atc ccg tcc gat cca tct gac tta aac att ttc ctg gag atc 1968 Pro Lys Ile Pro Ser Asp Pro Ser Asp Leu Asn Ile Phe Leu Glu Ile 645 650 655 ctt tgc tta gta ctc ttg tcc act acc tgt gta gtg acc tgg ctc tgc 2016 Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Thr Thr Cys Val Val Thr Trp Leu Cys 660 665 670 tgc aaa cgc aga gga aag act tcc ttc tgg tca gat gtg cca gac cca 2064 Cys Lys Arg Arg Gly Lys Thr Ser Phe Trp Ser Asp Val Pro Asp Pro 675 680 685 gcc cac agt agc ctg agc tcc tgg ttg ccc acc atc atg aca gag gaa 2112 Ala His Ser Ser Leu Ser Ser Trp Leu Pro Thr Ile Met Thr Glu Glu 690 695 700 acc ttc cag tta ccc agc ttc tgg gac tcc agc gtg cca tca atc acc 2160 Thr Phe Gln Leu Pro Ser Phe Trp Asp Ser Ser Val Pro Ser Ile Thr 705 710 715 720 aag atc act gaa ctg gag gaa gac aag aaa ccg acc cac tgg gat tcc 2208 Lys Ile Thr Glu Leu Glu Glu Asp Lys Lys Pro Thr His Trp Asp Ser 725 730 735 gaa agc tct ggg aat ggt agc ctt cca gcc ctg gtt cag gcc tat gtg 2256 Glu Ser Ser Gly Asn Gly Ser Leu Pro Ala Leu Val Gln Ala Tyr Val 740 745 750 ctc caa gga gat cca aga gaa att tcc aac cag tcc cag cct ccc tct 2304 Leu Gln Gly Asp Pro Arg Glu Ile Ser Asn Gln Ser Gln Pro Pro Ser 755 760 765 cgc act ggt gac cag gtc ctc tat ggt cag gtg ctt gag agc ccc acc 2352 Arg Thr Gly Asp Gln Val Leu Tyr Gly Gln Val Leu Glu Ser Pro Thr 770 775 780 agc cca gga gta atg cag tac att cgc tct gac tcc act cag ccc ctc 2400 Ser Pro Gly Val Met Gln Tyr Ile Arg Ser Asp Ser Thr Gln Pro Leu 785 790 795 800 ttg ggg ggc ccc acc cct agc cct aaa tct tat gaa aac atc tgg ttc 2448 Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Ile Trp Phe 805 810 815 cat tca aga ccc cag gag acc ttt gtg ccc caa cct cca aac cag gaa 2496 His Ser Arg Pro Gln Glu Thr Phe Val Pro Gln Pro Pro Asn Gln Glu 820 825 830 gat gac tgt gtc ttt ggg cct cca ttt gat ttt ccc ctc ttt cag ggg 2544 Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro Pro Phe Asp Phe Pro Leu Phe Gln Gly 835 840 845 ctc cag gtc cat gga gtt gaa gaa caa ggg ggt ttc tag 2583 Leu Gln Val His Gly Val Glu Glu Gln Gly Gly Phe 850 855 860 <210> 40 <211> 860 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 40 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Asp Pro Ser Asp Leu Asn Ile Phe Leu Glu Ile 645 650 655 Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Thr Thr Cys Val Val Thr Trp Leu Cys 660 665 670 Cys Lys Arg Arg Gly Lys Thr Ser Phe Trp Ser Asp Val Pro Asp Pro 675 680 685 Ala His Ser Ser Leu Ser Ser Trp Leu Pro Thr Ile Met Thr Glu Glu 690 695 700 Thr Phe Gln Leu Pro Ser Phe Trp Asp Ser Ser Val Pro Ser Ile Thr 705 710 715 720 Lys Ile Thr Glu Leu Glu Glu Asp Lys Lys Pro Thr His Trp Asp Ser 725 730 735 Glu Ser Ser Gly Asn Gly Ser Leu Pro Ala Leu Val Gln Ala Tyr Val 740 745 750 Leu Gln Gly Asp Pro Arg Glu Ile Ser Asn Gln Ser Gln Pro Pro Ser 755 760 765 Arg Thr Gly Asp Gln Val Leu Tyr Gly Gln Val Leu Glu Ser Pro Thr 770 775 780 Ser Pro Gly Val Met Gln Tyr Ile Arg Ser Asp Ser Thr Gln Pro Leu 785 790 795 800 Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Ile Trp Phe 805 810 815 His Ser Arg Pro Gln Glu Thr Phe Val Pro Gln Pro Pro Asn Gln Glu 820 825 830 Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro Pro Phe Asp Phe Pro Leu Phe Gln Gly 835 840 845 Leu Gln Val His Gly Val Glu Glu Gln Gly Gly Phe 850 855 860 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 41 caggggccag tggatagacc gatg 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 42 gctcactgga tggtgggaag atg 23 <210> 43 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <220> <221> V_region <222> (1)..(348) <400> 43 gag gat cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag cca ggg gcc 48 Glu Asp Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aaa gac acc 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 tat ata cag tgg gtg aag ctg agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile Gln Trp Val Lys Leu Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct ctg aat ggt aat act aaa tat gtc ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Leu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aat aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gtt agg tct ggg acc ctc ttt gac ttc tgg ggc caa ggc acc act ctc 336 Val Arg Ser Gly Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 aca gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Glu Asp Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile Gln Trp Val Lys Leu Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Leu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <220> <221> V_region <222> (1)..(318) <400> 45 gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac att cac aag tat 96 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr 20 25 30 ata gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct agg ctg ctc ata 144 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 cag tac aca tct aca tta cag cca ggc atc cca tca agg ttc agt gga 192 Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc aac ctg gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gat aat ctt cgg acg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Thr 85 90 95 ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 47 ccatggagtt agtttgggca gcagatcc 28 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 48 aac tac tgg atg aac 15 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 50 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 50 agg att cat cct tct gat agt gaa act cac tac aat caa aag ttc aag 48 Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 aac 51 Asn <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(24) <400> 52 tta tat tac tat act atg gac tac 24 Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 54 aag gca agc caa gac att aac aag aat ata gct 33 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Asn Ile Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Asn Ile Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 56 tac aca tct aca tta cag cca 21 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 58 cta cag tat gat aat ctt ccg tat acg 27 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 60 agc tac tgg atg cac 15 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 62 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 62 gag att aat cct tac aat ggt ggt act aac tac aat gag aag ttc aag 48 Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 agc 51 Ser <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(18) <400> 64 tgg aag ttg ggg act tac 18 Trp Lys Leu Gly Thr Tyr 1 5 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 65 Trp Lys Leu Gly Thr Tyr 1 5 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 66 cgg gca agt cag gaa att agt ggt tac tta agc 33 Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 68 gcc gca tcc act tta gat tct 21 Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser 1 5 <210> 70 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 70 cta caa tat gct agt tat cct cgg acg 27 Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 72 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 72 gtt tat tct ttg cac 15 Val Tyr Ser Leu His 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Val Tyr Ser Leu His 1 5 <210> 74 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 74 gtt att agt act tac tat ggt gat gct atc tac aac cag aag ttc aag 48 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 ggc 51 Gly <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 76 gag ggg aat ggt aac ccc ctt gac tac 27 Glu Gly Asn Gly Asn Pro Leu Asp Tyr 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Glu Gly Asn Gly Asn Pro Leu Asp Tyr 1 5 <210> 78 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <400> 78 act gcc agc tca agt gta agt tcc agt tac ttg cac 36 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 80 agc aca tcc aac ctg gct tct 21 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 82 cac cag tat cat cgt tcc ccg ctc acg 27 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 84 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 84 agt tat ggt gta cac 15 Ser Tyr Gly Val His 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Ser Tyr Gly Val His 1 5 <210> 86 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 86 gtg ata tgg agg gat gga agc aca acc tat aat tca gct ctc aaa tcc 48 Val Ile Trp Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 87 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Val Ile Trp Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(24) <400> 88 aat tgg aat ggt ctt atg gac tac 24 Asn Trp Asn Gly Leu Met Asp Tyr 1 5 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Asn Trp Asn Gly Leu Met Asp Tyr 1 5 <210> 90 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 90 agg gca agt cag gac att agc tat tat tta aac 33 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 92 tac aca tca aga tta cac tca 21 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 94 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 94 caa cag ggt cat acg gtt ccg tgg acg 27 Gln Gln Gly His Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Gln Gln Gly His Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 96 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 96 agc tac tgg atg cac 15 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 98 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 98 gct att tat cct gga aac agt gat agc tac aac cag aag ttc aag ggc 48 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 100 <211> 12 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(12) <400> 100 gtt atg gcc tac 12 Val Met Ala Tyr 1 <210> 101 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Val Met Ala Tyr 1 <210> 102 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 102 cgg gca agt cag gac att ggt aat agc tta aac 33 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 104 gcc aca tcc aat tta gat tct 21 Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 106 cta caa tat gct agt tct ccg tgg acg 27 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 108 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 108 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac act ttc acc aac tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cga ggc ctc gag tgg att 144 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att cat cct tct gat agt gaa act cac tac aat caa aag ttc 192 Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag aac aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atc caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tat tgt 288 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aat tta tat tac tat act atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336 Ala Asn Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 109 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 110 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 110 gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac att aac aag aat 96 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Asn 20 25 30 ata gct tgg cac caa cac aag cct gga aaa ggt cct agg ctg ctc ata 144 Ile Ala Trp His Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tgg tac aca tct aca tta cag cca ggc atc cca tca agg ttc agt gga 192 Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc aac ctg gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gca act tat tac tgt cta cag tat gat aat ctt ccg tat 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga tcg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 111 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Asn 20 25 30 Ile Ala Trp His Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 112 <211> 345 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 112 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctt gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att aat cct tac aat ggt ggt act aac tac aat gag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag agc aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca ata tgg aag ttg ggg act tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act 336 Thr Ile Trp Lys Leu Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 gtc tct gca 345 Val Ser Ala 115 <210> 113 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Trp Lys Leu Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 114 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 114 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc tta tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca agt cag gaa att agt ggt tac 96 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 tta agc tgg ctt cag cag aaa cca gat gga act att aaa cgc ctg atc 144 Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 tac gcc gca tcc act tta gat tct ggt gtc cca aaa agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc agc ctt gag tct 240 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gac tat tac tgt cta caa tat gct agt tat cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 116 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 116 cag gtc cag ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gtg agg cct ggg gtc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tct ggc tac aca ttc act gtt tat 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Val Tyr 20 25 30 tct ttg cac tgg gtg aag cag agt cat gca agg agt cta gag tgg att 144 Ser Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Arg Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt gat gct atc tac aac cag aag ttc 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt gcc aga ctg aca tct gag gat tct gcc atc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gag ggg aat ggt aac ccc ctt gac tac tgg ggc caa ggc acc 336 Ala Arg Glu Gly Asn Gly Asn Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca 354 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 117 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Val Tyr 20 25 30 Ser Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Arg Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Gly Asn Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 118 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 118 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc acc aac atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat tct gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc ccg 288 Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 324 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 119 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 120 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 120 cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc aca tgc acc gtc tca gga ttc tca tta agt agt tat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 ggt gta cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gtg ata tgg agg gat gga agc aca acc tat aat tca gct ctc aaa 192 Gly Val Ile Trp Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 tcc aga ctg agc atc agc aag gac ggc tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Gly Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctc caa act gat gac aca gcc atg tac tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga aat tgg aat ggt ctt atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc 336 Arg Asn Trp Asn Gly Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 acc gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 121 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Gly Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Trp Asn Gly Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 122 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 122 gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agc tat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aga cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct gga aca gaa tct tct ctc acc att agc aat ctg gaa caa 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Ser Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt cat acg gtt ccg tgg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Val Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 123 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Ser Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 124 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 124 gag gtt cag ctc cag cag tct ggg act gtg ctg gca agg cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt acc agc tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggc gct att tat cct gga aac agt gat agc tac aac cag aag ttc aag 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 ggc aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tcc acc agc act gcc tac atg 240 Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac tct gcg gtc tat tac tgt aca 288 Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 agt gtt atg gcc tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 336 Ser Val Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 125 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Ser Val Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 126 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 126 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc tta tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca agt cag gac att ggt aat agc 96 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser 20 25 30 tta aac tgg ctt cag cag gaa cca gat gga act att aaa cgc ctg atc 144 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 tac gcc aca tcc aat tta gat tct ggt gtc tcc aaa agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc acc atc agc agc ctt gag tct 240 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gta gac tat tac tgt cta caa tat gct agt tct ccg tgg 288 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aag 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 127 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 128 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1398) <400> 128 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca gca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gaa ctg gtg aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac act ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc aac tac tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cga ggc ctc 192 Thr Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga agg att cat cct tct gat agt gaa act cac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn 65 70 75 80 caa aag ttc aag aac aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atc caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tat tgt gca aat tta tat tac tat act atg gac tac tgg ggt caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Asn Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg gtc 432 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 480 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 528 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 576 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 624 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 672 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 720 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 768 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 816 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 864 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 912 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 960 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 1008 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 1056 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1104 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg 1152 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1200 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1248 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1296 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1344 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1392 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 ggt aaa tg a 1401 Gly Lys 465 <210> 129 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 129 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Asn Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val 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ccg cca tct gat 432 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac 480 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc 528 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac 576 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac 624 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc 672 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tg a 711 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 135 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 135 Met Asp Met Arg Val Pro Ala His Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys 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aag ggc aag gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt gcc aga ctg aca tct gag gat tct gcc atc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile 100 105 110 tat tac tgt gca aga gag ggg aat ggt aac ccc ctt gac tac tgg ggc 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asn Gly Asn Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg 432 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 480 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 528 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 576 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg 624 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 672 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 720 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 768 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 816 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 864 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 912 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 960 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 1008 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 1056 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1104 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 1152 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 1200 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 1248 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 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atc agt gcc tca 48 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 atg tct gca tct cta ggg gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc 144 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 tca agt gta agt tcc agt tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga 192 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 tcc tcc ccc aaa ctc tgg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga 240 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 gtc cca gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc 288 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 aca atc acc aac atg gag gct gaa gat tct gcc act tat tac tgc cac 336 Thr Ile Thr Asn Met Glu Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 cag tat cat cgt tcc ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag 384 Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 ctg aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct 432 Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat 480 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc 528 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag 576 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 180 185 190 gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac 624 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg 672 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga 714 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 139 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 139 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Thr Asn Met Glu Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 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synthesized nucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <400> 142 atg atg tcc tct gct cag ttc ctt ggt ctc ctg ttg ctc tgt ttt caa 48 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 ggt acc aga tgt gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att agc tat tat tta aac tgg tat cag cag aga cca gat gga act gtt 192 Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gaa tct tct ctc acc att agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Ser Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 aat ctg gaa caa gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt cat 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His 100 105 110 acg gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgt 384 Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 432 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 480 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 528 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 576 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 672 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga 705 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 143 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 143 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Ser Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His 100 105 110 Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg 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Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gaa tgg att ggc gct att tat cct gga aac agt gat agc tac aac cag 240 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln 65 70 75 80 aag ttc aag ggc aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tcc acc agc act 288 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr 85 90 95 gcc tac atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac tct gcg gtc tat 336 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt aca agt gtt atg gcc tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc 384 Tyr Cys Thr Ser Val Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 115 120 125 gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 432 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 480 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 528 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 576 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 624 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205 acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 672 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 720 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 225 230 235 240 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 768 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 816 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 864 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 275 280 285 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 912 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 960 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 1008 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1056 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1104 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1152 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1200 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1248 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1296 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1344 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1386 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 145 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 145 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Thr Ser Val Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 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cta caa 336 Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 tat gct agt tct ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc 384 Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 aag cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat 432 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac 480 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc 528 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac 576 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac 624 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc 672 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tg a 711 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 147 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 147 Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Ile Phe Gly Phe Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Pro Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 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agtgctgcca 480 caggtc 486 <210> 149 <211> 492 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 149 atggagatgc tctctgccgg aagggtccct gcgctgctgc tctgcctggg tttccatctt 60 ctacaggcag tcctcagtac aactgtgatt ccatcatgta tcccaggaga gtccagtgat 120 aactgcacag ctttagttca gacagaagac aatccacgtg tggctcaagt gtcaataaca 180 aagtgtaact ctgacatgaa tggctactgt ttgcatggac agtgcatcta cctggtggac 240 atgagtcaaa attactgcag gtgtgaagtg ggttatactg gtgtccgatg tgaacatttc 300 tatttaaccg tccaccaacc tttaagcaaa gaatatgtgg ctttgaccgt gattcttatt 360 attttgtttc ttatcatagt tgtcggttcc acatattatt tctgcagatg gtacaggaat 420 cgaaaaagta aagaaccaaa gaaggaatat gagagagtta cctcagggga tccagagttg 480 ccgcaagtct ga 492 <210> 150 <211> 342 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 150 Met Glu Thr Leu Pro Ala Ser Trp Val Leu Thr Leu Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Ser His Leu Leu Gln Ala Val Ile Ser Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys 20 25 30 Ile Pro Gly Glu Ser Glu Asp Asn Cys Thr Ala Leu Val Gln Met Glu 35 40 45 Asp Asp Pro Arg Val Ala Gln Val Gln Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp 50 55 60 Met Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met 65 70 75 80 Arg Glu Lys Phe Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Leu Arg Cys 85 90 95 Glu His Phe Phe Leu Thr Val His Gln Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val 100 105 110 Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn 115 120 125 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp 130 135 140 Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp 145 150 155 160 Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn 165 170 175 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn 180 185 190 Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 195 200 205 Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 210 215 220 Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala 225 230 235 240 Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys 245 250 255 Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile 260 265 270 Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn 275 280 285 Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys 290 295 300 Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys 305 310 315 320 Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe 325 330 335 Ser Arg Thr Pro Gly Lys 340 <210> 151 <211> 343 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 151 Met Glu Met Leu Ser Ala Gly Arg Val Pro Ala Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser Thr Thr Val Ile Pro Ser 20 25 30 Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys Thr Ala Leu Val Gln Thr 35 40 45 Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser Ile Thr Lys Cys Asn Ser 50 55 60 Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp 65 70 75 80 Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg 85 90 95 Cys Glu His Phe Tyr Leu Thr Val His Gln Pro Leu Ser Lys Glu Tyr 100 105 110 Val Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro 115 120 125 Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys 130 135 140 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val 145 150 155 160 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 165 170 175 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 180 185 190 Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 195 200 205 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 210 215 220 Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg 225 230 235 240 Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys 245 250 255 Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp 260 265 270 Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys 275 280 285 Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser 290 295 300 Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser 305 310 315 320 Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser 325 330 335 Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 340 <210> 152 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 152 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Ala Val Leu Ser Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly 225 230 235 240 Glu Ser Ser Asp Asn Cys Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro 245 250 255 Arg Val Ala Gln Val Ser Ile Thr Lys Cys Gly Ser Thr His His His 260 265 270 His His His 275

Claims

EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물.
EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 세포 증식 억제제.
EREG 단백질에 결합하는 항체를 유효성분으로 함유하는 항암제.
제 3항에 있어서, EREG 단백질에 결합하는 항체는 세포 증식 저해 활성을 가지는 항체인 것을 특징으로 하는 항암제.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, EREG 단백질에 결합하는 상기 항체는

(1) CDR1로서 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 항체;

(2) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 452번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(3) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(4) CDR1로서 서열번호 12로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 14로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 16으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(5) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 18로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(6) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(7) (1)의 H 사슬 및 (4)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(8) (2)의 H 사슬 및 (5)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(9) (3)의 H 사슬 및 (6)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(10) CDR1로서 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 51로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 53으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(11) (10)에 있어서, CH로서 서열번호 149로 기재된 아미노산 서열의 118 내지 441번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(12) (10)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 체;

(13) CDR1로서 서열번호 55로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 57로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 59로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(14) (13)에 있어서, CL로서 서열번호 151로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(15) (13)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(16) (10)의 H 사슬 및 (13)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(17) (11)의 H 사슬 및 (14)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(18) (12)의 H 사슬 및 (15)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(19) CDR1로서 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(20) (19)에 있어서, CH로서 서열번호 153으로 기재된 아미노산 서열의 116 내지 439번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(21) (19)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 체;

(22) CDR1로서 서열번호 67로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 71로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(23) (22)에 있어서, CL로서 서열번호 155로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(24) (22)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(25) (19)의 H 사슬 및 (22)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(26) (20)의 H 사슬 및 (23)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(27) (21)의 H 사슬 및 (24)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(28) CDR1로서 서열번호 73으로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 75로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 77로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(29) (28)에 있어서, CH로서 서열번호 157로 기재된 아미노산 서열의 119 내지 442번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(30) (28)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(31) CDR1로서 서열번호 79로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 81로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 83으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(32) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 159로 기재된 아미노산 서열의 109 내지 215번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(33) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(34) (28)의 H 사슬 및 (31)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(35) (29)의 H 사슬 및 (32)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(36) (30)의 H 사슬 및 (33)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(37) CDR1로서 서열번호 85로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 87로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 89로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(38) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 161로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 440번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(39) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(40) CDR1로서 서열번호 91로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 93 으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 95로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(41) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 163으로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(42) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(43) (37)의 H 사슬 및 (40)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(44) (38)의 H 사슬 및 (41)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(45) (39)의 H 사슬 및 (42)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(46) CDR1로서 서열번호 97로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 99로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 101로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(47) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 165로 기재된 아미노산 서열의 113 내지 436번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(48) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(49) CDR1로서 서열번호 103으로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 105 에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 107로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(50) (49)에 있어서, CL로서 서열번호 167로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(51) (49)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(52) (46)의 H 사슬 및 (49)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(53) (47)의 H 사슬 및 (50)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(54) (48)의 H 사슬 및 (51)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(55) (1) 내지 (54) 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체를 포함하는, (1) 내지 (54) 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체;

(56) (1) 내지 (55) 중 어느 하나의 항체로서, 동일한 EREG 단백질의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체; 및,

(57) (1) 내지 (56) 중 어느 하나의 항체의 저분자화 항체

로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체인 것을 특징으로 하는 항암제.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, EREG 단백질에 결합하는 상기 항체가 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열에서 29번째의 Ala로부터 69번째의 Ser까지, 또는 63번째의 Val로부터 108번째의 Leu까지를 인식하는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 7항에 있어서, 상기 암은 원발성 암인 것을 특징으로 하는 항암제.
제 7항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는 항암제.
EREG 단백질에 결합하고, EREG 단백질을 발현하는 세포에 대해서 세포 증식 저해 활성을 가지는 항체.
제 10항에 있어서, 상기 세포 증식 저해 활성이 세포독성 활성인 것을 특징으로 하는 항체.
제 11항에 있어서, 상기 세포독성 활성은 ADCC 활성인 것을 특징으로 하는 항체.
제 11항에 있어서, 세포독성 활성이 CDC 활성인 것을 특징으로 하는 항체.
제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, EREG 단백질에 대한 중화 활성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
제 10항에 있어서, 상기 세포 증식 저해 활성이 중화 활성인 것을 특징으로 하는 항체.
제 10항의 항체로부터 제조되는 저분자화 항체.
제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제 또는 독성 펩티드가 상기 항체에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
화학요법제, 독성 펩티드 및 방사성 동위 원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성 물질이 결합된 것을 특징으로 하는, EREG 단백질에 결합하는 항체.
제 10항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는

(1) CDR1로서 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(2) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 452번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(3) (1)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(4) CDR1로서 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(5) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 18로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(6) (4)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(7) (1)의 H 사슬 및 (4)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(8) (2)의 H 사슬 및 (5)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(9) (3)의 H 사슬 및 (6)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(10) CDR1로서 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 51로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 53으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(11) (10)에 있어서, CH로서 서열번호 149로 기재된 아미노산 서열의 118 내지 441번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(12) (10)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(13) CDR1로서 서열번호 55로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 57로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 59로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(14) (13)에 있어서, CL로서 서열번호 151로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(15) (13)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(16) (10)의 H 사슬 및 (13)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(17) (11)의 H 사슬 및 (14)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(18) (12)의 H 사슬 및 (15)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(19) CDR1로서 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열을 유H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(20) (19)에 있어서, CH로서 서열번호 153으로 기재된 아미노산 서열의 116 내지 439번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(21) (19)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(22) CDR1로서 서열번호 67로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 71로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(23) (22)에 있어서, CL로서 서열번호 155로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(24) (22)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(25) (19)의 H 사슬 및 (22)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(26) (20)의 H 사슬 및 (23)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(27) (21)의 H 사슬 및 (24)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(28) CDR1로서 서열번호 73으로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 75로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 77로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(29) (28)에 있어서, CH로서 서열번호 157로 기재된 아미노산 서열의 119 내지 442번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(30) (28)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(31) CDR1로서 서열번호 79로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 81로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 83으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(32) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 159로 기재된 아미노산 서열의 109 내 지 215번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(33) (31)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107에서 213위의 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(34) (28)의 H 사슬 및 (31)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(35) (29)의 H 사슬 및 (32)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(36) (30)의 H 사슬 및 (33)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(37) CDR1로서 서열번호 85로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 87로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 89로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(38) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 161로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 440번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(39) (37)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(40) CDR1로서 서열번호 91로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 93으로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 95로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(41) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 163으로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(42) (40)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(43) (37)의 H 사슬 및 (40)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(44) (38)의 H 사슬 및 (41)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(45) (39)의 H 사슬 및 (42)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(46) CDR1로서 서열번호 97로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 99로 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 101로 기재된 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(47) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 165로 기재된 아미노산 서열의 113 내지 436번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(48) (46)에 있어서, CH로서 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열의 117 내지 446번째 아미노산 서열을 가지는 H 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(49) CDR1로서 서열번호 103으로 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호 105 에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3으로서 서열번호 107로 기재된 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(50) (49)에 있어서, CL로서 서열번호 167로 기재된 아미노산 서열의 108 내지 214번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(51) (49)에 있어서, CL로서 서열번호 20으로 기재된 아미노산 서열의 107 내지 213번째 아미노산 서열을 가지는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(52) (46)의 H 사슬 및 (49)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(53) (47)의 H 사슬 및 (50)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(54) (48)의 H 사슬 및 (51)의 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

(55) (1) 내지 (54) 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체를 포함하는, (1) 내지 (54) 중 어느 하나의 항체와 동등한 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체;

(56) (1) 내지 (55) 중 어느 하나의 항체로서, 동일한 EREG 단백질의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체; 및,

(57) (1) 내지 (56) 중 어느 하나의 항체의 저분자화 항체

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 10항 내지 제 20항 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열에서 29번째의 Ala로부터 69번째의 Ser까지, 또는 63번째의 Val로부터 108번째의 Leu까지를 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
암진단 마커로서 EREG 단백질 또는 EREG mRNA의 용도.
EREG 단백질에 결합하는 항체를 EREG 단백질에 결합시키는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
(a) 피검사체로부터 시료를 채취하는 단계; 및,

(b) EREG 단백질에 결합하는 항체를 이용하여 채취된 시료에 포함된 EREG 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
(1) 방사성 동위 원소로 표지 된, EREG 단백질에 결합하는 항체를 피검사체에게 투여하는 단계; 및 (2) 상기 방사성 동위 원소의 축적을 검출하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
제 22항에 있어서, 상기 방사성 동위 원소는 양전자 방출 핵종인 것을 특징으로 하는 진단 방법.
제 25항에 있어서, 상기 양전자 방출 핵종은 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ⁴⁵Ti, ⁵⁵Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁶Br, ⁸⁹Zr 및 ¹²⁴I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
EREG 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
제 22항 내지 제 27항 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암 및 신장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
제 28항에 있어서, 상기 암은 원발성 암인 것을 특징으로 하는 진단 방법.
제 28항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는 진단 방법.
EREG 단백질에 결합하는 항체를 포함하는, 암 진단 방법으로 이용하기 위한 진단제.
EREG 단백질에 결합하는 항체와 EREG 단백질을 포함하는 생체 시료를 포함하는 암 진단용 키트.
(1) EREG 발현 세포에 피검화합물을 접촉시키는 단계;

(2) EREG 발현 세포에서의 EREG의 발현 레벨을 측정하는 단계; 및,

(3) 대조군과 비교하여 EREG의 발현 레벨을 저하시키는 화합물을 후보 암 치료제로서 선택하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 후보 화합물의 스크리닝 방법.
제 33항에 있어서, EREG의 발현 레벨은 배양 상등액 중에 분비되는 EREG 단백질의 레벨에 의해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
(1) EREG와 피검화합물의 존재하에서 EREG 의존적으로 증식하는 세포를 배양 하는 단계;

(2) 세포 증식 레벨을 측정하는 단계; 및,

(3) 대조군과 비교하여 세포 증식을 억제한 피검화합물을 후보 암 치료제로서 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료제 후보 화합물의 스크리닝 방법.