WO2018097239A1 - クリアリングエージェント - Google Patents

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WO2018097239A1
WO2018097239A1 PCT/JP2017/042190 JP2017042190W WO2018097239A1 WO 2018097239 A1 WO2018097239 A1 WO 2018097239A1 JP 2017042190 W JP2017042190 W JP 2017042190W WO 2018097239 A1 WO2018097239 A1 WO 2018097239A1
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independently
salt
streptavidin
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雅信 塚越
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サヴィッド・セラピューティックス株式会社
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • the present invention relates to a clearing agent for removing streptavidin mutants in the body and use thereof.
  • a pretargeting method using a combination of a streptavidin variant with reduced affinity for natural biotin described in International Publication WO2015 / 125820, and a biotin variant having a high affinity for this streptavidin variant It is promising as a novel treatment for diseases such as cancer.
  • a fusion of a streptavidin mutant and a molecular probe such as an antibody
  • it remains in the body without being localized at the target site such as a disease site. It is desirable to quickly remove (clearing) the above fusion from the body.
  • the present invention does not localize to a target site such as a diseased site after administering a fusion of a streptavidin variant with reduced affinity for natural biotin described in International Publication WO2015 / 125820 and a molecular probe. Furthermore, an object of the present invention is to provide a clearing agent capable of rapidly removing (clearing) the fusion body remaining in the body from the body. Furthermore, this invention made it the subject which should be solved to provide the diagnostic kit and treatment kit using said clearing agent.
  • the present inventor has bound a plurality of sugar residues via a linking group to a biotin variant dimer described in International Publication WO2015 / 125820. It has been found that by administering a compound, a fusion of a streptavidin variant with a reduced affinity for natural biotin and a molecular probe can be rapidly removed (clearing) from the body, and the present invention has been completed.
  • a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof is each independently .
  • X1a, X1b, X2a and X2b represents O or NH are each independently .
  • Y 1 and Y 2 represents a C or S independently .
  • Z 1 and Z 2 each independently represent O
  • V 1 and V 2 each independently represents S or S + —O ⁇
  • n1 and n2 each independently represent an integer of 0 or 1.
  • L10 and L12 each independently represent a divalent linking group.
  • L11 represents a trivalent linking group
  • L14 represents a divalent linking group
  • Sugar represents a sugar residue.
  • [2] The compound according to [1] or a salt thereof represented by the following formula (2), wherein n1 and n2 are 0. (Wherein, X1a, X1b, X2a, X2b , Y 1, Y 2, Z 1, Z 2, V 1, V 2, L10, L12, L11, L14, and Sugar is as defined in [1]) [3] The compound or a salt thereof according to [1] or [2] represented by the following formula (3).
  • L10 and L12 are each independently an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, —CONH—, —NHCO—, —O—, or a combination thereof. Or a salt thereof.
  • L11 is The compound or its salt in any one of [1] to [4] which is group shown by these.
  • L13 is an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, —CONH—, —NHCO—, —O—, Or a compound or a salt thereof according to any one of [1] to [5], which is a combination thereof.
  • kits for therapeutic, in-vivo diagnosis or in-vitro diagnosis comprising at least a compound according to any one of [1] to [8] or a salt thereof and a fusion of a streptavidin mutant and a molecular probe .
  • the kit according to [12] further comprising a therapeutic, in-vivo diagnostic substance, or in-vitro diagnostic substance labeled with a compound represented by the following formula (10).
  • X1a, X1b, X2a and X2b represents O or NH are each independently, Y 1 and Y 2 is each independently C or S, Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O ⁇ , n1 and n2 each independently represent an integer of 0 or 1, m1 and m2 each independently represents an integer of 1 to 10 L represents a linking group.
  • a fusion of a streptavidin mutant with a reduced affinity for natural biotin and a molecular probe can be rapidly removed (cleared) from the body.
  • the clearing agent of the present invention is useful in diagnostic and therapeutic methods based on a pretargeting method using a combination of a streptavidin mutant and a biotin-modified dimer compound.
  • FIG. 1 shows in the case of administration of clearing agent after 6 hours of administration of the 125 I-labeled pre-targeting antibody -Cupid, the results of analysis of the effect of clearing agent on mouse blood clearance.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the effect of the clearing agent on mouse blood clearance when a clearing agent was administered 24 hours after administration of 125 I-labeled pretargeting antibody-Cupid.
  • FIG. 3 shows the results of affinity measurement of Compound 14 (Zhepyr1) and Compound 25 (Zephyr2) with Cupid.
  • FIG. 4 shows the results of confirmation of Cupid clearance by Zephyr2 in In vivo.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof, and preferably in the following formula (2) where n1 and n2 are 0 in the formula (1). It is the compound shown.
  • X1a, X1b, X2a and X2b each independently represent O or NH.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent C or S.
  • Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH.
  • V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O ⁇ .
  • n1 and n2 each independently represent an integer of 0 or 1.
  • L10 and L12 each independently represent a divalent linking group.
  • L11 represents a trivalent linking group.
  • L14 represents a divalent linking group.
  • Sugar represents a sugar residue.
  • the compound of the present invention is preferably a compound represented by the formula (3) or a salt thereof. (Wherein L10, L12, L11, L14, and Sugar are as defined above)
  • L10 and L12 are each independently an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, —CONH—, —NHCO—, —O—, or a combination thereof.
  • the alkylene group having 1 to 10 carbon atoms may have a substituent such as —COOCH 3 .
  • L10 and L12 are each independently an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, —CONH—, —NHCO—, or a combination thereof.
  • the alkylene group having 1 to 5 carbon atoms may have a substituent such as —COOCH 3 .
  • L10 and L12 are each independently a linking group comprising a combination of two alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms and two —CONH—, or two alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms and two This is a linking group comprising a combination with —NHCO—.
  • L10 and L12 are each independently — (CH 2 ) p —CONH— (CH 2 ) q —CONH—, or —NHCO— (CH 2 ) r —NHCO— (CH 2 ) s —. .
  • p, q, r and s are each independently an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 6, more preferably an integer of 2 to 6, and further preferably 4 or 5. is there.
  • L10 and L12 are each independently — (CH 2 ) p —CONH—CH (COOCH 3 ) — (CH 2 ) q —NHCO—, or —CONH— (CH 2 ) r —CH (COOCH 3 ) —NHCO— (CH 2 ) s —.
  • p, q, r and s are each independently an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 6, more preferably an integer of 2 to 6, and further preferably 4 or 5. is there.
  • L11 is a trivalent linking group, preferably It is group shown by these.
  • L13 is preferably an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, —CONH—, —NHCO—, —O—, and A linking group consisting of a combination of
  • L14 is preferably a linking group comprising a combination of an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, —CONH—, —NHCO—, and —O—.
  • Sugar is a sugar residue.
  • Preferable sugar residues include, but are not limited to, glucose, mannose, galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine, N-acetylgalactosamine and the like.
  • Specific examples of the compound of the present invention include the following compounds or salts thereof.
  • the compound represented by formula (1), formula (2) or formula (3) of the present invention or a salt thereof is used as a clearing agent for clearing a fusion of a streptavidin mutant and a molecular probe. can do.
  • Kit for treatment, in-vivo diagnosis or in-vitro diagnosis is the above-described formula (1), formula (2) or formula (3) of the present invention. Or a salt thereof, and a fusion of a streptavidin mutant and a molecular probe.
  • the streptavidin variant according to the present invention is a streptavidin variant consisting of an amino acid sequence in which Asn which is the 37th amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is substituted with another amino acid residue. It is preferable.
  • the streptavidin variant in the present invention is particularly preferably a streptavidin variant consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a wild-type (natural) core streptavidin, (1) Mutation in which tyrosine at the 10th amino acid residue is substituted with serine: (2) Mutation in which tyrosine at the 71st amino acid residue is substituted with serine: (3) Mutation in which arginine at the 72nd amino acid residue is substituted with lysine: (4) Mutation in which glutamic acid at the 89th amino acid residue is substituted with aspartic acid: (5) Mutation in which arginine at the 91st amino acid residue is substituted with lysine: (6) Mutation in which glutamic acid at the 104th amino acid residue is substituted with asparagine: (7) a mutation in which aspartic acid at the 11th amino acid residue is substituted with aspartic acid; (8) Mutation in which serine at the 15th amino acid residue is substituted with aspartic acid: (9) A mutation in which serine at the 33rd amino acid residue
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 further includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (10) Mutation in which asparagine at the 37th amino acid residue is substituted with glycine: Is an amino acid sequence having
  • the DNA encoding the streptavidin mutant is incorporated into an expression vector, and the expression vector is transformed into a host to express the streptavidin mutant of the present invention. Can be made.
  • the vector has a replication origin (ori) and a gene for selecting a transformed host (for example, a drug such as ampicillin, tetracycline, kanamycin, or chloramphenicol). It is preferable to have a drug resistance gene or the like.
  • a promoter capable of efficiently expressing a streptavidin variant in the host such as a lacZ promoter or a T7 promoter.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET.
  • the host preferably uses BL21 expressing T7 RNA polymerase).
  • a signal sequence for increasing the yield of the streptavidin mutant can be added to the vector.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the calcium chloride method or the electroporation method.
  • a tag for improving solubility for example, a sequence encoding glutathione-S-transferase, thioredoxin, or maltose-binding protein may be added. It also encodes tags designed to facilitate purification, such as polyhistidine tags, Myc epitopes, hemagglutinin (HA) epitopes, T7 epitopes, Xpress tags and FLAG peptide tags, and other known tag sequences A sequence may be added.
  • expression vectors derived from mammals for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), derived from insect cells
  • Expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), an expression vector derived from a retrovirus (for example, pZIPneo), an expression vector derived from yeast (for example, “Pichia® Expression® Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11®, SP-Q01), an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, PPL608, p
  • promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have the MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, More preferably, it has a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited and may be either prokaryotic or eukaryotic.
  • E. coli and various animal cells can be used.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • animal cells mammalian cells such as CHO cells, COS cells, 3T3 cells, HeLa cells, Vero cells, or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 can be used.
  • CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, a lipofection method, or the like.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger, are known. .
  • E. coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, etc.
  • Bacillus subtilis is also known.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium for animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • a growth factor for promoting cell proliferation may be added.
  • Streptavidin mutants can be used with molecular probes attached.
  • molecular probes include antibodies, peptides, nucleic acids, aptamers, and the like. Specifically, antibodies, peptides, nucleic acids, aptamers, etc. that target the following antigens that are specifically expressed in cancer can be used. it can.
  • coli Shiga toxin type 1 E. ⁇ coli Shiga toxin type 2, EGFL7, EGFR, endotoxin, EpCAM, episialin, ERBB3, Escherichia coli Respiratory syncytial virus F protein, FAP, fibrin II ⁇ chain, fibronectin extra domain-B, folate receptor 1, Frizzled receptor, GD2, GD3 ganglioside, GMCSF receptor ⁇ chain, GPNMB, hepatitis B Surface antigen, Hepatitis B virus, HER1, HER2 / neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DR ⁇ , HNGF, Hsp90, human ⁇ amyloid, human scatter factor receptor kinase, human TNF, ICAM- (CD54), IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IgE, IgE Fc region, IGF-1 receptor, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1 ⁇ , IL-12, IL-13,
  • a preferred specific example of the molecular probe is an anti-human CD20 antibody (eg, rituximab) or an anti-epiregulin single chain antibody.
  • Rituximab is an anti-human CD20 antibody, and human CD20 is expressed only on human B cells.
  • a therapeutic agent for cellular non-Hodgkins lymphoma and mantle cell lymphoma obtained by labeling the mouse anti-CD20 monoclonal antibody with the radioisotope 90Y is commercially available as Zevalin (registered trademark).
  • Zevalin registered trademark
  • RI is directly labeled on the anti-CD20 antibody, and it takes several days for tumor accumulation after in vivo administration. This causes serious side effects such as bone marrow suppression by RI.
  • Epiregulin is a member of epidermal growth factor and is known to function as a cancer growth inhibitory factor that induces morphological changes in Hela cells. Yutani et al. Produced an anti-epireulin antibody (WO2008 / 047723). Lee et al. Also humanized and evaluated anti-epiregulin antibodies (Biochemical and Biophysical Research communications 444 (2013) 1011-1017).
  • the streptavidin mutant can be accumulated specifically in cancer cells. Then, from diagnostic or therapeutic substances (fluorescent dyes, chemiluminescent agents, radioisotopes, metal compounds, sensitizers, metal compounds, etc.) conjugated to biotin variants having affinity for the above streptavidin variant Neutron capture agents, low molecular compounds such as drugs, micro or nano bubbles, proteins, etc.) can be administered to a patient, so that substances can be accurately accumulated in cancer cells.
  • diagnostic or therapeutic substances fluorescent dyes, chemiluminescent agents, radioisotopes, metal compounds, sensitizers, metal compounds, etc.
  • a fusion of a molecular probe and a streptavidin mutant is administered to a patient, and then the clearing agent of the present invention is administered to remain in the body without being specifically accumulated in cancer cells.
  • the above fusion can be quickly removed from the body (clearing). Thereby, non-specific accumulation of diagnostic or therapeutic substances can be prevented, and false positives in diagnosis and side effects in treatment can be reduced.
  • antibody can be used as the antibody to be bound to the streptavidin variant. Both polyclonal and monoclonal antibodies can be used. Although subclass of the antibody is not particularly limited, preferably IgG, particularly IgG 1 is suitably used. “Antibody” includes all modified antibodies and antibody fragments. Humanized antibodies, humanized antibodies, human antibodies, antibodies derived from various animals such as mice, rabbits, rats, guinea pigs, monkeys, chimeric antibodies of human antibodies and antibodies derived from various animals, diabody, scFv, Fd, Fab, Fab ′, F (ab) ′ 2 may be mentioned, but is not limited thereto.
  • a fusion of a streptavidin variant and an antibody can be obtained using methods known to those skilled in the art. For example, it can be obtained by a chemical binding method (US5, 608, 060), or by ligating DNA encoding a streptavidin variant and DNA encoding an antibody, and expressing it in a host cell using an expression vector or the like, It can also be obtained as a fusion protein.
  • the DNA encoding the streptavidin variant and the DNA encoding the antibody may be linked via DNA encoding an appropriate peptide called a linker. It is desirable that a streptavidin variant-antibody fusion is produced leaving a specific binding force between the antibody and the target molecule.
  • the kit of the present invention may further contain a therapeutic, in-vivo diagnostic or in-vitro diagnostic substance labeled with a compound represented by the following formula (10).
  • X1a, X1b, X2a and X2b represents O or NH are each independently, Y 1 and Y 2 is each independently C or S, Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O ⁇ , n1 and n2 each independently represent an integer of 0 or 1, m1 and m2 each independently represents an integer of 1 to 10 L represents a linking group.
  • the compound represented by the above formula (10) (hereinafter also referred to as biotin-modified dimer compound) is described as a compound represented by the formula (1) in International Publication WO2015 / 125820.
  • the contents described in International Publication WO2015 / 125820, in particular, the compound represented by Formula (1) in International Publication WO2015 / 125820 and preferred structures thereof are all cited in the present specification.
  • the compound represented by the above formula (10) in the present invention the following specific compounds described in International Publication WO2015 / 125820 can be used.
  • a substance for treatment, in-vivo diagnosis or in-vitro diagnosis labeled with a compound represented by formula (10) can be used.
  • a radioisotope is used as a substance for treatment, in-vivo diagnosis or in-vitro diagnosis
  • a chelating group for capturing the radioisotope is bonded to the biotin-modified dimer compound represented by the formula (10).
  • Compounds may be used.
  • DOTA 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • TETA 1,4 , 8,11-tetraazacyclotetradecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetate
  • N2S2, MAG3, CHX-A-DTPA and the like.
  • radioisotopes for imaging include gamma-ray nuclides ( 67 Ga, 99m Tc, 111 In, 123 I, positron emitting nuclides ( 18 F, 62 Cu, 64 Cu, 66 Ga).
  • the radioisotopes for treatment include Peter radionuclides ( 32 P, 67 Cu, 89 Sr, 90 Y) 114m In, 117m Sn, 131 I, 153 Sm, 166 Ho, 177, Lu, 186, Re, 188 Re, etc.), alpha nuclides ( 211 At, 212 Bi, 212, Pb, 213 Bi, 223 Ra, 225 Ac), Auger electron beam nuclides ( 125 I, 165 Er, etc.), preferably 64 Cu, 124 I, 76 Br, 68 Ga, 99m Tc, 123 I, 131 I, 90 Y can be used.
  • a compound in which a fluorescent compound or a drug compound (for example, an anticancer agent) is bound to the above-described biotin modified dimer compound can also be used.
  • the fluorescent compound that can be used in the present invention include fluorescein 5-isothiocyanate (FITC), IR Dye (registered trademark) 800, and fluorescein.
  • drugs for example, anticancer agents
  • PBD pyrrolobenzodiazepine
  • maytansine analogs for example, DM1, DM4, etc.
  • Dolastatin analogues eg Monomethyl auristatin E (MMAE), Monomethyl auristatin F (MMAF), dolastatin 10, tubulysin, etc.
  • duocarmycin analogues eg DC1, DC4, DC44 etc.
  • Camptothecin analogs eg SN-38
  • others eg methotrexate, vinblastine, calicheamicin, ⁇ -amanitin, doxorubicin, melphalan
  • Reverse phase high performance liquid chromatography was performed using JASCO-HPLC system. Detection was carried out using ultraviolet light of 210 nm or 254 nm, and the mobile phase was a gradient solvent system (acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid MQ solution). The analysis was carried out using a YMC-Pack-ODS-AM (150 ⁇ 4.6 mL) or YMC-Triart-C18 (150 ⁇ 4.6 mL) ⁇ ⁇ ⁇ column at a flow rate of 1 mL / min. The fractionation was performed using a YMC-Triart-C18 (250 ⁇ 10 mL) column with a flow rate of 3 mL / min.
  • Reagents were purchased from Aldrich, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (TCI), Kanto Chemical Co., Ltd. Kanto, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and Watanabe Chemical Industry Co., Ltd. All reagents and solvents were used as they were unless otherwise specified.
  • Acetonitrile (7.0 mL) was added to carboxylic acid 2 (300 mg, 0.69 mmol), di (N-succinimidyl) carbonate (265 mg, 1.0 mmol) was added, and then pyridine (164 mg, 167 ⁇ L, 2.1 mmol) was added. The mixture was stirred at room temperature for 17 and a half hours. The solvent was distilled off under reduced pressure, ethyl acetate was added, and the mixture was washed once with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and once with saturated brine.
  • Compound 24 (same as Compound 12) (2.4 mg, 1.4 ⁇ mol) is added to Bisiminobiotin 23 (2 mg, 1.4 ⁇ mol), and copper sulfate-pentahydrate (CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 2.2 mg, 8.7 ⁇ mol) ), Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amine (TBTA, 0.8 mg, 1.5 ⁇ mol), sodium ascorbate (ascorbic acid Na, 4.0 mg, 20 ⁇ mol) And distilled water (100 ⁇ L) and acetonitrile (100 ⁇ L) were added.
  • Example 2 Construction of anti-CEA-Cupid (ST03-Cupid) expression vector
  • the gene sequence of scFv antibody ST03 that recognizes the N-A1 part of CEACAM5 was prepared based on the literature (US 7626011: Antibodies against tumor surface). antigens).
  • the gene sequence of ST03-Cupid fused with ST03 gene and Cupid gene was synthesized by artificial gene synthesis (Eurofingenomics) (SEQ ID NO: 1).
  • Cupid is a protein called V2122 (also referred to as LISA314-V2122) (SEQ ID NO: 4 in WO2015 / 125820) described in WO2015 / 125820.
  • the amino acid sequence of Cupid is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing of the present application.
  • the ST03-Cupid gene was incorporated into the multicloning site 1 (MCS1) of the expression vector pETDuet-1 (Novagen), and the skp gene (SEQ ID NO: 2) was incorporated into the multicloning site 2 (MCS2).
  • ST03-Cupid gene was integrated by treating the vector with restriction enzyme sites NcoI and EcoRI, and using primers (1740_Fw; AGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGACCG (SEQ ID NO: 5), 1741_Rv; CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG (SEQ ID NO: 6)) Ligation and cloning were performed using In-Fusion® HD® Cloning® Kit (Clontech). Thereafter, it was confirmed by sequence that the ST03-Cupid gene was correctly integrated.
  • the vector in which the ST03-Cupid gene was incorporated was treated with the restriction enzyme NdeI and amplified using the primers (skp_Fw; AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT (SEQ ID NO: 7), skp_Rv; TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG (SEQ ID NO: 8)) Ligation and cloning were performed using Fusion® HD® Cloning® Kit (Clontech). After that, the sequence confirmed that the skp gene was correctly integrated. As a result, a vector (pETDuet-ST03-Cupid_skp) ⁇ ⁇ ⁇ capable of simultaneously expressing ST03-Cupid protein and skp protein was completed.
  • Example 3 Expression of ST03-Cupid
  • the pETDuet-ST03-Cupid_skp vector was transformed into BL21 (DE3) (Nippon Gene) and precultured overnight at 37 ° C in 2xYT medium (BD).
  • a final concentration of 0.5 mM IPTG was added and cultured at 37 ° C. for 4 hours. After centrifugation, the culture supernatant was recovered and stored at 4 ° C.
  • Example 4 Purification of ST03-Cupid ST03-Cupid protein was roughly purified by a batch method using 6xHis-Tag added to the C-terminus. Specifically, cOmplete His-Tag Purification Resin equilibrated with buffer A (50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Imidazole, pH 8.0) was added to the culture supernatant stored at 4 ° C. The mixture was stirred overnight at 4 ° C. for protein binding to the resin. Next, the resin was recovered in a column, and a 20 column volume washing operation was performed with buffer A. Subsequently, the crude product of ST03-Cupid was recovered by elution with buffer B (50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 400 mM Imidazole, pH 8.0).
  • buffer A 50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 5
  • Example 5 Preparation of iodine label of ST03-Cupid N-succinimidyl-3- (4-hydroxy-3- [ 125 I] iodophenyl) propionate, Bolton-Hunter Reagent (NEX120, PerkinElmer) was added to the purified ST03-Cupid protein. Used for radioiodine labeling. Specifically, 20 times mole of Bolton-Hunter Reagent with respect to the number of moles of protein to be used was taken out from the Eppendorf tube, the solvent was evaporated, and then the protein solution was added and reacted on ice for 2 hours.
  • Bolton-Hunter Reagent NEX120, PerkinElmer
  • Example 6 In vivo test of clearing agent (compound 14)
  • compound 14 125 I-labeled ST03-Cupid ([ 125 I] ST03-Cupid) was isolated in male mice. Intravenous administration was performed, blood was collected over time, and changes in blood radioactivity concentration due to administration of Compound 14 were measured. Specifically, four experimental groups were prepared. The first group was administered with [ 125 I] ST03-Cupid, and 6 hours later, Compound 14 was administered as a single intravenous dose. The second group was administered with saline instead of Compound 14 as the first control group. It was made into a group.
  • the third group was administered with [ 125 I] ST03-Cupid and 24 hours later, Compound 14 was administered as a single intravenous dose, and the fourth group was administered with saline instead of Compound 14 as the third control group.
  • a group to be administered was used.
  • [125 I] blood in the case of the ST03-Cupid the compound was administered 14 to 24 hours after administration first: [125 I] after ST03-Cupid administration 10 minutes, the second time: [125 I] ST03-Cupid administration 24 hours later, 3rd: 10 minutes after administration of Saline or Compound 14, 4th: 1 hour after administration of Saline or Compound 14, 5th: 3 hours after administration of Saline or Compound 14, 6th: Saline or Compound 14 6 hours after administration, and the seventh: 24 hours after administration of Saline or Compound 14.
  • the collected blood (40-50 ⁇ L) was measured with a gamma counter.
  • the results were graphed by dividing the count rate (dmp) measured by the gamma counter by the amount of blood collected (g) and calculating the count rate per unit weight (dpm / g of blood). Similarly, the remaining ratio (% ID / g of blood) of the post-dose dose was calculated and graphed by dividing by the count rate of [ 125 I] ST03-Cupid before administration.
  • the measurement results are shown in Tables 1 and 2 and FIGS. From these results, it was shown that the blood concentration of ST03-Cupid can be efficiently reduced by the clearing agent of the present invention, and the usefulness as a clearing agent was shown.
  • Example 7 Affinity measurement between Compound 14 (Zhepyr1) and Compound 25 (Zephyr2) and Cupid
  • kinetic analysis by SPR was performed. Specifically, the ligand CEA-Cupid was immobilized on Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) using Amin Coupling Kit (GE Healthcare) targeting 5000RU, and the analyte Zephyr1 or Zephyr2 was reduced from 10 nM to 2 Kinetics analysis was performed by the Single Cycle Kinetics method using 5 dilution series.
  • Example 8 ⁇ Preparation of labeled Psyche-B-DOTA ( 111 In)> 111 InCl 3 solution 37 MBq (approx. 20 pmol), add the same volume of 100 mM acetic acid buffer to pH 4-5, Psyche-B-DOTA 1000 times in molar ratio (10 nmol), DMSO concentration 0.2% or more And heat at 80 ° C. for 15 minutes or longer. This was analyzed by HPLC to confirm the radiochemical purity. This was diluted with 10 mM acetate buffer to 1 nmol / mL, and this was used as an administration solution.

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Abstract

本発明の課題は、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体を投与した後に、疾患部位などの標的部位に局在せずに、体内に残存している上記融合体を、体内から迅速に除去（クリアリング）することができるクリアリングエージェントを提供することである。本発明によれば、下記式（１）で示される化合物又はその塩が提供される。 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示す。Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示す。Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し。ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示す。Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に２価の連結基を示す。Ｌ１１は３価の連結基を示す。Ｌ１４は２価の連結基を示す。Ｓｕｇａｒは糖の残基を示す。）

Description

クリアリングエージェント
　本発明は、体内においてストレプトアビジン変異体を除去するためのクリアリングエージェント、及びその利用に関する。
　アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く、アビジン／ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。このアビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組合わせたドラッグデリバリーの方法、プレターゲティング法が考案されている（Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302）。
　ニワトリ由来のアビジンや微生物由来のストレプトアビジンは人体に対し高い免疫原性を示すことから、低免疫原性ストレプトアビジンが報告されている（国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５）。さらに、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体が報告されている（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０）。
国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５ 国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０
Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302
　国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されている天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこのストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体の組み合わせを用いたプレターゲティング法は、がんなどの疾患に対する新規な治療法として有望である。上記したプレターゲティング法を実現するためには、ストレプトアビジン変異体と分子プローブ（抗体など）との融合体を投与した後に、疾患部位などの標的部位に局在せずに、体内に残存している上記融合体を、体内から迅速に除去（クリアリング）することが望ましい。
　本発明は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されている天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体を投与した後に、疾患部位などの標的部位に局在せずに、体内に残存している上記融合体を、体内から迅速に除去（クリアリング）することができるクリアリングエージェントを提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、上記のクリアリングエージェントを用いた診断キット及び治療キットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されているビオチン改変体の二量体に対して、連結基を介して複数の糖残基を結合した化合物を投与することによって、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体を体内から迅速に除去（クリアリング）できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　下記式（１）で示される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示す。Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示す。Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し。ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示す。Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に２価の連結基を示す。Ｌ１１は３価の連結基を示す。Ｌ１４は２価の連結基を示す。Ｓｕｇａｒは糖の残基を示す。）
［２］　ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）で示される、［１］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ、Ｘ２ｂ、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1、Ｚ2、Ｖ1、Ｖ2、Ｌ１０、Ｌ１２、Ｌ１１、Ｌ１４、及びＳｕｇａｒは、［１］と同義である）
［３］　下記式（３）で示される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｌ１０、Ｌ１２、Ｌ１１、Ｌ１４、及びＳｕｇａｒは、［１］と同義である）
［４］　Ｌ１０及びＬ１２がそれぞれ独立に、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、又はそれらの組み合わせである、［１］から［３］の何れかに記載の化合物又はその塩。
［５］　Ｌ１１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で示される基である、［１］から［４］の何れかに記載の化合物又はその塩。
［６］　Ｌ１３が、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 又はそれらの組み合わせである、［１］から［５］の何れかに記載の化合物又はその塩。
［７］　Ｌ１４が、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、又はそれらの組み合わせである、［１］から［６］の何れかに記載の化合物又はその塩。
［８］　以下の何れかの化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［９］　［１］から［８］の何れかに記載の化合物又はその塩を含む、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体をクリアリングするためのクリアリングエージェント。
［１０］　ストレプトアビジン変異体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３７番目のアミノ酸残基であるAsnが他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる、ストレプトアビジン変異体である、［９］に記載のクリアリングエージェント。
［１１］　ストレプトアビジン変異体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるストレプトアビジン変異体である、［９］又は［１０］に記載のクリアリングエージェント。
［１２］　［１］から［８］の何れかに記載の化合物又はその塩と、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体とを少なくとも含む、治療用、体内診断用又は体外診断用のキット。
［１３］　下記式（１０）で示される化合物で標識した、治療用、体内診断用又は体外診断用の物質をさらに含む、［１２］に記載のキット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、Ｌは連結基を示す。）
　本発明によれば、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体を体内から迅速に除去（クリアリング）することができる。
本発明のクリアリングエージェントは、ストレプトアビジン変異体と、ビオチン改変体の２量体化合物との組み合わせを用いたプレターゲティング法に基づく診断法・治療法において有用である。
図１は、125I標識プレターゲティング抗体-Cupidの投与の６時間後にクリアリングエージェントを投与した場合における、マウス血中クリアランスに及ぼすクリアリングエージェントの影響を解析した結果を示す。 図２は、125I標識プレターゲティング抗体-Cupidの投与の２４時間後にクリアリングエージェントを投与した場合における、マウス血中クリアランスに及ぼすクリアリングエージェントの影響を解析した結果を示す。 図３は、化合物１４（Zhepyr1）および化合物２５（Zephyr2）とCupidとの親和性測定の結果を示す。 図４は、In vivo でのZephyr2によるCupidのクリアランスを確認した結果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）クリアリングエージェント
　本発明の化合物は、下記式（１）で示される化合物又はその塩であり、好ましくは式（１）においてｎ１及びｎ２が０である場合である下記式（２）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　上記式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示す。Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示す。Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し。ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示す。Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に２価の連結基を示す。Ｌ１１は３価の連結基を示す。Ｌ１４は２価の連結基を示す。Ｓｕｇａｒは糖の残基を示す。
　式（１）及び式（２）において、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 で示される部分は好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 の何れかであるが、これらに限定はされない。
　本発明の化合物は、好ましくは、式（３）で示される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、Ｌ１０、Ｌ１２、Ｌ１１、Ｌ１４、及びＳｕｇａｒは、上記と同義である）
　好ましくは、Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、又はそれらの組み合わせである。炭素数１から１０のアルキレン基は、－ＣＯＯＣＨ3等の置換基を有していてもよい。
　より好ましくは、Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に、炭素数１から５のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、又はそれらの組み合わせである。炭素数１から５のアルキレン基は、－ＣＯＯＣＨ3等の置換基を有していてもよい。
　さらに好ましくは、Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に、２つの炭素数１から５のアルキレン基と２つの－ＣＯＮＨ－との組み合わせからなる連結基、あるいは２つの炭素数１から５のアルキレン基と２つの－ＮＨＣＯ－との組み合わせからなる連結基である。
　さらに好ましくは、Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に、－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－ＣＯＮＨ－、又は－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）r－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－である。式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはそれぞれ独立に１から１０の整数であり、好ましくは１から６の整数であり、より好ましくは２から６の整数であり、さらに好ましくは４又は５である。
　さらに好ましくは、Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に、－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－（ＣＨ2）q－ＮＨＣＯ－、又は－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）r－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－である。式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはそれぞれ独立に１から１０の整数であり、好ましくは１から６の整数であり、より好ましくは２から６の整数であり、さらに好ましくは４又は５である。
　Ｌ１１は、３価の連結基であり、好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 で示される基である。
　Ｌ１３は、好ましくは、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 の組み合わせからなる連結基である。
　Ｌ１４は、好ましくは、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、及び－Ｏ－の組み合わせからなる連結基である。
　Ｓｕｇａｒは糖残基である。好ましい糖残基としては、特に限定されないが、グルコース、マンノース、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルマンノサミン、N-アセチルガラクトサミンなどの残基を挙げることができる。
　本発明の化合物の具体例としては、以下の化合物又はその塩を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　上記した本発明の化合物（後記する実施例の化合物１４および化合物２５）は、後記する実施例１に記載の合成法又はそれに準じた合成法により合成することができる。
3-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)プロピオン酸 (化合物2)の合成
　化合物 1のジクロロメタン溶液に、3-メルカプトプロピオン酸と塩化スズ(IV)を加え、加熱還流し、溶媒を減圧留去し、0.1規定塩酸を加え酢酸エチルで抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することで化合物2を得る。
 (2R,3R,4R,5R,6S)-5アセトアミド-2-(アセトキシメチル)-6-((3-((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)-3-オキソプロピル)チオ)テトラヒドロ-2H-ピラン-3.4-ジイルジアセテート (化合物3)の合成
　化合物2 にアセトニトリルを加え、炭酸ジ(N-スクシンイミジル) を加えた後、ピリジンを加え室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を中性シリカゲルクロマトグラフィーで精製することで、化合物3を得る。
ジ-tert-ブチル(13-(2,2-ジメチル-4,15-ジオキソ-3,8,11-トリオキサ-5,14,-ジアザヘプタデカン-17-イル)-13-ニトロ-10,16-ジオキソ-3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,25-ジイル)ジカーバメート (化合物5)の合成
　ニトロメタントリスプロピオン酸とアミン4、 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール-無水和物にジクロロメタンを加えた後、トリエチルアミンを加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え1規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することで、化合物5を得る。
ジ-tert-ブチル(13-アミノ-13-(2,2-ジメチル-4,15-ジオキソ-3,8,11-トリオキサ-5,14-ジアザヘプタデカデカン-17-イル)-10,16-ジオキソ-3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,25-ジイル)ジカーバメート　(化合物6)の合成
　塩化ニッケル(II)にメタノールを加えた後、水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で攪拌する。化合物5のメタノール溶液を加えた後に、水素化ホウ素ナトリウムを徐々に加える。室温で攪拌し、セライトろ過をしたろ液を減圧留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出する。飽和食塩水で洗浄し、酢酸エチル、ジクロロメタンで再抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して化合物6を得る。
2,(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エタ-1-ノール (化合物8)の合成
　アルコール7のN,N-ジメチルホルムアミド溶液にアジ化ナトリウムを加え、80℃で攪拌する。蒸留水を加え、酢酸エチル、ジクロロメタンで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して化合物8を得る。
2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エチル(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カーボネート (化合物9)の合成
　化合物8のN,N-ジメチルホルムアミド溶液に炭酸ジ(N-スクシンイミジル)を加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して化合物9を得る。
2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エチルジ-tert-ブチル(13-(2,2-ジメチル-4,15-ジオキソ-3,8,11-トリオキサ-5,14-ジアザヘプタデカン-17-イル)-10,16-ジオキソー3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,13,25-トリイル)トリカーバメート (10)の合成
　化合物9に化合物6のジクロロメタン溶液を加え、トリエチルアミンを加える。40℃で攪拌する。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え、1規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して化合物10を得る。
13-(3-((2-(2-(2-(2-アンモニオエトキシ)エトキシ)エチル)アミノ)-3-オキソプロピル)-13-(((2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)カルボニル)アミノ)-10,16-ジオキソ-3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,25-ジアンモニウムトリ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (11)の合成
　化合物10のジクロロメタン溶液に、トリフルオロ酢酸を加える。室温で攪拌し、溶媒を減圧留去して化合物11を含む粗生成物 (赤色油状)を得る。
2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エチル(1,33-ビス(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-17-(16-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-3,14-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,13-ジアザヘキサデシル)3,14,20,31-テトラオキソ-7,10,24,27-テトラオキサ-4,13,21,30-テトラアザトリトリアコンタン-17-イル)カーバメート (12)の合成
　スクシンイミド3, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール-無水和物にアンモニウム塩11 (12 mg, 10μmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加えた後に、N,N-ジイソプロピルエチルアミンを加える。室温で攪拌し、溶媒を減圧留去する。シリカゲルクロマトグラフィーでスクシンイミド3を除いた後に、メタノールで溶出する。得られた混合物にナトリウムメトキシドを加え、メタノールに溶解させる。室温で３時間攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を逆相シリカゲルクロマトグラフィーで精製して化合物12 を得る。
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-((1-(28-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-12,12-ビス(16-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-3,14-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,13-ジアザヘキサデシル)-10,15,26-トリオキソ-3,6,9,19,22-ペンタオキサ-11,16,25-トリアザオクタコシル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)エチル)カルバモイル)-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル))ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル))ビス(アザンジイル ))ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル))ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (14)の合成
　ビスイミノビオチン13に化合物12を加え、硫酸銅-五水和物、トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン、アスコルビン酸ナトリウムを加え、蒸留水,tert-ブタノールを加える。室温で攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を逆相HPLCで精製することで化合物14を得る。
　ジメチル 6,6’-((5-(3-(2-(2-(2-(ペンタ-4-イナミド)エトキシ)エチル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザネジイル))(2S,2`S)-ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート)  ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (23)の合成
　ビスイミノビオチン21、N-ヒドロキシコハク酸イミジルエステル22にN,N-ジメチルホルムアミド、トリエチルアミンを加える。室温で攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を、自動精製装置で精製することで化合物23を得る。
ジメチル 6,6`-((5-(3-(2-(2-(2-(3-(1-(28-(((2S,3R,4R,5R,6R,)-アセタミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-12,12-ビス(16-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセタミド-4,5ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-3,14-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,13-ジアザヘキサデシル)-10,15,26-トリオキソ-3,6,9,19,22-ペンタオキサ-11,16,25-トリアザオクタコシル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)プロパナミド)エトキシ)エトキシ)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザネジイル))(2S,2`S)-ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート) ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (25)の合成
　ビスイミノビオチン23に化合物24（化合物12と同じ）を加え、硫酸銅-五水和物 (CuSO4・5H2O)、トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン (TBTA)、アスコルビン酸ナトリウムを加え、蒸留水,アセトニトリルを加える。室温で攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を逆相HPLCで精製することで、化合物25を得る。
　上記した本発明の式（１）、式（２）又は式（３）で示される化合物又はその塩は、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体をクリアリングするためのクリアリングエージェントとして使用することができる。
（２）治療用、体内診断用又は体外診断用のキット
　本発明による治療用、体内診断用又は体外診断用のキットは、上記した本発明の式（１）、式（２）又は式（３）で示される化合物又はその塩と、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体とを少なくとも含む。
　本発明におけるストレプトアビジン変異体としては、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３７番目のアミノ酸残基であるAsnが他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる、ストレプトアビジン変異体であることが好ましい。
　本発明におけるストレプトアビジン変異体としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるストレプトアビジン変異体であることが特に好ましい。
　配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、野生型（天然）のコアストレプトアビジンにおいて、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
（７）１１番目のアミノ酸残基のアスパラギンがアスパラギン酸に置換している変異；
（８）１５番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギン酸に置換している変異：
（９）３３番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギンに置換している変異；
を有するアミノ酸配列である。
　配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号３に記載したアミノ酸配列においてさらに、
（１０）３７番目のアミノ酸残基のアスパラギンがグリシンに置換している変異：
を有するアミノ酸配列である。
　本発明で用いるストレプトアビジン変異体を製造するためには、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に形質転換することによって、本発明のストレプトアビジン変異体を発現させることができる。
　大腸菌を宿主とする場合には、ベクターとしては、複製起点（ori）を有し、さらに形質転換された宿主を選択するための遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子など）を有していることが好ましい。また、発現ベクターの場合には、宿主においてストレプトアビジン変異体を効率よく発現させることができるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーターまたはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpress system」（キアゲン）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21を使用することが好ましい)などが挙げられる。また、ベクターには、ストレプトアビジン変異体の収量をあげるためのシグナル配列などを付加することもできる。
　宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また、可溶性を向上させるためのタグ、例えばグルタチオンーS－トランスフェラーゼやチオレドキシン、マルトース結合蛋白質をコードする配列が付加されていてもよい。また、精製を容易にすることを目的にした設計されたタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃエピトープ、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、Ｔ７エピトープ、ＸｐｒｅｓｓタグやＦＬＡＧペプチドタグ、その他の既知のタグ配列をコードする配列が付加されていてもよい。
　大腸菌以外にも、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれでもよい。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。
　真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、HeLa細胞、Vero細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5などを用いることができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
　原核細胞を使用する場合は、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
　これらの細胞を、本発明のＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより本発明のストレプトアビジン変異体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6～8であるのが好ましい。培養は、通常、約30～40℃で約15～200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。また、細胞の増殖を促進するための成長因子の添加を行ってもよい。
　ストレプトアビジン変異体は、分子プローブを結合させて使用することができる。分子プローブとしては、例えば抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を挙げることができ、具体的には、癌に特異的に発現する以下抗原を標的とした抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を用いることができる。
エピレギュリン、ROBO1,2,3,4、1-40-β-アミロイド, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, 腺がん抗原,　α-フェトプロテイン, アンギオポエチン2, 炭疽毒素, AOC3 (VAP-1), B-リンパ腫細胞, B7-H3, BAFF, βアミロイド, C242抗原, C5, CA-125, カルボニックアンヒドラーゼ9 (CA-IX), 心臓ミオシン, CCL11 (eotaxin-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigin), CD147 (basigin), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD154, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE受容体), CD25(IL-2受容体のα鎖), CD28, CD3, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ), CD4, CD40, CD41(インテグリンα-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CFD, ch4D5, CLDN18.2, クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）,クランピング因子A, CSF2, CTLA-4, サイトメガロウイルス, サイトメガロウイルス糖タンパク質B, DLL4, DR5, E. coli 志賀毒素１型, E. coli志賀毒素２型、EGFL7, EGFR, エンドトキシン, EpCAM, エピシアリン（episialin）, ERBB3, 大腸菌（Escherichia coli）, 呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus）のFタンパク質, FAP, フィブリンIIβ鎖, フィブロネクチンエクストラドメイン-B, 葉酸受容体1, Frizzled 受容体, GD2, GD3ガングリオシド, GMCSF受容体α鎖, GPNMB, Ｂ型肝炎表面抗原, Ｂ型肝炎ウイルス、HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DRβ, HNGF, Hsp90, ヒトβアミロイド,ヒト分散因子（scatter factor）受容体キナーゼ, ヒトTNF, ICAM-1 (CD54), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 領域, IGF-1受容体, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1β, IL-12, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-23, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6受容体, IL-9, ILGF2, インフルエンザA ヘマグルチニン, インスリン様増殖因子I受容体, インテグリンα4, インテグリンα4β7, インテグリンα5β1, インテグリンα7 β7, インテグリンαIIbβ3, インテグリンαvβ3, インテグリンγ誘導タンパク質,インターフェロン受容体, インターフェロンα/β受容体, ITGA2, ITGB2 (CD18), KIR2D, L-セレクチン(CD62L), Lewis-Y抗原, LFA-1 (CD11a), リポタイコ酸, LOXL2, LTA, MCP-1, メソテリン、MS4A1, MUC1, ムチンCanAg, ミオスタチン, N-グリコリルノイラミン酸, NARP-1, NCA-90 (顆粒球抗原), NGF, NOGO-A, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, フォスファチジルセリン,前立腺がん細胞、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）,狂犬病ウイルス糖タンパク質、RANKL, 呼吸器合胞体ウイルス, RHD, Ｒｈ（Rhesus）因子, RON, RTN4, スクレロスチン, SDC1, セレクチンP, SLAMF7, SOST, スフィンゴシン-1-ホスフェート, TAG-72, TEM1, テネイシンC, TFPI, TGFβ1, TGFβ2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 腫瘍抗原CTAA16.88,MUC1の腫瘍特異的グリコシル化, TWEAK受容体, TYRP1(グリコプロテイン75), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, ビメンチン, VWF
　分子プローブの好ましい具体例としては、抗ヒトCD20抗体（例えば、リツキシマブ）、又は抗エピレギュリン一本鎖抗体である。
　リツキシマブは抗ヒトCD20抗体であり、ヒトCD20はヒトB細胞にのみ発現する。マウス型抗CD20モノクロナール抗体に放射性同位元素９０Ｙを標識した細胞性非ホジキンスリンパ腫、マントル細胞リンパ腫治療薬が、ゼヴァリン（登録商標）として市販されている。当該医薬品は、抗CD２０抗体に直接RIが標識され、体内投与後腫瘍集積までに数日の時間を要する。そのためＲＩによる骨髄抑制などの重篤な副作用が生じる。これらの解決策として、プレターゲッティング法が提唱されている。Pagneliらは、抗CD２０抗体-scfvとストレプトアビジン変異体との融合タンパク及びRI標識ビオチンあるいはビスビオチンを用いたプレターゲッティング法の検討を行っている。
　エピレギュリン（Epiregulin）は、上皮細胞成長因子（epidermal  growth  factor）のメンバーであり、Hela細胞の形態変化を誘導する癌増殖阻害因子として機能することが知られている。油谷らは、抗epireulin抗体を作製した（WO2008/047723）。またLeeらは、抗エピレギュリン抗体のヒト化とその評価を行った（Biochemical  and　Biophysical  Research  communications  444（2013）1011-1017）。
　即ち、癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的にストレプトアビジン変異体を集積できることができる。その後、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変体に結合させた診断用もしくは治療用物質（蛍光色素、化学発光剤、放射性同位元素、金属化合物等からなる増感剤、金属化合物等からなる中性子捕捉剤、薬剤などの低分子化合物、マイクロあるいはナノバブル、タンパク質など）を患者に投与することによって、癌細胞へ的確に物質を集積させることが可能になる。
　本発明においては、分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体を患者に投与した後に、本発明のクリアリングエージェントを投与することにより、癌細胞に特異的に集積せずに体内に残存している上記融合体を迅速に体内から除去（クリアリング）することができる。これにより、診断用もしくは治療用物質が、非特異的に集積することを防止することができ、診断における偽陽性、治療における副作用を軽減することができる。
　ストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
　ストレプトアビジン変異体と抗体の融合体は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン変異体―抗体融合体は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
　本発明のキットは、下記式（１０）で示される化合物で標識した、治療用、体内診断用又は体外診断用の物質をさらに含むものでもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、Ｌは連結基を示す。）
　上記した式（１０）で示される化合物（以下、ビオチン改変体２量体化合物とも言う）は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０において式（１）で示される化合物として記載されている。国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されている内容、特に国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０における式（１）で示される化合物とその好ましい構造は全て本願明細書に引用するものとする。本発明における上記した式（１０）で示される化合物としては、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されている下記の具体的化合物を使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　本発明では、式（１０）で示される化合物（ビオチン改変体２量体化合物）で標識した、治療用、体内診断用又は体外診断用の物質を使用することができる。
　治療用、体内診断用又は体外診断用の物質として放射性同位元素を使用する場合には、式（１０）で示されるビオチン改変体２量体化合物に、放射性同位元素を捕捉するキレート基が結合している化合物を使用してもよい。キレート基としては、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N、N'、N''、N'''-テトラ酢酸),　DTPA(ジエチレントリアミン５酢酸)、TETA(1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-N、N'、N''、N'''-テトラ酢),　N2S2、MAG3、CHX-A-DTPA、などを挙げることができる。
　上記したキレート基が結合している化合物に放射性同位元素が捕捉されている化合物を提供することができる。キレート基に捕捉される放射性同位元素の内、イメージング用の放射性同位元素としてはガンマ線核種（67Ga、99mTc、111In、123I、ポジトロン放出核種（18F、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、86Y、89Zr、4Tc、124I）,を用いることができる。治療用の放射性同位元素としては、ペーター線核種（32P、67Cu、89Sr、90Y、114mIn、117mSn、131I、153Sm、166Ho、177,Lu、186,Re、188Re等）、アルファー線核種(211At、212Bi、212,Pb、213Bi、223Ra、225Ac等)、オージェ電子線核種(125I、165Er等)、を用いることができる。上記の中でも好ましくは、64Cu、124I,76Br, 68Ga、99mTc、123I、131I、90Yを用いることができる。
　本発明においては、上記したビオチン改変体２量体化合物に蛍光化合物又は薬剤化合物（例えば、抗がん剤）が結合している化合物を使用することもできる。
　本発明で用いることができる蛍光化合物としては、フルオレセイン5-イソチオシアナート （FITC）、IR Dye（登録商標）800、又はフルオレセインなどを挙げることができる。本発明で用いることができる薬剤（例えば、抗がん剤）としては、PBD (ピロロベンゾジアゼピン)クラス（例えば、SJG-136、SG2202など）、メイタンシン（maytansine） 類縁体（例えば、DM1、DM4など）、ドラスタチン（dolastatin） 類縁体（例えば、Monomethyl auristatin E (MMAE)、Monomethyl　auristatin F (MMAF)、dolastatin 10、tubulysinなど）、デュオカルマイシン（duocarmycin）類縁体（例えば、DC1、DC4、DC44など）、カンプトテシン（ camptothecin）類縁体（例えば、SN-38など）、その他（例えば、メトトレキサート（methotrexate）、ビンブラスチン（vinblastine）、カリケアミシン（calicheamicin）、α－アマニチン（α-amanitin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、メルファラン（melphalan））などを挙げることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：クリアリングエージェント（化合物１４）の合成
一般的方法
　核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは、JEOL ECX500 (1H NMR: 500MHz)、またはJEOL ECS400(1H NMR: 400MHz) スペクトロメータを用いて測定した。化学シフトは、内部参照として重溶媒中の残存溶媒ピークに対する値としてppmで記載した （CDCl3:δ= 7.26 ppm,  CD3OD:δ= 3.31 ppm）。低分解能質量スペクトル (LRMS) は、島津製作所 LCMS-2020によりESI-MSを用いて測定した。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル 関東化学 60 (40～50μm) 、あるいはシリカゲル　関東化学 60N (40～100 μm)、WakosilR 40C18 (30～50 μm, 70+%)を用いて行った。反応は薄層クロマトグラフィー (TLC)、あるいは低分解能質量分析 (LRMS) によって追跡した。
　逆相高速液体クロマトグラフフィー (HPLC) は、JASCO-HPLCシステムを用いて行った。210 nm または 254 nmの紫外光を用いて検出し、移動相はグラジエント溶媒系 (アセトニトリル／0.1% トリフルオロ酢酸MQ溶液) を用いた。分析については、YMC-Pack ODS-AM (150×4.6 mL) またはYMC-Triart-C18 (150×4.6 mL) のカラムを用い、流速 1 mL/minで行った。分取については、YMC-Triart-C18 (250×10 mL) のカラムを用い流速3 mL/minで行った。
　試薬は、Aldrich、東京化成工業株式会社 (TCI)、関東化学株式会社 (Kanto)、和光純薬工業株式会社、渡辺化学工業株式会社から購入した。全ての試薬及び溶媒は、特に明記が無い限り市販品をそのまま使用した。
3-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)プロピオン酸 (化合物2)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　既知の手法（Wangら、Journal of Bacteriology,(2014),196,3122）により合成した化合物 1(386 mg,0.99 mmol)のジクロロメタン(10 mL)溶液に、3-メルカプトプロピオン酸(158 mg,129 μL)と塩化スズ(IV) (336 mg,149 μL)を加え、60℃で18時間加熱還流した。溶媒を減圧留去し、0.1規定塩酸を加え酢酸エチルで２度抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=15:1 酢酸0.5 %)で精製することで化合物2（300 mg, 収率 70%,白色アモルファス状）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.97（s, 3H） , 2.00（s, 3H） , 2.07（s, 3H） , 2.17（s, 3H） , 2.77（ddd, 2H, J = 6.9, 6.9, 2.3 Hz） , 2.98 (ddd, 2H, J = 6.9, 6.9, 2.3 Hz) , 3.89 (t, 1H, J = 5.8 Hz) , 4.06 (dd, 1H, J = 11.5, 6.9 Hz) , 4.19-4.25 (m, 2H) , 4.74 (d, 1H, J = 10.3 Hz) , 5.13 (dd, 1H, J = 10.9, 3.5 Hz) , 5.39 (d, 1H, J = 3.5 Hz) , 5.51 (d, 1H, J = 9.2).
(2R,3R,4R,5R,6S)-5アセトアミド-2-(アセトキシメチル)-6-((3-((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)-3-オキソプロピル)チオ)テトラヒドロ-2H-ピラン-3.4-ジイルジアセテート (化合物3)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　カルボン酸2 (300 mg, 0.69 mmol) にアセトニトリル (7.0 mL)を加え、炭酸ジ(N-スクシンイミジル) (265 mg, 1.0 mmol) を加えた後、ピリジン (164 mg, 167 μL, 2.1 mmol)を加え室温で17時間半攪拌した。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を中性シリカゲルクロマトグラフィー (ジクロロメタン/メタノール＝30：1)で精製することで、標題化合物3 (297 mg, 収率80 %, 白色アモルファス状)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.96 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.89-2.99 (m, 6H), 3.05-3.22 (m, 2H), 3.88-3.91 (dd, 1H, J = 6.6, 6.6 Hz), 4.12 (dd, 1H, J = 3.1, 6.6), 4.15 (dd, 1H, J = 3.1, 6.6), 4.30 (q, 1H, J =10.3 Hz), 4.70-4.72 (d, 1H, J =10.3 Hz), 5.05 (dd, 1H, J =10.9, 3.5 Hz), 5.38 (d, 1H, J =3.5 Hz), 5.90 (d, 1H, J =9.8 Hz)
ジ-tert-ブチル(13-(2,2-ジメチル-4,15-ジオキソ-3,8,11-トリオキサ-5,14,-ジアザヘプタデカン-17-イル)-13-ニトロ-10,16-ジオキソ-3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,25-ジイル)ジカーバメート (化合物5)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　ニトロメタントリスプロピオン酸 (150 mg, 0.54 mmol)と既知の手法 (Wilburら, Bioconjugate.Chem. (2010) 21, 1225) により合成したアミン4 (436 mg, 1.8 mmol), 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 363 mg, 1.9 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール-無水和物 (HOBt anhydrous, 256 mg, 1.9 mmol)にジクロロメタン (5.4 mL)を加えた後、トリエチルアミン (274 mg,  0.38 mL, 2.7 mmol)を加え、室温で13時間半攪拌した。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え1規定塩酸で1度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー (ジクロロメタン/メタノール=20：1)で精製することで、標題化合物5 (412 mg, 収率 79 %, 透明油状)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.42 (s, 27H), 2.16 (d, 6H, J =5.6 Hz), 2.24 (d, 6H, J =7.5 Hz), 3.29 (d, 6H, J =5.2 Hz), 3.42 (q, 6H, J =5.2 Hz), 3.51-3.55 (m, 24H), 5.12 (brs, 2H), 6.45 (brs, 2H).
ジ-tert-ブチル(13-アミノ-13-(2,2-ジメチル-4,15-ジオキソ-3,8,11-トリオキサ-5,14-ジアザヘプタデカデカン-17-イル)-10,16-ジオキソ-3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,25-ジイル)ジカーバメート　(化合物6)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　塩化ニッケル(II) (36 mg, 0.28 mmol)にメタノール (4.0 mL)を加えた後、水素化ホウ素ナトリウム (33 mg, 0.83 mmol)を加え、室温で30分攪拌した。化合物5 (269 mg, 0.28 mmol)のメタノール (12 mL)溶液を加えた後に、水素化ホウ素ナトリウム (166 mg, 4.2 mmol)を徐々に加えた。室温で2時間半攪拌し、セライトろ過をしたろ液を減圧留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで2度抽出した。飽和食塩水で洗浄し、酢酸エチルで1度、ジクロロメタンで1度再抽出をした。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して標題化合物6 (237 mg, 収率 91 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.42 (s, 27H), 1.67 (brs, 6H), 2.24 (brs, 6H), 3.29-3.31 (m, 6H), 3.42 (q, 6H, J =5.0 Hz), 3.53 (q, 12H, J =5.5 Hz), 3.59 (s, 12H), 5.24(brs, 2H), 6.58(brs, 2H).
2,(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エタ-1-ノール (化合物8)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　アルコール7(4.15 g, 14 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド (30 mL)溶液にアジ化ナトリウム(1.78 g, 27 mmol)を加え、80℃で18時間攪拌した。蒸留水を加え、酢酸エチルで2度、ジクロロメタンで3度抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して標題化合物8 (2.26 g, 収率 94 %, 黄褐色油状)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：2.36 (brs, 1H), 3.36 (t, 2H, J =5. 3 Hz), 3.52-3.71 (m, 10H)
2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エチル(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)カーボネート (化合物9)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　アルコール8 (514 mg, 2.9 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)溶液に炭酸ジ(N-スクシンイミジル) (1.2 g, 4.9 mmol)を加え、室温で24時間半攪拌した。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して標題化合物9 (781 mg, 収率 85 %, 黄褐色油状)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：2.83 (s, 4H), 3.39 (t, 2H, J =5.3 Hz), 3.66-3.70 (m, 6H), 3.78-3.80 (m, 2H), 4.45-4.48 (m, 2H).
2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エチルジ-tert-ブチル(13-(2,2-ジメチル-4,15-ジオキソ-3,8,11-トリオキサ-5,14-ジアザヘプタデカン-17-イル)-10,16-ジオキソー3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,13,25-トリイル)トリカーバメート (10)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　化合物9 (44 mg, 0.14 mmol)にアミン6 (100 mg, 0.11 mmol)のジクロロメタン (1.4 mL)溶液を加え、トリエチルアミン (NEt3, 53 mg, 74 μL, 0.52 mmol)を加えた。40℃で12時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加え、1規定塩酸で1度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー (ジクロロメタン/メタノール=15：1→10：1)で精製して標題化合物10 (51 mg, 収率 42 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.37 (s, 27H), 1.88-1.91 (m, 6H), 2.12-2.16 (m, 6H), 3.07 (s, 2H), 3.25-3.26 (d, 6H, J =5.0 Hz), 3.32-3.37 (m, 8H), 3.46-3.63 (m, 34H), 4.08 (brs, 2H), 5.22 (brs, 2H), 6.65 (brs, 2H).
13-(3-((2-(2-(2-(2-アンモニオエトキシ)エトキシ)エチル)アミノ)-3-オキソプロピル)-13-(((2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)カルボニル)アミノ)-10,16-ジオキソ-3,6,20,23-テトラオキサ-9,17-ジアザペンタコサン-1,25-ジアンモニウムトリ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (11)
　化合物10のジクロロメタン (1.5 mL)溶液に、トリフルオロ酢酸 (TFA, 0.75 mL)を加えた。室温で1時間半攪拌し、溶媒を減圧留去して標題化合物11を含む粗生成物 (赤色油状)を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
LRMS (ESI)： m/z 834 [M+H]+.
2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エチル(1,33-ビス(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-17-(16-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-3,14-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,13-ジアザヘキサデシル)3,14,20,31-テトラオキソ-7,10,24,27-テトラオキサ-4,13,21,30-テトラアザトリトリアコンタン-17-イル)カーバメート (12)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　スクシンイミド3 (18 mg, 34 μmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール-無水和物 (HOBt anhydrous, 1.1 mg, 8.5 μmol)にアンモニウム塩11 (12 mg, 10μmol)のN,N-ジメチルホルムアミド (170 μL)溶液を加えた後に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIPEA, 85 μL)を加えた。室温で25時間半攪拌し、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=10：1→8：1)でスクシンイミド3を除いた後に、メタノールで溶出した。得られた混合物 (14.9 mg)にナトリウムメトキシド (NaOMe, 2.0 mg, 37 μmol)を加え、メタノール (1.0 mL)に溶解させた。室温で３時間攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を逆相シリカゲルクロマトグラフィー (水→メタノール)で精製して標題化合物12 (8.0 mg, 収率 46 %, 白色アモルファス状)を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：1.93-1.96 (m,6H), 1.97 (s, 9H), 2.20-2.23(m,6H), 2.56 (dd, 6H, J =7.5, 6.9 Hz), 2.87 (ddd, 3H, J =13.8, 6.9, 6.9 Hz), 3.02 (ddd, 3H, J =13.8, 7.5, 7. 5 Hz), 3.36-3.39 (m, 15H), 3.55-3.63 (m, 35H),  3.66 (s, 4H), 3.66-3.73 (m, 6H), 3.81 (dd, 3H, J =11.5, 7.5 Hz), 3.88 (d, 3H, J =2.9 Hz), 4.04 (t, 3H, J =10.3 Hz), 4.12 (brs, 2H), 4.478 (d, 3H, J =10.9 Hz).
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-((1-(28-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-12,12-ビス(16-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-3,14-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,13-ジアザヘキサデシル)-10,15,26-トリオキソ-3,6,9,19,22-ペンタオキサ-11,16,25-トリアザオクタコシル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)エチル)カルバモイル)-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル))ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル))ビス(アザンジイル ))ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル))ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (14)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　ビスイミノビオチン13 (3.6 mg, 3.2 μmol)に化合物12 (5.4 mg, 3.2 μmol)を加え、硫酸銅-五水和物 (CuSO4・5H2O, 2.2 mg, 8.7 μmol)、トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン (TBTA, 0.4 mg, 7.5 μmol)、アスコルビン酸ナトリウム (ascorbic acid Na, 2.5 mg, 13 μmol)を加え、蒸留水 (100  μL),tert-ブタノール (200 μL)を加えた。室温で4時間半攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack YMC-Triart-C18グラジエント: 0-20-20.5-60.5-61 min; 0.5-0.5-17.5-57.5-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 35.4 min)で精製することで標題化合物14 (3.9 mg, 収率 49 %,　白色固体)を得た。化合物１４はＺｅｐｈｙｒ１とも言う。
LRMS (ESI)： m/z 875 [M+3H]3+.
ジメチル 6,6’-((5-(3-(2-(2-(2-(ペンタ-4-イナミド)エトキシ)エチル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザネジイル))(2S,2`S)-ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート)  ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (23)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　ビスイミノビオチン21 (21.8 mg, 0.015 mmol)、N-ヒドロキシコハク酸イミジルエステル22 (3.9 mg, 0.020 mmol)にN,N-ジメチルホルムアミド (0.2 mL)、トリエチルアミン (6.4 μL, 0.046 mmol)を加えた。室温で7時間半攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を、自動精製装置 (山善 ODS-SM 50μm グエラジエント: 0-1-20-25 min; 5-5-80-100 % MeOH in 0.1% TFA水で精製することで標題化合物23 (16 mg, 69 %, 褐色油状)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ：1.41-1.78 (m, 22H), 1.83-1.92 (m, 2H), 2.24 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 2.26 (t, 4H, J = 2.8 Hz), - (m, 4H), 2.80 (d, 2H, J = 10.2 Hz), 2.98 (dd, 2H, J = 13.3, 5.0 Hz), 3.23-3.28  (m, 2H), 3.34-3.42 (m, 8H), 3.57 (dt, 4H, J = 17.4, 5.5 Hz) 3.64 (s, 4H), 3.70 (s, 6H), 4.40 (dd, 2H, J = 9.6, 5.0 Hz), 4.51 (dd, 2H, J = 8.2, 4.6 Hz), 4.71 (dd, 2H, J = 5.0, 7.8 Hz), 7.81 (s, 1H), 7.95 (d, 2H, J = 1.8 Hz) 
ジメチル 6,6`-((5-(3-(2-(2-(2-(3-(1-(28-(((2S,3R,4R,5R,6R,)-アセタミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-12,12-ビス(16-(((2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセタミド-4,5ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)チオ)-3,14-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,13-ジアザヘキサデシル)-10,15,26-トリオキソ-3,6,9,19,22-ペンタオキサ-11,16,25-トリアザオクタコシル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)プロパナミド)エトキシ)エトキシ)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザネジイル))(2S,2`S)-ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート) ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (25)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　ビスイミノビオチン23 (2 mg, 1.4 μmol)に化合物24（化合物12と同じ） (2.4 mg, 1.4 μmol)を加え、硫酸銅-五水和物 (CuSO4・5H2O, 2.2 mg, 8.7 μmol)、トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン (TBTA, 0.8 mg, 1.5 μmol)、アスコルビン酸ナトリウム (ascorbic acid Na, 4.0 mg, 20 μmol)を加え、蒸留水 (100  μL),アセトニトリル (100 μL)を加えた。室温で3時間攪拌し、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack YMC-Triart-C18グラジエント: 0-20-20.5-60.5-61 min;5-5-17.5-57.5-100% MeCN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5 %),tR= 37.2 min)で精製することで、標題化合物25 (0.5 mg, 11 %, 白色固体)を得た。化合物２５はＺｅｐｈｙｒ２とも言う。
LRMS (ESI)： m/z 721.7 [M+3H]3+.
実施例２：抗CEA-Cupid (ST03-Cupid) の発現ベクターの構築
　CEACAM5のN-A1部分を認識するscFv型抗体ST03の遺伝子配列は文献をもとに作製した（US 7626011：Antibodies against tumor surface antigens）。ST03遺伝子とCupid遺伝子とを融合させたST03-Cupidの遺伝子配列は人工遺伝子合成（Eurofingenomics社）を行った（配列番号１）。Cupidとは、ＷＯ２０１５／１２５８２０号公報に記載されているＶ２１２２（ＬＩＳＡ３１４－Ｖ２１２２とも言う）（ＷＯ２０１５／１２５８２０号公報における配列番号４）と称されるタンパク質である。Cupidのアミノ酸配列を、本願の配列表の配列番号４に示す。
　次に文献を参照し、シャペロン機能を有するタンパク質skpと目的のタンパク質ST03-Cupidと同時に大腸菌で発現させることで可溶性画分にて回収する方法を実施した（国際公開WO2015125820： ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用）。具体的には、発現ベクターpETDuet-1(Novagen社)のマルチクローニングサイト１（MCS1）にST03-Cupid遺伝子を組み込み、マルチクローニングサイト２（MCS2）にskp遺伝子（配列番号２）を組み込んだ。ST03-Cupid遺伝子を組み込みは、制限酵素サイトNcoIとEcoRIでベクターを処理し、プライマー（1740_Fw; AGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGACCG（配列番号５）, 1741_Rv; CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号６））を使用し増幅したST03-Cupid遺伝子をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社）を用いてライゲーションおよびクローニングを行った。その後、ST03-Cupid遺伝子が正しく組み込まれたことをシーケンスで確認した。次に、ST03-Cupid遺伝子が組み込まれたベクターを制限酵素NdeIで処理し、プライマー（skp_Fw; AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号７）, skp_Rv; TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号８））を使用し増幅したskp遺伝子をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社）を用いてライゲーションおよびクローニングを行った。その後、skp遺伝子が正しく組み込まれたことをシーケンスで確認した。これによりST03-Cupidタンパク質とskpタンパク質とを同時に発現できるベクター (pETDuet-ST03-Cupid_skp) が完成した。
実施例３：ST03-Cupidの発現
　pETDuet-ST03-Cupid_skp ベクターをBL21(DE3)（ニッポン・ジーン社）に形質転換し２xYT培地（BD社）、37℃にて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 2.0になるまで37℃で培養を行った。次に最終濃度0.5 mM IPTGを添加し37℃で４時間培養し、遠心分離後、培養上清を回収し４℃で保存した。
実施例４：ST03-Cupidの精製
　ST03-Cupidタンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用しバッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 5mM Imidazole, pH8.0）で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を４℃で保存した培養上清へ添加し、２時間から一晩、４℃にて撹拌しレジンへのタンパク質結合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業を行った。その後、バッファーB（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazole, pH8.0）で溶出しST03-Cupidの粗精製物の回収を行った。
　次に、Protein L カラム（Capto L; GE Healthcare）による精製を行った。PBSで平衡化したカラムに上述の粗精製物を注入しレジンへのタンパク質結合処理を行ったのちに２０カラムボリュームのPBSで洗浄後、10 mMグリシン塩酸バッファー pH2.1 にて溶出した。溶出したタンパク質溶液は脱塩カラム（PD-10 Colum, GE Healthcare）を用いて溶媒をPBSに置換し、限外ろ過カラム（VIVASPIN Turbo 15, Sartorius）にて濃縮を行った。
実施例５：ST03-Cupidのヨウ素標識作製
　精製されたST03-Cupidタンパク質にN-succinimidyl-3-(4-hydroxy-3-[125I]iodophenyl)propionate, Bolton-Hunter Reagent (NEX120, PerkinElmer)を用いて放射性ヨウ素標識を行った。具体的には、使用するタンパク質のモル数に対し20倍モルのBolton-Hunter Reagentをエッペンチューブ取り出し、溶媒を気化させたのちにタンパク質溶液を添加して氷上で2時間反応させた。その後、脱塩カラム（PD MiniTrap G-25, GE Healthcare）にて未反応の放射性ヨウ素Bolton-Hunter Reagentを取り除き、限外ろ過カラム（VIVASPIN Turbo 4, Sartorius）にて濃縮を行った。濃縮後、ドーズキャリブレータ（CRC-25w, CAPINTEC）で放射能量の測定およびSDS-PAGEによるCBB染色にてタンパク質のクオリティーチェックを行った。
実施例６：クリアリングエージェント(化合物１４)のin vivo試験
　化合物１４（Ｚｅｐｈｙｒ１）の有効性を確認するために125I標識されたST03-Cupid（[125I]ST03-Cupid）を雄性マウスに単回静脈内投与し、継時的に採血し、化合物１４投与による血液中放射能濃度変化の測定を行った。具体的に実験群は４群準備した。１群目は[125I]ST03-Cupidを投与し6時間後に化合物１４を単回静脈内投与する群とし、２群目は１群目のコントロール群として化合物１４の代わりに生理食塩水を投与する群とした。さらに３群目は[125I]ST03-Cupidを投与し24時間後に化合物１４を単回静脈内投与する群とし、４群目は３群目のコントロール群として化合物１４の代わりに生理食塩水を投与する群とした。
　具体的にマウスへの[125I]ST03-Cupidの投与は濃度50 kBq/100 μL の[125I]ST03-Cupidを100μL単回静脈内投与した（143 pmol/50 kBq/100 μL injection）。さらに[125I]ST03-Cupid投与6時間後または24時間後に化合物１４ をST03-Cupidの投与モル数の２倍量（286 pmol/100 μL injection）もしくは生理食塩水を100μL投与した。またマウスは各群n=4～6で行った。
　採血は継時的にマウスの眼窩静脈から行った。[125I]ST03-Cupidを投与後6時間後に化合物１４を投与した場合の採血は１回目：[125I]ST03-Cupid投与10分後、２回目：[125I]ST03-Cupid投与6時間後、３回目：Saline又は化合物１４を投与10分後、４回目：Saline又は化合物１４を投与1時間後、５回目：Saline又は化合物１４を投与3時間後、6回目：Saline又は化合物１４を投与18時間後、7回目：Saline又は化合物１４を投与24時間後に行った。同様に[125I]ST03-Cupidを投与後24時間後に化合物１４を投与した場合の採血は１回目：[125I]ST03-Cupid投与10分後、２回目：[125I]ST03-Cupid投与24時間後、３回目：Saline又は化合物１４を投与10分後、４回目：Saline又は化合物１４を投与1時間後、５回目：Saline又は化合物１４を投与3時間後、6回目：Saline又は化合物１４を投与6時間後、7回目：Saline又は化合物１４を投与24時間後に行った。採取された血液(40～50μL)はガンマカウンタにより測定を行った。結果は、ガンマカウンタにより測定された計数率(dmp)を採血量(g)で割り単位重さ当たりの計数率(dpm/g of blood)を計算しグラフ化した。同様に投与前の[125I]ST03-Cupidの計数率で割ることで投与後投与量のうち残存する割合(%ID/g of blood)を計算しグラフ化した。測定の結果を表１及び２並びに図１及び２に示す。これらの結果から、本発明のクリアリングエージェントにより、ST03-Cupidの血中濃度を効率的に低下させることができることが示され、クリアリングエージェントとしての有用性が示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
実施例７：化合物１４（Zhepyr1）および化合物２５（Zephyr2）とCupidとの親和性測定
　Zephyr1およびZephyr2のCupidに対する親和性を確認するためにSPR (Biacore T200) によるカイネティクス解析を行った。具体的には、リガンドであるCEA-CupidをSensor Chip CM5 (GE Healthcare) に Amin Coupling Kit (GE Healthcare) を用いて5000RUをターゲットにして固定化し、アナライトであるZephyr1 もしくはZephyr2 を10 nM から２倍希釈５系列をもちいて Single Cycle Kinetics 法によりカイネティクス解析を実施した。取得したデータをBiacore T200 Evaluation Software, version 2.0 (GE Healthcare) を使用し Bivalent Analyte モードでフィッティングしカイネティクスパラメータを算出した。その結果、Zephyr1: ka = 3.792E+4、kd = 4.42E-6（図３のＡ）およびZephyr2: ka = 1.578E+7、kd = 0.09339（図３のＢ）となった。 すなわち Zephyr1 KD = ka/kd = 1.167E-10 MおよびZephyr2: KD = ka/kd = 5.885E-09 Mとなった。この結果より、Zephyr2 (KD = 5.885E-09 M )はZephyr1 (KD = 1.167E-10 M )に比べCupidへの親和性が約50分の１に低下していることが確認された。
実施例８
＜標識体Psyche-B-DOTA(111In)の調製＞
111InCl3溶液 37 MBq (約20 pmol)に、同体積の100 mM 酢酸バッファーを加えpH4～5とし、Psyche-B-DOTAをモル比で1000倍 (10 nmol)、DMSO濃度0.2%以上となるよう添加し、80℃で15分以上加熱する。これをHPLCで分析し、放射化学的純度を確認した。これを1 nmol/mLとなるように10 mM酢酸バッファーで希釈し、これを投与液とした。
＜In vivo でのZephyr2によるCupidのクリアランス＞
　生体内の血中に存在するCupidがZephyr2 によりクリアランスをされるかどうかについてゼノグラフトモデルマウスを用いて実験をおこなった。Zephyr2投与群マウス３匹、非投与群（コントロール群）マウス３匹で実施した。具体的には、ゼノグラフトモデルマウスにCEA-Cupidを150 pmol 投与し、投与20時間後にZephyr2を100 pmol 投与した（コントロール群は未処理）。さらにZephyr2投与2時間後に投与液Psyche-B-DOTA(111In)を両群に投与した。次に標識体投与4時間後に採血を行いガンマーカクンターにて放射線量の測定を行った。その結果、Zephyr2投与群は４.51 %ID/g、コントロール群は22.09 %ID/gとなりZephyr2投与により血中のCEA-Cupidのクリアランスが確認された（図４）。

Claims (13)

  1. 下記式（１）で示される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示す。Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示す。Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し。ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示す。Ｌ１０及びＬ１２はそれぞれ独立に２価の連結基を示す。Ｌ１１は３価の連結基を示す。Ｌ１４は２価の連結基を示す。Ｓｕｇａｒは糖の残基を示す。）
  2. ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）で示される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ、Ｘ２ｂ、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1、Ｚ2、Ｖ1、Ｖ2、Ｌ１０、Ｌ１２、Ｌ１１、Ｌ１４、及びＳｕｇａｒは、請求項１と同義である）
  3. 下記式（３）で示される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｌ１０、Ｌ１２、Ｌ１１、Ｌ１４、及びＳｕｇａｒは、請求項１と同義である）
  4. Ｌ１０及びＬ１２がそれぞれ独立に、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、又はそれらの組み合わせである、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  5. Ｌ１１が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で示される基である、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  6. Ｌ１３が、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     又はそれらの組み合わせである、請求項１から５の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  7. Ｌ１４が、炭素数１から１０のアルキレン基、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、又はそれらの組み合わせである、請求項１から６の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  8. 以下の何れかの化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  9. 請求項１から８の何れか一項に記載の化合物又はその塩を含む、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体をクリアリングするためのクリアリングエージェント。
  10. ストレプトアビジン変異体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３７番目のアミノ酸残基であるAsnが他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる、ストレプトアビジン変異体である、請求項９に記載のクリアリングエージェント。
  11. ストレプトアビジン変異体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるストレプトアビジン変異体である、請求項９又は１０に記載のクリアリングエージェント。
  12. 請求項１から８の何れか一項に記載の化合物又はその塩と、ストレプトアビジン変異体と分子プローブとの融合体とを少なくとも含む、治療用、体内診断用又は体外診断用のキット。
  13. 下記式（１０）で示される化合物で標識した、治療用、体内診断用又は体外診断用の物質をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、Ｌは連結基を示す。）
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