JP2012167987A - ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子 - Google Patents
ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012167987A JP2012167987A JP2011028447A JP2011028447A JP2012167987A JP 2012167987 A JP2012167987 A JP 2012167987A JP 2011028447 A JP2011028447 A JP 2011028447A JP 2011028447 A JP2011028447 A JP 2011028447A JP 2012167987 A JP2012167987 A JP 2012167987A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ligand
- bond
- formula
- biotin
- alkyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 title claims abstract description 54
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 title claims description 94
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 title claims description 47
- 239000011616 biotin Substances 0.000 title claims description 47
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 41
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- -1 alkyl azide Chemical class 0.000 claims description 30
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 25
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 8
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 8
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001301 oxygen Chemical group 0.000 claims description 7
- 229910052760 oxygen Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000001356 alkyl thiols Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 5
- 125000006177 alkyl benzyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 20
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007819 coupling partner Substances 0.000 abstract 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 77
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 38
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 18
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 17
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 15
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 15
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 14
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 11
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 7
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 7
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 7
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XJFZOSUFGSANIF-UHFFFAOYSA-N 3-chloro-2-(chloromethyl)prop-1-ene Chemical compound ClCC(=C)CCl XJFZOSUFGSANIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 6
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N cyclohexene Chemical compound C1CCC=CC1 HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 6
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- YMAPADGKASYTPY-FROKLYQUSA-N CC(O)=O.CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O Chemical class CC(O)=O.CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O YMAPADGKASYTPY-FROKLYQUSA-N 0.000 description 5
- WZFQZRLQMXZMJA-KSTCHIGDSA-N [(3ar,5r,6s,7r,7ar)-6,7-diacetyloxy-2-methyl-5,6,7,7a-tetrahydro-3ah-pyrano[3,2-d][1,3]oxazol-5-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)O[C@H]1[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(=O)C)O[C@@H]2OC(C)=N[C@@H]21 WZFQZRLQMXZMJA-KSTCHIGDSA-N 0.000 description 5
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 5
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MBQYGQMGPFNSAP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCN=[N+]=[N-] MBQYGQMGPFNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 4
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 125000005745 ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 4
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 4
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 1H-1,2,3-Triazole Chemical compound C=1C=NNN=1 QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GIAFURWZWWWBQT-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanol Chemical compound NCCOCCO GIAFURWZWWWBQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APTGPWJUOYMUCE-UHFFFAOYSA-N S-Ethyl thioacetate Chemical compound CCSC(C)=O APTGPWJUOYMUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- WWECJGLXBSQKRF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;methanol Chemical compound OC.CN(C)C=O WWECJGLXBSQKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N pyrazine-2,5-dicarboxylic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C1=CN=C(C(O)=O)C=N1 KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 2
- MIOPJNTWMNEORI-GMSGAONNSA-N (S)-camphorsulfonic acid Chemical compound C1C[C@@]2(CS(O)(=O)=O)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C MIOPJNTWMNEORI-GMSGAONNSA-N 0.000 description 1
- 0 ******N(C*C(F)(F)F)** Chemical compound ******N(C*C(F)(F)F)** 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIZGSVFYNBZVIK-FHHHURIISA-N 3'-sialyllactose Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@@]1(C(O)=O)O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@@H]1O OIZGSVFYNBZVIK-FHHHURIISA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZCFWOHAWRIQGF-UHFFFAOYSA-N 3-chloropropane-1-thiol Chemical compound SCCCCl TZCFWOHAWRIQGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-VAWYXSNFSA-N AIBN Substances N#CC(C)(C)\N=N\C(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002521 alkyl halide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-SKWQFERISA-N alpha-D-Galp-(1->4)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-SKWQFERISA-N 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGUUDTWORXNLAK-UHFFFAOYSA-N azidoalcohol Chemical compound ON=[N+]=[N-] UGUUDTWORXNLAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- HYGYSIDIKIGPJA-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethyl acetate;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl.CCOC(C)=O HYGYSIDIKIGPJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N dimethylmethane Natural products CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N lacto-N-neotetraose Natural products OCC1OC(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)C(NC(=O)C)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940062780 lacto-n-neotetraose Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N neolactotetraose Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- TVDSBUOJIPERQY-UHFFFAOYSA-N prop-2-yn-1-ol Chemical compound OCC#C TVDSBUOJIPERQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000002653 sulfanylmethyl group Chemical group [H]SC([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明のリガンド固定化分子は、2個のビオチンを有し、ストレプトアビジン又はアビジンとの結合を介して強固に固相支持体と結合することができる。また、リガンド部位に関しては、所望の数のリガンドを自在に結合させることができ、また、固相支持体から、伸長するリガンド存在部位までの距離を容易に変えること可能である。
以上の特徴を有する本発明のリガンド固定化分子は、既知又は未知のリガンド結合パートナーの探索を様々な条件を変えて実施することが可能であり、従来、見出すことができなかったリガンド結合パートナーの同定を可能にする。
【選択図】なし
Description
以上のように、細胞内における様々な現象は、細胞内に存在する物質同士の相互作用を介して生じることが多く、そのため、細胞機能の解明においては、生体分子同士の相互作用を考慮しながら研究開発等を進めていくことが非常に重要になってくる。
このような方法においては、リガンドを結合させたリガンド固定化分子を固相支持体に対して安定に強く固定することが重要な点として挙げられる。一般に、ビオチン−ストレプトアビジン(又はアビジン)結合は、強固で安定な結合を実現すると考えられている。しかしながら、リガンドを固定化するリンカーをより安定に固定するためには、ビオチン−ストレプトアビジン結合をさらに増強することが望ましい。ストレプトアビジンは1分子内に4つのビオチン結合部位を有しており、リガンド固定化分子をストレプトアビジンに結合させるには、固定化分子を1個でビオチン化するより2個でビオチン化した方がより強い結合を得ることができる(非特許文献1及び非特許文献2など)。従って、リガンドを固定化するためにビオチン−ストレプトアビジン(又はアビジン)結合を利用する場合には、1つのリガンド固定化用分子あたり2個以上のビオチンを保持させた方がより安定な固定化を実現することができると考えられる。
しかしながら、これまでに、そのような分子は開発されていない。
そこで、本発明は、リガンド固定化分子のリガンドが結合する部分と固相支持体に結合する部分(本発明のリガンド固定化分子においては、ビオチン又はビオチン誘導体が結合部分)を別々に調製し、これらを結合させたリガンド固定用分子の提供を目的とする。
リガンド固定化分子を固相支持体に結合させる点において、1分子あたりのビオチンの数を2個とすることで、従来の類似分子と比較して、固相支持体への結合安定性が顕著に上昇する。さらに、2個のビオチンを使用することで、より堅固で安定な立体構造をリガンド固定化分子に与えることが可能となる。その結果、リガンド同士の不自然な接触や重なり合いを回避することができ、よりネイティブな状態にリガンドを保ちつつ、結合パートナーの探索ために提示することができる。
また、リガンド結合部分をビオチン結合部分と別個に調製することで、リガンド固定化分子自体の長さ、保持するリガンドの数、空間あたりのリガンド密度などを調節することができる。そのため、リガンドと結合する結合パートナー分子の物理的特性が未知であってもパートナー分子を容易に同定し得ることとなる。このようなリガンド固定化分子の各部分の調製おいては、特に、リガンド結合部分については、デンドリマーの調製技術を利用することが可能である。
(式(I)中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1〜10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Wは以下の式(II)、
(式(II)中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である)を表す)
(式(IV)中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1〜10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Yは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す)。
(式(II)中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Aは硫黄又は酸素を表し、R1は炭素数1〜10の飽和炭化水素鎖を表し、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である。Zは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す)。
式(I)中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1〜10飽和炭化水素鎖を表し、好ましくは、炭素数1〜5の直鎖状飽和炭化水素鎖である。R2は、炭素数1〜30で、不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖である。好ましくは、炭素数は5〜25の直鎖状炭化水素であって、適宜、アミド結合、エーテル結合を含む。また、Aは硫黄又は酸素を表し、好ましくは、硫黄であり、Bはビオチン又はビオチン誘導体(ストレプトアビジン又はアビジンと結合するビオチン誘導体)を表す。2個のビオチン間の間隔は(つまり、B−R2−CH−R2−Bの長さ)、20Å以上が好ましく、例えば、30Å〜50Å、より好ましくは、35Å〜45Åである。ビオチン間の距離がこの範囲内にあれば、R2の炭化水素鎖は、親水性を有するものであれば、特に限定はされない。
式(II)中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよい。R3は水素又は炭化水素鎖である。R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよい。Xはリガンドを表す。kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である。
ここで「リガンド」とは、何らかの物質又は分子と結合する物質のことで、該リガンドの結合パートナーは既知であっても、未知であってもよい。例えば、受容体をリガンドとした場合、該受容体と結合するホルモン、神経伝達物質などが結合パートナーとなり得る。あるいは、ホルモンなどをリガンドとした場合には、受容体が結合パートナーとなり得る。本発明のリガンドは、いかなるものであってもよく、好ましくは、生体内に存在するか、又は人工物であっても生体内で作用すると予想される物質である。本発明のリガンドとしては、例えば、抗体、酵素、ペプチドアプタマー、受容体などのタンパク質性物質、DNA、RNA又はこれらの誘導体などの核酸、抗生物質などのタンパク質性もしくは非タンパク質性生体内活性物質、あるいは、レクチンなどに結合し得る糖(例えば、ラクトース、シアリルラクトース、グロボトリオース、ラクト−N−ネオテトラオース、オリゴマンノースなどの他、生体内の特定の組織等に存在するレクチンと結合することが既知の糖鎖などであり、単糖、オリゴ糖などいかなる糖鎖であってもよい)などを挙げることができる。
式(IV)中、R1、R2、A及びBは、上述の式(I)と同一の分子、原子、置換基等を表す。Yは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。また、式(I)の化合物と同様に、2個のビオチン間の間隔は(つまり、B−R2−CH−R2−Bの長さ)、20Å以上が好ましく、例えば、30Å〜50Å、より好ましくは、35Å〜45Åである。
また、式(V)中、R1、R3、R4、R5、R6、A及びXは、上述の式(I)と同一の分子、原子、置換基等を表す。kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である。Zは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。E−X間の距離については、上述したように適宜決定することができる。
本発明の診断薬は、上述のキットの形態で提供してもよく、この場合、該キットには、リガンド固定化分子を固定化する固相支持体、例えば、プレート(例えば、ウェル付きのプレートなど)やビーズ(例えば、磁気ビーズ)等が含まれていてもよい。あるいは、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、分子の大きさが異なる種々の式(I)の化合物が、ビオチン−ストレプトアビジン(又はアビジン)結合を介してマイクロアレイ用のチップ上に予め、各々、固定化されていてもよく、該チップは、ハイスループットの診断に用いられてもよい。
式(I)の化合物の1例として、k=1、l=1、m=0の[GlcNAc(OH)]2−(ビオチン)2コンジュゲートの製造方法を以下に示す。
テトラエチレングリコール(1)(5.00g,25.7mmol)をピリジン(50mL)に溶解させ、窒素雰囲気下0℃でp−トルエンスルホン酸クロライド(5.39g,28.3mmol)を加えて攪拌した。反応液は0℃で攪拌され、2時間後TLC上で反応の進行を確認したところ、原料が多量に残っていたためp−トルエンスルホン酸クロライド(0.98g,5.14mmol)をさらに加えた。その後1時間攪拌し、綿栓ろ過により析出した塩をろ過した。そのろ液を濃縮し、黄色透明液体(Rf = 0.48 [CHCl3 : EtOAc : MeOH = 5:4:1 (v/v/v)])を得た。
得られた液体をDMF(44mL)に溶解させ、次いでアジ化ナトリウム(5.01g,77.1mmol)を加えた後、窒素雰囲気下80℃で3時間攪拌した。反応終了後、綿栓ろ過と濃縮を順次行い、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を氷水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させ、セライトろ過を行い、濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル 1:3 (v/v),シリカゲル 300mL]により精製され、無色透明シラップの目的物(3)(2.59g,45.9%)を得た。
Rf = 0.34 [CHCl3: EtOAc: MeOH = 5:4:1 (v/v/v)]
IR (neat); 3447 (νO-H), 2872 (νC-H), 2108 (νN3), 1125 (νC-O-C) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 3.73 (br t, 2 H, HOCH2), 3.69-3.67 (m, 10 H, CH2), 3.62 (t, 2 H, J = 4.5 Hz, HOCH2CH2), 3.41 (t, 2 H, J = 5.0 Hz, CH2N3), 2.63 (br s, 1 H, OH)
13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 72.46 (HOCH2CH2), 70.60, 70.57, 70.48, 70.23 and 69.94 (CH2), 61.63 (HOCH2), 50.59 (CH2N3)
N−アセチルグルコサミンα−アセテート(4)(4.00g,10.3mmol)を塩化メチレン(20mL)に溶解させ、アルゴン置換をし、氷冷下で撹拌しながらトリフルオロメタンスルホン酸トリシリルメチル(2.05mL,11.3mmol)を滴下した。その後60℃で5時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷冷し、過剰のトリエチルアミンを加えて塩基性条件とした。続いて濃縮を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ[トルエン―酢酸エチル―トリエチルアミン 100:200:1 (v/v/v),シリカゲル 230mL]により精製し、オレンジ色透明のシラップとして目的物(5)(3.08g,91.1%)を得た。
Rf = 0.49 [CHCl3: MeOH = 10:1 (v/v)]
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 5.97 (d, 1 H, J1,2 = 7.5 Hz, H-1), 5.27 (t, 1 H, J = 2.5 Hz, H-3), 4.96-4.90 (m, 1 H, H-4), 4.19-4.12 (m, 3 H, H-2, H-6a, H-6b), 3.65-3.56 (m, 1 H, H-5)
アジドアルコール(3)(5.39g,24.3mmol)およびオキサゾリン体(5)(3.08g,9.35mmol)を塩化メチレン(15mL)に溶解させ、アルゴン雰囲気下でカンファースルホン酸(0.217g,0.935mmol)を加えた後、90℃で1時間撹拌した。反応終了後クロロホルムで希釈し、氷水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。続いて無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させ、セライトろ過した後、濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ [1回目;クロロホルム―メタノール 20:1 (v/v),シリカゲル 780mL、2回目;クロロホルム―酢酸エチル―メタノール 15:14:1(v/v/v),シリカゲル 630mL]で精製することにより、白色ろう状固体として目的物(6)(3.82g,74.5%)を得た。
Rf = 0.37 [CHCl3: MeOH = 15:1 (v/v)]
[α]D 33 -24.0o (C 1.06, CHCl3)
IR (neat); 2878 (νC-H), 2112 (νN3), 1746 (νC=O, ester), 1667 (νC=O, amide), 1553 (δN-H, amide), 1242 (νC-C(=O)-O, ester ), 1045 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 6.64(d, 1 H, JNH,2 = 9.3 Hz, NH), 5.11-5.06 (m, 2 H, H-3, H-4), 4.79 (d, 1 H, J1,2 = 8.6 Hz, H-1), 4.26 (dd, 1 H, J5,6a = 12.3 Hz, J6a,6b = 4.8 Hz, H-6a), 4.13 (dd, 1 H, J5,6b = 2.5 Hz, J6b,6a = 12.3 Hz, H-6b), 4.13-4.08 (m, 1 H, H-2), 3.91-3.60 (m, 15 H, -OCH2-×7, H-5), 3.40 (dd, 2 H, Jgem = 5.6 Hz, Jvic = 4.5 Hz, -CH2N3), 2.09, 2.01 and 1.98 (each s, 12 H, OAc×3, NAc)
13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 170.54, 170.47 and 170.43(-C=O, ester), 169.14 (-C=O, amide), 101.65 (C-1), 73.22, 71.46, 71.28, 70.55, 70.44, 70.31, 70.14, 69.62, 68.54, 68.46, 62.04, 53.65, 50.42, 22.74 (-NHCOCH3), 20.52, 20.47 and 20.39 (-COCH3)
MALDI-TOF-MS calcd for C22H36N4O12 [M+Na]+: 571.22, Found: 571.28
Anal. Calcd for C22H36N4O12: C, 48.17; H, 6.62; N, 10.21, Found: C, 48.11; H, 6.57; N, 10.12.
3−クロロ−2−クロロメチル−1−プロペン(7)(3.00g,24.0mmol)およびプロパルギルアルコール(8.50mL,144mmol)をDMF(30.0mL)に溶解させ、アルゴン置換した後、氷冷した。続いて50%水素化ナトリウム(7.60g,158mmol)を少量ずつ加えていき、1時間かけて全てを加え終えた後、室温に戻してさらに1時間撹拌した。反応終了後、反応液に過剰のメタノールを加え、濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、氷水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過を行った後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル 20:1 (v/v),シリカゲル 580mL]によって精製し、無色透明オイル状のジアルキン体(8)(3.19g,81.0%)を得た。
Rf = 0.41 [n-Hexane: EtOAc = 12:1 (v/v)]
IR (neat); 3293 (ν≡C-H), 2857 (νC-H), 2116 (νC≡C), 1443, 1358 and 1263 (νas,C-O-C of ether, δC-H), 1086 (νs,C-O-C, ether), 675-644 (δ≡C-H) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 5.26 (m, 2H, CH2=), 4.16 (d, 4H, CH2C≡C×2), 4.09 (t, 4H, =CCH2×2), 2.45 (t, 2H, C≡CH×2)
13C-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 141.07 (H2C=C), 115.57 (H2C=C), 79.50 (-C≡CH), 74.46 (-C≡CH), 70.12 (=CCH2×2), 57.16 (OCH2C≡×2)
アジ化グリコシド(6)(3.57g,6.44mmol)とジアルキン体(8)(0.440g,2.68mmol)をメタノール(15mL)に溶解させ、アルゴン置換した後に氷冷下で攪拌しながら、0.1M硫酸銅(II)五水和物水溶液(13.4mL,1.34mmol)と1.0Mアスコルビン酸ナトリウム水溶液(7.5mL,7.5mmol)を順に滴下した。その後室温に戻して4時間攪拌した。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を氷水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。続いてセライトろ過を行い、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ [クロロホルム―メタノール 20:1 (v/v),シリカゲル 480mL]で数回精製することにより、無色透明の高粘性シラップとして目的物(9)(3.19g,94.4%)を得た。
Rf = 0.36 [CHCl3: MeOH = 10:1 (v/v)]
IR (neat); 2937 (νC-H), 1746 (νC=O, ester), 1661 (νC=O, amide), 1559 (δN-H, amide), 1240 (νC-C(=O)-O, ester ), 1045 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.44 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 6.67 (d, 2 H, JNH,2 = 9.2 Hz, NHAc×2), 5.26 (s, 2 H, CH2=), 5.14 (t, 2 H, J = 9.9 Hz, H-3×2), 5.07 (t, 2 H, J = 9.6 Hz, H-4×2), 4.78 (d, 2 H, J1,2 = 8.6 Hz, H-1×2), 4.62 (s, 4 H, =C(CH2OCH2-)2), 4.56 (t, 4 H, Jvic = 5.3 Hz,-OCH2CH2N-×2), 4.25 (dd, 2 H, J5,6a = 12.3 Hz, J6a,6b = 4.8 Hz, H-6a×2), 4.12 (dd, 2 H, J5,6b = 2.4 Hz, J6a,6b = 12.3 Hz, H-6b×2), 4.04 (q, 2 H, J = 9.5 Hz, H-2×2), 3.91-3.56 (m, 26 H, -OCH2-×12 and H-5×2), 3.90 (t, 4 H, Jvic = 5.3 Hz,-OCH2CH2N-×2), 2.08, 2.01, 2.00 and 1.93 (each s, 24 H, OAc×6, NAc×2)
13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 170.77×2 and 170.48 (-C=O, ester), 169.32 (-C=O, amide), 144.89 (-CH=C- of triazole ring), 141.97 (CH2=C-), 123.65(-CH=C- of triazole ring), 115.01 (CH2=C-), 101.66 (C-1), 73.26, 71.68, 71.28, 70.97, 70.66, 70.56, 70.47, 70.23, 69.30, 68.70, 63.56, 62.18, 54.01, 50.17, 23.00 (-NHCOCH3), 20.74, 20.70 and 20.60 (-COCH3)
MALDI-TOF-MS calcd for C54H84N8O26 [M+Na]+: 1283.54, Found: 1283.55
N−アセチルグルコサミンアセテート二量体(9)(308mg,244μmol)と3−クロロ−1−プロパンチオール(357μL,3.66mmol)を1,4−ジオキサン(1.5mL)に溶解させ、続いて室温にてAIBN(20.0mg,122μmol)を添加し、アルゴン置換を行った。その後反応系を一気に80℃の油浴に浸たし、80℃で1時間攪拌した。TLC上で反応が終了したことを確認し、シクロヘキセン(371μL,3.66mmol)を加えて反応を停止させた。続いて濃縮を行い、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール 20:1 (v/v),シリカゲル 60mL]で精製することにより白色泡状〜無色透明高粘性シラップとして目的物(10)(269mg,80.3%)を得た。
Rf = 0.22 [CHCl3: MeOH = 15:1 (v/v)]
[α]D 28 -16.3o (C 0.58, CHCl3)
IR (neat); 2872 (νC-H), 1748 (νC=O, ester), 1667 (νC=O, amide), 1557 (δN-H, amide), 1233 (νC-C(=O)-O, ester ), 1045 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.70 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 6.58 (d, 2 H, JNH,2 = 9.2 Hz, NHAc×2), 5.13 (t, 2 H, J = 9.8 Hz, H-3×2), 5.07 (t, 2 H, J = 9.5 Hz, H-4×2), 4.79 (d, 2 H, J1,2 = 8.6 Hz, H-1×2), 4.60 (s, 4 H, -CH2CH(CH2OCH2-)2), 4.55 (t, 4 H, Jvic = 4.3 Hz,-OCH2CH2N-×2), 4.25 (dd, 2 H, J5,6a = 12.3 Hz, J6a,6b = 4.7 Hz, H-6a×2), 4.13 (dd, 2 H, J5,6b = 2.3 Hz, J6a,6b = 12.3 Hz, H-6b×2), 4.05 (q, 2 H, J = 9.5 Hz, H-2×2), 3.91-3.54 (m, 32 H, -OCH2-×12, -CH2CH(CH2O-)2, -CH2Cl and H-5×2), 3.90 (t, 4 H, Jvic = 5.3 Hz,-OCH2CH2N-×2), 2.63 (t, 2 H, J = 7.0 Hz, -SCH2CH2CH2Cl), 2.60 (d, 2 H, J = 6.7 Hz, -CHCH2SCH2CH2CH2Cl), 2.30-1.90 (m, 3 H, -CHCH2SCH2CH2CH2Cl), 2.08, 2.01 and 1.94 (each s, 24 H, OAc×6, NAc×2)
13C-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 170.66×2, 170.40 (-C=O, ester), 169.24 (-C=O, amide), 144.76 (-CH=C- of triazole ring), 123.45(-CH=C- of triazole ring), 101.59 (C-1), 73.16, 71.53, 71.24, 70.55, 70.43, 70.37, 70.11, 69.74, 69.19, 68.59×2, 64.40, 62.07, 53.83, 50.06, 43.41, 39.68, 31.97, 30.93, 29.48, 22.92 (-NHCOCH3), 20.66×3 (-COCH3)
MALDI-TOF-MS calcd for C57H91ClN8O26S [M+Na]+: 1393.54, Found: 1393.55
Anal. Calcd for C57H91ClN8O26S・2H2O: C, 48.63; H, 6.80; N, 7.96, Found: C, 48.61; H, 6.50; N, 7.67.
2−(2−アミノエトキシ)エタノール(11)(10.0g,95.1mmol)を蒸留水(65mL)に溶解させ、さらに水酸化カリウム(5.87g,105mmol)を加えて攪拌し、窒素置換した後0℃に氷冷した。次に1,4−ジオキサン(35mL)に二炭酸ジ−tert−ブチル(22.8g,105mmol)を溶解させた溶液を全て滴下し、0℃で1時間攪拌した後、室温に戻してさらに7時間攪拌した。その後反応液をクロロホルムで2回抽出し、その抽出液を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過、濃縮を行った。最後にシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル 2:5 (v/v),シリカゲル 790mL]で精製することにより、無色透明の液体として目的物(12)(18.1g,92.8%)を得た。
Rf = 0.61 [CHCl3: EtOAc: MeOH = 5:4:1 (v/v/v)]
IR (neat); 3358 (νO-H), 2976-2872 (νC-H), 1694 (νC=O, amide), 1518 (δN-H, amide) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 5.28 (br s, 1 H, NHBoc), 3.78-3.71 (m, 2 H, HOCH2-), 3.68-3.53 (m, 4 H, J = 5.2 Hz, -CH2OCH2-), 3.33 (q, 2 H, -CH2NHBoc), 3.09 (t, 1 H, J = 5.6 Hz, HO), 1.45 (s, 9 H, Boc)
13C-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 156.10 (-C=O, amide), 79.38 (-C(CH3)3), 72.17 (HOCH2CH2O-), 70.27 (-OCH2CH2NHCO-), 61.67 (HOCH2-), 40.34 (-CH2NHCO-), 28.33 (CH3×3 of Boc)
6−アミノヘキサン酸(3.00g,22.9mmol)を1,4−ジオキサン(34mL)と蒸留水(23mL)に溶解させ、0℃に氷冷した。次に1M水酸化ナトリウム水溶液(23mL,23mmol)と、二炭酸ジ−tert−ブチル(5.50g,22.5mmol)―1,4−ジオキサン(12mL)混合溶液を順に滴下し、室温で一晩攪拌した。TLC上で原料が消失したことを確認した後、反応液を酢酸エチルで洗浄し、水層に1M硫酸水溶液を加えて攪拌した。その酸性水溶液をクロロホルムで3回抽出し、無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させた後、セライトろ過と濃縮を行うことにより、白色固体として目的物(14)(5.11g,96.6%)を得た。
Rf = 0.23 [Hexane: EtOAc = 1:1 (v/v)], 0.71 [CHCl3: MeOH: H2O = 65:25:4 (v/v/v)]
IR (neat); 3347 (νCOO-H), 2976 (νC-H), 1692 (νC=O, amide), 1530 (δN-H, amide), 1173 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 4.68 (br s, 1 H, -NHBoc×2), 3.10 (br m, 2 H, -CH2NHBoc), 2.33 (t, 2 H, J = 7.5 Hz, -CH2COOH), 1.63 (quintet, 2 H, J = 7.6 Hz, -CH2CH2COOH), 1.52-1.32 (m, 4 H, --CH2CH2CH2NHBoc), 1.46 (s, 9 H, -NHBoc)
13C-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 178.58 (-COOH), 156.07 (-C=O, amide), 79.13 (C(CH3)3), 40.25 (-CH2NHBoc), 33.85 (HOOCCH2-), 29.51 (CH2CH2NHBoc), 28.23 (CH3×3), 26.08 (CH2CH2CH2NHBoc), 24.24 (HOOCCH2CH2-)
アルコール(12)(19.7g,96.0mmol)と3−クロロ−2−クロロメチル−1−プロペン(7)(3.00g,24.0mmol)をDMF(230mL)に溶解させ、アルゴン雰囲気下かつ室温で50%水素化ナトリウムを少量ずつ加えてはTLC上で反応の進行を確認した。TLC上で目的物のスポットが最も濃くなるまで水素化ナトリウムを加えた後、過剰のメタノールを加えて反応を停止させた。続いて反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した後、氷水、飽和食塩水で順に洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル 1:1→2:3 (v/v),シリカゲル 820,590mL]で2回精製することにより、無色透明液体として目的物(15)(4.41g,40.4%)を得た。
Rf = 0.49 [Hexane: EtOAc = 1:2 (v/v)]
[a]D 34 +0.15 o (C 0.60, CHCl3)
IR (neat); 2978-2897 (νC-H), 1701 (νC=O, amide), 1516 (δN-H, amide), 1172 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 5.01 (s, 2 H, CH2=), 5.07 (br s, 2 H, -NHBoc×2), 4.04 (s, 4 H, =C(CH2O-)2), 3.62-3.53 (m, 12 H, -OCH2CH2OCH2-×2), 3.31 (br s, 4 H, -CH2NHBoc), 1.44 (s, 18 H, -NHBoc×2)
13C-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ: 159.96 (-C=O, amide), 142.33 (CH2=C-), 114.44 (CH2=), 79.15 (C(CH3)3×2), 71.76 , 70.25 and 69.40 (-CH2OCH2CH2OCH2CH2NHBoc×2), 40.35 (-CH2NHBoc×2), 28.41 (CH3×6)
MALDI-TOF-MS calcd for C22H42N2O8 [M+Na]+: 485.28, Found: 485.25
Anal. Calcd for C22H42N2O8・0.5H2O: C, 56.03; H, 9.19; N, 5.94, Found: C, 55.87; H, 9.02; N, 5.84.
ジアミンBoc保護体(15)(100mg,216μmol)を塩化メチレン(1.0mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下トリフルオロ酢酸(240μL,3.24mmol)を滴下した後、室温で2時間攪拌した。TLC上で原料が消失したことを確認した後に反応液を濃縮し、淡黄色透明の液体としてジアミンのトリフルオロ酢酸塩(Rf=0.14[CHCl3:MeOH:H2O=65:25:4(v/v/v)])を得た。
得られたアミン塩をDMF(1.0mL)に溶解させ、アルゴン雰囲気下0℃でN−メチルモルホリン(50μL,0.45mmol)を滴下した。滴下後、室温に戻して1時間攪拌した。続いてカルボン酸(14)(100mg,432μmol)とN,N−ジメチル−4−アミノピリジン:DMAP(63.1mg,518μmol)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩:EDC(124mg,648μmol)を加え、60℃で一晩攪拌した。その後TLC上で反応の進行を確認したところ、原料がわずかに残っていたためEDC(25.2mg,130μmol)とDMAP(11.2mg,86.4mmol)を追加し、反応を完全に進ませた。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣を酢酸エチルで希釈した。希釈液は氷水、飽和食塩水で順に洗浄され、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した後、セライトろ過、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ [クロロホルム―メタノール 25:1 (v/v),シリカゲル 44mL]で精製することにより、無色透明シラップとして目的物(16)(129mg,86.6%)を得た。
Rf = 0.45 [CHCl3: MeOH = 10:1 (v/v)]
[α]D 33 -0.04 o (C 0.34, CHCl3)
IR (neat); 2934 (νC-H), 1701 and 1647 (νC=O, amide), 1506 (δN-H, amide), 1170 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 6.29 (br s, 2 H, -CH2NHCOCH2-×2), 5.21 (s, 2 H, CH2=), 4.75 (br s, 2 H, -NHBoc×2), 4.04 (s, 4 H, =C(CH2O-)2), 3.64-3.57 (m, 8 H, -OCH2CH2O-×2), 3.56 (t, 4 H, J = 5.2 Hz, -CH2CH2NHCOCH2-×2), 3.44 (q, 4 H, J = 5.3 Hz, -CH2CH2NHCOCH2-×2), 3.10 (br q, 4 H, -CH2NHBoc×2), 2.18 (t, 4 H, J = 7.5 Hz, -NHCOCH2-×2), 1.64 (q, 4 H, J = 7.6 Hz, -CH2CH2CH2CH2NHBoc×2), 1.52-1.47 (m, 4 H, -CH2CH2NHBoc×2), 1.44 (s, 18 H, -NHBoc×2), 1.37-1.31 (m, 4 H, -CH2CH2CH2NHBoc×2),
13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 172.99 (-C=O, amide), 156.02 (NHCOC(CH3)3), 142.27 (CH2=C-), 114.65 (CH2=), 78.94 (C(CH3)3×2), 71.68 , 70.16, 69.89, 69.37, 40.36 (-CH2NHBoc×2), 39.10, 36.38, 29.75, 28.41 (CH3×6), 26.38, 25.27
MALDI-TOF-MS calcd for C34H64N4O10 [M+Na]+: 711.45, Found: 711.36
Anal. Calcd for C34H64N4O10・0.3H2O: C, 58.82; H, 9.34; N, 8.07, Found: C, 58.88; H, 9.43; N, 7.91.
ジアミンBoc保護体(16)(2.31g,3.35mmol)を塩化メチレン(16mL)に溶解させ、アルゴン雰囲気下0℃でトリフルオロ酢酸(4.45mL,60.3mmol)を滴下した後、室温で3時間攪拌した。TLC上で原料の消失を確認した後反応液を濃縮し、黄色透明シラップとしてジアミンのトリフルオロ酢酸塩(Rf=0.17 [CHCl3:MeOH:H2O=65:25:4 (v/v/v)])を得た。
得られたアミン塩をDMF(15mL)に溶解させ、アルゴン雰囲気下0℃でN−メチルモルホリン(0.82mL,7.4mmol)を滴下した。滴下後、室温に戻して30分攪拌した。続いてビオチン(1.80g,7.37mmol)とDMAP(0.980 g,8.04mmol)、EDC(2.45g,12.7mmol)を加え、60℃で一晩攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[1回目:クロロホルム―メタノール 5:1(v/v),シリカゲル 240mL;2回目:クロロホルム―メタノール―水 65:15:2 (v/v/v),シリカゲル 300mL]とゲルろ過クロマトグラフィ(Sephadex LH−20,メタノール,ゲル容量 300mL)で精製することにより、白色固体として目的物(17)(2.14g,67.7%)を得た。
Rf = 0.33 [CHCl3: MeOH : H2O = 65:25:4 (v/v/v)]
[α]D 30 +41.6 o (C 0.53, MeOH)
IR (KBr); 3306 and 3092 (νN-H, amide), 2929 and 2859 (νC-H), 1701 and 1643 (νC=O, amide), 1553 (δN-H, amide), 1099 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 5.13 (s, 2 H, CH2=), 4.41 (dd, 2 H, J1exo,2 = 4.9 Hz, J2,3 = 7.8 Hz, H-2 of biotin×2), 4.22 (dd, 2 H, J2,3 = 7.8 Hz, J3,4 = 4.5 Hz, H-3 of biotin×2), 3.97 (s, 4 H, =C(CH2O-)2), 3.55-3.50 (m, 8 H, -OCH2CH2O-×2), 3.46 (t, 4 H, J = 5.5 Hz, -OCH2CH2NHCO-×2), 3.27 (t, 4 H, J = 5.5 Hz, -OCH2CH2NHCO-×2), 3.15-3.11 (m, 2 H, H-4 of biotin), 3.08 (t, 4 H, - CH2CH2CH2NHCO-×2), 2.85 (dd, 2 H, J1exo,2 = 5.0 Hz, J1exo,1endo = 12.8 Hz, H-1exo of biotin×2), 2.63 (d, 2 H, J1exo,1endo = 12.8 Hz, H-1endo of biotin×2),
2.14-2.10 (m, 8 H, -NHCOCH2CH2CH2CH2CH2NHCOCH2-×2),
1.59-1.24 (m, 24 H, -NHCOCH2CH2CH2CH2CH2NHCOCH2CH2CH2CH2-×2)
13C-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 176.15 and 175.93 (-C=O, amide), 166.10 (NHCOC(CH3)3), 144.22 (CH2=C-), 114.99 (CH2=), 72.65, 71.25, 70.68, 70.62, 63.39 (C-3 of biotin), 61.63 (C-2 of biotin), 57.02 (C-4 of biotin), 41.06, 40.35, 40.22, 36.92, 36.83, 30.15, 29.80, 29.51, 27.58, 26.94, 26.66
MALDI-TOF-MS calcd for C44H76N8O10S2 [M+H]+: 941.52, Found: 941.51
Anal. Calcd for C44H76N8O10S2・0.5H2O: C, 55.61; H, 8.17; N, 11.79, Found: C, 55.64; H, 8.13; N, 11.54.
ビスビオチンチオアセチル体(17)(500mg,531μmol)を蒸留水―2−メトキシエタール混合溶媒(1:1(v/v),2.5mL)に溶解させ、さらにアルゴン雰囲気下でチオ酢酸(1.13mL,15.9mmol)と2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(89.7mg,546μmol)を加え、80℃で3時間攪拌した。その後、室温でシクロヘキセンを加えて反応を停止させ、反応液をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール―水 85:16:2 (v/v/v),シリカゲル 70mL]で3回精製した。続いてゲルろ過クロマトグラフィ(Sephadex LH−20,溶媒:メタノール,ゲル体積: 150mL)で精製することにより、白色固体として目的物(18)(160mg,29.6%)を得た。なおこの反応では未反応の原料(17)をほぼ回収することができた(315mg,仕込み量に対して63.0%)。
Rf = 0.38 [CHCl3: MeOH : H2O = 65:15:2 (v/v/v)]
[α]D 30 +39.0 o (C 0.72, MeOH)
IR (KBr); 3296 and 3086 (νN-H, amide), 2926 and 2859 (νC-H), 1697 and 1639 (νC=O, thioester and amide), 1553 (δN-H, amide), 1134 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 4.41 (dd, 2 H, J1exo,2 = 4.5 Hz, J2,3 = 7.8 Hz, H-2 of biotin×2), 4.22 (dd, 2 H, J2,3 = 7.9 Hz, J3,4 = 4.5 Hz, H-3 of biotin×2), 3.54-3.48 (m, 8 H, -OCH2CH2O-×2), 3.46 (t, 4 H, J = 5.6 Hz, -OCH2CH2NHCO-×2), 3.41 (dddd, 4 H, J = 5.8, 9.7 and 25.4 Hz, AcSCH2CH(CH2O-)2), 3.28 (t, 4 H, J = 5.6 Hz, -OCH2CH2NHCO-×2), 3.15-3.11 (m, 2 H, H-4 of biotin), 3.08 (t, 4 H, - CH2CH2CH2NHCO-×2),
2.92 (d, 2 H, J = 6.7 Hz, AcSCH2-), 2.85 (dd, 2 H, J1exo,2 = 5.0 Hz, J1exo,1endo = 12.7 Hz, H-1exo of biotin×2),
2.63 (d, 2 H, J1exo,1endo = 12.8 Hz, H-1endo of biotin×2), 2.25 (s, 3 H, SAc),
2.14-2.10 (m, 8 H, -NHCOCH2CH2CH2CH2CH2NHCOCH2-×2), 1.98 (septet, 1 H, J = 6.1 Hz, AcSCH2CH-),
1.68-1.24 (m, 24 H, -NHCOCH2CH2CH2CH2CH2NHCOCH2CH2CH2CH2-×2)
13C-NMR (MeOD, 200 MHz) δ: 197.33 (-C=O, thioester), 176.03, 175.95, 175.80 and 175.71 (-C=O, amide), 165.84 (-C=O, amide of biotin), 71.47, 71.06, 70.48, 63.21 (C-3 of biotin), 61.45 (C-2 of biotin), 56.90 (C-4 of biotin), 41.05, 40.84, 40.34, 40.23, 36.80, 30.71, 30.62, 30.02, 29.68, 29.37, 28.80, 27.45, 26.82, 26.53
MALDI-TOF-MS calcd for C46H80N8O11S3 [M+H]+: 1017.52, Found: 1017.51
Anal. Calcd for C46H80N8O11S3: C, 54.31; H, 7.93; N, 11.01, Found: C, 54.12; H, 7.95; N, 10.84
化合物(10)と化合物(18)から[GlcNAc(OH)]2−(ビオチン)2コンジュゲートを以下のスキーム5の過程により合成した。
N−アセチルグルコサミン2量体(10)(188mg,137μmol)とビオチン2量体 (18)(139mg,137μmol)をメタノール―DMF混合溶媒(1:1 (v/v),1.0mL)に溶解させ、ナトリウムメトキシド(12.5mg,230μmol)を加えて室温で1時間攪拌した。反応溶液が濁り始めたため、40℃の熱をかけ、さらに11時間攪拌した。TLC上で原料の消失を確認し、強酸性陽イオン交換樹脂IR−120B(H+)を適量加えて中和した。その反応液を綿栓ろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール―水 65:25:4 (v/v/v),シリカゲル 70mL]で精製し、さらに分取型リサイクルHPLC(カラムJAIGEL−W525;溶媒 メタノール)で精製することにより、白色泡状固体として最終目的物(19)(140mg,49.6%)を得た。
Rf = 0.24 [CHCl3: MeOH: H2O = 65:25:4 (v/v/v)]
IR (KBr); 3296 and 3086 (νO-H, νN-H, amide), 2926 and 2859 (νC-H), 1694 and 1647 (νC=O, amide), 1557 (δN-H, amide), 1078 (νC-O-C, ether) cm-1
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 7.95 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 4.52 (t, 4 H, J = 5.1 Hz,-OCH2CH2N(triazole)-×2), 4.50 (s, 4 H, -CH=CN(CH2-)×2), 4.42 (dd, 2 H, J1’exo,2’ = 4.6 Hz, J2’,3’ = 7.5 Hz, H-2’ of biotin×2), 4.40 (d, 2 H, J1,2 = 8.5 Hz, H-1), 4.23 (dd, 2 H, J2’,3’ = 7.9 Hz, J3’,4’ = 4.5 Hz, H-3’ of biotin×2), 3.87-3.79 (m, 4 H, H-6a, 6b), 3.83 (t, 4 H, J = 5.1 Hz, OCH2CH2N(triazole)-×2), 3.63-3.17 (m, 48 H, H-2×2, H-5×2, -OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-×2, -SCH2CH(CH2OCH2C(N-)=)2, -SCH2CH(CH2OCH2CH2OCH2-)2×2), 3.36 (dd, 2 H, J2,3 = 10.3 Hz, J3,4 = 8.5 Hz, H-3), 3.28 (t, 4 H, J = 5.6 Hz, -OCH2CH2NHCO-×2), 3.15-3.11 (m, 2 H, H-4’ of biotin), 3.09 (t, 4 H, J = 7.1 Hz, - CH2CH2CH2NHCO-×2),
2.85 (dd, 2 H, J1’exo,2 = 5.0 Hz, J1’exo,1’endo = 12.7 Hz, H-1’exo of biotin×2),
2.63 (d, 2 H, J1’exo,1’endo = 12.7 Hz, H-1’endo of biotin×2), 2.54-2.49 (m, 8 H, -CH2SCH2CH2CH2SCH2-), 2.13 (q, 8 H, J = 7.2 Hz, -NHCOCH2CH2CH2CH2CH2NHCOCH2-×2), 2.00-1.95 (m, 2 H, -CHCH2SCH2CH2CH2SCH2CH-), 1.90 (s, 6 H, NHAc×2), 1.74 (quintet, 2 H, J = 7.1 Hz, -SCH2CH2CH2S-), 1.68-1.24 (m, 24 H, -NHCOCH2CH2CH2CH2CH2NHCOCH2CH2CH2CH2-×2)
13C-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 176.13, 175.91 and 173.73(-C=O, amide), 166.07 (-C=O, amide of biotin), 145.85 (-CH=C- of triazole ring), 125.88 (-CH=C- of triazole ring), 102.81 (C-1), 78.04, 76.31, 72.16, 71.74. 71.66, 71.62, 71.58, 71.50, 71.44, 71.25, 70.84, 70.63, 70.38, 69.88, 65.03, 63.38, 62.84, 61.62, 57.37, 57.02, 51.43, 41.25, 41.20, 41.08, 40.37, 40.23, 36.94, 36.84, 32.28, 32.23, 31.82, 30.47, 30.16, 29.80, 29.51, 27.59, 26.94, 26.66, 23.15.
MALDI-TOF-MS calcd for C89H156N16O30S4 [M+Na]+: 2080.00, Found: 2080.00
次に、式(I)の化合物を合成するために使用可能な式(V)(k=1、l=1、m=1)の化合物として、GlcNAcテトラマーの合成例を以下に示す。
GlcNAcテトラマーは以下のスキーム6の過程により合成した。
N−アセチルグルコサミンアセテート2量体(9)(509mg,404μmol)を1,4−ジオキサン(3.0mL)に溶解させ、さらにアルゴン雰囲気下でチオ酢酸(431μL,6.06mmol)と2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(33.4mg,203μmol)を加え、80℃で1時間攪拌した。TLC上で反応の進行を確認したところ、原料が残っていたため2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(33.0mg,201μmol)を追加し、さらに2時間攪拌した。反応終了後、室温でシクロヘキセンを加えて反応を停止させ、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール15:1 (v/v), シリカゲル 67mL]で精製することにより、白色泡状固体として目的物(20)(460mg,85.2%)を得た。
Rf = 0.48 [CHCl3: MeOH = 10:1 (v/v)]
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.73 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 6.64 (d, 2 H, JNH,2 = 9.1 Hz, NHAc×2), 5.15 (t, 2 H, J = 9.8 Hz, H-3×2), 5.07 (t, 2 H, J = 9.6 Hz, H-4×2), 4.79 (d, 2 H, J1,2 = 8.6 Hz, H-1×2), 4.59 (s, 4 H, AcSH2CH(CH2OCH2-)2), 4.56 (t, 4 H, J = 5.1 Hz,-OCH2CH2N-×2), 4.25 (dd, 2 H, J5,6a = 12.3 Hz, J6a,6b = 4.7 Hz, H-6a×2), 4.12 (dd, 2 H, J5,6b = 2.1 Hz, J6a,6b = 12.2 Hz, H-6b×2), 4.05 (q, 2 H, J = 9.3 Hz, H-2×2), 3.90 (t, 4 H, J = 5.3 Hz,-OCH2CH2N-×2), 3.90-3.49 (m, 30 H, -OCH2-×12, -CH2CH(CH2O-)2 and H-5×2), 2.93 (d, 2 H, J = 6.7 Hz, -CH2SAc), 2.33 (s, 3 H, -SAc), 2.14-2.05 (m, 1 H, -CHCH2SAc), 2.08, 2.01×2 and 1.94 (each s, 24 H, OAc×6 and NAc×2)
13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 170.73×2 and 170.42 (-C=O, ester), 169.28 (-C=O, amide), 144.90 (-CH=C- of triazole ring), 123.56 (-CH=C- of triazole ring), 101.66 (C-1), 73.24, 71.66, 71.29, 70.65, 70.46, 70.22, 69.76, 69.28, 68.67, 64.53, 62.16, 53.9, 50.13, 39.68, 30.57, 27.91, 22.99 (-NHCOCH3), 20.73, 20.68, 20.59 (-COCH3)
MALDI-TOF-MS calcd for C56H88N8O27S [M+Na]+: 1359.54, Found: 1359.60
ビス[N−アセチルグルコサミンアセテート]チオアセチル体(20)(428mg,320 μmol)と3−クロロ−2−クロロメチル−1−プロペン(7)(17.0μL,160μmol)をメタノール―DMF混合溶媒(1:1(v/v),2.2mL)に溶解させ、アルゴン置換した後に氷冷した。続いて、ナトリウムメトキシド(14.5mg,268μmol)を加えて室温で一晩攪拌した。その後TLC上で反応の進行を確認したところ、原料が残っていたためナトリウムメトキシド(25.2mg,466μmol)を加え、反応を完全に進行させた。反応終了後、酢酸(42.3μL,739μmol)を加えて中和し、濃縮を行った。
得られた残渣をピリジン(3.0mL)に溶解させ、無水酢酸(3.0mL)を加えて室温で一晩攪拌した。TLC上で反応終了を確認後、反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を1 M硫酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順に洗浄し、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。続いてセライトろ過、濃縮を行い、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール15:1(v/v),シリカゲル 50mL]で精製することにより、白色泡状固体として目的物(21)(297mg,70.2%)を得た。
Rf = 0.43 [CHCl3: MeOH = 10:1 (v/v)]
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.72 (s, 4 H, H of triazole ring×4), 6.70 (d, 4 H, JNH,2 = 8.6 Hz, NHAc×4), 5.64 (t, 4 H, J = 9.8 Hz, H-3×4), 5.06 (t, 4 H, J = 9.6 Hz, H-4×4), 4.93 (s, 2 H, CH2=), 4.80 (d, 4 H, J1,2 = 8.6 Hz, H-1×4), 4.58 (s, 8 H, -CH=C(triazole)-CH2O-×4), 4.56 (br s, 8 H, -OCH2CH2N-×4), 4.25 (dd, 4 H, J5,6a = 12.3 Hz, J6a,6b = 3.5 Hz, H-6a×4), 4.12 (br d, 4 H, J6a,6b = 12.2 Hz, H-6b×4), 4.05 (q, 4 H, J = 9.0 Hz, H-2×4), 3.91-3.56 (m, 68 H, -OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2N-×4, H-5×4, -SCH2CH(CH2O-)2×2), 3.21 (s, 4 H, CH2=C(CH2S-)2), 2.46 (d, 4 H, J = 6.0 Hz, -CHCH2S-×2), 2.21-1.90 (m, 2 H, -SCH2CH(CH2-)2×2), 2.08, 2.01 and 1.93 (each s, 48 H, OAc×12, NAc×4)
13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 170.67×2, 170.41 (-C=O, ester), 169.25 (-C=O, amide), 144.79 (-CH=C- of triazole ring), 140.51 (CH2=), 123.54 (-CH=C- of triazole ring), 115.74 (CH2=C-), 101.58 (C-1), 73.17, 71.58, 71.20, 70.59, 70.46, 70.41, 70.16, 69.80, 69.24, 68.63, 64.42, 62.12, 53.91, 50.08, 39.32, 35.74, 29.97, 22.95 (-NHCOCH3), 20.68, 20.64 and 20.55 (-COCH3)
MALDI-TOF-MS calcd for C112H176N16O52S2 [M+Na]+: 2664.10, Found: 2663.83
化合物(21)は、例えば、スキーム4に示す方法などにより、Zに相当する部分をアセチル基等にし、本発明の式(V)の化合物の1つとして使用することができる。
本発明の実施例で合成した化合物(19)は、リガンドとして1分子あたり2個のGlcNAcを有している。従って、GlcNAcを1個のみしか有していない分子と比較すると、GlcNAcと結合パートナー分子との結合親和性が上昇していることが予想される。この点について、以下に検討を行った。結合パートナー分子として、WGAレクチンを使用した。また、GlcNAc1個のみを有する対照分子として以下の化合物Aを使用した。
WGAレクチンと糖(化合物(19)のGlcNacなど)が結合すると蛍光強度の変化が生じる。この蛍光スペクトルの変化から、WGAレクチンとリガンド(化合物(19)又は対照化合物A)との結合親和性を測定することができる。
WGAレクチン溶液(0.65μM、pH7.2、5.0±0.1℃)に化合物(19)(657μM、0.15MNaCl含有50mMTris−HClバッファー)又は化合物A(35.3mM、0.15MNaCl含有50mMTris−HClバッファー)を5μLずつ加えた時の蛍光スペクトル(Ex.295nm)変化から、348nmにおける蛍光強度変化を測定し、結合親和性(Ka)を測定した。
その結果、本発明の化合物(19)の結合親和性は、Ka=5.7×105M−1であったのに対し、化合物Aは、Ka=8.2×103M−1と2桁程度低かった。従って、本発明のリガンド固定化分子は、リガンド数を自在に増加させることが可能であり、所望の結合親和性を有するリガンド固定化分子の調製が可能な優れた分子である。
Claims (7)
- 以下の式(I)で示されるリガンド固定化分子。
(式(I)中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1〜10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Wは以下の式(II)、
(式(II)中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である)を表す) - 前記kが1、lが2、mが0である請求項1に記載のリガンド固定化分子。
- 請求項1に記載のリガンド固定化分子の製造に使用される式(V)で表される化合物。
(式(II)中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Aは硫黄又は酸素を表し、R1は炭素数1〜10の飽和炭化水素鎖を表し、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である)を表す。Zは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す)。 - 請求項3に記載の化合物のいずれか1つと請求項4に記載の化合物のいずれか1つを用いて請求項1に記載のリガンド固定化分子を製造する方法。
- 請求項3に記載の化合物及び請求項4に記載の化合物を含んでなる請求項1に記載のリガンド固定化分子製造キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011028447A JP5717281B2 (ja) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011028447A JP5717281B2 (ja) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012167987A true JP2012167987A (ja) | 2012-09-06 |
JP5717281B2 JP5717281B2 (ja) | 2015-05-13 |
Family
ID=46972305
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011028447A Active JP5717281B2 (ja) | 2011-02-14 | 2011-02-14 | ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5717281B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018097239A1 (ja) * | 2016-11-25 | 2018-05-31 | サヴィッド・セラピューティックス株式会社 | クリアリングエージェント |
EP3584576A4 (en) * | 2017-02-17 | 2021-03-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | METHOD FOR IDENTIFYING A POTENTIAL DRUG TARGET PROTEIN FOR DEVELOPING AN ANTIBODY DRUG AND METHOD FOR MANUFACTURING ANTIBODY AGAINST A TARGET PROTEIN |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002516252A (ja) * | 1998-05-20 | 2002-06-04 | デイド・ベーリング・インコーポレイテッド | 特異的結合アッセイのためのビス−ビオチン化合物 |
JP2004157108A (ja) * | 2002-09-09 | 2004-06-03 | Japan Science & Technology Agency | リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法 |
-
2011
- 2011-02-14 JP JP2011028447A patent/JP5717281B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002516252A (ja) * | 1998-05-20 | 2002-06-04 | デイド・ベーリング・インコーポレイテッド | 特異的結合アッセイのためのビス−ビオチン化合物 |
JP2004157108A (ja) * | 2002-09-09 | 2004-06-03 | Japan Science & Technology Agency | リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018097239A1 (ja) * | 2016-11-25 | 2018-05-31 | サヴィッド・セラピューティックス株式会社 | クリアリングエージェント |
CN109983024A (zh) * | 2016-11-25 | 2019-07-05 | 赛威德医疗公司 | 清除剂 |
JPWO2018097239A1 (ja) * | 2016-11-25 | 2019-10-17 | サヴィッド・セラピューティックス株式会社 | クリアリングエージェント |
JP7045069B2 (ja) | 2016-11-25 | 2022-03-31 | サヴィッド・セラピューティックス株式会社 | クリアリングエージェント |
US11866457B2 (en) | 2016-11-25 | 2024-01-09 | Savid Therapeutics Inc. | Clearing agent |
EP3584576A4 (en) * | 2017-02-17 | 2021-03-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | METHOD FOR IDENTIFYING A POTENTIAL DRUG TARGET PROTEIN FOR DEVELOPING AN ANTIBODY DRUG AND METHOD FOR MANUFACTURING ANTIBODY AGAINST A TARGET PROTEIN |
US11442066B2 (en) | 2017-02-17 | 2022-09-13 | Mitsui Chemicals, Inc | Method for identifying drug-discovery target protein for development of antibody drug, and method for producing antibody against target protein |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5717281B2 (ja) | 2015-05-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7071430B2 (ja) | 糖質コンジュゲートrna剤およびその調製方法 | |
US11168085B2 (en) | Process for the cycloaddition of a hetero(aryl) 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne | |
JP4955659B2 (ja) | 糖及びその類似体を骨格とする分子輸送体並びにその製造方法 | |
CA3020585A1 (en) | Targeted nucleic acid conjugate compositions | |
CA2551495A1 (en) | Conjugated small molecules | |
JP5885378B2 (ja) | グリコペプチドの調製法 | |
WO2012069188A1 (en) | Continuous flow processes for photoconjugation of high-molecular chemical entities | |
JP5717281B2 (ja) | ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子 | |
JP4628960B2 (ja) | リンカー化合物及びリガンド複合体、並びにそれらの製造方法 | |
US9441002B2 (en) | Dithiolane based thiol modifier for labeling and stronger immobilization of bio-molecules on solid surfaces | |
CN114075255B (zh) | 一种糖基供体及其在制备糖苷中的用途 | |
Simon et al. | Synthesis and characterization of photoaffinity labelling reagents towards the Hsp90 C-terminal domain | |
Lelle et al. | An amino acid-based heterofunctional cross-linking reagent | |
EP4003367A1 (en) | Use of e-selectin antagonists to enhance the survival of reconstituted, bone marrow-depleted hosts | |
US8569515B2 (en) | Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers | |
KR20200057192A (ko) | 나이트로기 환원 효소 검출용 근적외선 조성물 및 제조방법 | |
KR102042741B1 (ko) | 영상화용 링커 화합물 | |
KR101946488B1 (ko) | 링커 화합물 및 이의 제조방법 | |
WO2021081881A1 (zh) | 一种基于tdg分子骨架的功能糖类分子及其制备方法 | |
KR100877644B1 (ko) | 링커 화합물 및 리간드 복합체, 및 그것들의 제조 방법 | |
KR101763320B1 (ko) | 링커 화합물 및 이의 제조방법 | |
Sheikh et al. | First synthesis of non-symmetrical “phthalimidoyl active ester” bi-dentate cross-linking reagents having an acid chloride, 2-benzothiazole, or 1-benzotriazol group | |
Seeberger et al. | Continuous flow processes for photoconjugation of high-molecular chemical entities | |
CN116761819A (zh) | 化合物或其盐、以及由它们得到的抗体 | |
Rauthu | Design of selective ligands for conjugate drug targeting to human serum albumin (HSA) through cysteine-34 and β-D-galactopyranoside inhibitors towards galectins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140122 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140807 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140819 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141014 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150311 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150316 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5717281 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |