KR101946488B1

KR101946488B1 - 링커 화합물 및 이의 제조방법

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Publication number: KR101946488B1
Application number: KR1020170118072A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 최재호; 김진호; 이재성; 시호영
Original assignee: (주)바이오액츠
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2019-02-11

Abstract

본 발명은 다용도 링커 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저분자 화합물, 고분자 화합물, 고분자 나노입자, 자성 나노입자 또는 양자점 등의 기질 표면에 표지될 수 있는 링커 화합물, 이의 제조방법 및 이의 응용에 관한 것이다. 본 발명은 다용도로 사용될 수 있는 신규한 링커를 제공한다. 본 발명에 따른 링커는 저분자, 고분자, 고분자 나노입자, 양자점 또는 자성 나노입자 등의 기질과 결합하여 표면을 개질하거나 자성 나노입자의 산화를 방지할 수 있으며, 표적물질과의 반응성을 향상시킬 수 있다.

Description

링커 화합물 및 이의 제조방법{Linker compound and preparation method thereof}

본 발명은 다용도 링커 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저분자 화합물, 고분자 화합물, 고분자 나노입자, 자성 나노입자 또는 양자점 등의 기질 표면에 표지될 수 있는 링커 화합물, 이의 제조방법 및 이의 응용에 관한 것이다.

의약용도로 사용되는 많은 저분자량의 화합물들이 상당한 독성을 가지고 있음이 잘 알려져 있으며, 수년 동안 상기 저분자량의 화합물들의 세포독성을 감소시키고 의약적 효능을 향상시키기 위한 다양한 시도가 있었다.

저분자량 약물의 독성을 감소시키고 효능을 향상시키기 위한 한가지 시도는 표적화제-유도 약물 전달 시스템으로 유도하는 것이다. 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 표적화부분과 생물학적 활성부부분을 포함하는 링커의 개발에 대한 연구가 다각도에서 이루어지고 있다.

한편, 단백질 간의 상호작용 및 유전자 정보에 관한 연구를 통하여 질병을 진단 및 치료에 적용하는 연구가 활발했는데, 이러한 연구에 핵심이 되는 것 중의 하나가 단백질을 특정한 곳에 고정화시키는 기술이다.

종래의 단백질 고정화 방법으로 한국 등록특허 제10-0448880호에는 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성화기를 직접시켜 단백질을 고정하는 방법에 관한 특징이 개시되어 있으며, 한국 등록특허 제10-0577694호에는 고체기판 표면에 졸-겔 법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에 상기 다공성 박막에 물리적 흡착으로 단백질을 고정하는 방법에 관한 특징이 개시되어 있고, 한국 공개특허 제10-2003-034136호에는 양이온성 아미노 잔기가 2 개의 효소에 2 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시키는 고정화 효소를 이용하여 단백질을 고정하는 방법에 관한 특징이 개시되어 있다.

그러나 이러한 종래의 방법은 화학적 공정에 의한 단백질의 변성, 물리적 흡착에만 의존하는 단백질 고정방법으로 단백질의 고정화 능력의 저하가 있고, 표면 개질 비용이 높으며, 대량생산이 어렵고, 제조과정이 어렵다는 단점이 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하고, 다용도로 이용될 수 있는 새로운 링커의 개발이 시급히 요구되고 있다.

1. 한국 등록특허 제10-0448880호 2. 한국 등록특허 제10-0577694호 3. 한국 공개특허 제10-2003-034136호

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 다용도로 사용될 수 있는 링커 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 링커 화합물의 응용에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 기질의 표면 특성을 조절할 수 있으면서, 표적 물질을 기질 표면에 안정되게 고정화시킬 수 있는 링커 화합물을 개발하고자 노력한 끝에 기질에 표지되는 말단, 표면 특성을 조절하기 위한 스페이서 및 표적 물질과 상호작용할 수 있는 작용기를 포함하는 말단으로 구성된 링커 화합물을 개발하였으며, 이 링커 구조가 각종 기질에 화학적으로 결합하여 기질 표면의 우수한 개질 효과를 나타내면서, 표적 물질, 구체적으로 단백질에 대하여 우수한 고정화 능력을 발휘하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 링커 화합물을 제공한다.

본 발명은 다용도로 사용될 수 있는 신규한 링커를 제공한다. 본 발명에 따른 링커는 저분자, 고분자, 고분자 나노입자, 양자점 또는 자성 나노입자 등의 기질과 결합하여 표면을 개질하거나 자성 나노입자의 산화를 방지할 수 있으며, 표적물질과의 반응성을 향상시킬 수 있다.

도 1a 내지 1c는 제조예 1에서 제조한 자성 나노입자의 형태를 보여준다.
도 2a는 링커를 활용한 자성 나노입자 표면 개질에 관한 본 발명을 도식적으로 보여준다.
도 2b는 표면 개질된 자성 나노입자의 Amine기를 갖는 형광체 도입한 후의 사진을 보여준다.
도 3a는 자성 나노입자 항체 부착율 확인 Protocol을 보여준다.
도 3b는 자성 나노입자 항체 부착율 확인 Protocol을 보여준다.
도 4a 내지 4d는 자성 나노입자 부착 전 후 항체 및 항원 농도 변화를 보여준다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1a로 표시되는 링커 화합물에 관한 것이다.

[화학식 1a]

상기 R은 숙신이미딜옥실(succinimidyloxyl) 또는 에텐설포닐C_1-6알킬아미닐이고, 상기 n은 1 내지 100의 정수이다.

본 발명에 따른 링커는 (i) 기질 표면에 화학적으로 결합하는 부분; (ii) 기질의 표면 특성을 조절하는 스페이서(spacer) 부분; 및 (iii) 생분자와 결합하는 부분으로, 크게 3개의 부분으로 구성되어 있다.

기질 표면에 화학적으로 결합하기 위하여, 본 발명에 따른 링커는 일 말단에 기질 표면과 화학적으로 결합하기 위하여, 숙신이미딜옥실 또는 에텐설포닐C_1-6알킬아미닐기를 포함한다. 스페이서는 기질 표면의 물리화학적 특성을 조절할 뿐만 아니라 기질의 표면적을 증가시켜 표적 물질과의 결합력을 향상시키는 역할을 한다. 본 발명에 따른 상기 스페이서에서 n은 1 내지 100의 정수 중에서 선택될 수 있다. 표적 물질과 결합하기 위하여, 본 발명에 따른 링커는 타 말단에 카르복시기를 포함한다.

본 발명에 따르면 상기 표적물질은 단백질 또는 핵산분자와 같은 생체 분자일 수 있다. 상기 단백질은 구체적으로 항원, 항체 및 효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 링커 화합물은 하기 화학식 1b의 구조를 갖는다.

[화학식 1b]

다른 구현예에 있어서, 상기 링커 화합물은 하기 화학식 1 또는 화학식 3의 구조를 갖는다.

다른 구현예에 있어서, 상기 링커 화합물은 하기 화학식 4 내지 화학식 21 중 어느 하나의 구조를 갖는다.

본 발명의 다른 측면은 (1) 기질, 및 (2) 상기 기질의 표면에 결합되어 있는 본 발명의 여러 구현예에 따른 링커 화합물을 포함하는 표면 개질된 기질에 관한 것이다.

일 구현예에 있어서, 상기 기질은 저분자 화합물, 고분자 화합물, 고분자 나노입자, 양자점 및 자성 나노입자 중에서 선택되는 어느 하나이다.

다른 구현예에 있어서, 상기 기질 1 당량을 기준으로 상기 링커 화합물 1 내지 10 당량이 상기 기질의 표면에 결합된다.

본 발명의 또 다른 측면은 (1) 표적 물질, 및 (2) 상기 표적 물질에 결합되어 있는 본 발명의 여러 구현예에 따른 링커 화합물을 포함하는 표면 개질된 표적 물질에 관한 것이다.

일 구현예에 있어서, 상기 표적 물질은 생체 분자이다.

다른 구현예에 있어서, 상기 표적 물질은 항원, 항체, 효소, 핵산 분자 중에서 선택된다.

본 발명이 또 다른 측면은 (1) 본 발명의 여러 구현예에 따른 링커 화합물, (2) 상기 링커 화합물 일단에 결합되어 있는 기질, 및 (3) 상기 링커 화합물의 타단에 결합되어 있는 표적 물질을 포함하는 영상화용 복합체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 영상화용 복합체를 포함하는 영상화용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 표면 개질된 기질을 포함하는 바이오 칩에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 표면 개질된 기질을 포함하는 약물 전달용 지지체에 관한 것이다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예

합성예 1-1: 화합물 1-1의 제조

아르곤 기류 하에서 1,10-데칸디올(1,10-decanediol) (10.0g, 57.37mmol, 1eq)를 무수 MC 25mL 용해한 후 트리에틸아민(Triethylamine) (40.0mL, 17.21mmol)을 첨가하여 0℃로 낮추었다. 상기 반응 혼합액에 메탄설포닐클로라이드(methanesulfonylchloride) (4.7mL, 4.07mmol)를 천천히 주입하고 0℃에서 1시간 동안 교반 후 상온으로 승온시켜 18시간 동안 추가 교반하였다. 반응 종결 후 얼음물로 세척한 뒤, 정제수와 디클로로메탄 첨가하여 잠시 교반한 뒤 유기층과 물층으로 분리하고, 유기층을 모아 10% 소듐클로라이드 수용액으로 세척하였다. 마그네슘설페이트로 유기층에 잔류하는 물을 제거한 뒤 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법(용리액: 80% EtOAc-Hexanes)으로 정제하여 노란색 고체의 화합물 1-1을 얻었다(g, 31.6%).

합성예 1-2: 화합물 1-2의 제조

디메틸포름아미드(Dimethylformamide, DMF) 60mL에 화합물 1-1(4.00g, 12.10mmol), 벤질-4-히드록시벤조에이트(benzyl 4-hydroxybenzoate) (1.85g, 8.06mmol) 및 포타슘카보네이트(potassium carbonate) (1.35g, 9.68mmol)을 용해시킨 뒤, 아르곤 기류하의 50℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종결 후 상온으로 냉각 한 뒤, 에틸아세테이트와 정제수를 첨가하여 잠시 교반한 뒤, 유기층과 물층으로 분리하였으며, 유기층을 정제수로 세척하였다. 마그네슘설페이트로 유기층에 잔류하는 물을 제거한 뒤 농축하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(용리액: 30% EtOAc-Hexane)으로 정제하여 흰색 고체의 화합물 1-2를 얻었다(2.3g, 41%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 8.00 (d,J=7.2Hz, 2H), 7.25-7.44 (m, 5H), 6.90 (d,J=7.2Hz, 2H), 5.33 (s, 2H), 4.20-4.22 (m, 2H), 3.98-3.01 (m, 2H), 3.12 (m, 3H), 1.71-1.81 (m, 4H), 1.31-1.46 (m, 12H).

합성예 1-3: 화합물 1-3의 제조

DMF 72mL에 화합물 1-2 (3.6g, 7.78mmol), 메틸-4-히드록시벤조에이트(methyl-4-hydroxybenzoate) (1.80g, 11.67mmol) 및 포타슘카보네이트 (1.60g, 11.67mmol)을 용해시킨 뒤, 아르곤 기류 하의 50℃에서 18시간 교반하였다. 반응 종결 후 상온으로 냉각한 뒤, 에틸아세테이트와 정제수를 첨가하여 교반한 뒤, 유기층과 물층으로 분리하였으며, 유기층을 정제수로 세척하였다. 마그네슘설페이트로 유기층에 잔류하는 물을 제거한 뒤 농축하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피법 (용리액: 30% EtOAc-Hexane)으로 정제하여 흰색 고체의 화합물 1-3을 제조하였다(3.1g, 77.6%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 7.96-8.02 (m, 4H), 7.32-7.44 (m, 5H), 6.87-6.90 (m, 4H), 5.33 (s, 2H), 3.97-4.00 (m, 4H), 3.87 (s, 3H), 1.75-1.81 (m, 4H), 1.31-1.46 (m, 12H).

합성예 1-4: 화합물 1-4의 제조

THF 50mL에 화합물 2-3 및 Pd/C (10 wt%, 75mg)을 첨가한 뒤, 수소 기류하에서 4시간 교반하였다. 반응 종결 후 Celite 여과를 실시하고, 수집된 여과액은 농축하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(용리액: 5% MeOH-CH2Cl2)으로 정제하여 흰색 고체의 화합물 1-4를 제조하였다(278mg, 67%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.03-8.06 (m, 2H), 7.96-7.98 (m, 2H), 6.89-6.93 (m, 4H), 3.99-4.03 (m, 4H), 3.99 (s, 3H), 1.78-1.82 (m, 4H), 1.25-1.34 (m, 12H).

합성예 2-1: 화합물 2-1의 제조

헥사에틸렌 글리콜 대신에 테트라에틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는 합성예 1-1과 동일한 방법으로 노란색 오일의 목적하는 화합물 2-1을 얻었다(700mg, 78%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 4.30-4.34 (m, 4H), 3.69-3.74 (m, 4H), 3.57-3.64 (m, 8H), 3.02 (s, 6H).

합성예 2-2: 화합물 2-2의 제조

화합물 1-1 대신에 화합물 2-1을 사용한 것을 제외하고는 합성예 1-2와 동일한 방법으로 투명한 오일의 목적하는 화합물 2-2를 얻었다(2.750mg, 52%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.00 (d,J=9.0Hz, 2H), 7.29-7.43 (m, 5H), 6.90 (d, J=9.0Hz, 2H), 5.31 (s, 2H), 4.32-4.35 (m, 2H), 4.15-4.17 (m, 2H), 3.83-3.85 (m, 2H), 3.63-3.74 (m, 10H), 3.03 (s, 6H).

합성예 2-3: 화합물 2-3의 제조

화합물 1-2 대신에 화합물 2-2를 사용한 것을 제외하고는 합성예 1-3과 동일한 방법으로 투명한 오일의 목적하는 화합물 2-3을 얻었다(2.620mg, 83%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 7.93-8.00 (m, 2H), 7.29-7.43 (m, 5H), 6.88-6.90 (m, 4H), 5.31 (s, 2H), 4.12-4.15 (m, 4H), 3.82-3.84 (m, 3H), 3.85 (s, 4H), 3.65-3.70 (m, 8H).

합성예 2-4: 화합물 2-4의 제조

화합물 1-3 대신에 화합물 2-3을 사용한 것을 제외하고는 합성예 1-4와 동일한 방법으로 흰색 고체의 목적하는 화합물 2-4을 얻었다(482mg, 84%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.00 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.95 (d, J=9.2Hz, 2H), 6.94-6.87 (m, 4H), 4.13-4.18 (m, 4H), 3.84-3.88 (m, 7H), 3.60-3.73 (m, 8H).

합성예 3-1: 화합물 3-1의 제조

헥사에틸렌 글리콜 대신에 폴리에틸렌 글리콜(average Mn 1,000)을 사용한 것과 정제과정이 없는 것을 제외하고는 합성예 1-1과 동일한 방법으로 투명한 오일의 목적하는 화합물 3-1을 얻었다(2g).

합성예 3-2: 화합물 3-2의 제조

화합물 3-1(2g, 2mmol)를 DMF 20mL에 용해시킨 뒤, 3-히드록시프로피오닉애시드(3-hydroxypropionic acid) 334μL (4mmol)과 포타슘카보네이트(potassium carbonate) (691mg, 5mmol) (2.750mg, 52%)를 넣고 아르곤 기류하의 50℃에서 18시간 교반하였다(1.3g).

합성예 4-1: 화합물 4-1의 제조

폴리에틸렌 글리콜(average Mn 1,000) 대신에 폴리에틸렌 글리콜(average Mn 4,000)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 3-1과 동일한 방법으로 투명한 오일의 목적하는 화합물 4-1을 얻었다(2.5g).

합성예 4-2: 화합물 4-2의 제조

화합물 3-1 대신에 화합물 4-1을 사용한 것을 제외하고는 합성예 3-2와 동일한 방법으로 투명한 오일의 목적하는 화합물 4-2를 얻었다(2.2g).

합성예 5: 화합물 5의 제조

디에틸렌 글리콜(diethylene glycol) (0.28mL, 3.00mmol)를 피리딘(pyridine) 10mL에 용해시킨 후 석신산 무수물(succinic anhydride) (721mg, 7.20mmol)을 첨가하여 상온에서 72시간동안 교반한 뒤 농축하였다. 반응물을 소금물(100mL)에 용해시킨 후 2N 수산화나트륨 수용액을 첨가하였다. 상기 반응액을 에틸아세테이트(ethyl acetate, EA)로 3회 추출한 뒤 물층을 6N 염산용액을 사용하여 pH2 까지 산성화 시켰다. 반응액을 에틸아세테이트로 3회 추출한 뒤 마그네슘설페이트로 유기층에 잔류하는 물을 제거한 뒤 농축하여 흰색의 화합물 5를 얻었다(1450mg, 80.2%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.21-4.23 (m, 4H), 3.68-3.71 (m, 4H), 2.59-2.63 (m, 8H).

합성예 6: 화합물 6의 제조

디에틸렌 글리콜 대신에 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 5와 동일한 방법을 수행하여 흰색의 화합물 6을 제조하였다(1600mg, 82.3%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.09-4.11 (m, 4H), 3.57-3.59 (m, 4H), 3.52 (s, 4H), 2.50-2.52 (m, 4H), 2.45-2.49 (m, 4H).

합성예 7: 화합물 7의 제조

트리에틸렌 글리콜 대신에 테트라에틸렌 글리콜(tetraethylene glycol)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 5와 동일한 방법으로 흰색의 목적하는 화합물 7을 얻었다(950mg, 78%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.11-4.13 (m, 4H), 3.58-3.61 (m, 4H), 3.53 (s, 8H), 2.47-2.52 (m, 8H).

합성예 8: 화합물 8의 제조

테트라에틸렌 글리콜 대신에 펜타에틸렌 글리콜(pentaethylene glycol)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 5와 동일한 방법으로 흰색의 목적하는 화합물 8을 얻었다(1000mg, 77.6%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.21-4.23 (m, 4H), 3.68-3.70 (m, 4H), 3.64 (s, 12H), 2.58-2.62 (m, 8H).

합성예 9: 화합물 9의 제조

펜타에틸렌 글리콜 대신에 헥사에틸렌글리콜(hexaethylene glycol)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 5와 동일한 방법으로 흰색의 목적하는 화합물 9를 얻었다(800mg, 79.7%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.21-4.23 (m, 4H), 3.68-3.70 (m, 4H), 3.64 (s, 16H), 2.58-2.62 (m, 8H).

합성예 10: 화합물 10의 제조

헥사에틸렌 글리콜 대신에 헵타에틸렌 글리콜(heptaethylene glycol)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 5와 동일한 방법으로 흰색의 목적하는 화합물 10을 얻었다(500mg, 75%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.21-4.23 (m, 4H), 3.68-3.70 (m, 4H), 3.63 (s, 20H), 2.58-2.64 (m, 8H).

합성예 11: 화합물 11의 제조

헵타에틸렌 글리콜 대신에 옥타에틸렌 글리콜(octaethylene glycol)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 5와 동일한 방법으로 흰색의 목적하는 화합물 11을 얻었다(600mg, 75.4%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO):δ 4.21-4.23 (m, 4H), 3.68-3.70 (m, 4H), 3.63 (s, 24H), 2.59-2.61 (m, 8H).

비교예 1: 화학식 5의 화합물 제조

한국 등록특허 제10-1763320호의 합성법을 참조하여 제조하였다.

비교예 2: 화학식 6의 화합물 제조

비교예 3: 화학식 7의 화합물 제조

실시예 1: 화학식 8의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5을 디메틸포름아미드(Dimethylformamide, DMF) 6.5mL, 피리딘 6.5mL에 용해시킨 다음, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄테트라플루오르보레이트(N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uroniumtetrafluorborate, TSTU) (1324mg, 4.398mmol)을 디메틸포름아미드 1mL에 녹여 첨가한 뒤, 아르곤 기류하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후, 동결건조하여 피리딘을 제거한 뒤 역상컬럼크로마토그래피법(용리액: 20% MeCN-H₂O)으로 정제하여 분홍색 오일의 화학식8의 화합물을 얻었다(1230mg, 69.3%).

LC/MS, 계산치 C₁₆H₂₁NO₁₁ 403.1, 측정치 402.1

실시예 2: 화학식 9의 화합물 제조

디메틸포름아미드 5mL에 실시예 1의 화합물 (48mg, 0.119mmol), 2-(2-클로로에틸설포닐)에탄아민 하이드로클로라이드(2-(2-chloroethylsulfonyl)ethanamine hydrochloride) (74mg, 0.357mmol)를 용해시킨 뒤 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine, DIPEA)(0.207mL, 1.19mmol)을 첨가한 뒤, 질소 기류하의 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후 디에틸 에테르(diethyl ether)로 입자를 석출시킨 다음 원심분리기를 사용해 분리시킨 뒤 진공건조기에 건조시켜 화학식 9의 화합물을 얻었다(11mg, 22.1%).

LC/MS, 계산치 C₁₆H₂₅NO₁₀S 423.1, 측정치 422.1

실시예 3: 화학식 10의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 6에서 제조한 화합물 6을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 분홍색 오일의 화학식 10의 화합물을 제조하였다(1226mg, 64.8 %).

LC/MS, 계산치 C₁₈H₂₅NO₁₂ 447.1, 측정치 446.1

실시예 4: 화학식 11의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 3에서 제조한 화학식 10의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 11의 화합물을 제조하였다(15.2mg, 20.8%).

LC/MS, 계산치 C₁₈H₂₉NO₁₁S 467.2, 측정치 466.1

실시예 5: 화학식 12의 화합물 제조

합성예 6에서 제조한 화합물 6 대신에 합성예 7에서 제조한 화합물 7을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 노란색 오일의 화학식 12의 화합물을 제조하였다(535mg, 49.1%).

LC/MS, 계산치 C₂₀H₂₉NO₁₃ 491.2, 측정치 490.1

실시예 6: 화학식 13의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 5에서 제조한 화학식 12의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 13의 화합물을 제조하였다(10.8mg, 20%).

LC/MS, 계산치 C₂₀H₃₃NO₁₂S 511.2, 측정치 510.1

실시예 7: 화학식 14의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 8에서 제조한 화합물 8를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 분홍색 오일의 화학식 14의 화합물을 제조하였다(601mg, 49.4 %).

LC/MS, 계산치 C₂₂H₃₃NO₁₄ 535.2, 측정치 534.1

실시예 8: 화학식 15의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 7에서 제조한 화학식 14의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 15의 화합물을 제조하였다(7.4mg, 21.6%).

LC/MS, 계산치 C₂₂H₃₇NO₁₃S 555.2, 측정치 554.1

실시예 9: 화학식 16의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 9에서 제조한 화합물 9를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 노란색 오일의 화학식 16의 화합물을 제조하였다(450mg, 47.4 %).

LC/MS, 계산치 C24H37NO15 579.22, 측정치 578.6

실시예 10: 화학식 17의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 9에서 제조한 화학식 16의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 17의 화합물을 제조하였다(18.7mg, 23%).

LC/MS, 계산치 C₂₄H₄₁NO₁₄S 599.2, 측정치 598.2

실시예 11: 화학식 18의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 10에서 제조한 화합물 10을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 투명한 오일의 화학식 18의 화합물을 제조하였다(140mg, 24.9 %).

LC/MS, 계산치 C₂₆H₄₁NO₁₆ 623.2, 측정치 622.5

실시예 12: 화학식 19의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 11에서 제조한 화학식 18의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 19의 화합물을 제조하였다(3.6mg, 16%).

LC/MS, 계산치 C₂₆H₄₅NO₁₅S 643.3, 측정치 642.4

실시예 13: 화학식 20의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 11에서 제조한 화합물 11을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 투명한 오일의 화학식 20의 화합물을 제조하였다(250mg, 36.8 %).

LC/MS, 계산치 C₂₈H₄₅NO₁₇ 667.3, 측정치 666.4

실시예 14: 화학식 21의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 13에서 제조한 화학식 20의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 21의 화합물을 제조하였다(16.7mg, 19.8%).

LC/MS, 계산치 C₂₈H₄₉NO₁₆S 687.3, 측정치 686.4

실시예 15: 화학식 22의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 3에서 제조한 화합물 3-2를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 투명한 오일의 화학식 22의 화합물을 제조하였다(1.3g, quantative).

실시예 16: 화학식 23의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 15에서 제조한 화학식 22의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 23의 화합물을 제조하였다(600mg, quantative).

실시예 17: 화학식 24의 화합물 제조

합성예 5에서 제조한 화합물 5 대신 합성예 4에서 제조한 화합물 4-2를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 투명한 오일의 화학식 24의 화합물을 제조하였다(2.2g, quantative).

실시예 18: 화학식 25의 화합물 제조

실시예 1에서 제조한 화학식 8의 화합물 대신 실시예 17에서 제조한 화학식 24의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법으로 화학식 25의 화합물을 제조하였다(1g, quantative).

제조예 1: 자성 나노입자의 합성

링커 화합물의 표지 대상으로 사용되는 자성 나노입자는 한국 공개특허 제10-2013-0058710호 등의 문헌에서 쉽게 합성될 수 있다. 자성 나노입자는 아연과 망간, 철, 원료 물질이 혼합으로 이루어진 ZnMnFe₂O₄로 구성되어 있다. 상기의 자성 나노입자 합성 후 실리카를 코팅하여 입자 사이즈가 500nm인 표면 개질된 자성 나노입자이며, 도 1에 표기하였다.

시험예 1: 자성 나노입자와 링커 합성물 표지

표지되는 자성 나노입자의 경우 Sigma-Aldrich사 등에서 쉽게 구할 수 있는 자성 나노입자도 가능하며 나노입자 표면에 모두 Silica 처리 후 NH₂기로 변경하여 실시예와 같은 링커의 표지 부착이 쉽게 가능하다. 해당 자성 나노입자의 표면 반응기를 이용하여 선별된 비교예 3과 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 15, 16, 17, 18번의 링커 10종을 활용하여 표면의 부착하였다.

[---올해 7/25 등록된 특허에 속해있던 링커 3종(실시예 1, 2, 3으로 적어서 주셨던 링커)는 모두 비교예로 바꿨고, 그에 따라 실시예 번호가 3씩 줄었습니다. 예를 들어 애초에 적어주셨던 실시예 13은 실시예 10으로 바뀌었습니다---]

부착 방법은 자성 나노입자 1mg에 300μL의 MES buffer (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid), 0.05M, pH 6.2)를 첨가하여 분산시킨 후 반응 용액으로 사용한다. 첨가되는 시약은 EDC (N-(30Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 1mg과 NHS ester (N-Hydroxygsulfosuccinimide sodium salt) 1mg을 MES 에 10mg/mL 농도로 녹인 후 자성 나노입자에 첨가하여 25℃, 15분 동안 반응시켰다. 반응 후 Magnetic stand를 활용하여 자성 나노입자와 반응하지 않은 시료 또는 버퍼 교환을 위하여 자성 나노입자를 제외한 반응 용액을 버린 뒤, Borate buffer (0.05M boric acid, pH 8.5) 300μL를 넣고 섞어 준 뒤 다시 Magnetic stand에 정치시켜 용액을 제거하는 작업을 2회 반복하였다. 해당 작업을 통해 자성 나노입자 표면이 NHSester 상태로 pH 8.5 환경을 맞추어 준 다음, 각 각의 선별된 Linker 10mg 씩 담겨 있는 Tube에 300μL에 자성 나노입자를 넣고 링커 입자가 보이지 않도록 Pipetting하였다. 간단한 Mixing이 이루어지면 Incubator에서 25℃로 1-2시간 반응시켜 링커를 부착하였다.

링커가 부착된 자성 나노입자의 경우, 말단 표면이 카르복실기 (-COOH)로 이루어져 있으며 링커와 자성 나노입자 간 결합을 확인하기 위하여 NH₂기를 가지고 있는 형광 염료를 활용하여 외부 카르복실기에 도입 후 형광량을 측정해 보았다.

우선, 링커로 표면 개질된 자성 나노입자를 MES buffer(pH 6.1) 300μL로 분산시킨 후 EDC 1mg과 NHS ester 1mg을 각 각 첨가하여 15분간 25℃에서 반응시켰다. 반응 후 Magnetic stand에 정치시켜 남은 여액을 제거 한 후 Borate buffer (pH 8.5) 300μL를 첨가하였다. Amine기를 가지고 있는 Flamma^ㄾ 648 amine 형광 염료를 DMF에 10mg/mL로 녹인 후 10μL를 자성 나노입자에 넣고 25℃ 1-2시간 정도 반응시켰다. 자성 나노입자 표면과 반응하지 않은 염료를 모두 제거하기 위하여 Magnetic stand에 정치시킨 후 에탄올로 10회 Washing하였다. 남은 염료의 제거가 확인되면 자성 나노입자 자체의 형광 도입율을 비교 분석하기 위하여 형광 분석 장치를 통해 각 각의 형광 분석을 진행하여 자성 나노입자와 링커의 도입이 이루어 진 것을 최종 확인하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.

시험예 2: 링커로 표면 개질된 자성 나노입자의 항원, 항체 도입 시험

링커가 도입된 자성 나노입자에 항체와 항원을 도입하기 위하여 자성 나노입자 표면에 카르복실기를 이용하여 NHSester기로 변환 후 항체 초기 농도에서 부착되지 않은 여액의 항체 농도를 비교 분석하였다. 부착에 사용된 항체는 Goat-anti-Rabbit-igG (Invitrogen 社)이며, 항원으로는 IgG from rabbit serum (Sigma Aldrich 社)를 사용하였다.

우선, 링커가 도입된 자성 나노입자의 항체를 부착하기 위하여, 자성 나노입자를 Magnetic stand에 정치시킨 후 MES buffer로 교환하였다. 이어서 EDC와 NHSester를 1mg 씩 넣고 25℃ 15분간 반응시켰다.

다시 Magnetic stand에 정치시킨 후 Borate buffer로 교환하여 자성 나노입자 1mg 당 200μg의 항체를 첨가하여 25℃에서 1-2시간 반응시켰다. 반응 전 후의 항체 농도를 분석하기 위하여 자성 나노입자에 항체를 넣기 전 농도와 자성 나노입자와 결합한 후 자성 나노입자를 제외한 그 여액 중 항체의 농도를 나노드랍의 흡광도 분석을 통해 항체의 농도 전 후를 비교하여 자성 나노입자의 항체 부착율 분석을 진행하였다.

이후 최종 항체가 부착된 자성 나노입자를 다시 Magnetic stand에 정치시켜 여액을 제거한 후 PBS (10mM, pH 7.4)로 Buffer 교환 후 항원 200μg을 넣고 25℃ 1시간 반응하여 마찬가지로 나노드랍을 활용하여 항원 전 후의 농도를 비교하여 항원 부착율 또한 확인하여 도 3에 나타내었다.

Claims

하기 화학식 1a로 표시되는 링커 화합물:
[화학식 1a]

상기 R은 에텐설포닐C_1-6알킬아미닐이고,
상기 A는 C_1-3알킬렌옥시C_1-3알킬렌이며,
상기 n은 1 내지 100의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 링커 화합물은 하기 화학식 1b의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 링커 화합물:
[화학식 1b]

.
제1항에 있어서, 상기 링커 화합물은 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 링커 화합물:
[화학식 3]

..
제1항에 있어서, 상기 링커 화합물은 하기 화학식 5, 화학식 7, 화학식 9, 화학식 11, 화학식 13, 화학식 15, 화학식 17, 화학식 19 및 화학식 21 중 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 링커 화합물:
[화학식 5]

[화학식 7]

[화학식 9]

[화학식 11]

[화학식 13]

[화학식 15]

[화학식 17]

[화학식 19]

[화학식 21]

.
(1) 기질, 및 (2) 상기 기질의 표면에 결합되어 있는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 링커 화합물을 포함하는 표면 개질된 기질.
제5항에 있어서, 상기 기질은 저분자 화합물, 고분자 화합물, 고분자 나노입자, 양자점 및 자성 나노입자 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표면 개질된 기질.
제5항에 있어서, 상기 기질 1 당량을 기준으로 상기 링커 화합물 1 내지 10 당량이 상기 기질의 표면에 결합되는 것을 특징으로 하는 표면 개질된 기질.
(1) 표적 물질, 및 (2) 상기 표적 물질에 결합되어 있는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 링커 화합물을 포함하는 표면 개질된 표적 물질.
제8항에 있어서, 상기 표적 물질은 생체 분자인 것을 특징으로 하는 표면 개질된 표적 물질.
제9항에 있어서, 상기 표적 물질은 항원, 항체, 효소, 핵산 분자 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 표면 개질된 표적 물질.
(1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 링커 화합물, (2) 상기 링커 화합물 일단에 결합되어 있는 기질, 및 (3) 상기 링커 화합물의 타단에 결합되어 있는 표적 물질을 포함하는 영상화용 복합체.
제11항에 있어서, 상기 기질은 저분자 화합물, 고분자 화합물, 고분자 나노입자, 양자점 및 자성 나노입자 중에서 선택되는 어느 하나이고,
상기 표적 물질은 생체 분자인 것을 특징으로 하는 영상화용 복합체.
제11항에 따른 영상화용 복합체를 포함하는 영상화용 조성물.
제5항에 따른 표면 개질된 기질을 포함하는 바이오 칩.
제5항에 따른 표면 개질된 기질을 포함하는 약물 전달용 지지체.