JP6876002B2

JP6876002B2 - 機能的要素を共有結合により係留させるための細胞透過性、細胞適合性、かつ開裂可能であるリンカー

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Publication number: JP6876002B2
Application number: JP2017563259A
Authority: JP
Inventors: セルジーレヴィン; レイチェルフリードマンオハナ; トーマスカークランド; キースヴイウッド
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2021-05-26
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: US11667648B2; JP2018518484A; EP3304078B1; EP3304078A1; EP3304078A4; WO2016196956A1; US10618907B2; US20160355523A1; US20200199140A1

Description

関連出願の相互参照
本発明は、２０１５年６月５日に出願された米国仮特許出願第６２／１７１，６２０号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が組み込まれる。

本明細書は、機能的要素（例えば、細胞相互作用要素及び捕捉要素）を係留（例えば、共有結合で）させるための、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的（chemoselectively）に開裂可能なリンカー、ならびにそれを使用する（例えば、細胞内標的の細胞内結合と細胞外遊離）方法を提供する。

対象の細胞、タンパク質、及び分子の検出、単離、及び固定化は、多種多様な現代の生物学的用途（例えば、基礎分子生物学の研究、薬物の発見、臨床診断など）にとって不可欠な技術である。既存の技術に対し利点を提供する組成物及び方法が求められている。

本明細書は、機能的要素（例えば、細胞相互作用要素及び捕捉要素）を係留（例えば、共有結合で）させるための、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能なリンカー、ならびにそれを使用する（例えば、細胞内標的の細胞内結合と細胞外遊離）方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書は、分子成分及び／または機能的要素（例えば、限定するわけではないが、細胞相互作用要素及び捕捉要素など）をつなぐための、官能基選択的に開裂可能なリンカー（例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）を提供する。本明細書の多くの実施形態では、細胞相互作用要素と捕捉要素の連結について具体的に記載しているが、本明細書のいずれの実施形態も、そのように限定するものではない。本明細書に記載する官能基選択的に開裂可能なリンカーは、任意の２つの分子成分（例えば、タンパク質、低分子、核酸、その組み合わせなど）をつなぐ際に利用され得る。本明細書に記載するリンカー、及びそれらを含む化合物または組成物は、例えば、細胞内標的（例えば、標的タンパク質）の標識、検出、単離、及び／または固定化に利用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するリンカーは、タンパク質性、または高度にタンパク質性の環境（例えば、細胞環境、細胞溶解物、生化学組成物、試験管内など）において細胞適合性、細胞透過性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する構造における機能的要素（例えば、細胞相互作用要素及び捕捉要素）は、細胞適合性及び細胞透過性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するリンカーを含む構造（例えば、Ｚ−Ｙ−Ｑ、式中、Ｚは細胞相互作用要素であり、Ｑは捕捉要素であり、及びＹは官能基選択的に開裂可能なリンカーである）は、タンパク質性、または高度にタンパク質性の環境（例えば、細胞環境、細胞溶解物、生化学組成物、試験管内など）において細胞適合性、細胞透過性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能である。

いくつかの実施形態では、本明細書は、二重機能性（例えば、２つの分子成分の連結）、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能な組成物を提供する。いくつかの実施形態では、二重機能性（例えば、２つの分子成分の連結）、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能な組成物は、（ａ）第１の機能的要素、（ｂ）第２の機能的要素、及び（ｃ）第１の機能的要素を第２の機能的要素に共有結合により係留させる、官能基選択的に開裂可能な部分を含むリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１の機能的要素は第１の分子成分と化学的に相互作用（例えば、共有結合または非共有結合による）することができ、第２の機能的要素は、第２の分子成分と化学的に相互作用（例えば、共有結合または非共有結合による）することができる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の分子成分は、構造及び／または機能において異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の分子成分は、構造及び／または機能において同一であるかまたは類似している。いくつかの実施形態では、第１の機能的要素と第１の分子成分の化学的相互作用及び／または第２の機能的要素と第２の分子成分の化学的相互作用は選択的または非選択的であってよい。いくつかの実施形態では、第１の機能的要素及び／または第２の機能的要素は、レポーター機能（例えば、蛍光団、ルシフェラーゼ、抗体、核酸など）を含む。いくつかの実施形態では、第１の機能的要素及び／または第２の機能的要素は、表面（例えば、マイクロプレート、粒子）を含む。

いくつかの実施形態では、二重機能性（例えば、２つの分子成分の連結）、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能な組成物は、（ａ）細胞相互作用要素、（ｂ）捕捉要素、及び（ｃ）細胞相互作用要素を捕捉要素に共有結合により係留させる、官能基選択的に開裂可能な部分を含むリンカーを含む。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素は低分子またはペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素は、酵素もしくは細胞の表現型の阻害物質、酵素もしくは細胞の表現型の活性化物質、または酵素もしくは細胞の表現型の調節物質である。いくつかの実施形態では、捕捉要素は、基質または酵素阻害物質である。いくつかの実施形態では、捕捉要素は、特定のタンパク質（例えば、酵素または変異酵素）と特定の共有結合（例えば、共有結合性基質または自殺阻害物質）を形成する。いくつかの実施形態では、捕捉要素は、ハロアルカン基、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン、またはニトロフェニルホスホン酸を含む。いくつかの実施形態では、捕捉要素は親和性要素である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、遷移金属（例えば、周期表のｄブロック元素）で開裂可能な官能基である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、モリブデンで開裂可能な部分、タングステンで開裂可能な部分、イリジウムで開裂可能な部分、ロジウムで開裂可能な部分、ルテニウムで開裂可能な部分、白金で開裂可能な部分、ニッケルで開裂可能な部分、銅で開裂可能な部分、鉄で開裂可能な部分、コバルトで開裂可能な部分、パラジウムで開裂可能な部分、またはルテニウムで開裂可能な部分である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、Ｐｄで開裂可能であるか、またはＲｕで開裂可能な部分である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、アリル−ヘテロ原子基、プロパルギル−ヘテロ原子基などからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、アリルエーテル、アリルアミン、アリルエステル、アリルアミド、アリル尿素、アリルカルボナート、及びアリルカルバマートからなる群から選択されるアリル−ヘテロ原子基を含む。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、アリルカルバマート基を含む。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、プロパルギルエーテル、プロパルギルアミン、プロパルギルエステル、プロパルギルアミド、プロパルギル尿素、プロパルギルカルボナート、及びプロパルギルカルバマートからなる群から選択されるプロパルギル−ヘテロ原子基を含む。いくつかの実施形態では、組成物は式：Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑを含み、式中、Ｚは細胞相互作用要素であり、Ｑは捕捉要素であり、Ｌ¹とＬ²は、互いに独立して任意選択で存在する独立リンカー部分であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分である。

いくつかの実施形態では、本明細書は、（ａ）細胞相互作用要素、官能基選択的に開裂可能な部分、及び捕捉要素を含んでいる、二重機能性、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能な組成物を細胞に投与する、（ｂ）細胞相互作用要素を、対応する細胞内標的に結合させる、（ｃ）前記細胞を溶解させて細胞溶解物を作製する、（ｄ）捕捉要素を捕捉物質と接触させる、（ｅ）官能基選択的に開裂可能なリンカーを対応する官能基選択性物質と接触させ、これにより、細胞相互作用要素及び結合した細胞内標的を捕捉物質から遊離させるという工程のうち１つ以上を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、捕捉物質を、表面上に固定化する。

いくつかの実施形態では、本明細書は、（ａ）第１の機能的要素、官能基選択的に開裂可能な部分、及び第２の機能的要素を含んでいる、二重機能性、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能な組成物と、（ｂ）（ｉ）細胞、細胞溶解物、もしくは他のタンパク質性の環境、及び／または（ｉｉ）官能基選択性物質のうちいずれか１つ以上とを含む系を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書は、（ａ）細胞相互作用要素、官能基選択的に開裂可能な部分、及び捕捉要素を含んでいる、二重機能性、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ／または官能基選択的に開裂可能な組成物と、（ｂ）（ｉ）細胞、細胞溶解物、または他のタンパク質性の環境、（ｉｉ）細胞内標的、（ｉｉｉ）表面に提示された捕捉物質、及び（ｉｖ）官能基選択性物質のうち１つ以上とを含む系を提供する。いくつかの実施形態では、細胞内標的は融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、細胞内標的とレポータータンパク質、例えば、ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼとの融合体である。

いくつかの実施形態では、本明細書は、式Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑの組成物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｌ¹は第１のリンカー部分であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分であり、Ｌ²は第２のリンカー部分であり、Ｑは捕捉要素（または他の機能的要素）である。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、Ｚ及びＹに直鎖状につながれた少なくとも１つの原子によってＺとＹを分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＺとＹを、１〜２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはその間の任意の範囲（例えば、２〜２０、５〜１０、１５〜３５、２５〜１００など））の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、ＱとＹを、Ｑ及びＹに直鎖状につながれた少なくとも１つの原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、ＱとＹを、１〜２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはその間の任意の範囲（例えば、２〜２０、５〜１０、１５〜３５、２５〜１００など））の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＺとＹを、２つ以上の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、ＱとＹを、２つ以上の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｚは、細胞成分と相互作用する（例えば、共有結合または非共有結合）分子成分である。いくつかの実施形態では、Ｑは、捕捉物質（例えば、抗体、変異体脱ハロゲン酵素、ストレプトアビジンなど）と相互作用する（例えば、共有結合または非共有結合）分子成分である。いくつかの実施形態では、Ｚ及びＱは、細胞適合性及び／または細胞透過性がある。いくつかの実施形態では、Ｌ¹及びＬ²は、互いに独立して、Ｃ−、Ｎ、Ｏ−、Ｓ−、Ｐ−、及び／またはハロゲンを含有する官能基の１つ以上を含み得る、直鎖または分岐鎖の炭素系部分を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書は、式Ｚ−（Ｌ−Ｙ）_n−Ｌ−Ｑの組成物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、各Ｌは互いに独立したリンカー部分であり、各Ｙは互いに独立した官能基選択的に開裂可能な部分であり、Ｑは捕捉要素（または他の機能的要素）であり、ｎは１〜２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはその間の任意の範囲）である。いくつかの実施形態では、各Ｌは同一の化学部分である。いくつかの実施形態では、各Ｙは同一の化学部分である。いくつかの実施形態では、各Ｌは互いに独立して、本明細書に記載するＬ基から選択される。いくつかの実施形態では、各Ｙは互いに独立して、本明細書に記載するＬ基から選択される。

いくつかの実施形態では、本明細書は、ハロアルカン基質と機能的要素（例えば、タグ、ラベル、反応性基、ペプチド、標的タンパク質、抗体、核酸、表面、低分子、細胞相互作用要素など）とをつなぐための、官能基選択的に開裂可能なリンカー（例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）を提供する。本明細書に記載する基質及びリンカーは、例えば、タンパク質、細胞、及び分子について、標識化、検出、相互作用の特性解析、位置の特定などを行う際に利用される。特定の実施形態では、本明細書で提供するリンカーは、化学的に開裂可能なユニット（例えば、アリルカルバマート）を含み、ハロアルカン基質と安定な共有結合を形成する脱ハロゲン酵素変異型が結合する基質内で利用される。

いくつかの実施形態では、本明細書は、式Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分、例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）であり、Ｌ¹は第１のリンカー部分であり、Ｍはアルキルカルバマート基であり、Ｌ²は第２のリンカー部分であり、Ａはアルキル基であり、Ｘはハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｌ²−Ａは、ＭとＸを、直鎖状につながれた６〜１８の原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＹとＭを、２つ以上（例えば、２〜１００（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはその間の任意の範囲）の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ａは（ＣＨ₂）₆である。いくつかの実施形態では、Ｌ²−Ａは、ＭとＸを、２つ以上（例えば、２〜１００（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはその間の任意の範囲）の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ²はカルバマート基を含まない。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基からなる。いくつかの実施形態では、Ｌ²は（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_xを含み、式中、ｘ＝０〜５である。いくつかの実施形態では、Ｌ²は（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₂を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は（ＣＨ₂）₂を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹はＯ（ＣＨ₂）₂を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書は、式Ｚ−Ｇ−Ａ−Ｘの化合物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ａはアルキル基であり、Ｘはハロゲンであり、Ｇは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはその間の範囲）の官能基選択的に開裂可能な部分Ｙ（例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）、ならびに任意選択で１つ以上のリンカー部分Ｌ及び／または１つ以上のアルキルカルバマート基Ｍを含む。非限定的な例示的化合物には、例えば、Ｚ−Ｙ¹−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ｙ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ¹−Ｍ²−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ¹−Ｌ³−Ｍ²−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｍ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｍ−Ｌ¹−Ｙ¹−Ｙ²−Ｌ²−Ａ−Ｘなどが含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書は、式Ｚ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｌ³は第３のリンカー部分であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分、例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）であり、Ｌ¹は第１のリンカー部分であり、Ｍはアルキルカルバマート基であり、Ｌ²は第２のリンカー部分であり、Ａはアルキル基であり、Ｘはハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｌ³は、ＺとＹを、２つ以上（例えば、２〜２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはその間の任意の範囲（例えば、２〜２０、５〜１０、１５〜３５、２５〜１００など）））の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ³は、直鎖状につながれたＣＨ₂基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ³は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²−Ａは、ＭとＸを、１〜２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはその間の任意の範囲（例えば、２〜２０、５〜１０、６〜１８、１５〜３５、２５〜１００など））の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、ＹとＭを、２つ以上（例えば、２〜１８）の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ａは（ＣＨ₂）₆である。いくつかの実施形態では、Ｌ²−Ａは、ＭとＸを、１２の直鎖状につながれた原子によって分離する。いくつかの実施形態では、Ｌ²はカルバマート基を含まない。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ²は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基からなる。いくつかの実施形態では、Ｌ²は（（ＣＨ₂）₂Ｏ）_xを含み、式中、ｘ＝０〜５である。いくつかの実施形態では、Ｌ²は（（ＣＨ₂）₂Ｏ）₂を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹は（ＣＨ₂）₂を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹はＯ（ＣＨ₂）₂を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書は、式：Ｚ−Ｙ−Ａ−Ｘ；Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ａ−Ｘ；Ｚ−Ｙ−Ｌ²−Ａ−Ｘ；及びＺ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ａ−Ｘのうちの１式の化合物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｌ¹は、存在する場合は、第１のリンカー部分であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分、例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）であり、Ｌ²は、存在する場合は、第２のリンカー部分であり、Ａはアルキル基であり、Ｘはハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ａは（ＣＨ₂）₆である。いくつかの実施形態では、Ｙ及びＸは、少なくとも８個の直鎖状につながれた原子（例えば、８個の原子、９個の原子、１０個の原子、１１個の原子、１２個の原子、１３個の原子、１４個の原子、１５個の原子、１６個の原子、１７個の原子、１８個の原子、１９個の原子、２０個の原子、またはそれ以上）によって分離される。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｌ²を含み、Ｌ²はアルキルカルバマート基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ¹及び／またはＬ²が存在し、直鎖状につながれたＣＨ₂基及びＯ基を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書は、細胞相互作用要素（または他の機能的要素）と捕捉物質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素、抗体、ストレプトアビジンなど）とを連結する方法を提供し、かかる方法は、細胞適合性及び細胞透過性がある、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑ、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ²−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ｑ、またはＺ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ｑを含む組成物と捕捉要素とを接触させることを含み、上記式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分、例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）であり、Ｌ¹は第１のリンカー部分であり、Ｍはアルキルカルバマート基であり、Ｌ²は第２のリンカー部分であり、Ｌ³（存在する場合）は、第３のリンカー部分であり、Ｑは捕捉要素であり、ここで、捕捉物質は捕捉要素と特異的に結合（共有結合または非共有結合）する。

いくつかの実施形態では、本明細書は、細胞相互作用要素（または他の機能的要素）と変異体脱ハロゲン酵素とを共有結合させる方法を提供し、かかる方法は、Ｚ−Ｌ^l−Ｙ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、またはＺ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘを含む基質と変異体脱ハロゲン酵素とを接触させることを含み、上記式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分、例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）であり、Ｌ¹は第１のリンカー部分であり、Ｍはアルキルカルバマート基であり、Ｌ²は第２のリンカー部分であり、Ａはアルキル基であり、Ｘはハロゲンであり、Ｌ³（存在する場合）は、第３のリンカー部分であり、ここで、変異体脱ハロゲン酵素は、対応する野生型脱ハロゲン酵素に対し、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、かかる少なくとも１つのアミノ酸置換の結果、変異体脱ハロゲン酵素が基質（例えば、Ｚ−Ｙ−Ｌ^l−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘなど）と共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、変異体脱ハロゲン酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型脱ハロゲン酵素と基質の間に形成された結合を開裂させる水分子活性化に関連している、対応する野生型脱ハロゲン酵素のアミノ酸残基における置換である。いくつかの実施形態では、変異体脱ハロゲン酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、基質とエステル中間体を形成する、対応する野生型脱ハロゲン酵素のアミノ酸残基における置換である。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、捕捉物質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）と細胞相互作用要素（または他の機能的要素）の複合体を、官能基選択的に開裂可能な部分（Ｙ）を開裂させる官能基選択性物質に曝露させることによって、細胞相互作用要素から捕捉物質を遊離させることを含む。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、本明細書に記載するように、アリル含有部分またはプロパルギル含有部分である。いくつかの実施形態では、官能基選択性物質は、水溶性の遷移金属錯体（例えば、Ｐｄ、Ｒｕなどを含むもの）を含むか、それを本質的な構成要素とするか、またはそれを構成要素とする。いくつかの実施形態では、遷移金属は、１つ以上の水溶性有機ホスフィン配位子によって錯体を形成する。いくつかの実施形態では、官能基選択性物質は、遷移金属塩と好適な配位子（例えば、水溶性有機ホスフィン配位子、窒素系配位子、Ｎ−ヘテロ環状カルベンなど。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，Ｋ．，Ｈ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００９，１０９，６４３．を参照のこと）との相互作用によって形成する。いくつかの実施形態では、パラジウム源として好適な遷移金属塩は、パラジウム（ＩＩ）塩であり、これは酢酸パラジウム：Ｐｄ（ＯＡｃ）₂、トリフルオロ酢酸パラジウム：Ｐｄ（ＴＦＡ）₂、硝酸パラジウム：Ｐｄ（ＮＯ₃）₂、塩化パラジウム：ＰｄＣｌ₂、臭化パラジウム：ＰｄＢｒ₂、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム：Ｎａ₂ＰｄＣｌ₄、テトラクロロパラジウム酸カリウム：Ｋ₂ＰｄＣｌ₄、テトラクロロパラジウム酸リチウム：Ｌｉ₂ＰｄＣｌ₄、テトラブロモパラジウム酸ナトリウム：Ｎａ₂ＰｄＢｒ₄、及びテトラブロモパラジウム酸カリウム：Ｋ₂ＰｄＢｒ₄を含む群から選択されるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、水溶性Ｐｄ（ＩＩ）予備官能基選択性物質は、図１に示すＰｄ（ＯＡｃ）₂錯体のうちいずれかから選択される。図１に示す予備官能基選択性物質に類似する他のパラジウム塩の予備官能基選択性物質は、本明細書に記載する実施形態で使用される。いくつかの実施形態では、錯体ルテニウム官能基選択性物質について好適なルテニウム源は当技術分野のＡｉｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１０，４６，５５０６−５５０８；Ｓｔｒｅｕ＆Ｍｅｇｇｅｒｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，５６４５−５６４８；Ｓａｎｃｈｅｚｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１４，５，１９０１−１９０７；Ｃｒｏｃｈｅｔ＆Ｃａｄｉｅｒｎｏ．ＤａｌｔｏｎＴｒａｎｓ．２０１４，４３，１２４４７−１２４６２において理解されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、遷移金属の配位に好適なホスフィン配位子には、単座ホスフィン及び二座ホスフィンが含まれる。好適なホスフィン配位子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，ＫＨ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００９，１０９，６４３に記載されている。本明細書の官能基選択性物質形成のための遷移金属の配位に利用されるホスフィンの例には、図２に示すものが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、遷移金属の配位に好適な配位子は、ハイブリッド配位子であり、窒素、リン、Ｎ−ヘテロ環状カルベン（例えば、Ａｒｄｕｅｎｇｏ型カルベン）などを含有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物及び方法により、タンパク質性または高度にタンパク質性の環境における効率的な官能基選択的な開裂が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質性または高度にタンパク質性の環境は、表面に結合しているかまたは表面に固定化されているタンパク質（例えば、磁性粒子）を含む。いくつかの実施形態では、系（例えば、細胞内標的）の成分を損傷させずに（または損傷が最小限である）効率的な開裂を可能にする条件が提供される（例えば、開裂剤濃度、緩衝、時間など）。いくつかの実施形態では、その後の質量分析法による試料分析を妨げずに効率的な開裂を可能にする条件が提供される（例えば、開裂剤濃度、緩衝、時間など）。

いくつかの実施形態では、本明細書は、細胞内標的（例えば、標的タンパク質）を同定、単離、または固定化する方法を提供し、かかる方法は、（ａ）官能基選択的に開裂可能な部分（例えば、Ｚ−Ｙ−Ｑまたは本明細書に記載する他の構造）によって捕捉要素（例えば、脱ハロゲン酵素基質）に係留された細胞相互作用要素を含む組成物と、試料（例えば、細胞）とを接触させること、（ｂ）捕捉要素の捕捉物質（例えば、固体支持体上）と試料とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）に先立つ細胞溶解を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、試料と官能基選択性物質とを接触させて官能基選択的に開裂可能な部分を開裂させることを含む。いくつかの実施形態では、捕捉要素は、タンパク質または酵素と共有結合または他の安定な結合を形成する、親和性分子、阻害物質、または基質である。いくつかの実施形態では、捕捉要素はハロアルカンであり、捕捉物質は変異体脱ハロゲン酵素であり、ここで、変異体脱ハロゲン酵素は、対応する野生型脱ハロゲン酵素に対し、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも１つのアミノ酸置換により、変異体脱ハロゲン酵素が、対応する野生型脱ハロゲン酵素と基質の間に形成される結合よりも安定な結合を基質と形成し、ここで、変異体脱ハロゲン酵素における少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型脱ハロゲン酵素と基質の間に形成された結合を開裂させる水分子活性化に関連している、対応する野生型脱ハロゲン酵素のアミノ酸残基における置換であるか、または基質とエステル中間体を形成する、対応する野生型脱ハロゲン酵素のアミノ酸残基における置換であり、（ｃ）標的分子を同定する。他の実施形態では、捕捉要素及び捕捉物質は、ビオチン／ストレプトアビジン、ベンジルグアニン／Ｏ⁶−アルキルグアニン−ＤＮＡトランスフェラーゼ、ベンジルシトシン／修飾Ｏ⁶−アルキルグアニン−ＤＮＡトランスフェラーゼ、クチナーゼ／ニトロフェニルホスホン酸、またはその変異型である。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素（例えば、対象化合物）は、薬物、薬物化合物、阻害物質、配位子、生体分子、または低分子である。いくつかの実施形態では、標的分子はタンパク質（例えば、酵素、受容体、転写因子など）である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、変異体脱ハロゲン酵素と細胞内標的の複合体を、Ｙ基を開裂させる官能基選択性物質と接触させることよって、変異体脱ハロゲン酵素から細胞内標的を遊離させることを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書は、被験配位子の細胞における細胞内標的（例えば、分子またはタンパク質）を同定する方法を提供し、かかる方法は、（ａ）本明細書に記載するＺ−Ｙ−Ｑ組成物（例えば、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘなど）を含む細胞を接触させ、上記式中、Ｚは被験配位子であり、Ｑは捕捉要素であり、かつＹは官能基選択的に開裂可能な部分であり、ここで、被験配位子は細胞内標的と結合し、（ｂ）細胞を溶解させて細胞溶解物を作製し、（ｃ）細胞溶解物と表面または支持体に付着した捕捉物質（例えば、Ｑに対応するかまたは特異的）とを接触させ、（ｄ）未結合の溶解物を洗い流し、（ｅ）表面または支持体と官能基選択性物質（例えば、Ｙに対応するかまたは特異的）とを接触させて表面または支持体から細胞内標的を遊離させ、（ｆ）細胞内標的を同定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書は、細胞における細胞内標的（例えば、分子またはタンパク質）の存在または量を検出する方法を提供し、かかる方法は、（ａ）本明細書に記載するＺ−Ｙ−Ｑ組成物（例えば、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘなど）を含む細胞を接触させ、（ｂ）細胞を溶解させて細胞溶解物を作製し、（ｃ）細胞溶解物と表面または支持体に付着した捕捉物質（例えば、Ｑに対応するかまたは特異的）とを接触させ、（ｄ）未結合の溶解物を洗い流し、（ｅ）表面または支持体と官能基選択性物質（例えば、Ｙに対応するかまたは特異的）とを接触させ、（ｆ）細胞内標的の存在または量を検出または決定することを含む。いくつかの実施形態では、対象分子と相互作用する細胞内部タンパク質を検出する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書は、遷移金属で開裂可能なリンカーによって第２の分子成分に連結された第１の分子成分を含む、官能基選択的に開裂可能な構成体と、遷移金属イオン、または遷移金属イオンを放出できる官能基選択性物質とを、遷移金属イオンによって開裂可能なリンカーが開裂され、第１の分子成分が第２の分子成分から遊離される条件下で接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、アリル−ヘテロ原子基及びプロパルギル−ヘテロ原子基からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、アリルエーテル、アリルアミン、アリルエステル、アリルアミド、アリル尿素、アリルカルボナート、及びアリルカルバマートからなる群から選択されるアリル−ヘテロ原子基を含む。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分はアリルカルバマート基を含む。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分は、プロパルギルエーテル、プロパルギルアミン、プロパルギルエステル、プロパルギルアミド、プロパルギル尿素、プロパルギルカルボナート、及びプロパルギルカルバマートからなる群から選択されるプロパルギル−ヘテロ原子基を含む。いくつかの実施形態では、遷移金属はＰｄまたはＲｕである。いくつかの実施形態では、条件は、タンパク質性または高度にタンパク質性の環境を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質性の環境は細胞または細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、タンパク質性の環境は、表面（例えば、磁性粒子）上に結合また固定化したタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１の分子成分は、細胞相互作用要素であり、細胞内標的に結合している。いくつかの実施形態では、第２の分子成分は、捕捉要素であり、捕捉物質に結合している。いくつかの実施形態では、捕捉物質は表面に結合している。

いくつかの実施形態では、本明細書は、官能基選択的に開裂可能な部分（例えば、アリル−ヘテロ原子リンカー（例えば、アリル−カルバマート−含有リンカー）、プロパルギル含有リンカーなど）を使用して第１の分子成分と第２の分子成分（例えば、捕捉要素と細胞相互作用要素）を可逆的に連結することを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書は、官能基選択性物質（例えば、遷移金属（例えば、Ｐｄ、Ｒｕなど）を含む）を使用して、第１の分子成分と第２の分子成分（例えば、捕捉要素と細胞相互作用要素）を連結する官能基選択的に開裂可能な部分を開裂させることを提供する。

例示的な水溶性Ｐｄ（ＯＡｃ）₂錯体の構造を示す。例示的な水溶性ホスフィンの構造を示す。例示的な水溶性ホスフィンの構造を示す。例示的な水溶性ホスフィンの構造を示す。例示的な水溶性ホスフィンの構造を示す。遷移金属塩及び配位する配位子から官能基選択性物質を形成させるための例示的な反応スキームを示す。官能基選択性物質を用いてアリルカルバマートリンカーを開裂させる例示的な触媒サイクルを示す。開裂されたアリルカルバマートとの反応の前（左）及び後（右）の例示的な求核剤を示す。開裂されたアリルカルバマートとの反応の前（左）及び後（右）の例示的な求核剤を示す。色素−クロロアルカン複合体とＨＡＬＯＴＡＧとの反応（左上）、その後のＰｄ触媒によるアリルカルバマート複合体（ＰＢＩ−５６９６）の官能基選択的な開裂を示す。色素−クロロアルカン複合体とＨＡＬＯＴＡＧとの反応（左上）、その後のＰｄ触媒によるアリルカルバマート複合体（ＰＢＩ−５６９６）の官能基選択的な開裂を示す。溶解物及び細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ＊クロロアルカン複合体の結合動態を示す。溶解物及び細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ＊クロロアルカン複合体の結合動態を示す。溶解物及び細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ＊クロロアルカン複合体の結合動態を示す。細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ７９６クロロアルカン複合体の結合動態、及びＢＩＲＢ７６複合体（ＰＢＩ−５４４６及びＰＢＩ−５８１３）によるＴＨＰ−１細胞におけるＴＨＦα分泌の阻害を示す。細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ７９６クロロアルカン複合体の結合動態、及びＢＩＲＢ７６複合体（ＰＢＩ−５４４６及びＰＢＩ−５８１３）によるＴＨＰ−１細胞におけるＴＨＦα分泌の阻害を示す。細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ７９６クロロアルカン複合体の結合動態、及びＢＩＲＢ７６複合体（ＰＢＩ−５４４６及びＰＢＩ−５８１３）によるＴＨＰ−１細胞におけるＴＨＦα分泌の阻害を示す。ＰＢＩ−５７４１で標識したＨＡＬＯＴＡＧまたはＨＡＬＯＴＡＧ：ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞のイメージングを示す。標識細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。各種溶離法を使用した内在性標的の富化を示す。細胞溶解物及びＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズが及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。細胞溶解物及びＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズが及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。バッファー組成が及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。バッファー組成が及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。バッファー及びホスフィン配位子の性質が及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。バッファー及びホスフィン配位子の性質が及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズに対する開裂効率ならびにバッファー、ホスフィン配位子の性質、及びＰｄ−ホスフィンの比が及ぼす開裂効率に対する影響を示す。ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズに対する開裂効率ならびにバッファー、ホスフィン配位子の性質、及びＰｄ−ホスフィンの比が及ぼす開裂効率に対する影響を示す。作製済みＰｄ−ホスフィン錯体が及ぼす開裂効率に対する影響を示す。作製済みＰｄ−ホスフィン錯体が及ぼす開裂効率に対する影響を示す。ＴＭＲ−クロロアルカン複合体とＨＡＬＯＴＡＧ（左上）との反応、その後のＰｄ触媒によるアリルカルバマート複合体（ＰＢＩ−５７４１及びＰＢＩ−６０４５）の官能基選択的な開裂を示す。ＴＭＲ−クロロアルカン複合体とＨＡＬＯＴＡＧ（左上）との反応、その後のＰｄ触媒によるアリルカルバマート複合体（ＰＢＩ−５７４１及びＰＢＩ−６０４５）の官能基選択的な開裂を示す。ＰＢＩ−５７４１；ＰＢＩ−６０４４；ＰＢＩ−６０４５で標識したＨＡＬＯＴＡＧまたはＨＡＬＯＴＡＧ：ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞のイメージングを示す。標識細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズ（磁性及び非磁性）が及ぼすＰｄ触媒による開裂効率に対する影響を示す。Ｐｄ触媒による開裂にホスフィンが与える影響を示す。Ｐｄ触媒による開裂にホスフィンが与える影響を示す。Ｐｄ触媒による開裂効率に求核剤の性質が与える影響を示す（例は、ＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳについてのものであり、Ｐｄとホスフィンとの比は８：１に維持した）。Ｐｄ触媒による開裂効率に求核剤の性質が与える影響を示す（例は、ＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳについてのものであり、Ｐｄとホスフィンとの比は８：１に維持した）。開裂効率にＰｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ比が与える影響を示す。開裂効率にＰｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ比が与える影響を示す。イブルチニブ−クロロアルカン複合体の構造を示す。溶解物におけるＨＡＬＯＴＡＧへのイブルチニブ−クロロアルカンの結合動態を示す。細胞におけるＨＡＬＯＴＡＧへのイブルチニブ−クロロアルカンの結合動態を示す。さまざまなイブルチニブ−クロロアルカンを用いたイブルチニブ−ＣＡによる、ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズ上のＢＴＫ：ＮＬｕｃ融合体の捕捉効率を示す。ウエスタンブロット解析、ＴＥＶのタンパク質分解による開裂によるＮＡＮＯＬＵＣ（Ｎｌｕｃ）の遊離、Ｐｄ：ＤＡＮＰＨＯＳ比１：８における「Ｐｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_x」２ｍＭによるＢＴＫ：Ｎｌｕｃ融合体の遊離、及びＰｄ：ＤＡＮＰＨＯＳ比１：８における「Ｐｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_x」０．６６ｍＭによるＢＴＫ：Ｎｌｕｃ融合体の遊離を示す。Ｒａｍｏｓ細胞からイブルチニブ−ＣＡ−Ｔ４Ｅ（ＰＢＩ６１３２）で富化した標的の質量分析を示す。タンパク質性の環境における開裂効率に触媒組成が与える影響を示す。タンパク質性の環境における開裂効率に触媒組成が与える影響を示す。タンパク質性の環境における開裂効率にＰｄ／ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳのモル比が与える影響を示す。タンパク質性の環境における開裂効率にＰｄ／ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳのモル比が与える影響を示す。タンパク質性の環境における開裂効率に保存条件が与える影響を示す。タンパク質性の環境における開裂効率に保存条件が与える影響を示す。タンパク質性の環境における開裂効率にパラジウム源が与える影響を示す。ＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン複合体の構造を示す。溶解物中における、ＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン複合体の結合動態にリンカーが与える影響を示す。無傷細胞内における、ＨＡＬＯＴＡＧへのＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン複合体の結合動態にリンカーが与える影響を示す。ＢＩＲＢ７９６の力価にリンカーが与える影響を示す。各種溶離法を使用したＢＩＲＢ７９６複合体によるＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９の富化にリンカーが与える影響を示す。ＮＬｕｃ抗体を用いたウエスタンによる解析。ＣＡ−Ｔ１及びＣＡ−Ｔ４Ｅにそれぞれ、競合的溶出及び化学的開裂を使用して結合させたＢＩＲＢ７９６によってＴＨＰ−１細胞から富化した標的の質量分析を示す。ポナチニブ−クロロアルカン複合体の構造を示す。開裂可能なクロロアルカンタグの特性にカルバマート基が与える影響を示す。溶解物中におけるＨＡＬＯＴＡＧへのポナチニブ複合体の結合動態。開裂可能なクロロアルカンタグの特性にカルバマート基が与える影響を示す。無傷細胞内におけるＨＡＬＯＴＡＧへのポナチニブ複合体の結合動態。開裂可能なクロロアルカンタグの特性にカルバマート基が与える影響を示す。ポナチニブ複合体による精製ＡＢＬ１の阻害。開裂可能なクロロアルカンタグの特性にカルバマート基が与える影響を示す。ポナチニブ複合体による細胞内でのＳＴＡＴ５レポーター発現阻害。

定義
本明細書において、用語「官能基選択的」及びその派生語（例えば、「官能基選択的に」）は、特定の官能基、部分、または一組の官能基に対する、薬剤（「官能基選択性物質」）の化学的に選択的な反応性または触媒作用を指す。「官能基選択的に開裂可能な基」は、適切な条件（例えば、適切な官能基選択性物質）に曝露した場合に切断される化学部分である。本明細書において、「細胞透過性がある」という用語は、化合物または他の組成物が生細胞の細胞膜を横断する能力を指す。本明細書において、「細胞適合性がある」という用語は、化合物、または他の組成物が、実質的に、分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ）または分解（ｄｅｇｒａｄｉｎｇ）を受けることなく細胞内部に留まる能力を指す。本明細書において、「タンパク質性の環境」という用語は、タンパク質濃度が０．１ｍｇ／ｍｌより大きい局所条件を指す。「高度にタンパク質性の環境」は、タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌより大きい局所条件を指す。本明細書において、本明細書で「Ｚ」基として示される「細胞相互作用要素」という用語は、細胞成分（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸（例えば、特定の配列など）など）と相互作用する（例えば、共有結合または非共有結合で結合する）、または「被験細胞相互作用要素」の場合、細胞成分（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸（例えば、特定の配列など）など）と相互作用する可能性のある、任意の分子部分（例えば、低分子（例えば、薬物、毒素、反応性基、ペプチドなど）など）を指す。本明細書において、本明細書で「Ｑ」基として示される「捕捉要素」という用語は、対応する「捕捉物質」と、共有結合または安定な非共有結合で相互作用する分子成分を指す。本明細書において、「機能的要素」という用語は、本明細書の組成物、方法、及び系において、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって連結されている「細胞相互作用要素」及び「捕捉要素」を指す。本明細書に記載する実施形態に利用され得る他のさらなる機能的要素は、「位置特定要素」、「検出要素」などを含む。

本明細書において、「直鎖状につながれた原子」という用語は、鎖またはポリマーの骨格原子を指すが、主鎖または骨格を形成しないペンダント鎖、側鎖、またはＨ原子は除く。

本明細書において、「野生型」という用語は、遺伝子または遺伝子産物、天然に生じる資源から単離された遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する当該遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、母集団において最も高頻度で観察される遺伝子であることから、その遺伝子の「野生型」として指定される物を言う。対照的に、用語「変異体」とは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／または機能特性における改変（例えば、改変された特徴）を提示する遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に生じる変異体を単離することができ、これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に改変された特徴を有していることで同定されるということに留意されたい。

本明細書において、用語「固体支持体」は、試薬、例えば基質、変異体タンパク質、薬物様分子、及び他の被験成分が付着する、もしくはし得る、任意の固体材料または固定材料に関して使用される。固体支持体の例には、顕微鏡スライド、マイクロタイタープレートのウェル、カバーガラス、ビーズ、粒子、樹脂、細胞培養フラスコ、ならびに他の多くの好適な物品が挙げられる。ビーズ、粒子、または樹脂は、磁性または常磁性であり得る。

本明細書において、用語「対象化合物」は、標的分子、例えば、タンパク質、核酸などに結合し得る薬物、薬物様化合物、生体分子、低分子、毒素、ペプチドなどを指すために使用される。いくつかの実施形態では、対象化合物を細胞相互作用要素または被験細胞相互作用要素として使用する。

本明細書に記載する組成物に言及する場合（特に明記しない限り）、全体を通して本文及び構造において以下の一文字表記を使用する。「Ａ」は炭素２個以上のアルカンであり、
「Ｄ」は、「Ｖ」と反応した場合に共有結合を形成する反応性基であり、
「Ｅ」はヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）であり、
「Ｇ」はＹ基、Ｍ基、及び／またはＬ基であり、
「Ｌ」はリンカー部分であり、
「Ｍ」はアルキルカルバマートであり、
「Ｑ」は捕捉要素であり、
「Ｒ」は有機官能基であり、
「Ｖ」は、「Ｄ」と反応した場合に共有結合を形成する反応性基であり、
「Ｘ」はハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉなど）であり、
「Ｙ」は、適切な官能基選択性物質（例えば、アリル−ヘテロ原子（例えば、アリルカルバマート）、プロパルギル−ヘテロ原子など）との相互作用によって開裂可能な、官能基選択的に開裂可能な部分であり、
「Ｚ」は、細胞内標的と結合することができる細胞相互作用要素である。

本明細書は、機能的要素（例えば、細胞相互作用要素及び捕捉要素）を係留（例えば、共有結合で）させるための、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ官能基選択的に開裂可能なリンカー、及びそれを使用する（例えば、細胞内標的の細胞内捕捉と細胞外遊離）方法を提供する。

Ｉ．構造
いくつかの実施形態では、一般分子式Ｚ−Ｙ−Ｑを含む組成物を提供し、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な基であり、Ｑは捕捉要素（または他の機能的要素）である。組成物は、１つ以上のリンカー部分（例えば、Ｌ¹、Ｌ²など）をさらに含んでよく、一般分子式がＺ−Ｌ−Ｙ−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ−ＱまたはＺ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑであってよい。組成物は、官能基選択的に開裂可能な部分を２つ以上含んでよい。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素、官能基選択的に開裂可能な基、捕捉要素、及び任意選択によるリンカー（複数可）を組み合わせたものは細胞透過性及び細胞適合性である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基は、官能基選択的な開裂物質の存在下、緩和な条件下（例えば、生理的条件、中性付近ｐＨ、室温付近など）で開裂可能である。

いくつかの実施形態では、基質は式：Ｚ−Ｙ−Ｑの化合物を最小限含み、式中、Ｚは細胞相互作用要素（または他の機能的要素）であり、ここで、Ｙはアリルカルバマート基（例えば、−ＮＨＣＯＯＣＨ₂ＣＨＣＨ−）であり、ここで、Ｑは捕捉要素（または他の機能的要素）である。いくつかの実施形態では、ＺとＹは、Ｌ（例えば、Ｚ−Ｌ−Ｙ−）によって分離されてよく、ここで、ＬはＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖である。いくつかの実施形態では、ＹとＱは、Ｍ（例えば、−Ｙ−Ｍ−Ａ−）によって分離されてよく、ここで、Ｍはアルキルカルバマート基である。いくつかの実施形態では、ＹとＭは、Ｌ（例えば、−Ｙ−Ｌ−Ｍ−）によって分離されてよく、ここで、ＬはＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖である。いくつかの実施形態では、ＭとＡは、Ｌ（例えば、−Ｍ−Ｌ−Ｑ）によって分離されてよく、ここで、ＬはＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖である。好適な基質は、Ｚ−Ｙ−Ｑ、Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｑ、Ｒ−Ｙ−Ｌ₂−Ｑ、Ｚ−Ｌ₁−Ｙ−Ｌ₂−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ｑ、Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ｍ−Ｑ、Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ｑ、Ｚ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｍ−Ｑ、Ｚ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ｌ₂−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ−Ｍ−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ−Ｍ−Ｌ−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｍ−Ｌ−Ｑ、Ｚ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｍ−Ｌ−Ｑ、Ｚ−Ｙ−Ｌ−Ｙ−Ｑ、Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ｙ−Ｌ−Ｑなどを含む。

Ａ．官能基選択的に開裂可能な基
いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基は、適切な官能基選択性物質に曝露した場合に化学的に開裂することができる任意の化学部分である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基は、リンカー（例えば、直鎖リンカー）として機能して、他の２つの部分（例えば、細胞相互作用要素及び捕捉要素）をつなぐことができる。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基は２つの基を連結し、かかる官能基選択的に開裂可能な基が官能基選択的に開裂されると、２つの基は互いに遊離する。例えば、官能基選択的に開裂可能な基Ｙによって、細胞相互作用要素Ｚが捕捉物質Ｑに係留される（例えば、Ｚ−Ｙ−Ｑ）。Ｙが化学的に開裂されてＹ¹とＹ²になると、Ｚ及びＱの係留は解除される（例えば、Ｚ¹−Ｙ¹及びＹ²−Ｑ）。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な好適な基は細胞透過性である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な好適な基は、それらが成分となっている組成物の細胞透過性を妨げない。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な好適な基は、それらが成分となっている組成物の細胞透過性に負の影響を及ぼさない。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な好適な基は細胞適合性である。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な好適な基は、それらが成分となっている組成物の細胞適合性を妨げない。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な好適な基は、それらが成分となっている組成物の細胞適合性に負の影響を及ぼさない。官能基選択的に開裂可能な部分は本明細書に明確に記載されているものに限定するわけではないが、以下は、本明細書の実施形態に利用される官能基選択的に開裂可能な部分の例である。

１．アリル含有基
本明細書に記載する組成物及び方法に利用される、官能基選択的に開裂可能な基としてアリル−ヘテロ原子基が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、官能基選択的に開裂可能な基は下記式のものであってよく、

式中、Ｅは、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ（例えば、任意の好適な酸化状態）、Ｐ（例えば、任意の好適な酸化状態）、Ｓｅ）であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁶は有機部分であり、例えば、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、ヘテロアリール、アミド、エステル、カルバマート、カーボネート、尿素、チオ尿素、スルファミド、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸などから選択される。ＥがＮまたはＰである実施形態では、Ｅ基は、Ｈまたは本明細書に記載する他の有機官能基もしくは有機ヘテロ官能基でさらに置換されてよい。いくつかの実施形態では、Ｒ⁶は、

を含む。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルエーテルであり、例えば、式

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁶はアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含む］で表されるものである。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルアミンであり、例えば、式

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、及びＲ⁷は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁶はアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含む］で表されるものである。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基は硫化アリルであり、例えば、式

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、及びＲ⁵は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁶はアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含む］で表されるものである。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルスルホキシドであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルスルホンであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルセレニド（ａｌｌｙｌｓｅｌｅｎｉｄｅ）であり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルエステルであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルアミドであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリル尿素であり、例えば、式

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁷、及びＲ⁸は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁶はアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含む］で表されるものである。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルカルボナートであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルカルバマートであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はアリルビス−ヘテロ原子であり、例えば、式

［式中、Ｒ²〜Ｒ⁹は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、二重結合の立体配置はＥまたはＺ、例えば、

である］で表されるものである。

いくつかの実施形態では、Ｅ及びＥ’は、互いに独立して、Ｎ、Ｓ、及びＯから選択され、Ｅ及びＥ’は同一または異なるヘテロ原子であってよい。いくつかの実施形態では、Ｒ⁶及びＲ⁷は、互いに独立して、

を含む。

一般に、アリル−ヘテロ原子型（例えば、アリルカルバマート、アリルカーボナート、アリル尿素、アリルアミド、アリルエステル、アリルアミン、アリルエーテルなど）の官能基選択的に開裂可能な基は、アリル置換（例えば、ＰｄまたはＲｕで触媒）によって開裂可能である。例えば、

である。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能なアリル−ヘテロ原子リンカーを含む組成物をＰｄまたはＲｕ触媒（例えば、他の生理学的または細胞内条件下で）に曝露させることにより、リンカーの開裂が生じる。

２．プロパルギル含有基
本明細書に記載する組成物及び方法に利用される、官能基選択的に開裂可能な基にはプロパルギル−ヘテロ原子基が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、官能基選択的に開裂可能な基は下記式のものであってよく、

式中、Ｅは、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ）であり、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁴は有機部分であり、例えば、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、ヘテロアリール、アミド、エステル、カルバマート、カーボネート、尿素、チオ尿素、スルホンアミド、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸などから選択される。ＥがＮまたはＰである実施形態では、Ｅ基は、Ｈまたは本明細書に記載する他の有機官能基もしくは有機ヘテロ官能基でさらに置換されてよい。いくつかの実施形態では、Ｒ⁴は、

を含む。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギルエーテルであり、例えば、式

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁴はアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含む］で表されるものである。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギルアミンであり、例えば、式

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、及びＲ⁴は各々、互いに独立して、Ｈ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含み、Ｒ⁵はアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはそれより長いかもしくは分岐した型（例えば、イソプロピル））、アリール、またはヘテロアリールを含む］で表されるものである。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギルエステルであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギルアミドであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギル尿素であり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギルカルボナートであり、例えば、式

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な基はプロパルギルカルバマートであり、例えば、式

一般に、プロパルギル−ヘテロ原子型の官能基選択的に開裂可能な基は、パラジウムまたは他の遷移金属による開裂によって開裂可能である。例えば、

である。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能なプロパルギル−ヘテロ原子リンカーを含む組成物をＰｄまたはＲｕ触媒（例えば、他の生理学的または細胞内条件下で）に曝露させることにより、リンカーの開裂が生じる（Ｌｉｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１４，６，３５２．；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

Ｂ．リンカー部分
いくつかの実施形態では、リンカー部分（例えば、Ｌ¹、Ｌ²など）、例えば、官能基選択的に開裂可能な基と細胞相互作用要素または捕捉要素とをつなぐリンカー部分は、本明細書の組成物の一部として提供される。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素または捕捉要素をつなぐ「リンカー」は、官能基選択的に開裂可能な部分（Ｙ）及び０、１つ、２つ、またはそれ以上の「リンカー部分」（Ｌ¹、Ｌ²など）を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、アルキル鎖、アルケニル鎖、またはアルキニル鎖の任意の組み合わせ、及び主鎖ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐなど）を含む、直鎖または分岐鎖である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、＝Ｃ＝、炭素−炭素三重結合、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ、ＳＨ、ＯＨ、ＣＮなどから選択される１つ以上の骨格基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、任意の好適な有機官能基を含む、１つ以上の置換基、ペンダント、側鎖などを含む。

いくつかの実施形態では、リンカーは、各元素／部分が他の要素／部分の存在による影響を受けずに機能できるよう、機能的要素と官能基選択的に開裂可能な部分との間に十分な距離を提供する。例えば、リンカーは、十分な距離を提供して、捕捉要素が捕捉物質と結合でき、細胞相互作用要素が細胞内標的と結合でき、かつ官能基選択的に開裂可能な部分が官能基選択性物質基質により開裂される（例えば、部分／要素間の障害がない、または障害が抑制されている）ようにする。

本明細書で使用するリンカー部分は単共有結合ではない（そのような単共有結合の連結は、例えば、Ｚ−ＹまたはＹ−Ｑのように表される）。いくつかの実施形態では、リンカーは、第１と第２の機能的要素（例えば、Ｚ、Ｑ）を長さ約５オングストローム〜約１０００オングストローム（両端の値を含む）で分離する。好適なリンカーは、第１と第２の機能的要素（例えば、Ｚ、Ｑ）を、約５Å、１０Å、２０Å、５０Å、１００Å、１５０Å、２００Å、３００Å、４００Å、５００Å、６００Å、７００Å、８００Å、９００Å、１０００Å、及びそれらの任意の好適な範囲（例えば、５〜１００Å、５０〜５００Å、１５０〜７００Åなど）で分離する。いくつかの実施形態では、リンカーは、第１と第２の機能的要素（例えば、Ｚ、Ｑ）を約１〜２００個の原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、またはそれら任意の好適な範囲（例えば、２〜２０、１０〜５０など））で分離する。

特定の実施形態では、リンカー部分は、アルキルカルバマート基（例えば、（ＣＨ₂）_nＯＣＯＮＨ、（ＣＨ₂）_nＮＨＣＯＯなど）を含む。本明細書のいくつかの構造では、アルキルカルバマートはＭで表される。いくつかの実施形態では、アルキルカルバマートは、ＮＨ末端が機能的要素（例えば、Ｚ、Ｑ）の方へ、またＣＯＯ末端が官能基選択的に開裂可能な部分の方へ向けて配される。いくつかの実施形態では、アルキルカルバマートは、ＣＯＯ末端が機能的要素（例えば、Ｚ、Ｑ）の方へ、またＮＨ末端が官能基選択的に開裂可能な部分の方へ向けて配される。いくつかの実施形態では、リンカーまたはリンカー部分はアルキルカルバマート基を１つ含む。いくつかの実施形態では、リンカーまたはリンカー部分は、アルキルカルバマート基を２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８など）含む。

いくつかの実施形態では、リンカー部分は、Ｚ基の機能性（例えば、捕捉要素（例えば、Ａ−Ｘ、ビオチン、エピトープなど）と捕捉物質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素、ストレプトアビジン、抗体）の間の相互作用）を最適化する距離で、機能的要素（例えば、ＺまたはＱ（例えば、Ａ−Ｘ））とアリルカルバマート（Ｙ）またはアルキルカルバマート（Ｍ）とを分離するように構成される。ある実施形態では、ＺまたはＱと、ＭまたはＹは、１〜２００の直鎖状につながれた原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、またはそれらの任意の好適な範囲（例えば、２〜２０、１０〜５０、６〜１８（例えば、（ＣＨ２）₆Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）_6~18など）など）で分離される。組成物が−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｘまたは−Ｍ−Ｌ−Ａ−Ｘ（かつ、ＬはＭもＹも含まない）を含むいくつかの実施形態では、ＡとＬは合わせて１〜２００の直鎖状につながれた原子を含む（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、またはそれらの任意の好適な範囲（例えば、２〜２０、１０〜５０、６〜１８））。いくつかの実施形態では、ＡとＬ²は、９〜１５の直鎖状につながれた原子（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）を含む。いくつかの実施形態では、ＡとＬ²は１２の直鎖状につながれたＣ原子、Ｎ原子、及び／またはＯ原子（例えば、（ＣＨ₂）₆Ｏ（ＣＨ₂）₂Ｏ（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₆（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₆Ｏ（ＣＨ₂）₂（ＣＨ₂）₃など）を含む。

いくつかの実施形態では、リンカーは、官能基とカルバマートの間の相互作用を減弱させる距離で、Ｚ基またはＱ基と、最近位のカルバマート（例えば、ＭまたはＹ）とを分離するように構成される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、１超の直鎖状につながれたＣ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、及び／またはＯ原子を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、１つ以上のアルキルカルバマート基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、１つ以上のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基など）を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、Ｏ（ＣＨ₂）₂基または（ＣＨ₂）Ｏ基を１つ以上（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００）含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、１〜２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、またはそれらの任意の好適な範囲（例えば、２〜２０、１０〜５０、６〜１８））の直鎖状につながれた原子を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、１〜２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、またはそれらの任意の好適な範囲（例えば、２〜２０、１０〜５０、６〜１８））の原子が直鎖状につながれた長さである。

Ｃ．機能的要素
本明細書は、本明細書に記載する組成物及び方法において有用な２つの機能的要素（例えば、捕捉要素（Ｑ）及び細胞相互作用要素（Ｚ））を含む組成物を提供する。機能的要素は、自身が付着している組成物に対して機能または潜在的機能を提供する分子成分または高分子成分である。そのような機能は、本明細書に記載する組成物またはタンパク質もしくはそれに結合している融合体の単離、精製、検出、位置の特定、固定化などを行う際に有用であり得る。いくつかの実施形態では、機能的要素は、細胞成分（例えば、細胞相互作用要素）と相互作用する。いくつかの実施形態では、機能的要素は、捕捉物質（例えば、捕捉要素）と結合する。本明細書の実施形態では、捕捉物質と細胞相互作用要素とをつなぐ、官能基選択的に開裂可能なリンカーとして、最も典型的な形態を記載しているが、実施形態をそのように限定するものではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する官能基選択的に開裂可能なリンカーは、機能的要素の他の対（例えば、検出要素、細胞内位置特定要素など）をつなぐ。

いくつかの実施形態では、第１の機能的要素（例えば、細胞相互作用要素（Ｚ））は、第２の機能的要素（例えば、捕捉要素（Ｑ））に、官能基選択的に開裂可能な部分（Ｙ）及び任意選択で１つ以上のリンカー部分（例えば、Ｌ、Ｌ１、Ｌ２など）を介して共有結合で連結される。本明細書で提供する範囲内である組成物の好適な配置には、例えば、Ｚ−Ｙ−Ｑ、Ｚ−Ｌ−Ｙ−Ｑ、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑなどが含まれる。いくつかの実施形態では、そのような組成物の場合、機能的要素はその機能特性（例えば、細胞内標的への結合、捕捉物質への結合など）を保持する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、細胞適合性であり、かつ／または細胞透過性である。したがって、好適な機能的要素（例えば、細胞相互作用要素、捕捉要素）は、そのような組成物において細胞適合性及び／または細胞透過性があるものである。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって連結されている機能的要素を含む組成物は、細胞外で加えた場合に、細胞膜を通過して細胞に侵入することができる（例えば、拡散、エンドサイトーシス、能動輸送、受動輸送などを介する）。いくつかの実施形態では、好適な機能的要素は、それらの特定の機能の他、細胞適合性及び細胞透過性に基づいて選択される。

１．細胞相互作用要素
いくつかの実施形態では、組成物は、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって別の機能的要素（例えば、捕捉要素）に連結されている細胞相互作用要素を含む。細胞相互作用要素は、１つ以上の細胞の（例えば、細胞内の）成分と相互作用する生理学的かつ／または薬理学的に活性な物質である。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素には、低分子（例えば、薬物、薬物様分子、毒素、被験化合物など）、アミノ酸（例えば、天然に生じるアミノ酸または非天然アミノ酸）、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素は、細胞内条件下で細胞内標的と結合する（例えば、共有結合または非共有結合）。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素は、細胞内条件下で細胞内標的との安定な相互作用を形成し、そのような相互作用を緩和なプロセス条件及び分析条件下（例えば、中性付近ｐＨ（例えば、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、及びそれらの任意の好適な範囲のｐＨ）、室温、低濃度の変性物質または他の不安定化分子など）で維持する。

いくつかの実施形態では、細胞内標的は、細胞相互作用要素（例えば、低分子、ペプチド、核酸、脂質など）に対する任意の好適な結合／相互作用のパートナー（例えば、受容体、酵素）を含む。特定の実施形態では、細胞内標的は、細胞相互作用要素に結合するか、そうでなければ細胞相互作用要素と相互作用する（例えば、安定に相互作用する）タンパク質である。より詳細な実施形態では、細胞内標的は、低分子細胞相互作用要素に結合するか、そうでなければ低分子細胞相互作用要素と相互作用する（例えば、安定に相互作用する）受容体タンパク質または酵素である。本明細書の実施形態は、細胞内標的の同一性、種類、またはクラスによって制限されるものではない。

いくつかの実施形態では、細胞内標的は、アッセイ実施対象の細胞の内在性細胞成分である。他の実施形態では、アッセイ実施対象の細胞に細胞内標的を発現させる。いくつかの実施形態では、細胞内標的を、かかる細胞内標的にとっての内因性レベルまたは近傍レベル（例えば、天然の存在量）で（例えば、細胞内標的の過剰発現はない）発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書の方法により、細胞（または細胞溶解物）に存在する内在性の細胞内標的の捕捉が可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書の方法により、天然または内在性の存在量またはその近傍存在量で細胞に存在する細胞内標的を捕捉し、これによりアッセイの生物学的関連性を最大限に引き出すことが可能になる。ある実施形態では、こうした方法により細胞内標的の内在性レベルでの捕捉が可能になることから、かかる方法は、細胞相互作用要素の不明標的を捕捉するのに有用である。

２．捕捉要素
いくつかの実施形態では、組成物は、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって別の機能的要素（例えば、細胞相互作用要素）に連結されている捕捉要素を含む。捕捉要素は、非共有結合型相互作用によって安定な複合体を形成するか、または特定の捕捉物質と共有結合による連結を形成する分子成分である。

いくつかの実施形態では、捕捉要素はタンパク質（例えば、酵素）に対する基質であり、捕捉物質はそのタンパク質である。いくつかの実施形態では、捕捉要素は「共有結合性基質」または、反応対象のタンパク質または酵素と共有結合を形成するものである。基質は、酵素との相互作用時に酵素と共有結合を形成する反応性基（例えば、改変基質）を含み得るか、または酵素は、共有結合で結合している中間体を基質に一致させることができない変異体型であり得る。いくつかの実施形態では、基質は、かかる基質と共有結合を形成する変異体タンパク質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）によって認識される。そのような実施形態では、基質と野生型バージョンのタンパク質（例えば、脱ハロゲン酵素）とを相互作用させると生成物が形成され野生型タンパク質が再生されるが、基質（例えば、ハロアルカン）と変異体バージョンのタンパク質（例えば、脱ハロゲン酵素）とを相互作用させると、タンパク質と基質の間に安定な結合が形成される（例えば、共有結合の形成）。基質は、自身の基質と超安定な結合または共有結合を形成するよう改変されている任意の変異体タンパク質に対する任意の好適な基質であってよく、通常、かかるタンパク質による結合は一過性にすぎないであろう。いくつかの実施形態では、タンパク質は変異体加水分解酵素または脱ハロゲン酵素である。いくつかの実施形態では、タンパク質は変異体脱ハロゲン酵素であり、基質はハロアルカンである。いくつかの実施形態では、ハロアルカンは、末端をハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉなど）で封止されたアルカン（例えば、Ｃ₂〜Ｃ₂₀）を含む。いくつかの実施形態では、ハロアルカンは式Ａ−Ｘで表され、式中、Ｘはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉなど）であり、Ａは２〜２０個の炭素を含むアルカンである。ある実施形態では、Ａは炭素２〜１２個の直鎖セグメントを含む。ある実施形態では、Ａは炭素２〜１２個の直鎖セグメントである。いくつかの実施形態では、ハロアルカンは、変異体脱ハロゲン酵素との相互作用を妨げない、任意のさらなるペンダント基または置換基を含んでよい。

いくつかの実施形態では、捕捉物質はＳＮＡＰタグであり、捕捉要素はベンジルグアニンである（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｒｉｖａｔＧ、ＴａｒａｓｋａＪＷ（２０１２年１月）．ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３０（１）：８−１６．を参照のこと）。いくつかの実施形態では、捕捉物質はＣＬＩＰタグであり、捕捉要素はベンジルシトシンである（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧａｕｔｉｅｒ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏｌ．２００８Ｆｅｂ；１５（２）：１２８−３６．を参照のこと）。

自身の基質（例えば、ハロアルカン基質）と共有結合で結合する変異体タンパク質を含む系（例えば、変異体加水分解酵素（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）は、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ある実施形態では、基質は、脱ハロゲン酵素、例えば、ハロアルカン脱ハロゲン酵素または脂肪族もしくは芳香族のハロゲン化基質における炭素−ハロゲン結合を開裂させる脱ハロゲン酵素に対する基質、例えばＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍもしくはＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒの脱ハロゲン酵素に対する基質であるか、またはセリン・ベータ−ラクタマーゼに対する基質である。いくつかの実施形態では、基質には、任意選択で、かかる基質の反応性基と１つ以上の官能基とを物理的に分離するリンカーが含まれる。例えば、基質には、その基質の１つ以上の官能基がタンパク質（例えば、脱ハロゲン酵素）と基質の反応性基（例えば、ハロアルカン）との相互作用を妨げないよう、長さ、構造、電荷、及び疎水性が十分であるリンカーが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、捕捉要素は「親和性分子」であり、捕捉物質は、そのような親和性分子と選択的に相互作用する「受容体」（例えば、低分子、タンパク質、抗体など）である。そのような対には、捕捉物質としての抗体と捕捉要素としての抗原；捕捉要素としてのＨｉｓタグと捕捉物質としてのニッケルカラム；捕捉物質としてのタンパク質と捕捉要素としての高親和性低分子（例えば、ストレプトアビジンとビオチン）などが含まれると考えられる。したがって、親和性分子を含む組成物は、例えば、親和性分子と受容体（例えば、生物由来または生物由来ではない受容体分子）との選択的相互作用に基づいて細胞から分離される。受容体分子は、溶液中で遊離していても、または固体支持体に付着していてもよい。いくつかの実施形態では、親和性分子に連結されている細胞相互作用要素または他の機能的要素は、その後、官能基選択的に開裂可能なリンカーの官能基選択的な開裂によって受容体から遊離する（例えば、細胞の捕捉物質に結合している細胞内標的の検出または精製を可能にする）。

例えば、親和性分子が相互作用する特定の分子（受容体分子と呼ぶ）は、有機低分子、スルフヒドリル基（−ＳＨ）などの化学基、または親和性分子に対する抗体もしくは他の天然に生じるリガンドなどの生体高分子であろうと考えられる。結合は通常、化学的なものであり、共有結合もしくは非共有結合の形成またはイオン結合もしくは水素結合などの相互作用の形成を伴い得る。受容体分子は、溶液中で遊離しているか、または固体もしくは半固体の表面、ポリマーマトリックスに結合しているか、または固体もしくは半固体の基質上に存在し得るであろう。相互作用は、外部因子、例えば、光、温度、圧力、または触媒として作用する化学的もしくは生物学的分子の付加によって誘発されてもよい。親和性分子と受容体分子の間に相互作用（通常、一種の結合）が起きるために反応混合物から複合体が検出及び／または分離される。

親和性分子の例には、免疫原性分子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質のエピトープ（例えば、その分子に特異的な抗体を調製するために有用な任意の分子））；ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びその誘導体；金属結合分子；ならびにこれらの分子の断片及び組み合わせといった分子が含まれる。例示的な親和性分子には、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）、Ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＳｔｅｐｔＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド、Ｃ末端ＲＮＡタグ、金属結合ドメイン、金属結合反応性基、アミノ酸反応性基、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、親和性相互作用により、さまざまな表面に対する本明細書に記載の組成物の細胞外での（例えば、細胞溶解後）付着が促進される。好適な表面には、クロマトグラフィー分離用樹脂、組織培養表面または結合プレートのようなプラスチック、マイクロタイター皿及びビーズ、セラミックス及びガラス、磁性粒子などの粒子、ポリマー及び他のマトリックスが挙げられる。場合によっては、これらの材料は、光ファイバー、ｃｈｅｍｆｅｔ、及びプラズモン検出器などの生体分子検出装置の一部であってよい。

親和性分子の別の例はダンシルリジン（ｄａｎｓｙｌｌｙｓｉｎｅ）である。ダンシル環と相互作用する抗体は市販されているが（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ；ミズーリ州セントルイス）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，１９８８）に記載のような公知のプロトコルを使用して調製することもできる。例えば、抗ダンシル抗体を、クロマトグラフィーカラムの充填材に固定化させる。この方法、すなわちアフィニティーカラムクロマトグラフィーでは、固定化された抗体との相互作用によりカラムに保持されるべき基質と変異体加水分解酵素との複合体が生じ、それ以外の分子はカラムを通過することにより、分離が達成される。その後、抗体−抗原間の相互作用の破壊によって複合体を遊離させる。特定のクロマトグラフィーカラム材料、例えば、イオン交換またはアフィニティー用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ及び他のクロマトグラフィー用樹脂が市販されている（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ；ミズーリ州セントルイス；ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ；ニュージャージー州ピスカタウェイ）。ダンシルリジンは、その蛍光特性のため好都合に検出され得る。

抗体を受容体分子として用いる場合、免疫沈降法及びフィルターまたは他の表面、例えばビーズ、プレートもしくは樹脂への抗体の固定化といった他の生化学的分離法を介して分離を実施することもできる。例えば、組成物は、親和性分子特異的または他の機能的要素特異的な抗体を用いて磁性ビーズをコートすることによって単離され得る。ビーズは、磁場を用いて混合物から分離されることが多い。

親和性分子を有する複合体を検出及び／または単離する方法には、ゲル濾過液体クロマトグラフィー、高速（ｆａｓｔ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ）液体クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術が挙げられる。タンパク質を分離する他の方法もまた、変異体加水分解酵素と基質の複合体の検出及びその後の単離に有用であり、例えば、電気泳動、等電点電気泳動及び質量分析法がある。

３．他の官能基
本明細書に記載する組成物は、官能基選択的に開裂可能な部分によって共に係留された２つの機能的要素を含む。本明細書に記載するほとんどの実施形態では、機能的要素は細胞相互作用要素及び捕捉要素であるが、本明細書で提供する範囲の実施形態のように限定されるものではない。むしろ組成物は、細胞相互作用要素または捕捉要素に係留されるかまたは互いに係留している、異なる機能を有する他の機能要素を含んでよい。本明細書に記載する実施形態に利用され得る他の例示的な機能的要素を以下に記載する。

いくつかの実施形態では、機能的要素には、低分子（例えば、薬物、薬物様分子、毒素、被験化合物など）、アミノ酸（例えば、天然に生じるアミノ酸または非天然アミノ酸）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、酵素、補因子、補酵素、酵素に対するペプチドまたはタンパク質基質、例えば、分岐ペプチド基質（例えば、Ｚ−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−４−ニトロベンジルアミド（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）（ＮＢＡ）、自殺基質、または受容体）、１つ以上のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰまたはＧＤＰ）とその類似体、例えば、オリゴヌクレオチド、ある遺伝子またはその部分に対応する二本鎖または一本鎖ＤＮＡ（例えば、転写因子のようなタンパク質と結合することができるＤＮＡ）、ある遺伝子に対応するＲＮＡ（例えば、終止コドンを欠くｍＲＮＡ、またはその部分）、ＲＮＡｉまたはそのためのベクターのための二本鎖ＲＮＡ、糖タンパク質、多糖類、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、脂質二重層などの脂質、薬物（例えば、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、またはｃａｍｐｔｏｓａｒ（ＣＰＴ−１１；イリノテカン）のような化学療法薬）、アミノアシル化された開始ｔＲＮＡもしくはアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡのようなアミノアシル化ｔＲＮＡ、Ｃａ²⁺と結合する分子、Ｋ⁺と結合する分子、Ｎａ⁺と結合する分子、ｐＨ感受性分子、放射性核種、電子顕微鏡観察で高電子密度の分子、造影剤（例えば、バリウム、ヨウ素または他のＭＲＩもしくはＸ線用造影剤）、ＮＯの存在下で蛍光を発するかまたは活性酸素に対して感受性を示す分子、ナノ粒子（例えば、イムノゴールド粒子、常磁性ナノ粒子、アップコンバージョンするナノ粒子、または量子ドット）、酵素に対するタンパク質以外の基質、酵素阻害物質（可逆性または非可逆性阻害物質）、キレート剤、架橋基（例えば、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド）、グルタチオン、ビオチンまたは他のアビジン結合分子、アビジン、ストレプトアビジン、ｃＡＭＰ、ホスファチジルイノシトール、ヘム、ｃＡＭＰの配位子、金属、ＮＴＡが含まれるが、これらに限定されるものではなく、また一実施形態では、１つ以上の色素、例えば、キサンテン色素、カルシウム感受性色素、例えば、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）−フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（Ｆｌｕｏ−３）、ナトリウム感受性色素、例えば、１，３−ベンゼンジカルボン酸、４，４’−［１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン−７，１６−ジイルビス（５−メトキシ−−６，２−ベンゾフランジイル）］ビス（ＰＢＦＩ）、ＮＯ感受性色素、例えば、４−アミノ−５−メチルアミノ−２’，７’−ジフルオレセイン（ｄｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、または他の蛍光団（例えば、カルボキシローダミン類似体、例えば、米国特許第１３／６８２，５８９号を参照のこと）が含まれる。いくつかの実施形態では、機能的要素は、ハプテンまたは免疫原性分子、例えば、その分子に特異的な抗体によって結合している分子である。いくつかの実施形態では、官能基は、放射性核種または放射性核種の配位子（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒ）、例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉを含み、これには診断法に有用な分子が含まれる。

ある実施形態では、機能的要素は、それに結合している組成物及び／またはタンパク質もしくは融合体の検出を可能にする、検出可能な特性を有する。検出可能な機能的要素には、電磁スペクトル特性、例えば、放出もしくは吸収、磁力、電子スピン共鳴、電気容量、誘電率または電気伝導率が特徴的なもの、ならびに強磁性官能基、常磁性官能基、反磁性官能基、発光性官能基、電気化学発光性官能基、蛍光性官能基、リン光発光性官能基、色官能基、抗原性官能基、または特徴的質量を有する官能基が含まれる。機能的要素には、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド）、タンパク質（例えば、発光タンパク質、ペプチド、造影剤（例えば、ＭＲＩ造影剤）、放射性核種、親和性タグ（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）、ハプテン、アミノ酸、脂質、脂質二重層、固体支持体、蛍光団、発色団、レポーター分子、放射性核種、電子顕微鏡観察で高電子密度の分子、ＭＲＩ造影剤（例えば、マンガン、ガドリニウム（ＩＩＩ）、または酸化鉄粒子）、またはその配位子（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の機能的要素を検出する方法、または特定の機能的要素及びそれに結合している任意の要素を含む組成物を単離する方法は当業者に公知である。

いくつかの実施形態では、官能基は固体支持体であるかまたは固体支持体を含む。好適な固体支持体には、沈降性粒子（磁性粒子、セファロース、またはセルロースビーズなど）、膜、ガラス（例えば、スライドガラス）、セルロース、アルギン酸塩、可塑性ポリマーもしくは合成により調製した他のポリマー（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブまたはマルチウェルプレートのウェル）、自己組織化単分子膜、表面プラズモン共鳴チップ、または表面が電子伝導性の固体支持体などが挙げられる。

いくつかの実施形態では、機能的要素は光親和性標識基である。いくつかの実施形態では、機能的要素は、細胞内標的に付着するための、光（例えば、ＵＶ）で活性化され得る基（例えば、アジド基）を１つ以上有する細胞内標的に対する配位子である。

例示的な検出可能な機能的要素には、ハプテン（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンのように免疫原性を増強させるために有用な分子）、開裂可能標識（例えば、光開裂性ビオチン）及び蛍光標識（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）修飾クマリン及びスクシンイミドまたはスルホノスクシンイミド（ｓｕｌｆｏｎｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で修飾されたたＢＯＤＩＰＹ（ＵＶ及び／または可視光で励起した蛍光検出により検出可能）、ローダミン（Ｒ１１０、ロードール、ＣＲＧ６、テキサスメチルレッド（ＴＡＭＲＡ）、Ｒｏｘ５、ＦＡＭ、またはフルオレセイン）、クマリン誘導体（例えば、７アミノクマリン、及び７−ヒドロキシクマリン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、１−ヒドロキシピレン、レソルフィン、フェナレノンまたはベンズフェナレノン（ｂｅｎｚｐｈｅｎａｌｅｎｏｎｅ）（米国特許第４，８１２，４０９号））、アクリジノン（米国特許第４，８１０，６３６号）、アントラセン、及びアルファナフトールとベータ−ナフトールの各誘導体、フッ素化されたフルオレセイン及びロードールなどのフッ素化キサンテン誘導体（例えば、米国特許第６，１６２，９３１号）、ならびに生物発光分子（例えば、ルシフェラーゼ（例えば、発光エビ由来ルシフェラーゼ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国出願第１２／７７３，００２号、米国出願第１３／２８７，９８６号を参照のこと）またはＧＦＰもしくはＧＦＰ誘導体）が挙げられる。蛍光性（または生物発光性）の機能的要素を使用してリン酸化のような系内変化をリアルタイムで感知してよい。金属イオンの化学センサーのような蛍光分子を利用して、組成物と結合するタンパク質を標識化してよい。生物発光性または蛍光性の官能基、例えば、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン、ＧＦＰ、または赤外色素は機能的要素として利用され、例えば、相互作用研究（例えば、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、ＬＲＥＴまたは電気泳動を使用するもの）に利用され得る。

別のクラスの機能的要素には、電磁放射を用いて検出可能な分子が含まれ、これらには、キサンテン蛍光団、ダンシル蛍光団、クマリン及びクマリン誘導体、蛍光性アクリジニウム部分、ベンゾピレン系蛍光団、ならびに７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、及び３−Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−２，３−ジアミノ−プロピオン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、蛍光分子は、アミノ酸とは異なる波長における蛍光量子収量が高く、より好ましくは、スペクトルの可視光部分、またはＵＶと可視光の両方の部分で励起され得る蛍光量子収量が高い。あらかじめ選択した波長での励起時、分子は、目視でも、または従来の蛍光検出法を使用しても低濃度で検出可能である。電気化学発光分子、例えば、ルテニウムキレート及びその誘導体またはニトロキシドアミノ酸（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅａｍｉｎｏａｃｉｄ）及びその誘導体は、フェムトモル範囲及びそれ以下で検出可能である。

蛍光分子に加え、電磁場及び電磁放射に対する分子の相互作用と応答に基づく物性を有する多種多様な分子が、本明細書に記載する組成物及び方法に利用される。これらの特性には、電磁スペクトルのＵＶ領域、可視光領域及び赤外領域における吸収、ラマン活性な発色団の存在が含まれ、これらはさらに共鳴ラマン分光法、電子スピン共鳴法による作用及び核磁気共鳴及び分子質量（例えば、質量分析法による）によって増強され得る。

ＩＩ．系
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、系において１つ以上のさらなる要素、組成物、成分、デバイスなどと共に提供される。例えば、細胞透過性／適合性のある組成物（本明細書に記載のもの）は細胞と共に提供されるかまたは細胞に投与される。同様に、組成物は固体支持体と共に提供されてよく、それに対し組成物上の機能的要素が付着してよい。さらに、酵素基質（例えば、ハロアルカン）を含む組成物は、基質と共有結合を形成する変異体タンパク質（例えば、脱ハロゲン酵素）と共に提供されてよい。本明細書の範囲内でさまざまな系に利用される要素、組成物、成分、デバイスなどのいくつかを以下に記載する。

いくつかの実施形態では、系は固体支持体を含む。好適な固体支持体には、沈降性粒子（磁性粒子、セファロース、またはセルロースビーズなど）、膜、ガラス（例えば、スライドガラス）、セルロース、アルギン酸塩、可塑性ポリマーもしくは合成により調製した他のポリマー（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブまたはマルチウェルプレートのウェル）、自己組織化単分子膜、表面プラズモン共鳴チップ、または表面が電子伝導性の固体支持体などが挙げられる。

いくつかの実施形態では、系は、本明細書に記載するような官能基選択的に開裂可能な組成物、及びタンパク質上の機能的要素と安定して相互作用できるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、自身の基質と共有結合を形成するよう改変されている変異体バージョンの酵素である。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、変異体タンパク質、加水分解酵素及び／または脱ハロゲン酵素であり、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号に詳細が記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質、加水分解酵素、及び／または脱ハロゲン酵素は、対応する野生型タンパク質、加水分解酵素または脱ハロゲン酵素に対し、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。変異体タンパク質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）は、組換え技術（例えば、部位特異的変異導入法または再帰的変異導入法）により調製されたものに限られるわけではなく、変異体タンパク質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）に、基質、例えば１つ以上の官能基を含む基質と安定した結合（例えば、共有結合）を形成できる能力を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は変異体加水分解酵素である。ある実施形態では、変異体タンパク質は変異体脱ハロゲン酵素である。少なくとも１つのアミノ酸置換により、変異体タンパク質は基質と共に、対応する野生型タンパク質と基質との間で形成される結合よりも安定な結合を形成する（例えば、共有結合）。変異体タンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換は、対応する野生型タンパク質と基質の間に形成された結合を開裂させる水分子活性化に関連している、対応する野生型タンパク質のアミノ酸残基における置換であるか、または基質とエステル中間体を形成する、対応する野生型タンパク質のアミノ酸残基における置換である。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、対応する野生型タンパク質に対して少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、ここで、１つは、野生型タンパク質において水分子活性化に関連している残基か、または野生型タンパク質において、加水分解酵素に対する基質が求核攻撃することによってエステル中間体を形成する残基における置換であり、もう１つは、野生型タンパク質において、加水分解酵素の基質に対する結合部位（複数可）の残基またはその近傍の残基であるが、対応する野生型タンパク質において水分子活性化に関連している残基、または基質とエステル中間体を形成する残基ではない残基における置換である。一実施形態では、第２の置換は、野生型タンパク質において、基質がタンパク質の触媒ポケット内へ侵入するための部位（複数可）が並ぶ残基における置換である。好ましくは、さらなる置換（複数可）により、対応する野生型タンパク質の基質に結合するそれらの変異体の安定な共有結合形成の割合が増加する。タンパク質、加水分解酵素及び脱ハロゲン酵素の配列及び変異の詳細は、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号、米国特許第７，４２５，４３６号、米国特許第７，４２９，４７２号、米国特許第７，８６７，７２６号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、要素間の安定相互作用は、公知の捕捉／結合系、例えばＳＮＡＰタグ及び／またはＣＬＩＰタグの使用により達成される。

さまざまな実施形態では、系は、変異体タンパク質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）及び対象とするタンパク質またはペプチド（例えば、薬物標的、マーカータンパク質（例えば、選択可能マーカータンパク質、親和性タグ（例えば、ポリヒスチジン配列））、対象酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ＲＮａｓｉｎ、ＲＮａｓｅ、及び／またはＧＦＰ）、核酸結合タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、分泌タンパク質、抗体またはその一部（例えばＦｃ）、生物発光タンパク質、受容体リガンド、調節タンパク質、血清タンパク質、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、反応性システインを有するタンパク質、受容体タンパク質（例えば、ＮＭＤＡ受容体、チャネルタンパク質（例えば、ＨＥＲＧチャネルタンパク質など、ナトリウム、カリウムまたはカルシウムに感受性であるチャネルタンパク質のようなイオンチャネルタンパク質））、膜タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質（例えば、プロテアーゼ基質）、転写因子、タンパク質不安定化配列、または輸送タンパク質（例えば、ＥＡＡＴ１−４グルタメート輸送体）、ならびに移行シグナル（例えば、ミトコンドリア局在化配列、核局在化シグナルまたはミリストイル化配列といった、変異体加水分解酵素を特定の位置へ輸送する、プラスチドを標的とするシグナル））のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。

ある実施形態では、融合タンパク質は、変異体タンパク質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）及び少なくとも１つの対象タンパク質をコードする組換えＤＮＡから発現させるか、または化学合成により生成させる。対象タンパク質を、変異体タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合させてよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、変異体タンパク質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素）のＮ末端に対象タンパク質を、Ｃ末端に別のタンパク質、例えば、異なるタンパク質を含む。例えば、対象タンパク質は蛍光タンパク質または抗体であってよい。任意選択で、融合体のタンパク質はコネクター配列（例えば、少なくとも２つのアミノ酸残基を有するもの、例えば１３〜１７のアミノ酸残基を有するもの）によって分離される。融合タンパク質内にコネクター配列が存在することにより、融合体のいずれかのタンパク質の機能がそれら個々のタンパク質の機能に対して改変されることは実質的にない。したがって、変異体脱ハロゲン酵素とルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、発光エビ−由来のルシフェラーゼ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国出願第１２／７７３，００２号、米国出願第１３／２８７，９８６号を参照のこと））の融合体の場合、コネクター配列の存在により、変異体脱ハロゲン酵素とそれに対する基質の間に形成される結合の安定性またはルシフェラーゼの活性が改変されることは実質的にない。融合体のタンパク質のどのような特定の組み合わせでも、多種多様なコネクター配列を採り入れてよい。いくつかの実施形態では、コネクター配列は、酵素（例えば、開裂可能な配列（例えば、酵素で開裂可能な配列、化学的に開裂可能な配列、光開裂性配列など））によって認識される配列である。

ＩＩＩ．方法
本明細書は、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって連結された一対の機能的要素（例えば、捕捉要素及び細胞相互作用要素）を含む細胞適合性かつ細胞透過性である組成物を利用する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な二重機能性組成物（例えば、細胞相互作用と捕捉）を細胞または細胞集団に細胞外から導入する。組成物は、その細胞透過性により、適切な機序（例えば、受動輸送）によって細胞に侵入する。

いくつかの実施形態では、細胞は、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって連結された２つの機能的要素（例えば、Ｚ−Ｙ−Ｑ、Ｚ−Ｌ−Ｙ−Ｑ、Ｚ−Ｌ¹−Ｙ−Ｌ²−Ｑなど）を含む細胞適合性／透過性の組成物に対して、その組成物が細胞に侵入するような条件下で曝露される。組成物上に提示されている機能的要素の同一性にしたがって、組成物は、細胞内に局在化した１つ以上の細胞成分などと相互作用することになる。その後、官能基選択性物質への曝露と同時に、官能基選択性部分は開裂し、官能基の連結が解除される。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な組成物を官能基選択性物質に曝露する前に、組成物の機能要素を検出する工程、機能的要素を細胞成分と相互作用（例えば、結合）させる工程、細胞の溶解または透過化（例えば、無傷細胞に対する透過性がない細胞成分に対して）を行う工程、機能的要素を表面または固体支持体などに結合させる工程の１つ以上の工程を実施する。

いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な二重機能性組成物は、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質）と相互作用するように構成された第１の機能的要素（例えば、細胞相互作用要素）、及び捕捉物質（例えば、変異体脱ハロゲン酵素、抗体、ストレプトアビジンなど）と結合するように構成された第２の機能的要素（例えば、捕捉要素）とを含み、これらは官能基選択的に開裂可能な部分（例えば、任意選択で、官能基選択的に開裂可能な部分と機能的要素の一方または両方とをつなぐリンカー部分を含む）によってつながれている。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な二重機能性組成物に細胞を曝露させると、組成物が細胞に侵入する（例えば、任意の好適な機序（例えば、受動拡散、能動輸送、エンドサイトーシスなど）による）。いくつかの実施形態では、第１の機能的要素が細胞成分と相互作用（例えば、共有結合または非共有結合）するための時間が許容される。いくつかの実施形態では、細胞を溶解させ、溶解物を捕捉物質（例えば、溶液、固体表面上など）に曝露させる。第２の機能的要素が捕捉物質に結合できるよう時間が与えられる。いくつかの実施形態では、細胞成分に結合した、捕捉された組成物を官能基選択性物質に曝露して官能基選択的に開裂可能な部分を開裂させると、捕捉物質から細胞成分が遊離する。いくつかの実施形態では、遊離した細胞内標的及び／または細胞相互作用要素の検出、特性解析、同定、分析などを行う。

組成物の機能的要素の１つが細胞相互作用要素である実施形態では、組成物を細胞内に適切な時間（例えば、１秒未満、１秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、６時間、１日、２日、もしくはそれ以上、またはその間の任意の好適な範囲）存在させる。いくつかの実施形態では、細胞相互作用要素にとっての細胞内標的が細胞内に存在する場合、細胞内標的と細胞相互作用要素の間で相互作用（例えば、共有結合、非共有結合など）が起きることになる（例えば、適切な時間尺度、所与の適切な細胞条件（例えば、細胞周期の時期）、細胞内標的及び細胞相互作用要素の細胞内での所与の適正な局在化などで）。いくつかの実施形態では、細胞内標的と細胞相互作用要素の相互作用の後、細胞（複数可）を溶解させるか、またはさらに透過処理を行う（例えば、細胞内標的が細胞から出られるようにする）。組成物の機能的要素の１つが捕捉要素である実施形態では、細胞、組成物、及び／または細胞溶解物を捕捉物質（例えば、溶液状であるかまたは固体支持体に付着している）に曝露させる。いくつかの実施形態では、組成物の捕捉要素の捕捉により、細胞相互作用要素に結合した細胞内標的が固定化される。いくつかの実施形態では、捕捉（例えば、固定化）の後、結合しなかった細胞成分（例えば、細胞相互作用要素と相互作用しない成分）を洗い流すか、または除去する。いくつかの実施形態では、官能基選択的に開裂可能な部分の官能基選択的な開裂によって、捕捉物質（及び、例えば、固体支持体）から細胞相互作用要素（及び、例えば、存在する場合は、結合した細胞内標的）を遊離させる。いくつかの実施形態では、遊離した細胞内標的及び／または細胞相互作用要素の検出、特性解析、同定、分析などを行う。

ある実施形態では、細胞内における生物活性物質（例えば、低分子及び／または薬物様分子）の細胞内標的（例えば、タンパク質またはタンパク質複合体）の発見と検証を行う高感度法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物の細胞相互作用要素（複数可）として生物活性物質またはそのライブラリーを用い、それを内在性タンパク質しか含まないかまたは対象細胞内標的を発現している細胞（複数可）に曝露させる。組成物及び方法により、生物活性物質、細胞内標的、及び／または正の相互作用（例えば、結合事象）を生じさせる生物活性物質と細胞内標的との対の、捕捉、精製／単離、遊離、及び特性解析が可能になる。いくつかの実施形態では、細胞複合体を遊離させるために緩和な条件を使用するため、プロセシング及び分析の間に細胞相互作用要素と細胞内標的の相互作用が妨げられることはない。

いくつかの実施形態では、方法は、表現型スクリーニングアッセイの一部として利用されるか、または該アッセイと併用される。例えば、表現型スクリーニングで所望の表現型応答をもたらす一組の低分子は、各々、官能基選択的に開裂可能なリンカーによって捕捉要素に（例えば、化学合成または酵素を用いた手段によって）係留される。細胞内標的（任意選択でレポーターと融合させる）と会合し、表現型応答を再び発生させるという二重機能（例えば、細胞相互作用及び相互作用後捕捉）で細胞を処理する。いくつかの実施形態では、その後、細胞を溶解させ、この時点では細胞相互作用要素に連結されている細胞内標的を、捕捉要素と捕捉物質（例えば、表面または基質に提示されている）の結合によって捕捉する。いくつかの実施形態では、捕捉物質は溶液状であり、捕捉要素の捕捉後、続いて固体表面に結合させる。他の実施形態では、捕捉物質を、捕捉要素との相互作用時に固体表面（例えば、ウェル、マイクロプレート、ビーズなど）に結合させる。

いくつかの実施形態では、方法は、内在性標的（例えば、生物活性物質の既知の標的と不明な標的）を捕捉または「プルダウン」するために提供される。いくつかの実施形態では、生物活性物質を細胞相互作用要素として用いる。そのような細胞相互作用要素を用いる官能基選択的に開裂可能な組成物を細胞に導入し、細胞内空間内に通過させる。内在性タンパク質（複数可）（または他の内在性標的）を細胞相互作用要素に結合させ、その後、典型的には細胞（複数可）を溶解させた後、捕捉物質（例えば、表面（例えば、ビーズ）に提示されている）によって捕捉（例えば、プルダウン）する。そのようなプルダウン法に続き、分析を行って捕捉された標的（例えば、タンパク質）を同定することができる。分析技術には、ウエスタンブロット法、ゲル電気泳動、質量分析法、核磁気共鳴分光法、機能解析などが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、生物活性分子（例えば、細胞相互作用要素）を、官能基選択的に開裂可能な部分（及び任意選択で１つ以上のリンカー部分）を介して捕捉要素に付着させることにより、親生物活性分子の細胞透過性を維持している二重機能性組成物が作製される。いくつかの実施形態では、二重機能性組成物は、例えば、先にＷＯ／２０１４０９３６７１及びＷＯ／２０１４１５１２８２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、固体支持による捕捉を手段とする細胞からのタンパク質のプルダウンなど、さまざまな用途に利用される。本明細書に記載する組成物及びリンカーにより、捕捉された標的の官能基選択的な遊離が可能になる。この官能基選択的な開裂により、低分子とタンパク質間の相互作用とは独立した遊離形態が提供され、バックグラウンドを最小限に抑えて樹脂からタンパク質を効率的に遊離させることができる。開裂可能なリンカーの開裂速度は、生物活性低分子が標的タンパク質から解離する速度に影響されず、共有結合の場合でも、細胞相互作用要素からの細胞内標的の効率的な開裂を可能にする。捕捉された標的を樹脂から遊離させるこれまでの試みには、変性条件下での非特異的溶離及び競合による特異的溶離が含まれる。非特異的溶離のマイナス面は、標的タンパク質の変性すること、及び非特異的に結合したタンパク質が樹脂から遊離することである。非修飾生物活性化合物を使用する特定の溶離には、特異的に結合したタンパク質のみを遊離させるという変性面での利点はあるが、遊離効率は、各標的と結合した低分子の溶解度及び滞留時間に強く依存し、滞留時間の長さ、及び／または薬物溶解度の低さが、標的タンパク質の遊離を非効率的にしている。本明細書に記載する官能基選択的に開裂可能なリンカーは、これらの短所を克服している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するリンカーにより、薬物−タンパク質間の相互作用の種類を問わず、固体支持体から捕捉した細胞内標的を選択的に遊離させることが可能になる。系成分の溶解度または動態／熱力学にかかわらず、捕捉した標的を選択的に遊離させる能力は、既存の方法論に対する重要な利点となる。

いくつかの実施形態では、本明細書の組成物の第１の機能的要素は光親和性基である。そのようないくつかの実施形態では、方法は、（ａ）標的を含有している反応混合物、細胞、細胞溶解物などを、光親和性基、官能基選択的に開裂可能な部分、及び第２の官能基を含む二重機能性組成物に接触させること、（ｂ）光親和性基（例えば、光への曝露による）を活性化させて、標的の結合を誘導すること、及び（ｃ）官能基選択的に開裂可能な部分を官能基選択性物質に接触させて、第２の官能基から光親和性基及び結合した標的を遊離させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、（ｂ）と（ｃ）の間に１つ以上の工程を含むか、または標的に結合した組成物の検出、単離、精製などを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書の組成物の第１の機能的要素は固体表面であり、第２の機能的要素は細胞相互作用要素、捕捉要素、光親和性基、親和性要素、または標的と結合（共有結合または非共有結合）することができる他の基である。そのようないくつかの実施形態では、方法は、（ａ）固体表面、官能基選択的に開裂可能な部分、及び標的と結合（共有結合または非共有結合）することができる第２の機能的要素を含む二重機能性組成物を、標的を含んでいる反応混合物、細胞溶解物などに接触させること、（ｂ）標的を第２の機能的要素に結合させること、及び（ｃ）官能基選択的に開裂可能な部分を官能基選択性物質に接触させて、表面から第２の機能的要素及び結合した標的を遊離させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、（ｂ）と（ｃ）の間に１つ以上の工程を含むか、または標的に結合した組成物の検出、単離、精製などを含む。

ＩＶ．アリルカルバマート構造
以下は、二重機能性、細胞透過性、細胞適合性があり、かつ官能基選択的に開裂可能な組成物質（ｃｏｍｐｏｓｉｔｏｒ）の例示的なセットを提供するものである。官能基選択的に開裂可能な異なる基（例えば、プロパルギル基など）、捕捉要素（例えば、親和性分子）、及び／または細胞相互作用要素（Ｚ）に代わる他の機能的要素（例えば、検出可能部分）を含む同様の組成物は、本明細書の実施形態の範囲内である。

本明細書は、ハロアルカン基質（Ａ−Ｘ）と細胞相互作用要素（Ｚ）とをつなぐリンカーを含有しているアリル−カルバマート（Ｙ）を提供する。特に、本明細書で提供するリンカーは、化学的に開裂可能なアリルカルバマート単位を含み、自身のハロアルカン基質と共有結合を形成する脱ハロゲン酵素変異型に対する基質内部で利用される。本明細書は、例えば、２つの化学部分（例えば、官能基と脱ハロゲン酵素基質）をつなぐ際に利用される化学リンカーを提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞透過性かつ化学的に開裂可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するリンカーは、先に記載されているクロロアルカンカルバマート（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１４／０３２２７９４号）と特定の構造類似性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するリンカーは、米国公開第２０１４／０３２２７９４号に記載のリンカー同様、１つ以上のアルキルカルバマート構造モチーフを含む。ただし、アルキルカルバマートの存在如何にかかわらず、本明細書のいくつかの実施形態に記載のリンカーは、１つ以上のアリルカルバマート単位を含む。アリルカルバマートを含めることにより、かかるリンカー（及びそのようなリンカーを含む化合物または基質）は、細胞透過性と細胞適合性の両方を示すことができる。いくつかの実施形態では、アリルカルバマート基はさらに、リンカー（及びそのようなリンカーを含む化合物または基質）を官能基選択的に開裂可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するリンカーは、細胞透過性リンカー、細胞内で安定なリンカー、非特異的結合がないリンカー、及び緩和な条件下で開裂するリンカーのうち１つ以上（例えば、すべて）である。

いくつかの実施形態では、アリルカルバマートリンカーの官能基選択的な開裂は、遷移金属錯体（例えば、配位したパラジウム（Ｐｄ）またはルテニウム（Ｒｕ））での処理時に生じる。いくつかの実施形態では、官能基選択性物質は、触媒活性状態にある遷移金属（例えば、Ｐｄ（０）、Ｒｕ（ＩＩ）など）を安定化させる配位子（例えば、１つ以上の水溶性ホスフィン配位子）によって遷移金属（例えば、Ｐｄ、Ｒｕなど）が遷移金属塩から配位することにより生成される（例えば、図３を参照のこと）。この機序（本明細書に記載する実施形態は、この機序に限定されない）では、触媒活性錯体Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）₂は、より安定であるが触媒活性に劣る水溶性錯体Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）₃と平衡状態で存在する。Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）₃は、水溶性有機ホスフィンとＰｄ（ＩＩ）塩の反応により生成する。ホスフィン（例えば、ＴＰＰＴＳ）は、触媒活性のＰｄ（０）種の生成において二重に作用する。最初に、１当量のＴＰＰＴＳが犠牲になりＰｄ（ＩＩ）をＰｄ（０）に還元させる。第２に、ＴＰＰＴＳは、触媒活性形態にあるＰｄ（０）種の安定化に利用される。他のホスフィンは、Ｐｄ（ＩＩ）を触媒活性Ｐｄ（０）に還元し、溶液中のＰｄ（０）種を安定化させることができる。いくつかの実施形態では、別の還元剤（例えば、水素、ＣＯ、ギ酸など）によって還元が達成される。

遷移金属配位錯体によってアリルカルバマートリンカーが開裂される一般機序を図４に示すが、開裂は、いかなる特定の作用機序に限定されるものではなく、かかる作用機序についての理解は本明細書に記載する実施形態を実施するために必要というわけではない。図４において、Ｒ１部分とＲ２部分を連結しているアリルカルバマートは、Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）₂錯体（またはＰｄ（ＩＩ）から触媒活性Ｐｄ（０）への還元と溶液中のＰｄ（０）種の安定化の両方をすることができる他の部分（例えば、ホスフィン））によって開裂されるが、図４に示す一般的スキームは、アリルカルバマートを含有する他のリンカー、化合物、及び基質ならびに他の官能基選択性物質（例えば、他の遷移金属（例えば、Ｒｕ）及び／または配位する他の配位子）にも当てはまる。図４に示される一般機序（本明細書に記載する実施形態は、かかる機序に限定されない）において、触媒活性錯体Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）₂はアリルカルバマート（ステップ１）を不安定化させ、かつ／または開裂中間体を安定化させ（ステップ２）本来ならば安定なアリルカルバマート基の開裂を誘導する。その後、カルバマート中間体をアミンとＣＯ₂に変換（ステップ３）する一方、求核剤との反応によりアリル中間体をトラップする（ステップ４）。開裂反応を完了させる好適な求核剤には、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ベンゼンスルフィン酸、炭素求核剤（例えば、ジメドン、ジメチルバルビツル酸など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない（図５）。

いくつかの実施形態では、組成物は式：Ｚ−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を含み、式中、Ｚは細胞相互作用要素であり、Ｙはアリルカルバマート基（例えば、−ＮＨＣＯＯＣＨ₂ＣＨＣＨ−）であり、Ｌ¹はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖であり、Ｍはアルキルカルバマート基であり、Ｌ²はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖であり、Ａは炭素が少なくとも２個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個など）のアルカンであり、Ｘはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉなど）であり、かつ、Ａ−Ｘは脱ハロゲン酵素に対する基質である。

いくつかの実施形態では、基質は、式：Ｚ−Ｌ³−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−Ｌ²−Ａ−Ｘの化合物を含み、式中、Ｚは細胞相互作用要素であり、Ｌ³はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖であり、Ｙはアリルカルバマート基（例えば、−ＮＨＣＯＯＣＨ₂ＣＨＣＨ−）であり、Ｌ¹はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖であり、Ｍはアルキルカルバマート基であり、Ｌ²はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖であり、Ａは炭素が少なくとも２個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個など）のアルカンであり、Ｘはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉなど）であり、かつ、Ａ−Ｘは脱ハロゲン酵素に対する基質である。

いくつかの実施形態では、基質は式：Ｚ−Ｙ−Ａ−Ｘの化合物を最小限含み、式中、Ｚは細胞相互作用要素であり、Ｙはアリルカルバマート基（例えば、−ＮＨＣＯＯＣＨ₂ＣＨＣＨ−）であり、Ａは炭素が少なくとも２個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個など）のアルカンであり、Ｘはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉなど）であり、かつ、Ａ−Ｘは脱ハロゲン酵素に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＺとＹは、Ｌ³によって分離されてよく（例えば、Ｚ−Ｌ³−Ｙ−）、ここで、Ｌ³はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖である。いくつかの実施形態では、ＹとＡは、Ｍ（例えば、−Ｙ−Ｍ−Ａ−）によって分離されてよく、ここで、Ｍはアルキルカルバマート基である。いくつかの実施形態では、ＹとＭは、Ｌ¹（例えば、−Ｙ−Ｌ¹−Ｍ−）によって分離されてよく、ここで、Ｌ¹はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖である。いくつかの実施形態では、ＭとＡは、Ｌ²（例えば、−Ｍ−Ｌ²−Ａ−）によって分離されてよく、ここで、Ｌ²はＣ、Ｎ、Ｓ、またはＯを含む多原子の直鎖または分岐鎖である。好適な基質は、Ｚ−Ｙ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｌ₁−Ｙ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｙ−Ｌ₂−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ₁−Ｙ−Ｌ₂−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｌ₁−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｌ₁−Ｙ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｌ₁−Ｙ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ₁−Ｙ−Ｌ₂−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ₁−Ｙ−Ｍ−Ｌ₂−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ₁−Ｍ−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ₁−Ｍ−Ｌ₂−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｍ−Ｌ₁−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｌ₁−Ｙ−Ｌ₂−Ｍ−Ｌ₃−Ａ−Ｘ、Ｚ−Ｙ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｘ、Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｍ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｘなどを含む。

実験
実施例１
以下の例にて、パラジウム：ＴＰＰＴＳ錯体によって触媒される官能基選択的な開裂を実証する。その化学構造においてアリル−カルバマート基を含有している、または欠いている、大きさが類似した複数のクロロアルカンリンカーを合成し、Ｃｙ３蛍光色素に結合させた（図６）。ＰＢＩ−５６９６は、アリル−カルバマート基を含有し、ＰＢＩ−５６９８及びＰＢＩ−５６９７はアルキル−カルバマート基を含有する。Ｃｙ３：クロロアルカン複合体を、固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズ；ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共にインキュベートし、複合体と固定化ＨＡＬＯＴＡＧが共有結合した後、ビーズを２ｍＭのパラジウム：ＴＰＰＴＳ錯体で処理し、樹脂からのＣｙ３色素遊離について調べた。これらの開裂条件下、アリル−カルバマート基（すなわち、ＰＢＩ−５６９６）を含有するＣｙ３：クロロアルカン複合体のみが開裂されて、ビーズからのＣｙ３色素遊離が生じた（図６）。これらの結果は、パラジウム触媒による開裂はアリルカルバマート基に対して選択的であることを示している。

実施例２
以下の例で、クロロアルカンリンカーの化学構造へのアリルカルバマート基の挿入、及び、クロロアルカンリンカーの構造に対する障害を最小限にするための、この挿入の最適化について記載する。クロロアルカンリンカーを生物活性化合物に化学的に付着させ、それらが相互作用する細胞内標的タンパク質を選択的に単離できるようにすることができる。このクロロアルカンリンカーを、化合物の生物活性と細胞内透過性ならびにＨＡＬＯＴＡＧタンパク質への速やかな共有結合に対する影響が最小限になるよう最適化した。この例（図７Ａ〜７Ｃ）では、クロロアルカンリンカーを、ＢＩＲＢ＊に結合させ（ＰＢＩ−４８３４）、アリルカルバマート基を３種の異なる立体配置でリンカーに組み込み、ＰＢＩ−５６４６、ＰＢＩ−５６７６及びＰＢＩ−５６７７を作製した。４つのＢＩＲＢ＊複合体を、細胞溶解物中の場合または生細胞内部にある場合のＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に対する結合動態について比較した。ＨＡＬＯＴＡＧに対する溶解物中での結合動態は、ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を発現している細胞から最終濃度１μＭで調製した溶解物にＢＩＲＢ＊−クロロアルカン複合体を加えることによって測定した。０〜６０分のインキュベーションの後、異なる測定ポイントで採取した各反応物の一部（各々が異なるＢＩＲＢ＊複合体を含有）を除去し、ＨＡＬＧＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えて最終濃度１μＭとし、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（未結合で残っているもの）に結合させた。各測定時点の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で走査した。ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してバンドを定量化し、各結合動態を、クロロアルキル化合物を加えていない時間ゼロに対する経時的結合率（％）として測定した。ＰＢＩ−５６７６は、ＰＢＩ−４８３４と同様のＨＡＬＯＴＡＧ結合動態を示し、この立体配置において、ＨＡＬＯＴＡＧに対するクロロアルカンの結合動態にアリルカルバマート基が与える障害は最小限であることが示された。

ＨＡＬＯＴＡＧに対する細胞内部での結合動態は、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を発現している生細胞を、最終濃度１０μＭのＢＩＲＢ＊クロロアルカン複合体で処理することによって測定した。０〜１２０分のインキュベーションの各測定ポイントの後、培地を５μＭのＨＡＬＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド含有培地と交換し、細胞をさらに１５分インキュベートして、ＴＭＲ蛍光リガンドをＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（未結合で残っているもの）に結合させた。培地を除去した後、界面活性剤溶解バッファーを用いて細胞を溶解させ、各測定ポイントを上記のように分析した。ＰＢＩ−５６７６は、ＰＢＩ−４８３４と同様のＨＡＬＯＴＡＧ結合動態を示し、この立体配置において、細胞内透過性に対するアリルカルバマート基の影響は最小限であることが示された。

これらの結果を総合すると、この例の結果は、最適化された立体配置において、クロロアルカンリンカー化学構造へのアリル−カルバマート基の組み込みがその特徴（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧに対する速やかな結合動態及び細胞内透過性に対する最小限の影響）に与える影響は最小限であることを実証している。

実施例３
以下の例で、アリル−カルバマート基によって与えられる、クロロアルカンリンカーの構造と特徴（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧへの結合動態、化合物の生物活性、及び細胞内透過性に対する影響が最小限であること）に対する障害が最小限であることの一般性をさらに実証する。ＢＩＲＢ７９６をクロロアルカンリンカー（ＰＢＩ−５４４６）に結合させ、アリル−カルバマート基を上記で決定した最適化立体配置でリンカーに挿入し、ＰＢＩ−５８１３を作製した（図８Ａ〜８Ｃ）。両複合体を、生細胞内部でのＨＡＬＯＴＡＧ結合動態及び生物活性について比較した。ＨＡＬＯＴＡＧに対する細胞内部での結合動態は、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を発現している生細胞を、最終濃度１０μＭのＢＩＲＢ７９６クロロアルカン複合体で処理することによって測定した。０〜１２０分のインキュベーションの各測定ポイントの後、培地を５μＭのＨＡＬＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド含有培地と交換し、細胞をさらに１５分インキュベートして、ＴＭＲ蛍光リガンドをＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（未結合で残っているもの）に結合させた。培地を除去した後、界面活性剤溶解バッファーを用いて細胞を溶解させ、さまざまな測定ポイントにおける試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、画像をＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査した。バンドを定量化し、各結合動態を、クロロアルキル化合物を加えていない時間ゼロに対する経時的結合率（％）として測定した。両複合体とも、生細胞内部で同様のＨＡＬＯＴＡＧ結合動態を示し、最適化された立体配置におけるアリル−カルバマート基は、細胞内透過性及びＨＡＬＯＴＡＧ結合動態に対し最小限の障害しか示さないことが示された（図８Ａ〜８Ｃ）。

生物活性を、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１細胞でのＴＮＦα分泌阻害を介して測定した（図８Ａ〜８Ｃ）。ＴＨＰ−１細胞を９６ウェルプレートのウェルに１００，０００細胞／ウェルで播種し、ＢＩＲＢ７９６複合体の系列希釈で２時間処理し、その後、最終濃度２５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）で２４時間刺激した。上清を、ヒトＴＮＦα分泌についてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で分析した。両複合体とも同様のＴＮＦα分泌阻害を示し、この立体配置でのアリル−カルバマート基の組み込みは、ＢＩＲＢ７９６の生物活性に対し全く影響を与えなかったことが示された。したがって、かかる組込みはクロロアルカンの特徴に最小限の影響しか与えない。

実施例４
以下の例で、アリルカルバマート基の細胞安定性を実証する。これらの実験では、最適化された立体配置でアリル−カルバマートを含有しているクロロアルカンをテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）に結合させた（ＰＢＩ−５７４１）。それぞれ普遍的な発現及び核内発現を示すＨＡＬＯＴＡＧ及びＨＡＬＯＴＡＧ：ＮＬＳ₃を安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を２００ｎＭのＰＢＩ−５７４１で２４時間処理するか、または２４時間増殖させた後、２．５μＭのＰＢＩ−５７４１で１５分処理した。その後、細胞を培地で３回洗浄してからＮｉｋｏｎ共焦点レーザー顕微鏡でイメージングした。イメージング後、細胞を採取して界面活性剤溶解バッファーで溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、画像をＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査した。これらの標識処理により、ＴＭＲ複合体のＨＡＬＯＴＡＧへの共有結合がもたらされた。アリルカルバマート基が細胞内開裂すれば色素の損失が伴うはずであるから、標識強度も失われるはずである。細胞イメージング及びゲル分析（図９）では、標識から２４時間後と１５分後で同様の標識強度が示され、アリル−カルバマート基の２４時間にわたる細胞安定性を示している。

実施例５
本明細書に記載する実施形態を展開する過程で行った富化実験では、競合的薬物溶出による遊離よりもパラジウム触媒による標的遊離を使用した方が、滞留時間の長い内在性標的の富化が増強されることが実証された（図１０）。自身の標的に対する解離速度が遅いＢＩＲＢ７９６を、アリル−カルバマート基を含有しているクロロアルカンに結合させた、（ＰＢＩ−５８１３）。この例では、１５０ｍｍ皿に２×１０⁷のＨｅｐＧ２細胞を播種し、１６時間後、最終濃度２０μＭのＢＩＲＢ７９６複合体（ＰＢＩ−５８１３）を３皿に加え、対照３皿は未処理のままとした。２時間のインキュベーション後、培地を除去し、ＰＢＳで細胞をすばやく洗浄して界面活性剤溶解バッファー中で１０分間溶解させ、３０００×ｇで１分間遠心分離にかけた。その後、ＨＡＬＯＴＡＧコートした静置ビーズ７５ｕｌに透明な溶解物を加え、振盪しながら１５分インキュベートした。結合後、未結合部分を除去し、ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズを３回洗浄し、競合的溶出（４００μＭの非複合体化ＢＩＲＢ７９７）または化学的開裂（１ｍＭまたは２ｍＭのモル比１：２のパラジウム：ＴＰＰＴＳ）によって捕捉した標的をビーズから特異的に遊離させた。遊離した標的を、抗ＭＡＰＫ１４抗体（ＡＢＣＡＭ）、抗ＭＡＰＫ１１抗体（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＭＡＰＫ９抗体（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、及び抗ＭＡＰＫ１３抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたウエスタンブロット法に供した（図１０）。図１０の結果は、競合的薬物溶出を利用した標的遊離に対し、化学的開裂による標的遊離を利用した方がＢＩＲＢ７９６の既知標的の富化が増強されていることを示す。これらの結果は、長い滞留時間を示す標的を富化する場合、競合的薬物溶出に対し化学的開裂の方が有利であることを実証している。

実施例６
本明細書に記載する実施形態を展開する過程で行った実験で、タンパク質が豊富な環境（例えば、濃縮細胞溶解物またはタンパク質コートしたビーズ）では、パラジウム触媒による開裂の効率は有意に低下し、これはタンパク質濃度と直接相関することが実証された（図１１）。溶液中でのパラジウム触媒による開裂に対してタンパク質濃度が与える影響を検討する実験では、漸増濃度のＨＥＫ２９３細胞溶解物に５μｇのＨＡＬＯＴＡＧを添加した。ＨＡＬＯＴＡＧを、４μＭのＰＢＩ−５７４１（アリルカルバマート基含有クロロアルカンと複合体化したＴＭＲ）に３０分共有結合で結合させ、その後、ＰｄとＴＰＰＴＳのモル比が１：２のＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_xを１ｍＭまたは２ｍＭ用いて３０分開裂させ、対照試料は未処理のままとした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。アリルカルバマート基が開裂すれば色素の損失が伴うはずであるから、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質の標識強度も低下するはずである。開裂効率は、Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）_xで処理しなかった対照に対するシグナル損失の割合として決定した。結果は、細胞溶解物の濃度が漸増する場合の開裂効率は、バッファーでの開裂効率と比較して有意に低く、タンパク質濃度と直接相関したことを示す。

ビーズ上でのパラジウム触媒による開裂に対するタンパク質濃度の影響を検討する実験では、ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズの漸増量を２０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧに共有結合させた後、ビーズを、ＰｄとＴＰＰＴＳのモル比が１：２のＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_xを２ｍＭ用いて３０分処理した。アリルカルバマート基が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素の試料を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。結果は、開裂効率は固定化したタンパク質の量と直接相関し、タンパク質コートしたビーズの量を漸増させた場合に有意に低下したことを示す。

実施例７
この例は、特定のバッファー組成は、パラジウム触媒によるアリルカルバマート基の開裂に影響を及ぼし得ることを実証する（図１２）。この例では、高濃度のＨＥＫ２９３細胞溶解物（１５０μｇ）にＨＡＬＯＴＡＧを添加し、その後、ＰＢＩ−５７４１に３０分共有結合で結合させた。その後、標識反応物を、異なるバッファーで調製した、ＰｄとＴＰＰＴＳのモル比が１：２のＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_xを２ｍＭ用いて３０分処理し、対照試料は未処理のままとした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。アリルカルバマート基が開裂すれば色素の損失が伴うはずであるから、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質の標識強度も低下するはずである。開裂効率は、Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）_xで処理しなかった対照に対するシグナル損失の割合として決定した。図１２の結果は、バッファーの組成が、パラジウム触媒による開裂効率において極めて重要な役割を果たすことを示している。ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、及びＭＥＳの各バッファーでは開裂は効率的であったが、ＣＡＰＳバッファー及びＴＲＩＳバッファーでは開裂が完全に抑制された。

実施例８
この例は、ホスフィンの性質及びバッファー組成がパラジウム触媒によるアリルカルバマート基の開裂に影響を及ぼし得ることを実証する（図１３）。この例では、高濃度のＨＥＫ２９３細胞溶解物（１５０μｇ）にＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を添加し、その後、ＰＢＩ−５７４１に３０分共有結合で結合させた。その後、標識反応物を、異なるバッファーで調製した、Ｐｄとホスフィンのモル比が１：２のＰｄ（ホスフィン）_xを２ｍＭ用いて３０分処理し、対照試料は未処理のままとした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。アリル−カルバマート基が開裂すれば、色素の損失が伴うはずであるから、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質の標識強度も低下するはずである。開裂効率は、Ｐｄ（ホスフィン）_xで処理しなかった対照に対するシグナル損失の割合として決定した。図１３の結果は、ホスフィンの性質、及びバッファー組成は、パラジウム触媒による開裂効率において極めて重要な役割を果たすことを示している。電子が不足したホスフィンであるＤＡＮＰＨＯＳはいずれの被験バッファー（ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ）においても他のホスフィンより効率が良く、ＴＰＰＴＳは、ＭＯＰＳバッファーにおいてＭＥＳバッファー及びＨＥＰＥＳバッファーよりも高い開裂効率を示したが、ＴＸＰＤＳ（電子が豊富なホスフィン）、Ｃｙ−Ａｍｐｈｏｓ（正電荷と電子豊富）、及びＢＤＳＰＰＢ（二座配位子）は有意に低い開裂効率を示した（図１３）。

実施例９
この例は、ホスフィンの性質及びバッファー組成が、ビーズ上でのアリルカルバマートの開裂効率に影響を及ぼし得ることを実証する（図１４）。図１４の実験は、２種類の異なる量のＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧを２２５μｇまたは４５０μｇ含有しているビーズ）で行われた。ビーズを６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧに共有結合させた後、異なるバッファーで調製した、Ｐｄとホスフィンのモル比が１：２、１：４、及び１：８のＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_xを２ｍＭまたはＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_xを２ｍＭ用いてビーズを３０分処理した。アリル−カルバマート基が開裂すれば、ビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。結果は、樹脂上での開裂にはＰｄ：ホスフィンのモル比を高くする必要があることを示している。さらに、ＤＡＮＰＨＯＳは、被験バッファー（ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ）いずれにおいてもＴＰＰＴＳより効率が良かった。

実施例１０
以下の例で、あらかじめ水で作製し、酸素欠乏条件下で保存したパラジウム：ホスフィン錯体は、バッファーで調製して直ちに使用された錯体よりも活性であることを実証する。これらの実験では（図１５）、（固定化ＨＡＬＯＴＡＧ４５０μｇ）を含有しているＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズを６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧに共有結合させた後、Ｐｄとホスフィンのモル比が１：８のＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_xまたはＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_xを２ｍＭ用いてビーズを６０分処理した。Ｐｄ−ホスフィン錯体は、異なるバッファーで調製し直ちに使用するか、またはあらかじめ４ｍＭ溶液として水で作製してから酸素欠乏条件下で保存するかのいずれかとした。あらかじめ作製した溶液は、同一バッファーに希釈して２ｍＭの溶液とした後、直ちに使用した。アリルカルバマート基が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。３種のバッファーいずれにおいても、あらかじめ作製したパラジウム：ホスフィン錯体によるアリルカルバマート基の高い開裂効率が観察された。これらの結果は、あらかじめ作製したＰｄ−ホスフィン錯体は、高い開裂効率をもたらす高濃度の活性触媒を含有していたことを示している。さらに、結果は、３種の被験バッファー（ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ）いずれにおいても、ＤＡＮＰＨＯＳはＴＰＰＴＳより効率が良かった。

実施例１１
以下の例で、あらかじめ作製したパラジウム：ＴＰＰＴＳ錯体（Ｐｄとホスフィンのモル比１：８）によって触媒される官能基選択的な開裂を実証する。その化学構造においてアリル−カルバマート基を含有している、または欠いている、大きさが同様のクロロアルカンリンカーを複数合成し、ＴＭＲ蛍光色素に結合させた（図１６）。ＰＢＩ−５７４１及びＰＢＩ−６０４５はアリル−カルバマート基を含有し、ＰＢＩ−６０４４はアルキル−カルバマート基を含有していた。この例では、精製したＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を、ＴＭＲ−クロロアルカン複合体に３０分共有結合で結合させた。その後、標識反応物を、ＰｄとＴＰＰＴＳのモル比が１：８であるＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_xを２ｍＭ、０．６６ｍＭ、及び０．２２ｍＭ用いて３０分処理し、対照試料は未処理のままとした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。アリルカルバマート基が開裂すれば色素の損失が伴うはずであるから、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質の標識強度も低下するはずである。開裂効率は、Ｐｄ（ＴＰＰＴＳ）_xで処理しなかった対照に対するシグナル損失の割合として決定した。図１６の結果は、これらの開裂条件下では、アリル−カルバマート基を含有するＴＭＲクロロアルカン複合体（例えば、ＰＢＩ−５７４１及びＰＢＩ−６０４５）のみが開裂、開裂効率は時間と濃度に依存的であったことを示している。これらの結果は、パラジウム触媒による開裂はアリルカルバマート基に対して選択的であることを示している。

実施例１２
以下の例で、アリルカルバマート基の細胞安定性を実証する。これらの実験では、ＨＡＬＯＴＡＧ：ＮＬＳ₃（核内発現を示す）を安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、２００ｎＭのＴＭＲクロロアルカン複合体で２４時間処理した。複合体のうち、ＰＢＩ−５７４１及びＰＢＩ−６０４５の２つはアリルカルバマート基を含有し、ＰＢＩ−６０４４はアルキル−カルバマート基を含有していた。細胞を培地で１回洗浄してからＮｉｋｏｎ共焦点レーザー顕微鏡でイメージングした。イメージング後、細胞を採取して界面活性剤溶解バッファーで溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、画像をＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査した。これらの標識処理により、ＴＭＲ複合体のＨＡＬＯＴＡＧへの共有結合がもたらされた。アリルカルバマート基が細胞内開裂すれば色素の損失が伴うはずであるから、標識強度の損失も伴うはずである。細胞イメージング及びゲル分析の結果（図１７Ａ〜１７Ｂ）は、３つのすべての複合体で同様の標識強度を示しており、２４時間を通したアリルカルバマート基の細胞安定性を示している。

実施例１３
本明細書に記載する実施形態を展開する過程で行った実験で、タンパク質が豊富な環境（例えば、タンパク質コートしたビーズ）では、パラジウム触媒による開裂効率は有意に低下し、タンパク質濃度と直接相関することが実証された（図１８）。これらの実験では、漸増量のＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性または非磁性ビーズを２０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧに共有結合させた後、ビーズを、ＰｄとＴＰＰＴＳのモル比１：８であらかじめ作製したＰｄ（ＴＰＰＴＳ）_x錯体２ｍＭ、０．６６ｍＭ、または０．２２ｍＭと共にＨＥＰＥＳバッファー中で３０分処理した。アリルカルバマート基が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素の試料を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。結果は、開裂効率は固定化したタンパク質の量と直接相関し、タンパク質コートしたビーズの量を漸増させた場合に有意に低下したことを示す。

実施例１４
この例は、ホスフィンの性質が、パラジウム触媒によるアリルカルバマート基の開裂に影響を及ぼし得ることを実証する（図１９）。これらの実験では、ＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇを含有）を、６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、ビーズを、モル比１：８であらかじめ作製したＰｄ（ホスフィン）錯体２ｍＭまたは０．６６ｍＭを用いてＨＥＰＥＳバッファー中で３０分処理した。アリルカルバマート基が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素の試料を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。図１９の結果は、ホスフィンの性質が、パラジウム触媒による開裂効率において極めて重要な役割を果たすことを示している。ＤＡＮＰＨＯＳ族由来の電子不足のホスフィン、特にＤＡＮＰＨＯＳとｏ−ＤＡＮＰＨＯＳは他のホスフィンより効率が良かった。

実施例１５
この例は、求核剤の性質がパラジウム触媒によるアリルカルバマート基の開裂に影響を及ぼし得ることを実証する（図２０）。これらの実験では、ＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇを含有）を、６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、ビーズを、Ｐｄとホスフィンのモル比１：８であらかじめ作製したＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_xまたはＰｄ（ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ）_x錯体２ｍＭ、０．６６ｍＭ、または０．２２ｍＭを用いて、複数のアミンバッファーまたは別の求核剤を含有する非アミンバッファー中で３０分処理した。アリルカルバマート基が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素の試料を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。図２０の結果は、求核剤の性質がパラジウム触媒による開裂効率において極めて重要な役割を果たすことを示している。さらに、ホスフィンと求核剤の組み合わせは非常に重要である。Ｐｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体の場合、最高開裂効率は、ジメチルバルビツル酸５ｍＭを添加したＰＢＳバッファーを使用して達成された。ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳの場合は、最高開裂効率は、ＭＯＰＳバッファーを使用して達成された。さらに、ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳは、特に濃度０．２２ｍＭにおいてＤＡＮＰＨＯＳより効率が良かった。

実施例１６
本明細書に記載する実施形態を展開する過程で行った実験で、パラジウム触媒による開裂効率は、あらかじめ作製したＰｄ−ホスフィン溶液のモル比に依存することが実証された（図２１）。これらの実験では、（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇ）を含有しているＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズを６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照試料はビーズとインキュベートしなかった。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、ビーズを、ＰｄとＤＡＮＰＨＯＳのモル比が１：４、１：６、１：８、１：１０、１：１２及び１：１５のＰｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体２ｍＭ、０．６ｍＭ、または０．２２ｍＭを用いて、ＰＢＳ／ジメチルバルビツル酸中で３０分処理した。アリルカルバマート基が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、ビーズと共にインキュベートしなかった対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。ＰｄとＤＡＮＰＨＯＳのモル比を１：６以上であらかじめ作製したＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_x溶液で高い開裂効率が観察された

実施例１７
以下の例で、クロロアルカンリンカーの化学構造へのアリル−カルバマート基の挿入、及び、パラジウム触媒による開裂を効率的にし、クロロアルカンリンカーの特徴（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧに速やかに結合させること、及び化合物の細胞内透過性に対する障害を最小限に抑えること）に対する障害を最小限にするための、この挿入の最適化について記載する。クロロアルカンリンカーを生物活性化合物に化学的に付着させ、それらが相互作用する細胞内標的タンパク質を選択的に単離できるようにすることができる。この例では、クロロアルカンリンカーを、共有結合的キナーゼ阻害剤であるイブルチニブに結合させ、ＰＢＩ−６０４０を作製した。アリルカルバマート基の挿入を最適化するため、立体配置が複数あるアリルカルバマート基を含有する、長さの異なるリンカーをさらに７つ作製し、イブルチニブに結合させた（図２２）。これらのイブルチニブ複合体を、細胞溶解物中の場合または生細胞内部にある場合のＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に対する結合動態（図２３）、ＢＴＫ：ＮＬｕｃ融合タンパク質（ＢＴＫはイブルチニブの標的である）の捕捉（図２４Ａ）、及びパラジウム触媒による開裂効率（図２４Ｂ）について比較した。

ＨＡＬＯＴＡＧに対する溶解物中での結合動態（図２３Ａ）は、ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を発現している細胞から調製した溶解物を、最終濃度１μＭのイブルチニブとクロロアルカンの複合体を用いて最高６０分処理することによって測定した。特定のインキュベーション時間の後、一定分量を取り出し、最終濃度１μＭのＨＡＬＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて処理して残存する未結合ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を標識化した。各分注をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で走査した。ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してバンドを定量化し、結合動態を、クロロアルカンでタグ付けした化合物を加えていない時間ゼロに対する経時的結合率（％）として決定した。短いリンカーＰＢＩ−６０４１を除き、全リンカーともＨＡＬＯＴＡＧに対して良好な結合動態を示し、最も長いリンカーのＰＢＩ−６０３１とＰＢＩ−６０３２は比較的緩徐な結合を示した。これらの結果は、ＰＢＩ−６０４１を除くすべての立体配置では、アリルカルバマート基の挿入は、ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質へのクロロアルカンの結合に対して何ら有意な障害とならないことを示している。

ＨＡＬＯＴＡＧに対する細胞内部での結合動態（図２３Ｂ）は、ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を発現している生細胞を、最終濃度１０μＭのイブルチニブとクロロアルカンの複合体を用いて最高９０分処理することによって測定した。その後、培地を、ＨＡＬＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド５μＭを含有する培地と交換し、細胞をさらに１５分インキュベートして残存する未結合ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を標識化した。その後、界面活性剤溶解バッファーで細胞を溶解させ、さまざまな測定ポイントにおける試料を上記のように分析した。複合体はいずれも同様のＨＡＬＯＴＡＧ結合動態を示し、アリルカルバマート基の挿入が、細胞内透過性に対し最小限の障害しか示さなかったことが示された。さらに、これらのリンカーの長さも細胞内透過性に対し最小限の影響しか与えなかった。

相互作用する細胞内標的の捕捉効率を調べるため、イブルチニブの標的として既知であるＢＴＫを遺伝子操作によりＮＡＮＯＬＵＣ（ＮＬｕｃ）ルシフェラーゼレポーター（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に融合させた。イブルチニブはＢＫＴの共有結合阻害剤なので、ＢＴＫとＮＬｕｃの間にＴＥＶ認識部位を組み込んでタンパク質分解によりＮＬｕｃがビーズから遊離するようにした。細胞溶解物（ＢＴＫ：ＮＬｕｃ融合体を発現している細胞由来）をイブルチニブとクロロアルカンの複合体１μＭ（最終濃度）で２時間処理した後、イブルチニブとクロロアルカンの複合体、及びそれらの相互作用標的ＢＴＫ：ＮＬｕｃをＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に捕捉した。捕捉効率は、未処理の細胞溶解物に対する未結合画分中の生物発光損失の割合として決定した。図２４Ａの結果は、短いリンカーのＰＢＩ−６０４１、ＰＢＩ−６０２５、及びＰＢＩ−６０２７の場合、アリルカルバマート基の挿入により、アリルカルバマート基を含有しないＰＢＩ−６０４０よりも捕捉効率が低下したことを示している。しかし、長いリンカーのＰＢＩ−６０２９、ＰＢＩ−６０３０、ＰＢＩ−６０３１、及びＰＢＩ−６０３２では、アリルカルバマート基挿入による捕捉効率に対する障害はなかった。

パラジウム触媒によるこれらのリンカーの開裂効率を調べるため、ＨＡＬＯＴＡＧビーズに共有結合で捕捉されたＢＴＫ：ＮＬｕｃ融合体の遊離を２つの方法、すなわちｉ）ＴＥＶのタンパク質分解による開裂及びｉｉ）パラジウム触媒による開裂によって決定した（図２４Ｂ）。ＴＥＶのタンパク質分解により融合体が開裂すればＮＬｕｃの遊離がもたらされるはずであり、クロロアルカンリンカー内部でパラジウム触媒によりアリルカルバマート基が開裂すればＢＴＫ：ＮＬｕｃの遊離が伴うはずである。抗ＮＬｕｃ抗体を使用した遊離タンパク質のウエスタン分析により、ＴＥＶのタンパク質分解性開裂による有意なＮＬｕｃ遊離が全被験リンカーで示された。ただし、短いリンカーのＰＢＩ−６０４１では、そのＨＡＬＯＴＡＧ結合動態の低さ、及びそのＢＴＫ：Ｎｌｕｃ捕捉の低さと一致した低遊離が観察された。Ｐｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_x処理による有意なＢＴＫ：ＮＬｕｃ遊離は、アリルカルバマート基を含有するリンカーでのみ検出された。さらに、高いパラジウム触媒による開裂効率が長いリンカーで観察された。ＰＢＩ−６０３０及びＰＢＩ−６０２９はＴＥＶ及び２ｍＭのＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_xによる同様の遊離効率を示し、より長いＰＢＩ−６０３１及びＰＢＩ−６０３２はＴＥＶ及び２ｍＭ及び０．６６ｍＭのＰｄ（ＤＡＮＰＨＯＳ）_xによる同様の遊離効率を示した。

総合すると、これらの結果は、長いクロロアルカンリンカーへのアリルカルバマート基の組み込みはパラジウム触媒による効率的な開裂を可能にすると同時に、細胞透過性及びＨＡＬＯＴＡＧ結合動態に対して最小限の障害しか示さなかったことを実証している。

実施例１８
以下の例で、パラジウム触媒による溶離が、生物活性化合物と共有結合で相互作用する標的を富化する能力を実証する。イブルチニブはその主要標的であるＢＴＫのＡＴＰ結合ポケットでシステインに共有結合で結合する。さらに、イブルチニブは、ＡＴＰ結合ポケット内の対応するシステインの存在に応じて、他のチロシンキナーゼと共有結合型相互作用または可逆的相互作用をすることが報告されている。Ｒａｍｏｓ細胞を、最終濃度２０μＭのイブルチニブ−ＣＡ−Ｔ４Ｅを用いて２．５時間処理した後（対照細胞は未処理のまま）、細胞を溶解させ、クロロアルカン複合体を、それらに結合した標的とと共にＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に捕捉した。その後、６ｍＭパラジウム触媒によって標的を遊離させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した（図２５）。質量分析法により、共有結合で相互作用すると予測されたキナーゼ（すなわち、ＢＴＫ、ＢＬＫ及びＴＥＣ）を含め、複数のチロシンキナーゼの富化が示された。これらの結果は、パラジウム触媒による溶離は、他の溶離法では対処できない共有結合型相互作用に適用可能であることを実証している。

実施例１９
以下の例（例えば、図２７を参照のこと）で、ホスフィン及び求核剤の性質が、タンパク質性の環境でのパラジウム触媒によるアリル−カルバマート結合の開裂に影響を及ぼし得ることを実証する。これらの実験では、ＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇを含有）を６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートした。対照色素ＰＢＩ−５７４１は、固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質をまったく含有しないビーズと共にインキュベートした。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、ビーズを、モル比１：８であらかじめ作製したＰｄ（ホスフィン）錯体２ｍＭ、０．６６ｍＭ、または０．２２ｍＭを用いてＨＥＰＥＳまたはＭＯＰＳバッファー中で３０分処理した。アリル−カルバマート基が開裂すれば、ビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素の試料を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。結果は、ホスフィン及び求核剤の性質がパラジウム触媒による開裂効率において極めて重要な役割を果たすことを示している。ＤＡＮＰＨＯＳ族由来の電子不足のホスフィン、特にＤＡＮＰＨＯＳ及びｏ−ＤＡＮＰＨＯＳは、一般に使用されるホスフィンであるＴＰＰＴＳより効率が良かった。

実施例２０
本明細書に記載する実施形態を展開する過程で行った実験で、パラジウム触媒による開裂効率はＰｄ−ホスフィン溶液のモル比に依存することが実証された（例えば、図２７を参照すると共に、ＤＡＮＰＨＯＳに関する図２１及び実施例１６も参照のこと）。これらの実験では、ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇを含有）を、６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照色素ＰＢＩ−５７４１は、固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズと共にインキュベートした。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、ビーズを、Ｐｄとｏ−ＤＡＮＰＨＯＳのモル比が１：４、１：６、１：８、１：１０、１：１２、及び１：１５のＰｄ−Ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体２ｍＭ、０．６ｍＭ、または０．２２ｍＭを用いて３０分処理した。アリル−カルバマート結合が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。Ｐｄとｏ−ＤＡＮＰＨＯＳのモル比が１：８〜１：１０のＰｄ−Ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ溶液で高い開裂効率が観察された。

実施例２１
この例は、活性触媒は、密封ガラスアンプルに入れた溶液としても、または凍結乾燥形態でも保存可能であることを実証する（例えば、図２８を参照のこと）。凍結乾燥の場合、パラジウムを十分に還元させてから凍結乾燥することが極めて重要である。これらの実験では、ＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇを含有）を、６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照色素ＰＢＩ−５７４１は、固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズと共にインキュベートした。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、溶液として、または凍結乾燥形態（調製後直ちに凍結乾燥したもの、または１時間後、３時間後、６時間後、２２時間後、及び５２時間後に凍結乾燥したもの）で保存した触媒から調製したＰｄ／ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳを０．６６ｍＭ用いてビーズを３０分処理した。アリル−カルバマート結合が開裂すればビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素の試料を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。結果は、溶液で保存した触媒または調製後６時間以上経ってから凍結乾燥した触媒がその活性を保持したことを示している。

実施例２２
スキーム１：活性触媒の調製：
触媒溶液調製の基本手順：

操作は、アルゴン雰囲気下（シュレンク管を用いる方法）で実施した。凍結脱気を３サイクル行って水を脱気した。

ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ（１８８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、純度９７％）を密封バイアルに入れ、撹拌子を装備した。空気を排気し、バイアルをアルゴンで充填した（３回繰り返し）。脱気水（９ｍＬ）をカニューレを介して加えると、澄明な溶液が形成された。別の密封バイアルに、Ｎａ₂ＰｄＣｌ₄（１１．８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を入れ、空気を排気し、バイアルをアルゴンで充填した（３回繰り返し）。脱気水（１ｍＬ）を固体Ｎａ₂ＰｄＣｌ₄に加えると、茶色の溶液が形成された。茶色の水溶液のＮａ₂ＰｄＣｌ₄（１ｍＬ、１１．８ｍｇ／ｍＬ）溶液を、撹拌したホスフィン溶液に加えると、澄明な黄色の溶液が形成された。澄明な黄色溶液のＰｄ−Ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体を、アルゴン下で適切な長さの時間混合させた。十分な長さの時間が経過したら、黄色溶液を下記のように移した。
・ガラスアンプルに１ｍＬ分注し、アルゴン下または真空下で火炎密封（ｆｉｒｅｓｅａｌ）した。溶液を遮光して４℃で保存した；
・ガラスアンプルに１ｍＬ分注し、アンプルをセプタで密封し、溶液を液体窒素上で慎重に凍結させ、凍結乾燥時、ガラスアンプルを火炎密封（ｆｉｒｅｓｅａｌ）して遮光し−８０℃で保存した；
・セプタで密封したガラスバイアルに１ｍＬ分注し、溶液を液体窒素またはドライアイス上で凍結させ、凍結乾燥させた。凍結乾燥残留物を密封ガラスバイアルに入れて−８０℃で保存した。

スキーム２：Ｐｄ（ＯＡｃ）₂からの活性触媒の調製：
Ｐｄ（ＯＡｃ）₂からの触媒溶液調製の基本手順：

Ｐｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ（１：８）溶液４ｍＭの例
ＤＡＮＰＨＯＳ（９６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、純度９７％）及びＰｄ（ＯＡｃ）₂（４．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を撹拌子を装備した密封バイアルに入れた。空気を排気し、バイアルをアルゴンで充填した（３回繰り返し）。脱気水（５ｍＬ）をカニューレを介して加えて攪拌すると、澄明な溶液が形成された。（Ｐｄ（ＯＡｃ）₂が反応し、緩徐に溶解する）。澄明な黄色溶液のＰｄ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体をアルゴン下で２０時間混合させてからバイアルに包装する。

触媒の効率はＰｄ源に依存「しない」。Ｎａ₂ＰｄＣｌ₄及びＰｄ（ＯＡｃ）₂いずれも、同一条件下では双方ともに非常に類似した効率を示したことが実験で示されている。

実施例２３
以下の例で、２つの異なるパラジウム塩源から調製した触媒に同様の反応性があることを実証する（例えば、図２９を参照のこと）。ＨＡＬＯＴＡＧコートしたビーズ（固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質４００μｇを含有）を、６０μＭのＰＢＩ−５７４１と共に３０分インキュベートし、対照色素ＰＢＩ−５７４１は固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質を含有しないビーズと共にインキュベートした。ＰＢＩ−５７４１を固定化ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に共有結合させた後、ビーズを、２種のパラジウム塩源Ｐｄ（ＯＡＣ）₂またはＮａ₂ＰｄＣｌ₄から調製した、Ｐｄとホスフィンのモル比が１：８のＰｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ触媒２ｍＭを用いて３０分処理した。Ｐｄ／ＤＡＮＰＨＯＳ錯体をＨＥＰＥＳバッファーまたはＭＯＰＳバッファーに再構成した。アリル−カルバマート基が開裂すれば、ビーズからの色素遊離が伴うはずである。遊離色素を対照色素と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＴｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置で走査し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴを使用してバンドを定量化した。開裂効率は、対照色素に対する遊離色素の割合として決定した。いずれのパラジウム塩源から調製した触媒でも、同様のアリル−カルバマート基開裂効率が観察された。

実施例２４
以下の例で、クロロアルカンリンカーの化学構造へのアリル−カルバマート基の挿入、及び、パラジウム触媒による開裂を効率的にし、クロロアルカンリンカーの特徴（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧに速やかに結合させること、及び化合物の効力及び細胞内透過性に対する障害を最小限に抑えること）に対する障害を最小限にするための、この挿入の最適化について記載する。クロロアルカンリンカーを生物活性化合物に化学的に付着させ、それらが相互作用する細胞内標的を選択的に単離できるようにすることができる。この例では、クロロアルカンリンカーをＢＩＲＢ７９６に結合させてＢＩＲＢ７９６−ＣＡ−Ｔ１を作製した。アリルカルバマート基の挿入を最適化するため、立体配置が２種類あるアリルカルバマート基を含有する、長さの異なるリンカーをさらに７つ作製し、ＢＩＲＢ７９６に結合させた（図３０）。複合体を、細胞溶解物中の場合と生細胞内部の場合のＨＡＬＯＴＡＧタンパク質に対する結合動態（図３１）、ＢＩＲＢ７９６の力価に与える影響（図３２）、及びパラジウム触媒によるリンカー開裂効率（図３３）について比較した。

ＨＡＬＯＴＡＧに対する溶解物中での結合動態（図３１Ａ）は、ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を発現している細胞から調製した溶解物を、最終濃度１μＭのＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン複合体で最高６０分処理して測定した。特定のインキュベーション時間の後、一定分量を取り出し、最終濃度１μＭのＨＡＬＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で処理して残存する未結合ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を標識化した。各分注をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００蛍光イメージ装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で走査した。ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してバンドを定量化し、結合動態を、クロロアルカンでタグ付けした化合物を加えていない時間ゼロに対する経時的結合率（％）として決定した。トランス型二重結合を有するリンカー（すなわちＣＡ−Ｔ２Ｅ、ＣＡ−Ｔ３Ｅ及びＣＡ−Ｔ４Ｅ）は、シス型二重結合を有するそれぞれのリンカーよりも速いＨＡＬＯＴＡＧ結合を示した。長いリンカーＣＡ−Ｔ４Ｅの結合動態は、ＨＡＬＯＴＡＧへの結合に対する影響が最小である開裂不可能なリンカーＣＡ−Ｔ１に最も類似していた。

ＨＡＬＯＴＡＧに対する細胞内部での結合動態（図３１Ｂ）は、ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を発現している生細胞を、最終濃度１０μＭのＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン複合体で最高９０分処理して測定した。その後、培地を、ＨＡＬＯＴＡＧＴＭＲ蛍光リガンド５μＭを含有する培地と交換し、細胞をさらに１５分インキュベートして残存する未結合ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質を標識化した。その後、界面活性剤溶解バッファーで細胞を溶解させ、さまざまな測定ポイントにおける試料を上記のように分析した。リンカーは、細胞内でも溶解物中でもＨＡＬＯＴＡＧ結合動態に対して同様の相対的影響を示し、このことは、その長さにかかわらず、細胞内透過性がそれらの結合の制限因子とならなかったことを示している。

ＢＩＲＢ７９６がマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を阻害することによりＴＮＦαなどの炎症誘発性サイトカインの産生が抑制される。ＬＰＳ刺激したＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦα分泌の阻害について各種ＢＩＲＢ７９６複合体を比較し、リンカーがＢＩＲＢ７９６の力価に与える影響を検討した（図３２）。ＴＨＰ−１細胞を９６ウェルプレートに１００，０００細胞／ウェルで播種し、ＢＩＲＢ７９６（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ）及びＢＩＲＢ７９６−クロロアルカン複合体の系列希釈を用いて２時間処理した後、最終濃度２５０ｎｇｍＬ−１のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を用いて２４時間刺激した。上清を、ヒトＴＮＦαの分泌についてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。結果は、開裂可能なクロロアルカンリンカーの長さとそれがＢＩＲＢ７９６力価に与える影響との逆相関を示している。長いリンカーであるＣＡ−Ｔ４ＺとＣＡ−Ｔ４Ｅのみが、開裂不可能なリンカーＣＡ−Ｔ１と同様の力価を示した。

これらのリンカーのパラジウム触媒による開裂効率を調べるため、ＢＩＲＢ７９６の標的として既知であるＭＡＰＫ９を遺伝子操作によりＮＡＮＯＬＵＣ（ＮＬｕｃ）に融合させて（ＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９）ＨＡＬＯＴＡＧビーズに捕捉し、ＭＡＰＫ９の遊離を２つの方法、すなわち、ｉ）ＳＤＳ及びｉｉ）パラジウム触媒による開裂によって決定した（図３３）。細胞溶解物（ＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９融合体を発現している細胞由来）を、最終濃度１μＭのＢＩＲＢ７９６クロロアルカン複合体を用いて２時間処理した後、複合体とそれらに結合したＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９をＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に捕捉した。その後、ＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９を、１％ＳＤＳ、２ｍＭのパラジウム触媒、または０．６６ｍＭのパラジウム触媒いずれかで処理して遊離させた。抗ＮＬｕｃ抗体を使用した遊離タンパク質のウエスタン分析により、そのＨＡＬＯＴＡＧ結合動態の低さと一致したＣＡ−Ｔ０を除いては、全被験リンカーでＳＤＳによるＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９の有意な遊離が示された。パラジウム触媒による有意なＮＬｕｃ：ＭＡＰＫ９遊離は、長いリンカーでしか検出されなかった。

総合すると、これらの結果は、長いクロロアルカンリンカーへのアリルカルバマート結合の組み込みは、パラジウム触媒による効率的な開裂を可能にすると同時に、細胞透過性及びＨＡＬＯＴＡＧ結合動態に対して最小限の障害しか示さなかったことを実証している。

実施例２５
以下の例で、化合物が狙う長期滞留時間を示す標的を富化する場合、競合的溶離に対しパラジウム触媒による溶離の方が有利であることを実証する。ＴＨＰ−１細胞を、最終濃度２０μＭのＢＩＲＢ７９６−ＣＡ−Ｔ１及びＢＩＲＢ７９６−ＣＡ−Ｔ４Ｅを用いて２．５時間処理した後（対照細胞は未処理のまま）、細胞を溶解させ、クロロアルカン複合体を、それらに結合した標的と共にＨＡＬＯＴＡＧコートした磁性ビーズ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に捕捉した。その後、４００μＭのＢＩＲＢ７９６または６ｍＭのパラジウム触媒によって標的を遊離させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した（図３４）。質量分析法により、パラジウム触媒での溶離による内在性標的の高富化が示された。

実施例２６
以下の例で、開裂可能なクロロアルカンリンカーの特徴に対しカルバマート基が寄与することを実証する。ＣＡ−Ｔ４Ｅは４つのカルバマート基を含有し、そのうちの１つはＨＡＬＯＴＡＧへの速やかな結合動態にとって必須である。２つのさらなるリンカーを作製し、１つは、他の３つのカルバマートをアミドで置換し、もう１つは、２つのアリルカルバマート基をアリルエーテル結合で置換した。３つのリンカーすべてをポナチニブに結合させ（図３５）、それぞれポナチニブ−ＣＡ−Ｔ４Ｅ（６１４２）、ポナチニブ−トリ−アミド（Ｓ８３）、及びポナチニブａｌｌ−ＰＥＧ（ＳＬ＿０７２９）とした。リンカーを、ＨＡＬＯＴＡＧ及びＡＢＬ１への結合に対するそれらの影響について生化学的アッセイ及び細胞アッセイで比較した。３つのリンカーはすべて、ＨＡＬＯＴＡＧに対する溶解物中での結合動態は同様であり、精製ＡＢＬ１の阻害は比較できるほどであることを示し、アミドまたはＰＥＧへの変更は、両タンパク質への結合に対して影響を与えないことが示された（図３６）。細胞アッセイでは、アミドにより、細胞内のＨＡＬＯＴＡＧに対する結合動態が低下し、ポナチニブの力価がＣＡ−Ｔ４Ｅ及びａｌｌＰＥＧリンカーに対して２０倍減少したことから、細胞透過性に対する影響が大きいことを暗示している（図３６Ｂ及び図３６Ｄ）。これらの結果は、ＣＡ−Ｔ４Ｅが細胞透過性に対して最小限の影響しか与えないことにはカルバマートが寄与していることを示唆する。

実施例２７
以下は、本明細書に記載する実施形態の範囲内の例示的な組成物であり、ここで、官能基選択的に開裂可能なリンカー部分はクロロアルカン機能的要素と４−ニトロフェニル機能的要素（及び開裂不可能なリンカーを含む対照組成物（ＰＢＩ４４４０））とを連結する。
４−ニトロフェニルカルバマート−クロロアルカン：

ＰＢＩ４４４０の合成はＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００８，３，３７３−３８２に記載されている。

アリルカルバマートリンカー

実施例２８
リンカーの合成：
４−ニトロフェニルカルバマート合成の基本手順：
窒素下、ピリジン（１．３５当量）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（１．０５当量）を、撹拌したアルコールのＤＣＭ溶液０．２５Ｍに加えた（反応スキームで示されるように、０℃または２５℃にて）。得られる溶液／懸濁液を、２５℃で放置するかまたは１２時間かけて２５℃まで昇温し（０℃から開始した場合）、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサンまたはＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製した。

ＳＬ＿０１５７を、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｂ．；Ｈｉｌｌｅｒ，Ｗ．；Ｐｏｌｌｅｘ，Ａ．；Ｈｉｅｒｓｅｍａｎｎ，Ｍ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１１，１３，４４３８にしたがって合成した。

窒素下、撹拌したＳＬ＿０１５７（７１０ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）にピリジン（３８２μＬ、４．７４ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（７４３ｍｇ、３．６８ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られる溶液を１２時間かけて２５℃まで昇温し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１．２３ｇ（収率９５％）のＳＬ＿０１６０を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｄｔ，Ｊ＝１１．７，５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６６（ｄｔ，Ｊ＝１１．７，７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３２（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．０９（ｓ，６Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₇Ｈ₂₅ＮａＮＯ₆Ｓｉ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ３９０．１３，実測値３９０．１。

ＳＬ＿０１６０の溶液（４００ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）に、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルアミン塩酸塩（３１２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、次いでＥｔ₃Ｎ（２９０μＬ、２０．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を撹拌させたまま１８時間放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３９５ｍｇ（収率８０％）のＳＬ＿０１６１を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．７１（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．５６（ｄｔ，Ｊ＝１１．３，６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．６３（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．２７（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６７ − ３．５０（ｍ，８Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｑ，５．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４４ − １．３２（ｍ，４Ｈ），０．９０（ｓ，９Ｈ），０．０７（ｓ，６Ｈ）。

ＳＬ＿０１６１（３９５ｍｇ、８７４μｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（２０ｍＬ）に２ＮＨＣｌ（水溶液）３滴を滴下した。得られる澄明溶液を撹拌させたまま１０分放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、２６３ｍｇ（収率９８％）のＳＬ＿０１６３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．８７（ｄｔ，Ｊ＝１１．５，６．３Ｈｚ，０Ｈ），５．６４（ｄｔ，Ｊ＝１０．８，７．３Ｈｚ，０Ｈ），５．２４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６５−３．５１（ｍ，８Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４３（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₅Ｈ₂₉ＣｌＮＯ₅ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ３３８．１７，実測値３３８．１。

窒素下、撹拌したＳＬ＿０１６３（１７７ｍｇ、５２４μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）にピリジン（５７μＬ、０．７ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（１１０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られる溶液を１６時間かけて２５℃まで昇温し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１５９ｍｇ（収率６０％）のＳＬ＿０１６５を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．９３ − ５．７５（ｍ，２Ｈ），５．２３（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６５ − ３．５１（ｍ，８Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３８（ｑ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６１（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５０ − １．３４（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₂Ｈ₃₂ＣｌＮ₂Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ５０３．１８，実測値５０３．１。

ＳＬ＿０１６６を、Ｋｏｎｎｉｎｇ，Ｄ．；Ｈｉｌｌｅｒ，Ｗ．；Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ，Ｍ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１２，１４，５２５８−５２６１にしたがって合成した。

ＳＬ＿０１６６（２３０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２ｍＬ）に、５０％水溶性ＮａＯＨ（２．５ｍＬ）を加え、次いでＢｕ₄ＮＨＳＯ₄を２２℃で加えた。激しく撹拌して得られる粘性混合物に、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．５９ｍＬ、４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。得られる溶液を２０時間以上かけて２２℃で激しく撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の消費が示された。５ｍＬのＨ₂Ｏを加え、２５ｍＬのジエチルエーテルで水層から分離し、２５ｍＬのジエチルエーテルで２回抽出した。有機層を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３５７ｍｇ（収率９３％）のＳＬ＿０２０３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．７６（ｍ，２Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），４．０９（ｄｄ，Ｊ＝１２．６，５．４Ｈｚ，０Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｍ，１Ｈ），１．９０ −１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６２ − １．５１（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）。

撹拌子が装備された火炎乾燥した５０ｍＬフラスコに、窒素下、ＳＬ＿０２０３（３５７ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を加え、溶液を０℃に冷却した。ＬｉＡｌＨ₄ １ＭのＴＨＦ溶液（６．２ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）をシリンジを介してゆっくり加え、反応混合物を一晩かけて２２℃に昇温した。１６時間後、ＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示され、反応混合物を冷却して０℃に戻し、激しく撹拌しながら３０％ロッシェル塩水溶液（２ｍＬ）で反応を停止させた。３０分後、白色沈殿をろ去し、ろ液をＴＨＦ（１００ｍＬ）で洗浄した。ＴＨＦ溶液を合わせ、溶媒を減圧留去した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１９７ｍｇ（収率７３％）のＳＬ＿０２０６を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．７９ − ５．７２（ｍ，２Ｈ），４．６６（ｍ，１Ｈ），４．３０ − ４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１９ − ４．０５（ｍ，３Ｈ），３．９０ − ３．８３（ｍ，１Ｈ），３．７６ − ３．７１（ｍ，２Ｈ），３．５９ − ３．４６（ｍ，３Ｈ），１．９１ − １．４７（ｍ，６Ｈ，Ｈ₂Ｏとオーバーラップ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₁Ｈ₂₀Ｏ₄Ｌｉ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｌｉ］⁺ ２２３．１５，実測値２２３．３９。

ピリジン（１４７μＬ、１．８２ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸４−ニトロフェニル（２７５ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０２０６（１９７ｍｇ、９１１μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１６時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３０７ｍｇ（収率８８％）のＳＬ＿０２０９を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），５．７６（ｍ，２Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ２Ｈ），４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．１，７．６，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｍ，１Ｈ），１．８８ − １．６６（ｍ，２Ｈ），１．６１ − １．４７（ｍ，４Ｈ，Ｈ₂Ｏとオーバーラップ）。

ＳＬ＿０２０９（３０７ｍｇ、８０５μｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）にＪ１４５４Ｔ（２３０ｍｇ、８８６μｍｏｌ）に次いで、トリエチルアミン（３４０μＬ、２．４１ｍｍｏｌ）を加えたところ、白色沈殿を形成する（ＮＥｔ₃・ＨＣｌ）。得られる懸濁液を撹拌したまま２２℃で２０時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、２８０ｍｇ（収率７５％）のＳＬ＿０２１０を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．８２ − ５．６６（ｍ，２Ｈ），５．２９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．６３（ｍ，１Ｈ），４．３１ − ４．１９（ｍ，３Ｈ），４．１４ − ４．０４（ｍ，３Ｈ），３．８９ − ３．７９（ｍ，１Ｈ），３．６５ − ３．５０（ｍ，１１Ｈ），３．４９ − ３．４４（ｍ，２Ｈ），３．４０ − ３．３３（ｍ，２Ｈ），１．８４ − １．７２（ｍ，３Ｈ，），１．５４ − １．５７（ｍ，６Ｈ，Ｈ₂Ｏとオーバーラップ），１．９４ − １．３１（ｍ，５Ｈ，Ｈ₂Ｏとオーバーラップ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₂Ｈ₄₁ＣｌＮＯ₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４６６．２５，実測値４６６．４３。

撹拌子が装備された２０ｍＬマイクロウェーブバイアルに、ＳＬ＿０２１０（２８０ｍｇ、６００μｍｏｌ）、ＰＰＴＳ（１５．１ｍｇ、６０．０μｍｏｌ）及びＥｔＯＨ（１０ｍＬ）を加えた。得られる溶液をマイクロウェーブで５０℃にて６０分加熱し、その時点で分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、２２０ｍｇ（収率９６％）のＳＬ＿０２１３を澄明な油として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₇Ｈ₃₃ＣｌＮＯ₆ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺３８２．２０、実測値３８２．５７。

ピリジン（９３μＬ、１．２ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（１７４ｍｇ、８６４μｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０２１３（２２０ｍｇ、５７６μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１６時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１５３ｍｇ（収率４９％）のＳＬ＿０２１４を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．９３ − ５．７４（ｍ，２Ｈ），５．２９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．８９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６５（ｍ，２Ｈ），３．６１ − ３．５０（ｍ，８Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｄｔ，Ｊ＝１３．６，６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｄｔ，Ｊ＝１３．６，６．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ₂Ｏとオーバーラップ），１．５０ − １．３３（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₄Ｈ₃₆ＣｌＮ₂Ｏ₁₀ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ５４７．２１，実測値５４７．２０。

ＳＬ＿０２２６を、Ｋｏｎｎｉｎｇ，Ｄ．；Ｈｉｌｌｅｒ，Ｗ．；Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ，Ｍ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１２，１４，５２５８−５２６１にしたがって合成した。

撹拌子が装備された炉乾燥済み２５０ｍＬ丸底フラスコにＳＬ＿０２２６（３．４８ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を投入した。ＳＬ＿０２２６をトルエンで共沸乾燥した（３回）。Ｎ₂下、乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）をカニューレを介して加え、撹拌溶液を氷浴で０℃に冷却した。Ｒｅｄ−Ａｌ（７．１２ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、７０％トルエン溶液）を撹拌溶液に１５分かけて滴下した。反応混合物を撹拌したまま０℃で６０分放置し、さらに６０分２２℃に昇温し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質のほぼ完全な消失が示された。反応混合物を冷却して０℃に戻し、３０％ロッシェル塩水溶液（５０ｍＬ）で反応を停止させ、１５０ｍＬのＥｔ₂Ｏで３回抽出してからＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過して濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１．５０ｇ（収率４２％）のＳＬ＿０４６２を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．９８ − ５．７９（ｍ，２Ｈ），４．６５（ｄｄ，Ｊ＝４．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄｄｑ，Ｊ＝１２．８，４．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１９−４．１６（ｍ，２Ｈ），４．００（ｄｄｑ，Ｊ＝１２．０，５．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｍ，１Ｈ），１．９１ − １．６８（ｍ，２Ｈ），１．６６ − １．４９（ｍ，４Ｈ）。

炉乾燥した１００ｍＬフラスコにＮａＨ（３５８ｍｇ、６０％、鉱油分散、８．９４ｍｍｏｌ）を投入し、次いでＮ₂下、ＴＨＦ（２５ｍＬ）を投入した。複数口のフラスコ内で、ＳＬ＿０４６２（１．４０ｇ、８．１３ｍｍｏｌ）をトルエンで共沸乾燥し（３回）、ＴＨＦ（２５ｍＬ）で希釈した。あらかじめ０℃に冷却したＮａＨ／ＴＨＦ懸濁液に、カニューレを介してＳＬ＿０４６２の溶液を加えた。この茶色混合物を０℃で３０分撹拌し、その時間の経過後、ｔＢｕ−ブロモアセタート（ｔＢｕ−ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）（１．３８ｍＬ、９．３５ｍｍｏｌ）を滴下した。得られるスラリーを２２℃に温め、１８時間撹拌した。水（７５ｍＬ）を加え、反応物をＥｔ₂Ｏ（７５ｍＬ、３回）で抽出した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ₄）させてから濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（０→５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、５７４ｍｇ（収率２５％）のＳＬ＿０４６４を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．９９−５．７６（ｍ，２Ｈ），４．６８（ｄ，５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｔ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３１ − ４．２２（ｍ，１Ｈ），４．１１−４．０７（ｍ，１Ｈ），４．０３−３．８２（ｍ，４Ｈ），３．５５ − ３．４７（ｍ，１Ｈ），１．９２− １．７８（ｍ，１Ｈ），１．７７− １．６６（ｍ，１Ｈ），１．６６ − ４．５１（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₅Ｈ₂₆Ｏ₅Ｎａ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺３０９．１７，実測値３０９．２２。

ＳＬ＿０４６４（５７０ｍｇ、１．９９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）に０℃にてＬｉＡｌＨ₄のエーテル溶液１Ｍ（１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２２℃に昇温し、撹拌したまま２２時間放置し、その時点で反応混合物を冷却して０℃に戻し、気体発生が停止するまで３０％ロッシェル塩水溶性をゆっくり滴加して反応を停止させた。反応停止混合物を激しく撹拌したままさらに３０分放置し、白色沈殿をセライトパッドにろ取した。セライトパッドを、別のＴＨＦ（５０ｍＬ）で洗浄し、ろ液を濃縮してフラッシュクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１９５ｍｇ（収率４５％）のＳＬ＿０４６６を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ ５．９１ − ５．９７（ｍ，２Ｈ），４．６４（ｄｄ，Ｊ＝４．０，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３０ − ４．２２（ｍ，１Ｈ），４．０６ − ４．０３（ｍ，２Ｈ），４．０３ − ３．９６（ｍ，１Ｈ），３．９５ − ３．８３（ｍ，１Ｈ），３．７７ −３．７３（ｍ，２Ｈ），３．５８ − ３．４８（ｍ，３Ｈ），１．９１ − １．５０（ｍ，６Ｈ，Ｈ₂Ｏとオーバーラップ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₁Ｈ₂₀ＮａＯ₄ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ２３９．１３，実測値２３９．１３。

ピリジン（１１１μＬ、１．３８ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（２０８ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０４６６（１４９ｍｇ、６８９μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１６時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１８８ｍｇ（収率７２％）のＳＬ＿０４６９を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），５．８２（ｄｄ，Ｊ＝１５．７，４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．７４（ｄｄ，Ｊ＝１５．７，４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．５９（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．３７（ｍ，２Ｈ），４．１４（ｄｄ，Ｊ＝１２．９，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７７ − ３．７１（ｍ，１Ｈ），３．７０ − ３．６６１（ｍ，２Ｈ），３．４６ − ３．３９（ｍ，１Ｈ），１．７８ −１．５６（ｍ，２Ｈ），１．５３ − １．４０（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₈Ｈ₂₃ＮａＮＯ₄ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４０４．１３，実測値４０４．１。

ＳＬ＿０４６９（１０４ｍｇ、２７３μｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）にＪ１４５４Ｔ（７８ｍｇ、３００μｍｏｌ）に次いで、トリエチルアミン（１９０μＬ、１．３６ｍｍｏｌ）を加えたところ、白色沈殿を形成する（ＮＥｔ₃・ＨＣｌ）。得られる懸濁液を撹拌したまま２２℃で５時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、９４ｍｇ（収率７４％）のＳＬ＿０４７６を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ７．１７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．８２ − ５．６７（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｓ，１Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｍ，２Ｈ），３．９７ − ３．８７（ｍ，３Ｈ），３７３（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５３（ｍ，２Ｈ），３．４９ − ３．４５（ｍ，５Ｈ），３．４２ − ３．３４（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７５ − １．５７（ｍ，３Ｈ），１．５４− １．２３（ｍ，１１Ｈ）。

撹拌子が装備された１０ｍＬマイクロウェーブバイアルに、ＳＬ＿０４７７（９４．０ｍｇ、２０２μｍｏｌ）、ＰＰＴＳ（５．１ｍｇ、２０μｍｏｌ）及びＥｔＯＨ（５ｍＬ）を加えた。得られる溶液をマイクロウェーブで５０℃にて６０分加熱し、その時点で分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、６７ｍｇ（収率８７％）のＳＬ＿０４７７を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄｔｄ，Ｊ＝１５．７，３．７，０．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄｔｔ，Ｊ＝１５．７，５．６，１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｍ，２Ｈ），３．９３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，４Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５４ − ３．４９（ｍ，２Ｈ），３．４９ − ３．４４（ｍ，４Ｈ）３．４２−３．３４（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７１（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４１ − １．２６（ｍ，４Ｈ）。

ピリジン（２８μＬ、３５０μｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（５３ｍｇ、２６３μｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０４７７（６７．０ｍｇ、１７５μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１８時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、６３ｍｇ（収率６６％）のＳＬ＿０４７８を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．０１ − ５．８１（ｍ，２Ｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０７（ｍ，２Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４１ − １．２３（ｍ，４Ｈ）。

ＳＬ＿０１６０（２６９ｍｇ、７３２μｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（１０ｍＬ）に、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エタン−１−オール（１０９ｍｇ、７３２μｍｏｌ）を加え、次いでＮＥｔ₃（２００μＬ、１４５μｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を２２℃で２４時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、２２０ｍｇ（収率８０％）のＳＬ＿０４８３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５７ − ４．５１（ｍ，３Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）３．５１ − ３．４６（ｍ，６Ｈ），３．４２ − ３．３７（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），０．０５（ｓ，６Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₇Ｈ₃₅ＮａＮＯ₆Ｓｉ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４００．２１，実測値４００．２。

ピリジン（５８μＬ、０．７ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（１１３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０４８３（２０２ｍｇ、５３５μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に０℃で加えた。得られる溶液を２０時間かけて２５℃まで昇温し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１４７ｍｇ（収率５１％）のＳＬ＿０４８６を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６１（ｄｔｔ，Ｊ＝１１．５，５．５，１．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｄｔｔ，Ｊ＝１１．５，６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｍ，２Ｈ），４．３６（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７１（ｍ，２Ｈ），３．５９ − ３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５４− ３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），０．０４（ｓ，５Ｈ）。

ＳＬ＿０４８６（１３４ｍｇ、２４７μｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍＬ）にＪ１４５４Ｔ（７１ｍｇ、２７２μｍｏｌ）を加え、次いでトリエチルアミン（１７２μＬ、１．２３μｍｏｌ）を加えたところ、濁った溶液を形成する（ＮＥｔ₃・ＨＣｌ沈殿）。得られる懸濁液を撹拌したまま２２℃で５時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、１２６ｍｇ（収率８１％）のＳＬ＿０４９２を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１６（ｍ，２Ｈ），５．６２（ｄｔ，Ｊ＝１１．２，５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｄｔ，Ｊ＝１２．６，６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５２ − ３．４５（ｍ，８Ｈ），３．４２ − ３．３４（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３８（ｍ，４Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），０．０５（ｓ，５Ｈ）。

ＳＬ＿０４９４（１１３ｍｇ、１８０μｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（１０ｍＬ）に２ＮＨＣｌ_(水溶液)２滴を滴下した。得られる澄明溶液を撹拌させたまま２５分放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、８５ｍｇ（収率９２％）のＳＬ＿０４９４を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１５（ｍ，２Ｈ），５．６４（ｄｔ，Ｊ＝１１．８，６．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４６（ｄｔ，Ｊ＝１１．５，６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｍ，４Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．５１ − ３．４４（ｍ，８Ｈ），３．４２ − ３．３２（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｍ，４Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４１ − １．２５（ｍ，４Ｈ）。

ピリジン（３７μＬ、４６０μｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（４７ｍｇ、２３０μｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０４９４（７９ｍｇ、１５０μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１６時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、４６ｍｇ（収率４４％）のＳＬ＿０４９６を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｍ，２Ｈ），５．７８（ｍ，２Ｈ），４．８９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．５２ − ３．４４（ｍ，８Ｈ），３．４２ − ３．３２（ｍ，６Ｈ），３．１２（ｐ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４１ − １．２２（ｍ，４Ｈ）。

ＳＬ＿０４９６（４０ｍｇ、５９μｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（１５ｍＬ）に、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エタン−１−オール（８．８ｍｇ、５９μｍｏｌ）を加え、次いでＮＥｔ₃（２５μＬ、１７７μｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を２２℃で１６時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、３７ｍｇ（収率９１％）のＳＬ＿０５０１を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．２２ − ７．１５（ｍ，３Ｈ），５．６５ − ５．６１（ｍ，２Ｈ），４．６０ − ４．５０（ｍ，５Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｄｄ，Ｊ＝４．０，５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．５２ − ３．４５（ｍ，１４Ｈ），３．４３ −３．３６（ｍ，１０Ｈ），３．１５ − ３．０７（ｍ，６Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４２ − １．２５（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₉Ｈ₅₅ＣｌＮ₃Ｏ₁₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６８８．３４，実測値６８８．３。
ピリジン（２１μＬ、２５０μｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（２１ｍｇ、１００μｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０５０４（３５ｍｇ、５１μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１６時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、２９ｍｇ（収率６７％）のＳＬ＿０５０４を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２１ − ７．１３（ｍ，３Ｈ），５．６５ − ５．６０（ｍ，２Ｈ），４．５７ − ４．５３（ｍ，４Ｈ），４．３８ − ４．３５（ｍ，２Ｈ），４．０５ − ４．０１（ｍ，２Ｈ），３．７２ − ３．６９（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．５８ − ３．５２（ｍ，５Ｈ），３．５１ − ３．４４（ｍ，７Ｈ），３．４５ − ３．３６（ｍ，６Ｈ），３．１７ − ３．０７（ｍ，１０Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４１ − １．２２（ｍ，４Ｈ）。

窒素下、撹拌したＳＬ＿０４６２（５５０ｍｇ、３．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に、ピリジン（３４８μＬ、４．３１ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（６７６ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られる溶液を１６時間かけて２５℃まで昇温し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、０．７２ｇ（収率６７％）のＳＬ＿０４８４を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），５．９９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６，４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８７（ｄｔ，Ｊ＝１５．６，５．８Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｍ，２Ｈ），４．６１（ｓ，１Ｈ），４．１８（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，４．６，１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．４，８．０，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４４（ｄｔ，Ｊ＝１０．７，４．７Ｈｚ，１Ｈ），１．８０− １．６１（ｍ，２Ｈ），１．５４ − １．３７（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₆Ｈ₁₉ＮａＮＯ₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺３６０．４、実測値３６０．０。

ＳＬ＿０２１２（５１２ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（２０ｍＬ）に、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エタン−１−オール（２２６ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を加え、次いでＮＥｔ₃（４２４μＬ、３．０４ｍｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を２２℃で２２時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、３７６ｍｇ（収率７１％）のＳＬ＿０４８５を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７９（ｍ，２Ｈ），４．５６（ｍ，２Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｔｄ，Ｊ＝９．５，７．９，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．５２ − ３．４９（ｍ，４Ｈ），３．４９ − ３．４４（ｍ，２Ｈ），３．４３ − ３．３７（ｍ，５Ｈ），３．１２（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７５ − １．５７（ｍ，２Ｈ），１．５５ − １．１（ｍ，２Ｈ）。

ピリジン（５７μＬ、０．７ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（１１１ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０４８５（１８２ｍｇ、５２４μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に０℃で加えた。得られる溶液を２２時間かけて２５℃まで昇温し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、２４０ｍｇ（収率８９％）のＳＬ＿０４９３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，４．３Ｈｚ，１Ｈ），５．７３（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５７（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３６（ｍ，２Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｍ，３Ｈ），３．５８（ｍ，２Ｈ），３．５３（ｍ，２Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，３Ｈ），３．１３（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７７− １．５６（ｍ，２Ｈ），１．５３ − １．４１（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₃Ｈ₃₂ＮａＮ₂Ｏ₁₁ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ５３５．２，実測値５３５．２。
ＳＬ＿０４９３（２２０ｍｇ、４２９μｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍＬ）にＪ１４５４Ｔ（１１７ｍｇ、４５１μｍｏｌ）を加えてからトリエチルアミン（１２０μＬ、８５９μｍｏｌ）を加えたところ、濁った溶液を形成する（ＮＥｔ₃・ＨＣｌ沈殿）。得られる懸濁液を２２℃で撹拌したまま２時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、１６４ｍｇ（収率６４％）のＳＬ＿０４９５を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．７８（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｍ，２Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．４，

７．９，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｄｄ，Ｊ＝５．６，３．９Ｈｚ，２Ｈ），３．５２ − ３．４４（ｍ，８Ｈ），３．４３ − ３．３４（ｍ，７Ｈ），３．１２（ｍ，４Ｈ），１．７８ − １．５８（ｍ，４Ｈ），１．５５ − １．４２（ｍ，６Ｈ），１．４２ − １．２５（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₂Ｈ₄₂ＣｌＮ₂Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ − ＴＨＰ＋Ｈ］⁺ ５１３．２６，実測値５１３．２。

撹拌子が装備された２０ｍＬマイクロウェーブバイアルに、ＳＬ＿０４９５（１５０．０ｍｇ、２５１μｍｏｌ）、ＰＰＴＳ（６．３ｍｇ、２５μｍｏｌ）及びＥｔＯＨ（１５ｍＬ）を加えた。得られる溶液をマイクロウェーブで５０℃にて６０分加熱し、その時点で分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、１２０ｍｇ（収率９３％）のＳＬ＿０４９７を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１７（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄｔ，Ｊ＝１５．６，４．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄｔ，Ｊ＝１５．６，５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｍ，２Ｈ），３．９４（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５２ − ３．４３（ｍ，８Ｈ），３．４３ − ３．３４（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｍ，４Ｈ），１．７０（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４３ − １．２４（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₂Ｈ₄₂ＣｌＮ₂Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ５１３．２６，実測値５１３．２。

ピリジン（８７μＬ、１．１ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（８６ｍｇ、４２９μｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０４９７（１１０ｍｇ、２１４μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、１４１ｍｇ（収率９７％）のＳＬ＿０４９８を淡黄色の油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３１（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｍ，２Ｈ），７．２７ − ７．０７（ｍ，２Ｈ），６．０３ − ５．８２（ｍ，２Ｈ），４．７６（ｍ，２Ｈ），４．５０（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．７０ − ３．２５（ｍ，１８Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，４Ｈ），１．７６ − １．６１（ｍ，２Ｈ），１．５４ − １．４３（ｍ，２Ｈ），１．４２ − １．２６（ｍ，２Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₉Ｈ₄₅ＣｌＮ₃Ｏ₁₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６７８．２６，実測値６７８．２。

ＳＬ＿０４９８（１２０ｍｇ、１７７μｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（１５ｍＬ）に、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エタン−１−オール（２６ｍｇ、１７７μｍｏｌ）を加え、次いでＮＥｔ₃（７４μＬ、５３１μｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を２２℃で１６時間放置し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、１０６ｍｇ（収率８７％）のＳＬ＿０５０３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．２２ − ７．１２（ｍ，３Ｈ），５．７９（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），４．４７ − ４．４３（ｍ，４Ｈ），４．０４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．５２ − ３．４５（ｍ，１４Ｈ），３．４４ − ３．３６（ｍ，１０Ｈ），３．１６ − ３．０６（ｍ，６Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４２ − １．２５（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₉Ｈ₅₅ＣｌＮ₃Ｏ₁₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６８８．３４，実測値６８８．３。

ピリジン（５９μＬ、７２７μｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（５９ｍｇ、２９１μｍｏｌ）を、窒素下、撹拌したＳＬ＿０５０３（１００ｍｇ、１４５μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に２２℃で加えた。得られる溶液を２２℃で１６時間以上撹拌したまま放置し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、９３ｍｇ（収率７５％）のＳＬ＿０５０５を帯黄色の油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｍ，３Ｈ），５．７８（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｓ，４Ｈ），４．３８ − ４．３４（ｍ，２Ｈ），４．０６ − ４．００（ｍ，２Ｈ），３．７２ − ３．６８（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５８ − ３．５２（ｍ，６Ｈ），３．５２ − ３．４５（ｍ，８Ｈ），３．４４−３．３３（ｍ，８Ｈ），３．１７−３．０７（ｍ，６Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４２ − １．２５（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₆Ｈ₅₈ＣｌＮ₄Ｏ₁₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ８５３．３５，実測値８５３．３０。

イブルチニブ−クロロアルカンの合成：

ＳＬ＿０４６０を、Ｔｕｒｅｔｓｋｙ，Ａ．，Ｋｉｍ，Ｅ．，Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．ＳｃｉＲｅｐ．２０１４，４，４７８２にしたがって、市販の後半段階中間体である（（Ｒ）−３−（４−フェノキシフェニル）−Ｌ−（ピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）から合成した。

イブルチニブ−ＣＡ合成の基本手順：
ＳＬ＿０４６０（１０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に、適切なクロロアルカンの４−ニトロフェニルカルバマート（１０μｍｏｌ）を加え、次いでＥｔ₃Ｎ（５０μｍｏｌ）を２２℃で加えた。得られる黄色溶液を２２℃で１６時間放置し、その時点で溶媒を減圧留去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、イブルチニブ−ＣＡ複合体を澄明な油として得た。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９６％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₄Ｈ₆₀ＣｌＮ₈Ｏ₁₀ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ８９５．４１，実測値８９５．５２。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９９％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₂Ｈ₅₄ＣｌＮ₈Ｏ₈ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ８３３．３８，実測値８３３．２８。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９９％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₄Ｈ₅₈ＣｌＮ₈Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ８７７．４０，実測値８７７．４０。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９９％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₄Ｈ₅₈ＣｌＮ₈Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ８７７．４０，実測値８７７．６４。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９９％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₉Ｈ₆₇ＣｌＮ₉Ｏ₁₂ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １００８．４６，実測値１００８．５０。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９６％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₅₆Ｈ₈₀ＣｌＮ₁₀Ｏ₁₆ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １１８３．５４，実測値１１８３．５０。

ＨＰＬＣ純度（２５４ｎｍ）９９％超。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₅₆Ｈ₈₀ＣｌＮ₁₀Ｏ₁₆ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １１８３．５４，実測値１１８３．９７。

触媒溶液調製の基本手順：

操作はすべてアルゴン雰囲気下で実施する。液体窒素での凍結脱気を３サイクル行って水を脱気した。

Ｐｄ−ｏＤＡＮＰＨＯＳ（１：８）溶液４ｍＭの例
ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ（１８８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、純度９７％）を密封バイアルに入れ、撹拌子を装備した。空気を排気し、バイアルにアルゴンを充填した（３回繰り返し）。脱気水（９ｍＬ）をカニューレを介して加えたところ、澄明溶液が生成された。別の密封バイアルにＮａ₂ＰｄＣｌ₄（１１．８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を入れて空気を排気し、バイアルにアルゴンを充填した（３回繰り返し）。脱気水（１ｍＬ）を固体Ｎａ₂ＰｄＣｌ₄に加えたところ、茶色の溶液が生成された。茶色の水溶液のＮａ₂ＰｄＣｌ₄（１ｍＬ、１１．８ｍｇ／ｍＬ）溶液を、撹拌したホスフィン溶液に加えたところ、澄明な黄色溶液が生成された。澄明な黄色溶液のＰｄ−ｏ−ＤＡＮＰＨＯＳ錯体を３０分混合し、アルゴン下、密封バイアルに（１ｍＬずつ）移した。原液を遮光し室温で保存した。

実施例２９
ＢＩＲＢ７９６複合体

Ｓ３１（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｓ．２００９，７４，５４７−５５９）（９００ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）と、水溶性飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍＬ）との二相性混合物を激しく撹拌し、そこにホスゲン溶液（１０．７ｍＬ、トルエン中１５ｗｔ％、１５．０ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。２５分後、有機層を分離し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濃縮した。得られる黄色油をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、Ｓ３３（ＪＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，２９９４−３００８）（１．２６ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１．９４ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に２２℃で加えた。窒素下、得られる溶液を２２時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、粗反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（０→２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、１．４１ｇ（収率７０％）のＳ３４を白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．７３（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｄｄ，Ｊ＝７．０，１．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，２．３，１．２Ｈｚ，１Ｈ）７．８７（ｍ，１Ｈ），７．８４（ｑ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５８ − ７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），４．２４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６５− ３．５０（ｍ，４Ｈ），２．８３（ｔ，．Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．５３（ｄｄ，Ｊ＝５．６，３．７Ｈｚ，４Ｈ），１．２７（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ １６４．３，１５６．９，１５４．５，１４１．０，１３８．７，１３２．１，１３２．０，１３１．６，１３０．２，１２８．８，１２８．１，１２７．４，１２６．９，１２６．５，１２５．２５，１２３．５，１２３．１，１１９．０，１１４．３，１０５．５，１００．３，６７．６，６７．２，５８．７，５５．２，３３．４，３０．６；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₁Ｈ₃₅Ｎ₆Ｏ₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ５３９．２８，実測値５３９．２９。

窒素下、乾燥させた（トルエン（２５ｍＬ）と３回共沸乾燥）Ｓ３４（１．３６ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）を０℃（氷浴）で撹拌し、そこにＬｉＡｌＨ₄（２５．３ｍＬ、２５．３ｍｍｏｌ）のエーテル溶液１Ｍを加えた。得られる溶液を１６時間かけて２２Ｃに昇温し、その時点でＨＰＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物を冷却して０℃に戻し、ゆっくりと０．２ｍＬのＨ₂Ｏに次いで１５％ＫＯＨ水溶液（２ｍＬ）を加え、最後にＨ₂Ｏ（５ｍＬ）を加えて反応を停止させた。（Ｈ₂発生に注意すること！）。得られる懸濁液を０℃で３０分撹拌してろ過した。ろ過ケーキをさらなるＴＨＦ（５ｍＬ）で洗浄し、合わせた有機物をＭｇＳＯ₄で乾燥させて溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、７００ｍｇ（収率５１％）のＳ３５を黄色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．４５ − ８．１０（ｍ，１Ｈ），７．８６ − ７．６６（ｍ，１Ｈ），７．５９ − ７．４４（ｍ，４Ｈ），７．４３ − ７．３３（ｍ，３Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｓ，２Ｈ），３．８０ −３．５６（ｍ，４Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）２．７５ − ２．４７（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ １６３．５，１５６．０，１５４．０，１４５．１，１３９．７，１３８．９，１３１．４，１３０．６，１２８．４，１２７．９，１２７．３，１２７．０，１２６．４，１２５．６，１２５．４，１２４．２，１２３．５，１２２．９，１０５．５，９７．１，６７．７，６７．２，５８．６，５５．２，４６．２，３３．３，３０．８；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₁Ｈ₃₉Ｎ₆Ｏ₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ５４３．３１，実測値５４３．２８。

Ｓ３５（１４．０ｍｇ、２５．８μｍｏｌ）とＮＣＴ−ＴＦＰ（２０．２ｍｇ、２８．４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍＬ）に、Ｅｔ₃Ｎ（１８．０μＬ、１２９μｍｏｌ）を加え、得られる溶液を２２℃で１２時間撹拌し、その時点でＨＰＬＣ分析により出発物質の消費が示された。反応混合物をＣ１８カラムに直接担持させ、分取ＨＰＬＣ（Ｃ₁₈、５→９５％ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ、０．０５％ＴＦＡ）で精製した。溶媒を凍結乾燥によって除去し、３０．０ｍｇのＢＩＲＢ７９６−ＮＣＴ（Ｓ３６）（収率１０７％）を濃青色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．２６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），８．１５（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝７．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．４８（ｍ，４Ｈ），７．４７ − ７．４２（ｍ，１Ｈ），７．４３ − ７．３３（ｍ，２Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｓ，２Ｈ），４．６９（ｓ，２Ｈ），４．５７（ｄｄ，Ｊ＝５．８，３．７Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｂｒ．Ｓ，４Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ＝５．５，４．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６８（ｄｔ，Ｊ＝８．８，５．６Ｈｚ，４Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，８Ｈ），３．０３ − ２．８８（ｍ，４Ｈ），２．７７ − ２．６９（ｍ，４Ｈ），２．１０ − １．９８（ｍ，４Ｈ），１．９６ −１．８５（ｍ，４Ｈ），１．８２ − １．７１（ｍ，４Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₆₆Ｈ₇₁Ｎ₈Ｏ₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １０８７．５４，実測値１０８７．７４。

ＢＩＲＢ７９６−ＣＡ合成の基本手順：
Ｓ３５（１０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に、適切なクロロアルカンの炭酸４−ニトロフェニル（１０μｍｏｌ）を加え、次いでＥｔ₃Ｎ（５０μｍｏｌ）を２２℃で加えた。得られる黄色溶液を２２℃で１６時間放置し、その時点で溶媒を真空下で除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、ＢＩＲＢ−ＣＡ複合体を澄明または（帯）黄色の油として得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．２９ − ８．２５（ｍ，１Ｈ），７．８６ − ７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６０ − ７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１７ − ４．０７（ｍ，４Ｈ），３．７６ − ３．７０（ｍ，４Ｈ），３．６６ − ３．５８（ｍ，４Ｈ），３．５８ − ３．４９（ｍ，１０Ｈ），３．４９ − ３．３９（ｍ，３Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７４ − ２．５５（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｑ，Ｊ＝７．９，６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６５ − １．５０（ｍ，２Ｈ），１．５０ − １．３６（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ １６３．６，１５９．１，１５８．９，１５９．０，１５４．２，１４２．５，１３９．７，１３９．０，１３１．６，１３０．７，１２８．３，１２８．０，１２７．３，１２７．０，１２６．５，１２５．５，１２５．４，１２４．４，１２３．５，１２３．０，１０５．６，９７．１，７２．２，７１．５，７１．２，７１．２，７０．９，７０．５，６７．７，６７．３，６５．３，６５．１，５８．７，５５．２，４５．７，４５．１，４１．７，３３．７，３３．７，３０．８，３０．５，２７．７，２６．５；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₉Ｈ₇₁ＣｌＮ₇Ｏ₁₁ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ９６８．４９，実測値９６８．７４。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３１ − ８．２５（ｍ，１Ｈ），７．８１ − ７．７６（ｍ，１Ｈ），７．５７ − ７．５１（ｍ，１Ｈ），７．５１ − ７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４７ − ７．３６（ｍ，４Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），５．６９ − ５．５８（ｍ，２Ｈ），４．６２（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４１ − ４．２５（ｍ，４Ｈ），３．７７ −３．７０（ｍ，４Ｈ），３．６２−３．５２（ｍ，５Ｈ），３．５１ − ３．４１（ｍ，５Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８１−２．６４（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｑ，Ｊ＝８．１，６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６５−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４９− １．３５（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ １６３．７，１５８．９，１５８．６，１５６．１，１５４．２，１４２．５，１３９．７，１３９．０，１３１．６，１３０．７，１２９．４，１２９．２，１２８．３，１２８．０，１２７．３，１２７．１，１２６．５，１２５．６，１２５．４，１２４．５，１２３．５，１２３．０，１０５．６，９７．３，７２．２，７１．２，７１．２，７０．９，６７．６，６７．２，６１．７，６１．５，５８．７，５５．２，４５．７，４５．２，４１．７，３３．７，３３．４，３０．８，３０．５，２７．７，２６．５；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₇Ｈ₆₅ＣｌＮ₇Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ９０６．４５，実測値９０６．５９。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３１ − ８．２４（ｍ，１Ｈ），７．８３ − ７．７７（ｍ，１Ｈ），７．５７ − ７．３１（ｍ，７Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），５．６３（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，２Ｈ），３．８２ − ３．６６（ｍ，４Ｈ），３．６１ − ３．３５（ｍ，１２Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７７ − ２．５９（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｑ，Ｊ＝８．０，６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６６ − １．５１（ｍ，２Ｈ），１．５１ − １．３５（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₉Ｈ₆₉ＣｌＮ₇Ｏ₁₀ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ９５０．４８，実測値９５０．６４。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３０ − ８．２５（ｍ，１Ｈ），７．８９ − ７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６１ − ７．３０（ｍ，７Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），５．８２ − ５．６７（ｍ，２Ｈ），４．５４ − ４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１６ − ４．０９（ｍ，２Ｈ），３．９６ − ３．９０（ｍ，２Ｈ），３．７５ − ３．６７（ｍ，４Ｈ），３．６０ − ３．５２（ｍ，７Ｈ），３．５３ − ３．３８（ｍ，５Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７７− ２．４９（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｑ，Ｊ＝７．９，６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．５６（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．５１ − １．３６（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₉Ｈ₆₉ＣｌＮ₇Ｏ₁₀ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ９５０．４８，実測値９５０．８８。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３０ − ８．２５（ｍ，１Ｈ），７．８１ − ７．７３（ｍ，１Ｈ），７．５４ − ７．３４（ｍ，７Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），５．６８ − ５．５９（ｍ，２Ｈ），４．６５ − ４．５８（ｍ，２Ｈ），４．５８ −４．５１（ｍ，２Ｈ），４．３５（ｓ，２Ｈ），４．３２（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１６ − ４．１２（ｍ，２Ｈ），３．７５ − ３．７０（ｍ，４Ｈ），３．６７ − ３．６２（ｍ，２Ｈ），３．６１ − ３．５３ ’（ｍ，９Ｈ），３．５３ − ３．４６（ｍ，５Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２９ − ３．２０（ｍ，４Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７１ − ２．６３（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｑ，Ｊ＝８．０，６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５７（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．５０ − １．３６（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₅₄Ｈ₇₈ＣｌＮ₈Ｏ₁₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １０８１．５４，実測値１０８１．７１。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３０ − ８．２３（ｍ，１Ｈ），７．８７ − ７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５９ − ７．３３（ｍ，７Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），５．８４ − ５．７２（ｍ，２Ｈ），４．５３ − ４．４５（ｍ，４Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），４．３２（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７９ − ３．６９（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６１ − ３．５３ ’（ｍ，９Ｈ），３．５３ − ３．４６（ｍ，５Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｔｄ，Ｊ＝５．６，２．２Ｈｚ，４Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７８ − ２．５６（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｑ，Ｊ＝８．０，６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５７（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．５０ − １．３６（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₅₄Ｈ₇₈ＣｌＮ₈Ｏ₁₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １０８１．５４，実測値１０８１．８０。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３０ − ８．２４（ｍ，１Ｈ），７．８３ − ７．７４（ｍ，１Ｈ），７．６１ − ７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｓ，２Ｈ），５．７４ − ５．６５（ｍ，２Ｈ），４．６８ − ４．５６（ｍ，４Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），４．３２（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２３ − ４．０３（ｍ，４Ｈ），３．７８ − ３．６８（ｍ，４Ｈ），３．６８ − ３．３９（ｍ，２７Ｈ），３．３０ − ３．１５（ｍ，７Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７４ − ２．５６（ｍ，４Ｈ），１．７５（ｄｑ，Ｊ＝８．１，６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６５ − １．５１（ｍ，２Ｈ），１．５１ − １．３５（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₆₁Ｈ₉₁ＣｌＮ₉Ｏ₁₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １２５６．８２，実測値１２５６．９６。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．３１ − ８．２５（ｍ，１Ｈ），７．８４ − ７．７７（ｍ，１Ｈ），７．６１ − ７．２３（ｍ，７Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．４１（ｓ，１Ｈ），５．８２（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｓ，４Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１５（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），３．８１ − ３．７０（ｍ，４Ｈ），３．７０ − ３．３７（ｍ，２７Ｈ），３．２９ − ３．１６（ｍ，６Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．７７ − ２．５０（ｍ，４Ｈ），１．７４（ｄｔ，Ｊ＝７．９，６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５７（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．５２ − １．３６（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₆₁Ｈ₉₁ＣｌＮ₉Ｏ₁₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １２５６．８２，実測値１２５６．９６。

ポナチニブ複合体
修飾ポナチニブの合成（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，４７０１−４７１９から一部を修正した手順）。

臭化塩（Ｓ５５）⁸（６８５ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）とＳ５６（８８０ｍｇ、３．６２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２５ｍＬ）を撹拌し、そこに炭酸カリウム（３３３ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を２２℃で加えた。得られる懸濁液を２２℃で６０時間撹拌し、その時点でＴＬＣにより出発物質の消費が示された。溶液を約２０ｍＬに濃縮してシリカに吸着させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、９１５ｍｇ（収率８５％）のＳ５７を帯黄色の油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．４１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），３．７４（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，２Ｈ），２．４６ − ２．３５（ｍ，８Ｈ），２．２７（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₀Ｈ₃₀Ｆ₃Ｎ₄Ｏ₄ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４４７．２２，実測値４４７．２５。

撹拌子を装備した２５０ｍＬフラスコに、Ｐｄ／Ｃ（８０ｍｇ、１０ｗｔ％）を投入した。窒素雰囲気下、Ｓ５７（８４０ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（７５ｍＬ）をカニューレを介して加え、フラスコの排気／水素ガスの充填を行った（３回）。水素雰囲気下（Ｈ₂バルーン）、懸濁液を５０分激しく撹拌し、その時点でＨＰＬＣにより出発物質の消費が示された。反応混合物をセライトパッドを介してろ過し、ケーキを別のＭｅＯＨ２００ｍＬで洗浄した。得られるメタノール溶液を濃縮し、７３５ｍｇ（収率９４％）のＳ５８を帯黄色の油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆，メジャー回転異性体を報告） δ ７．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８１ − ６．７２（ｍ，２Ｈ），５．４３（ｓ，２Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），２．９１（ｍ，２Ｈ），２．４０ − ２．８（ｍ，１０Ｈ），１．５８ − １．４５（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₀Ｈ₃₂Ｆ₃Ｎ₄Ｏ₂ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４１７．２５、実測値４１７．６６。

３−ヨード−４−メチル安息香酸（１．２８ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）に懸濁させた。塩化オキサリル（４２０μＬ、４．９ｍｍｏｌ）に次いで、ＤＭＦ（１滴）を加えた。反応物を２２℃で撹拌し、気体発生が約６０分観察され、その時点でＨＰＬＣ分析により出発物質のほぼ完全な消費が示された。溶媒を真空下で除去し、１．３８ｇ（収率１０１％）の橙色油として得た（保存時、凝脂）。この物質は、それ以上精製または特性解析を行わずに次工程で使用した。

Ｓ５８（４００ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１１．７ｍｇ、９６．０μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（２１４μＬ、１．２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）に、Ｓ５９（２７０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を加えた。得られる溶液を２２℃で９０分撹拌し、その時点でＨＰＬＣにより出発物質の消費が示された。真空下で溶媒を除去し、残渣をＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、３９１ｍｇ（収率６２％）のＳ５９を帯黄色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １０．４９（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５７（ｓ，２Ｈ），２．９３（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．５０ − ２．３０（ＤＭＳＯ−ｄ₅とオーバーラップ，ｍ，１２Ｈ），１．５４（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₈Ｈ₃₇Ｆ₃ＩＮ₄Ｏ₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６６１．１９，実測値６６１．２７。

Ｓ６０（２５０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（２１．９ｍｇ、１９μｍｏｌ）、ＣｕＩ（５．４ｍｇ、２８μｍｏｌ）、及び３−エチニルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン（Ｓ６１）（ＪＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，４７０１−４７１９）（７０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を、セプタで密封したバイアルに入れ、撹拌子を装備した。バイアルを排気し、アルゴンで充填した（３回）。乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に次いで、ジシクロヘキシルアミン（１１３μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を２２℃で１５時間撹拌し、その時点でＨＰＬＣにより出発物質の消費が示された。水（２０ｍＬ）を加え、反応物をＥｔＯＡｃで抽出した（２５ｍＬ、３回）。有機層を合わせてＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過して濃縮した。粗物質を分取ＨＰＬＣ（Ｃ₁₈、３→９７％ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ、０．０５％ＴＦＡ）で精製し、２０８ｍｇ（収率８１％）のＳ６２を黄色の油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １０．５６（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｄｄ，Ｊ＝４．４，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄ，Ｊ＝９．２，４．５Ｈｚ，１Ｈ），３．５７（ｓ，２Ｈ），２．９３（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．４８ − ２．３５，（ｍ，７Ｈ），２．３５ − ２．２０（ｍ，３Ｈ），１．５４（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆，） δ １６４．５，１５５．５，１４５．０，１４３．５，１３９．６，１３８．２，１３８．１，１３２．１８，１３２．０，１３１．２，１３０．１，１３０．０，１２８．５，１２７．３（ｑ，Ｊ＝３２Ｈｚ），１２６．１１，１２６．０７，１２３．５，１２２．５，１１９．０，１１７．２（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１１１．７，９６．４，８１．１，７７．３，５７．４，５５．３，５２．６，３８．３，２８．２，２６．５，２０．４；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₆Ｈ₄₁Ｆ₃Ｎ₇Ｏ₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６７６．３１，実測値６７６．３０。

Ｓ６２（１５０ｍｇ、１６６μｍｏｌ）を開裂カクテル（１００：２０：１のＤＣＭ：ＴＦＡ：ＴｉＰＳ）１５ｍＬで１時間処理し、その時点でＨＰＬＣにより出発物質の消費及び単一生成物への変換が示された。溶媒を真空下で除去して１４０ｍｇ（収率９２％）のＳ６３を黄色固体として得、さらなる特性解析及び精製を行わずに次工程で使用した。

ポナチニブ−ＣＡ合成の基本手順：
Ｓ６３（１０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に、適切なクロロアルカンの炭酸４−ニトロフェニル（ＣＡ−Ｔ１炭酸４−ニトロフェニル（Ｓ８７）合成）³（１０μｍｏｌ）を加え、次いでＥｔ₃Ｎ（５０μｍｏｌ）を２２℃で加えた。得られる黄色溶液を２２℃で１６時間放置し、その時点で溶媒を真空下で除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、ポナチニブ−ＣＡ複合体を澄明または（帯）黄色の油として得た。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．６３（ｄｄ，Ｊ＝４．４，１．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１Ｈｚ，２Ｈ），８．１０（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝９．３，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２０ − ４．１２（ｍ，４Ｈ），３．７５ − ３．６４（ｍ，６Ｈ），３．６３（ｓ，４Ｈ），３．６０ − ３．５０（ｍ，８Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３５ − ３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＤ₂ＨＯＤとオーバラップ），３．１５（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６６（ｓ，４Ｈ），２．６３ − ２．５４（ｍ，６Ｈ），２．５０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７４（ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ），１．５８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．５１ − １．２９（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₄₉Ｈ₆₅Ｃ１Ｆ₃Ｎ₈Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １００１．４５，実測値１００１．５７。

¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．６５（ｄｄ，Ｊ＝４．５，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１７ − ８．１５（ｍ，１Ｈ），８．１３（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄ，Ｊ＝９．５，４．２Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｍ，２Ｈ），４．５３（ｍ，５Ｈ），４．２２ − ４．１１（ｍ，５Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．７３ − ３．６５（ｍ，５Ｈ），３．６５ − ３．５６（ｍ，１４Ｈ），３．５５ − ３．４９（ｍ，９Ｈ），３．４９ − ３．４３（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），３．２８−３．１５（ｍ，８Ｈ），３．１４−３．０１（ｍ，１Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６１−２．４１（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），１．７６（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．５０ − １．２８（ｍ，４Ｈ）；（ＥＳＩ＋）Ｃ₆₁Ｈ₈₅Ｃ１Ｆ₃Ｎ₁₀Ｏ₁₅ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １２８９．５８，実測値１２８９．７９。

ポナチニブとトリ−アミド−クロロアルカンの複合体
トリ−アミド−クロロアルカンリンカーの合成

ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）プロパノアート（１．００ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）を撹拌し、そこにクロロギ酸４−ニトロフェニル（１．２９ｇ、６．４０ｍｍｏｌ）に次いでピリジン（１．７２ｍＬ、２１．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られる濁った溶液を２２℃で２０時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下、反応混合物を約２０ｍＬに濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（０→４０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、１．３５ｇ（収率７９％）のＳ７２を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．４７ − ８．１８（ｍ，２Ｈ），７．６８ − ７．４４（ｍ，２Ｈ），４．５４ − ４．１６（ｍ，２Ｈ），３．７６ − ３．６５（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．５８ − ３．４６（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １７０．４，１５５．３，１５２．０，１４５．１，１２５．４，１２２．５，７９．７，６９．７，６９．６，６８．３，６７．９，６６．２，３５．８，２７．７；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₈Ｈ₂₅ＮＮａＯ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ４２２．１，実測値４２２．１。

Ｓ７２（８２０ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（２０ｍＬ）に、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン−１−アミン塩酸塩（Ｓ０７）（５８８ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を加え、次いで、トリメチルアミン（１．４３ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を１８時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。反応混合物をほぼ真空下で濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、６７４ｍｇ（収率６８％）のＳ７３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１６ − ３．８９（ｍ，２Ｈ），３．７２ − ３．５３（ｍ，６Ｈ），３．５３ − ３．４３（ｍ，８Ｈ），３．３８（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７０（ｄｑ，Ｊ＝８．０，６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．５８ − １．４４（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，１３Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １７０．４，１５６．２，７９．７，７０．２，６９．６，６９．５，６９．４，６９．１，６８．８，６６．２，６３．１，４５．３，３５．８，３２．０，２９．０，２７．７，２６．１，２４．９；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₂Ｈ₄₂ＣｌＮＮａＯ₈ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ５０６．３，実測値５０６．２。

Ｓ７３（５６４ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に、ＴｉＰＳ（０．２５ｍＬ）を加え、次いでＴＦＡ（５ｍＬ）を加えた。得られる溶液を５時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗Ｓ７４を、それ以上精製せずに以降の工程で使用した。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１１ − ３．９３（ｍ，２Ｈ），３．７０ − ３．５８（ｍ，３Ｈ），３．５８ − ３．５１（ｍ，３Ｈ），３．５１ − ３．４２（ｍ，７Ｈ），３．３８（ｑｄ，Ｊ＝６．８，１．２Ｈｚ，５Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｄｔ，Ｊ＝８．０，６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４２− １．２０（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₈Ｈ₃₅ＣｌＮＯ₈ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４２８．２１，実測値４２８．４９。

アルゴン下、Ｓ０４（１．２０ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）、ＮｏｓＮＨＢｏｃ（２．１０ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）及びＰＰｈ₃（２．７３ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３０ｍＬ）を０℃で撹拌し、そこにＤＩＡＤ（２．３３ｍＬ、１１．１ｍｍｏｌ、９４％）を加えた。得られる黄色溶液を２２℃に昇温して１７時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→５０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、２．３ｇ（収率７３％）のＳ７５を黄色油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．２６ − ８．１２（ｍ，１Ｈ），８．１２ − ８．０３（ｍ，１Ｈ），８．０３ − ７．７８（ｍ，２Ｈ），５．９０ − ５．６３（ｍ，２Ｈ），４．２７（ｍ，２Ｈ），４．２９ − ４．２３（ｍ，２Ｈ），４．２０ − ４．０７（ｍ，１Ｈ），４．０２ −３．８６（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．４，８．０，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５１−３．３４（ｍ，１Ｈ），１．８４− １．５４（ｍ，２Ｈ），１．５３ − １．３８（ｍ，４Ｈ），１．２３（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １４９．５，１４７．１，１３５．５，１３１．７，１３１．４，１３０．１，１２６．６，１２４．８，９７．２，８４．９，６５．９，６１．３，４８．１，３０．２，２７．２，２５．０，１９．１；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₀Ｈ₂₉Ｎ₂Ｏ₈Ｓ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４５７．１６，実測値４５７．４。

Ｓ７５（６９０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）及び４−メルカプト安息香酸（４６６ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（８３６ｍｇ、６．０５ｍｍｏｌ）を加え、得られる懸濁液を４０℃に昇温して２０時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗残渣を水（５０ｍＬ）とＤＣＭ（５０ｍＬ）に分離させた。有機層を除去し、水層をさらなるＤＣＭ（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を合わせてＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→４０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、２１９ｍｇ（収率５３％）のＳ７６を黄色油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ６．９８（ｓ，１Ｈ），５．８０ − ５．４４（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１９ − ３．９９（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝１２．７，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．４，７．９，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５３（ｓ，２Ｈ），３．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，５．７Ｈｚ，１Ｈ），１．８５− １．５４（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，４Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １５５．４，１２９．９，１２６．８，９７．１，７７．６，６６．３，６１．２，４１．１，３０．２，２８．２，２５．０，１９．１；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₄Ｈ₂₅ＮＮａＯ₄ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ２９４．２，実測値２９４．０。

Ｓ７６（２１８ｍｇ、８０３μｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（１０ｍＬ）に、ＰＰＴＳ（２０ｍｇ、８０μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４５℃で９０分維持し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→７０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、１５０ｍｇ（収率９９％）のＳ７７を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ６．９４（ｍ，１Ｈ），５．８１ − ５．２７（ｍ，２Ｈ），４．６５（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｓ，２Ｈ），３．５１（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ １５５．５，１３１．０，１２６．８，７７．５，６０．９，４１．２，２８．３；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₉Ｈ₁₈ＮＯ₃ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １８８．１３，実測値１８８．１７。

Ｓ７７（１５０ｍｇ、８０１μｍｏｌ）のトルエン溶液（５ｍＬ）を０℃で撹拌し、そこにＤＰＰＡ（２７０ｍｇ、９６１μｍｏｌ）に次いでＤＢＵ（１４５μＬ、９６１μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で２時間維持し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示され、反応混合物をシリカゲルカラムに直接担持させてシリカゲルクロマトグラフィー（０→５０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、１００ｍｇ（収率５９％）のＳ７８を澄明な油として得た（¹ＨＮＭＲによる異性体の混合比、約５：１）。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₂Ｃｌ₂，メジャー（直鎖型）異性体を報告） δ ５．９５ − ５．５１（ｍ，２Ｈ），４．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），３．７６（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₁₈Ｈ₃₃Ｎ₈Ｏ₃ ⁺に対する計算値［２Ｍ＋Ｈ］⁺ ４２５．２６，実測値４２５．４５。

ＴＨＦ（１０ｍＬ）とＨ₂Ｏ（２．５ｍＬ）の混合液に溶解させたＳ７８（１００ｍｇ、４７１μｍｏｌ）の溶液を撹拌し、そこに樹脂に結合させたＰＰｈ₃（１ｇ、１．４〜２．００ｍｍｏｌ／ｇ）を加えた。反応混合物を２２℃で１８時間維持し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。固体をろ去して溶媒を真空下で除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→９０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、２１ｍｇ（収率２４％）のＳ７９を帯黄色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ６．８９（ｍ，１Ｈ），５．７２ −５．５１（ｍ，１Ｈ），５．５１−５．３１（ｍ，１Ｈ），３．４８（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｄｄ，Ｊ＝５．１，１．５Ｈｚ，３Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）。

Ｓ７９（２０．０ｍｇ、１０７μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、Ｓ７４（５７．４ｍｇ、１３４μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５１．０ｍｇ、１３４μｍｏｌ）、及びＥｔ₃Ｎ（７５μＬ、５３７μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４ｍＬ）を加えた。得られる黄色溶液を４０℃で２時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、５０ｍｇ（収率７８％）のＳ８０を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．９６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５０ − ５．４４（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），３．６９ − ３．４４（ｍ，１６Ｈ），３．４２ − ３．３４（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．３５− １．２７（ｍ，２Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₇Ｈ₅₁ＣｌＮ₃Ｏ₉ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ５９６．３３，実測値５９６．４８。

Ｓ８０（５０ｍｇ、８４μｍｏｌ）を開裂カクテル（１００：１０：１のＤＣＭ−ＴＦＡ−ＴｉＰＳ）１０ｍＬに溶解させ、反応混合物を２２℃で４０分撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗残渣を精製し、Ｅｔ₂Ｏで洗浄して４１ｍｇ（収率８０％）のＳ８１を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．０８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｓ，３Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ１Ｈ），６．８５−５．７１（ｍ，１Ｈ），５．６２−５．４５（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６６ − ３．５３（ｍ，６Ｈ），３．５３ − ３．４１（ｍ，１２Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．３３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７１（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３５（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₂Ｈ₄₃ＣｌＮ₃Ｏ₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ４９６．２８，実測値４９６．３６。

ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）３，３’−（エタン−１，２−ジイルビス（オキシ））ジプロピオナート（５２．０ｍｇ、１３１μｍｏｌ）及びＮＥｔ₃（９μＬ、０．０７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）を激しく撹拌し、そこにＳ８１（２０ｍｇ、３３μｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）を１５分かけて２２℃で加えた。添加完了時、反応混合物をさらに４０分反応させた。真空下で溶媒を除去して粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、ＭＳで所望のｍ／ｚを与えた画分を採取し、２２ｍｇ（収率８６％）のＳ８２を澄明な油として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₄Ｈ₅₈ＣｌＮ₄Ｏ₁₄ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ７８１．３６，実測値７８１．５３。

Ｓ６３（８．５ｍｇ、９．３μｍｏｌ）、Ｓ８２（２２ｍｇ、２８μｍｏｌ）、及びＥｔ₃Ｎ（７μＬ、４８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を２２℃で９０分撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下で溶媒を除去して粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１００％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、５．５ｍｇ（収率４８％）のＳ８３を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．６３（ｄｄ，Ｊ＝４．３，１．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，４．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６３ｍ，２Ｈ），４．１５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８４ − ３．７６（ｍ，４Ｈ），３．７５ − ３．６９（ｍ，６Ｈ），３．６７（ｍ，３Ｈ），３．６３ − ３．５４（ｍ，１１Ｈ），３．５４ − ３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２８（ｍ，２Ｈ），３．２６ − ３．１６（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｄ，Ｊ＝２５．９Ｈｚ，８Ｈ），２．４３（ｔｄ，Ｊ＝６．１，４．４Ｈｚ，６Ｈ），１．８５ − １．６６（ｍ，４Ｈ），１．５８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．５０ − １．３３（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₆₁Ｈ₈₅Ｃ１Ｆ₃Ｎ₁₀Ｏ₁₂ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １２４１．６０，実測値１２４１．８１。

ポナチニブとａｌｌ−ＰＥＧクロロアルカンの複合体の合成
ａｌｌ−ＰＥＧクロロアルカンリンカー（最適化していない）の合成

Ｎ₂下、撹拌子が装備された炉乾燥済み５００ｍＬフラスコに、ＮａＨ（９８８ｍｇ、６０％、鉱油分散、２４．７ｍｍｏｌ）に次いでＴＨＦ（１００ｍＬ）を０℃で投入した。未希釈の２，２’−（（オキシビス（エタン−２，１−ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン−１−オール）（４．０ｇ、２１ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下した後、（Ｅ）−１，４−ジブロモ−２−ブテン（２．２０ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）含有ＴＨＦ（１０ｍＬ）を１度に加えた。反応混合物を２０時間かけて２２℃に昇温し、１ｍＬのＡｃＯＨを加えて反応混合物の反応を停止させた。反応混合物をセライトに吸着させ、溶媒を真空下で除去した。シリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）による精製を実施した。ビス−アルキル化生成物（ｍ／ｚ＝４４１．２６［Ｍ＋Ｈ］⁺）で富化した画分を合わせて濃縮し、開始ジオール、モノアルキル化生成物及びビス−アルキル化生成物の混合物（ＳＬ＿０７１８）として３６０ｍｇの黄色油を得た。

混合物ＳＬ＿０７１８（３６０ｍｇ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）に溶解させ、クロロギ酸４−ニトロフェニル（４９４ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、次いでピリジン（０．６６ｍＬ、８．２ｍｍｏｌ）で処理した。得られる溶液を２２℃で撹拌したまま１８時間放置した後、シリカゲルカラムに直接担持させた。シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製した。少量画分から不純物のない（ｃｌｅａｎ）２７ｍｇの生成物ＳＬ＿０７２３を帯黄色油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．４４ − ８．１２（ｍ，２Ｈ），７．７８ − ７．３０（ｍ，２Ｈ），５．７１ − ５．６８（ｍ，２Ｈ），４．５３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），４．４１ − ４．２５（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｍ，４Ｈ），３．７１ − ３．６５（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５２ − ３．４２（ｍ，２４Ｈ），３．４１ − ３．３６（ｍ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₂₇Ｈ₄₃ＮＮａＯ₁₄ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ６２８．２６，実測値６２８．２４。

ＳＬ＿０７２３（２７ｍｇ、４５μｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液（７ｍＬ）に、Ｊ１４５４Ｔ（１３ｍｇ、５０μｍｏｌ）を加え、次いでＮＥｔ₃（３１μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。得られる黄色溶液を２０時間反応させ、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全消費が示された。真空下で溶媒を除去し、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、２６ｍｇ（収率８５％）のＳＬ＿０７２５を黄色油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ７．１８（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．７４ −５．６７（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０７ − ４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９９ − ３．８４（ｍ，４Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５８ − ３．４４（ｍ，３２Ｈ），３．４４ − ３．３３（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４３ − １．２２（ｓ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₁Ｈ₆₁ＣｌＮＯ₁３⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６９０．３８，実測値６９０．６２。

ＳＬ＿０７２５（２６ｍｇ、３８μｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を撹拌し、そこにクロロギ酸４−ニトロフェニル（１５ｍｇ、７５μｍｏｌ）を加えた後、ピリジン（１５μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。得られる溶液を２２℃で２０時間撹拌し、その時点でＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下、反応混合物を約５ｍＬに濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（０→１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して５ｍｇ（収率１６％）のＳＬ＿０７２７を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ ８．４５ − ８．１４（ｍ，２Ｈ），７．６７ − ７．４５（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．７２（ｍ，２Ｈ），４．４７ − ４．２７（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９９ − ３．８７（ｍ，４Ｈ），３．７８ − ３．６６（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．５８ − ３．４２（ｍ，３０Ｈ），３．４２ − ３．３３（ｍ，４Ｈ），３．１０（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４７（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４１（ｓ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₃₈Ｈ₆₄ＣｌＮ₂Ｏ₁₇ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ ８５５．３９，実測値８５５．５４。

Ｓ６３（５ｍｇ、６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に、ＳＬ＿０７２７（５ｍｇ、６μｍｏｌ）を加えた後、１滴のＮＥｔ₃を滴下した。得られる帯黄色溶液を２２℃で撹拌したまま１９時間放置し、その時点でＨＰＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。真空下、反応混合物を濃縮してシリカゲルクロマトグラフィー（０→３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、５．５ｍｇ（収率７４％）のＳＬ＿０７２９を澄明な油として得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ） δ ８．６３（ｄｄ，Ｊ＝４．５，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄｄ，Ｊ＝７．７，２．１Ｈｚ，２Ｈ），８．０９（ｄｄ，Ｊ＝９．３，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝９．２，４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．７９（ｍ，２Ｈ），４．３４ − ４．０７（ｍ，４Ｈ），４．０７ − ３．８６（ｍ，４Ｈ），３．７１ − ３．５９（ｍ，２８Ｈ），３．５９ − ３．５０（ｍ，１２Ｈ），３．５０ − ３．４３（ｍ，２Ｈ），３．２７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１４（ｑ，Ｊ＝８．４，７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７６ − ２．６７（ｂｒ．Ｓ．４Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），２．６２ − ２．５０（ｍ，６Ｈ），１．７５（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），１．５８（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．５１ − １．２６（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ₆₃Ｈ₉₁ＣｌＦ₃Ｎ₈Ｏ₁₅ ⁺に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］⁺ １２９１．６３，実測値１２９１．７９。

本出願で言及されたすべての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、記載にある特徴及び実施例のさまざまな変更、再組合わせ、及び変形は当業者に明らかとなろう。具体的な実施形態が記載されてはいるが、主張される本発明がそのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されるべきである。事実、関連分野の当業者には明白である、記載されている様態及び実施形態に関する各種変更は、以下の請求項の範囲内であることが意図される。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕二重機能性、細胞透過性、細胞適合性のある、官能基選択的に開裂可能な組成物であって、
（ａ）細胞相互作用要素と、
（ｂ）捕捉要素と、
（ｃ）前記細胞相互作用要素を前記捕捉要素に共有結合により係留させるリンカーとを含み、ここで、前記リンカーは、官能基選択的に開裂可能な部分を含む、前記組成物。
〔２〕前記細胞相互作用要素は、低分子またはペプチドである、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記捕捉要素は、酵素に対する共有結合性基質である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕前記捕捉要素はハロアルカン基を含む、前記〔３〕に記載の組成物。
〔５〕前記捕捉要素は親和性要素である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔６〕前記官能基選択的に開裂可能な部分は、アリル−ヘテロ原子基、プロパルギル−ヘテロ原子基からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔７〕前記官能基選択的に開裂可能な部分は、アリルエーテル、アリルアミン、アリルエステル、アリルアミド、アリル尿素、アリルカルボナート、及びアリルカルバマートからなる群から選択されるアリル−ヘテロ原子基を含む、前記〔６〕に記載の組成物。
〔８〕前記官能基選択的に開裂可能な部分は、アリルカルバマート基を含む、前記〔７〕に記載の組成物。
〔９〕前記官能基選択的に開裂可能な部分は、プロパルギルエーテル、プロパルギルアミン、プロパルギルエステル、プロパルギルアミド、プロパルギル尿素、プロパルギルカルボナート、及びプロパルギルカルバマートからなる群から選択されるプロパルギル−ヘテロ原子基を含む、前記〔６〕に記載の組成物。
〔１０〕式
Ｚ−Ｌ ¹ −Ｙ−Ｌ ² −Ｑ、
［式中、Ｚは細胞相互作用要素であり、Ｑは捕捉要素であり、ここで、Ｌ ¹ とＬ ² は、互いに独立して任意選択で存在する独立リンカー部分であり、Ｙは官能基選択的に開裂可能な部分である］を含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔１１〕（ａ）前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の二重機能性、細胞透過性、細胞適合性のある、官能基選択的に開裂可能な組成物を細胞に投与すること、
（ｂ）細胞相互作用要素を、対応する細胞内の細胞内標的に結合させること、
（ｃ）前記細胞を溶解させて細胞溶解物を作製すること、及び
（ｄ）前記捕捉要素を、表面に固定化された捕捉物質と接触させること
を含む、方法。
〔１２〕（ｅ）前記官能基選択的に開裂可能なリンカーを対応する官能基選択性物質と接触させ、これにより、前記細胞相互作用要素と前記結合した細胞内標的を、前記表面から遊離させることをさらに含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕（ａ）前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の二重機能性、細胞透過性、細胞適合性のある、官能基選択的に開裂可能な組成物と、
（ｂ）（ｉ）細胞、
（ｉｉ）細胞内標的、
（ｉｉｉ）表面に提示された捕捉物質、及び
（ｉｖ）官能基選択性物質の４つのうち１つ以上
とを含む、系。
〔１４〕遷移金属で開裂可能なリンカーによって第２の分子成分に連結された第１の分子成分を含む、官能基選択的に開裂可能な組成物と、遷移金属イオン、または遷移金属イオンを放出できる官能基選択性物質とを、前記遷移金属イオンによって前記開裂可能なリンカーが開裂される条件下で接触させ、前記第１の分子成分を前記第２の分子成分から遊離させること
を含む、方法。
〔１５〕前記官能基選択的に開裂可能な部分は、アリル−ヘテロ原子基及びプロパルギル−ヘテロ原子基からなる群から選択される、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕前記アリル−ヘテロ原子基は、アリルエーテル、アリルアミン、アリルエステル、アリルアミド、アリル尿素、アリルカルボナート、及びアリルカルバマートからなる群から選択される、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記アリル−ヘテロ原子基はアリルカルバマート基を含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記官能基選択的に開裂可能な部分は、プロパルギルエーテル、プロパルギルアミン、プロパルギルエステル、プロパルギルアミド、プロパルギル尿素、プロパルギルカルボナート、及びプロパルギルカルバマートからなる群から選択されるプロパルギル−ヘテロ原子基を含む、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１９〕前記遷移金属はＰｄまたはＲｕである、前記〔１４〕に記載の方法。
〔２０〕前記条件はタンパク質性の環境を含む、前記〔１４〕に記載の方法。
〔２１〕前記タンパク質性の環境は細胞または細胞溶解物である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕前記第１の分子成分は細胞相互作用要素であり、細胞内標的に結合している、前記〔１４〕に記載の方法。
〔２３〕前記第２の分子成分は捕捉要素であり、捕捉物質に結合している、前記〔１４〕に記載の方法。
〔２４〕前記捕捉物質は表面に結合している、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕（ａ）（ｉ）相互作用要素と、
（ｉｉ）捕捉要素と、
（ｉｉｉ）官能基選択的に開裂可能な部分を含んでいる、前記相互作用要素を前記捕捉要素に共有結合で係留させるリンカーと
を含む組成物を、細胞溶解物または生化学組成物に投与すること、
（ｂ）前記相互作用要素と対応する標的とが結合できるようにすること、
（ｃ）前記捕捉要素を、表面に固定化された捕捉物質と接触させること
を含む、方法。
〔２６〕（ｄ）前記官能基選択的に開裂可能なリンカーを対応する官能基選択性物質と接触させ、これにより、前記相互作用要素と前記結合した標的を前記表面から遊離させることをさらに含む、前記〔１０〕に記載の方法。

Claims

（ａ）二重機能性、細胞透過性、細胞適合性のある、官能基選択的に開裂可能な組成物を細胞に投与する工程、ここで、前記組成物は
（ｉ）細胞標的タンパク質と非共有結合することができる相互作用要素と、
（ii）ハロアルカン基を含む捕捉要素と、
（iii）アリル−ヘテロ原子基、プロパルギル−ヘテロ原子基からなる群から選択される官能基選択的に開裂可能な部分を含む、前記相互作用要素を前記捕捉要素に共有結合により係留させるリンカーとを含む、
（ｂ）前記相互作用要素を、対応する細胞標的タンパク質に結合させる工程、
（ｃ）前記細胞を溶解させて細胞溶解物を作製する工程、及び
（ｄ）前記捕捉要素を、表面に固定化された捕捉物質と接触させる工程
を含む、方法。
（ｅ）前記官能基選択的に開裂可能なリンカーを対応する官能基選択性物質と接触させ、これにより、前記相互作用要素と前記結合した細胞標的タンパク質を、前記表面から遊離させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
（ａ）（ｉ）細胞標的タンパク質と非共有結合することができる相互作用要素と、
（ii）ハロアルカン基を含む捕捉要素と、
（iii）アリル−ヘテロ原子基、プロパルギル−ヘテロ原子基からなる群から選択される官能基選択的に開裂可能な部分を含む、前記相互作用要素を前記捕捉要素に共有結合で係留させるリンカーとを含む組成物を、細胞又は細胞溶解物に投与する工程、
（ｂ）前記相互作用要素を、対応する標的に結合させる工程、及び
（ｃ）前記捕捉要素を、表面に固定化された捕捉物質と接触させる工程
を含む、方法。
（ｄ）前記官能基選択的に開裂可能なリンカーを対応する官能基選択性物質と接触させ、これにより、前記相互作用要素と前記結合した標的を前記表面から遊離させる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
前記官能基選択的に開裂可能な部分は、アリルカルバマート基を含む、請求項１又は３に記載の方法。