ES2559505T3

ES2559505T3 - Luciferasas de Oplophorus sintéticas con mayor emisión de luz

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Publication number: ES2559505T3
Application number: ES10717013.6T
Authority: ES
Inventors: Lance P. Encell; Keith V. Wood; Monika G. Wood; Mary Hall; Paul Otto; Gediminas Vidugiris; Kristopher Zimmerman
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2010-05-03
Publication date: 2016-02-12
Anticipated expiration: 2030-05-03
Also published as: IL274145A; US10233485B2; CN102459579B; CA2758572A1; DK3409764T3; PL3181687T3; US20100281552A1; PT2456864E; EP3409764B1; IL265263B; US11667950B2; PT3409764T; IL265263A; CN108192950A; CN102459579A; EP3181687A1; US11365436B2; PT2990478T; EP3409764A1; EP3181687B1

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de luciferasa modificada que tiene al menos 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con una luciferasa de Oplophorus de tipo salvaje, y que comprende más de una sustitución de un aminoácido en posiciones seleccionadas de 2, 4, 11, 20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 166, 167 y 169 correspondientes a SEQ ID NO:1, en el que el polipéptido de luciferasa modificada presenta un aumento en al menos 4 veces de la emisión de luminiscencia en una célula procariota y/o una célula eucariota, con relación a la correspondiente luciferasa de Oplophorus de tipo salvaje.

Description

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Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Estos programas aparean secuencias similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones, inserciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas generalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

El término “aislado”, cuando se emplea en relación con un ácido nucleico o un polipéptido, tal como en “oligonucleótido aislado”, “polinucleótido aislado”, “proteína aislada” o “polipéptido aislado”, se refiere a un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos que se identifica y se separa de al menos un contaminante con el que normalmente está asociado en su origen. Así, un ácido nucleico aislado o un polipéptido aislado está presente en una forma o en un emplazamiento que es diferente del que se encuentra en la naturaleza. Por contraste, los ácidos nucleicos no aislados (por ejemplo, ADN y ARN) o los polipéptidos no aislados (por ejemplo, proteínas y enzimas) se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia dada de ADN (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la célula hospedante cerca de genes vecinos; las secuencias de ARN (por ejemplo, una secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica) se encuentran en la célula como una mezcla con numerosos otros ARNm que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, un ácido nucleico aislado incluye, por ejemplo, dicho ácido nucleico en células que normalmente expresan este ácido nucleico, en donde el ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente que la de las células naturales,

o bien está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente que la que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico u oligonucleótido aislado puede estar presente en forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando el ácido nucleico u oligonucleótido aislado se va a utilizar para expresar una proteína, el oligonucleótido contiene, como mínimo, la hebra sentido o codificadora (es decir, un ácido nucleico monocatenario), pero puede contener hebras sentido y antisentido (es decir, un ácido nucleico bicatenario).

Las expresiones y el término “molécula de ácido nucleico”, “polinucleótido” o “secuencia de ácido nucelico”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un ácido nucleico, ADN o ARN, que comprende las secuencias codificadoras necesarias para la producción de un polipéptido o precursor de proteína. El polipéptido codificado puede ser un polipéptido de longitud completa, uno de sus fragmentos (más pequeño que la longitud completa), o una fusión del polipéptido de longitud completa, o de uno de sus fragmentos, con otro polipéptido, produciendo un polipéptido de fusión.

La “luciferasa de Oplophorus” es un complejo de proteínas de 35 kDa y 19 kDa nativas. La proteína de 19 kDa es el componente catalítico más pequeño (GenBank n.º de registro BAB13776, 196 aminoácidos). Tal como se emplea en la presente, OgLuc es la proteína de 19 kDa sin el péptido señal (169 aminoácidos, restos 28 a 196 de BAB13776).

Un “péptido”, una “proteína” y un “polipéptido” significa cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación). Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención codifican un variante de una proteína natural, o un fragmento polipeptídico de esta, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la proteína natural (nativa o de tipo salvaje) a partir de la cual se deriva. La expresión “polipéptido de fusión” o “proteína de fusión” se refiere a una proteína quimérica que contiene una proteína de referencia (por ejemplo, luciferasa) unida en el N-y/o C-terminal a una o más secuencias heterólogas (por ejemplo, un polipéptido que no es de luciferasa).

La estructura primaria de la proteína (secuencia primaria, secuencia peptídica, secuencia de proteína) es la secuencia de aminoácidos. En general se indica comenzando a partir del extremo amino-terminal (N) hasta el extremo carboxilo-terminal (C). La estructura secundaria de la proteína puede describirse como la conformación local de la cadena peptídica, independiente del resto de la proteína. Existen elementos de la estructura secundaria ”regulares” (por ejemplo, hélices, láminas o cadenas) que en general están estabilizados mediante interacciones de enlaces de hidrógeno entre los átomos del esqueleto de los restos participantes, y elementos de la estructura secundaria “irregulares” (por ejemplo, curvas, vueltas, bucles, espirales, segmentos desordenados o no estructurados). La estructura secundaria de la proteína puede predecirse con diferentes métodos/programas, por ejemplo, PSIPRED (McGuffin et al., Bioinformatics, 16:404 (2000)), PORTER (Pollastri et al., Bioinformatics, 21:1719 (2005)), DSC (King y Sternberg, Protein Sci., 5:2298 (1996)), véase http://www.expasy.Org/tools/#secondary para obtener una lista. La estructura terciaria de una proteína es la estructura tridimensional global de la cadena peptídica. Se describe a través de las posiciones atómicas en el espacio tridimensional, y puede implicar interacciones entre grupos que están distantes en la estructura primaria. Las estructuras terciarias de las proteínas se clasifican en plegamientos, que son disposiciones tridimensionales específicas de elementos de la estructura secundaria. A veces no existe una similitud de secuencia discernible entre proteínas que tienen el mismo plegamiento.

La expresión “de tipo salvaje” o el término “nativo”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un gen o un producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico aislado a partir de una fuente natural. Un gen de tipo salvaje es el que se observa con más frecuencia en una población y, por tanto, se denomina de modo arbitrario la forma “de tipo salvaje” del gen. En contraste, el término “mutante” se refiere a un gen o un producto génico que muestra modificaciones en la secuencia y/o las propiedades funcionales (es decir, características

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procariotas incluyen, pero no se limitan los promotores SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac o de maltosa, e incluyen cualquier fragmento que tenga actividad de promotor. Los promotores de eucariotas incluyen, pero no se limitan a promotores constitutivos, por ejemplo, promotores víricos, tales como promotores de CMV, SV40 y RSV, así como promotores regulables, por ejemplo, un promotor inducible o reprimible, tal como el promotor tet, el promotor hsp70 y un promotor sintético regulado por CRE, incluyendo cualquier fragmento que tenga actividad de promotor. La molécula de ácido nucleico, el módulo de expresión y/o el vector de la invención puede introducirse en una célula mediante cualquier método que incluye, pero no se limita a una transformación mediada por calcio, una electroporación, una microinyección, una lipofección y similares.

III. Secuencias optimizadas y vectores y células hospedantes que codifican la luciferasa modificada

También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, uno de sus fragmentos o una fusión de esta. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para la expresión en al menos un hospedante seeleccionado. Las secuencias optimizadas incluyen secuencias que tienen codones optimizados, es decir, los codones que se emplean con más frecuencia en un organismo con relación a otro organismo, por ejemplo, un organismo con parentesco lejano, así como modificaciones para añadir o modificar secuencias Kozak y/o intrones y/o para eliminar secuencias no deseables, por ejemplo, sitios potenciales de unión a factores de transcripción. Estas secuencias optimizadas pueden producir una mayor expresión, por ejemplo, un mayor nivel de expresión de proteínas, cuando se introducen en una célula hospedante.

En una realización, el polinucleótido incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, y dicha secuencia de ácido nucleico está optimizada para la expresión en una célula hospedante de mamífero. En una realización, un polinucleótido optimizado ya no se hibrida con la correspondiente secuencia no optimizada, por ejemplo, no se hibrida con la secuencia no optimizada bajo condiciones de rigurosidad alta o intermedia. El término “rigurosidad” se emplea para referirse a condiciones de temperatura, fuerza iónica y la presencia de otros compuestos, bajo las cuales se realizan las hibridaciones de los ácidos nucleicos. Con unas condiciones de “alta rigurosidad”, el apareamiento de las bases de los ácidos nucleicos solo se producirá entre fragmentos de ácidos nucleicos que tengan una alta frecuencia de secuencias de bases complementarias. Así, a menudo son necesarias condiciones de rigurosidad “altas” o “intermedias” cuando se desea que unos ácidos nucleicos que no son completamente complementarios entre sí se hibriden o se asocien entre ellos. En la técnica se conocen numerosas condiciones equivalentes que pueden emplearse para obtener condiciones de rigurosidad intermedias o bajas.

En otra realización, el polinucleótido tiene menos del 90%, por ejemplo, menos del 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la correspondiente secuencia no optimizada, y opcionalmente codifica un polipéptido que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido codificado por la secuencia no optimizada. También se proporcionan construcciones, por ejemplo, módulos de expresión, y vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada, por ejemplo, con una secuencia de ácido nucleico optimizada, así como kits que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada, la construcción o el vector.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, uno de sus fragmentos o una fusión de esta, opcionalmente está optimizada para la expresión en una célula hospedante concreta y también opcionalmente está unida operablemente a secuencias reguladoras de la transcripción, por ejemplo, uno o más potenciadores, un promotor, una secuencia de terminación de la transcripción o una de sus combinaciones, para formar un módulo de expresión.

En una realización, una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, uno de sus fragmentos o una fusión de esta, se optimiza mediante la sustitución de codones, por ejemplo, al menos 25% de los codones, en una secuencia de luciferasa de tipo salvaje, por codones que se emplean preferentemente en una célula concreta (seleccionada). Los codones preferidos tienen una frecuencia de uso de los codones relativamente alta en una célula seleccionada, y preferiblemente su introducción resulta en la introducción de relativamente pocos sitios de unión a factores de trasncripción para los factores de transcripción presentes en la célula hospedante seleccionada, y relativamente pocos otros atributos estructurales no deseables. Así, el producto de ácido nucleico optimizado puede presentar un mayor nivel de expresión debido a una mayor frecuencia de uso de codones, y un menor riesgo de desarrollar un comportamiento transcripcional inapropiado debido a un menor número de secuencias reguladores de la transcripción no deseables.

Una molécula de ácido nucleico aislada y optimizada puede tener una composición de codones que difiera de la de la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje en más del 30%, 35%, 40%, o más del 45%, por ejemplo, 50%, 55%, 60% o más de los codones. Los ejemplos de codones para su uso en la invención son los codones que se emplean con más frecuencia que al menos otro codón para el mismo aminoácido en un organismo concreto y, en una realización, tampoco son codones de bajo uso en ese organismo y tampoco son codones de bajo uso en el organismo empleado para clonar o seleccionar la expresión de la molécula de ácido nucleico. Además, los codones para ciertos aminoácidos (concretamente, los aminoácidos que tienen tres o más codones) pueden incluir

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dos o más codones que se emplean con más frecuencia el otro codón o codones (no preferidos). La presencia de codones en la molécula de ácido nucleico que se emplean con más frecuencia en un organismo que en otro organismo resulta en una molécula de ácido nucleico que, cuando se introduce en las células del organismo que emplea estos codones con más frecuencia, se expresa en esas células a un nivel que es mayor que la expresión de la secuencia del ácido nucleico de origen o de tipo salvaje en esas células.

En una realización de la invención, los codones que son diferentes son los que se emplean con más frecuencia en un mamífero, mientras que en otra realización, los codones que son diferentes son los que se emplean con más frecuencia en una planta. Los codones preferidos para diferentes organismos son conocidos en la técnica, por ejemplo, véase www.kazusa.or.jp/codon/. Un tipo concreto de mamífero, por ejemplo, un ser humano, puede tener un conjunto diferente de codones preferidos que otro tipo de mamífero. De modo similar, un tipo concreto de planta puede tener un conjunto diferente de codones preferidos que otro tipo de planta. En una realización de la invención, la mayoría de los codones que difieren son aquellos que son los codones preferidos en una célula hospedante deseada. Los codones preferidos para organismos, que incluyen mamíferos (por ejemplo, seres humanso) y plantas, son conocidos en la técnica (por ejemplo, Wada et al., Nucl. Acids Res., 18:2367 (1990); Murray et al., Nucl. Acids Res., 17:477 (1989)).

IV. Ejemplo de luciferasa para la potenciación de la estabilidad

Se ha demostrado que la luciferasa segregrada por el camarón abisal Oplophorus gracilirostris posee muchas características interesantes, tales como una alta actividad, un alto rendimiento cuántico y una amplia especificidad de sustrato (coelenteracina, análogos de la coelenteracina). La reacción bioluminiscente de Oplophorus se produce cuando la oxidación de la coelenteracina (la luciferina) con óxigeno molecular es catalizada por la luciferasa de Oplophorus, lo cual resulta en una luz de una intensidad máxima a 462 nm y en los productos CO2 y coelenteramida (Shimomura et al., Biochemistry, 17:994 (1978); esto difiere de Inouye, 2000, que menciona 454 nm). La luminiscencia óptima se produce a pH 9 en presencia de NaCl 0,05-0,1 M a 40 ºC, y debido a la resistencia poco común de esta enzima al calor, la luminiscencia visible aparece a unas temperaturas mayores que 50 ºC cuando se emplea la enzima muy purificada, o a más de 70 ºC cuando se emplea la enzima parcialmente purificada. A pH 8,7, la luciferasa nativa tiene un peso molecular de aproximadamente 130.000, y aparentemente comprende 4 monómeros de 31.000; a pH menores, la luciferasa nativa tiende a polimerizar.

La proteína madura consiste en proteínas de 19 kDa y 35 kDa (heterotetrámero que consiste en dos componentes de 19 kDa y dos componentes de 35 kDa). La proteína de 19 kDa (OgLuc) se ha sobreexpresado como un monómero en E. coli y ha demostrado ser activa, aunque predominantemente se produce en forma de cuerpos de inclusión. Es probable que la formación de cuerpos de inclusión sea debida a la inestabilidad de la proteína dentro de la célula.

La estructura tridimensional de OgLuc no está disponible. Además, no están disponibles modelos basados en una homología conocida, puesto que OgLuc no presenta homología de secuencia con otras luciferasas ni tampoco una similitud de secuencia global significativa con otras proteínas conocidas. Para generar un modelo se empleó un método de reconocimiento de plegamiento para identificar proteínas homólogas distantes. Empleando esta estrategia, tal como se describe a continuación, se identificó un conjunto de proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) que pertenecen a la superfamilia de proteínas de la calicina, y se generó un modelo de homología de OgLuc basándose en las estructuras tridimensionales de tres de estas FABP.

Las calicinas son una superfamilia de proteínas cuyso miembros comparten estructuras en barril- similares. Los miembros incluyen, pero no se limitan a proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) y lipocalinas. La familia de proteínas FABP tiene una estructura en barril- discontinua de diez cadenas; los barriles de la avidina y MPI, aunque tienen ocho cadenas, son más circulares en una sección transversal que los de las lipocalinas y no tienen una hélice C-terminal o cadena I; mientras que la triabina tiene una geometría de barril similar pero posee una topología modificada. Las cadenas N-y C-terminales de las FABP y las lipocalinas pueden superponerse con gran similitud, siendo necesaria la pérdida (de FABP a lipocalina) o la ganancia (de lipocalina a FABP) de dos cadenas centrales necesarias para efectuar la transformación de una en otra (Flower et al., Protein Science, 2:753 (1993)). Además, más allá de alguna similitud funcional (unión a ligandos hidrófobos y/o interacción macromolecular), estas familias se caracterizan por un patrón de plegamiento similar (un barril- antiparalelo dominado por una topología mayoritariamente +I), dentro del cual amplias partes de sus estructuras pueden ser consideradas equivalentes desde el punto de vista estructural, aunque las familias no comparten una similitud de secuencia global.

Estudios previos (Flower, Protein Pept. Lett, 2:341 (1995)) han demostrado que los miembros de la superfamilia de la calicina también comparten un patrón estructural diferenciado. Un resto arginina o lisina (procedente de la última cadena del barril-) forma enlaces de hidrógeno con los grupos carbonilo de la cadena principal de la hélice similar a 310 N-terminal y se empaqueta sobre un triptófano conservado (procedente de la primera cadena del barril-). Este patrón puede observarse en las estructuras de las lipocalinas internas, que también comparten una interacción conservada del bucle L6, y en las lipocalinas externas, más diversas desde el punto de vista estructural. También es evidente en las otras cuatro familias que comprenden las calicinas. El estudio de las estructuras disponibles de la estreptavidina y la avidina de pollo, del inhibidor de metaloproteinasa de Erwinia chrysanthemi, y de la estructura de la triabina, revela una disposición muy similar de restos en interacción. La mayoría de las FABP conocidas tienen

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una disposición de las interacciones de cadenas laterales similar a la descrita anteriormente, en la que un triptófano, procedente de la primera cadena del barril de FABP, se empaqueta contra una arginina procedente de una posición cercana al extremo de este último. Sin embargo, esta característica está ausente en un grupo de FABP más altamente divergentes, ejemplificadas por las FABP de músculo de insecto.

El modelo de homología de OgLuc demuestra que la firma estructural de plegamiento de la calicina, que une con eficacia el N-y C-terminal entre sí mediante enlaces de hidrógeno, y que está presente en las tres FABP, no está completamente conservada en OgLuc. La firma estructural diferenciada (en la cual una arginina o una lisina, que es capaz de formar una serie de enlaces de hidrógeno potenciales con los carbonilos de la cadena principal de una hélice 310 corta, se empaqueta sobre un triptófano conservado de una manera no aleatoria y estructuralmente superponible) se corresponde con unos determinantes de secuencia comunes a los miembros de la familia de la calicina: un patrón de secuencia N-terminal característico, que muestra la conservación de restos clave, y un motivo C-terminal más débil. La conservacón de restos concretos y las interacciones a través de los miembros de las familias apoya la opinión de que hubo un origen evolutivo común, aunque muy lejano, para la superfamilia de la calicina. El presente modelo de OgLuc predice que el resto Asn166 de OgLuc cerca del C-terminal no es capaz de unirse con enlaces de hidrógeno a los carbonilos de la cadena principal cerca del N-terminal. Sin embargo, los modelos de mutantes que contienen Arg o Lys en la posición 166 sugieren que el restablecimiento de este motivo estructural puede mejorar la estabilidad estructural de OgLuc y su expresión/actividad en células.

Ejemplo 1

Las desventajas de OgLuc pueden solucionarse mediante ingeniería de proteínas, pero para que esto pueda hacerse de una manera eficaz se necesitaría conocer la estructura tridimensional de OgLuc. No existen modelos de la estructura terciaria ni estructuras terciarias experimentales publicados de OgLuc. Se empleó la formación de modelos de homología para generar un modelo de estructura terciaria de OgLuc. La construcción del modelo de homología comprende varias etapas, que incluyen la identificación de uno o más moldes estructurales tridimensionales, el alineamiento de la secuencia diana (por ejemplo, OgLuc) y una o más estructuras de molde, la construcción del modelo, y la evaluación de la calidad del modelo. La identificación de uno o más moldes estructurales tridimensionales para OgLuc no es intuitiva, porque los métodos de búsqueda de secuencias convencionales no identifican una similitud global significativa con ninguna proteína con una estructura terciaria conocida. Para solucionar este problema se emplearon dos estrategias para identificar homólogos de OgLuc remotos con estructura terciaria conocida.

Estrategia 1:

Se empleó una búsqueda en un banco de moldes basada en un modelo oculto de Markov (HMM) (Karplus et al., Bioinformatics, 14:846 (1998)) para detectar estructuras de molde lejanamente relacionadas empleando la herramiento de identificación de moldes SWISS-MODEL en http://swissmodel.expasy.org//SWlSS-MODEL.html (Arnold et al., Bioinformatics, 22:195 (2006)).

El mejor molde de estructura tridimensional (mayor puntuación del valor E) identificado para OgLuc empleando esta estrategia fue una proteína de unión a ácidos grasos (FABP) (Protein Data Bank (PDB) n.º de registro 1VYF) (Angelucci et al., Biochemistry, 43:13000 (2004)). También se identificaron otras FABP con menor puntuación, que incluyen PDB n.º de registro 1PMP y 1CRB.

A continuación se muestran ejemplos de alineamientos de la secuencia diana (OgLuc, los restos 1-2 y 168-169 se han omitido) y las secuencias de los moldes de estructura tridimensional identificados (1VYF, 1PMP, 1CRB). Nótese que, debido a la baja similitud de secuencia, la colocación de los huecos en el alineamiento puede variar.

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correspondiente luciferasa de partida. En diversas realizaciones, las mediciones de luminiscencia se normalizaron a la correspondiente luciferasa de partida de interés, por ejemplo, OgLuc sintética, y se indican en ciertas realizaciones como una mejora, un aumento o similares “en X veces” (es decir, en 2 veces, en 3 veces, en 4,5 veces, etc.).

La estabilidad de la señal de un clon variante se determinó volviendo a leer la placa multiples veces después de la adición del tampón de ensayo a la muestra, por ejemplo, midiendo la luminiscencia cada 30 segundos o cada minuto, durante una longitud de tiempo. La semivida de la señal se determinó empleando estas mediciones, y el promedio de los 6 pocillos replicados se comparó entre los variantes con la correspondiente luciferasa de partida. La semivida que indica la estabilidad de la señal se normalizó a la correspondiente luciferasa de partida de interés, por ejemplo, OgLuc.

Ejemplo 5: Método para medir la estabilidad de la proteína, concretamente la termoestabilidad

Se prepararon muestras de lisados a partir de cultivos inducidos tal como se describe en el ejemplo 4. Las muestras de lisado en placas de 96 pocillos replicadas se incubaron a diversas temperaturas, que incluyen, por ejemplo a 22, 30, 37, 42, 50 o 54 ºC. En diferentes momentos, las placas se cultivaron a -70 ºC. Antes de medir la luminiscencia según se describe en el ejemplo 4, cada placa se descongeló a temperatura ambiente, es decir, 22 ºC, durante 10 minutos. Las muestras se ensayaron con el tampón de ensayo de tergitol al 0,5% descrito en el ejemplo 4. La medición “T = 0”, según se describe en el ejemplo 4, para cada placa del momento del tiempo, se empleó para determinar la semivida de la proteína. La semivida, que indica la estabilidad de la proteína, se normalizó a la correspondiente luciferasa de partida de interés, por ejemplo, OgLuc.

Ejemplo 6: Generación de una luciferasa modificada con mayor emisión de luz

Para estudiar si el restablecimiento de la firma estructural de la calicina en OgLuc puede mejorar la actividad y la estabilidad globales de las proteínas, se diseñaron versiones sintéticas de la secuencia de OgLuc. Las versiones sintéticas incluyen el uso optimizado de codones para E. coli y células de mamífero, y codones para Arg o Lys que sustituyen a Asn en la posición 166. Tal como se mencionó previamente, la numeración se basa en SEQ ID NO:1. La optimización de codones (para E. coli) y los cambios de nucleótidos para el codón 166 a Arg o Lys se realizaron por medios sintéticos (Gene Dynamics, LLC). En el clon OgLuc+N166R, el codón AAC se cambió a CGT (que codifica Arg). En el clon OgLuc+N166K, el codón AAC se cambió a AAA (que codifica Lys).

Los genes de OgLuc sintéticos se subclonaron en un vector adecuado para la sobreexpresión en bacterias o lisados de reticulocitos de conejo TnT (Promega Corp.; vector pF1K Flexi para sistemas de expresión basados en T7), y se empleó para transformar E. coli KRX. Se seleccionaron colonias individuales, se cultivaron, se indujeron con ramnosa, se lisaron empleando lisozima y una única congelación-descongelación, y se midieron para la luminiscencia empleando reactivos de sustrato de luciferasa de Renilla (Promega Corp.) en un luminómetro Veritas. Las reacciones de reticulocitos de conejo TnT se realizaron según los protocolos del fabricante (Promega Corp.) y se midieron de la misma forma que los lisados bacterianos.

Los mutantes se compararon con la proteína OgLuc parental (es decir, de partida) sintética para la producción de emisión de luz total (luminiscencia). En E. coli, se observó una mejora en 5 veces y 10 veces (N166K y N166R, respectivamente) en la luminiscencia con coelenterazina como sustrato. En los lisados de TnT, la mejora fue entre 4 veces y 7 veces (N166K y N166R). Estas secuencias (que contienen Arg o Lys en la posición 166) representan variantes de OgLuc que producen una mayor estabilidad.

Se analizaron diversos variantes de OgLuc con una sustitución de un aminoácido en la posición 166 para el brillo, es decir, se seleccionaron variantes que eran al menos 1,2 veces más brillantes que la OgLuc de tipo salvaje. Las siguientes sustituciones produjeron un variante que era al menos 1,2 veces más brillante que OgLuc de tipo salvaje: N166K; N166R; N166A; N166L; N166P; N166Q; y N166S (véase la tabla 1). La tabla 1 muestra el variante más brillante, indicado por la mejora en número de veces con respecto a OgLuc de tipo salvaje, que tiene la sustitución del aminoácido N166R.

Tabla 1 -Resumen de la mejora en número de veces de la luminiscencia en variantes de OgLuc con una sustitución de un aminoácido en la posición 166 frente a OgLuc de tipo salvaje

Sustitución del aminoácido en la posición 166: Mejora en el plegamiento

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Una mutagénesis empleando PCR propensa a errores y saturación NNK, según se describe en el ejemplo 3, del variante OgLuc+N166R produjo variantes con mayor brillo, por ejemplo, al menos 1,2 veces más brillantes, con relación al variante OgLuc+N166R. La tabla 2 resume estos variantes que comprenden la sustitución N166R, así 5 como una de las siguientes sustituciones en los restos 2 (S), 4 (E, S, R, G, D, T o L), 11 (R, V, I, L, K o T), 33 (K), 44 (I o L), 45 (E), 54 (F, T, V, G, W, S, o L), 68 (V, Y), 75 (R, K, Q, G, T o A), 104 (L), 115 (E, I, Q, L, V, G, H, R, S, C, A,

o T), 124 (K), 135 (K), 138 (V, I, N, T, L, C, R, M o K), 139 (E), 167 (V), o 169 (L). La tabla 2 muestra la mejora del plegamiento en forma de la mejora en número de veces de la luminiscencia del variante frente al correspondiente variante OgLuc+N166R de partida empleando RLAB y utilizando el promedio de la señal en el intervalo de 4-6

10 minutos después de comenzar la reacción, por ejemplo, después de la inyección del sustrato. Para cada sustitución de aminoácido listada, la sustitución que produce la mayor mejora se lista en primer lugar y la sustitución que produce la menor mejora se lista al final. Los variantes que muestran la mayor mejora incluyen variantes que contienen una sustitución en el resto 4, 54, o 138.

Tabla 2 -Resumen de la mejora en número de veces de la luminiscencia de los variantes de OgLuc+N166R frente al 15 correspondiente OgLuc+N166R de partida

Posición: Aminoácido Codón Mejora en n.º de veces del brillo (RLAB), promedio de 4-6 min (con rel. a N166R)

2: S TCC 9

4: E GAG 20

4: S AGT 7

4: R AGG 6

4: G GGG
4

4: D GAT
4

4: T ACG 3

4: L CTG 3

11: R CGG 13

11: V GTG 6

11: I ATT 6

11: L CTT 3

11: K AAG 3

11: T ACT 2

33: K AAG 10

44: I ATT 25

44: L CTT 2

45: E GAG 2

54: F TTT 10

54: T ACT 8

54: V GTT 6

54: G GGG 5

54: S AGT 4

54: W TGG 3

54: L TTG 2

68: V GTT 2

68: Y TAT 3

72: Q CAG 3

75: R AGG 6

21

75: K AAG 5

75: Q CAG 5

75: G GGT 4

75: T ACG 4

75: A GCG 4

104: L CTT 10

115: E GAG 20

115: I ATT 4

115: Q CAG 3

115: L CTT 3

115: V GTT 3

115: G GGG 3

115: H CAT 3

115: R CGG 2

115: S AGT 2

115: C TGT 2

115: A GCT 2

124: K AAA 8

135: K AAG 10

138: V GTG 10

138: I ATT 8

138: T ACG 6

138: L CTG 5

138: C TGT 6

138: R CGG 5

138: M ATG 4

138: K AAG 3

139: E GAG 13

167: V GTT 40

169: L TTG 10

Otros variantes del variante OgLuc+N166R presentan más de una sustitución de un aminoácido. Estos otros variantes se listan en la tabla 2 en la que se listan las sustituciones de aminoácidos y la mejora en número de veces de la luminiscencia del variante OgLuc+N166R frente al correspondiente OgLuc N166R de partida. Se encontraron otros variantes que incluían mutaciones silenciosas, es decir, cambios en nucleótidos que no alteran el aminoácido codificado por ese codón.

Tabla 3 -Resumen del aumento en número de veces de la luminiscencia de los variantes OgLuc+N166R con más de una sustitución de un aminoácido y/o mutaciones silenciosas frente al correspondiente OgLuc+N166R de partida

N.º de veces frente a N166R: Cambio del aminoácido con respecto a N166R (codones)

6: E23V (gta), S28P (cct), I143V (ctc)

15: A4S (gca), L34M (atg), I76V (gtc)

2: G51V (gtt), 199V (gtt)

13: L3L (tta), S37S (tcg), V44V (gta)

5: L3L (tta), L27M (atg)

5: L3L (tta)

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Claims

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