JP4613441B2 - 新規ルシフェラーゼおよび発光蛋白質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、十脚類（Decapoda）由来のルシフェラーゼ、具体的にはヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来の分泌型ルシフェラーゼに関する。詳細には、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される該ルシフェラーゼ、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した宿主、並びに該宿主を培養するまたは該組換えベクターを用いてインビトロ−トランスクリプション−トランスレーションを実施することを特徴とする発光活性を有する蛋白質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ルシフェラーゼおよび発光蛋白質をコードする遺伝子は、表１に示される文献に開示されるもののみが知られている。
【０００３】
【表１】
【０００４】
これらの発光蛋白質およびルシフェラーゼは、産業上重要な酵素として、例えばレポーター蛋白質として既に広く利用されている。これら酵素群の発光反応を利用した種々の検出法の開発に伴い、発光検出装置が普及し、また、高感度化など該装置も進歩している。しかし、このような状況下において、これまでに知られている発光蛋白質およびルシフェラーゼの中で、広範囲の用途に適用し得るルシフェラーゼまたは発光蛋白質は存在せず、それぞれの目的に適合する酵素を選択する必要があった。
【０００５】
一方、学術論文、特許明細書等に開示されている発光基質（ルシフェリンと称される）について、その構造が決定されているものは下記の式（１）〜式（８）に示すもののみである。
【化１】
【０００６】
【化２】
【０００７】
【化３】
【０００８】
【化４】
【０００９】
【化５】
【００１０】
【化６】
【００１１】
【化７】
【００１２】
【化８】
【００１３】
発光基質には生物種特異的であるものと生物種非特異的なものがあり、更にその他の生体成分（補酵素、補欠分子等）を必要とする発光反応がある。生物発光酵素反応のうち最小単位での発光反応は、発光酵素ルシフェラーゼ、発光基質ルシフェリン、分子状酸素の３者のみで発光反応が起きる場合である。
【００１４】
表１における最小単位での発光反応の例は、腔腸動物の花虫類（Cindaria）に属するレニラ（Renilla）由来ルシフェラーゼ、甲殻類（Ostracoda）に属するウミホタル（Cypridina）由来のルシフェラーゼと鞭毛藻類（Flagellata）に属するゴニオラックス（Gonyaulax）由来のルシフェラーゼであるが、これらに対応する発光基質ルシフェリンの構造は、例えば前記式（４）および（５）に示すように非常に複雑である。例えば、ウミホタルおよびゴニオラックスルシフェリンの合成法は知られているが、その複雑な合成工程のために収率が悪く、天然抽出ルシフェリンが使用されている。このため、価格が非常に高価であり、産業用としての実用性は乏しい。これに対し、セレンテラジンとして知られているレニラルシフェリンは種々の方法が確立されているため、セレンテラジンおよびその誘導体は安価に販売されており、容易に取得することができる。
【００１５】
また、表１の発光蛋白質群において、天然に存在する分泌型ルシフェラーゼは、ウミホタルルシフェラーゼのみであり、その遺伝子構造はThompson, E.M., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571 (1989年）に、その使用例は、Inouye, S., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9584-9587 (1992年) に開示されている。
【００１６】
分泌型ルシフェラーゼの産業上有効な点は、ドラッグスクリーニングシステム等のバイオアッセイ系を構築する場合、細胞外分泌するルシフェラーゼをレポーター分子として用いることにより、細胞破砕せず、生細胞においてその活性を容易に検出できることである。また、本来分泌性の蛋白質を製造することは、宿主−ベクター系を適切に選別すればさほど困難でなく、培養液中からの組換え蛋白質の精製は容易である。このため、分泌型ルシフェラーゼを大量に製造する場合、その製造・精製のコストを押さえることができるという利点がある。
【００１７】
さらに、発光反応が最小単位、即ち発光酵素ルシフェラーゼ、発光基質ルシフェリンおよび分子状酸素の３者のみで起こり、且つ発光基質ルシフェリンが取得が容易なセレンテラジンまたはその誘導体であり、該ルシフェラーゼが分泌型蛋白質である発光反応系が特に有利である。しかし、そのような分泌型のルシフェラーゼの遺伝子単離および生細胞での発現は報告されていない。このような分泌型ルシフェラーゼおよびその遺伝子は学術基礎、応用研究の領域に留まらず、診断薬や検査薬等、産業上有用である。
【００１８】
発明者は、先行技術文献等を調査・検討した結果、これまで確認されているセレンテラジンを発光基質とした分泌型ルシフェラーゼは、十脚類（Decapoda）に属する発光エビ由来のルシフェラーゼのみであることを知った。発光エビは分泌性のルシフェラーゼ（酵素）を有し、これをルシフェリン（発光基質）および分子状酸素と反応させると青色に発光する。世界中に生息する発光エビ分類の詳細は、Herring, P.J., J. Mar. Biol. Ass. U.K., 56, 1029-1067 (1976年)に開示されている。そして、発光エビのルシフェラーゼに関する唯一の生化学的研究としては、静岡県の駿河湾に生息する深海発光エビであるヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）についてのShimomura, O., Masugi, T., Johnson, F.H. & Haneda, Y., Biochemistry, 17, 994-998(1978年)である。前記先行技術は、分子量３１,０００のモノマーの４量体からなる分子量約１３０,０００を有するルシフェラーゼを開示しており、さらに当該ルシフェラーゼの２２℃における光子収量が０.３２であり、高発光活性（１.７５×１０15Ｐｈｏｔｏｎ／ｓ.mg）を有し、最適発光温度は４０℃で熱安定性にすぐれ、幅広いｐＨで反応が進むことを記載している。
【００１９】
このヒオドシエビル由来のシフェラーゼの発光反応におけるルシフェリンは前記の式（２）に示されるセレンテラジンである。セレンテラジンはレニラ（Renilla）ルシフェラーゼ反応、および発光蛋白質イクオリン（Aequorin）の発光反応の発光基質でもある。これらの酵素群とヒオドシエビのルシフェラーゼの最大の相違点は、レニラルシフェラーゼや発光蛋白質イクオリンの発光基質特異性と比較して、ヒオドシエビのルシフェラーゼは非常に幅広い基質特異性を示す点にある。即ち、ヒオドシエビのルシフェラーゼは、発光基質セレンテラジン誘導体として安価に合成できるビスデオキシセレンテラジンを使用することができ、他のルシフェラーゼ酵素と比較して有利である。
【００２０】
しかしながら、分泌型ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼについて、上記先行技術に記載されていること以外について、例えばその蛋白質構造および遺伝子構造に関する情報は全く得られていない。発光エビの多くは深海に生息するため実験材料としての生個体の大量入手が非常に困難であることがその理由と考えられる。また、近年の環境変化の影響等により個体が減少し、少量の生固体の入手さえも困難になってきている状況である。このため、生物資源の一つであるヒオドシエビの遺伝子ライブラリーの構築とともに、早急なヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子の単離が望まれている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、深海に生息するヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を用いて高純度の組換え分泌型ルシフェラーゼ蛋白質を提供することである。また、本発明の目的は、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した宿主細胞、例えば微生物および動物培養細胞、並びに高純度の組換え分泌型ルシフェラーゼ蛋白質の製造方法を提供することである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
ヒオドシエビから発光活性を有する分泌型ルシフェラーゼを単離・精製した結果、分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される分泌型ルシフェラーゼを見出した。そして、各々の蛋白質のアミノ酸配列を部分的に決定し、これに基づきルシフェラーゼの構成蛋白質である１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を決定した。さらに、該遺伝子を含む組換えベクターを作製し、該ベクターを用いる無細胞発現系および該ベクターで形質転換した宿主、例えば大腸菌や酵母などの微生物または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系によって前記蛋白質を製造した。
【００２３】
即ち、本発明は、十脚類（Decapoda）由来のルシフェラーゼに関する。具体的には、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される該ルシフェラーゼに関する。詳細には、ヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来の１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される分泌型ルシフェラーゼルに関する。
【００２４】
本発明はまた、該ルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａの蛋白質であって、発光活性を有する蛋白質に関する。具体的には、前記発光蛋白質は、SEQ ID NO：２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ発光活性を有する蛋白質である。
【００２５】
１９ｋＤａの蛋白質は、さらに当該技術分野において知られている、蛋白質精製のためのペプチド配列および／または細胞外分泌シグナルペプチドもしくは細胞内器官への移行シグナルペプチドを含むことができ、そのようなシグナルペプチドは、１９ｋＤａ蛋白質の前駆体由来のSEQ ID NO：２のアミノ酸配列１〜２７番に包含されるシグナルペプチド、または他の公知のシグナルペプチドとすることができる。細胞外分泌シグナルペプチドとしては、公知の真核生物の分泌シグナルペプチド（例えば、von Heijne, G. Eur. J. Biochem 133:17-21 (1983年)）および公知の原核生物の分泌シグナルペプチド（例えば、von Heijne, G. & Abrahmsen, L. FEBS Lett. 244: 439-446(1989年)に記載）を挙げることができる。また、細胞内器官への移行シグナルペプチドとしては、ミトコンドリアへの移行シグナルペプチド（例えば、Gavel, Y. ＆ von Heijne, G., Protein Engineering 4: 33-37 (1990年)）、 クロロプラスト移行シグナルペプチド（例えば、Gavel, Y.＆ von Heijne, G., FEBS Lett. 261:455-458(1990年)）および核内移行シグナルペプチド（例えば、Dingwall, C. & Laskey, R.A., Trends Biochem.Sci. 16:478-481 (1991年)）を挙げることができる。
【００２６】
本発明はまた、該ルシフェラーゼを構成する分子量３５ｋＤａの蛋白質に関し、具体的にはSEQ ID NO：４に示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質に関する。前記３５ｋＤａの蛋白質は、さらに３５ｋＤａ蛋白質の前駆体由来のSEQ ID NO：４のアミノ酸配列１〜３９番に包含されるシグナルペプチド、または上述のシグナルペプチドを含むことができる。
【００２７】
本発明はまた、前記１９ｋＤａの発光蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：１に示す塩基配列の４６〜６３３番の塩基配列、（ｂ）前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有する。
【００２８】
本発明はまた、前記３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：３に示す塩基配列の７９〜１１５５番の塩基配列、（ｂ）前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有する。
【００２９】
前記１９ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび／または３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、さらに公知の上述のペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、例えば上記文献に開示されるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含することができる。なお、本明細書においてポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ）を包含する。
【００３０】
本発明はまた、上述したルシフェラーゼ、前記１９ｋＤａの発光蛋白質、または前記１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質に、セレンテラジンまたはその誘導体を基質として作用させることを特徴とする発光方法に関する。本発明のルシフェラーゼおよび発光蛋白質は、酵素である該蛋白質、発光基質ルシフェリンであるセレンテラジンまたはその誘導体、および分子状酸素のみで発光反応が起きる。その反応条件として、温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲であり、ｐＨは５.５〜１１の範囲、好ましくは７〜１０の範囲である。
【００３１】
本発明はまた、１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質をコードする前記ポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換えベクターに関する。本発明の好ましい態様において、組換えベクターは、その挿入物を発現させうる組換え発現ベクターである。そのような組換えベクターは、当該技術分野における公知の任意の方法で作製することができる。
【００３２】
本発明において、前記蛋白質を発現させるために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロ トランスクリプション−トランスレーション）に、および宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系に適するベクターとすることができ、そのようなベクターは市販されているかまたは公知のベクターから容易に作製することができる。例えば、インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイルスのimmeadiate-early エンハンサー／プロモター領域を組込み、その下流域にＴ７のプロモター配列／マルチクローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターやＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモターを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−ＴａｇおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。また、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適するベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモターを有するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ２７ｂ（＋）やｐＥＴ２８ａ（＋）；ノバジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキシダーゼのプロモターを有するピチア発現系ベクターｐＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９ＫやＰＩＣ３.５Ｋ；インビトロゲン社）などである。
【００３３】
また、精製のためのペプチド配列としては、当該技術分野にて用いられているペプチド配列とすることができるが、例えばヒスチジン残基が４個以上、好ましくは６個以上連続したヒスチジンタグ配列、モノクローナル抗体への結合能を持つエピトープタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインまたはプロテインＡをコードする配列などが包含される。これらペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入物として含有するベクターは市販されている。例えば、大腸菌、酵母などの微生物宿主に用いるベクターは、大腸菌系のＴ７のプロモターを有し、ヒスチジン残基を１０個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えばｐＥＴ１６ｂ；ノバジェン社）、ヒスチジン残基を６個をアミノ末端に有する発現ベクター（例えばｐＨＢ６；ロッシュダイアグノスチィック社、pＴｒｃ−Ｈｉｓシリーズベクター；インヴィトロゲン社、ｐＨＡＴベクターシリーズ；クローンテック社）などである。動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒスチジン残基を６個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えば、ｐＨＭ６やｐＶＭ６；ロッシュダイアグノスチィック社）の使用が可能である。昆虫培養細胞系ではバキュロウイルス系のヒスチジン残基を６個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えば、pＢａｃPＡK−Ｈｉｓベクター；クローンテック社）。また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼと融合発現するpＧＥＸシリーズベクター（ファルマシア）、プロテインＡを発現するｐＲＩＴ２またはｐＥＺＺ１８ベクター（ファルマシア）が使用可能である。
【００３４】
本発明の蛋白質を製造するためのインビトロトランスレーションは、公知の方法、例えばSpirin, A.S., et.al., Science 242: 1162-1164(1988年)および Patnaik, R. & Swartz, J.M. Biotechniques 24: 862-868(1998年)に記載の方法で実施することができ、市販のインビトロトランスレーションキット（例えば、ＴＮＴ−インビトロトランスクリプション−トランスレーションキット、プロメガ社製）を用いてもよい。
【００３５】
本発明または、上述の組換えベクターで形質転換した、宿主細胞、例えば微生物（大腸菌、酵母など）および動物培養細胞（昆虫培養細胞、哺乳類培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞など）に関する。
【００３６】
従って、本発明は、１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換え発現ベクターを用いてインビトロトランスクリプション−トランスレーションを実施することからなる、本発明のルシフェラーゼまたはその構成成分である１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質の製造方法に関する。さらに本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、所望の蛋白質を単離することからなる、本発明のルシフェラーゼまたはその構成成分である１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質の製造方法に関する。
【００３７】
本発明の蛋白質の製造方法において、発現させた蛋白質は、宿主細胞の培養後、その培地からまたは菌体の可溶性画分から単離することができ、実際に培養した宿主細胞を破砕し、遠心分離した得られた可溶性画分に十分な発光活性が検出された。しかし、大腸菌で発現させた場合に、本発明の蛋白質、例えば１９ｋＤａの発光蛋白質が菌体内に封入体（インクルージョンボデイ）として大量に蓄積され（菌体の５％〜１０％程度）、不活性状態にあることが見い出された。故に、封入体を包含する不溶性画分から発現させた蛋白質を回収し、再活性化を行うことができれば、発光活性を有する所望の蛋白質をより多量に製造することが可能となる。
【００３８】
故に、本発明の蛋白質の製造方法は、当該技術分野において知られている蛋白質の可溶化剤でその不溶性画分を処理することにより、所望の蛋白質を可溶化して次いで単離・精製し、さらに単離した蛋白質を溶媒として１つ以上の多価アルコールの存在下にて再生させて、再活性化させることを包含する。
【００３９】
発現した蛋白質の可溶化は、当該技術分野において知られている可溶化剤、例えば尿素および／またはグアニジン塩酸塩を用いて行うことができる。その濃度は、尿素の場合は２〜８Ｍの範囲、好ましくは８Ｍであり、グアニジン塩酸塩の場合は１〜６Ｍの範囲、好ましくは６Ｍである。またその際のｐＨは通常６〜９の範囲、好ましくはｐＨ７〜８の範囲であり、処理温度は通常１０〜６０℃の範囲、好ましくは２０〜３５℃の範囲である。
【００４０】
再生・再活性化において溶媒として用いることができる多価アルコールは、例えばグリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ショ糖、果糖およびブドウ糖からなる群から選択される１つ以上の多価アルコールであり、好ましくはグリセリン、ポリエチレングリコールおよび／またはプロピレングリコール、より好ましくはグリセリンである。また、多価アルコールの濃度範囲は、１０〜９０％(W／V)、好ましくは３０〜９０％(W／V)、より好ましくは５０〜７０％(W／V)である。
【００４１】
また、本発明の蛋白質の製造方法において、発現させた蛋白質は公知の方法により単離・精製されるが、その精製法としては公知の任意の方法から適宜選択することができる。例えば、本発明の蛋白質が上述した精製のためのペプチド配列を包含する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、ヒスチジンタグ配列にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインにはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡまたは他の蛋白質の配列の場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
【００４２】
さらに本発明は、下記のアミノ酸配列の繰り返し単位：
（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ
（但し、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す。）
を有する蛋白質であって、前記ルシフェラーゼを構成し、且つルシフェラーゼを安定化する機能を有する蛋白質に関する。このようなロイシンリピート構造は、図２に示すように、３５ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列に見出されるものである。従って、前記３５ｋＤａ蛋白質と同様に、ルシフェラーゼを安定化する機能を有することが期待される。
【００４３】
本発明はまた、抗原として前記ルシフェラーゼ、前記１９ｋＤａもしくは３５ｋＤａの蛋白質またはそれらの断片を抗原として作製され、且つ前記抗原と特異的に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に関する。前記抗原として、抽出した天然の蛋白質、組換え蛋白質、これらの蛋白質の部分的分解物、または本発明の蛋白質のアミノ酸配列に基づく合成ペプチドを用いることができる。そのような抗原は、例えばSEQ ID NO：２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミノ酸配列、SEQ ID NO：４に示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列から選択される少なくとも５個の連続したアミノ酸配列、好ましくは１０〜１５アミノ酸残基からなるポリペプチドである。本発明にかかる抗体は、常法（例えば、Harlow, E. & Lane, D, in Antibodies-Laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press., pp53-138 (1988年)）に従って作製することができる。
【００４４】
本発明にかかる抗体は、ヒオドシエビ由来の分泌型ルシフェラーゼ、またはこれを構成する蛋白質の検出に用いることができるが、これらと配列相同性がある他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および検索にも使用することができる。従って、本発明はまた、前記抗体を用いるルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および／または検索方法に関し、前記方法によって同定される新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質もまた本発明に包含される。本発明の検出および／または検索法によれば、分類上に近種ルシフェラーゼを容易に取得することが可能である。
【００４５】
上述のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および／または検索方法は、例えば他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしくはその組織の粗抽出物を試料として、本発明の抗体が結合する蛋白質を検出・検索することからなる。そのような検出手段としては、例えばイムノブロット、イムノアフィ二ティクロマトグラフィーを挙げることができる。また、他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリーについて、本発明の抗体を用いてエクスプレッション クローニング（Sambrook, J., Fritsch,E.F., & Maniatis,T., Molecular Cloning − a Laboratory Mannual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp12.3-12.44 (1989年)）を実施して、新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質をコードするＤＮＡを直接得ることができる。
【００４６】
本発明はまた、SEQ ID NO：２に示される本発明の１９ｋＤａ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列およびその相補的配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、詳細にはSEQ ID NO：１の塩基配列またはその相補的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくはアミノ酸５個の長さに対応する１４個であるのが好ましく、アミノ酸７個に対応する２０個以上であるのがさらに好ましい。そのようなプライマーにはその５′末端に適する制限酵素部位を包含させることができる。
【００４７】
本発明はまた、SEQ ID NO：４に示される本発明の３５ｋＤａ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列およびその相補的配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、詳細にはSEQ ID NO：３の塩基配列またはその相補的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドの長さは、上述した通りであり、同様にその５′末端に適する制限酵素部位を包含させることができる。
【００４８】
これらオリゴヌクレオチドプライマーは、本発明のルシフェラーゼを構成する蛋白質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡの検出に用いるとができ、その手法としては公知の遺伝子検出法を用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が特に好ましい。
【００４９】
また、これらのプライマーを用いて、他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）から、新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。その手段としては、公知の適する方法を用いることができるが、ＰＣＲ法が好ましい。
【００５０】
従って、本発明はまた、これらオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ルシフェラーゼを構成する蛋白質および発光蛋白質をコードする遺伝子の検出および／または検索法に関し、前記方法によって検索される新規ルシフェラーゼ、これを構成する新規蛋白質および発光蛋白質、並びに該蛋白質をコードする新規遺伝子もまた本発明に包含される。本発明の検出および／または検索法によれば、分類上に近種ルシフェラーゼ、具体的には相同性が５０％程度までのルシフェラーゼ遺伝子を容易に取得することが可能である。
【００５１】
下記の実施例により本発明のルシフェラーゼ、これを構成する蛋白質の単離および精製、該蛋白質をコードする遺伝子の単離ならびにそれらの同定法についてについて説明する。
【００５２】
【実施例】
実施例１ 発光エビのルシフェラーゼの精製と構成蛋白質の同定
材料である発光ヒオドシエビ（学名：Oplophorus gracilirostris）は、静岡県駿河湾で行われている桜エビ漁の網に混入するヒオドシエビを採取した。粗精製物は、Shimomura, O., Masugi, T., Johnson, F.H. & Haneda, Y., Biochemistry 17:994-998（1978年）に記載の方法に従って調製した。さらに、精製度をあげるため疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：０.７cm（直径）×３.５cm）を使用し、１.５Ｍ 硫酸アンモニウムを含有する２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.５の緩衝液で平衡化したカラムより、硫酸アンモニウム濃度を下げることにより溶出し発光活性をもつ画分を集めた。この画分を５０mM 塩化ナトリウム含有２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.５の緩衝液で平衡化したスーパーデックスカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：１cm（直径）×４８cm）に供しゲルろ過を行った。同一カラムでの分子量サイズマーカー（ａ：アミラーゼ（２００ｋＤａ），ｂ：アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ），ｃ：血清アルブミン（６７ｋＤａ），ｄ：オボアルブミン（４３ｋＤａ），ｅ：カルボニックアンハイドラーゼ（３０ｋＤａ）およびｆ：リボヌクレアーゼ（１３.７ｋＤａ））と比較した結果、ヒオドシエビのルシフェラーゼの分子量は、約１０６ｋＤａであった。その結果を図１に示す。また、精製酵素の比活性は１.３×１０15ｑｕａｎｔａ／ｓ.mgであった。
【００５３】
精製したサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲル）によって分析した。その結果、精製画分は、分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質で構成されていることが明かとなった。更に、精製した蛋白質（２５μg）を０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ０.３mlに溶解し、ゲルろ過カラムによる高速液体クロマトグラフィーにて分離した。即ち、０.１Ｍの塩化ナトリウムおよび０.１％のＳＤＳを含む２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.７の溶媒系で、ゲルろ過用カラムＴＳＫ３０００ＳＷ（東ソー、０.７５cm（直径）×３０cm）を使用し、分離蛋白質を吸光度２８０nmで検出した。その結果、２つの主ピークを検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、それぞれのピークは分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質に対応することが明らかとなった。以上のことより、分子量が約１０６ｋＤａを示すヒオドシエビの有する本発明のルシフェラーゼは、分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質それぞれ２個より構成されることが明らかとなった。
【００５４】
実施例２ ルシフェラーゼのアミノ酸配列の決定
アミノ酸配列の決定は、常法によって気相シークエンサー（アプライドバイオシステム社製のモデル４７０型）用いて実施した。サンプル調製は以下の通りである。
【００５５】
１）精製ルシフェラーゼは、１２％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量３５ｋＤａの蛋白質と分子量１９ｋＤａの蛋白質を分離後、エレクトロブロット法を用いて、１５０ｍＡ、１時間の条件でポリビニリデンジフルオライド メンブレン（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）にトランスファーした。染色後、分子量１９ｋＤａと３５ｋＤａの蛋白質部分をそれぞれ切り出して、シークエンサーに供し、その部分的アミノ酸配列を決定した。
【００５６】
２）精製ルシフェラーゼ（５０μg）を５Ｃ４カラム（ウオーターズ社製、カラムサイズ：０.３９cm（直径）×１５cm）を用い逆相系の高速液体クロマトグラフィーにて分離した。溶媒系はトリフルオロ酢酸０.１％を含むアセトニトリル／水で、アセトニトリル勾配（８０分間で０％から８０％に上ける）によって溶出し、蛋白質画分を吸光度２２０nmで検出してピーク画分を集め、減圧下に濃縮して、シークエンサーを用いてそのアミノ酸配列を決定した。分子量３５ｋＤａの蛋白は、リジンエンドペプチダーゼ（ベーリンガー社製、シークエンスグレード）を重量比５０分の１にて処理し、ペプチド断片を５Ｃ８カラム（バイダック社製、カラムサイズ：０.４６cm（直径）×２５cm）を用い逆相系の高速液体クロマトグラフィーにて分離した。溶媒系は、トリフルオロ酢酸０.１％を含むアセトニトリル／水で、アセトニトリル勾配（８０分間で１５％から５５％に上げる）によって溶出し、ペプチド断片画分を吸光度２２０nmで検出してピーク画分を集め、シークエンサーを用いてその部分的アミノ酸配列を決定した。
【００５７】
上述のように決定された酸配列を以下に示す。
▲１▼ 分子量１９ｋＤａの蛋白質について決定したアミノ酸配列
N-末端配列（SEQ ID NO：５）：Phe-Thr-Leu-Ala-Asp-Phe-Val-Gly-Asp-Trp-Gln-Gln-Thr-Ala-Gly-Tyr-Asn-Gln-Asp-Gln-Val-Leu-Glu-Gln-Gly-Gly-Leu-Ser
▲２▼ 分子量３５ｋＤａの蛋白質について決定したアミノ酸配列
N-末端配列（SEQ ID NO：６）：Ala-Val-Ala-(x)-Pro-Ala-Ala-Glu-Asp-Ile-Ala-Pro-(x)-Thr-(x)-Lys-Val-Gly-Glu-Gly-Asp-Val-Met-Asp-Met-Asp-(x)-Ser-Lys
（ここで(x)は、未決定アミノ酸を示す。）
▲３▼ リジンエンドペプチダーゼ処理により得られたペプチド断片の配列：
a) Val-Thr-Ser-Asp-Ala-Glu-Leu-Ala-Ser-Ile-Phe-Ser-Lys-Thr-Phe-Pro（SEQ ID NO：７）
b) Asn-Asp-Leu-Ser-Ser-Phe-Pro-Phe-Glu-Glu-Met-Ser-Gln-Tyr-Thr-Lys（SEQ ID NO：８）
c) Leu-Val-Leu-Gly-Tyr-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Leu-Pro-Val-Gly-Ala-Ile（SEQ ID NO：９）
d) Asn-Leu-Asp-Pro-Ala-Val-Phe-His-Ala-Met-(x)-Gln（SEQ ID NO：１０）
【００５８】
実施例３ ヒオドシエビのｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーの作製およびルシフェラーゼ遺伝子クローニング
駿河湾に生息するヒオドシエビを採取し、直ちにドライアイス上で凍結を行い、使用まで−８０℃で保存した。全ＲＮＡの調製は、Inouye, S. & Tsuji, F.I., FEBS Lett., 315, 343-346 (1993年) に記載のグアニジンイソチオシアネート法により行った。その結果、２尾（体長４０mm、重さ２.８ｇ）のヒオドシエビから２Ｍ ＬｉＣｌを用いて得られた全ＲＮＡの沈澱を回収し、約０.９mgの全ＲＮＡを得た。続いて、ポリ(Ａ)+ＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)−セルロース スパンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製し、Kakizuka, A., Yu, R., Evans, R.M. & Umesono, K., in Essential Developmental Biology (Stern, C.D. ed.), IRL Press, Oxford, U.K., pp223-232 (1993年) に記載の方法に従い、２μｇのポリ(Ａ)+ＲＮＡをｄＴ12-18をプライマーとして、ｃＤＮＡ合成キット（タイムセーバーｃＤＮＡ合成キット；ファルマシア−バイオテック社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ（２０ng）にＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩの制限酵素部位を有するリンカーを付加し、予め１μgの牛小腸由来アルカリフォスファターゼ処理をしたλＺａｐＩＩベクター（ストラタジーン社製）に全量５μlを添加し、４℃、１６時間処理してこれらを連結させた。次いで、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＧｏｌｄIII（ストラタジーン社製）のパッケージング・キットを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その力価は、１.１×１０6プラーク形成／ユニットであった。
【００５９】
実施例４ 合成オリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲプライマーの調製
スクリーニング用およびＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは、市販業者へ化学合成による合成を依託して入手した。
遺伝子ライブラリーから分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質に対応するｃＤＮＡを分離するためのオリゴヌクレオチドプローブは、実施例２により得られた上記のアミノ酸配列の情報をもとにそれぞれ作製した。
【００６０】
１９ｋＤａ蛋白質については、Ala-Gly-Tyr-Asn-Gln-Asp-Gln（SEQ ID NO：１１）のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブＳＯＬ−２（5′GCN-GGN-TA(T/C)-AA(T/C)-CA(A/G)-GA(T/C)-CA 3′）（SEQ ID NO：１３）を、そして３５ｋＤａ蛋白質については、Gly-Asp-Val-Met-Asp-Met-Asp（SEQ ID NO：１２）のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブＯＬ−３（5′GTN-GT(T/C)-GTN-ATG-GA(T/C)-ATG-TC 3′）（SEQ ID NO：１４）を合成した。
【００６１】
実施例５ ルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
実施例３で得られたｃＤＮＡライブラリーについて、実施例４で合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Wallace, R.B., et.al., Nucl. Acids Res., 9, 879-897（1981年）に記載のプラークハイブリダイゼーション法によって、１９ｋＤａ蛋白質についてはプローブＳＯＬ−２を、３５ｋＤａ蛋白質についてはプローブＯＬ−３を用いてスクリーニングを実施した。ＳＯＬ−２およびＯＬ−３は、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′末端ラベルして標識プローブとして用いた。ｃＤＮＡライブラリーから直径１５cmのＬＢ−培地プレート（１.２％ アガロース，水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，pH７.２）に、３５,０００個のファージプラークが生成するように蒔き、３７℃で８時間培養後、それぞれ２枚のフィルターをとり、アルカリＤＮＡ変性、中和、風乾後、紫外線照射しＤＮＡを固定した。そして、フィルターを２０mlのハイブリダイゼーション液（９００mM ＮａＣｌ，９０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８.０），６mM ＥＤＴＡ，０.２％牛血清アルブミン、０.２％ポリビニルピロリドン、０.２％フィコール、１％ＳＤＳ、５０μg／ml熱変性サケ精子ＤＮＡ）に入れ、５０℃で１時間保温した。更に新しいハイブリダイゼーション液と入れ替えて１時間保温後、32Ｐ−標識プローブを加えて５０℃で一昼夜ハイブリダイゼーションした。溶液を捨て、室温でフィルターをＳＳＣ緩衝液（３００mM ＮａＣｌ，３０mM クエン酸ナトリウム）で３回洗浄後、オートラジオグラフィーにかけた。強いシグナルを示すファージ部分をかき出し、２次スクリーニングを同様に行い、単一のポジティブクローンを分離した。クローン化ファージからのプラスミドベクターへの変換は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐｈａｇｅｍｉｄ系（ストラタジーン社製）を用いて行った。結果として、ＳＯＬ−２にポジティブなクローンを、遺伝子ライブラリー３００,０００個から１個取得し、一方、ＯＬ−３にポジティブなクローンを７０,０００個から９個得た。
【００６２】
実施例６ 組換えベクターの調製
実施例５で得られたクローンを用い、それぞれの組換えベクタープラスミドを、常法により大腸菌からアルカリ法で調製した。分子量１９ｋＤａ蛋白質に由来し、ＳＯＬ−２にポジティブな１個のクローンから得られた組換えプラスミドをｐＫＡＺ−４１２と命名した。他方、分子量３５ｋＤａ蛋白質に由来し、ＯＬ−３にポジティブな９個のクローンから得られた組換えプラスミドについて制限地図切断試験を行った結果、９個とも同一制限酵素地図を示したため、最長なクローンを選択し、これをｐＯＬ−２３と命名した。
【００６３】
実施例７ 遺伝子配列の決定およびルシフェラーゼ遺伝子の同定
塩基配列の決定は、ダイターミネーターサイクルシークエンシング法を用いて、アプライドバイオシステム社の蛍光シークエンサー（ＡＢＩ ３７３および３７７型）により決定し、SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３に示すように遺伝子の塩基配列を明らかにした。
【００６４】
その結果、シグナルペプチド配列を含む１９ｋＤａ蛋白はSEQ ID NO：２に示す１９６アミノ酸から構成され、これはSEQ ID NO：１に示す塩基配列のうち４６〜６３３に相当することが分かった。しかし、１９ｋＤａ蛋白質は、実施例２にて決定されたアミノ末端のアミノ酸配列から、分泌のために必要なシグナルペプチド配列を除いたSEQ ID NO：２の２８〜１９６番アミノ酸により示される１６９アミノ酸よりなる分子量１８,６８９.５０ダルトン（約１９ｋＤａ）のポリペプチドであって、等電点が４.７０と推定される。
【００６５】
同様に、シグナルペプチド配列を含む３５ｋＤａ蛋白は、SEQ ID NO：４に示す３５９アミノ酸から構成され、これはSEQ ID NO：３に示す塩基配列のうち７９〜１１５５に相当することが分かった。そして、３５ｋＤａ蛋白質は、実施例２にて決定されたアミノ末端のアミノ酸配列から、分泌のために必要なシグナルペプチド配列を除いたSEQ ID NO：４の４０〜３５９番アミノ酸に示される３２０アミノ酸よりなる分子量３４,８３７.０８ダルトン（約３５ｋＤａ）のポリペプチドであって、等電点が４.６１と推定される。
【００６６】
一方、実施例２にて決定されたペプチド断片のアミノ配列は全て、塩基配列の情報から得られるSEQ ID NO：２または SEQ ID NO：４のアミノ酸配列と完全に一致した。このことより、クローン化されたｐＫＡＺ−４１２およびｐＯＬ−２３は、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａと３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
【００６７】
実施例８ ヒオドシエビルシフェラーゼ由来の SEQ ID NO ：１−４に示される配列のデーターベース検索
SEQ ID NO：１−４に示される配列（アミノ酸配列、ヌクレオチド配列）について、相同性等を遺伝子データベース（National Center for Biotechnology informationに登録されている全てのデーターベース）を用いて検索した。解析ソフトはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を用いた。SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３の塩基配列については、すべてのエントリー遺伝子に対して、SEQ ID NO：２およびSEQ ID NO：４のアミノ酸配列については、エントリーアミノ酸配列およびエントリー遺伝子より翻訳されるアミノ酸配列に対して行った。その結果、SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３の塩基配列と著しい相同性のある遺伝子配列は検出されなかった。また、SEQ ID NO：２およびSEQ ID NO：４のアミノ酸配列についても、顕著な相同性を有する配列は検出されなかった。特に、セレンテラジンを含むイミダゾピラノジン化合物関連蛋白質であるレニラルシフェラーゼ（３６ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ６３５０１）、イクオリン（２１.５ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ，Ｌ２９５７１）、レニラルシフェリン結合蛋白質（２０.５ｋＤａ；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯ，Ｐ０５９３８）、ウミホタルルシフェラーゼ（５８.５ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ２５６６６）、ホタルルシフェラーゼ、発光細菌ルシフェラーゼとは、全く相同性は検出できなかった。
【００６８】
しかし、SEQ ID NO：２に示される１９ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列は、大腸菌のアミンオキシダーゼ（登録番号ｐｉｒ １４０９２４）のドメインＤ３−Ｓ１領域（アミノ酸配列２１７−３９２番）と弱い相同性（２６％（同一のアミノ酸：４４／１６９），４９％（類似のアミノ酸：８３／１６９））があり、また脂肪酸結合蛋白（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｌ２３３２２）のアミノ末端領域（アミノ酸配列１〜４７番）とも弱い相同性（２８％（同一のアミノ酸：１３／４７），５１％（類似のアミノ酸：２４／４７））があるが、機能的な相同性は検出できなかった。
【００６９】
また、図２に示すように、SEQ ID NO：４に示される３５ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列は、下記の繰り返し単位：
(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Asn-Xaa-(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Xaa-Pro（Xaa：任意のアミノ酸）
に示される、ロイシンに富むリピート構造を有することが明らかとなった。
【００７０】
実施例９ ルシフェラーゼに対する抗体の作製およびウエスタンブロット法によるルシフェラーゼ蛋白質の検出法
実施例１により得られた高度に精製したヒオドシエビルシフェラーゼ（８０μg）を抗原として、常法によりニュージーランドホワイトウサギに免疫を行い、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質に対する抗体の作製を試みた。Inouye, S.およびTsuji, F.I., Anal. Biochem., 201: 114-118 (1992年)に従って、抗体血清を５００倍希釈で使用したウエスタンブロット法にで分析した結果、作製された抗体は１９ｋＤａおよび３５ｋＤａを特異的に認識した（図３）。これにより、得られた本抗体を用いれば、ヒオドシエビルシフェラーゼ、および類似する配列を有し且つ類似な高次構造を有する他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出または検索が可能となる。
【００７１】
実施例１０ ルシフェラーゼ構成蛋白質発現ベクターの構築
実施例６で得られた組換えベクターｐＫＡＺ−４１２およびｐＯＬ−２３を発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを用いて大腸菌内および培養細胞内で該蛋白質を発現させた。用いた発現ベクターの制限酵素地図を、図４および図５に示す。
（１）大腸菌内での発現ベクターは、１９ｋＤａまたは３５ｋＤａ蛋白質をコードする、即ちSEQ ID NO：２の２８〜１９６番のアミノ酸配列またはSEQ ID NO：４の４０〜３５９番のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて調製し、該ＤＮＡ断片を、市販ヒスチジンタグを有するｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂベクター（インビトロゲン社製）の制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入することによって作製することができる。具体的には、
▲１▼ １９ｋＤａ蛋白質発現ベクター場合
ｐＫＡＺ−４１２を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
ＫＡＺ−３（5′CCGGCTAGC-TTT-ACG-TTG-GCA-GAT-TTC-GTT-GGA 3′；ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１５）、および
Ｔ７−ＢｃａＢＥＳＴ（5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′）(SEQ ID NO：１６)
を用いて、ＰＣＲキット（日本ジーン社製）にてＰＣＲ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ消化した後，ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂの制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結することによって、発現ベクターｐＨｉｓ−ＫＡＺを構築した。
【００７２】
▲２▼ ３５ｋＤａ蛋白質発現ベクターの場合
ｐＯＬ−２３を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
ＯＬ−７（5′CCGTCTAGA-GCT-GTT-GCC-TGT-CCT-GCA-GCC 3′；ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１７）および
ＯＬ−８（5′GCCGTCGAC-TTA-TTG-GCA-CAT-TGC-ATG-GAA 3′；ＳａｌＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１８）
を用いて、ＰＣＲキット（日本ジーン社製）にて（ＰＣＲ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素制限酵素ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化した後、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂの制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結することによって、発現ベクターｐＨｉｓ−ＯＬを構築した。
【００７３】
（２）動物培養細胞での発現ベクターは、１９ｋＤａまたは３５ｋＤａ蛋白質をコードする、即ちSEQ ID NO：２の２８〜１９６番のアミノ酸配列またはSEQ ID NO：４の４０〜３５９番のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて調製し、該ＤＮＡ断片をＮｈｅＩ／ＸｂａＩ消化した後、市販レニラルシフェラーゼ発現ベクターｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社製）のＮｈｅＩ／ＸｂａＩレニラルシフェラーゼ遺伝子部分と置き換えることによって作製することができる。
▲１▼ 分泌シグナル配列を有する１９ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＳＫＡＺ−ＣＭＶおよび分泌シグナル配列を欠失した１９ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＫＡＺ−ＣＭＶを、下記のプライマー：
ＫＡＺ−１：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCG-TAC-TCC-ACT-CTG-TTC-ATA 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１９）
ＫＡＺ−２：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-TTT-ACG-TTG-GCA-GAT-TTC-GTT-GGA 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２０）
ＫＡＺ−５：5′CCGCTCTA-GAA-TTA-GGC-AAG-AAT-GTT-CTC-GCA-AAG-CCT 3′（ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２１）
を使用して（１）と同様にＰＣＲ法によって構築した。ここで、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶの構築にはプライマーＫＡＺ−１とＫＡＺ−５を、またｐＫＡＺ−ＣＭＶの構築にはプライマーＫＡＺ−２とＫＡＺ−５を使用した。
【００７４】
▲２▼ 分泌シグナル配列を有する３５ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＳＯＬ−ＣＭＶおよび分泌シグナル配列を欠失した３５ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＯＬ−ＣＭＶを、下記プライマー：
ＯＬ−４：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCT-GTC-AAC-TTC-AAG-TTT 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２２）
ＯＬ−５：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCT-GTT-GCC-TGT-CCT-GCA-GCC 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２３）
ＯＬ−６：5′CCGCTCTAGAA-TTA-TTG-GCA-CAT-TGC-ATG-GAA 3′（ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２４）
を使用して、上記▲１▼と同様にＰＣＲ法によって構築した。ここで、ｐＳＯＬ−ＣＭＶの構築にはプライマーＯＬ−４とＯＬ−６を、またｐＯＬ−ＣＭＶの構築にはプライマーＯＬ−４とＯＬ−５を使用した。
【００７５】
実施例１１ ルシフェラーゼ構成蛋白質の無細胞系での発現
実施例１０で構築した発現ベクターｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＯＬ−ＣＭＶおよびｐＳＯＬ−ＣＭＶ、並びに陽性コントロールとしてレニラルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＣＭＶを用いて、無細胞系でヒオドシエビルシフェラーゼ構成蛋白質遺伝子を発現させた。無細胞系の遺伝子発現は、組換えプラスミドまたは該プラスミドより調製したｍＲＮＡから蛋白質を製造する方法であり、特に検出感度の高い発光系においては有用である。本実施例においては、市販のインビトロトランスレーションキット（ＴＮＴ−インビトロトランスクリプション−トランスレーションキット、プロメガ社製）を使用した。また、発現蛋白質の分泌シグナルペプチドの存在を確認するため、分泌シグナルペプチド切断活性を持つマイクロゾーム膜画分を添加した。反応は、０.５μgのプラスミドＤＮＡ、２０μlのウサギ網状赤血球、１μlの１mM−メチオニン、２.５μlのマイクロゾーム膜画分を加えて、全量を２５μlとし３０℃で９０分保温した後、反応溶液の１μＬの発光活性を測定した。
【００７６】
発光測定のための反応溶液は、全量が１００μlでＥＤＴＡを１０mMの濃度で含む５０mM濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７.６）溶液に基質セレンテラジン１μgを加え、酵素を添加することにより発光反応を開始し、発光をルミフォトメーターで検出した。結果を表２に示す。なお、発光相対値１(ｒｌｕ)＝１.２５×１０７フォトン／秒である。
【００７７】
【表２】
【００７８】
ｐＫＡＺ−ＣＭＶには顕著な活性が見い出され、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶにマイクロゾーム膜画分添加することにより、その効率は低いものの活性が約２０倍上がることから、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ発現の１９ｋＤａ蛋白質のアミノ末端には、分泌シグナルペプチド様配列の存在が確認された。分泌シグナルペプチド様配列の問題は、他の効率的に切断される公知の分泌シグナルペプチドを付加またはこれと置換することにより解決することができる。また、実施例５で作製したルシフェラーゼ抗体を用いて、インビトロトランスレーション産生蛋白質をウエスタンブロット分析により解析した結果、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質の発現が確認された。
【００７９】
実施例１２ ルシフェラーゼを構成する蛋白質の大腸菌での発現
実施例１０で構築した発現ベクターｐＨｉｓ−ＫＡＺとｐＨｉｓ−ＯＬ、およびコントロールプラスミドとしてｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂを用いて、常法に従って大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。得られた形質転換株の一晩培養液０.１mlをアンピシリン（５０μg／ml）含有ＬＢ液体培地（１０ml）に植菌し、３７℃で２時間振盪培養後、最終濃度が１mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に３時間培養した。その菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供して、発現蛋白質を確認した。その結果、分子量２０ｋＤａおよび３６ｋＤａに相当する発現蛋白質のバンドを確認した。これらの発現蛋白質には、ニッケルキレートカラムで精製可能な６個のヒスチジン配列を含む１４アミノ酸配列を付加しているため、分子量サイズが大きくなっていると考えられる。また、これらのバンドは、ヒスチジン配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（キアゲン社製）および実施例９で作製したポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析では、両方の抗体により認識されることため、発現蛋白質はアミノ末端にヒスチジン配列を有するヒオドシエビルシフェラーゼの構成蛋白質（分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質）であることが確認された。
【００８０】
上記ＩＰＴＧで発現誘導処理した培養液１mlを１０,０００rpmで遠心分離し、集めた菌体を１mlの緩衝液（３０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，pH７.６）に懸濁し超音波破砕した。１０,０００rpm、４℃で遠心分離し、上清を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液に対して、セレンテラジンまたはビスデオキシセレンテラジンを基質として１μg添加して、発光活性をルミフォトメーターで測定した。その結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】
【００８２】
この表から各々の活性を比較すると、ｐＨｉｓ−ＫＡＺを保持する菌株の活性は、負の対照であるｐＴｒｃＨｉｓ−ＢおよびｐＨｉｓ−ＯＬの約一万倍である。従って、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質のうち、分子量１９ｋＤａ蛋白質が発光活性を有することが明らかとなり、発光反応を１９ｋＤａ単独でも行うことができること、ビスデオキシセレンテラジンを基質として利用できることが明らかとなった。このため、３５ｋＤａの蛋白質は、基質特異性に直接関与せず、発光活性を有する１９ｋＤａ蛋白質に熱耐性を付与するなど、ルシフェラーゼ（酵素）の安定性を付与する機能を有していることが示唆される。
【００８３】
実施例１３ ルシフェラーゼを構成する蛋白質の動物培養細胞での発現
実施例１０で構築した、動物培養細胞での発現ベクターである、プラスミドｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＯＬ−ＣＭＶおよびｐＳＯＬ−ＣＭＶ、並びに正のコントロールとしてレニラルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＣＭＶを、培養細胞ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションすることにより、ヒオドシエビルシフェラーゼ構成蛋白質遺伝子の発現を試みた。ＣＯＳ７細胞（２×１０5個）は、１０％（v／v）の熱不活性化胎牛血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ペニシリン（１００単位／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）を含むダルベッコ変型イーグル培地３mlを含有する３５mmシャーレ中で培養した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ社製）を用いて２μgのプラスミドＤＮＡで形質転換した。更に３６時間培養した後、細胞と培地を分離した。得られた細胞を０.５mlのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、−８０℃での凍結と３７℃での融解を繰り返して抽出液を得た。セレンテラジンおよびビスデオキシセレンテラジンを基質として１μg添加して、発光活性をルミフォトメーターで測定した。その結果を表４に示す。
【００８４】
【表４】
【００８５】
活性を比較した結果、ｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶおよび正のコントロールｐＲＬ−ＣＭＶのみに顕著な発光活性が見い出された。ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶの培養液への分泌効率が低いことは、実施例１１の結果と一致する。一方、ｐＫＡＺ−ＣＭＶの発光強度が現在レポータープラスミドとして市販されているｐＲＬ−ＣＭＶと同等であることから、ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼの１９ｋＤａ蛋白質遺伝子は、動物培養細胞系でのレポーター遺伝子として充分使用することが可能であることが示された。
【００８６】
実施例１４ 大腸菌の封入体からの発現蛋白質の単離およびその再生
実施例１１にて構築した組換え発現プラスミドｐＨｉｓ−ＫＡＺで形質転換し、実施例１２で培養した菌体を２０mlの２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７.５、に懸濁し、超音波破砕装置（ブランソン社製：モデル２５０型）で細胞を破壊後、冷却高速遠心機（１２,０００×ｇ，２０分）により封入体を包含する沈殿不溶性画分と可溶画分とに分離した。
【００８７】
（１）尿素による発現蛋白質の可溶化
不溶性画分を先ず２０mlの２Ｍ尿素（和光純薬社製）を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に超音波処理により十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して不溶性画分を回収し、この操作を２回繰り返す。２Ｍの濃度では目的の１９ｋＤａ蛋白質は殆ど（５％以下）可溶化しないが、他の蛋白質不純物はかなり除去された。回収した不溶性画分に２０mlの８Ｍ尿素を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して、可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９５％以上であった。この回収画分をニッケルキレートカラムクロマトグラフィーに供した。
【００８８】
（２）グアニジン塩酸塩による発現蛋白質の可溶化
不溶性画分を２０mlの０.５Ｍグアニジン塩酸塩（和光純薬社製）を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に超音波処理により十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して不溶性画分を回収し、この操作を２回繰り返した。回収した不溶性画分に２０mlの６Ｍグアニジン塩酸塩を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して、上清の可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結果、電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９０％以上であった。この回収画分を８モル尿素にて１０倍に希釈してニッケルキレートカラムクロマトに供した。
【００８９】
（３）グアニジン塩酸塩および尿素による発現蛋白質の可溶化
上記（２）と同様に不溶性画分を０.５Ｍ グアニジン塩酸塩で２回処理した。得られた不溶性画分を２０mlの８Ｍ尿素を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して、上清の可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結果、電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９０％以上であった。この回収画分をニッケルキレートカラムクロマトに供した。
【００９０】
（４）ニッケルキレートゲルクロマトグラフィーによる精製
ニッケルキレートゲルはキレートゲルファーストフロー（ファルマシア社）と０.０１Ｍの塩化ニッケル水溶液を混合することにより調整し、カラム（カラムサイズ：１cm（直径）×６cm）に充填した。カラムゲルは濃度８Ｍの尿素を含む、濃度２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７.５）緩衝液（以下に緩衝液Ａと記載する）で平衡化したカラムに（１）〜（３）にて調製した可溶性画分を供した。緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、０.３Ｍのイミダゾール（和光純薬社）で吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分（約１０ml）を１Ｌの緩衝液Ａ中において４℃で１８時間透析を行い、イミダゾールを除去した。透析試料を再度を緩衝液Ａで平衡化した上記カラムに供し、緩衝液Ａ３０mlで洗浄後、イミダゾールの０〜０.３Ｍの直線的濃度勾配（全溶出量，１００ml）によりヒスチジンを有する１９ｋＤａ蛋白質を溶出した。精製された蛋白質の純度は９５％であった。バイオラッド社製の色素結合法による蛋白質定量の結果、４００mlの培養菌体から６.８mg蛋白質を得た。
【００９１】
（５）精製１９ｋＤａ蛋白質の再生・再活性化
上記（４）にて精製した１９ｋＤａ蛋白質は全く発光活性を示さない。そこで、多価アルコール溶媒としてグリセリン（和光純薬）を用い、精製した蛋白質をグリセリン最終濃度（v／w）０％〜９０％の溶液中に２５℃で、３０分間放置し、上述のように発光活性を測定した。（１）の尿素よる可溶化試料についての結果を表５に示す。
【００９２】
【表５】
【００９３】
その結果、尿素を含まない緩衝液で処理することによりわずかに再活性化されるが、グリセリンを添加することにより再活性化が顕著に増加することが示された。特にグリセリン濃度が５０〜７０％の場合、グリセリンを添加しないものと比較して約５０倍の再活性化が観察された。その再生の効率は、天然のルシフェラーゼ活性を基準に算出した結果、約６０〜８０％であった。また、（２）および（３）にて可溶化した場合でも同様な結果が得られた。
【００９４】
さらに再生処理した当該蛋白質をグリセリン０％または５０％中にて、４℃で３０日間保存し、その発光活性を測定した。その結果、グリセリン０％では保存前と比較して発光活性が約１／５に低下したが、グリセリン５０％では、−２０℃で保存した場合（データは示さない）と同様に、ほとんど活性の低下が認められなかった。このことは、再生した活性化１９ｋＤａ蛋白質は、グリセリン（５０〜７０％）中で安定に保存することが可能でありことを示している。保存試験の結果を下記の表に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
【発明の効果】
本発明によれば、深海に生息するヒオドシエビ由来のルシフェラーゼが分子量１９ｋＤａおよび分子量３５ｋＤａの蛋白質から構成されることが明らかとなり、さらに該蛋白質をコードする遺伝子が単離され、該遺伝子を用いて高純度の組換え分泌型ルシフェラーゼ蛋白質が提供される。また、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した細菌および動物培養細胞が得られ、これを用いた分泌型ルシフェラーゼ蛋白質の製造方法が提供される。これは、本発明のルシフェラーゼおよびその構成蛋白質を大量に調製することができることを意味する。本発明において調製されたルシフェラーゼおよびその構成蛋白質（特に分子量１９ｋＤａの蛋白質）は多くの測定・分析法に適用することができ、また診断薬や検査薬としても有用である。
さらに、本発明の蛋白質を抗原として作製される抗体、該蛋白質をコードするＤＮＡから得られるプライマーは、本発明のルシフェラーゼ、またはこれを構成する蛋白質、およびこれらと相同性がある他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出、検索およびそのクローニングに用いることができる。
【００９７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】精製ヒオドシエビ由来ルシフェラーゼのゲル濾過による分子量の決定を示す。
【図２】ヒオドシエビ由来の３５ｋＤａ蛋白質に存在するロイシンリピート配列を示す。
【図３】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼに対するポリクロナール抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す。
【図４】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａ蛋白質遺伝子の制限酵素地図と発現ベクターを模式的に示す図である。
【図５】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼを構成する３５ｋＤａ蛋白質遺伝子の制限酵素地図と発現ベクターを模式的に示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、十脚類（Decapoda）由来のルシフェラーゼ、具体的にはヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来の分泌型ルシフェラーゼに関する。詳細には、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される該ルシフェラーゼ、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した宿主、並びに該宿主を培養するまたは該組換えベクターを用いてインビトロ−トランスクリプション−トランスレーションを実施することを特徴とする発光活性を有する蛋白質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ルシフェラーゼおよび発光蛋白質をコードする遺伝子は、表１に示される文献に開示されるもののみが知られている。
【０００３】
【表１】
これらの発光蛋白質およびルシフェラーゼは、産業上重要な酵素として、例えばレポーター蛋白質として既に広く利用されている。これら酵素群の発光反応を利用した種々の検出法の開発に伴い、発光検出装置が普及し、また、高感度化など該装置も進歩している。しかし、このような状況下において、これまでに知られている発光蛋白質およびルシフェラーゼの中で、広範囲の用途に適用し得るルシフェラーゼまたは発光蛋白質は存在せず、それぞれの目的に適合する酵素を選択する必要があった。
【０００５】
一方、学術論文、特許明細書等に開示されている発光基質（ルシフェリンと称される）について、その構造が決定されているものは下記の式（１）〜式（８）に示すもののみである。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
発光基質には生物種特異的であるものと生物種非特異的なものがあり、更にその他の生体成分（補酵素、補欠分子等）を必要とする発光反応がある。生物発光酵素反応のうち最小単位での発光反応は、発光酵素ルシフェラーゼ、発光基質ルシフェリン、分子状酸素の３者のみで発光反応が起きる場合である。
【００１４】
表１における最小単位での発光反応の例は、腔腸動物の花虫類（Cindaria）に属するレニラ（Renilla）由来ルシフェラーゼ、甲殻類（Ostracoda）に属するウミホタル（Cypridina）由来のルシフェラーゼと鞭毛藻類（Flagellata）に属するゴニオラックス（Gonyaulax）由来のルシフェラーゼであるが、これらに対応する発光基質ルシフェリンの構造は、例えば前記式（４）および（５）に示すように非常に複雑である。例えば、ウミホタルおよびゴニオラックスルシフェリンの合成法は知られているが、その複雑な合成工程のために収率が悪く、天然抽出ルシフェリンが使用されている。このため、価格が非常に高価であり、産業用としての実用性は乏しい。これに対し、セレンテラジンとして知られているレニラルシフェリンは種々の方法が確立されているため、セレンテラジンおよびその誘導体は安価に販売されており、容易に取得することができる。
【００１５】
また、表１の発光蛋白質群において、天然に存在する分泌型ルシフェラーゼは、ウミホタルルシフェラーゼのみであり、その遺伝子構造はThompson, E.M., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571 (1989年）に、その使用例は、Inouye, S., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9584-9587 (1992年) に開示されている。
【００１６】
分泌型ルシフェラーゼの産業上有効な点は、ドラッグスクリーニングシステム等のバイオアッセイ系を構築する場合、細胞外分泌するルシフェラーゼをレポーター分子として用いることにより、細胞破砕せず、生細胞においてその活性を容易に検出できることである。また、本来分泌性の蛋白質を製造することは、宿主−ベクター系を適切に選別すればさほど困難でなく、培養液中からの組換え蛋白質の精製は容易である。このため、分泌型ルシフェラーゼを大量に製造する場合、その製造・精製のコストを押さえることができるという利点がある。
【００１７】
さらに、発光反応が最小単位、即ち発光酵素ルシフェラーゼ、発光基質ルシフェリンおよび分子状酸素の３者のみで起こり、且つ発光基質ルシフェリンが取得が容易なセレンテラジンまたはその誘導体であり、該ルシフェラーゼが分泌型蛋白質である発光反応系が特に有利である。しかし、そのような分泌型のルシフェラーゼの遺伝子単離および生細胞での発現は報告されていない。このような分泌型ルシフェラーゼおよびその遺伝子は学術基礎、応用研究の領域に留まらず、診断薬や検査薬等、産業上有用である。
【００１８】
発明者は、先行技術文献等を調査・検討した結果、これまで確認されているセレンテラジンを発光基質とした分泌型ルシフェラーゼは、十脚類（Decapoda）に属する発光エビ由来のルシフェラーゼのみであることを知った。発光エビは分泌性のルシフェラーゼ（酵素）を有し、これをルシフェリン（発光基質）および分子状酸素と反応させると青色に発光する。世界中に生息する発光エビ分類の詳細は、Herring, P.J., J. Mar. Biol. Ass. U.K., 56, 1029-1067 (1976年)に開示されている。そして、発光エビのルシフェラーゼに関する唯一の生化学的研究としては、静岡県の駿河湾に生息する深海発光エビであるヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）についてのShimomura, O., Masugi, T., Johnson, F.H. & Haneda, Y., Biochemistry, 17, 994-998(1978年)である。前記先行技術は、分子量３１,０００のモノマーの４量体からなる分子量約１３０,０００を有するルシフェラーゼを開示しており、さらに当該ルシフェラーゼの２２℃における光子収量が０.３２であり、高発光活性（１.７５×１０15Ｐｈｏｔｏｎ／ｓ.mg）を有し、最適発光温度は４０℃で熱安定性にすぐれ、幅広いｐＨで反応が進むことを記載している。
【００１９】
このヒオドシエビル由来のシフェラーゼの発光反応におけるルシフェリンは前記の式（２）に示されるセレンテラジンである。セレンテラジンはレニラ（Renilla）ルシフェラーゼ反応、および発光蛋白質イクオリン（Aequorin）の発光反応の発光基質でもある。これらの酵素群とヒオドシエビのルシフェラーゼの最大の相違点は、レニラルシフェラーゼや発光蛋白質イクオリンの発光基質特異性と比較して、ヒオドシエビのルシフェラーゼは非常に幅広い基質特異性を示す点にある。即ち、ヒオドシエビのルシフェラーゼは、発光基質セレンテラジン誘導体として安価に合成できるビスデオキシセレンテラジンを使用することができ、他のルシフェラーゼ酵素と比較して有利である。
【００２０】
しかしながら、分泌型ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼについて、上記先行技術に記載されていること以外について、例えばその蛋白質構造および遺伝子構造に関する情報は全く得られていない。発光エビの多くは深海に生息するため実験材料としての生個体の大量入手が非常に困難であることがその理由と考えられる。また、近年の環境変化の影響等により個体が減少し、少量の生固体の入手さえも困難になってきている状況である。このため、生物資源の一つであるヒオドシエビの遺伝子ライブラリーの構築とともに、早急なヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子の単離が望まれている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、深海に生息するヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を用いて高純度の組換え分泌型ルシフェラーゼ蛋白質を提供することである。また、本発明の目的は、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した宿主細胞、例えば微生物および動物培養細胞、並びに高純度の組換え分泌型ルシフェラーゼ蛋白質の製造方法を提供することである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
ヒオドシエビから発光活性を有する分泌型ルシフェラーゼを単離・精製した結果、分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される分泌型ルシフェラーゼを見出した。そして、各々の蛋白質のアミノ酸配列を部分的に決定し、これに基づきルシフェラーゼの構成蛋白質である１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を決定した。さらに、該遺伝子を含む組換えベクターを作製し、該ベクターを用いる無細胞発現系および該ベクターで形質転換した宿主、例えば大腸菌や酵母などの微生物または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系によって前記蛋白質を製造した。
【００２３】
即ち、本発明は、十脚類（Decapoda）由来のルシフェラーゼに関する。具体的には、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される該ルシフェラーゼに関する。詳細には、ヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来の１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構成される分泌型ルシフェラーゼルに関する。
【００２４】
本発明はまた、該ルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａの蛋白質であって、発光活性を有する蛋白質に関する。具体的には、前記発光蛋白質は、SEQ ID NO：２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ発光活性を有する蛋白質である。
【００２５】
１９ｋＤａの蛋白質は、さらに当該技術分野において知られている、蛋白質精製のためのペプチド配列および／または細胞外分泌シグナルペプチドもしくは細胞内器官への移行シグナルペプチドを含むことができ、そのようなシグナルペプチドは、１９ｋＤａ蛋白質の前駆体由来のSEQ ID NO：２のアミノ酸配列１〜２７番に包含されるシグナルペプチド、または他の公知のシグナルペプチドとすることができる。細胞外分泌シグナルペプチドとしては、公知の真核生物の分泌シグナルペプチド（例えば、von Heijne, G. Eur. J. Biochem 133:17-21 (1983年)）および公知の原核生物の分泌シグナルペプチド（例えば、von Heijne, G. & Abrahmsen, L. FEBS Lett. 244: 439-446(1989年)に記載）を挙げることができる。また、細胞内器官への移行シグナルペプチドとしては、ミトコンドリアへの移行シグナルペプチド（例えば、Gavel, Y. ＆ von Heijne, G., Protein Engineering 4: 33-37 (1990年)）、 クロロプラスト移行シグナルペプチド（例えば、Gavel, Y.＆ von Heijne, G., FEBS Lett. 261:455-458(1990年)）および核内移行シグナルペプチド（例えば、Dingwall, C. & Laskey, R.A., Trends Biochem.Sci. 16:478-481 (1991年)）を挙げることができる。
【００２６】
本発明はまた、該ルシフェラーゼを構成する分子量３５ｋＤａの蛋白質に関し、具体的にはSEQ ID NO：４に示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質に関する。前記３５ｋＤａの蛋白質は、さらに３５ｋＤａ蛋白質の前駆体由来のSEQ ID NO：４のアミノ酸配列１〜３９番に包含されるシグナルペプチド、または上述のシグナルペプチドを含むことができる。
【００２７】
本発明はまた、前記１９ｋＤａの発光蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：１に示す塩基配列の４６〜６３３番の塩基配列、（ｂ）前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有する。
【００２８】
本発明はまた、前記３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：３に示す塩基配列の７９〜１１５５番の塩基配列、（ｂ）前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有する。
【００２９】
前記１９ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび／または３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、さらに公知の上述のペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、例えば上記文献に開示されるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含することができる。なお、本明細書においてポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ）を包含する。
【００３０】
本発明はまた、上述したルシフェラーゼ、前記１９ｋＤａの発光蛋白質、または前記１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質に、セレンテラジンまたはその誘導体を基質として作用させることを特徴とする発光方法に関する。本発明のルシフェラーゼおよび発光蛋白質は、酵素である該蛋白質、発光基質ルシフェリンであるセレンテラジンまたはその誘導体、および分子状酸素のみで発光反応が起きる。その反応条件として、温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲であり、ｐＨは５.５〜１１の範囲、好ましくは７〜１０の範囲である。
【００３１】
本発明はまた、１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質をコードする前記ポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換えベクターに関する。本発明の好ましい態様において、組換えベクターは、その挿入物を発現させうる組換え発現ベクターである。そのような組換えベクターは、当該技術分野における公知の任意の方法で作製することができる。
【００３２】
本発明において、前記蛋白質を発現させるために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロ トランスクリプション−トランスレーション）に、および宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系に適するベクターとすることができ、そのようなベクターは市販されているかまたは公知のベクターから容易に作製することができる。例えば、インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイルスのimmeadiate-early エンハンサー／プロモター領域を組込み、その下流域にＴ７のプロモター配列／マルチクローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターやＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモターを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−ＴａｇおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。また、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適するベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモターを有するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ２７ｂ（＋）やｐＥＴ２８ａ（＋）；ノバジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキシダーゼのプロモターを有するピチア発現系ベクターｐＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９ＫやＰＩＣ３.５Ｋ；インビトロゲン社）などである。
【００３３】
また、精製のためのペプチド配列としては、当該技術分野にて用いられているペプチド配列とすることができるが、例えばヒスチジン残基が４個以上、好ましくは６個以上連続したヒスチジンタグ配列、モノクローナル抗体への結合能を持つエピトープタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインまたはプロテインＡをコードする配列などが包含される。これらペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入物として含有するベクターは市販されている。例えば、大腸菌、酵母などの微生物宿主に用いるベクターは、大腸菌系のＴ７のプロモターを有し、ヒスチジン残基を１０個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えばｐＥＴ１６ｂ；ノバジェン社）、ヒスチジン残基を６個をアミノ末端に有する発現ベクター（例えばｐＨＢ６；ロッシュダイアグノスチィック社、pＴｒｃ−Ｈｉｓシリーズベクター；インヴィトロゲン社、ｐＨＡＴベクターシリーズ；クローンテック社）などである。動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒスチジン残基を６個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えば、ｐＨＭ６やｐＶＭ６；ロッシュダイアグノスチィック社）の使用が可能である。昆虫培養細胞系ではバキュロウイルス系のヒスチジン残基を６個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えば、pＢａｃPＡK−Ｈｉｓベクター；クローンテック社）。また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼと融合発現するpＧＥＸシリーズベクター（ファルマシア）、プロテインＡを発現するｐＲＩＴ２またはｐＥＺＺ１８ベクター（ファルマシア）が使用可能である。
【００３４】
本発明の蛋白質を製造するためのインビトロトランスレーションは、公知の方法、例えばSpirin, A.S., et.al., Science 242: 1162-1164(1988年)および Patnaik, R. & Swartz, J.M. Biotechniques 24: 862-868(1998年)に記載の方法で実施することができ、市販のインビトロトランスレーションキット（例えば、ＴＮＴ−インビトロトランスクリプション−トランスレーションキット、プロメガ社製）を用いてもよい。
【００３５】
本発明または、上述の組換えベクターで形質転換した、宿主細胞、例えば微生物（大腸菌、酵母など）および動物培養細胞（昆虫培養細胞、哺乳類培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞など）に関する。
【００３６】
従って、本発明は、１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換え発現ベクターを用いてインビトロトランスクリプション−トランスレーションを実施することからなる、本発明のルシフェラーゼまたはその構成成分である１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質の製造方法に関する。さらに本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、所望の蛋白質を単離することからなる、本発明のルシフェラーゼまたはその構成成分である１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤａの蛋白質の製造方法に関する。
【００３７】
本発明の蛋白質の製造方法において、発現させた蛋白質は、宿主細胞の培養後、その培地からまたは菌体の可溶性画分から単離することができ、実際に培養した宿主細胞を破砕し、遠心分離した得られた可溶性画分に十分な発光活性が検出された。しかし、大腸菌で発現させた場合に、本発明の蛋白質、例えば１９ｋＤａの発光蛋白質が菌体内に封入体（インクルージョンボデイ）として大量に蓄積され（菌体の５％〜１０％程度）、不活性状態にあることが見い出された。故に、封入体を包含する不溶性画分から発現させた蛋白質を回収し、再活性化を行うことができれば、発光活性を有する所望の蛋白質をより多量に製造することが可能となる。
【００３８】
故に、本発明の蛋白質の製造方法は、当該技術分野において知られている蛋白質の可溶化剤でその不溶性画分を処理することにより、所望の蛋白質を可溶化して次いで単離・精製し、さらに単離した蛋白質を溶媒として１つ以上の多価アルコールの存在下にて再生させて、再活性化させることを包含する。
【００３９】
発現した蛋白質の可溶化は、当該技術分野において知られている可溶化剤、例えば尿素および／またはグアニジン塩酸塩を用いて行うことができる。その濃度は、尿素の場合は２〜８Ｍの範囲、好ましくは８Ｍであり、グアニジン塩酸塩の場合は１〜６Ｍの範囲、好ましくは６Ｍである。またその際のｐＨは通常６〜９の範囲、好ましくはｐＨ７〜８の範囲であり、処理温度は通常１０〜６０℃の範囲、好ましくは２０〜３５℃の範囲である。
【００４０】
再生・再活性化において溶媒として用いることができる多価アルコールは、例えばグリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ショ糖、果糖およびブドウ糖からなる群から選択される１つ以上の多価アルコールであり、好ましくはグリセリン、ポリエチレングリコールおよび／またはプロピレングリコール、より好ましくはグリセリンである。また、多価アルコールの濃度範囲は、１０〜９０％(W／V)、好ましくは３０〜９０％(W／V)、より好ましくは５０〜７０％(W／V)である。
【００４１】
また、本発明の蛋白質の製造方法において、発現させた蛋白質は公知の方法により単離・精製されるが、その精製法としては公知の任意の方法から適宜選択することができる。例えば、本発明の蛋白質が上述した精製のためのペプチド配列を包含する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、ヒスチジンタグ配列にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインにはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡまたは他の蛋白質の配列の場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
【００４２】
さらに本発明は、下記のアミノ酸配列の繰り返し単位：
（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ
（但し、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す。）
を有する蛋白質であって、前記ルシフェラーゼを構成し、且つルシフェラーゼを安定化する機能を有する蛋白質に関する。このようなロイシンリピート構造は、図２に示すように、３５ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列に見出されるものである。従って、前記３５ｋＤａ蛋白質と同様に、ルシフェラーゼを安定化する機能を有することが期待される。
【００４３】
本発明はまた、抗原として前記ルシフェラーゼ、前記１９ｋＤａもしくは３５ｋＤａの蛋白質またはそれらの断片を抗原として作製され、且つ前記抗原と特異的に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に関する。前記抗原として、抽出した天然の蛋白質、組換え蛋白質、これらの蛋白質の部分的分解物、または本発明の蛋白質のアミノ酸配列に基づく合成ペプチドを用いることができる。そのような抗原は、例えばSEQ ID NO：２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミノ酸配列、SEQ ID NO：４に示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列から選択される少なくとも５個の連続したアミノ酸配列、好ましくは１０〜１５アミノ酸残基からなるポリペプチドである。本発明にかかる抗体は、常法（例えば、Harlow, E. & Lane, D, in Antibodies-Laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press., pp53-138 (1988年)）に従って作製することができる。
【００４４】
本発明にかかる抗体は、ヒオドシエビ由来の分泌型ルシフェラーゼ、またはこれを構成する蛋白質の検出に用いることができるが、これらと配列相同性がある他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および検索にも使用することができる。従って、本発明はまた、前記抗体を用いるルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および／または検索方法に関し、前記方法によって同定される新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質もまた本発明に包含される。本発明の検出および／または検索法によれば、分類上に近種ルシフェラーゼを容易に取得することが可能である。
【００４５】
上述のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および／または検索方法は、例えば他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしくはその組織の粗抽出物を試料として、本発明の抗体が結合する蛋白質を検出・検索することからなる。そのような検出手段としては、例えばイムノブロット、イムノアフィ二ティクロマトグラフィーを挙げることができる。また、他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリーについて、本発明の抗体を用いてエクスプレッション クローニング（Sambrook, J., Fritsch,E.F., & Maniatis,T., Molecular Cloning − a Laboratory Mannual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp12.3-12.44 (1989年)）を実施して、新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質をコードするＤＮＡを直接得ることができる。
【００４６】
本発明はまた、SEQ ID NO：２に示される本発明の１９ｋＤａ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列およびその相補的配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、詳細にはSEQ ID NO：１の塩基配列またはその相補的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくはアミノ酸５個の長さに対応する１４個であるのが好ましく、アミノ酸７個に対応する２０個以上であるのがさらに好ましい。そのようなプライマーにはその５′末端に適する制限酵素部位を包含させることができる。
【００４７】
本発明はまた、SEQ ID NO：４に示される本発明の３５ｋＤａ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列およびその相補的配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、詳細にはSEQ ID NO：３の塩基配列またはその相補的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドの長さは、上述した通りであり、同様にその５′末端に適する制限酵素部位を包含させることができる。
【００４８】
これらオリゴヌクレオチドプライマーは、本発明のルシフェラーゼを構成する蛋白質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡの検出に用いるとができ、その手法としては公知の遺伝子検出法を用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が特に好ましい。
【００４９】
また、これらのプライマーを用いて、他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）から、新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。その手段としては、公知の適する方法を用いることができるが、ＰＣＲ法が好ましい。
【００５０】
従って、本発明はまた、これらオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ルシフェラーゼを構成する蛋白質および発光蛋白質をコードする遺伝子の検出および／または検索法に関し、前記方法によって検索される新規ルシフェラーゼ、これを構成する新規蛋白質および発光蛋白質、並びに該蛋白質をコードする新規遺伝子もまた本発明に包含される。本発明の検出および／または検索法によれば、分類上に近種ルシフェラーゼ、具体的には相同性が５０％程度までのルシフェラーゼ遺伝子を容易に取得することが可能である。
【００５１】
下記の実施例により本発明のルシフェラーゼ、これを構成する蛋白質の単離および精製、該蛋白質をコードする遺伝子の単離ならびにそれらの同定法についてについて説明する。
【００５２】
【実施例】
実施例１ 発光エビのルシフェラーゼの精製と構成蛋白質の同定
材料である発光ヒオドシエビ（学名：Oplophorus gracilirostris）は、静岡県駿河湾で行われている桜エビ漁の網に混入するヒオドシエビを採取した。粗精製物は、Shimomura, O., Masugi, T., Johnson, F.H. & Haneda, Y., Biochemistry 17:994-998（1978年）に記載の方法に従って調製した。さらに、精製度をあげるため疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：０.７cm（直径）×３.５cm）を使用し、１.５Ｍ 硫酸アンモニウムを含有する２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.５の緩衝液で平衡化したカラムより、硫酸アンモニウム濃度を下げることにより溶出し発光活性をもつ画分を集めた。この画分を５０mM 塩化ナトリウム含有２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.５の緩衝液で平衡化したスーパーデックスカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：１cm（直径）×４８cm）に供しゲルろ過を行った。同一カラムでの分子量サイズマーカー（ａ：アミラーゼ（２００ｋＤａ），ｂ：アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ），ｃ：血清アルブミン（６７ｋＤａ），ｄ：オボアルブミン（４３ｋＤａ），ｅ：カルボニックアンハイドラーゼ（３０ｋＤａ）およびｆ：リボヌクレアーゼ（１３.７ｋＤａ））と比較した結果、ヒオドシエビのルシフェラーゼの分子量は、約１０６ｋＤａであった。その結果を図１に示す。また、精製酵素の比活性は１.３×１０15ｑｕａｎｔａ／ｓ.mgであった。
【００５３】
精製したサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲル）によって分析した。その結果、精製画分は、分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質で構成されていることが明かとなった。更に、精製した蛋白質（２５μg）を０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ０.３mlに溶解し、ゲルろ過カラムによる高速液体クロマトグラフィーにて分離した。即ち、０.１Ｍの塩化ナトリウムおよび０.１％のＳＤＳを含む２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.７の溶媒系で、ゲルろ過用カラムＴＳＫ３０００ＳＷ（東ソー、０.７５cm（直径）×３０cm）を使用し、分離蛋白質を吸光度２８０nmで検出した。その結果、２つの主ピークを検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、それぞれのピークは分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質に対応することが明らかとなった。以上のことより、分子量が約１０６ｋＤａを示すヒオドシエビの有する本発明のルシフェラーゼは、分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質それぞれ２個より構成されることが明らかとなった。
【００５４】
実施例２ ルシフェラーゼのアミノ酸配列の決定
アミノ酸配列の決定は、常法によって気相シークエンサー（アプライドバイオシステム社製のモデル４７０型）用いて実施した。サンプル調製は以下の通りである。
【００５５】
１）精製ルシフェラーゼは、１２％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量３５ｋＤａの蛋白質と分子量１９ｋＤａの蛋白質を分離後、エレクトロブロット法を用いて、１５０ｍＡ、１時間の条件でポリビニリデンジフルオライド メンブレン（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）にトランスファーした。染色後、分子量１９ｋＤａと３５ｋＤａの蛋白質部分をそれぞれ切り出して、シークエンサーに供し、その部分的アミノ酸配列を決定した。
【００５６】
２）精製ルシフェラーゼ（５０μg）を５Ｃ４カラム（ウオーターズ社製、カラムサイズ：０.３９cm（直径）×１５cm）を用い逆相系の高速液体クロマトグラフィーにて分離した。溶媒系はトリフルオロ酢酸０.１％を含むアセトニトリル／水で、アセトニトリル勾配（８０分間で０％から８０％に上ける）によって溶出し、蛋白質画分を吸光度２２０nmで検出してピーク画分を集め、減圧下に濃縮して、シークエンサーを用いてそのアミノ酸配列を決定した。分子量３５ｋＤａの蛋白は、リジンエンドペプチダーゼ（ベーリンガー社製、シークエンスグレード）を重量比５０分の１にて処理し、ペプチド断片を５Ｃ８カラム（バイダック社製、カラムサイズ：０.４６cm（直径）×２５cm）を用い逆相系の高速液体クロマトグラフィーにて分離した。溶媒系は、トリフルオロ酢酸０.１％を含むアセトニトリル／水で、アセトニトリル勾配（８０分間で１５％から５５％に上げる）によって溶出し、ペプチド断片画分を吸光度２２０nmで検出してピーク画分を集め、シークエンサーを用いてその部分的アミノ酸配列を決定した。
【００５７】
上述のように決定された酸配列を以下に示す。
▲１▼ 分子量１９ｋＤａの蛋白質について決定したアミノ酸配列
N-末端配列（SEQ ID NO：５）：Phe-Thr-Leu-Ala-Asp-Phe-Val-Gly-Asp-Trp-Gln-Gln-Thr-Ala-Gly-Tyr-Asn-Gln-Asp-Gln-Val-Leu-Glu-Gln-Gly-Gly-Leu-Ser
▲２▼ 分子量３５ｋＤａの蛋白質について決定したアミノ酸配列
N-末端配列（SEQ ID NO：６）：Ala-Val-Ala-(x)-Pro-Ala-Ala-Glu-Asp-Ile-Ala-Pro-(x)-Thr-(x)-Lys-Val-Gly-Glu-Gly-Asp-Val-Met-Asp-Met-Asp-(x)-Ser-Lys
（ここで(x)は、未決定アミノ酸を示す。）
▲３▼ リジンエンドペプチダーゼ処理により得られたペプチド断片の配列：
a) Val-Thr-Ser-Asp-Ala-Glu-Leu-Ala-Ser-Ile-Phe-Ser-Lys-Thr-Phe-Pro（SEQ ID NO：７）
b) Asn-Asp-Leu-Ser-Ser-Phe-Pro-Phe-Glu-Glu-Met-Ser-Gln-Tyr-Thr-Lys（SEQ ID NO：８）
c) Leu-Val-Leu-Gly-Tyr-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Leu-Pro-Val-Gly-Ala-Ile（SEQ ID NO：９）
d) Asn-Leu-Asp-Pro-Ala-Val-Phe-His-Ala-Met-(x)-Gln（SEQ ID NO：１０）
【００５８】
実施例３ ヒオドシエビのｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーの作製およびルシフェラーゼ遺伝子クローニング
駿河湾に生息するヒオドシエビを採取し、直ちにドライアイス上で凍結を行い、使用まで−８０℃で保存した。全ＲＮＡの調製は、Inouye, S. & Tsuji, F.I., FEBS Lett., 315, 343-346 (1993年) に記載のグアニジンイソチオシアネート法により行った。その結果、２尾（体長４０mm、重さ２.８ｇ）のヒオドシエビから２Ｍ ＬｉＣｌを用いて得られた全ＲＮＡの沈澱を回収し、約０.９mgの全ＲＮＡを得た。続いて、ポリ(Ａ)+ＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)−セルロース スパンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製し、Kakizuka, A., Yu, R., Evans, R.M. & Umesono, K., in Essential Developmental Biology (Stern, C.D. ed.), IRL Press, Oxford, U.K., pp223-232 (1993年) に記載の方法に従い、２μｇのポリ(Ａ)+ＲＮＡをｄＴ12-18をプライマーとして、ｃＤＮＡ合成キット（タイムセーバーｃＤＮＡ合成キット；ファルマシア−バイオテック社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ（２０ng）にＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩの制限酵素部位を有するリンカーを付加し、予め１μgの牛小腸由来アルカリフォスファターゼ処理をしたλＺａｐＩＩベクター（ストラタジーン社製）に全量５μlを添加し、４℃、１６時間処理してこれらを連結させた。次いで、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＧｏｌｄIII（ストラタジーン社製）のパッケージング・キットを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その力価は、１.１×１０6プラーク形成／ユニットであった。
【００５９】
実施例４ 合成オリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲプライマーの調製
スクリーニング用およびＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは、市販業者へ化学合成による合成を依託して入手した。
遺伝子ライブラリーから分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質に対応するｃＤＮＡを分離するためのオリゴヌクレオチドプローブは、実施例２により得られた上記のアミノ酸配列の情報をもとにそれぞれ作製した。
【００６０】
１９ｋＤａ蛋白質については、Ala-Gly-Tyr-Asn-Gln-Asp-Gln（SEQ ID NO：１１）のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブＳＯＬ−２（5′GCN-GGN-TA(T/C)-AA(T/C)-CA(A/G)-GA(T/C)-CA 3′）（SEQ ID NO：１３）を、そして３５ｋＤａ蛋白質については、Gly-Asp-Val-Met-Asp-Met-Asp（SEQ ID NO：１２）のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブＯＬ−３（5′GTN-GT(T/C)-GTN-ATG-GA(T/C)-ATG-TC 3′）（SEQ ID NO：１４）を合成した。
【００６１】
実施例５ ルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
実施例３で得られたｃＤＮＡライブラリーについて、実施例４で合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Wallace, R.B., et.al., Nucl. Acids Res., 9, 879-897（1981年）に記載のプラークハイブリダイゼーション法によって、１９ｋＤａ蛋白質についてはプローブＳＯＬ−２を、３５ｋＤａ蛋白質についてはプローブＯＬ−３を用いてスクリーニングを実施した。ＳＯＬ−２およびＯＬ−３は、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′末端ラベルして標識プローブとして用いた。ｃＤＮＡライブラリーから直径１５cmのＬＢ−培地プレート（１.２％ アガロース，水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，pH７.２）に、３５,０００個のファージプラークが生成するように蒔き、３７℃で８時間培養後、それぞれ２枚のフィルターをとり、アルカリＤＮＡ変性、中和、風乾後、紫外線照射しＤＮＡを固定した。そして、フィルターを２０mlのハイブリダイゼーション液（９００mM ＮａＣｌ，９０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８.０），６mM ＥＤＴＡ，０.２％牛血清アルブミン、０.２％ポリビニルピロリドン、０.２％フィコール、１％ＳＤＳ、５０μg／ml熱変性サケ精子ＤＮＡ）に入れ、５０℃で１時間保温した。更に新しいハイブリダイゼーション液と入れ替えて１時間保温後、32Ｐ−標識プローブを加えて５０℃で一昼夜ハイブリダイゼーションした。溶液を捨て、室温でフィルターをＳＳＣ緩衝液（３００mM ＮａＣｌ，３０mM クエン酸ナトリウム）で３回洗浄後、オートラジオグラフィーにかけた。強いシグナルを示すファージ部分をかき出し、２次スクリーニングを同様に行い、単一のポジティブクローンを分離した。クローン化ファージからのプラスミドベクターへの変換は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐｈａｇｅｍｉｄ系（ストラタジーン社製）を用いて行った。結果として、ＳＯＬ−２にポジティブなクローンを、遺伝子ライブラリー３００,０００個から１個取得し、一方、ＯＬ−３にポジティブなクローンを７０,０００個から９個得た。
【００６２】
実施例６ 組換えベクターの調製
実施例５で得られたクローンを用い、それぞれの組換えベクタープラスミドを、常法により大腸菌からアルカリ法で調製した。分子量１９ｋＤａ蛋白質に由来し、ＳＯＬ−２にポジティブな１個のクローンから得られた組換えプラスミドをｐＫＡＺ−４１２と命名した。他方、分子量３５ｋＤａ蛋白質に由来し、ＯＬ−３にポジティブな９個のクローンから得られた組換えプラスミドについて制限地図切断試験を行った結果、９個とも同一制限酵素地図を示したため、最長なクローンを選択し、これをｐＯＬ−２３と命名した。
【００６３】
実施例７ 遺伝子配列の決定およびルシフェラーゼ遺伝子の同定
塩基配列の決定は、ダイターミネーターサイクルシークエンシング法を用いて、アプライドバイオシステム社の蛍光シークエンサー（ＡＢＩ ３７３および３７７型）により決定し、SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３に示すように遺伝子の塩基配列を明らかにした。
【００６４】
その結果、シグナルペプチド配列を含む１９ｋＤａ蛋白はSEQ ID NO：２に示す１９６アミノ酸から構成され、これはSEQ ID NO：１に示す塩基配列のうち４６〜６３３に相当することが分かった。しかし、１９ｋＤａ蛋白質は、実施例２にて決定されたアミノ末端のアミノ酸配列から、分泌のために必要なシグナルペプチド配列を除いたSEQ ID NO：２の２８〜１９６番アミノ酸により示される１６９アミノ酸よりなる分子量１８,６８９.５０ダルトン（約１９ｋＤａ）のポリペプチドであって、等電点が４.７０と推定される。
【００６５】
同様に、シグナルペプチド配列を含む３５ｋＤａ蛋白は、SEQ ID NO：４に示す３５９アミノ酸から構成され、これはSEQ ID NO：３に示す塩基配列のうち７９〜１１５５に相当することが分かった。そして、３５ｋＤａ蛋白質は、実施例２にて決定されたアミノ末端のアミノ酸配列から、分泌のために必要なシグナルペプチド配列を除いたSEQ ID NO：４の４０〜３５９番アミノ酸に示される３２０アミノ酸よりなる分子量３４,８３７.０８ダルトン（約３５ｋＤａ）のポリペプチドであって、等電点が４.６１と推定される。
【００６６】
一方、実施例２にて決定されたペプチド断片のアミノ配列は全て、塩基配列の情報から得られるSEQ ID NO：２または SEQ ID NO：４のアミノ酸配列と完全に一致した。このことより、クローン化されたｐＫＡＺ−４１２およびｐＯＬ−２３は、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａと３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
【００６７】
実施例８ ヒオドシエビルシフェラーゼ由来の SEQ ID NO ：１−４に示される配列のデーターベース検索
SEQ ID NO：１−４に示される配列（アミノ酸配列、ヌクレオチド配列）について、相同性等を遺伝子データベース（National Center for Biotechnology informationに登録されている全てのデーターベース）を用いて検索した。解析ソフトはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を用いた。SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３の塩基配列については、すべてのエントリー遺伝子に対して、SEQ ID NO：２およびSEQ ID NO：４のアミノ酸配列については、エントリーアミノ酸配列およびエントリー遺伝子より翻訳されるアミノ酸配列に対して行った。その結果、SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３の塩基配列と著しい相同性のある遺伝子配列は検出されなかった。また、SEQ ID NO：２およびSEQ ID NO：４のアミノ酸配列についても、顕著な相同性を有する配列は検出されなかった。特に、セレンテラジンを含むイミダゾピラノジン化合物関連蛋白質であるレニラルシフェラーゼ（３６ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ６３５０１）、イクオリン（２１.５ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ，Ｌ２９５７１）、レニラルシフェリン結合蛋白質（２０.５ｋＤａ；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯ，Ｐ０５９３８）、ウミホタルルシフェラーゼ（５８.５ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ２５６６６）、ホタルルシフェラーゼ、発光細菌ルシフェラーゼとは、全く相同性は検出できなかった。
【００６８】
しかし、SEQ ID NO：２に示される１９ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列は、大腸菌のアミンオキシダーゼ（登録番号ｐｉｒ １４０９２４）のドメインＤ３−Ｓ１領域（アミノ酸配列２１７−３９２番）と弱い相同性（２６％（同一のアミノ酸：４４／１６９），４９％（類似のアミノ酸：８３／１６９））があり、また脂肪酸結合蛋白（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｌ２３３２２）のアミノ末端領域（アミノ酸配列１〜４７番）とも弱い相同性（２８％（同一のアミノ酸：１３／４７），５１％（類似のアミノ酸：２４／４７））があるが、機能的な相同性は検出できなかった。
【００６９】
また、図２に示すように、SEQ ID NO：４に示される３５ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列は、下記の繰り返し単位：
(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Asn-Xaa-(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Xaa-Pro（Xaa：任意のアミノ酸）
に示される、ロイシンに富むリピート構造を有することが明らかとなった。
【００７０】
実施例９ ルシフェラーゼに対する抗体の作製およびウエスタンブロット法によるルシフェラーゼ蛋白質の検出法
実施例１により得られた高度に精製したヒオドシエビルシフェラーゼ（８０μg）を抗原として、常法によりニュージーランドホワイトウサギに免疫を行い、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質に対する抗体の作製を試みた。Inouye, S.およびTsuji, F.I., Anal. Biochem., 201: 114-118 (1992年)に従って、抗体血清を５００倍希釈で使用したウエスタンブロット法にで分析した結果、作製された抗体は１９ｋＤａおよび３５ｋＤａを特異的に認識した（図３）。これにより、得られた本抗体を用いれば、ヒオドシエビルシフェラーゼ、および類似する配列を有し且つ類似な高次構造を有する他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出または検索が可能となる。
【００７１】
実施例１０ ルシフェラーゼ構成蛋白質発現ベクターの構築
実施例６で得られた組換えベクターｐＫＡＺ−４１２およびｐＯＬ−２３を発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを用いて大腸菌内および培養細胞内で該蛋白質を発現させた。用いた発現ベクターの制限酵素地図を、図４および図５に示す。
（１）大腸菌内での発現ベクターは、１９ｋＤａまたは３５ｋＤａ蛋白質をコードする、即ちSEQ ID NO：２の２８〜１９６番のアミノ酸配列またはSEQ ID NO：４の４０〜３５９番のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて調製し、該ＤＮＡ断片を、市販ヒスチジンタグを有するｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂベクター（インビトロゲン社製）の制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入することによって作製することができる。具体的には、
▲１▼ １９ｋＤａ蛋白質発現ベクター場合
ｐＫＡＺ−４１２を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
ＫＡＺ−３（5′CCGGCTAGC-TTT-ACG-TTG-GCA-GAT-TTC-GTT-GGA 3′；ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１５）、および
Ｔ７−ＢｃａＢＥＳＴ（5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′）(SEQ ID NO：１６)
を用いて、ＰＣＲキット（日本ジーン社製）にてＰＣＲ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ消化した後，ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂの制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結することによって、発現ベクターｐＨｉｓ−ＫＡＺを構築した。
【００７２】
▲２▼ ３５ｋＤａ蛋白質発現ベクターの場合
ｐＯＬ−２３を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
ＯＬ−７（5′CCGTCTAGA-GCT-GTT-GCC-TGT-CCT-GCA-GCC 3′；ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１７）および
ＯＬ−８（5′GCCGTCGAC-TTA-TTG-GCA-CAT-TGC-ATG-GAA 3′；ＳａｌＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１８）
を用いて、ＰＣＲキット（日本ジーン社製）にて（ＰＣＲ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素制限酵素ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化した後、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂの制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結することによって、発現ベクターｐＨｉｓ−ＯＬを構築した。
【００７３】
（２）動物培養細胞での発現ベクターは、１９ｋＤａまたは３５ｋＤａ蛋白質をコードする、即ちSEQ ID NO：２の２８〜１９６番のアミノ酸配列またはSEQ ID NO：４の４０〜３５９番のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて調製し、該ＤＮＡ断片をＮｈｅＩ／ＸｂａＩ消化した後、市販レニラルシフェラーゼ発現ベクターｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社製）のＮｈｅＩ／ＸｂａＩレニラルシフェラーゼ遺伝子部分と置き換えることによって作製することができる。
▲１▼ 分泌シグナル配列を有する１９ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＳＫＡＺ−ＣＭＶおよび分泌シグナル配列を欠失した１９ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＫＡＺ−ＣＭＶを、下記のプライマー：
ＫＡＺ−１：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCG-TAC-TCC-ACT-CTG-TTC-ATA 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：１９）
ＫＡＺ−２：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-TTT-ACG-TTG-GCA-GAT-TTC-GTT-GGA 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２０）
ＫＡＺ−５：5′CCGCTCTA-GAA-TTA-GGC-AAG-AAT-GTT-CTC-GCA-AAG-CCT 3′（ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２１）
を使用して（１）と同様にＰＣＲ法によって構築した。ここで、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶの構築にはプライマーＫＡＺ−１とＫＡＺ−５を、またｐＫＡＺ−ＣＭＶの構築にはプライマーＫＡＺ−２とＫＡＺ−５を使用した。
【００７４】
▲２▼ 分泌シグナル配列を有する３５ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＳＯＬ−ＣＭＶおよび分泌シグナル配列を欠失した３５ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＯＬ−ＣＭＶを、下記プライマー：
ＯＬ−４：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCT-GTC-AAC-TTC-AAG-TTT 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２２）
ＯＬ−５：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCT-GTT-GCC-TGT-CCT-GCA-GCC 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２３）
ＯＬ−６：5′CCGCTCTAGAA-TTA-TTG-GCA-CAT-TGC-ATG-GAA 3′（ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ ID NO：２４）
を使用して、上記▲１▼と同様にＰＣＲ法によって構築した。ここで、ｐＳＯＬ−ＣＭＶの構築にはプライマーＯＬ−４とＯＬ−６を、またｐＯＬ−ＣＭＶの構築にはプライマーＯＬ−４とＯＬ−５を使用した。
【００７５】
実施例１１ ルシフェラーゼ構成蛋白質の無細胞系での発現
実施例１０で構築した発現ベクターｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＯＬ−ＣＭＶおよびｐＳＯＬ−ＣＭＶ、並びに陽性コントロールとしてレニラルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＣＭＶを用いて、無細胞系でヒオドシエビルシフェラーゼ構成蛋白質遺伝子を発現させた。無細胞系の遺伝子発現は、組換えプラスミドまたは該プラスミドより調製したｍＲＮＡから蛋白質を製造する方法であり、特に検出感度の高い発光系においては有用である。本実施例においては、市販のインビトロトランスレーションキット（ＴＮＴ−インビトロトランスクリプション−トランスレーションキット、プロメガ社製）を使用した。また、発現蛋白質の分泌シグナルペプチドの存在を確認するため、分泌シグナルペプチド切断活性を持つマイクロゾーム膜画分を添加した。反応は、０.５μgのプラスミドＤＮＡ、２０μlのウサギ網状赤血球、１μlの１mM−メチオニン、２.５μlのマイクロゾーム膜画分を加えて、全量を２５μlとし３０℃で９０分保温した後、反応溶液の１μＬの発光活性を測定した。
【００７６】
発光測定のための反応溶液は、全量が１００μlでＥＤＴＡを１０mMの濃度で含む５０mM濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７.６）溶液に基質セレンテラジン１μgを加え、酵素を添加することにより発光反応を開始し、発光をルミフォトメーターで検出した。結果を表２に示す。なお、発光相対値１(ｒｌｕ)＝１.２５×１０７フォトン／秒である。
【００７７】
【表２】
ｐＫＡＺ−ＣＭＶには顕著な活性が見い出され、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶにマイクロゾーム膜画分添加することにより、その効率は低いものの活性が約２０倍上がることから、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ発現の１９ｋＤａ蛋白質のアミノ末端には、分泌シグナルペプチド様配列の存在が確認された。分泌シグナルペプチド様配列の問題は、他の効率的に切断される公知の分泌シグナルペプチドを付加またはこれと置換することにより解決することができる。また、実施例５で作製したルシフェラーゼ抗体を用いて、インビトロトランスレーション産生蛋白質をウエスタンブロット分析により解析した結果、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質の発現が確認された。
【００７９】
実施例１２ ルシフェラーゼを構成する蛋白質の大腸菌での発現
実施例１０で構築した発現ベクターｐＨｉｓ−ＫＡＺとｐＨｉｓ−ＯＬ、およびコントロールプラスミドとしてｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂを用いて、常法に従って大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。得られた形質転換株の一晩培養液０.１mlをアンピシリン（５０μg／ml）含有ＬＢ液体培地（１０ml）に植菌し、３７℃で２時間振盪培養後、最終濃度が１mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に３時間培養した。その菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供して、発現蛋白質を確認した。その結果、分子量２０ｋＤａおよび３６ｋＤａに相当する発現蛋白質のバンドを確認した。これらの発現蛋白質には、ニッケルキレートカラムで精製可能な６個のヒスチジン配列を含む１４アミノ酸配列を付加しているため、分子量サイズが大きくなっていると考えられる。また、これらのバンドは、ヒスチジン配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（キアゲン社製）および実施例９で作製したポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析では、両方の抗体により認識されることため、発現蛋白質はアミノ末端にヒスチジン配列を有するヒオドシエビルシフェラーゼの構成蛋白質（分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質）であることが確認された。
【００８０】
上記ＩＰＴＧで発現誘導処理した培養液１mlを１０,０００rpmで遠心分離し、集めた菌体を１mlの緩衝液（３０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，pH７.６）に懸濁し超音波破砕した。１０,０００rpm、４℃で遠心分離し、上清を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液に対して、セレンテラジンまたはビスデオキシセレンテラジンを基質として１μg添加して、発光活性をルミフォトメーターで測定した。その結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】
この表から各々の活性を比較すると、ｐＨｉｓ−ＫＡＺを保持する菌株の活性は、負の対照であるｐＴｒｃＨｉｓ−ＢおよびｐＨｉｓ−ＯＬの約一万倍である。従って、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質のうち、分子量１９ｋＤａ蛋白質が発光活性を有することが明らかとなり、発光反応を１９ｋＤａ単独でも行うことができること、ビスデオキシセレンテラジンを基質として利用できることが明らかとなった。このため、３５ｋＤａの蛋白質は、基質特異性に直接関与せず、発光活性を有する１９ｋＤａ蛋白質に熱耐性を付与するなど、ルシフェラーゼ（酵素）の安定性を付与する機能を有していることが示唆される。
【００８３】
実施例１３ ルシフェラーゼを構成する蛋白質の動物培養細胞での発現
実施例１０で構築した、動物培養細胞での発現ベクターである、プラスミドｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＯＬ−ＣＭＶおよびｐＳＯＬ−ＣＭＶ、並びに正のコントロールとしてレニラルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＣＭＶを、培養細胞ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションすることにより、ヒオドシエビルシフェラーゼ構成蛋白質遺伝子の発現を試みた。ＣＯＳ７細胞（２×１０5個）は、１０％（v／v）の熱不活性化胎牛血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ペニシリン（１００単位／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）を含むダルベッコ変型イーグル培地３mlを含有する３５mmシャーレ中で培養した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ社製）を用いて２μgのプラスミドＤＮＡで形質転換した。更に３６時間培養した後、細胞と培地を分離した。得られた細胞を０.５mlのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、−８０℃での凍結と３７℃での融解を繰り返して抽出液を得た。セレンテラジンおよびビスデオキシセレンテラジンを基質として１μg添加して、発光活性をルミフォトメーターで測定した。その結果を表４に示す。
【００８４】
【表４】
活性を比較した結果、ｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶおよび正のコントロールｐＲＬ−ＣＭＶのみに顕著な発光活性が見い出された。ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶの培養液への分泌効率が低いことは、実施例１１の結果と一致する。一方、ｐＫＡＺ−ＣＭＶの発光強度が現在レポータープラスミドとして市販されているｐＲＬ−ＣＭＶと同等であることから、ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼの１９ｋＤａ蛋白質遺伝子は、動物培養細胞系でのレポーター遺伝子として充分使用することが可能であることが示された。
【００８６】
実施例１４ 大腸菌の封入体からの発現蛋白質の単離およびその再生
実施例１１にて構築した組換え発現プラスミドｐＨｉｓ−ＫＡＺで形質転換し、実施例１２で培養した菌体を２０mlの２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７.５、に懸濁し、超音波破砕装置（ブランソン社製：モデル２５０型）で細胞を破壊後、冷却高速遠心機（１２,０００×ｇ，２０分）により封入体を包含する沈殿不溶性画分と可溶画分とに分離した。
【００８７】
（１）尿素による発現蛋白質の可溶化
不溶性画分を先ず２０mlの２Ｍ尿素（和光純薬社製）を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に超音波処理により十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して不溶性画分を回収し、この操作を２回繰り返す。２Ｍの濃度では目的の１９ｋＤａ蛋白質は殆ど（５％以下）可溶化しないが、他の蛋白質不純物はかなり除去された。回収した不溶性画分に２０mlの８Ｍ尿素を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して、可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９５％以上であった。この回収画分をニッケルキレートカラムクロマトグラフィーに供した。
【００８８】
（２）グアニジン塩酸塩による発現蛋白質の可溶化
不溶性画分を２０mlの０.５Ｍグアニジン塩酸塩（和光純薬社製）を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に超音波処理により十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して不溶性画分を回収し、この操作を２回繰り返した。回収した不溶性画分に２０mlの６Ｍグアニジン塩酸塩を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して、上清の可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結果、電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９０％以上であった。この回収画分を８モル尿素にて１０倍に希釈してニッケルキレートカラムクロマトに供した。
【００８９】
（３）グアニジン塩酸塩および尿素による発現蛋白質の可溶化
上記（２）と同様に不溶性画分を０.５Ｍ グアニジン塩酸塩で２回処理した。得られた不溶性画分を２０mlの８Ｍ尿素を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）して、上清の可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結果、電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９０％以上であった。この回収画分をニッケルキレートカラムクロマトに供した。
【００９０】
（４）ニッケルキレートゲルクロマトグラフィーによる精製
ニッケルキレートゲルはキレートゲルファーストフロー（ファルマシア社）と０.０１Ｍの塩化ニッケル水溶液を混合することにより調整し、カラム（カラムサイズ：１cm（直径）×６cm）に充填した。カラムゲルは濃度８Ｍの尿素を含む、濃度２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７.５）緩衝液（以下に緩衝液Ａと記載する）で平衡化したカラムに（１）〜（３）にて調製した可溶性画分を供した。緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、０.３Ｍのイミダゾール（和光純薬社）で吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分（約１０ml）を１Ｌの緩衝液Ａ中において４℃で１８時間透析を行い、イミダゾールを除去した。透析試料を再度を緩衝液Ａで平衡化した上記カラムに供し、緩衝液Ａ３０mlで洗浄後、イミダゾールの０〜０.３Ｍの直線的濃度勾配（全溶出量，１００ml）によりヒスチジンを有する１９ｋＤａ蛋白質を溶出した。精製された蛋白質の純度は９５％であった。バイオラッド社製の色素結合法による蛋白質定量の結果、４００mlの培養菌体から６.８mg蛋白質を得た。
【００９１】
（５）精製１９ｋＤａ蛋白質の再生・再活性化
上記（４）にて精製した１９ｋＤａ蛋白質は全く発光活性を示さない。そこで、多価アルコール溶媒としてグリセリン（和光純薬）を用い、精製した蛋白質をグリセリン最終濃度（v／w）０％〜９０％の溶液中に２５℃で、３０分間放置し、上述のように発光活性を測定した。（１）の尿素よる可溶化試料についての結果を表５に示す。
【００９２】
【表５】
その結果、尿素を含まない緩衝液で処理することによりわずかに再活性化されるが、グリセリンを添加することにより再活性化が顕著に増加することが示された。特にグリセリン濃度が５０〜７０％の場合、グリセリンを添加しないものと比較して約５０倍の再活性化が観察された。その再生の効率は、天然のルシフェラーゼ活性を基準に算出した結果、約６０〜８０％であった。また、（２）および（３）にて可溶化した場合でも同様な結果が得られた。
【００９４】
さらに再生処理した当該蛋白質をグリセリン０％または５０％中にて、４℃で３０日間保存し、その発光活性を測定した。その結果、グリセリン０％では保存前と比較して発光活性が約１／５に低下したが、グリセリン５０％では、−２０℃で保存した場合（データは示さない）と同様に、ほとんど活性の低下が認められなかった。このことは、再生した活性化１９ｋＤａ蛋白質は、グリセリン（５０〜７０％）中で安定に保存することが可能でありことを示している。保存試験の結果を下記の表に示す。
【００９５】
【表６】
【発明の効果】
本発明によれば、深海に生息するヒオドシエビ由来のルシフェラーゼが分子量１９ｋＤａおよび分子量３５ｋＤａの蛋白質から構成されることが明らかとなり、さらに該蛋白質をコードする遺伝子が単離され、該遺伝子を用いて高純度の組換え分泌型ルシフェラーゼ蛋白質が提供される。また、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した細菌および動物培養細胞が得られ、これを用いた分泌型ルシフェラーゼ蛋白質の製造方法が提供される。これは、本発明のルシフェラーゼおよびその構成蛋白質を大量に調製することができることを意味する。本発明において調製されたルシフェラーゼおよびその構成蛋白質（特に分子量１９ｋＤａの蛋白質）は多くの測定・分析法に適用することができ、また診断薬や検査薬としても有用である。
さらに、本発明の蛋白質を抗原として作製される抗体、該蛋白質をコードするＤＮＡから得られるプライマーは、本発明のルシフェラーゼ、またはこれを構成する蛋白質、およびこれらと相同性がある他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出、検索およびそのクローニングに用いることができる。
【００９７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】精製ヒオドシエビ由来ルシフェラーゼのゲル濾過による分子量の決定を示す。
【図２】ヒオドシエビ由来の３５ｋＤａ蛋白質に存在するロイシンリピート配列を示す。
【図３】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼに対するポリクロナール抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す。
【図４】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａ蛋白質遺伝子の制限酵素地図と発現ベクターを模式的に示す図である。
【図５】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼを構成する３５ｋＤａ蛋白質遺伝子の制限酵素地図と発現ベクターを模式的に示す図である。
Claims (28)
- 十脚類（Decapoda）由来であって、分子量１９ｋＤａおよび分子量３５ｋＤａの蛋白質から構成されるルシフェラーゼ。
- 十脚類が、ヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris ）である請求項１に記載のルシフェラーゼ。
- 請求項１のルシフェラーゼを構成する、分子量１９ｋＤａの発光蛋白質。
- 前記発光蛋白質が、
（ａ）SEQ ID NO：２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３記載の発光蛋白質。 - さらに、精製のためのペプチド配列および／または細胞外分泌もしくは細胞内器官への移行のためのシグナルペプチド配列を有する、請求項３または４に記載の蛋白質。
- 請求項４に記載の発光蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- （ａ）SEQ ID NO：１示す塩基配列の４６〜６３３番の塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列
からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項６記載のポリヌクレオチド。 - 請求項１のルシフェラーゼを構成する、分子量３５ｋＤａの蛋白質。
- 前記蛋白質が、
（ａ）SEQ ID NO：４に示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する請求項８記載の蛋白質。 - さらに、精製のためのペプチド配列および／または細胞外分泌もしくは細胞内器官への移行のためのシグナルペプチド配列を有する、請求項８または９に記載の蛋白質。
- 請求項９に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- （ａ）SEQ ID NO：３に示す塩基配列の７９〜１１５５番の塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ請求項３〜５に記載の蛋白質と共にルシフェラーゼを構成することができる蛋白質をコードする塩基配列、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列
からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。 - 下記のアミノ酸配列の繰り返し単位をさらに有する、請求項９に記載の蛋白質。
（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ
（但し、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す。） - 請求項１または２に記載のルシフェラーゼ、請求項３〜５のいずれか１項に記載の発光蛋白質またはその断片を抗原として作製され、且つ前記抗原と特異的に結合する抗体。
- 請求項１４に記載の抗体を使用する、ルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出方法。
- プロモーターに作動的に連結された、請求項６または１１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つを挿入物として含有する組換え発現ベクター。
- 請求項１６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 動物培養細胞または微生物細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
- 請求項１６に記載の組換えベクターを用いてインビトロトランスクリプション−トランスレーションを実施して、発現した組換え蛋白質を単離することからなる、請求項３または８に記載の蛋白質の少なくとも１つを製造する方法。
- 請求項１７または１８に記載の宿主細胞を培養し、発現した組換え蛋白質を単離することからなる、請求項３または８に記載の蛋白質の少なくとも１つを製造する方法。
- さらに、溶媒として１つ以上の多価アルコールの存在下にて蛋白質を再生させてその酵素活性を再活性化させ、場合により前記溶媒中にて蛋白質を貯蔵することを包含する、請求項１９または２０に記載の方法。
- 多価アルコールが、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ショ糖、果糖およびブドウ糖からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
- 請求項１もしくは２に記載のルシフェラーゼ、または請求項３〜５のいずれか１項に記載の発光蛋白質をレポーターとして用いて検出可能なシグナルを発生させることを特徴とする、分析物の検出方法。
- 発光反応の基質としてセレンテラジンまたはその誘導体を用いることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
- 請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６に記載の組換え発現ベクターをレポーターまたはマーカーとして用いて検出可能なシグナルを発生させることを特徴とする、試験試料中の分析物を検出するためのバイオアッセイ法。
- 発光反応の基質としてセレンテラジンまたはその誘導体を用いることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
- アッセイすべき試料が、生細胞、生組織もしくは器官、またはその部分である、請求項２５または２６に記載の方法。
- 請求項１もしくは２に記載のルシフェラーゼ、請求項３〜５のいずれか１項に記載の発光蛋白質、請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６に記載の組換え発現ベクターを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
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