BRPI1010019B1 - polipeptídeo de luciferase modificada, vetor e kit compreendendo os mesmos - Google Patents

polipeptídeo de luciferase modificada, vetor e kit compreendendo os mesmos Download PDF

Info

Publication number
BRPI1010019B1
BRPI1010019B1 BRPI1010019A BRPI1010019A BRPI1010019B1 BR PI1010019 B1 BRPI1010019 B1 BR PI1010019B1 BR PI1010019 A BRPI1010019 A BR PI1010019A BR PI1010019 A BRPI1010019 A BR PI1010019A BR PI1010019 B1 BRPI1010019 B1 BR PI1010019B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
luciferase
ogluc
seq
polypeptide
amino acid
Prior art date
Application number
BRPI1010019A
Other languages
English (en)
Inventor
Vidugiris Gediminas
V Wood Keith
P Encell Lance
Hall Mary
G Wood Monika
Otto Paul
Zimmerman Kristopher
Original Assignee
Promega Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Promega Corp filed Critical Promega Corp
Publication of BRPI1010019A2 publication Critical patent/BRPI1010019A2/pt
Publication of BRPI1010019B1 publication Critical patent/BRPI1010019B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

“POLIPEPTÍDEO DE LUCIFERASE MODIFICADA, VETOR E KIT COMPREENDENDO OS MESMOS”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001]Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos No 61/174.838, depositado em 1 de maio de 2009, que é incorporado, neste documento, por referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES [002]A presente invenção refere-se às luciferases do Oplophorus sintéticas tendo propriedades melhoradas comparadas à luciferase do Oplophorus do tipo selvagem.
[003]O camarão de águas profundas Oplophorus gracilirostris emite uma névoa luminosa azul a partir da base de suas antenas, quando estimulado, como diversos outros camarões decápodes luminescentes, incluindo aqueles dos gêneros Heterocarpus, Systellaspis e Acanthephyra (Herring, J. Mar. Biol. Assoc. UK, 156:1029 (1976)). O mecanismo que é a base da luminescência do Oplophorus envolve a oxidação da luciferina do Oplophorus (coelenterazina) com o oxigênio molecular, que é catalisada pela luciferase do Oplophorus, como se segue:
luciferase de Oplophorus
Coelenterazina + O2 Coelenteramida + CO2 + hv (Àmáx = 454 nm) [004]A coelenterazina, um composto de imidazopirazinona, está envolvida na bioluminescência de uma ampla variedade de organismos como uma luciferina ou como a porção funcional de fotoproteínas. Por exemplo, a luciferina do rim do mar Renilla é a coelenterazina (Inoue e col., Tetrahed. Lett., 18:2685 (1977)), e a fotoproteína sensível ao cálcio equorina da medusa Aequorea também contém coelenterazina como sua porção funcional (Shimomura e col., Biochem., 17:994 (1978); Head e col., Nature, 405:372 (2000)).
RESUMO
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 13/81
2/64 [005]Em uma modalidade, a invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de luciferase modificada. O polipeptídeo de luciferase modificada tem pelo menos 60% de identidade da sequência de aminoácidos com uma luciferase de Oplophorus do tipo selvagem e inclui pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde a um aminoácido em uma luciferase de Oplophorus do tipo selvagem de SEQ ID No:1. O polipeptídeo de luciferase modificada tem pelo menos uma de luminescência melhorada, estabilidade do sinal melhorada, e estabilidade da proteína melhorada em relação à luciferase de Oplophorus do tipo selvagem.
[006]Em uma outra modalidade, a invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de luciferase modificada. O polipeptídeo de luciferase modificada tem luminescência melhorada em relação à luciferase de Oplophorus do tipo selvagem e uma substituição de pelo menos um aminoácido na posição 2, 4, 11, 20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167, ou 169 correspondendo à SEQ ID No:1.
[007]Os outros aspectos da invenção tornar-se-ão aparentes por consideração da descrição detalhada e dos desenhos que acompanham.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [008]A Figura 1 mostra os alinhamentos das estruturas secundárias de proteínas de ligação de ácidos graxos (FABPs) e OgLuc.
[009]A Figura 2 mostra os alinhamentos das estruturas secundárias de luciferase de dinoflagelado, FABP e OgLuc.
[0010]A Figura 3 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de OgLuc e diversas FABPs (SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, e 17-20, respectivamente) com base na sobreposição da estrutura 3D das FABPs.
[0011]As Figuras 4A-D mostram o curso de tempo de emissão de luz (i.e., luminescência) de variantes de OgLuc modificadas com uma combinação de duas ou
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 14/81
3/64 mais substituições de aminoácidos em OgLuc, em comparação com a variante de OgLuc N166R e a luciferase de Renila. 4A-4B) Luminescência (lum) em unidades relativas de luz (RLU) usando um ensaio de luminescência Flash mostrado sobre duas escalas diferentes de luminescência ao longo do tempo, em minutos. 4C-4D) Luminescência (lum) em RLU usando um ensaio de luminescência com 0,5% de tergitol Glo mostrado sobre duas escalas diferentes de luminescência ao longo do tempo, em minutos.
[0012]As Figuras 5A-C resumem a luminescência média em RLU das diversas variantes de OgLuc descritas no Exemplo 7 (Amostra), em T=0 (Média), com desvio padrão (Stdev) e coeficiente de variância (CV), em comparação com a OgLuc do WT, usando um tampão de ensaio de 0,5% de tergitol.
[0013]As Figuras 6A-B resumem o aumento na luminescência em T=0 das variantes de OgLuc sobre a OgLuc do WT, determinado a partir dos dados do tampão de ensaio de 0,5% de tergitol mostrados nas Figuras 5A-C.
[0014]As Figuras 7A-C resumem a luminescência média em RLU das variantes de OgLuc (Amostra), em T=0 (Média), com desvio padrão (Stdev) e coeficiente de variância (CV), em comparação com a OgLuc do WT, usando RLAB.
[0015]A Figura 8 resume o aumento na luminescência em T=0 das variantes de OgLuc sobre a OgLuc do WT, determinado a partir dos dados de RLAB mostrados nas Figuras 7A-C.
[0016]As Figuras 9A-D mostram a estabilidade do sinal das variantes de OgLuc comparadas à OgLuc do WT, usando um tampão de ensaio de 0,5% de tergitol. 9A-9C) Curso de tempo da emissão de luz das variantes de OgLuc (clone), a luminescência medida em RLU ao longo do tempo, em minutos. 9D) Meia vida do sinal, em minutos, das variantes de OgLuc, determinada a partir dos dados do curso de tempo da emissão de luz mostrados nas Figuras 9A-C.
[0017]As Figuras 10A-C mostram o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 15/81
4/64 estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc comparadas à OgLuc do WT, usando RLAB, com a luminescência medida em RLU, ao longo do tempo, em minutos.
[0018]As Figuras 11A-B mostram a meia vida do sinal, em minutos, das variantes de OgLuc comparadas à OgLuc do WT, determinada a partir dos dados do curso de tempo da emissão de luz mostrados nas Figuras 10A-C.
[0019]As Figuras 12A-B mostram a estabilidade da proteína a 22°C como a meia vida em minutos das variantes de OgLuc comparadas à OgLuc do WT.
[0020]As Figuras 13A-B resumem a luminescência média, em RLU, das variantes de OgLuc A33K e F68Y em T=0 (Média), com o coeficiente de variância (% de cv), comparadas à OgLuc do WT, usando o tampão de ensaio de 0,5% de tergitol (13A) ou o RLAB (13B).
[0021]As Figuras 14A-B resumem o aumento na luminescência em T=0 das variantes de OgLuc A33K e F68Y sobre a OgLuc do WT, determinado a partir dos dados mostrados nas Figuras 13A-B para os ensaios usando o tampão de ensaio de 0,5% de tergitol (14A) ou o RLAB (14B), respectivamente.
[0022]As Figuras 15A-B mostram a estabilidade do sinal das variantes de OgLuc A33K e F68Y comparadas à OgLuc do WT, usando um tampão de ensaio de 0,5% de tergitol. 15A) Curso de tempo da emissão de luz das variantes de OgLuc A33K e F68Y, com a luminescência medida em RLU ao longo do tempo, em minutos. 15B) Meia vida do sinal, em minutos, das variantes de OgLuc A33K e F68Y, determinada a partir dos dados do curso de tempo da emissão de luz mostrados na Figura 15A.
[0023]As Figuras 16A-B mostram a estabilidade do sinal das variantes de OgLuc A33K e F68Y comparadas à OgLuc do WT, usando RLAB. 16A) Curso de tempo da emissão de luz das variantes de OgLuc A33K e F68Y, com a luminescência medida em RLU ao longo do tempo, em minutos. 16B) Meia vida do sinal, em minutos, das variantes de OgLuc A33K e F68Y, determinada a partir dos dados do curso de
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 16/81
5/64 tempo da emissão de luz mostrados na Figura 16A.
[0024]A Figura 17 mostra a estabilidade da proteína a 22°C como a meia vida em minutos das variantes de OgLuc A33K e F68Y.
[0025]As Figuras 18A-B mostram o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc de Combinação de Núcleo comparadas à variante de OgLuc N166R e à luciferase de Renilla, usando tampão de ensaio de 0,5% de tergitol, com a luminescência medida em RLU, ao longo do tempo, em minutos.
[0026]A Figura 19 mostra o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc de Combinação de Núcleo comparadas à variante de OgLuc N166R e à luciferase de Renilla, usando RLAB, com a luminescência medida em RLU, ao longo do tempo, em minutos.
[0027]As Figuras 20A-B mostram o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc C1+C2+A4E e C1+A4E comparadas à OgLuc do WT (Og-Luc) e à luciferase de Renilla (hRL), e às variantes T2T e A54F, usando tampão de ensaio de 0,5% de tergitol (20A) ou RLAB (20B), com a luminescência medida em RLU, ao longo do tempo, em minutos.
[0028]A Figura 21 mostra o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc C1+C2+A4E e C1+A4E comparadas à OgLuc do WT (Og-Luc) e à luciferase de Renilla (hRL) e às variantes T2T e A54F, usando tampão de ensaio de 0,25% de tergitol, com a luminescência medida em RLU, ao longo do tempo, em minutos.
[0029]A Figura 22 mostra o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc C1+C2+A4E e C1+A4E comparadas à OgLuc do WT (Og-Luc) e à luciferase de Renilla (hRL) e às variantes T2T e A54F, nas células HEK 293, com o tampão RLAB, normalizado para o vagalume.
[0030]A Figura 23 mostra o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 17/81
6/64 estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc C1+C2+A4E e C1+A4E comparadas à OgLuc do WT (Og-Luc) e à luciferase de Renilla (hRL), nas células HEK 293, usando o tampão de 0,25% de tergitol, normalizado para o vagalume.
[0031]A Figura 24 mostra a estabilidade da proteína como a meia vida em minutos das variantes de OgLuc C1, C1+A4E, C1+C2+A4E, e C1+C3+A4E comparadas à OgLuc do WT, à luciferase de Renilla e à variante de N166R em diversas temperaturas, tais como 22, 37, 42, 50 e 54°C.
[0032]A Figura 25 mostra o curso de tempo da emissão de luz (i.e., a estabilidade do sinal) das variantes de OgLuc C1, C1+A4E, C1+C2+A4E, e C1+C3+A4E comparadas à OgLuc do WT (Og-Luc) e à luciferase de Renilla (hRL), usando RLAB, com a luminescência medida em RLU (lum) ao longo do tempo, em minutos, e a meia vida em minutos determinada a partir dos dados do curso de tempo.
[0033]A Figura 26 mostra o comprimento de ondas ótimo, em nm, com a maior luminescência, usando a coelenterazina como substrato para as variantes de N166R, C1+A4E e C1+C2+A4E comparadas à luciferase de Renilla, normalizado pelo maior valor de RLU no espectro.
[0034]As Figuras 27A-B resumem o aumento na luminescência em T=0 das variantes de C1+A4E aleatoriamente mutagenizadas (amostra ID) sobre a variante de C1+A4E de partida correspondente, com a troca de aminoácido indicada, usando o tampão de 0,5% de tergitol.
[0035]A Figura 28 resume o aumento na luminescência em T=0 das variantes de C1+A4E L92 sobre a variante de C1+A4E de partida correspondente, com a troca de aminoácido indicada, usando o tampão de 0,5% de tergitol.
[0036]A Figura 29 resume o aumento na luminescência em T=0 das variantes de combinação de C1+A4E (Amostra ID) sobre a variante de C1+A4E de partida correspondente, com as trocas de aminoácido indicadas, usando o tampão de 0,5% de tergitol.
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 18/81
7/64 [0037]A Figura 30 mostra o curso de tempo da emissão de luz do valor de logaritmo (ln) natural da luminescência, medida em RLU, ao longo do tempo, em minutos, e a meia vida, em minutos, da variante de C1+A4E+F541, comparada à
OgLuc C1+A4E de partida correspondente, a 50°C.
[0038]A Figura 31 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de SEQ ID No:10 (NATIVA), SEQ ID No:13 (WT Sintética), SEQ ID No:15 (N166R), SEQ ID No:25 (C1), SEQ ID No:27 (C1+C2), SEQ ID No:23 (C1+A4E), SEQ ID No:29 (C1+C2+A4E), e SEQ ID No:31 (C1+C3+A4E) com a sequência consenso.
[0039]A Figura 32 mostra o alinhamento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No:12 (NATIVA), SEQ ID No:2 (WT Sintética), SEQ ID No:14 (N166R), SEQ ID No:18 (C1), SEQ ID No:20 (C1+C2), SEQ ID No:16 (C1+A4E), SEQ ID No:22 (C1+C2+A4E), e SEQ ID No: 24 (C1+C3+A4E) com a sequência consenso.
[0040]A Figura 33A resume o aumento na luminescência em T=0 das variantes de OgLuc sobre N166R, determinado a partir dos dados com o tampão de ensaio de 0,5% de tergitol mostrados nas Figuras 5A-C e 14A, normalizado para a variante de N166R.
[0041]A Figura 33B resume o aumento na luminescência em T=0 das variantes de OgLuc sobre N166R, determinado a partir dos dados com RLAB mostrados nas Figuras 7A-C e 14B, normalizado para a variante de N166R.
[0042]A Figura 33C resume a meia vida do sinal, em minutos, das variantes de OgLuc, determinada a partir dos dados do curso de tempo da emissão de luz mostrados nas Figuras 9A-C e 15B (tampão de ensaio de 0,5% de tergitol) e 10A-C e 16B (RLAB), normalizada para a variante de N166R.
[0043]A Figura 33D resume a estabilidade da proteína a 22°C como a meia vida, em minutos, das variantes de OgLuc comparadas à OgLuc do WT, mostrada nas Figuras 12A-B e 17, normalizada para a variante de N166R.
[0044]A Figura 33E resume o aumento na luminescência, a meia vida do sinal
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 19/81
8/64 e a meia vida a 22°C mostrados nas Figuras 33A-D.
[0045]A Figura 34A mostra os resultados da luminescência dos lisados de E. coli contendo a variante IV (IV), a luciferase de Renilla (Renilla”) e C1+A4E (C1A4E) testados com 0,5% de tergitol.
[0046]A Figura 34B mostra a estabilidade da proteína a 50°C como a meia vida, em minutos, da variante VI (VI) e da luciferase de Renilla (Renilla”).
DESCRIÇÃO DETALHADA [0047]Antes que quaisquer modalidades da invenção sejam explicadas em detalhe, é para ser entendido que a invenção não está limitada neste pedido de patente aos detalhes de estrutura, síntese, e arranjo dos componentes apresentados na descrição a seguir ou ilustrados nos desenhos que se seguem. A invenção é descrita em relação a modalidades e técnicas específicas, entretanto, a invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou de ser realizada em diversos modos.
[0048]Na descrição dos métodos da invenção que se segue, as etapas de processo são realizadas à temperatura ambiente (cerca de 22°C) e à pressão atmosférica, salvo especificação em contrário. Também se entende especificamente que qualquer faixa numérica descrita neste documento inclua todos os valores a partir do menor valor até o maior valor. Por exemplo, se uma faixa de concentrações ou uma faixa de efeitos benéficos for estabelecida como 1% a 50%, entende-se que os valores tais como 2% a 40%, 10% a 30%, ou 1% a 3%, etc., sejam expressamente enumerados neste relatório descritivo. Similarmente, se uma faixa de identidades de sequências for dada como entre, p.ex., 60% a <100%, pretende-se que 65%, 75%, 90%, etc. sejam expressamente enumerados neste relatório descritivo. Estes são somente exemplos do que é especificamente pretendido, e todos os valores numéricos possíveis a partir do valor mais baixo até o valor mais alto são considerados expressamente estabelecidos neste pedido.
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 20/81
9/64 [0049]Nas modalidades da invenção, foram usadas diversas técnicas, como descritas neste documento, para identificar os sítios para a substituição de aminoácido, para produzir um polipeptídeo de luciferase de Oplophorus sintético aperfeiçoado. Foram usadas técnicas adicionais para otimizar a codificação dos códons dos polinucleotídeos para os diversos polipeptídeos, para aumentar a expressão dos polipeptídeos. Verificou-se que ao se fazer uma ou mais substituições de aminoácidos, sozinhas ou em diversas combinações, produziram-se luciferases do tipo Oplophorus sintéticas tendo pelo menos uma de luminescência melhorada, estabilidade do sinal melhorada, e estabilidade da proteína melhorada. Além disso, a inclusão de uma ou mais substituições de otimização dos códons nos polinucleotídeos que codificam para os diversos polipeptídeos produziu-se uma expressão melhorada dos polipeptídeos em diversos sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.
[0050]A luminescência refere-se à emissão de luz do polipeptídeo de luciferase sob condições apropriadas, p.ex., na presença de um substrato adequado, tal como uma coelenterazina. A emissão de luz pode ser medida como uma medição instantânea ou quase instantânea de emissão de luz (que é, algumas vezes, referida como luminescência em T=0 ou flash) com o início da reação de luminescência, que pode iniciar com a adição do substrato de coelenterazina. A reação de luminescência em diversas modalidades é realizada em uma solução contendo lisado, por exemplo, a partir das células em um sistema de expressão procariótico ou eucariótico; em outras modalidades, a expressão ocorre em um sistema in vitro ou a proteína luciferase é secretada para um meio extracelular, de modo tal que, neste último caso, não é necessário produzir um lisado. Em algumas modalidades, a reação é iniciada por injeção de materiais apropriados, p.ex., a coelenterazina, em uma câmara de reação (p.ex., um poço de uma placa de múltiplos poços, tal como uma placa de 96 poços) contendo a proteína luciferase. A câmara de reação pode estar situada em um dispositivo de leitura, o qual pode medir a emissão de luz, p.ex., usando
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 21/81
10/64 um luminômetro ou fotomultiplicador. A emissão de luz ou a luminescência pode também ser medida ao longo do tempo, por exemplo, na mesma câmara de reação, por um período de segundos, minutos, horas, etc. A emissão de luz ou a luminescência pode ser descrita como a média ao longo do tempo, a meia vida de declínio do sinal, a soma do sinal sobre um período de tempo, ou como a emissão de pico.
[0051]A luminescência melhorada inclui a emissão de luz ou a luminescência melhorada, determinada por comparação adequada de medições comparavelmente obtidas. Conforme divulgado neste documento, uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência da luciferase de Oplophorus sintética produzem polipeptídeos de luciferase modificada que exibem luminescência melhorada. As mudanças na sequência de nucleotídeos a partir da sequência de nucleotídeos de Oplophorus do tipo selvagem podem contribuir para a luminescência melhorada levando a uma substituição de aminoácido e/ou aumentando a expressão da proteína.
[0052]A estabilidade do sinal melhorada inclui um aumento em por quanto tempo o sinal de uma luciferase continua a emitir luz, por exemplo, como medida pela meia vida de declínio do sinal em um curso de tempo.
[0053]A estabilidade da proteína melhorada inclui a estabilidade térmica (p.ex., a estabilidade em temperaturas elevadas) e a estabilidade química (p.ex., a estabilidade na presença de desnaturantes, tais como os detergentes, incluindo, p.ex., o Triton X-100) melhoradas.
[0054]O termo OgLuc refere-se à subunidade de 19 kDa madura do complexo da proteína luciferase de Oplophorus, i.e., sem uma sequência sinal; a forma nativa da sequência de polipeptídeos de OgLuc madura é dada em SEQ ID No:1. O termo variante de OgLuc refere-se a uma OgLuc sintética com uma ou mais substituições de aminoácidos. Por exemplo, a variante de OgLuc N166R e OgLuc+N166R refere-se a uma OgLuc sintética que tem uma substituição de
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 22/81
11/64 aminoácido de N a R na posição 166 em relação à SEQ ID No:1. Os termos WT, OgLuc do WT e OgLuc do tipo selvagem referem-se à proteína de OgLuc madura codificada por um polinucleotídeo sintético com ACC na posição 2 em relação à SEQ ID No:1. O termo T2T refere-se a uma proteína de OgLuc madura, sintética, codificada por um polinucleotídeo sintético com ACA na posição 2 em relação à SEQ ID No:1. Para os dados apresentados abaixo nos Exemplos, a proteína do tipo selvagem que foi sintetiza é a proteína do tipo selvagem sintética de SEQ ID No:13, que é codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID No:2.
[0055]A numeração do aminoácido, usada por todo este pedido para identificar os resíduos substituídos, é especificada em relação às posições na sequência de polipeptídeos de OgLuc do tipo selvagem madura de SEQ ID No:1. A sequência de OgLuc do tipo selvagem de ocorrência natural pode ser inicialmente sintetizada com outros aminoácidos, os quais são posteriormente clivados, resultando na geração de um polipeptídeo do tipo selvagem maduro, tal como mostrado na SEQ ID No:1. Por exemplo, uma sequência sinal (p.ex., para dirigir a proteína nascente para uma organela particular, tal como o retículo endoplásmico, e/ou para dirigir a proteína para a secreção) pode estar presente no início da proteína nascente e pode então ser clivada para produzir a proteína do tipo selvagem madura.
[0056]A especificidade da luciferase de Oplophorus pelo substrato é inesperadamente ampla (Inouye and Shimomura. BBRC 223:349(1997). Por exemplo, a bisdesoxicoelenterazina, um análogo da coelenterazina, é um substrato excelente para a luciferase de Oplophorus, comparável à coelenterazina (Nakamura e col., Tetrahed. Lett., 38:6405 (1997)). Além disso, a luciferase de Oplophorus é uma enzima secretada, como a luciferase do ostracode marinho Cypridina (Vargula) hilgendorfii (Johnson e Shimomura, Meth. Enzyme, 57:331 (1978)), que também usa uma luciferina do tipo imidazopirazinona para emitir luz.
[0057]O peso molecular da luciferase de Oplophorus foi descrito ser 130 kDa
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 23/81
12/64 (por filtração em gel) para o complexo da proteína nativa, e 31 kDa após tratamento com SDS (Shimomura e col., Biochem., 17:1994 (1978)). A luciferase também mostrou um peso molecular de aproximadamente 106 kDa na filtração em gel, e verificou-se que a molécula separa-se em proteínas de 35 kDa e 19 kDa com a análise por dodecil sulfato de sódio-eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Inouye e col., FEBS Lett., 481:19 (2000)). Inouye e col. (2000) descreveram a clonagem molecular dos cDNAs que codificam as proteínas de 35 kDa e 19 kDa, e a identificação do componente de proteína que catalisa a reação de luminescência. Os cDNAs que codificam as proteínas foram expressos em células bacterianas e mamíferas como uma proteína de 19 kDa que era capaz de catalisar a oxidação luminescente da coelenterazina (Inouye e col., 200). A sequência primária da proteína de 35 kDa revelou uma sequência de repetição rica em leucina, enquanto a proteína de 19 kDa catalítica não compartilhou nenhuma homologia com quaisquer luciferases conhecidas, incluindo as diversas luciferases de imidazopirazinona (Inouye e col., 2000).
[0058]A proteína de 19 kDa (OgLuc) da luciferase de Oplophorus aparece para o menor componente catalítico tendo função de luciferase e a sua estrutura primária não tem nenhuma homologia significativa com qualquer luciferase descrita, incluindo as luciferases de imidazopirazinona (Lorenz e col., PNAS USA, 88:4438 (1991); Thompson e col., PNAS USA, 86:6567 (1989)). Inouye e col. (2000) descreveram que a sequência de aminoácidos global da proteína de 19 kDa parece similar àquela de uma amina oxidase de E. coli (757 resíduos de aminoácidos; pir 140924) na região dos resíduos 217-392 (domínio de D3-S1) (Parson e col. Structure 3:1171 (1995)), enquanto a região amino-terminal (3-49) da mesma proteína é homóloga à região amino-terminal (1-47) da proteína de ligação ao ácido graxo (132 resíduos de aminoácidos, GenBank, L23322) (Becker e col., Gene, 148:321 (1994)).
[0059]A modelagem da homologia requer a identificação de pelo menos um
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 24/81
13/64 molde de estrutura 3D adequado, normalmente uma estrutura 3D experimentalmente determinada de uma proteína homóloga com similaridade da sequência significativa com a proteína alvo. A OgLuc não tem similaridade da sequência significativa com outras proteínas conhecidas. Portanto, foram empregados métodos de reconhecimento da dobra, projetados para identificar homólogos distantes da OgLuc, tais como as proteínas com baixa similaridade da sequência com a OgLuc. Esta abordagem produziu diversos moldes de estruturas 3D potenciais que pertencem à família de proteínas das proteínas de ligação ao ácido graxo (FABPs), que é parte da superfamília de proteínas catalíticas. O modelo mostrou que a marca estrutural da dobra da calicina, que efetivamente interliga as extremidades de N e C com as ligações de hidrogênio, e que está presente em pelo menos três FABPs, não é completamente conservada na OgLuc. O resíduo da OgLuc Asn166 (próximo à extremidade de C) é incapaz de ligação de hidrogênio com as carbonilas da cadeia principal próximas à extremidade N-terminal. Entretanto, os modelos de mutantes contendo Arg ou Lys na posição 166 da OgLuc sugeriram que a restauração deste motivo de estrutura poderia melhorar a estabilidade estrutural da OgLuc e a sua expressão/atividade nas células.
[0060]As modalidades da invenção proporcionam uma luciferase modificada (variante), sintética, bem como seus fragmentos, por exemplo, aqueles úteis nos ensaios de complementação, tendo pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a uma luciferase do tipo selvagem correspondente, em uma região que é estruturalmente homóloga a um membro da superfamília da proteína calicina, p.ex., a família das proteínas de ligação ao ácido graxo. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma luciferase de crustáceo modificada, p.ex., uma luciferase de decápode modificada, bem como seus fragmentos, por exemplo, aqueles úteis nos ensaios de complementação, tendo pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a uma luciferase de crustáceo do tipo selvagem correspondente, em uma
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 25/81
14/64 região que é estruturalmente homóloga a um membro da superfamília da proteína calicina, p.ex., a família das proteínas de ligação ao ácido graxo. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma luciferase modificada de um flagelado unicelular eucariótico, bem como seus fragmentos, por exemplo, aqueles úteis nos ensaios de complementação, tendo pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a uma luciferase de flagelado unicelular eucariótico do tipo selvagem correspondente, p.ex., as luciferases a partir de Dinoflagellata incluindo Dinophyceae, Noctiluciphyceae, ou Syndiniophycea, em uma região que é estruturalmente homóloga a um membro da superfamília da proteína calicina, p.ex., a família das proteínas de ligação ao ácido graxo. Uma molécula de ácido nucléico codificando a luciferase modificada pode ou não codificar um peptídeo de sinal secretório ligado à luciferase modificada.
[0061]A pelo menos uma substituição na luciferase modificada sintética, ou em um seu fragmento, é em um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente na região que é estruturalmente homóloga a um membro da superfamília da proteína calicina, p.ex., a família das proteínas de ligação ao ácido graxo, resíduo este que pode participar na formação de ponte de hidrogênio ou iônica intramolecular, e está associado com a luminescência melhorada, na luciferase modificada. A luminescência melhorada inclui, porém não está limitada à emissão de luz melhorada, cinética de emissão de luz alterada, p.ex., maior estabilidade da intensidade de luz, ou cor da luminescência alterada, p.ex., uma mudança para comprimentos de ondas mais curtos ou mais longos, ou uma combinação destas. Em uma modalidade, o resíduo na luciferase modificada sintética na posição correspondente pode interagir com um resíduo em uma região correspondendo aos resíduos 1 a 10 ou 144 a 148 da OgLuc, p.ex., um tendo SEQ ID No: 1 (observar que a numeração destas posições é baseada em uma Phe no resíduo 1 da sequência madura, não uma Met; entretanto, outros resíduos podem preceder a Phe, tal como
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 26/81
15/64 uma Val na posição -1, que pode ser introduzida por inserção de um sítio de clonagem) ou um resíduo com átomos que estão dentro de 4 a 8 À, p.ex., dentro de 6 À, do resíduo na posição correspondente (posição 166). As posições correspondentes podem ser identificadas por alinhamento das sequências usando, por exemplo, programas de alinhamento das sequências, programas de predição da estrutura secundária ou métodos de reconhecimento da dobra, ou uma combinação destes. A luciferase modificada de acordo com a invenção pode incluir substituições de aminoácidos adicionais que alteram a cor da luminescência, por exemplo, substituição(ões) que resulta(m) em luminescência com vermelho alterado, altera(m) a estabilidade da proteína, ou qualquer combinação destas.
[0062]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma luciferase de decápode modificada, a qual tem luminescência melhorada em relação a uma luciferase de decápode do tipo selvagem correspondente. Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma luciferase de decápode modificada que utiliza a coelenterazina. As coelenterazinas incluem, porém não estão limitadas às coelenterazinas de ocorrência natural, bem como seus derivados (análogos), tais como aqueles divulgados na Patente U.S. No 7.118.878, assim como EnduRen, ViviRen, coelenterazina n, coelenterazina h, coelenterazina c, coelenterazina cp, coelenterazina e, coelenterazina f, coelenterazina fcp, coelenterazina hh, coelenterazina i, coelenterazina icp, 2-metil coelenterazina, e aquelas divulgadas no WO/040100 e no pedido U.S. No de Série 12/056.073, cujas divulgações são incorporadas por referência neste documento.
[0063]A luciferase modificada de acordo com a invenção tem um resíduo diferente da asparagina em uma posição que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1, que resulta na luminescência melhorada, e opcionalmente um ácido aspártico em uma posição que corresponde ao resíduo 5 na SEQ ID NO;1, uma glicina em uma posição que corresponde ao resíduo 8 na SEQ ID No:1, um ácido aspártico em uma
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 27/81
16/64 posição que corresponde ao resíduo 9 na SEQ ID No:1, um triptofano, tirosina ou fenilalanina em uma posição que corresponde ao resíduo 10 na SEQ ID No:1, uma asparagina em uma posição que corresponde ao resíduo 144 na SEQ ID No:1, e/ou uma glicina em uma posição que corresponde ao resíduo 147 na SEQ ID No:1, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, o resíduo na luciferase modificada que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 é a lisina. Em uma outra modalidade, o resíduo na luciferase modificada que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 é a arginina. Em uma modalidade, o resíduo na luciferase modificada que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 é capaz de formar uma ou mais ligações de hidrogênio ou iônicas intramoleculares com as carbonilas ou a cadeia lateral em uma posição que corresponde ao resíduo 9 na SEQ ID No:1, próxima à extremidade N-terminal da luciferase modificada. Em uma modalidade, a luciferase modificada não tem uma sequência sinal de peptídeos. Em uma modalidade, a luciferase modificada tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, porém menos do que 100%, de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID No:1.
[0064]Em uma modalidade, a luciferase do tipo selvagem correspondente é uma luciferase de Oplophorus, p.ex., Oplophorus gracilirostris, Oplophorus grimaldii, Oplophorus spinicauda, Oplophorus foliaceus, Oplophorus noraezeelandiae, Oplophorus typus, Oplophorus noraezelandiae ou Oplophorus spinous, luciferase de Heterocarpus, luciferase de Systellapis ou uma luciferase de Acanthephyra. Em uma modalidade, a luciferase modificada tem pelo menos uma emissão de luminescência melhorada 2 vezes ou mais, p.ex., pelo menos 4 vezes, em uma célula procariótica e/ou uma célula eucariótica em relação à luciferase do tipo selvagem correspondente.
[0065]Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma luciferase modificada de dinoflagelado, a qual tem luminescência melhorada em relação a uma luciferase de dinoflagelado do tipo selvagem correspondente, p.ex., uma luciferase de
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 28/81
17/64 dinoflagelado, tal como uma luciferase de Lingulodinium polyedrum, uma luciferase de Pyrocystis lunula ou uma tendo a SEQ ID No:21. A luciferase modificada pode ter um resíduo diferente da asparagina em uma posição que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1, p.ex., uma arginina, e opcionalmente uma prolina em uma posição que corresponde ao resíduo 5 na SEQ ID NO;1, uma glicina em uma posição que corresponde ao resíduo 8 na SEQ ID No:1, uma arginina em uma posição que corresponde ao resíduo 9 na SEQ ID No:1, um triptofano, tirosina ou fenilalanina em uma posição que corresponde ao resíduo 10 na SEQ ID No:1, uma fenilalanina em uma posição que corresponde ao resíduo 144 na SEQ ID No:1, e/ou uma treonina em uma posição que corresponde ao resíduo 147 na SEQ ID No:1, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, o resíduo na luciferase modificada que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 é a lisina. Em uma outra modalidade, o resíduo na luciferase modificada que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 é a arginina. Em uma modalidade, o resíduo na luciferase modificada que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 é capaz de formar uma ou mais ligações de hidrogênio ou iônicas intramoleculares com as carbonilas ou a cadeia lateral em uma posição que corresponde ao resíduo 9 na SEQ ID No:1, próxima à extremidade N-terminal da luciferase modificada. Em uma modalidade, a luciferase modificada não tem uma sequência sinal de peptídeos.
[0066]Em uma modalidade, a luciferase modificada tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, porém menos do que 100%, de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID No:21. A luciferase modificada da invenção, incluindo uma com substituições de aminoácidos adicionais que alteram a cor da luminescência, pode ser empregada com uma luciferina modificada em uma reação luminogênica que produz uma cor alterada da luminescência.
[0067]Proporciona-se adicionalmente uma luciferase modificada tendo um
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 29/81
18/64 domínio estrutural 3D relacionado ao barril beta de FABP, luciferase modificada esta que tem uma substituição que resulta na união não covalente, p.ex., por meio de ligações de hidrogênio ou iônicas intramoleculares, das folhas beta terminais do barril beta, e opcionalmente em ligações não covalentes adicionais, p.ex., por meio de ligações de hidrogênio ou iônicas intramoleculares, com as estruturas secundárias adjacentes.
[0068]As modalidades da invenção também proporcionam uma luciferase modificada de decápode ou dinoflagelado, a qual tem luminescência melhorada e uma arginina, lisina, alanina, leucina, prolina, glutamina ou serina em uma posição que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1 e pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a uma luciferase do tipo selvagem de decápode ou dinoflagelado correspondente. Em uma modalidade, a pelo menos uma substituição na luciferase modificada é uma substituição em uma posição que corresponde ao resíduo 4, 11,33, 44, 45, 54, 75, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 167, ou 169, ou uma combinação destes, na SEQ ID NO;1, p.ex., uma que resulta na luminescência melhorada em relação a uma luciferase modificada que tem luminescência melhorada e uma arginina, lisina, alanina, leucina, prolina, glutamina ou serina em uma posição que corresponde ao resíduo 166 na SEQ ID No:1.
[0069]Em uma modalidade, a luciferase modificada da invenção tem uma ou mais sequências de aminoácidos heterólogas na extremidade N-terminal, na extremidade de C, ou em ambas (um polipeptídeo de fusão, tal como um com uma marca de epítopo ou fusão), que opcionalmente interagem direta ou indiretamente com uma molécula de interesse. Em uma modalidade, a presença da(s) sequência(s) heteróloga(s) não altera substancialmente a luminescência da luciferase modificada antes ou após a interação com a molécula de interesse. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos heteróloga é uma marca de epítopo. Em uma outra modalidade, a sequência de aminoácidos heteróloga é uma que, durante ou após a
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 30/81
19/64 interação com uma molécula de interesse, é submetida a uma mudança conformacional, que, por sua vez, altera a atividade da luciferase, p.ex., uma OgLuc modificada com tal sequência de aminoácidos é útil para detectar interações alostéricas. A luciferase modificada ou uma fusão com a luciferase modificada ou um seu fragmento pode ser empregado como um relator.
[0070]Em uma modalidade, um fragmento de uma luciferase da invenção é fundido a uma sequência de aminoácidos heteróloga, a fusão, com isso, formando um barril beta, proteína de fusão esta que é capaz de gerar luminescência a partir de uma luciferina de ocorrência natural ou um seu derivado.
[0071]Proporciona-se também um polinucleotídeo que codifica uma luciferase modificada da invenção ou uma fusão dela, uma célula hospedeira isolada tendo o polinucleotídeo ou a luciferase modificada ou uma fusão dela, e métodos de utilizar o polinucleotídeo, a luciferase modificada ou uma fusão dela ou a célula hospedeira da invenção.
[0072]Proporciona-se adicionalmente um método para identificar as posições dos aminoácidos em uma proteína de interesse, que estão em diferentes estruturas secundárias, p.ex., estruturas separadas por 5 aminoácidos ou mais que não são parte de qualquer estrutura secundária, e são capazes de formação de ligações de hidrogênio ou iônicas uma com a outra. O método inclui comparar as estruturas secundárias preditas para a sequência de aminoácidos de uma proteína de interesse com as estruturas secundárias de uma ou mais proteínas sem similaridade da sequência global, p.ex., menos do que 30% de identidade com a proteína de interesse. As uma ou mais proteínas tem uma estrutura 3D definida e pelo menos uma das proteínas tem um primeiro resíduo associado com pelo menos uma primeira estrutura secundária que forma uma ligação de hidrogênio ou iônica, p.ex., pontes de sais, entre as cadeias laterais ou entre uma cadeia lateral de ou uma carbonila da cadeia principal próxima ou dentro de 5 ou 10 resíduos de um segundo resíduo associado com uma
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 31/81
20/64 segunda estrutura secundária, respectivamente. Em uma modalidade, a primeira estrutura secundária é C-terminal à segunda estrutura secundária. Em uma outra modalidade, a primeira estrutura secundária é N-terminal à segunda estrutura secundária. Então, determina-se se a proteína de interesse tem uma ou mais estruturas secundárias correspondendo à pelo menos a primeira estrutura secundária nas uma ou mais proteínas e, neste caso, determinando as posições dos aminoácidos na proteína de interesse que correspondem ao primeiro resíduo, ao segundo resíduo, ou a ambos, nas uma ou mais proteínas. Em uma modalidade, uma estrutura secundária é uma hélice 310 ou um barril beta. Em uma modalidade, a proteína de interesse é uma luciferase. Em uma modalidade, o primeiro resíduo é capaz de formar uma ligação de hidrogênio ou iônica com uma ou mais carbonilas da cadeia principal dentro de 5 resíduos do segundo resíduo. Em uma modalidade, as uma ou mais proteínas são proteínas de ligação ao ácido graxo.
Definições [0073]Os resíduos de aminoácidos nas luciferases modificadas da invenção podem ser aqueles na configuração L, na configuração D, ou os aminoácidos de ocorrência não natural, tais como norleucina, L-etionina, β-2-tienilalanina, 5metiltriptofano norvalina, L-canavanina, p-fluorfenilalanina, p-(4hidroxibenzoil)fenilalanina, ácido 2-ceto-4-(metiltio)butírico, beta-hidróxi leucina, gama-cloronorvalina, gama-metil D-leucina, beta-D-L hidroxileucina, ácido 2-amino-3clorobutírico, N-metil-D-valina, 3,4,diflúor-L-fenilalanina, 5,5,5-trifluorleucina, 4,4,4,triflúor-L-valina, 5-flúor-L-triptofano, 4-azido-L-fenilalanina, 4-benzil-L-fenilalanina, tiaprolina, 5,5,5-trifluorleucina, 5,5,5,5',5',5'-hexafluorleucina, ácido 2-amino-4-metil-4pentenóico, ácido 2-amino-3,3,3 -triflúor-metilpentanóico, ácido 2-amino-3-metil-5,5,5tri-fluorpentanóico, ácido 2-amino-3-metil-4-pentenóico, trifluorvalina, hexafluorvalina, homocisteína, hidroxilisina, ornitina, e aqueles com ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação, tal como, --CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, --CH=CHPetição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 32/81
21/64
- (cis e trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, e --CH2SO--, por métodos conhecidos na técnica. Ao manter a nomenclatura padrão dos polipeptídeos, as abreviações para os resíduos de aminoácidos de ocorrência natural são como mostradas na Tabela de
Correspondência a seguir.
TABELA DE CORRESPONDÊNCIA
1 Letra 3 Letras AMINOÁCIDO
Y Tyr L-tirosina
G Gly L-glicina
F Phe L-fenilalanina
M Met L-metionina
A Ala L-alanina
S Ser L-serina
I Ile L-isoleucina
L Leu L-leucina
T Thr L-treonina
V Val L-valina
P Pro L-prolina
K Lys L-lisina
H His L-histidina
Q Gln L-glutamina
E Glu ácido L-glutâmico
W Trp L-triptofano
R Arg L-arginina
D Asp ácido L-aspártico
N Asn L-asparagina
C Cys L-cisteína
[0074]A luminescência melhorada, conforme usada neste documento, pode
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 33/81
22/64 incluir quaisquer das que seguem: emissão de luz melhorada, cinética alterada da emissão de luz, p.ex., maior estabilidade da intensidade da luz, ou cor alterada da luminescência, p.ex., uma mudança para comprimentos de ondas mais curtos ou mais longos.
[0075]O termo homologia refere-se a um grau de complementariedade entre duas ou mais sequências. Pode haver homologia parcial ou homologia completa (i.e., identidade). A homologia é frequentemente medida usando software de análise da sequência (p.ex., o Pacote de Software de Análise da Sequência GCG e Seqweb, outrora vendido pela Genetics Computer Group. University of Wisconsin Biotechnology Center. 1710 University Avenue. Madison, WI 53705). Tal software combina sequências similares especificando graus de homologia para diversas substituições, remoções, inserções, e outras modificações. As substituições conservativas tipicamente incluem as substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina.
[0076]O termo isolado, quando usado em relação a um ácido nucléico ou um polipeptídeo, como em oligonucleotídeo isolado, polinucleotídeo isolado, proteína isolada, ou polipeptídeo isolado, refere-se a uma sequência de ácidos nucléicos ou aminoácidos que é identificada e separada de pelo menos um contaminante com o qual ela está normalmente associada em sua origem. Assim, um ácido nucléico isolado ou polipeptídeo isolado está presente em uma forma ou ambiente que é diferente daquele no qual ele é encontrado na natureza. Em contraste, os ácidos nucléicos não isolados (p.ex., o DNA ou o RNA) ou os polipeptídeos não isolados (p.ex., as proteínas e as enzimas) são encontrados no estado que eles existem na natureza. Por exemplo, uma dada sequência de DNA (p.ex., um gene) é encontrada sobre o cromossomo da célula hospedeira em proximidade aos genes vizinhos; as sequência de RNA (p.ex., uma sequência de mRNA específica codificando uma
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 34/81
23/64 proteína específica) são encontradas na célula como uma mistura com diversos outros mRNAs que codificam uma multiplicidade de proteínas. Entretanto, o ácido nucléico isolado inclui, a título de exemplo, tal ácido nucléico em células que normalmente expressam este ácido nucléico, onde o ácido nucléico está em uma posição cromossômica diferente daquela das células naturais, ou está de outro modo flanqueado por uma sequência de ácidos nucléicos diferente daquela encontrada na natureza. O ácido nucléico ou o oligonucleotídeo isolado pode estar presente na forma de fita simples ou fita dupla. Quando um ácido nucléico ou oligonucleotídeo isolado for para ser utilizado para expressar uma proteína, o oligonucleotídeo contém, como mínimo, a fita com sentido ou de codificação (i.e., um ácido nucléico de fita simples), porém pode conter ambas as fitas com sentido e sem sentido (i.e., um ácido nucléico de fita dupla).
[0077]O termo molécula de ácido nucléico, polinucleotídeo ou sequência de ácido nucléico, como usado neste documento, refere-se ao ácido nucléico, DNA ou RNA que compreende sequências de codificação necessárias para a produção de um precursor de polipeptídeo ou proteína. O polipeptídeo codificado pode ser um polipeptídeo de tamanho natural, um fragmento dele (menos do que o tamanho natural), ou uma fusão de qualquer um do polipeptídeo de tamanho natural ou do seu fragmento com um outro polipeptídeo, produzindo um polipeptídeo de fusão.
[0078]A luciferase de Oplophorus” é um complexo de proteínas nativas de 35 kDa e 19 kDa. A proteína de 19 kDa é o menor componente catalítico (acesso ao GenBank BAB13776, 196 aminoácidos). Conforme usada neste documento, a OgLuc é a proteína de 19 kDa sem o peptídeo sinal (169 aminoácidos, resíduos 28 a 196 de BAB13776).
[0079]Por peptídeo, proteína e polipeptídeo pretende-se qualquer cadeia de aminoácidos, independente do comprimento ou da modificação pós-traducional (p.ex., glicosilação ou fosforilação). As moléculas de ácidos nucléicos da invenção
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 35/81
24/64 codificam uma variante de um seu fragmento de proteína ou polipeptídeo de ocorrência natural, que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, porém menos do que 100%, de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da proteína de ocorrência natural (nativa ou tipo selvagem) a partir da qual ela é derivada. O termo polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão refere-se a uma proteína quimérica contendo uma proteína de referência (p.ex., luciferase), unida na extremidade N-terminal e/ou de C a uma ou mais sequências heterólogas (p.ex., um polipeptídeo que não seja de luciferase).
[0080]A estrutura primária da proteína (sequência primária, sequência do peptídeo, sequência da proteína) é a sequência de aminoácidos. Ela é geralmente descrita começando a partir da extremidade amino terminal (N) até a extremidade carboxila terminal (C). A estrutura secundária da proteína pode ser descrita como a conformação local da cadeia peptídica, independente do restante da proteína. Existem elementos da estrutura secundária regulares (p.ex., hélices, folhas ou fitas) que são geralmente estabilizados por interações das ligações de hidrogênio entre os átomos da cadeia principal dos resíduos participantes, e elementos da estrutura secundária irregulares (p.ex., curvas, dobras, loops, espirais, segmentos desordenados ou não estruturados). A estrutura secundária da proteína pode ser predita com diferentes métodos/programas, p.ex., PSIPRED (McGuffin e col., Bioinformatics, 16:404 (2000)), PORTER (Pollastri e col., Bioinformatics, 21:1719 (2005)), DSC (King e Sternberg, Protein Sci., 5:2298 (1996)), ver http://www.expasy.org/tools/#secondary quanto a uma lista. A estrutura terciária da proteína é a estrutura tridimensional (3D) global da cadeia peptídica. Ela é descrita por posições atômicas no espaço tridimensional, e pode envolver interações entre grupos que estão distantes na estrutura primária. As estruturas terciárias das proteínas são classificadas em dobras, que são arranjos tridimensionais específicos de elementos da estrutura secundária. Algumas vezes não
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 36/81
25/64 há nenhuma similaridade de sequência discernível entre as proteínas que têm a mesma dobra.
[0081]O termo tipo selvagem ou nativo, conforme usado neste documento, refere-se a um gene ou produto de gene que tem as características daquele gene ou produto de gene isolado de uma origem de ocorrência natural. Um gene do tipo selvagem é aquele que é mais frequentemente observado em uma população e é, assim, arbitrariamente designado a forma do tipo selvagem do gene. Em contraste, o termo mutante refere-se a um gene ou produto de gene que mostra modificações na sequência e/ou nas propriedades funcionais (i.e., características alteradas) quando comparado ao gene ou produto de gene do tipo selvagem. Observa-se que os mutantes de ocorrência natural podem ser isolados; estes são identificados pelo fato que eles têm características alteradas quando comparados ao gene ou produto de gene do tipo selvagem.
I.Polinucleotídeos e Proteínas Ilustrativos [0082]A invenção inclui uma luciferase modificada ou os seus fragmentos de proteínas, p.ex., aqueles com remoções, por exemplo, uma remoção de 1 a cerca de 5 resíduos, e as suas quimeras (fusões) (ver os pedidos U.S. N— de Série 60/985.585 e 11/732.105, cujas divulgações são incorporadas por referência neste documento) tendo pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a uma luciferase do tipo selvagem, substituição esta que resulta na luciferase modificada tendo estabilidade melhorada, luminescência melhorada, p.ex, emissão de luminescência melhorada, maior estabilidade da cinética de luminescência, ou cor alterada da luminescência, ou ambos. As sequências da luciferase de uma luciferase modificada são substancialmente as mesmas que a sequência de aminoácidos de uma luciferase do tipo selvagem correspondente. Um polipeptídeo ou peptídeo tendo substancialmente a mesma sequência significa que uma sequência de aminoácidos é predominantemente, porém não inteiramente, a mesma e conserva a atividade
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 37/81
26/64 funcional da sequência à qual ela está relacionada. Em geral, duas sequências de aminoácidos são substancialmente as mesmas ou substancialmente homólogas se elas forem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, porém menos do que 100%, de identidade da sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, a luciferase modificada é codificada por um polinucleotídeo recombinante.
[0083]A homologia ou a identidade pode ser frequentemente medida usando software de análise da sequência. Tal software compara as sequências similares especificando graus de homologia para diversas remoções, substituições e outras modificações. Os termos homologia e identidade, no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou sequências de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais quando comparados e alinhados para a correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada, como medida usando qualquer número de algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual.
[0084]Para a comparação da sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual são comparadas as sequências de teste. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas da subseqüência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo da sequência são designados. Os parâmetros preestabelecidos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências então calcula a porcentagem de identidades da sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.
[0085]Os métodos de alinhamento da sequência para comparação são
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 38/81
27/64 bastante conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e col. (1981), pelo algoritmo de alinhamento da homologia de Needleman e col. (J. Mol. Biol., 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Person e col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444 (1988)), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual.
[0086]As implementações no computador destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências para determinar a identidade da sequência. Tais implementações incluem, porém não estão limitadas à: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível da Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Versão 8 (disponível da Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA). Os alinhamentos usando estes programas podem ser efetuados usando os parâmetros preestabelecidos. O programa CLUSTAL está bem descrito por Higgins e col., Gene, 73:237 (1988); Higgins e col., CABIOS, 5:157 (1989); Corpet e col., Nucl. Acids Res., 16:1088 (1988); Huang e col., CABIOS, 8:155 (1992); e Pearson e col., Methods Mol. Biol., 24:307 (1994). O programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller, LABIOS, 4:11 (1988). Os programas BLAST de Altschul e col. (J. Mol. Biol., 215:403 (1990)) são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (PNAS USA, 90:5873 (1993)).
[0087]O software para efetuar as análises por BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de sequências de altas pontuações (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de dúvida, que igualam ou satisfazem alguma
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 39/81
28/64 pontuação de começo de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados. T é referida como o começo da pontuação da palavra da vizinhança (Altschul e col., J. Mol. Biol., 215:403 (1990)). Estes resultados iniciais da palavra da vizinhança atuam como sementes para iniciar as buscas para encontrar HSPs mais longos que as contêm. Os resultados da palavra são então prolongados em ambas as direções ao longo de cada sequência para até que a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser melhorada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para as sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de prêmio para um par de resíduos que se equiparam; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para os resíduos que se emparelham mal; sempre < 0). Para as sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos resultados da palavra em cada direção é parada quando a pontuação de alinhamento cumulativa diminuir pela quantidade X a partir de seu valor máximo atingido, a pontuação cumulativa for para zero ou abaixo devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa, ou o final de qualquer sequência for atingido.
[0088]Além de calcular a porcentagem de identidade da sequência, o algoritmo BLAST também efetua uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, p.ex., Karlin e Altschul, PNAS USA, 90:5873 (1993). Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual ocorreria por acaso uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. Por exemplo, uma sequência de ácido nucléico de teste é considerada similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de ácidos nucléicos de teste com a sequência de ácidos nucléicos de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001.
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 40/81
29/64 [0089]Para obter os alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, o Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser utilizado, conforme descrito em Altschul e col. (Nuc. Acids Res., 25:3389 (1997)). Alternativamente, o PSI-BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado para efetuar uma busca iterada que detecta as relações distantes entre as moléculas. Ver Altschul e col., supra. Quando se utiliza o BLAST, o Gapped BLAST, o PSI-BLAST, os parâmetros preestabelecidos dos respectivos programas (p.ex., BLASTN para as sequências de nucleotídeos, BLASTX para as proteínas) podem ser usados. O programa BLASTN (para as sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. Para a sequência de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62(ver Henikoff e Henikoff, PNAS USA, 89:10915 (1989)). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov.
[0090]Em particular, um polipeptídeo pode estar substancialmente relacionado a um outro polipeptídeo (de referência), porém para uma variação conservativa ou não conservativa. Uma variação conservativa significa a substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo biologicamente similar, incluindo os resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Os exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por um outro, ou a substituição de um resíduo polar por um outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácidos glutâmicos por aspárticos, ou glutamina por asparagina, e similares. Os outros exemplos ilustrativos de substituições conservativas incluem as alterações de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 41/81
30/64 para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina, glutamina, ou glutamato; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; valina para isoleucina para leucina. Uma luciferase modificada da invenção tem uma substituição conservativa ou uma não conservativa que resulta em estabilidade melhorada, luminescência, ou ambas.
[0091]As proteínas ou as proteínas de fusão de luciferase modificada da invenção podem ser preparadas por métodos recombinantes ou por métodos de síntese peptídica química em fase sólida. Tais métodos são conhecidos na técnica.
II.Vetores e Células Hospedeiras Codificando a Luciferase Modificada ou as suas Fusões [0092]Assim que for preparada uma molécula de ácido nucléico desejável codificando uma luciferase modificada, um fragmento dela, tal como um com atividade de luminescência ou que possa ser complementado por uma outra molécula para resultar em atividade de luminescência, ou uma fusão dela com atividade de luminescência, pode ser preparado um cassete de expressão codificando a luciferase modificada, um seu fragmento, p.ex., um para a complementação, ou uma sua fusão com atividade de luminescência. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando uma luciferase modificada é de modo opcional operavelmente ligada às sequências reguladoras de transcrição, p.ex., um ou mais reforçadores, um promotor, uma sequência de terminação da transcrição ou uma combinação destes, para formar um cassete de expressão. A molécula de ácido nucléico ou o cassete de expressão pode ser introduzido em um vetor, p.ex., um vetor de plasmídio ou viral, que opcionalmente inclui um gene marcador selecionável, e o vetor introduzido em uma célula de interesse, por exemplo, uma célula procariótica, tal como E. coli, Streptomyces spp.,
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 42/81
31/64
Bacillus spp., Staphylococcus spp. e similar, bem como células eucarióticas incluindo uma planta (dicotiledônea ou monocotiledônea), fungo, levedura, p.ex., Pichia, Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, ou uma célula mamífera, seus lisados, ou em uma mistura de transcrição/tradução in vitro. As células mamíferas incluem, porém não estão limitadas às células bovinas, caprinas, ovinas, caninas, felinas, de primata não humano, p.ex., símio, e humanas. As linhagens de células mamíferas incluem, porém não estão limitadas às células CHO, COS, 293, HeLa, CV-1, SH-SY5Y, HEK293, e NIH3T3.
[0093]A expressão de uma luciferase modificada codificada pode ser controlada por qualquer promotor capaz de expressão em células procarióticas ou células eucarióticas, incluindo os promotores sintéticos. Os promotores procarióticos incluem, porém não estão limitados aos promotores de SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac ou maltose, incluindo qualquer fragmento que tenha atividade de promotor. Os promotores eucarióticos incluem, porém não estão limitados aos promotores constitutivos, p.ex., promotores virais, tais como os promotores de CMV, SV40 e RSV, bem como promotores reguláveis, p.ex., um promotor induzível ou repremível, tal como o promotor de tet, o promotor de hsp70 e um promotor sintético regulado por CRE, incluindo qualquer fragmento que tenha atividade de promotor. A molécula de ácido nucléico, o cassete de expressão e/ou o vetor da invenção podem ser introduzidos em uma célula por qualquer método, incluindo, porém não limitado à transformação mediada por cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção e similar.
III.Sequências Otimizadas, e Vetores e Células Hospedeiras Codificando a Luciferase Modificada [0094]Também se proporciona uma molécula de ácido nucléico (polinucleotídeo) isolada compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando uma luciferase modificada da invenção, um seu fragmento ou uma fusão dela. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico isolada compreende uma
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 43/81
32/64 sequência de ácidos nucléicos que é otimizada para a expressão em pelo menos um hospedeiro selecionado. As sequências otimizadas incluem as sequências que estão otimizadas no códon, i.e., códons que são empregados mais frequentemente em um organismo em relação a um outro organismo, p.ex., um organismo distantemente relacionado, bem como as modificações para adicionar ou modificar as sequências de Kozak e/ou os introns, e/ou para remover sequências indesejáveis, por exemplo, os sítios de ligação aos fatores de transcrição potenciais. Tais sequências otimizadas podem produzir expressão melhorada, p.ex., níveis melhorados de expressão de proteína, quando introduzidas em uma célula hospedeira.
[0095]Em uma modalidade, o polinucleotídeo inclui uma sequência de ácidos nucléicos codificando uma luciferase modificada da invenção, sequência de ácidos nucléicos esta que é otimizada para a expressão em uma célula hospedeira mamífera. Em uma modalidade, um polinucleotídeo otimizado não mais hibridiza com a sequência não otimizada correspondente, p.ex., não hibridiza com a sequência não otimizada sob condições de severidade média ou alta. O termo severidade é usado em referência às condições de temperatura, resistência iônica, e à presença de outros compostos, sob as quais são conduzidas as hibridizações dos ácidos nucléicos. Com as condições de severidade alta, o emparelhamento de bases do ácido nucléico ocorrerá somente entre os fragmentos de ácidos nucléicos que tenham uma alta frequência de sequências de bases complementares. Desse modo, as condições de severidade média ou baixa são frequentemente requeridas quando for desejado que os ácidos nucléicos que não forem completamente complementares um ao outro sejam hibridizados ou anelados conjuntamente. A técnica sabe bem que podem ser empregadas diversas condições equivalentes para compreender as condições de severidade média ou baixa.
[0096]Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo tem menos do que 90%, p.ex., menos do que 80%, de identidade da sequência de ácidos nucléicos com a
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 44/81
33/64 sequência não otimizada correspondente e, opcionalmente, codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, porém menos do que 100%, de identidade dz sequência de aminoácidos com o polipeptídeo codificado pela sequência não otimizada. Proporcionam-se também construções, p.ex., cassetes de expressão, e vetores compreendendo a molécula de ácido nucléico isolada, p.ex., com a sequência de ácidos nucléicos otimizada, bem como kits compreendendo a molécula de ácido nucléico isolada, a construção ou o vetor.
[0097]Uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácidos nucléicos codificando uma luciferase modificada da invenção, um seu fragmento ou uma sua fusão, é opcionalmente otimizada para a expressão em uma célula hospedeira particular e também opcionalmente ligada operavelmente a sequências reguladoras da transcrição, p.ex., um ou mais reforçadores, um promotor, uma sequência de terminação da transcrição ou uma combinação destes, para formar um cassete de expressão.
[0098]Em uma modalidade, uma sequência de ácidos nucléicos codificando uma luciferase modificada da invenção, um seu fragmento ou uma sua fusão, é otimizada substituindo os códons, p.ex., pelo menos 25% dos códons, em uma sequência da luciferase do tipo selvagem por códons que sejam preferencialmente empregados em uma célula particular (selecionada). Os códons preferidos têm uma frequência relativamente alta de uso de um códon em uma célula selecionada, e preferivelmente a sua introdução resulta na introdução de relativamente poucos sítios de ligação aos fatores de transcrição para os fatores de transcrição presentes na célula hospedeira selecionada, e relativamente poucos outros atributos estruturais indesejáveis. Desse modo, o produto de ácido nucléico otimizado pode ter um nível melhorado de expressão devido à frequência melhorada de uso de um códon, e um risco reduzido de comportamento transcricional inadequado devido a um número
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 45/81
34/64 reduzido de sequências reguladoras da transcrição indesejáveis.
[0099]Uma molécula de ácido nucléico isolada e otimizada pode ter uma composição de códons que difere daquela da sequência de ácidos nucléicos do tipo selvagem correspondente em mais que 30%, 35%, 40%, ou mais que 45%, p.ex., 50%, 55%, 60% ou mais dos códons. Os códons ilustrativos para uso na invenção são aqueles que são empregados mais frequentemente do que pelo menos um outro códon para o mesmo aminoácido em um organismo particular e, em uma modalidade, também não são códons de baixo uso neste organismo e não são códons de baixo uso no organismo usado para clonar ou examinar quanto à expressão da molécula de ácido nucléico. Além disso, os códons para certos aminoácidos (i.e., aqueles aminoácidos que têm três ou mais códons) podem incluir dois ou mais códons que são empregados mais frequentemente do que o(s) outro(s) códon(s) (não preferido(s)). A presença de códons na molécula de ácido nucléico que são empregados mais frequentemente em um organismo do que em outro organismo resulta em uma molécula de ácido nucléico que, quando introduzida nas células do organismo que emprega estes códons mais frequentemente, é expressa nestas células em um nível que é maior do que a expressão da sequência de ácidos nucléicos do tipo selvagem ou de origem nestas células.
[00100]Em uma modalidade da invenção, os códons que são diferentes são aqueles empregados mais frequentemente em um mamífero, enquanto em uma outra modalidade, os códons que são diferentes são aqueles empregados mais frequentemente em uma planta. Os códons preferidos para os diferentes organismos são conhecidos na técnica, p.ex., ver www.kazusa.or.jp./codon/. Um tipo particular de mamífero, p.ex., um ser humano, pode ter um grupo diferente de códons preferidos do que um outro tipo de mamífero. Também, um tipo particular de planta pode ter um grupo diferente de códons preferidos do que um outro tipo de planta. Em uma modalidade da invenção, a maior parte dos códons que diferem são aqueles que são
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 46/81
35/64 códons preferidos em uma célula hospedeira desejada. Os códons preferidos para os organismos que incluem os mamíferos (p.ex., os seres humanos) e as plantas são conhecidos na técnica (p.ex., Wada e col., Nucl. Acids Res., 18:2367 (1990); Murray e col., Nucl. Acids Res., 17:477 (1989)).
IV.Luciferase Ilustrativa para o Aumento da Estabilidade [00101]A luciferase secretada do camarão de águas profundas Oplophorus gracilirostris mostrou possuir muitas características interessantes, tais como alta atividade, alta produção de quantum, e ampla especificidade pelo substrato (coelenterazina, análogos de coelenterazina). A reação bioluminescente do Oplophorus ocorre quando a oxidação da coelenterazina (a luciferina) com o oxigênio molecular é catalisada pela luciferase de Oplophorus, resultando em luz de intensidade máxima a 462 nm e nos produtos CO2 e coelenteramida (Shimomura e col., Biochemistry, 17:994 (1978); este difere de Inouye 2000, que menciona 454 nm). A luminescência ótima ocorre em pH 9 na presença de NaCl a 0,05-0,1 M, a 40°C, e, devido à resistência incomum desta enzima ao calor, a luminescência visível ocorre em temperaturas acima de 50°C, quando for usada a enzima altamente purificada, ou em mais de 70°C, quando for usada a enzima parcialmente purificada. Em pH 8,7, a luciferase nativa tem um peso molecular de aproximadamente 130.000, aparentemente compreendendo 4 monômeros de 31.000; em pHs mais baixos, a luciferase nativa tende a polimerizar.
[00102]A proteína madura consiste em proteínas de 19 kDa e 35 kDa (heterotetrâmero consistindo em dois componentes de 19 kDa e dois componentes de 35 kDa). A proteína de 19 kDa (OgLuc) tem sido superexpressa como um monômero em E. coli e mostra ser ativa, entretanto, ela é produzida predominantemente como corpos de inclusão. A formação de corpos de inclusão é provavelmente devida à instabilidade da proteína dentro da célula.
[00103]Uma estrutura 3D da OgLuc não está disponível. Além disso, não há
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 47/81
36/64 nenhum modelo baseado na homologia conhecido disponível, visto que a OgLuc não tem nenhuma homologia de sequência com as outras luciferases e nenhuma similaridade de sequência global significativa com as outras proteínas conhecidas. Para gerar um modelo, foi usado um método de reconhecimento da dobra, projetado para identificar proteínas homólogas distantes. Usando esta abordagem, conforme descrita a seguir, identificou-se um grupo de proteínas de ligação ao ácido graxo (FABPs) pertencentes à superfamília da proteína calicina, e gerou-se um modelo de homologia da OgLuc com base nas estruturas 3D de três destas FABPs.
[00104]As calicinas são uma superfamília de proteínas, cujos membros compartilham estruturas similares de cilindro β. Os membros incluem, porém não estão limitados às proteínas de ligação ao ácido graxo (FABPs) e às lipocalinas. A família da proteína FABP tem uma estrutura de cilindro β descontínua de dez fitas; os cilindros da avidina e de MPI, embora de oito fitas, são mais circulares na seção transversal do que aqueles das lipocalinas e não têm uma hélice C-terminal ou fita 1; embora a triabina tenha uma geometria de cilindro similar, contudo, tem uma topologia modificada. As fitas N e C terminais das FABPs e das lipocalins podem estar intimamente sobrepostas, com a perda (FABP para lipocalina) ou o ganho (lipocalina para FABP) de duas fitas centrais necessário para efetuar a transformação de uma em outra (Flower e col., Protein Science, 2:753 (1993)). Ademais, além de alguma similaridade funcional (ligação ao ligante hidrofóbico e/ou interação macromolecular), estas famílias são caracterizadas por um padrão de dobramento similar (um cilindro β antiparalelo dominado por topologia predominantemente +1), dentro do qual as partes grandes de suas estruturas podem ser estruturalmente equivalentes, embora as famílias não compartilhem nenhuma similaridade de sequência global.
[00105]Um trabalho anterior (Flower, Protein Pept. Lett., 2:341 (1995)) mostrou que os membros da superfamília da calicina também compartilham um padrão estrutural distinto. Um resíduo de arginina ou lisina (a partir da última fita do
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 48/81
37/64 cilindro β) que forma ligações de hidrogênio com os grupos carbonila da cadeia principal da hélice do tipo 310 N-terminal e agrupa-se através de um triptofano conservado (a partir da primeira fita do cilindro β). Este padrão pode ser visto tanto nas estruturas das lipocalinas de núcleo, que também compartilham uma interação conservada a partir do loop L6, quanto nas lipocalinas estranhas mais estruturalmente diversas. Ele também é aparente nas outras quatro famílias compreendendo as calicinas. O exame das estruturas disponíveis da estreptavidina e da avidina da galinha, o inibidor de metaloproteinase de Erwinia chrysanthemi, e da estrutura da triabina, todas revelaram um arranjo muito similar de resíduos que interagem. A maior parte das FABPs conhecidas tem um arranjo de interações das cadeias laterais similar àqueles descritos acima, em que um triptofano, a partir da primeira fita do cilindro da FABP, agrupa-se contra uma arginina a partir de próximo ao final da última. Esta característica está, entretanto, ausente de um grupo de FABPs mais altamente divergidas, exemplificado pelas FABPs do músculo de inseto.
[00106]O modelo de homologia da OgLuc mostra que a marca estrutural da dobra da calicina, que efetivamente fixa as extremidades de N e C juntamente com as ligações de hidrogênio, e que está presente nas três FABPs, não é completamente conservada na OgLuc. A marca estrutural distinta (em que uma arginina ou lisina, capaz de formar diversas ligações de hidrogênio potenciais com as carbonilas da cadeia principal de uma hélice 310 curta, agrupa-se através de um triptofano conservado em um modo não aleatório, estruturalmente sobreposto) corresponde aos determinantes da sequência, comuns para as famílias dos membros da calicina: um padrão de sequência N-terminal característico, mostrando conservação de resíduoschave, e um motivo C-terminal mais fraco. A conservação de resíduos e interações particulares, através das famílias dos membros, fornece algum suporte para a idéia que havia uma origem evolucionária comum, se muito distante, para a superfamília da calicina. O presente modelo da OgLuc prediz que o resíduo da OgLuc Asn166,
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 49/81
38/64 próximo à extremidade de C, é incapaz de ligação de hidrogênio com as carbonilas da cadeia principal, próximas à extremidade N-terminal. Entretanto, os modelos de mutantes contendo Arg ou Lys na posição 166 sugerem que a restauração deste motivo de estrutura poderia melhorar a estabilidade estrutural da OgLuc e a sua expressão/atividade nas células.
[00107]A invenção será adicionalmente descrita pelos exemplos não limitativos que se seguem.
Exemplo 1 [00108]Os defeitos da OgLuc poderiam ser abordados por engenharia de proteína, porém para executar desse modo em uma forma eficiente requereria conhecimento sobre a estrutura tridimensional (3D) da OgLuc. Não há nenhuma estrutura terciária experimental ou modelo de estrutura terciária publicado da OgLuc. A modelagem da homologia foi usada para gerar um modelo de estrutura terciária da OgLuc. A construção de um modelo de homologia compreende diversas etapas, incluindo a identificação do(s) molde(s) estrutural(is) 3D, o alinhamento da sequência alvo (p.ex., OgLuc) e da(s) estrutura(s) de molde, a construção do modelo, e a avaliação da qualidade do modelo. A identificação de um ou mais moldes estruturais 3D para a OgLuc não foi intuitiva porque os métodos padrões de busca de sequências não identificaram similaridade global significativa com as proteínas tendo estrutura terciária conhecida. Para superar este problema, foram empregadas duas abordagens para identificar os homólogos de OgLuc distantes com estrutura terciária conhecida.
Abordagem 1:
[00109]Uma busca na biblioteca de moldes com base no Modelo de Hidden Markov (HMM) (Karplus e col., Bioinformatics, 14:846 (1998)) foi usada para detectar estruturas de moldes distantemente relacionadas usando a Ferramenta de Identificação de Molde SWISS-MODEL no http://swissmodel.expasy.org//SWISSMODEL.html (Arnold e col., Bioinformatics, 22:195 (2006)).
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 50/81
39/64 [00110]O melhor molde de estrutura 3D (maior pontuação do valor E) identificado para a OgLuc usando esta abordagem foi uma proteína de ligação ao ácido graxo (FABP) (número de acesso do Banco de Dados de Proteínas (PDB) 1VYF) (Angelucci e col., Biochemistry, 43:13000 (2004)). Foram também identificadas FABPs adicionais com pontuações menores, incluindo os números de acesso do PDB 1PMP e 1CRB.
[00111]Os alinhamentos ilustrativos da sequência alvo (OgLuc, resíduos 1-2 e 168-169 omitidos) e das sequências dos moldes de estruturas 3D identificados (1VYF, 1PMP, 1CRB) são mostrados abaixo. Observar que, devido à baixa similaridade da sequência, a colocação de lacunas no alinhamento pode variar. 1vyf 1 GSMSSFLGKWKLSESHNFDAVMSKLGVSWATRQIGNTVTPTVTFTMDGDK.. 50
F G W N D V G S G VTP G
Alvo 3 --LADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENgl
1vyf 51 .......MTMLTESTFKN..LSCTFKF.....................GEEF 72
S F FK G
Alvo 53 kadihvilPYEGLSGFQMglIEMIFKVvypvddhhfkiilhygtlvidGVTP 104 1vyf 73
DEKTSDGRNVKSVVEKNSESKLTQTQVDPKNTTVIVREV.DGDTMKTTVTVG 123
GR N R VT
Alvo 105 NMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLInPDGSLLFRVTIN 156
1vyf 124 DVTAIRNYKRLS 135 (SEQ ID No:5)
VT R
Alvo 157 GVTGWRLCENI 167 (SEQ ID No:7)
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 51/81
40/64
1pmp 3 SNKFLGTWKLVSSENFDEYMKALGVGLATRKLGNLAKPRVIISKKGDI....
F G W N D G LG P G
Alvo 3
LADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENglka 54 1pmp 49....................ITIRTESPFKNTEISFKL........GQEFEE 72
P L G
Alvo 55 dihviipyeglsgfqmglieMIFKVVYPVDDHHFKIILhygtlvidGVTPNM 106
1pmp 73
TTADNRKTKSTVTLARGSLNQVQK.WNGNETTIKRKL.VDGKMVVECKMKDV 122
R WNGN R DG V
Alvo 107 IDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTlWNGNKIYDERLInPDGSLLFRVTINGV
158
1pmp 123 VCTRIYEKV 131 (SEQ ID No:3)
R E
Alvo 159 TGWRLCENI 167 (SEQ ID No:7)
1crb 1 PVDFNGYWKMLSNENFEEYLRALDVNVALRKIANLLKPDKEIVQDGDH....
DF G W N L P V G
Alvo 3
LADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENglka 54
1crb 49....................MIIRTLSTFRNYIMDFQV........GKEFEE 72
MI G
Alvo 55 dihviipyeglsgfqmglieMIFKVVYPVDDHHFKIILhygtlvidGVTPNM 106
1crb 73
DLTGIDDRKCMTTVSWDGDKLQCVQK.GEKEGRGWTQWI.EGDELHLEMRAE 122
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 52/81
41/64
R DG I L
Alvo 107 --IDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTlWNGNKIYDERLInPDGSLLFRVTIN
156
1crb 123 GVTCKQVFKKVH 134 (SEQ ID No:4)
GVT
Alvo 157 GVTGWRLCENI— 165 (SEQ ID No:7)
Abordagem 2:
[00112]Um método de reconhecimento da dobra usando o GeneSilico metaserver no https://genesilico.pl/meta2 (Kurowski e col., Nucl. Acids Res., 31:3305 (2003)) foi também usado para identificar os homólogos de OgLuc distantes com estrutura terciária conhecida.
[00113]Uma dobra da proteína é uma classificação estrutural 3D. As proteínas que compartilham a mesma dobra têm um arranjo similar de estruturas secundárias regulares, porém sem necessariamente mostrarem evidência de ligação evolucionária no nível de sequência da proteína.
[00114]Usando este método, foram identificados três moldes de estrutura 3D de maior pontuação (números de acesso do PDB 1VYF, 1PMP, e 1CRB). Os alinhamentos ilustrativos da sequência alvo (OgLuc) e das sequências dos moldes de estruturas 3D (1VYF, 1PMP, 1CRB) são mostrados abaixo. Observar que, devido à baixa similaridade da sequência, a colocação exata de lacunas no alinhamento é difícil de predizer com segurança.
[00115]OgLuc e 1PMP:
--SNKFLGTWKLVSSENFDEYMKALGVGLATRKLGNLAKPRVIISKKG......DIITIRTEFTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADI
HVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVV
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 53/81
42/64
.....SPFKNTEISFKLGQEFEETTAD.....NRKTKSTVTLARGSLNQVQKWNGNETTIKRKLV-DGKMVVECKMKDV
YPVDDHHFKIILHYGTL-VIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFRVTIN
GV
VCTRIYEKV--(IPMP) (SEQ ID No:3)
TGWRLCENILA(OgLuc)(SEQ ID No:1)
OgLuc e FABPs:
--SNKFLGTWKLVSSENFDEYMKALGVGLATRKLGNLAKPRVIISKKG......
DIITIRTESP-----------------PVDFNGYWKMLSNENFEEYLRALDVNVALRKIANLLKPDKEIVQDG......
DHMIIRTLST................
GSMSSFLGKWKLSESHNFDAVMSKLGVSWATRQIGNTVTPTVTFTMDG......
DKMTMLTEST................
FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADI
HVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVV
.......FKNTEISFKLGQEFEETTA.....DNRKTKSTVTLAR-GSLNQVQKWNGNETTIKRKLV-DGKMVVECKMKD
.......FRNYIMDFQVGKEFEEDLT---GIDDRKCMTTVSWDG-DKLQCVQKGEKEGRGWTQWIE-GDELHLEMRAEG
.......FKNLSCTFKFGEEFDEKTS.....DGRNVKSVVEKNSESKLTQTQVDPKNTTVIVREVD-GDTMKTTVTVGD
YPVDDHHFKIILHYGTL--VIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFRVTING
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 54/81
43/64
VVCTRIYEKV--(1PMP) (SEQ ID No:3)
VTCKQVFKKVH-(1CRB) (SEQ ID No:4)
VTAIRNYKRLS-(IVYF) (SEQ ID No:5)
VTGWRLCENILA(OgLuc)(SEQ ID No:1 [00116]Usando a informação gerada nas abordagens acima descritas, os modelos de homologia da OgLuc foram gerados com base em três moldes de estruturas 3D de FABPs (1PMP, 1CRB, e 1VYF) usando o software Discovery Studio e MODELER (Accelrys Software Inc.).
[00117]A Figura 1 mostra os alinhamentos das estruturas secundárias das FABPs e da OgLuc. 1PMP, 1CRB, 1VYF são os códigos de acesso do Banco de Dados de Proteínas (www.rcsb.org) para as sequência das FABPs ilustrativas com estrutura 3D conhecida. PDB significa a designação da estrutura secundária proporcionada pelos autores que depositaram a informação da estrutura 3D no Banco de Dados de Proteínas. DSC significa a predição da estrutura secundária com base no método de DSC (King e col., Protein Science, 5:2298 (1996)). Kabasch e Sander significa a predição da estrutura secundária com base no método de Kabash e Sander (Kabasch e Sander, Biopolymers, 22:2577 (198)). As caixas vermelhas indicam a extensão aproximada dos elementos da estrutura secundária de hélices, as setas azuis indicam a extensão aproximada dos elementos da estrutura secundária de folhas beta, e as barras cinzas indicam a estrutura secundária que não de hélice ou folha beta. Os motivos da sequência, centrados sobre os resíduos conservados da marca estrutural da calicina (Flower e col., Biochem. Biophys. Acta., 16:1088(2000)), podem ser vistos nos alinhamentos. O MOTIVO 1 N-terminal mais altamente conservado inclui o resíduo de OgLuc Trp10, e o MOTIVO 2 C-terminal menos bem conservado inclui o resíduo de OgLuc N166. Para o segundo alinhamento, a porcentagem aproximada por pares das identidades das sequências de proteínas é:
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 55/81
44/64
OgLuc-1PMP 14%, OgLuc-1CRB 9%, e OgLuc-1VYF 15%.
[00118]A Figura 2 mostra os alinhamentos das estruturas secundárias de luciferase de dinoflagelado, FABP e OgLuc. 1VPR e 1HMR são os códigos de acesso do Banco de Dados de Proteínas (www.rcsb.org) para as sequências com estrutura 3D conhecida. 1VPR é o domínio da luciferase de dinoflagelado 3 e 1 HMR é a FABP do músculo humano, a proteína mais intimamente relacionada à luciferase de dinoflagelado (Schultz e col., PNAS USA, 102:1378 (2005)). Kabasch e Sander significa a predição da estrutura secundária com base no método de Kabash e Sander (Kabasch e Sander, Biopolymers, 22:2577 (1983)). As caixas vermelhas indicam a extensão aproximada dos elementos da estrutura secundária de hélices, as setas azuis indicam a extensão aproximada dos elementos da estrutura secundária de folhas beta, e as barras cinzas indicam a estrutura secundária que não de hélice ou folha beta. 1VPR tem SEQ ID No:21; 1 HMR tem SEQ ID No:22.
[00119]A Figura 3 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de OgLuc e diversas FABPs (SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, e 17-20, respectivamente) com base na sobreposição da estrutura 3D das FABPs.
Exemplo 2 [00120]As proteínas de ligação ao ácido graxo (FABPs) pertencem à superfamília das proteínas calicinas. As calicinas não têm nenhuma similaridade global significativa no nível de sequência, porém compartilham uma estrutura de barril beta relacionada com uma marca estrutural distinta: uma arginina ou lisina (próxima à extremidade de C) que é capaz de formar diversas ligações de hidrogênio potenciais com as carbonilas da cadeia principal de uma hélice 310 curta e agrupa-se através de um triptofano conservado (próximo à extremidade N-terminal) (Flower e col., Biochem. Biophys. Acta, 1482:9 (2000)). No modelo de OgLuc gerado no Exemplo 1, a marca estrutural da calicina está somente parcialmente presente. O triptofano conservado (T rp 10), próximo à extremidade N-terminal (tal como um em uma folha beta N-terminal
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 56/81
45/64 de um barril beta), agrupa-se através de uma asparagina (Asn166) em vez de uma arginina ou lisina próxima à extremidade de C (tal como uma em uma folha beta Cterminal de um barril beta). O presente modelo prediz que a cadeia lateral de asparagina mais curta parece incapaz de formar ligações de hidrogênio com os resíduos próximos à extremidade N-terminal (na folha beta N-terminal do barril beta). Os modelos de OgLuc, onde foram feitas as substituições Asn166Arg e Asn166Lys, demonstraram que as cadeias laterais de arginina e lisina mais longas na OgLuc devem ser capazes de formar uma ou mais ligações, p.ex., uma ou mais ligações de hidrogênio, com as carbonilas da cadeia principal e/ou as cadeias laterais dos resíduos próximos à extremidade N-terminal. Por exemplo, elas podem formar uma ou mais ligações de hidrogênio com os resíduos da OgLuc Asp9 e/ou Gly8 e/ou Asp5 próximos à extremidade N-terminal. Adicionalmente, elas podem formar uma ou mais ligações de hidrogênio com um ou mais resíduos em outros elementos da estrutura secundária que estão em proximidade espacial estreita à posição 166, p.ex., Asn144 e/ou Gly147. Assim, a restauração da marca estrutural da calicina na OgLuc com uma mutação de Asn166Arg ou Asn166Lys pode ligar conjuntamente, de modo efetivo, as duas extremidades do barril beta (ou folhas beta terminais do barril beta) e possivelmente outros elementos da estrutura secundária. Isto pôde melhorar a estabilidade global da estrutura da proteína, e, desse modo, a atividade da OgLuc.
[00121]Uma sequência da proteína de OgLuc ilustrativa é
FTLADFVGDW QQTAGYNQDQ VLEQGGLSSL FQALGVSVTP IQKVVLSGEN GLKADIHVII PYEGLSGFQM GLIEMIFKVV YPVDDHHFKI ILHYGTLVID GVTPNMIDYF GRPYPGIAVF DGKQITVTGT LWNGNKIYDE RLINPDGSLL FRVTINGVTG WRLCENILA (SEQ ID No:1; 169 aminoácidos, negrito de Asn166 sublinhado).
[00122]Uma sequência de nucleotídeos da OgLuc ilustrativa é atggtgtttaccttggcagatttcgttggagactggcaacagacagctggatacaaccaagatcaagtgtta
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 57/81
46/64 gaacaaggaggattgtctagtctgttccaagccctgggagtgtcagtcaccccaatccagaaagttgtgctgtctgggg agaatgggttaaaagctgatattcatgtcatcatcccttacgagggactcagtggttttcaaatgggtctgattgaaatgat cttcaaagttgtttacccagtggatgatcatcatttcaagattattctccattatggtacactcgttattgacggtgtgacacc aaacatgattgactactttggacgcccttaccctggaattgctgtgtttgacggcaagcagatcacagttactggaactct gtggaacggcaacaagatctatgatgagcgcctgatcaacccagatggttcactcctcttccgcgttactatcaatgga gtcaccggatggcgcctttgcgagAACattcttgcc (SEQ ID No:2).
[00123]O códon AAC de SEQ ID No:2, que está escrito em letras maiúsculas na listagem acima, corresponde à posição de aminoácido 166 na sequência de OgLcu do tipo selvagem madura de SEQ ID No:1. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No:2 também inclui um códon ATG (metionina/sinal de partida) e um códon GTG (valina) no início por conveniência de uso nos sistemas de expressão. Todavia, a numeração do aminoácido, usada por todo este pedido para identificar os resíduos substituídos, é dada em relação à sequência de polipeptídeos de OgLuc do tipo selvagem madura de SEQ ID No:1. A sequência de OgLuc do tipo selvagem de ocorrência natural pode ser inicialmente sintetizada com outros aminoácidos, os quais são posteriormente clivados, resultando na geração de um polipeptídeo do tipo selvagem maduro, tal como mostrado em SEQ ID No:1. Por exemplo, uma sequência de sinal (p.ex., para dirigir a proteína nascente para uma organela particular, tal como o retículo endoplásmico, e/ou para dirigir a proteína para a secreção) pode estar presente no início da proteína nascente e pode então ser clivada para produzir a proteína do tipo selvagem madura.
[00124]Um alinhamento ilustrativo de OgLuc e três FABPs é mostrado abaixo. --SNKFLGTWKLVSSENFDEyMKALGVGLATRKLGNLAKPRVIISKKG......
DIITIRTESP-----------PVDFNGYWKMLSNENFEEYLRALDVNVALRKIANLLKPDKEIVQDG-----DHMIIRTLST---------GSMSSFLGKWKLSESHNFDAVMSKLGVSWATRQIGNTVTPTVTFTMDG-----Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 58/81
47/64
DKMTMLTEST..........
FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADI HVIIPYEGLSGFQMGLIE
33 44 54
.............FKNTEISFKLGQEFEETTA.....DNRKTKSTVTLAR-GSLNQVQKWNGNETTIKRKLV.............FRNYIMDFQVGKEFEEDLT---GIDDRKCMTTVSWDG-DKLQCVQKGEKEGRGWTQWIE.............FKNLSCTFKFGEEFDEKTS.....DGRNVKSVVEKNSESKLTQTQVDPKNTTVIVREVD-MIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTL-VIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDG-KQITVTGTLWNGNKIYDERLINP
114 115 124 135
DGKMVVECKMKDVVCTRIYEKV-- (SEQ ID No:3) GDELHLEMRAEGVTCKQVFKKVH- (SEQ ID No:4) GDTMKTTVTVGDVTAIRNYKRLS- (SEQ ID No:5) KGSLLFRVTINGVTGWRLCENILA (SEQ ID No:1)
Exemplo 3 [00125]Geração de Variantes de Luciferase Modificada com Luminescência Melhorada [00126]Salvo indicação em contrário, as variantes da sequência de OgLuc de partida com substituições aleatórias foram geradas usando o sistema mutagênico baseado na PCR, propensa a erros, Kit de Mutagênese Aleatória GeneMorph II (Stratagene; Daughtery, PNAS USA 97(5):2029 (2000)), de acordo com as instruções do fabricante, e saturação de NNK, conforme conhecido nas técnicas. As variantes resultantes foram construídas no contexto do vetor pF1K Flexi® para a expressão
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 59/81
48/64 baseada em T7 (Promega Corp.) e foram usadas para transformar a E. coli KRX usando práticas conhecidas na técnica. A biblioteca resultante foi expressa em E. coli e examinada quanto às variantes que tinham melhorado a emissão de luz em comparação com a proteína OgLuc de partida. As práticas padrões de seqüenciamento, conhecidas na técnica, foram usadas para identificar a substituição de aminoácido em cada clone de interesse.
[00127]As variantes de uma sequência de OgLuc de partida com mutações específicas foram geradas usando o kit de mutagênese sítio-dirigida baseado em oligo QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene; Kunkel, PNAS USA 82(2):488 (1985)), de acordo com as instruções do fabricante.
Exemplo 4 [00128]Métodos para Medir a Emissão de Luz e a Estabilidade do Sinal [00129]Os clones de E. coli contendo as variantes de luciferase modificada codificando o DNA de plasmídio com substituições de aminoácidos em OgLuc foram desenvolvidos em uma placa de 96 cavidades e induzidos com indução por abandono (walk away), i.e., autoindução (Shagat e col., KRX Autoinduction Protocol: A Convenient Method for Protein Expression, Promega Notes 98:17 (2008)) por 17 horas. Cada variante e a luciferase de partida correspondente tinham 6 réplicas na cavidade. As células foram lisadas usando um tampão de lise consistindo em HEPES a 150 mM pH 8,0, tiouréia a 100 mM, 0,1X PLB (Promega Corp. Cat. No E194A), 0,1 mg/mL de lisozima e 0,001 U/pL de RQ1 DNase, e medidas quanto à luminescência usando os reagentes de substrato da luciferase de Renilla (Promega Corp.) sobre um luminômetro Infinite 500 Tecan. As medições foram tomadas imediatamente após a adição, com injeção, de um tampão de ensaio de 0,5% de tergitol Glo (0,5% de tergitol), que contém KCl a 150 mM, CDTA a 1 mM, DTT a 10 mM, 0,5% de tergitol, coelenterazina a 20 pM (Promega Corp.)), ou um tampão RLAB Flash (Promega Corp.) contendo coelenterazina a 20 pM (Promega Corp.) (RLAB) à amostra de
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 60/81
49/64 lisado. Esta medição da luminescência, tomada imediatamente após a adição, é a medição no ponto de tempo T=0 e, em diversas modalidades, é tomada como uma medida da emissão total de luz (luminescência) gerada pela amostra. A luminescência média das 6 réplicas foi comparada entre as variantes com aquela da luciferase de partida correspondente. Em diversas modalidades, as medições da luminescência foram normalizadas para a luciferase de partida correspondente de interesse, por exemplo, a OgLuc sintética, e referidas, em certas modalidades, como número de vezes (i.e., 2 vezes, 3 vezes, 4,5 vezes, etc.) de melhora, aumento, ou similar.
[00130]A estabilidade do sinal de um clone da variante foi determinada por releitura da placa múltiplas vezes após a adição do tampão de ensaio à amostra, por exemplo, medindo a luminescência de 30 em 30 segundos ou de 1 em 1 minuto, por um espaço de tempo. A meia vida do sinal foi determinada usando estas medições e a média das 6 réplicas foi comparada entre as variantes com a luciferase de partida correspondente. A meia vida indicando a estabilidade do sinal foi normalizada para a luciferase de partida correspondente de interesse, por exemplo, a OgLuc.
Exemplo 5 [00131]Método de Medir a Estabilidade da Proteína, i.e., a Termoestabilidade [00132]As amostras de lisado foram preparadas a partir de culturas induzidas, conforme descrito no Exemplo 4. As amostras de lisado nas placas de 96 cavidades de réplicas foram incubadas em diversas temperaturas, incluindo, por exemplo, em 22, 30, 37, 42, 50 ou 54°C. Em diferentes pontos de tempo, as placas foram colocadas a -70°C. Antes de medir a luminescência conforme descrito no Exemplo 4, cada placa foi descongelada na TA, i.e., 22°C, por 10 minutos. As amostras foram testadas com o tampão de ensaio de 0,5% de tergitol descrito no Exemplo 4. A medição em T=0, conforme descrito no Exemplo 4, para cada placa no ponto de tempo, foi usada para determinar a meia vida da proteína. A meia vida, que indica a estabilidade da proteína, foi normalizada para a luciferase de partida correspondente de interesse, por exemplo,
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 61/81
50/64 a OgLuc.
Exemplo 6 [00133]Geração de uma Luciferase Modificada com Emissão de Luz Melhorada [00134]Para examinar se a restauração da marca estrutural da calicina na OgLuc poderia melhorar a estabilidade e a atividade globais da proteína, foram projetadas versões sintéticas da sequência de OgLuc. As versões sintéticas incluíam o uso de um códon otimizado para E. coli e células mamíferas e códons para Asn substituída por Arg ou Lys na posição 166. Conforme mencionado anteriormente, a numeração é baseada na SEQ ID No:1. A otimização do códon (para E. coli) e as alterações dos nucleotídeos para o códon 166 para Arg ou Lys foram engenheiradas por meios sintéticos (Gene Dynamics, LLC). No clone OgLuc+N166R, o códon AAC foi alterado para CGT (para codificar a Arg). No clone OgLuc+N166K, o códon AAC foi alterado para AAA (para codificar a Lys).
[00135]Os genes de OgLuc sintéticos foram subclonados em um vetor adequado para a superexpressão em lisados de bactérias ou reticulócitos de coelho TnT® (Promega Corp.; vetor pF1K Flexi® para sistemas de expressão baseados em T7), e usados para transformar a E. coli KRX. As colônias individuais foram selecionadas, desenvolvidas, induzidas com ramnose, lisadas usando lisozima e um único congelamento-descongelamento, e medidas quanto à luminescência usando os reagentes de substrato da luciferase de Renilla (Promega Corp.) sobre um luminômetro Veritas. As reações do reticulócito de coelho TnT® foram realizadas de acordo com os protocolos do fabricante (Promega Corp.) e medidas no mesmo modo que os lisados bacterianos.
[00136]Os mutantes foram comparados com a proteína OgLuc parental (i.e., de partida) sintética quanto à produção de emissão de luz total (luminescência). Na E. coli, observou-se uma melhora de 5 vezes e 10 vezes (N166K e N166R,
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 62/81
51/64 respectivamente) na luminescência com a coelenterazina como um substrato. Nos lisados de TnT®, a melhora foi entre 4 vezes e 7 vezes (N166K e N166R). Estas sequências (contendo Arg ou Lys na posição 166) representam variantes da OgLuc que resultam na estabilidade melhorada.
[00137]As diversas variantes da OgLuc com uma substituição de aminoácido na posição 166 foram analisadas quanto ao brilho, p.ex., examinadas quanto às variantes que eram pelo menos 1,2x mais brilhantes do que a OgLuc do tipo selvagem. As substituições a seguir produziram uma variante que era pelo menos 1,2x mais brilhante do que a OgLuc do tipo selvagem: N166K; N166R; N166A; N166L; N166P; N166Q; e N166S. (Ver a Tabela 1). A Tabela 1 mostra que a variante mais brilhante, conforme indicado pela melhora no número de vezes sobre a OgLuc do tipo selvagem, tinha a substituição de aminoácido N166R.
Tabela 1: Resumo do número de vezes de melhora na luminescência das variantes de OgLuc com substituição de aminoácido na posição 166 sobre a OgLuc
Figure BRPI1010019B1_D0001
como descrita no Exemplo 3, da variante de OgLuc+N166R resultou em variantes com brilho melhorado, p.ex., pelo menos 1,2x mais brilhantes, em relação à variante de
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 63/81
52/64
OgLuc+N166R. A Tabela 2 resume estas variantes que compreendiam a substituição de N166R, bem como uma das seguintes substituições nos resíduos 2 (S), 4 (E, S, R, G, D, T ou L), 11 (R, V, I, L, K ou T), 33 (K), 44 (I ou L), 45 (E), 54 (F, T, V, G, W, S, ou L), 68 (V, Y),75 (R, K, Q, G, T ou A), 104 (L), 115 (E, I, Q, L, V, G, H, R, S, C, A, ou T), 124 (K), 135 (K), 138 (V, I, N, T, L, C, R, M ou K), 139 (E), 167(V), ou 169 (L). A Tabela 2 mostra o número de vezes de melhora no número de vezes de melhora na luminescência da variante sobre a variante de OgLuc+N166R de partida correspondente, usando RLAB, usando uma média do sinal na faixa de 4-6 minutos após iniciar a reação, p.ex., após injeção do substrato. Para cada substituição de aminoácido listada, a substituição mais melhorada é listada primeiramente e a substituição menos melhorada listada no fim. As variantes que mostraram a maior melhora incluíram as variantes contendo uma substituição no resíduo 4, 54, ou 138.
Tabela 2: Resumo do número de vezes de melhora na luminescência das
variantes de OgLuc+N16 5R sobre a OgLuc+N166R de partida correspondente.
Posição Aminoácido Códon Número de vezes que o brilho é melhorado (RLAB), média de 4-6 min (em rel. à N166R)
2 S TCC 9
4 E GAG 20
4 S AGT 7
4 R AGG 6
4 G GGG 4
4 D GAT 4
4 T ACG 3
4 L CTG 3
11 R CGG 13
11 V GTG 6
11 I ATT 6
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 64/81
53/64
11 L CTT 3
11 K AAG 3
11 T ACT 2
33 K AAG 10
44 I ATT 25
44 L CTT 2
45 E GAG 2
54 F TTT 10
54 T ACT 8
54 V GTT 6
54 G GGG 5
54 S AGT 4
54 W TGG 3
54 L TTG 2
68 V GTT 2
68 Y TAT 3
72 Q CAG 3
75 R AGG 6
75 K AAG 5
75 Q CAG 5
75 G GGT 4
75 T ACG 4
75 A GCG 4
104 L CTT 10
115 E GAG 20
115 I ATT 4
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 65/81
54/64
115 Q CAG 3
115 L CTT 3
115 V GTT 3
115 G GGG 3
115 H CAT 3
115 R CGG 2
115 S AGT 2
115 C TGT 2
115 A GCT 2
124 K AAA 8
135 K AAG 10
138 V GTG 10
138 I ATT 8
138 T ACG 6
138 L CTG 5
138 C TGT 6
138 R CGG 5
138 M ATG 4
138 K AAG 3
139 E GAG 13
167 V GTT 40
169 L TTG 10
[00139]As variantes adicionais da variante de OgLuc+N166R tinham mais do que uma substituição de aminoácido. Estas variantes adicionais são listadas na Tabela 2 com as substituições de aminoácidos listadas e o número de vezes de melhora na luminescência da variante de OgLuc+N166R sobre a N166R OgLuc de partida correspondente. As variantes adicionais foram encontradas, as quais incluíam
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 66/81
55/64 as mutações silenciosas, i.e., alterações nos nucleotídeos que não alteraram o aminoácido codificado naquele códon.
Tabela 3: Resumo do número de vezes de melhora na luminescência das variantes de OgLuc+N166R com mais do que uma substituição de aminoácido e/ou
mutações silenciosas sobre a OgLuc+N166R de partida correspondent
Aumento sobre N166R Alteração do aminoácido a partir de N166R (códons)
6 E23V (gta), S28P (cct), I143V (ctc)
15 A4S (gca), L34M (atg), I76V(gtc)
2 G51V (gtt), I99V (gtt)
13 L3L(tta), S37S(tcg), V44V(gta)
5 L3L(tta), L27M(atg)
5 L3L(tta)
4 L3L(tta), Q32L(cta), K43R(aga)
3 L72Q(cag), G10G(ggt)
2 N144K(aag), A54A(gca)
Exemplo 7 [00140]Avaliação das Substituições Específicas nas Luciferases Modificadas [00141 ]As variantes de OgLuc adicionais foram geradas por mutagênese sítiodirigida, conforme descrito no Exemplo 3, para ter uma substituição em uma das seguintes posições: 2, 4, 11, 44, 54, 90, 115, 124 ou 138 em relação à SEQ ID No:1. As substituições nestas posições em combinação com N166R foram mostradas no Exemplo 6 terem emissão de luz total (luminescência) melhorada em comparação com a OgLuc do WT. Nas Figuras 5A-5C, 6A-6C, 7A-7C, 8, 9A-9D, 10A-10C,11A-11B, 12A-12B e 33A-33E, WT, N166R, e T2T referem-se às proteínas codificadas pelas SEQ ID NOS:2, 14 e 32, respectivamente, T2T+N166R refere-se à proteína codificada pela SEQ ID No:32, que tem uma substituição em N166R, A4E, Q11R,
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 67/81
56/64
V44I, A54F, A54F+N166R, A54I, P115E, P155E+N166R, Y138I, Q124K, Y138C+N166R, e I90V, cada um, referem-se à proteína codificada pela SEQ ID No:2 tendo uma substituição nos resíduos respectivos indicados na coluna Amostra na Figura 5A. Estas variantes foram avaliadas medindo-se a luminescência, conforme descrito no Exemplo 4. As Figuras 5A-5C e 7A-7C resumem a luminescência média em T=0 das variantes de OgLuc do WT usando 0,5% de tergitol (Figs. 5A-5C) ou RLAB (Figs. 7A-7C). O aumento na luminescência das variantes sobre a OgLuc do WT é mostrado nas Figuras 6A-B (0,5% de tergitol) e na Figura 8 (RLAB). O aumento na luminescência das variantes sobre a variante de N166R é mostrado nas Figuras 33A (0,5% de tergitol) e 33B (RLAB). As Figuras 5B, 6B, e 7B mostram os mesmos dados que as Figuras 5C, 6C, e 7C, respectivamente, porém em escalas diferentes para permitir que as barras menores sejam vistas mais claramente.
[00142]Para determinar se as substituições de aminoácidos nas diferentes variantes também tinham um efeito sobre a estabilidade do sinal, a estabilidade do sinal foi medida para cada variante. A estabilidade do sinal das variantes foi medida conforme descrito no Exemplo 4 e mostrada nas Figuras 9A-9C (0,5% de tergitol) e nas Figuras 10A-10C (RLAB) como a emissão de luz total (luminescência) ao longo do tempo. A meia vida do sinal de cada variante foi determinada a partir deste dado e mostrada na Figura 9D (0,5% de trgitol) e nas Figuras 11A-11B (RLAB). A meia vida do sinal para cada variante foi normalizada para a variante de N166R e mostrada na Figura 33C.
[00143]Para determinar se as substituições de aminoácidos nas diferentes variantes também tinham um efeito sobre a estabilidade da proteína (i.e., termoestabilidade), a estabilidade da proteína de cada variante, a 22°C, foi medida conforme descrito no Exemplo 5 e mostrada nas Figuras 12A-12B. Em 22°C, a proteína variante de OgLuc A54F+N166R teve uma meia vida de 178 minutos, enquanto a variante de OgLuc P115E+N166R teve uma meia vida de quase 120
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 68/81
57/64 minutos, em comparação com a OgLuc do WT, que teve uma meia vida de 38 minutos.
[00144]A Figura 33D resume a meia vida em minutos, a 22°C, das variantes de OgLuc comparadas à OgLuc do WT, mostrada nas Figuras 12A-B e 17, normalizada para a variante de N166R.
[00145]A Figura 33E resume o aumento na luminescência, a meia vida do sinal e a meia vida a 22°C mostrados nas Figuras A-D.
Exemplo 8 [00146]Avaliação das Substituições Específicas nas Luciferases Modificadas [00147]As variantes de OgLuc sintéticas adicionais foram geradas com substituições nos sítios 33 e 68. Especificamente, as substituições em A33K e F68Y foram feitas na OgLuc do WT (identificadas como WT A33K e WT F68Y nas Figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, e 33A-33E) e na sequência da variante de OgLuc+N166R (identificadas como N166R A33K e N166R F68Y nas Figuras 13A13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, e 33A-33E) e comparadas com a OgLuc do WT de partida correspondente (identificada como WT nas Figuras 13A-13B, 14A14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, e 33A-33E) e a variante de OgLuc+N166R (identificada como N166R nas Figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, e 33A-33E). A luminescência média em T=0 das variantes de OgLuc A33K e F68Y usando 0,5% de tergitol e RLAB é mostrada nas Figuras 13A e 13B, respectivamente. As variantes A33K e F68Y tiveram a maior luminescência em comparação com a OgLuc de partida correspondente, conforme adicionalmente mostrado com o aumento na luminescência das variantes sobre a OgLuc do WT nas Figuras 14A (0,5% de tergitol) e 14B (RLAB). A A33K e a F68Y separadamente na base do tipo selvagem mostraram um aumento de 1,6 e 1,7 vez sobre a WT usando RLAB (ver a Figura 14B) e um aumento de 3,8 e 3,9 vezes sobre a WT com 0,5% de tergitol (Figura 14A). A A33K e a F68Y separadamente na base de OgLuc+N166R mostraram um aumento de 5,1 e 3,3 vezes sobre a OgLuc do WT usando RLAB (ver a Figura 14B) e um aumento de 9,2 e 5
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 69/81
58/64 vezes sobre a OgLuc do WT usando 0,5% de tergitol (Figura 14A).
[00148]O aumento na luminescência das variantes sobre a variante de OgLluc+N166R é mostrado nas Figuras 33A (RLAB) e 33B (0,5% de tergitol). A substituição A33K na base do tipo selvagem mostrou um aumento de 2,6 (0,5% de tergitol) e 0,6 (RLAB) vezes na luminescência sobre a variante de OgLuc+N166R (ver as Figuras 33A e 33B). A substituição F68Y na base do tipo selvagem mostrou um aumento de 2,7 (0,5% de tergitol) e 0,7 (RLAB) vezes sobre a variante de OgLuc+N166R (ver as Figuras 33A e 33B). A substituição A33K na base variante de OgLuc+N166R mostrou um aumento de 6,3 (0,5% de tergitol) e 2,0 (RLAB) vezes sobre a variante de OgLuc+N166R (ver as Figuras 33A e 33B). A substituição F68Y na base de OgLuc+N166R mostrou um aumento de 3,4 (tergitol) e 1,3 (RLAB) sobre N166R (ver as Figuras 33A e 33B).
[00149]A estabilidade do sinal das variantes A33K e F68Y foi medida conforme descrito no Exemplo 4, usando 0,5% de tergitol (Figuras 15A-15B) e RLAB (Figuras 16A-16B). A meia vida do sinal da variante A33K na base de OgLuc do WT foi maior do que a meia vida da OgLuc do WT, porém menor na base variante de OgLuc+N166R quando usando 0,5% de tergitol (Figura 15B) ou RLAB (Figura 16B). A meia vida do sinal da variante F68Y na base de OgLuc do WT foi maior do que a meia vida da OgLuc do WT usando 0,5% de tergitol (Figura 16B), porém menor em qualquer base usando RLAB (Figura 15B).
[00150]A estabilidade da proteína (i.e., a termoestabilidade) das variantes A33K e F68Y foi medida conforme descrito no Exemplo 5, a 22°C, e mostrada na Figura 17. As substituições A33K e F68Y na base variante de N166R tiveram uma meia vida mais longa, especificamente 72 e 78 minutos, em comparação com a OgLuc do WT e a variante de N166R, que foi 55 e 67 minutos, respectivamente (Figura 17). As substituições A33K e F68Y na base de OgLuc do WT tiveram meias vidas de 58 e 57 minutos, respectivamente (Figura 17).
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 70/81
59/64
Exemplo 9 [00151]Avaliação de Combinações de Núcleo Específicas de Substituições nas Luciferases Modificadas - Emissão de Luz [00152]Para determinar se uma combinação de duas ou mais substituições de aminoácidos na OgLuc proporciona uma melhora adicional na luminescência, foram geradas diferentes variantes (designadas C1-C3) de OgLuc contendo as seguintes substituições de aminoácidos: N166R, Q11R, A33K, A54F, P115E, Q124K, Y138I e V44I (o resíduo 44 pode entrar em contato com o substrato), C2: V45E, N135K, I167V, P104L, e D139E (observar que 2 destas estão em locais que podem entrar em contato com o substrato); C3; S28P, L34M, G51V, I99V, e I143L. Estas variantes de Combinação de Núcleo foram geradas por mutação da OgLuc T2T por mutagênese sítio-dirigida, conforme descrito no Exemplo 3. A variante C1 foi adicionalmente mutada para conter uma substituição de aminoácido A4E para criar a variante C1+A4E. As combinações destas variantes foram também criadas com as substituições A4E, p.ex., C1+C2+A4E e C1+C3+A4E. Estes clones recombinantes foram construídos usando a mutagênese sítio-dirigida baseada em oligonucleotídeo, seguida por subclonagem no vetor pF4Ag (contém os promotores de T7 e CMV; pF4A comercialmente disponível, modificado para conter um sítio de ligação ao ribossomo de E. coli). Todas as variantes foram examinadas em células de E. coli. Resumidamente, os clones foram superexpressos na E. coli KRX, após o que as células foram lisadas e medidas quanto à luminescência usando a coelenterazina como um substrato. A variante de OgLuc N166R e a luciferase de Renilla foram também examinadas. Ambas as variantes C1, C1+A4E e C1+C3+A4E ,eram aproximadamente 4 logs mais brilhantes do que a variante de OgLuc N166R e pelo menos tão brilhantes quanto a luciferase de Renilla (Figuras 4A-4D). A emissão de luz total (i.e., a luminescência) destas variantes de Combinação de Núcleo em T=0 foi medida conforme descrito no Exemplo 4, usando 0,5% de tergitol Flash (Figura 4A)
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 71/81
60/64 e o RLAB Glo (Figura 4B).
[00153]É mostrado um alinhamento das sequências de proteína (Figura 31) e nucleotídeos (Figura 32) da nativa, WT, N166R, C1, C1+C2, C1+A4E, C1+C2+A4E, e C1+C3+A4E.
[00154]Uma substituição adicional foi introduzida em C1+A4E e C1+C3+A4E. Especificamente, o resíduo de A54F nestas variantes foi trocado para F54T. Estas variantes, C1+A4E+F54T e C1+C3+A4E+F54T, foram comparadas com C1+A4E e C1+C3+A4E de partida, correspondentes, bem como as luciferases de Renilla e OgLuc do WT, usando o método do Exemplo 4. Conforme visto nas Figuras 18A, 18B e 19, as variantes com a substituição F54T tiveram uma diminuição de 50-75% com 0,5% de tergitol e um aumento de cerca de 2-5 vezes na luminescência com o RLAB, em comparação com a WT (ver a medição em T=0 nas Figuras 18A e 19, respectivamente). A adição da substituição F54T mostrou uma emissão de luz total melhorada com o RLAB, porém mostrou um declínio mais rápido ao longo do tempo (Figura 19). Com 0,5% de tergitol, o declínio ao longo do tempo é similar à C1+A4E, porém as RLU's são menores em comparação com C1+A4E (figuras 18A-18B).
[00155]A luminescência das variantes C1, C1+A4E, C1+C2, e C1+C2+A4E, em comparação com a luciferase de Renilla, a OgLuc do WT, a T2T e a variante A54F, foi medida usando o método descrito no Exemplo 4. (Figuras 20A e 20B). As variantes C1+A4E e C1+C2+A4E tiveram um aumento de 4 e 2 logs, respectivamente, sobre a WT, usando 0,5% de tergitol (Figura 20A). As variantes C1+A4E, C1+C2+A4E, e C1+C3+A4E tiveram um aumento de 3, 1,5, e 3 logs, respectivamente, sobre a WT, usando o RLAB (Figura 20B). Um tampão de 0,25% de tergitol foi usado em vez de 0,5% de tergitol, para determinar a estabilidade do sinal, não se valendo do tergitol. A Figura 21 mostra as variantes C1, C1+A4E, C1+C2, e C1+C2+A4E tendo um aumento de 4, 4, 2, e 2 logs, respectivamente, sobre a WT, usando 0,25% de tergitol.
[00156]As variantes C1, C1+A4E, C1+C2, e C1+C2+A4E, em comparação
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 72/81
61/64 com a luciferase de Renilla, a OgLuc do WT, a T2T e as variantes OgLuc+A54F, foram também avaliadas em células HEK 293. Resumidamente, as células HEK293, preparadas a 15.000 células/poço em uma placa de 96 poços, foram transfectadas transientemente usando TransIT-LTI (mirus Bio) com DNAs de plasmídio codificando as diversas variantes e/ou as sequências de controle. Os mesmos plasmídios também carregaram um gene para a expressão constitutiva da luciferase de vagalume, para atuar como um controle da transfecção. Resumidamente, as células foram desenvolvidas, lisadas e tratadas conforme descrito no Exemplo 4. As células foram cotransfectadas com pGL4.13 para o controle da transfecção de vagalume (usou-se 0,04 ug/transfecção ou 10% do DNA total transfectado). A luminescência foi medida conforme descrito no Exemplo 4, usando RLAB (Figura 22) ou 0,25% de tergitol (Figura 23). Todo o dado da luciferase modificada foi então normalizado para a eficiência da transfecção usando a luminescência da luciferase de vagalume (substrato de luciferina) (Figuras 22 e 23). Todas as variantes C1, C1+A4E, C1+C2, e C1+C2+A4E tiveram maior luminescência comparadas à OgLuc em 0,5% de tergitol (Figura 22). As variantes C1+A4E e C1+C2+A4E também tiveram maior luminescência comparadas à OgLuc em 0,25% de tergitol (Figura 23).
Exemplo 10 [00157]Avaliação das Combinações Específicas de Substituições nas Luciferases Modificadas - Estabilidade da Proteína [00158]Para determinar se as substituições de aminoácidos nas diferentes variantes também tinham um efeito sobre a estabilidade da proteína, as diferentes variantes foram examinadas em diferentes temperaturas, e o efeito sobre a estabilidade medido. Conforme mostrado na Figura 24, na temperatura ambiente (aproximadamente 22°C), a OgLuc do tipo selvagem mostrou uma meia vida da proteína de 1 hora, enquanto a variante C1 mostrou uma meia vida da proteína de 9,4 horas. Conforme mostrado na Figura 24, a 30°C, a variante de OgLuc N166R teve uma meia vida de
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 73/81
62/64 proteína de 21 minutos, enquanto a variante C1+A4E não mostrou nenhum declínio após 6 horas. Em 30°C, a meia vida da proteína para a luciferase de Renilla foram 7,9 horas. A classificação da estabilidade a 30°C é OgLuc C1+A4E> luciferase de Renilla>OgLuc N166R. Conforme mostrado na Figura 24, a 37°C, a meia vida da proteína da variante de OgLuc N166R foram 2 minutos, enquanto nenhum declínio foi visto na variante C1+A4E. Em 54°C, as meias vidas da proteína das diferentes variantes foram como se segue: C1: 7 minutos, C1+A4E: 8 minutos, C1+C2+A4E: 128 minutos, e C1+C3+A4E: 24 minutos. As meias vidas da OgLuc do tipo selvagem e da variante de OgLuc N166R não puderam ser determinadas a 54°C porque elas eram muito instáveis.
Exemplo 11 [00159]Avaliação das Combinações Específicas de Substituições nas Luciferases Modificadas - Estabilidade do Sinal [00160]Para determinar se as substituições de aminoácidos nas diferentes variantes também tinham um efeito sobre a estabilidade do sinal, as diferentes variantes foram examinadas quanto à estabilidade do sinal. A estabilidade do sinal foi medida conforme descrito no Exemplo 4, usando RLAB. As seguintes meias vidas dos sinais foram determinadas para as diferentes variantes: OgLuc do tipo selvagem: 1,8 minutos, luciferase de Renilla: 0,8 minuto, C1: 1,7 minuto, C1+A4E: 1,7 minuto, C1+C2+A4E: 12,6 minutos, e C1+C3+A4E: 3,3 minutos (Figura 25).
Exemplo 12 [00161]Avaliação das Combinações Específicas de Substituições nas Luciferases Modificadas - Cor da Luminescência [00162]O comprimento de ondas ótimo com a maior luminescência usando a coelenterazina (Promega Corp.) como substrato foi determinado para as variantes OgLuc+N166R, C1+A4E e C1+C2+A4E, comparadas com a luciferase de Renilla. As amostras foram preparadas conforme descrito no Exemplo 4. O pico espectral foi
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 74/81
63/64 determinado medindo-se a luminescência em incrementos de 5 nm no comprimento de ondas usando um luminômetro Varioskan e 0,5% de tergitol. O dado foi normalizado pelo mais alto valor de RLU no espectro. Conforme mostrado na Figura 26, a Renilla tem um pico espectral de 480 nm, enquanto OgLuc+N166R, C1+A4E e C1+C2+A4E têm um pico espectral em 465 nm, que é um deslocamento da OgLuc nativa, que foi previamente descrito ser 455 nm (Inouye, FEBS Letters, 481(1):19-25 (2000)).
Exemplo 13 [00163]Geração de uma Luciferase Modificada com Luminescência Melhorada [00164]Foram geradas variantes adicionais por mutagênese aleatória, conforme descrito no Exemplo 3, da variante de C1+A4E. A emissão de luz total foi medida como descrito no Exemplo 4. As variantes de C1+A4E ilustrativas (i.e., aquelas que são pelo menos 1,2 vezes mais brilhantes do que a C1+A4E), porém não estão limitadas às, são listadas nas Figuras 27A e 27B por Amostra ID e pela substituição de aminoácido. As variantes de C1+A4E com substituições de aminoácidos na posição 20, 54, 72, 77, 79, 89, 90, ou 164 em relação à SEQ ID No: 1 mostraram um aumento de pelo menos 1,9 vezes na luminescência sobre a variante de C1+A4E de partida correspondente.
[00165]O clone 29H7, que continha a variante de C1+A4E+F54I, foi adicionalmente testado quanto à estabilidade da proteína, a 50°C, usando o método descrito no Exemplo 5. O clone 29H7 teve uma meia vida mais longa do que a variante de C1+A4E de partida correspondente (Figura 30).
[00166]Diversas variantes de C1+A4E com uma substituição de aminoácido na posição 92 foram analisadas quanto ao brilho, p.ex., examinadas quanto às variantes que eram pelo menos 1,2 vezes mais brilhantes do que a variante de C1+A4E. As substituições a seguir produziram uma variante que era pelo menos 1,2 vezes mais
Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 75/81
64/64 brilhante do que C1+A4E: L92G; L92Q; L92S; e L92A, e teve um aumento de 2,2, 2, 2,9 e 2,5 vezes sobre C1+A4E, respectivamente (ver a Figura 28).
[00167]Foram geradas variantes adicionais por mutagênese sítio-dirigida, descrita no Exemplo 3, da variante de C1+A4E, para terem combinações específicas das substituições F54I, F68S, M75K e I90V. Conforme mostrado na Figura 29, que lista as variantes (Amostra ID) e as substituições de aminoácidos verificadas em cada variante, estas combinações das substituições mostram um aumento significativo na luminescência de pelo menos 17,5 a 19,3 vezes sobre a variante de C1+A4E de partida correspondente.
[00168]Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patentes são incorporados neste documento por referência. Embora no relatório descritivo precedente esta invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades preferidas dela, e muitos detalhes tenham sido apresentados para propósitos de ilustração, será aparente para aqueles versados na técnica que a invenção está suscetível a modalidades adicionais e que certos dos detalhes neste documento podem ser variados consideravelmente, sem sair dos princípios básicos da invenção. Uma variante de combinação específica adicional de C1+A4E foi gerada para incluir 190V e F54I (IV). Conforme mostrado na Figura 34A, IV teve um aumento de cerca de 20 vezes na luminescência comparada à variante de C1+A4E de partida correspondente, como medido usando o método do Exemplo 4. Conforme mostrado na Figura 34B, a proteína IV era mais estável do que a luciferase de Renilla, a 50°C, visto que a meia vida para IV era 27,2 minutos comparada à Renilla, que era 9,6 minutos, usando o método do Exemplo 5.
[00169]As diversas características e vantagens da invenção são apresentadas nas reivindicações a seguir.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polipeptídeo de luciferase modificada CARACTERIZADO pelo fato de que compreende substituições em relação a uma luciferase de Oplophorus do tipo selvagem de SEQ ID NO:1 nas posições 2, 4, 11,20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51,54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167 e/ou 169, em que o polipeptídeo de luciferase modificada tem pelo menos um dentre luminescência melhorada, estabilidade do sinal melhorada e estabilidade da proteína melhorada em relação à luciferase de Oplophorus do tipo selvagem.
  2. 2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de luciferase modificada codificada tem luminescência melhorada em relação à luciferase de Oplophorus do tipo selvagem e uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 2, 4, 11, 20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167 ou 169 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  3. 3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de luciferase modificada tem estabilidade do sinal melhorada em relação à luciferase de Oplophorus do tipo selvagem e uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 4, 11, 20, 28, 33, 54, 68, 75, 115, 124, 138, 143 ou 166 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  4. 4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de luciferase modificada codificada tem estabilidade da proteína melhorada em relação à luciferase de Oplophorus do tipo selvagem e uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 11, 20, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167 ou 169 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  5. 5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de luciferase modificada
    Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 77/81
    2/3 codificada adicionalmente compreende uma deleção dos resíduos de luciferase correspondendo ao N-terminal da luciferase de Oplophorus do tipo selvagem de SEQ ID NO:10.
  6. 6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a luciferase de Oplophorus do tipo selvagem é de Oplophorus gracilirostris, Oplophorus grimaldii, Oplophorus spinicauda, Oplophorus foliaceus, Oplophorus novaezelandiae, Oplophorus typus ou Oplophorus spinous.
  7. 7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de luciferase modificada codificada compreende uma substituição correspondendo a pelo menos um dentre T2S, A4E/S/R/G/D/T/L, Q11R/V/I/L/K/T, Q20R, E23V, S28P, A33K, L34M, V44I/L, V45E, G51V, A54F/T/V/G/S/W/L/I, F68S/Y/V, L72Q, M75R/K/Q/G/T/A, I76V, F77W, V79I, K89E, I90T/V, L92S/A/G/Q, I99V, P104L, P115E/I/Q/L/V/G/H/R/S/C/A/T, Q124K, N135K, Y138V/I/N/T/L/C/R/M/K, D139E, I143L, N144K, C164S, N166R/K/A/L/P/Q/S, I167V ou 169L correspondendo à SEQ ID NO:1.
  8. 8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de luciferase modificada codificada compreende substituições de aminoácidos:
    (i) nas posições 11, 33, 44, 54, 115, 124, 138 e 166 correspondendo à SEQ ID NO:1;
    (ii) nas posições 23, 28, 143 e 166 correspondendo à SEQ ID NO:1;
    (iii) nas posições 4, 34, 76 e 166 correspondendo à SEQ ID NO:1; ou (iv) nas posições 51,99 e 166 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  9. 9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8(i), CARACTERIZADO pelo fato de que a luciferase modificada codificada adicionalmente compreende uma substituição de aminoácido na posição 4 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  10. 10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8(i) ou 9, CARACTERIZADO
    Petição 870180061065, de 16/07/2018, pág. 78/81
    3/3 pelo fato de que a luciferase modificada codificada adicionalmente compreende substituições de aminoácidos nas posições 45, 135, 104, 139, e 167 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  11. 11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8(i), 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a luciferase modificada codificada adicionalmente compreende as substituições de aminoácidos nas posições 28, 34, 51, 99 e 143 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  12. 12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende uma substituição de pelo menos um aminoácido na posição 20, 54, 68, 72, 77, 79, 89, 90, 92 ou 164 correspondendo à SEQ ID NO:1.
  13. 13. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
  14. 14. Vetor, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo está operavelmente ligado a um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac, maltose, CMV, SV40, RSV, promotores de tet, te, hsp70 e regulados por CRE.
  15. 15. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou o vetor como definido na reivindicação 13 ou 14.
BRPI1010019A 2009-05-01 2010-05-03 polipeptídeo de luciferase modificada, vetor e kit compreendendo os mesmos BRPI1010019B1 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17483809P 2009-05-01 2009-05-01
PCT/US2010/033449 WO2010127368A1 (en) 2009-05-01 2010-05-03 Synthetic oplophorus luciferases with enhanced light output

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI1010019A2 BRPI1010019A2 (pt) 2015-08-25
BRPI1010019B1 true BRPI1010019B1 (pt) 2019-02-05

Family

ID=42358981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI1010019A BRPI1010019B1 (pt) 2009-05-01 2010-05-03 polipeptídeo de luciferase modificada, vetor e kit compreendendo os mesmos

Country Status (16)

Country Link
US (7) US8557970B2 (pt)
EP (5) EP2990478B1 (pt)
JP (2) JP6038649B2 (pt)
KR (1) KR101665352B1 (pt)
CN (2) CN108192950B (pt)
AU (1) AU2010242771B2 (pt)
BR (1) BRPI1010019B1 (pt)
CA (1) CA2758572A1 (pt)
DK (4) DK2456864T3 (pt)
ES (4) ES2795287T3 (pt)
IL (3) IL215697B (pt)
LT (1) LT3409764T (pt)
PL (4) PL3409764T3 (pt)
PT (4) PT2456864E (pt)
SG (3) SG175180A1 (pt)
WO (1) WO2010127368A1 (pt)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2456864T3 (en) 2009-05-01 2015-12-21 Promega Corp SYNTHETIC OPLOPHORUS luciferases WITH IMPROVED LIGHT MISSION
ES2543913T3 (es) 2010-11-02 2015-08-25 Promega Corporation Derivados de coelenterazina y métodos de uso de los mismos
CN106148362B (zh) 2010-11-02 2021-04-30 普罗梅加公司 新型腔肠素底物及其使用方法
JP5896679B2 (ja) * 2011-03-15 2016-03-30 オリンパス株式会社 オオオバボタル由来ルシフェラーゼ
US9056885B2 (en) 2011-11-21 2015-06-16 Promega Corporation Carboxy X rhodamine analogs
US10519483B2 (en) 2012-02-21 2019-12-31 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents
EP2817422B1 (en) 2012-02-21 2019-01-23 Laboratory Corporation of America Holdings Methods and systems for detection of microorganisms
JP2015530114A (ja) 2012-09-26 2015-10-15 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ リアルタイムモニタリング
JP6751294B2 (ja) 2012-12-12 2020-09-02 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 細胞内生体発光共鳴エネルギ移動を用いた生物活性剤による細胞ターゲット結合の認知
EP2931305B1 (en) * 2012-12-12 2018-11-28 Promega Corporation Compositions and methods for capture of cellular targets of bioactive agents
US10067149B2 (en) 2012-12-12 2018-09-04 Promega Corporation Recognition of cellular target binding by a bioactive agent using intracellular bioluminescence resonance energy transfer
JP6511720B2 (ja) * 2013-02-28 2019-05-15 Jnc株式会社 コドン最適化変異エビルシフェラーゼ遺伝子およびその使用方法
US11072812B2 (en) 2013-03-15 2021-07-27 Promega Corporation Substrates for covalent tethering of proteins to functional groups or solid surfaces
US10168323B2 (en) * 2013-03-15 2019-01-01 Promega Corporation Compositions and methods for capture of cellular targets of bioactive agents
ES2926463T3 (es) 2013-03-15 2022-10-26 Promega Corp Activación de la bioluminiscencia mediante complementación estructural
CA2908266A1 (en) 2013-03-27 2014-10-02 Sample Technologies, Inc. Recombinant phage and bacterial detection methods
JP6040846B2 (ja) 2013-04-08 2016-12-07 Jnc株式会社 セレンテラジン類縁体
CN105531382A (zh) 2013-06-19 2016-04-27 六品科技公司 基于噬菌体的细菌检测法
JP6484987B2 (ja) * 2013-10-21 2019-03-20 Jnc株式会社 エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法
JP6442825B2 (ja) 2013-12-26 2018-12-26 Jnc株式会社 エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法
JP6703484B2 (ja) 2014-01-29 2020-06-03 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 細胞による取り込み測定のための、標識用試薬としての、キノンでマスクされたプローブ
EP3099691B1 (en) 2014-01-29 2019-11-20 Promega Corporation Pro-substrates for live cell applications
JP6256118B2 (ja) 2014-03-11 2018-01-10 Jnc株式会社 エビルシフェラーゼの触媒蛋白質のキメラ遺伝子及びその使用法
JP6265020B2 (ja) * 2014-04-16 2018-01-24 Jnc株式会社 エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法
EP3191600A1 (en) 2014-09-11 2017-07-19 Promega Corporation Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence
US11365402B2 (en) 2014-09-12 2022-06-21 Promega Corporation Internal protein tags
WO2016040835A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Promega Corporation Internal protein tags
US10571471B2 (en) 2015-02-05 2020-02-25 Promega Corporation Luciferase-based thermal shift assays
JP6876002B2 (ja) 2015-06-05 2021-05-26 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 機能的要素を共有結合により係留させるための細胞透過性、細胞適合性、かつ開裂可能であるリンカー
JP6862368B2 (ja) 2015-06-25 2021-04-21 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ チエノピロール化合物、及びそのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害剤としての使用
JP6978492B2 (ja) 2016-09-09 2021-12-08 プロメガ コーポレイションPromega Corporation 二重保護されたプロセレンテラジン基質
CA3039406A1 (en) 2016-09-19 2018-03-22 University Of Southern California Non-radioactive cytotoxicity assays
HUE064332T2 (hu) 2016-10-20 2024-03-28 Harvard College In vitro és sejtalapú esszék botulinum neurotoxinok aktivitásának mérésére
EP4144738A1 (en) 2016-11-01 2023-03-08 Promega Corporation Coelenterazine analogues tethered to energy acceptors
JP7139330B2 (ja) 2016-12-01 2022-09-20 プロメガ コーポレイション 細胞不透過性セレンテラジンアナログ
JP7161475B2 (ja) 2016-12-28 2022-10-26 プロメガ コーポレイション 官能化ｎａｎｏｌｕｃ阻害剤
US11788068B2 (en) 2017-10-25 2023-10-17 Roche Molecular Systems, Inc. Modified/mutant bacterial luciferases
WO2019110817A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Bioluminescent screening test for detecting cell cytolysis
US10975363B2 (en) * 2018-03-30 2021-04-13 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Materials and methods for biosynthetic manufacture and utilization of synthetic polypeptides, and products therefrom
EP3788048A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Promega Corporation Coelenterazine compounds as nanoluc suicide substrates
WO2019213118A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Invista North America S.A.R.L. Methods for controlling pha biosynthesis in cupriavidus or ralstonia
EP3788148A1 (en) 2018-05-02 2021-03-10 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods for maximizing biosynthesis through alteration of pyruvate-acetyl-coa-tca balance in species of the genera ralstonia and cupriavidus and organisms related thereto
JP7432529B2 (ja) 2018-05-30 2024-02-16 プロメガ コーポレイション 広域スペクトルキナーゼ結合剤
US11390599B2 (en) 2018-06-01 2022-07-19 Promega Corporation Inhibitors of oplophorus luciferase-derived bioluminescent complexes
US10962538B2 (en) 2018-06-14 2021-03-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Assays using arrestin recruitment and unmodified receptors
KR20210072040A (ko) 2018-10-03 2021-06-16 프로메가 코포레이션 코엘렌테라진 및 이의 유사체 및 유도체를 안정화하기 위한 조성물 및 방법
JP2022509200A (ja) 2018-11-28 2022-01-20 プロメガ コーポレイション 反応性ペプチド標識付け
EP3891503A2 (en) 2018-12-04 2021-10-13 Promega Corporation Broad spectrum gpcr binding agents
US11913944B2 (en) 2019-03-20 2024-02-27 Promega Corporation Photoaffinity probes
US11360096B2 (en) 2019-05-16 2022-06-14 Duke University Complex BRET technique for measuring biological interactions
AU2020298241A1 (en) 2019-06-21 2021-12-23 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods for producing mutant bacteriophages for the detection of Listeria
AU2020308448A1 (en) 2019-06-24 2022-02-03 Promega Corporation Modified polyamine polymers for delivery of biomolecules into cells
CA3147173A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Stephen Erickson Devices and methods for detecting microorganisms using recombinant reproduction-deficient indicator bacteriophage
EP4028540A1 (en) 2019-09-11 2022-07-20 Laboratory Corporation of America Holdings Methods and systems for the rapid detection of microorganisms using recombinant infectious agents to express an indicator subunit
AU2020392245A1 (en) 2019-11-27 2022-06-23 Promega Corporation Multipartite luciferase peptides and polypeptides
JP2023506486A (ja) 2019-12-10 2023-02-16 プロメガ コーポレイション 多官能性プローブを使用する生物発光検出用組成物及び生物発光検出方法
IL295070A (en) 2020-01-28 2022-09-01 Freeline Therapeutics Ltd An improved test for determining the value of neutralizing antibodies to a viral vector
WO2021237118A2 (en) 2020-05-22 2021-11-25 Promega Corporation Enhancement of kinase target engagement
CN116391129A (zh) 2020-08-28 2023-07-04 普罗美加公司 针对ras蛋白的靶标接合测定法
WO2022138892A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30 中外製薬株式会社 複数の標的分子と共に複合体を形成し得る候補分子のスクリーニング方法
CN113025586B (zh) * 2021-04-06 2022-10-04 湖北省中医院 一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法
US20240174992A1 (en) 2022-05-04 2024-05-30 Promega Corporation Split modified dehalogenase variants
WO2023215432A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Promega Corporation Circularly permuted dehalogenase variants
US20240132859A1 (en) 2022-05-04 2024-04-25 Promega Corporation Modified dehalogenase with extended surface loop regions
US20240191211A1 (en) 2022-05-04 2024-06-13 Promega Corporation Bioluminescence-triggered photocatalytic labeling
GB202213479D0 (en) 2022-09-14 2022-10-26 Ipsen Biopharm Ltd Cell-free clostridial neurotoxin assays
WO2024059832A1 (en) * 2022-09-15 2024-03-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for assessing kinase activity
GB202404021D0 (en) 2024-03-20 2024-05-01 Ipsen Biopharm Ltd Cell-based neurotoxin assay

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8911957D0 (en) 1989-05-24 1989-07-12 Interox Chemicals Ltd Peroxyacid manufacture
US5368484A (en) 1992-05-22 1994-11-29 Atari Games Corp. Vehicle simulator with realistic operating feedback
EP0689587B1 (en) * 1994-01-03 2008-04-09 Promega Corporation Mutant luciferases
WO1999014336A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
JP3694181B2 (ja) 1999-01-05 2005-09-14 キッコーマン株式会社 変異型ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ルシフェラーゼの製造法
ATE374820T1 (de) 1999-10-26 2007-10-15 Secr Defence Mutantenluciferase
EP1156103B1 (en) * 2000-04-26 2010-08-11 Chisso Corporation Oplophorus luciferase
JP4613441B2 (ja) * 2000-04-26 2011-01-19 チッソ株式会社 新規ルシフェラーゼおよび発光蛋白質
US7118878B1 (en) 2000-06-09 2006-10-10 Promega Corporation Method for increasing luminescence assay sensitivity
US7268229B2 (en) 2001-11-02 2007-09-11 Promega Corporation Compounds to co-localize luminophores with luminescent proteins
CA2489804C (en) 2002-06-19 2008-03-25 Medical Instill Technologies, Inc. Sterile filling machine having needle filling station within e-beam chamber
WO2005097825A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
JP3844082B2 (ja) * 2005-04-08 2006-11-08 キッコーマン株式会社 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法
JP4999341B2 (ja) * 2005-09-06 2012-08-15 株式会社バイオエネックス 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法
EP2004813B1 (en) * 2006-04-03 2015-06-03 Promega Corporation Permuted and nonpermuted luciferase biosensors binding cyclic nucleotides
US20080248511A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-09 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
WO2009061413A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Promega Corporation Hybrid fusion reporter and uses thereof
US9045730B2 (en) * 2008-05-19 2015-06-02 Promega Corporation Luciferase biosensors for cAMP
WO2010119721A1 (ja) * 2009-04-17 2010-10-21 独立行政法人産業技術総合研究所 超高輝度で安定な人工生物発光酵素
DK2456864T3 (en) 2009-05-01 2015-12-21 Promega Corp SYNTHETIC OPLOPHORUS luciferases WITH IMPROVED LIGHT MISSION
CN106148362B (zh) * 2010-11-02 2021-04-30 普罗梅加公司 新型腔肠素底物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2990478A1 (en) 2016-03-02
US20200248228A1 (en) 2020-08-06
SG10201601281WA (en) 2016-03-30
ES2691539T3 (es) 2018-11-27
US20140120548A1 (en) 2014-05-01
ES2559505T3 (es) 2016-02-12
IL265263A (en) 2019-05-30
EP2456864A1 (en) 2012-05-30
AU2010242771B2 (en) 2015-01-22
US9777311B2 (en) 2017-10-03
CN102459579B (zh) 2018-02-09
SG175180A1 (en) 2011-11-28
EP2456864B1 (en) 2015-11-11
PT2456864E (pt) 2016-01-20
EP3181687B1 (en) 2018-08-08
PL3181687T3 (pl) 2018-11-30
US8557970B2 (en) 2013-10-15
BRPI1010019A2 (pt) 2015-08-25
CN108192950B (zh) 2021-09-03
PL2990478T3 (pl) 2017-08-31
CN108192950A (zh) 2018-06-22
US20180051318A1 (en) 2018-02-22
CA2758572A1 (en) 2010-11-04
JP2016028599A (ja) 2016-03-03
US20190185908A1 (en) 2019-06-20
JP6038649B2 (ja) 2016-12-07
ES2795287T3 (es) 2020-11-23
DK2990478T3 (en) 2017-05-15
US11667950B2 (en) 2023-06-06
IL265263B (en) 2020-05-31
WO2010127368A1 (en) 2010-11-04
EP3181687A1 (en) 2017-06-21
LT3409764T (lt) 2020-06-10
IL274145B (en) 2021-07-29
US10844422B2 (en) 2020-11-24
EP3409764B1 (en) 2020-04-15
PT3409764T (pt) 2020-05-29
DK2456864T3 (en) 2015-12-21
CN102459579A (zh) 2012-05-16
ES2629390T3 (es) 2017-08-09
IL215697B (en) 2019-03-31
JP2012525819A (ja) 2012-10-25
PL2456864T3 (pl) 2016-04-29
SG10201901453PA (en) 2019-03-28
US10633690B2 (en) 2020-04-28
US20220389434A1 (en) 2022-12-08
AU2010242771A1 (en) 2011-11-03
EP2990478B1 (en) 2017-04-05
US10233485B2 (en) 2019-03-19
US20100281552A1 (en) 2010-11-04
KR101665352B1 (ko) 2016-10-12
DK3409764T3 (da) 2020-05-25
IL274145A (en) 2020-06-30
US11365436B2 (en) 2022-06-21
EP3744834A1 (en) 2020-12-02
PT2990478T (pt) 2017-05-08
DK3181687T3 (en) 2018-09-10
EP3409764A1 (en) 2018-12-05
PT3181687T (pt) 2018-10-19
US20210032676A1 (en) 2021-02-04
PL3409764T3 (pl) 2020-07-13
JP6227615B2 (ja) 2017-11-08
IL215697A0 (en) 2012-01-31
KR20120088548A (ko) 2012-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10844422B2 (en) Synthetic Oplophorus luciferases with enhanced light output
AU2002339151A1 (en) Method for measuring intracellular ATP and/or gene expression
EP1468284A2 (en) Method for measuring intracellular atp and/or gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 03/05/2010, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. (CO) 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 03/05/2010, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS