ES2543913T3 - Derivados de coelenterazina y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Derivados de coelenterazina y métodos de uso de los mismos Download PDF

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ES2543913T3 ES11785217.8T ES11785217T ES2543913T3 ES 2543913 T3 ES2543913 T3 ES 2543913T3 ES 11785217 T ES11785217 T ES 11785217T ES 2543913 T3 ES2543913 T3 ES 2543913T3
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Poncho Meisenheimer
James Unch
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Abstract

Un compuesto de fórmula (II):**Fórmula** en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(5 O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en R11 se selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-RA, -OC(O)O-RA, - N(RB)2 o -NHC(O)ORA; en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2; RA es alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-RC o -CH2-V-RC; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado a partir de**Fórmula** cada RX es independientemente H, halógeno o NO2 cada RY es independientemente H o Me cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S n es de 0 a 3; cada R es independientemente un alquilo C1-7; T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S- u -O-; y los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

Description

Derivados de coelenterazina y métodos de uso de los mismos
Esta solicitud reivindica la prioridad del documento de patente de EE.UU. con nº de serie 61/409.413, presentado el 2 de noviembre del 2010.
5 Campo de la invención
La presente invención proporciona compuestos y métodos para someter a ensayo la presencia y la actividad de enzimas.
Antecedentes
La presencia y la actividad de enzimas se pueden utilizar para determinar el estado de salud o metabólico de una
10 célula. Las enzimas también pueden ser marcadores de un tipo de célula particular ya que la aparición y la actividad de ciertas enzimas son frecuentemente características de una célula particular. Por ejemplo, la actividad de ciertas enzimas se puede usar frecuentemente para diferenciar células de origen bacteriano, vegetal o animal, o para distinguir la identidad del tejido a partir del cual se produce la enzima.
Las glicosidasas, también conocidas como glucósido hidrolasas, catalizan la hidrólisis del enlace glicosídico para
15 generar dos azúcares más pequeños. Son enzimas muy comunes con funciones en la naturaleza que incluyen la degradación de biomasa, tal como celulosa y hemicelulosa en estrategias de defensa antibacteriana (por ejemplo, lisozima), en mecanismos de patogénesis (por ejemplo, neuraminidasas víricas) y en la función celular normal (por ejemplo, manosidasas de recorte implicadas en la biosíntesis de glicoproteína ligada a N). En las bacterias y los procariotas, las glicosidasas se encuentran tanto como enzimas intracelulares como extracelulares que están
20 implicadas en gran medida en la adquisición de nutrientes. Uno de los casos importantes de glicosidasas en bacterias es la enzima beta-galactosidasa (LacZ), que está implicada en la regulación de la expresión del operón lac en E. coli. En organismos superiores, las glicosidasas se encuentran dentro del retículo endoplasmático y del aparato de Golgi, en donde están involucradas en el procesamiento de glicoproteínas ligadas a N, y en la lisozima como enzimas implicadas en la degradación de estructuras de hidratos de carbono. La carencia de glicosidasas
25 específicas en el lisosoma puede llevar a una serie de trastornos de almacenamiento lisosómico que dan como resultado problemas de desarrollo o la muerte. Las glicosidasas están implicadas en la biosíntesis y la degradación de glucógeno en el organismo. Junto con las glicosiltransferasas, las glicosidasas forman la principal maquinaria catalítica para la síntesis y la rotura de enlaces glicosídicos.
Las diaforasas son una clase ubicua de enzimas unidas a flavina que catalizan la reducción de diversos
30 compuestos, las cuales actúan como aceptoras de hidrógeno, desde la forma reducida de nucleótidos de difosfopiridina y trifosfopiridina, es decir, NADH, NADPH. El metabolismo energético celular es un proceso complejo que permite a las células almacenar energía a través de una serie de reacciones enzimáticas y químicas. Un aspecto esencial del metabolismo energético celular es el estado de oxidación-reducción de la célula. El estado metabólico de las células vivas, así como someter a ensayo la actividad enzimática y/o el nivel de metabolitos, se
35 pueden determinar por la medición del cofactor que define la redox NAD(P)/NAD(P)H.
Compendio
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5;
2’ AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
o cicloalquilo inferior; en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
10 Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L es un enlazador; n es de 0a 3;
15 cada R es independientemente un alquilo C1-7; T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S-u -O-; y los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (II):
20 en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
o cicloalquilo inferior;
11 AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, 5 N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;
cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;
10 L' es un enlazador; n es de 0a 3; cada R es independientemente un alquilo C1-7; T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S-u -O-; y
15 los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (III):
en donde R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
o cicloalquilo inferior;
12 AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, 25 N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;
cada RB es independientemente -H o -RA;
RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; 30 L' es un enlazador;
V es -S-u -O-;
cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; cada R es independientemente alquilo C1-7; y los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IV):
en donde R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
o cicloalquilo inferior;
16 AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, -N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
15 Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador; n es de 0a 3;
20 T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S-u -O-; cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; cada R es independientemente alquilo C1-7; y los enlaces con línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.
25 La presente invención también proporciona métodos de empleo de los compuestos anteriores.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra los resultados de pruebas biológicas de z-DEVD-coelenterazina-h. La FIG. 2 muestra los resultados de un ensayo con caspasa 3 empleando una luciferasa obtenida a partir de
Oplophorus y z-DEVD-coelenterazina-h.
La FIG. 3 muestra enlazadores adecuados.
La FIG. 4 muestra coelenterazinas que se pueden derivatizar.
La FIG. 5 muestra ejemplos de sacáridos pro-coelenterazina, útiles en ensayos de glicosidasa.
5 La FIG. 6 muestra diversos sustratos de peptidilo para las enzimas.
La FIG. 7 muestra pro-coelenterazinas adecuadas para el empleo en ensayos con proteasas.
La FIG. 8 muestra una correlación lineal entre el número de células y la luminiscencia lo que indica una relación directa entre la luminiscencia medida con los compuestos 40 y 50 y el número de células.
La FIG. 9 muestra la detección de NADH usando pro-coelenterazinas de acuerdo con la presente invención.
10 La FIG. 10 muestra otros sustratos de pro-coelenterazina adecuados de acuerdo con la presente invención.
Descripción detallada
La presente invención proporciona compuestos y métodos para someter a ensayo la presencia y la actividad de diversas enzimas en una muestra.
A menos que se especifique expresamente lo contrario, la expresión "que comprende" se utiliza en el contexto de la
15 presente solicitud para indicar que otros miembros pueden estar opcionalmente presentes además de los miembros de la lista introducida por "que comprende". Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente invención que la expresión "que comprende" incluya la posibilidad de que no estén presentes más miembros, es decir, para el objetivo de esta realización "que comprende" se ha de entender como que tiene el significado de "que consiste en".
20 Tal y como se emplea en la presente memoria, los siguientes términos y expresiones tienen los significados indicados. Se apreciará que los compuestos de la presente invención contienen átomos de carbono sustituidos de forma asimétrica y se pueden aislar en formas ópticamente activas o racémicas. Se conoce bien en la técnica cómo preparar formas ópticamente activas, como mediante la resolución de formas racémicas o mediante síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos. Todas las formas racémicas, diasterómeras, quirales y todas las
25 formas isómeras geométricas de una estructura forman parte de esta invención.
Los valores específicos que figuran a continuación para radicales, sustituyentes e intervalos, son sólo para fines ilustrativos. No excluyen otros valores definidos ni otros valores dentro de intervalos definidos para los radicales y los sustituyentes.
Definiciones
30 El término "alquilo" se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno a partir de un compuesto hidrocarburo. Un grupo alquilo puede contener de 1-30 átomos de carbono, o de 1-12 átomos de carbono, o de 1-10 átomos de carbono o de 1-6 átomos de carbono o de 1-4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede ser de cadena lineal o ramificada y puede estar saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado. Un grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido con, por ejemplo, halo. Ejemplos de grupos
35 alquilo de cadena lineal incluyen, pero no están limitados a, etilo, n-propilo, n-butilo y n-propilo, n-hexilo y n-heptilo. Ejemplos de grupos alquilo insaturados de cadena lineal que tienen uno o varios dobles enlaces carbono-carbono incluyen, pero no se limitan a, etenilo (vinilo, -CH=CH2), 2-propenilo (alilo, -CH-CH=CH2) y butenilo. Ejemplos de alquilos insaturados que tienen uno o varios enlaces triples carbono-carbono incluyen, pero no se limitan a, etinilo y 2-propinilo (propargilo). Ejemplos de grupos alquilo ramificados incluyen isopropilo, iso-butilo, sec-butilo, t-butilo e
40 iso-pentilo.
El término "aminoácido" se refiere tanto a aminoácidos naturales como no naturales. También incluye aminoácidos naturales y no naturales protegidos.
El término "arilo" se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno a partir de un anillo aromático. Un grupo arilo puede tener de 6-10 átomos de carbono (arilo C6-10). Por ejemplo, el
45 grupo arilo puede ser fenilo o naftilo.
El término "halo" se refiere a un halógeno, tal como Cl, F, Br o I.
El término "heteroarilo" se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno a partir de un anillo heteroaromático. Un anillo heteroaromático puede tener de 5-10 átomos en el anillo (heteroarilo C5-10) (El uso de "C" se entiende que significa el número total de átomos en el anillo, 50 independientemente de si el átomo es C, N, O o S). Los átomos del anillo pueden ser carbono, nitrógeno, azufre u
oxígeno. Más de un heteroátomo puede estar presente en el anillo. Por ejemplo, el grupo heteroarilo puede ser furilo, tienilo, tiazolilo, pirazolilo, triazolilo o tetrazolilo.
El término "enlazador" se refiere a una cadena de 2 a 50 átomos que enlaza un resto del sustrato con el núcleo de coelenterazina. Los enlazadores pueden incluir uno o varios heteroátomos. Los enlazadores también pueden estar 5 sustituidos por grupos oxo, grupos amino, grupos alquilo, halógenos y grupos nitro. Los enlazadores pueden contener también grupos arilo. Los enlazadores adecuados incluyen los que se muestran en la FIG. 3, tal como un enlazador de p-aminobencilo. Los enlazadores son adecuadamente "sin rastro" o enlazadores "auto-destructivos". La expresión "enlazador sin rastro" o "enlazador auto-destructivo" se refiere a un enlazador en el que la escisión del resto de sustrato desde el enlazador da como resultado la escisión espontánea del enlazador desde el núcleo de
10 coelenterazina, para liberar la coelenterazina. Ejemplos de "enlazadores auto-destructivos" incluyen los que se muestran en la FIG. 3.
La expresión "cicloalquilo inferior" se refiere a un resto monovalente obtenido mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno desde un compuesto hidrocarburo que tiene de 3 a 6 átomos de carbono. Ejemplos de grupos cicloalquilo inferiores saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo 15 y ciclohexilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo inferiores insaturados que tienen uno o varios dobles enlaces carbonocarbono incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo y ciclohexenilo.
La expresión "enzima luminiscente" a menos que se especifique lo contrario, se refiere a una enzima luminiscente de origen natural, recombinante o mutante que utiliza una coelenterazina como sustrato. La enzima luminiscente, si está presente de forma natural, es fácil de obtener por la persona experta a partir de un organismo. Si la enzima 20 luminiscente es una que se produce de forma natural o es una enzima luminiscente recombinante o mutante, es decir, una que conserva la actividad en una reacción luciferasa-coelenterazina de una enzima luminiscente de origen natural, se puede obtener fácilmente a partir de un cultivo de células bacterianas, de levadura, mamífero, insecto, células vegetales o similares, transformadas para expresar un ácido nucleico que codifica la enzima luminiscente. Además, la enzima luminiscente recombinante o mutante se puede obtener a partir de un sistema exento de células
25 in vitro, usando un ácido nucleico que codifica la luciferasa. Enzimas luminiscentes adecuadas incluyen luciferasas obtenidas a partir de decápodos bioluminiscentes, tales como los Ophophoroidea, p. ej., luciferasas obtenidas a partir de Oplophorus, organismos marinos tales como los cnidarios (por ejemplo, luciferasa de Renilla), familias de los decápodos Aristeidae, Solenoceridae, Luciferidae, Sergestidae, Pasipheidae y Thalassocarididae, y fotoproteínas, tales como la ecuorina.
30 Una "mezcla de reacción luminiscente" contiene materiales que permitirán que la enzima luminiscente genere una señal luminosa, es decir, luminiscencia. La mezcla también puede contener la enzima. Los materiales necesarios, y las concentraciones particulares y/o las cantidades, de los materiales necesarios para generar una señal luminiscente variarán dependiendo de la enzima luminiscente utilizada, así como del tipo de ensayo que se realiza. Frecuentemente se añadirán otros materiales a la solución que incluyen: un tampón para mantener la reacción en el
35 pH apropiado, un aditivo tal como Prionex o albúmina de suero bovino (BSA) para ayudar a conservar la actividad enzimática, agentes reductores, detergentes, etc.
El término "péptido" se refiere a una secuencia de al menos dos aminoácidos. En algunas realizaciones, un péptido puede contener no más de 80 aminoácidos, o no más de 35 aminoácidos, o no más de 10 aminoácidos.
El término "sacárido" se refiere a un azúcar o a otro hidrato de carbono, especialmente un azúcar simple. Incluye
40 tanto alfa-anómeros como beta-anómeros. El sacárido puede ser un compuesto polihidroxi C6, típicamente un pentahidroxi C6, y frecuentemente un glical cíclico. Incluye azúcares simples conocidos y sus derivados, así como polisacáridos con dos o más residuos de monosacáridos. El sacárido puede incluir grupos protectores en los grupos hidroxilo. Los grupos hidroxilo del sacárido pueden estar sustituidos con uno o varios grupos acetamido, halo o amino. Además, uno o varios de los átomos de carbono pueden estar oxidados, por ejemplo, a grupos ceto o
45 carbonilo. Sacáridos adecuados incluyen galactosa, glucosa, ácido glucurónico y ácido neuramínico.
El término "sustituido" es para indicar que uno o varios hidrógenos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5; en algunas realizaciones 1, 2 o 3, y en otras formas de realización 1 o 2) en el grupo indicado en la expresión usando "sustituido", se sustituye con una selección del(de los) grupo(s) indicado(s), o con un grupo adecuado conocido por los expertos en la técnica, siempre que no se supere la valencia normal del átomo indicado, y que la sustitución dé
50 como resultado un compuesto estable. Los sustituyentes adecuados incluyen halo, hidroxilo, fenilo, -NH2, -NHMe, -NMe2, -SH, -CH(OMe)2, -CF3, -OCH3, -SCH3, alquilo C1-4, piperazinilo y piperazinilo sustituido con arilo.
Compuestos
Se sabe que las coelenterazinas emiten luminiscencia cuando están bajo la acción de una amplia variedad de proteínas bioluminiscentes, tales como luciferasas marinas. Ejemplos de luciferasas marinas incluyen la luciferasa
55 de Renilla, ecuorina, la luciferasa de Gaussia, la luciferasa de Oplophorus y la luciferasa de Cypridina.
La invención proporciona derivados de coelenterazina que son a la vez sustratos para una enzima no luminiscente y prosustratos para una proteína luminiscente. Una vez que la enzima no luminiscente de interés actúa, el derivado se convierte en un sustrato para una proteína luminiscente, y por lo tanto es detectable por medios conocidos por un
experto ordinario en la técnica. En algunas realizaciones, los derivados son compuestos de Fórmulas I-IV que se muestran a continuación:
(1)
5 en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5;
2’ AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2-OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en 10
o cicloalquilo inferior;
15 en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;
cada RB es independientemente -H o -RA;
RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;
L es un enlazador; 20 nesde0a3;
cada R es independientemente un alquilo C1-7;
T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;
V es -S-u -O-; y
los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado; 25 (2)
en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
o cicloalquilo inferior;
11 AA
10 Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;
cada RB es independientemente -H o -RA; 15 RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;
L' es un enlazador;
n es de 0a 3;
cada R es independientemente un alquilo C1-7;
T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; 20 V es-S-u-O-;y
los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado;
(3)
en donde R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R;
R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
5
o cicloalquilo inferior;
12 AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, 10 N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;
cada RB es independientemente -H o -RA;
RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; 15 L' es un enlazador;
V es -S-u -O-;
cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-;
cada R es independientemente alquilo C1-7; y
los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado; o 20 (4)
en donde R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
o cicloalquilo inferior;
16 AA
Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
A CC
Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;
10 cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador; n es de 0a 3; T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;
15 V es-S-u-O-; cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; cada R es independientemente alquilo C1-7; y los enlaces con línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En algunas realizaciones, R2 es
o alquilo C2-5; cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; Z es -CH-o -N-; Y es -H u -OH; W es -NH2, halo, -OH, -NHC(O)R, -CO2R; y R es alquilo C1-7.
En algunas realizaciones, R2 es ; y X es O o S. En otras realizaciones, R2 es alquilo C2-5 de
25 cadena lineal. En ciertas realizaciones, R, cicloalquilo inferior o H, en donde R3 y R4 son ambos H
o alquilo C1-2. En otras realizaciones, R8 es bencilo.
En algunas realizaciones, V es S.
De forma adecuada, los compuestos de la presente invención son derivados de coelenterazinas de origen natural ("naturales") así como de análogos de las mismas, que incluyen coelenterazina-n, coelenterazina-f, coelenterazina-h,
30 coelenterazina-hcp, coelenterazina-cp, coelenterazina-c, coelenterazina-e, coelenterazina-fcp, bisdeoxicoelenterazina ("coelenterazina-hh"), coelenterazina-i, coelenterazina-icp y 2-metil coelenterazina, además de las descritas en el documento WO 2003/040100 y la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 12/056.073 (párrafo [0086]). Coelenterazinas adecuadas adicionales que se pueden derivatizar de acuerdo con la presente invención, incluyen las de la FIG. 4.
35 En algunas realizaciones, los derivados de coelenterazina de la presente invención son sustratos para glicosidasas. Los derivados adecuados incluyen los que se muestran en la FIG. 5.
En algunas realizaciones, los derivados de coelenterazina de la presente invención son sustratos para proteasas tales como caspasa 2, caspasas 3/7, caspasa 6, caspasa 8, caspasa 9, dipeptidil peptidasa 4 (DPPIV), calpaína, proteasoma similar a quimotripsina, proteasoma similar a tripsina, proteasoma similar a caspasa, granzima B, catepsinas B/L/K, trombina, tripsina, aminopeptidasa, y proteasa SARS. Los péptidos y aminoácidos adecuados, y
5 las enzimas para las que son sustratos, incluyen las enumeradas en la FIG. 6. Los derivados adecuados adicionales incluyen los enumerados en la FIG. 7.
En algunas realizaciones, los derivados de coelenterazina de la presente invención son sustratos para enzimas del citocromo P450.
En algunas realizaciones, los derivados de coelenterazina de la presente invención son sustratos para las enzimas 10 diaforasas.
Métodos de uso
Los derivados de coelenterazina de la presente invención se pueden utilizar en los reactivos del ensayo para detectar la presencia o la actividad de enzimas no luminiscentes, tales como enzimas del citocromo P450, proteasas
o glicosidasas. Los ensayos que utilizan enzimas luminiscentes y sus sustratos son bien conocidos en la técnica. Por
15 ejemplo, una enzima luminiscente, una mezcla de reacción luminiscente y un derivado de coelenterazina que es un sustrato de la enzima no luminiscente, se pueden añadir a una muestra de la que se sospecha que contiene la enzima no luminiscente. Si la enzima no luminiscente está presente en la muestra, la enzima no luminiscente actuará sobre el derivado de coelenterazina permitiendo que sea reconocido por la enzima luminiscente para producir una señal luminiscente. Alternativamente, la enzima no luminiscente puede convertir un derivado de
20 coelenterazina luminógena a una forma no luminiscente, es decir, en un ensayo de pérdida de señal.
En algunas realizaciones, el ensayo puede utilizar la quimioluminiscencia de coelenterazinas. Por ejemplo, un derivado de coelenterazina que es un sustrato de la enzima no luminiscente, se puede añadir a una muestra de la que se sospecha que contiene la enzima no luminiscente. Si la enzima no luminiscente está presente en la muestra, la enzima no luminiscente actuará sobre el derivado de coelenterazina permitiendo que se convierta en
25 quimioluminiscente y sea detectable por técnicas bien conocidas.
El derivado de coelenterazina se puede añadir a la muestra antes o al mismo tiempo que la enzima luminiscente. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una célula. Las células pueden ser células eucariotas, por ejemplo, células de levadura, de aves, vegetales, de insectos o de mamíferos, incluyendo pero no limitadas a células humanas, de simio, murinas, caninas, bovinas, equinas, felinas, ovinas, caprinas o porcinas, o células procariotas o
30 células procedentes de dos o más organismos diferentes, o lisados celulares o material sobrenadante de los mismos. Las células se pueden haber modificado genéticamente mediante técnicas recombinantes. En ciertos aspectos, la célula puede estar en un animal, por ejemplo, animales transgénicos, o en un fluido fisiológico, por ejemplo, sangre, plasma, orina, secreciones mucosas o similares.
La muestra puede contener más de una enzima no luminiscente que se va a detectar. En este caso, se puede
35 utilizar más de una enzima luminiscente. Además, se puede utilizar más de un sustrato. Se pueden utilizar múltiples sustratos y/o enzimas luminiscentes para detectar múltiples enzimas no luminiscentes u otra(s) molécula(s) de interés, por ejemplo, compuestos de ensayo al mismo tiempo, p. ej., en una reacción multiplex.
Los derivados de coelenterazina también son útiles en métodos in situ para analizar células. Los métodos para realizar un análisis in situ de células utilizando una luciferasa, son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, el 40 documento de patente de EE.UU. nº 5.998.204. Los derivados de coelenterazina no son sustratos de las enzimas luminiscentes antes de la exposición a una enzima no luminiscente. Sin embargo, después de la exposición a la enzima no luminiscente, los derivados se convierten en compuestos que se pueden detectar fácilmente en una reacción que emite luz en presencia de una enzima luminiscente. Por lo tanto, se puede determinar dónde se encuentra la enzima no luminiscente en una célula mediante la formación de imágenes in situ. Esto se puede
45 realizar poniendo en contacto una célula que expresa una enzima luminiscente con un derivado de coelenterazina.
Alternativamente, un animal transgénico que expresa un gen de una enzima luminiscente se puede administrar a un derivado de coelenterazina que es un sustrato para una enzima no luminiscente particular de interés. La tecnología de formación de imágenes (por ejemplo, formación de imágenes biofotónicas in vivo), se puede utilizar a continuación, para medir la luminiscencia en el sitio de expresión de la enzima luminiscente en el animal vivo, 50 intacto. Por lo tanto, un animal transgénico que expresa una enzima luminiscente se puede administrar a un derivado de coelenterazina que se convertirá en un sustrato para la enzima luminiscente en tejidos en los que se expresa la enzima no luminiscente adecuada, de interés. Si la enzima luminiscente se expresa también en ese tejido, se producirá una señal luminiscente y se puede detectar a través de cualquier medio adecuado. Por lo tanto, los compuestos del ensayo, por ejemplo, fármacos, se pueden analizar en un ensayo basado en un animal. El
55 compuesto del ensayo se debe administrar al animal antes del derivado de coelenterazina. Alternativamente, el tejido de animales transgénicos se puede utilizar en un ensayo basado en el tejido.
En algunas realizaciones, a un animal no transgénico se puede administrar un derivado de coelenterazina que es un sustrato para una enzima no luminiscente particular de interés. El derivado se convertirá en un sustrato para una
enzima luminiscente en tejidos en los que se expresa la enzima no luminiscente apropiada. Una muestra biológica, por ejemplo, sangre, suero, bilis, orina, heces o tejido, se puede obtener a partir del animal y se puede poner en contacto con una enzima luminiscente. La señal resultante se puede detectar por cualquier medio adecuado. Por lo tanto, los compuestos del ensayo, por ejemplo, fármacos, se pueden analizar en un ensayo basado en un animal. El
5 compuesto del ensayo se debe administrar al animal antes del derivado de coelenterazina.
En algunas realizaciones, los compuestos del ensayo tales como los fármacos candidatos, se pueden examinar y evaluar según sus actividades como, por ejemplo, (1) sustratos de una enzima no luciferasa, (2) reguladores, p. ej., inhibidores, inductores o activadores de una enzima no luciferasa, o (3) modificadores de un estado celular (p. ej., la viabilidad, el aumento de especies reactivas de oxígeno o el aumento del potencial reductor). Los derivados de
10 coelenterazina también se pueden utilizar para distinguir entre sustratos e inhibidores de una enzima no luciferasa. La selección se puede realizar ya sea in vitro o in vivo.
Además, para cualquiera de los ensayos bioluminógenos descritos en este documento, se pueden añadir otros reactivos a las mezclas de reacción, incluyendo, pero no limitado a aquellos que inhiben o evitan la inactivación de la luciferasa, o que amplían o mejoran de otro modo la señal luminiscente.
15 Kits
La invención también proporciona kits para determinar la presencia o la actividad de una o varias enzimas no luciferasas. El kit puede incluir uno o varios de los siguientes: derivado(s) de coelenterazina, enzima(s) no luciferasa, enzima(s) luminiscente dependiente de coelenterazina y tampón(es) de reacción. Los tampones de reacción pueden estar presentes en formulaciones individuales para las reacciones de enzimas no luciferasas y las reacciones de
20 enzimas luminiscentes o en una sola formulación para un ensayo de una sola etapa. Los kits de la presente invención también pueden contener inhibidores, activadores y/o potenciadores para la(s) enzima(s) no luciferasa. Los kits de la presente invención también pueden contener un control positivo y/o negativo para el ensayo.
La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
25 Ejemplo 1: Síntesis de z-DEVD-coelenterazina-h (compuesto 21)
3-((((9H-Fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-4-oxobutanoato de terc-butilo (13): Un matraz se cargó con Fmoc-Asp(OtBu)-OH (6,7 g, 16,28 mmol) y 100 mL de THF seco. A esta solución, a temperatura ambiente, se añadió N-metilmorfolina pura (1,9 mL, 17,28 mmol), y la solución se enfrió a -20°C. El 30 cloroformiato de isobutilo puro (2,2 mL, 16,96 mmol) se añadió mediante una jeringa y la suspensión resultante se
agitó durante 10 minutos. El alcohol amino (2,0 g, 16,24 mmol) se añadió en una porción, y la mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos antes de retirar el baño frío y se continuó agitando durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con 300 mL de acetato de etilo y la mezcla se lavó secuencialmente con dos porciones de 50 mL de agua, 50 mL de HCl 0,5 M y dos porciones de 50 mL de solución de salmuera.La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró a vacío. El residuo se sometió a cromatografía sobre sílice usando un gradiente de heptano/acetato de etilo. Esto proporcionó 5,2 g (10,7 mmol) del producto como un sólido blanco. 1H RMN (300 MHz, dmso) d 10,02 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7,5, 2H), 7,81-7,67 (m, 3H), 7,55 (d, J = 8,4, 2H), 7,47-7,27 (m, 4H), 7,24 (d, J = 8,4, 2H), 5,09 (t, J = 5,7, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,43 (d, J = 5,7, 2H), 4,37-4,16 (m, 3H), 2,76-2,51 (m, 2H), 1,37 (s, 9H).
3-((((9H-Fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((4-(clorometil)fenil)amino)-4-oxobutanoato de terc-butilo (14): Un matraz se cargó con alcohol (13) (0,5 g, 0,97 mmol) y 15 mL de benceno seco. A esta suspensión, a temperatura ambiente, se añadió trietilamina pura y, después de agitar durante 2 minutos, la mezcla se enfrió en un baño de hielo/agua durante 10 minutos. A esto, se añadió cloruro de tionilo puro (78 µL, 1,07 mmol) y, después de 2 minutos, el baño frío se retiró y se continuó agitando a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y la torta del filtro se enjuagó con 30 mL de benceno seco. El filtrado se concentró a vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice usando cloruro de metileno. Esto proporcionó 457 mg (0,85 mmol) del producto como un sólido blanco pegajoso. 1H RMN (300 MHz, dmso) δ 10,16 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7,5, 2H), 7,79 (d, J = 8,1, 1H), 7,76-7,68 (m, 2H), 7,61 (d, J = 8,5, 2H), 7,44-7,27 (m, 6H), 4,72 (s, 2H), 4,58-4,44 (m, 1H), 4,33-4,18 (m, 3H), 2,63 (ddd, J = 6,0, 14,6, 21,8, 2H), 1,37 (s, 9H).
Compuestos 17 y 18: Un matraz seco se cargó con coelenterazina-h (7) (200 mg, 0,37 mmol) y 15 mL de DMF anhidra, desoxigenada bajo atmósfera de argón. A esta solución, a temperatura ambiente, se añadieron yoduro de potasio (31 mg, 0,19 mmol) y carbonato de potasio (51 mg, 0,37 mmol), y la mezcla se agitó durante aproximadamente 2 minutos. A esto, se añadió el compuesto 14 y la mezcla se agitó durante 18 horas. Los productos se purificaron mediante cromatografía de fase inversa y normal.
Compuestos 19 y 20: A una solución de cualquiera de los compuestos 17 o 18 (365 mg, 0,4 mmol) en 3 mL de diclorometano a temperatura ambiente, se añadió una solución de piperidina (2 mL) en 7 mL de diclorometano. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos, se diluyó con 50 mL de tolueno y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa usando un gradiente de TFA al 0,1%/agua frente a acetonitrilo. La mezcla de regioisómeros (133 mg, 0,19 mmol) se disolvió en 2 mL de DMF seca y HOBt (30 mg, 0,22 mmol) y se añadió z-DEVD-CO2H (140 mg, 0,23 mmol). A esta solución, a temperatura ambiente, se añadió EDC (42 mg, 0,22 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche. La mezcla de reacción cruda se diluyó con 1 mL de acetonitrilo y se purificó mediante cromatografía en columna de fase inversa usando un gradiente de acetato de amonio 20 mM frente a acetonitrilo. Esto proporcionó 54 mg del compuesto 19 y 69 mg del compuesto 20.
Compuesto 21: Una mezcla cruda de los compuestos 19 y 20 se disolvió en 2 mL de diclorometano y a esta solución, a temperatura ambiente, se añadió una mezcla de desprotección que comprendía 4 mL de ácido trifluoroacético, 2 mL de diclorometano, 0,4 mL de triisopropilsilano y 0,4 mL de tioanisol. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas y se diluyó con 30 mL de éter dietílico. La suspensión se centrifugó, y el sólido se trituró dos veces con porciones de 10 mL de éter dietílico. El residuo se disolvió en 2 mL de metanol y se purificó mediante cromatografía de fase inversa usando un gradiente de acetato de amonio 20 mM frente a acetonitrilo. Esto proporcionó 9 mg del compuesto 21 como un sólido naranja.
Ejemplo 2: Prueba biológica de z-DEVD-coelenterazina-h (compuesto 21)
El compuesto 21 (50 µΜ) se combinó con luciferasa de Renilla (6,5 µg/mL, fusión Renilla-GST) en tampón HEPES 50 mM pH 7,2, DTT 2 mM y 0,5% de CHAPS y se incubó durante 20 minutos para eliminar cualquier derivado de coelenterazina libre que podría ser un sustrato para la luciferasa de Renilla. Se añadió la enzima caspasa-3 purificada (50 U/mL) o tampón control en una proporción de 1:1 en volumen para tener concentraciones finales de 25 µΜ de sustrato obtenido a partir de Z-DEVD-coelenterazina-h, 25 U/mL de caspasa-3 y 3,25 µg/mL de luciferasa. La luminiscencia se midió durante más de 110 minutos. A lo largo del tiempo, se observó un incremento de cien veces en la luminiscencia, en relación con muestras control que no contenían caspasa, indicando una liberación enzimática de coelenterazina y el reconocimiento de que los compuestos de coelenterazina de la presente invención se pueden utilizar para detectar enzimas caspasas (FIG. 1).
Ejemplo 3: Síntesis alternativa de z-DEVD-coelenterazina-h (compuesto 21)
(R)-3-Amino-4-(4-(hidroximetil)fenilamino)-4-oxobutanoato de terc-butilo (c). En un matraz de fondo redondo de 250 mL, b (6 g, 0,011 mol) se disolvió en dimetilformamida (60 mL). Se añadió piperidina (10 mL). Después de 4 horas, la TLC mostró la finalización de la reacción. El disolvente se evaporó. El residuo se purificó cargando sobre Celite
5 (15 g en 250 mL de EtOAc) y eluyendo sobre sílice (80 g) con un incremento de DCM frente a MeOH (10% en DCM). Las fracciones combinadas se evaporaron. Rendimiento (76%); Rf = 0.2 (50/50 de Hept/EtOAc), 1H RMN (300 MHz, dmso) δ 7,56 (d, J = 8,3, 2H), 7,22 (d, J = 8,3, 2H), 5,06 (t, J = 5,4, 1H), 4,41 (d, J = 4,6, 2H), 3,61 (t, J = 6,5, 1H), 2,59 (dd, J = 5,8, 15,5, 1H), 2,41 (dd, J = 7,2, 15,6, 1H), 1,35 (s, 9H); m/z.
(5S,8S,11R,14R)-5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-8-(3-terc-butoxi-3-3oxopropil)-14-(4-(hidroximetil)fenilcarbamoil)-1110 isopropil-3,6,9,12-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-(4,7,10,13-tetraazahexadecan-16-oato de terc-butilo (d). A un matraz de
fondo redondo de 100 mL, se añadió Z-D(tBu)E(tBu)V-OH (3,96 g, 6,5 mmol), c (1,6 g, 5,4 mmol), HOBt (0,915 g, 5,9 mmol) y DMF (25 mL). A la solución en agitación, se añadió EDAC (1,15 g, 5,9 mmol). Después de 18 horas, el disolvente se evaporó y el residuo se volvió a disolver en EtOAc (200 mL). La solución se lavó con ácido cítrico (30% -50 mL), bicarbonatosat (50 mL), agua (2 x 50 mL) y salmuera (50 mL). El material se adsorbió sobre Celite (15 g) y 5 se purificó sobre sílice con un incremento de heptano frente a EtOAc. Rendimiento (74%). 1H RMN (300 MHz, dmso) δ 9,85 (s, 1H), 8,33 (d, J = 7,7, 1H), 7,95 (d, J = 8,1, 1H), 7,83 (d, J = 8,3, 1H), 7,59 (d, J = 8,3, 1H), 7,53 (d, J = 8,5, 2H), 7,43-7,26 (m, 5H), 7,21 (d, J = 8,6, 2H), 5,06 (t, J = 5,7, 1H (desaparece en el intercambio con D2O)), 5,02 (d, J = 4,7, 2H), 4,70 (q, J = 7,7, 1H), 4,41 (d, J = 5,6, 2H (se colapsa a s en el intercambio con D2O)), 4,38-4,25 (m, 2H), 4,17-4,09 (m, 1H), 2,79-2,63 (m, 1H), 2,62-2,35 (m, 4H), 2,26-2,11 (m, 2H), 2,00-1,79 (m, 2H), 1,73 (d, J = 6,0, 1H),
10 1,34 (dd, J = 4,7, 7,4, 31H), 0,81 (t, J = 6,3, 6H). MS: Calculado para C45H65N5O13 883,5; encontrado 883,7.
(5S,8S,11R,14R)-5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-8-(3-terc-butoxi-3-oxopropil)-14-(4-(clorometil)fenil-carbamoil)-11isopropil-3,6,9,12-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,7,10,13-tetraazahexadecan-16-oato de terc-butilo (e). A un matraz RB de 100 mL, se añadió d (3,56 g, 4 mmol) con benceno (50 mL). La solución se evaporó y se almacenó durante una noche a alto vacío. Se añadió benceno seco (70 mL) al sólido junto con TEA (610 µl, 4,4 mmol). La solución se
15 enfrió en un baño de hielo y se añadió lentamente SOCl2 (320 µl, 4,4 mmol). La solución se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se añadió TEA adicional (241 µl) y SOCl2 (100 µl). Después de 2 horas adicionales, la mezcla de reacción se adsorbió sobre Celite (10 g) y se eluyó sobre sílice con incremento desde DCM frente a 5% de MeOH en DCM. Rendimiento (33%). 1H RMN (300 MHz, dmso) δ 10,00 (s, 1H), 8,35 (d, J = 7,8, 1H), 7,95 (d, J = 7,8, 1H), 7,84 (d, J = 8,3, 1H), 7,67 (d, J = 8,6, 3H), 7,41-7,22 (m, 7H), 5,11-4,91 (m, 2H), 4,77-4,59
20 (m, 3H), 4,43-4,21 (m, 2H), 4,19-4,04 (m, 1H), 3,30 (s, (agua)), 2,79-2,32 (m, 4H+DMSO), 2,26-2,07 (m, 2H), 2,001,79 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 1H), 1,40-1,24 (m, 27H), 0,81 (t, J = 6,4, 6H).
(5S,8S,11R,14R)-5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-8-(3-terc-butoxi-3-oxopropil)-14-(4-((2,8-dibencil-6-(4hidroxifenil)imidazol[1,2-a]pirazin-3-iloxi)metil)fenilcarbamoil)-11-isopropil-3,6,9,12-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,7,10,13tetraazahexadecan-16-oato de terc-butilo (20). A un vial desgasificado de argón que contenía coelenterazina-h (50
25 mg, 122 µmol) y K2CO3 (34 mg, 245 µmol), se añadió una solución desgasificada de e (133 mg, 147 µmol) en DMF (500 µl). Después de 2 horas, la reacción se inyectó directamente sobre RP-HPLC y se eluyó con un incremento de 0,1% de TFA (ac) frente a acetonitrilo. El pico principal se aisló y se evaporó. Rendimiento (13%). UV: picos 250, 300 y 420 nm. 1H RMN (300 MHz, dmso) δ 9,79 (s, 1H), 8,27 (d, J = 7,5, 1H), 7,92 (d, J = 8,0, 1H), 7,85 (d, J = 10,1, 1H), 7,58 (d, J = 8,3, 1H), 7,53 (d, J = 8,7, 2H), 7,45-7,14 (m, 15H), 7,09-6,80 (m, 6H), 6,72 (d, J = 8,8, 2H), 5,13
30 4,90 (m, 2H), 4,73-4,53 (m, 1H), 4,22 (dd, J = 5,0, 17,7, 3H), 4,16-4,01 (m, 3H (2H después del intercambio con D2O)), 3,25-3,01 (m, J = 10,0, 16,5, 4H), 2,76-2,53 (m, J = 15,6, 2H), 2,51-2,33 (m, 2H+dmso), 2,24-2,04 (m, 2H), 1,99-1,77 (m, 2H), 1,76-1,61 (m, 1H), 1,40-1,07 (m, 27H), 0,89-0,62 (m, 6H). MS: Calculado para C71H84N8O14 1272,6; encontrado 1272,8.
Ejemplo 4. Síntesis de 30
Una mezcla de éster acetílico de coelenterazina (0,50 g, 1,14 mmol), quinona bloqueo de trimetilo C2-cloruro de diamin carbonilo (0,436 g, 1,14 mmol), DMAP (0,139 g, 1,14 mmol) y TEA (0,115 g, 1,14 mmol) en 20 mL de dicloruro de metileno, se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El compuesto se purificó mediante cromatografía sobre sílice usando heptano/acetato de etilo como eluyente para proporcionar un rendimiento del 20%
40 (0,184 g). 1H RMN (300 MHz, CD2Cl2) δ 8,47 (s, 1H), 8,04 (d, 2H), 7,55 (d, 2H), 7,0-7,5 (m, 9H), 4,57 (s, 2H, CH2), 4,16 (s, 2H, CH2), 3,2-3,7 (m, 4H, NCH2), 2,7-3,2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 2,30 (s, 3H, CH3), 1,0-2,2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 796,5 (M+).
Ejemplo 5. Síntesis de 40
40 se preparó empleando el método similar para la preparación de 30 (Ejemplo 4). El compuesto se purificó mediante cromatografía sobre sílice usando heptano/acetato de etilo como eluyente, para proporcionar un rendimiento del 60% (0,32 g). 1H RMN (300 MHz, CD2C12) δ 8,47 (s, 1H), 8,03 (m, 2H), 7,57 (d, 2H), 7,1-7,5 (m, 7H), 6,33 (s, 1H), 6,17 (s, 1H), 4,58 (s, 2H, CH2), 4,19 (s, 2H, CH2), 3,3-3,7 (m, 4H, NCH2), 2,7-3,2 (m, 8H, 2NCH3
+ CH2), 1,0-2,2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 728,5 (M+). Pureza mediante HPLC: 90% a 262 nm.
Ejemplo 6. Síntesis de 50
10 50 se preparó empleando el método similar para la preparación de PBI 4442 (Ejemplo 20). El compuesto se purificó mediante cromatografía sobre sílice usando heptano/acetato de etilo como eluyente, para proporcionar un rendimiento del 17% (0,15 g). 1H RMN (300 MHz, CD2Cl2) δ 8,42 (s, 1H), 7,99 (m, 2H), 7,57 (d, 2H), 7,1-7,5 (m, 10H), 4,58 (s, 2H, CH2), 4,19 (s, 2H, CH2), 3,3-3,7 (m, 4H, NCH2), 2,7-3,2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 1,0-2,2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 738,5 (M+). Pureza con HPLC: 95% a 262 nm.
15 Ejemplo 7. Medición de células metabólicamente activas empleando derivados de quinona.
Este ejemplo muestra el uso de derivados de coelenterazina que contienen quinina para medir la cantidad de células metabólicamente activas. Las células viables conservan un estado metabólicamente activo que se pierde inevitablemente cuando las células están dañadas. Al entrar en las células vivas, la coelenterazina de quinona se reduce a un derivado de coelenterazina que es un sustrato para una luciferasa que emplea coelenterazina, por
20 ejemplo, la luciferasa de Oplophorus o de Renilla. La conversión de la coelenterazina de quinona es proporcional al número de células metabólicamente activas, y por lo tanto se puede medir cuantitativamente mediante el control de la luz producida por la reacción de la luciferasa.
Se prepararon diluciones dobles en serie de células Jurkat en PBS, y 50 µl por pocillo se transfirieron a pocillos en placas de 96 pocillos. Los compuestos 40 y 50 se diluyeron en PBS para preparar reservas 50 µΜ y 100 µΜ, 25 respectivamente. Se añadieron a las células 10 µΙ de las reservas del compuesto preparado y las células se colocaron a 37°C, en una incubadora con 5% de CO2. Después de 30 minutos de incubación, las células se retiraron de la incubadora, se enfriaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se añadieron 50 µl de reactivo de
detección de luciferasa de Oplophorus, directamente a los pocillos. Las muestras se mezclaron, se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos y se midió la luminiscencia. La FIG. 8 muestra la correlación lineal entre el número de células y la luminiscencia, lo que indica una relación directa entre la luminiscencia y el número de células.
Ejemplo 8: Ensayo de Caspasa 3 usando una luciferasa de Oplophorus y el Compuesto 21
5 Una variante de la luciferasa de Oplophorus (OgLuc), 9B8 opt, se utilizó en un ensayo bioluminiscente usando un sustrato de pro-coelenterazina que comprendía la secuencia de escisión de la caspasa-3 de DEVD. La enzima caspasa-3 purificada se mezcló con una muestra de lisado de E. coli que expresaba la variante 9B8 opt, la cual se purificó usando la resina HALOLINK ™ (Promega Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se diluyó 10 veces en un tampón que contenía MES 100 mM pH 6,0, CDTA 1 mM, KCl 150 mM, tiourea 35 mM, DTT 2 mM,
10 0,25% de TERGITOL® NP-9 (v/v), 0,025% de MAZU®, con o sin z-DEVD-coelenterazina-h 23,5 µΜ en HEPES 100 mM pH 7,5. La enzima caspasa-3 se incubó con la muestra del lisado durante 3 horas a temperatura ambiente y la luminiscencia se detectó en un luminómetro Turner MODULUS ™ en diversos momentos. Una muestra que contenía solo lisado bacteriano y una muestra que contenía solo caspasa-3, se utilizaron como controles. Se usaron tres repeticiones. La FIG. 2 y la Tabla 1 muestran que los sustratos de pro-coelenterazina de la presente invención se
15 pueden usar para detectar una enzima de interés.
Tabla 1
+/-caspasa
- +
tiempo (min) 5,0
URL 26.023 URL 25.411
15,3
7.707 36.906
29,9
4.013 41.854
60,9
2.305 43.370
190,3
1.155 42.448
Otra variante de la luciferasa de Oplophorus, L27V02 ("L27V"), se utilizó en un ensayo bioluminiscente usando un
sustrato de pro-coelenterazina que comprendía la secuencia de escisión de la caspasa-3 de DEVD. Se mezcló la 20 enzima caspasa-3 purificada (1 mg/mL) en MES 100 mM pH 6 (50 µl) con 227 nM de la variante L27V02 y PBI-3741
47 µΜ (z-DEVD-coelenterazina-h) en 50 µl de tampón de ensayo (MES 100 mM pH 6, tiourea 35 mM, 0,5% de
TERGITOL® NP-9 (v/v), CDTA 1 mM, DTT 2 mM y KCl 150 mM). Las reacciones se incubaron durante 3 horas a
temperatura ambiente y la luminiscencia se detectó como se ha descrito previamente. El ensayo con la variante
L27V02 se comparó con una versión del ensayo con luciferasa de luciérnaga, Caspasa 3/7 Glo (caspasa-Glo; 25 Promega Corp.). La Tabla 2 muestra que los compuestos de la presente invención se pueden usar en un ensayo
bioluminiscente para detectar una enzima de interés.
Tabla 2
(+) caspasa
+/ (-) caspasa +/-
L27V
11.532 93 803 25
Caspasa-Glo
15.156.567 793.981 302 5
Ejemplo predictivo 9: Síntesis de O-(8-bencil-2-(furan-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3(7H)-on-il)galactósido 30 (25)
i. acetobromo alfa-D-galactosa, AgOTf, TMU, DCM. ii. KOMe, THF
Síntesis típica de la pro-coelenterazina beta azúcar típica. O-(8-bencil-2-(furan-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin3(7H)-on-il)3,4,5,6-tetraacetoxi-beta-galactosido)
A un matraz de fondo redondo de 100 mL, se añade acetobromo-alfa azúcar adecuado (p. ej., acetobromo alfa-Dgalactosa) (1,1 eq), coelenterazina apropiada (p. ej., (8-bencil-2-(furan-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3(7H)ona) (1,0 eq, 100 mg) y triflato de plata (67 mg, 1 eq) y se desgasifica con argón durante 30 minutos. Se inyectan 2 mL de diclorometano y 70 µΙ de tetrametilurea y se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añaden 4 mL
5 de acetonitrilo y los sólidos se filtran. La muestra se purifica mediante la inyección del material sobrenadante en la columna preparativa C18 de 250x41 mm de RP-HPLC y las fracciones apropiadas se recogen eluyendo con un gradiente de agua frente a acetonitrilo u otro disolvente apropiado. Las fracciones se pueden evaporar para producir el compuesto.
A la muestra anterior, se añade 1 mL de metanol y se enfría a 0°C en un baño de hielo. A continuación, se puede
10 añadir una solución de metóxido de potasio (5,2 eq) en metanol o THF. Después de 30 minutos, se añaden exactamente 5,2 equivalentes de ácido acético. A continuación, se pueden añadir 3 mL de acetonitrilo y la muestra se puede filtrar. La muestra se puede purificar mediante la inyección del material sobrenadante en la columna preparativa C18 de 250x41 mm de RP-HPLC, y las fracciones apropiadas se pueden recoger eluyendo con un gradiente de agua frente a acetonitrilo u otro disolvente apropiado. Las fracciones se pueden evaporar para producir
15 el compuesto (25).
Ejemplo predictivo 10: Síntesis de diversos sustratos de P450
A una mezcla de la coelenterazina y 1,1 equivalentes de carbonato de potasio en DMF, bajo una atmósfera de argón, se podría añadir un equivalente de yoduro de metilo a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se
20 puede vigilar mediante cromatografía en capa fina. Al término de la reacción, la mezcla se puede enfriar en un baño de hielo durante varios minutos y se puede añadir un volumen de agua igual al volumen de la reacción. La mezcla resultante se puede extraer con un disolvente orgánico adecuado (p. ej., acetato de etilo) y los extractos se pueden concentrar para proporcionar el compuesto 1 crudo. El material se puede purificar adicionalmente mediante cromatografía sobre gel de sílice.
A una mezcla de la coelenterazina y 1,1 equivalentes tanto de carbonato de potasio como de yoduro de potasio, en DMF, bajo una atmósfera de argón, se podría añadir un equivalente de bromuro de p-metoxibencilo a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se puede vigilar mediante cromatografía en capa fina y, después de completarse la reacción, la mezcla de reacción se puede enfriar en un baño de hielo durante varios minutos antes de
30 la adición de un volumen de agua igual al volumen de reacción. La mezcla resultante se puede extraer con un disolvente orgánico adecuado (p. ej., acetato de etilo) y los extractos se pueden concentrar para proporcionar el compuesto 2 crudo. El material se puede purificar adicionalmente mediante cromatografía sobre gel de sílice.
Una mezcla de 3-bencil-5-fenilpirazin-2-amina (6) (1 equiv), ácido (E)-3-(4-((3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il)oxi)fenil)-2oxopropanoico (5) (1,5 equiv) y ácido sulfónico de alcanfor (1,5 equiv) en THF, se calienta a reflujo en presencia de tamices moleculares hasta que la condensación de los materiales de partida es completa. La mezcla de reacción se 5 diluye con acetato de etilo hasta 3 veces su volumen y se lava con agua y solución de salmuera. Después de secar sobre sulfato de sodio, el disolvente se elimina a vacío y el residuo que contiene el compuesto 7 se disuelve en DMF seca. La solución resultante se trata con anhídrido acético (1,5 equiv) y piridina (1,5 equiv) a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se puede controlar mediante TLC, y una vez completada, la mezcla de reacción se enfría en un baño de hielo durante varios minutos antes de la adición de un volumen de agua igual al volumen de la 10 reacción. La mezcla resultante se extrae con un disolvente orgánico adecuado (p. ej., acetato de etilo) y los extractos se concentran para proporcionar el compuesto 8. El material se disuelve en metanol y, después de enfriar a aproximadamente 0°C, se trata con borohidruro de sodio (5-10 equiv) en pequeñas porciones hasta que se completa la formación de producto. Mientras que aún está fría, la mezcla de reacción se puede tratar con ácido acético en una cantidad equivalente a los moles de hidruro añadidos previamente, y la mezcla de reacción se puede concentrar a 15 vacío. El residuo se puede triturar con agua varias veces para proporcionar el compuesto 3 crudo. Este material se
puede purificar usando cromatografía sobre gel de sílice.
Una mezcla de 3-bencil-5-(4-(3,3-dimetoxipropoxi)fenil)pirazin-2-amina (10) (1 equiv), ácido 2-oxo-3-fenilpropanoico
(9) (1,5 equiv) y ácido alcanfor sulfónico (CSA) (1,5 equiv) en THF, se calienta a reflujo en presencia de tamices
20 moleculares hasta que se completa la condensación de los materiales de partida. La mezcla de reacción se diluye con acetato de etilo hasta 3 veces su volumen y se lava con agua y solución de salmuera. Después de secar sobre sulfato de sodio, el disolvente se elimina a vacío y el residuo que contiene 11 se disuelve en DMF seca. La solución resultante se trata con anhídrido acético (1,5 equiv) y piridina (1,5 equiv) a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se puede controlar mediante TLC, y una vez completada, la mezcla de reacción se enfría en un baño de
25 hielo durante varios minutos antes de la adición de un volumen de agua igual al volumen de la reacción. La mezcla resultante se extrae con un disolvente orgánico adecuado (p. ej., acetato de etilo) y los extractos se concentran para
proporcionar el compuesto 12. El material se disuelve en metanol y, después de enfriar a aproximadamente 0°C, se trata con borohidruro de sodio (5-10 equiv) en pequeñas porciones hasta que se completa la formación de producto. Mientras que aún está fría, la mezcla de reacción se trata con ácido acético en una cantidad equivalente a los moles de hidruro añadidos previamente, y la mezcla de reacción se concentra a vacío. El residuo se tritura con agua varias
5 veces para proporcionar el compuesto 4 crudo. Este material se puede purificar usando cromatografía sobre gel de sílice.
Ejemplo 11: Medición de NADH
Un sustrato de pro-coelenterazina de la presente invención para la detección de diaforasa se utilizó para medir la cantidad de NADH presente en una muestra. Mediante la combinación de NADH, diaforasa, el sustrato de pro
10 coelenterazina y esterasas, se detectó el NADH presente en la muestra. El sustrato de pro-coelenterazina utilizado por la diaforasa se convirtió en coelenterazina. La cantidad de coelenterazina generada se detectó a través de una variante de luciferasa de Oplophorus, y la luminiscencia generada es proporcional a la cantidad de NADH presente en la muestra.
Para el ensayo, se incubaron 10 µL de NADH (en dosis ajustadas de 60 µΜ a0 µΜ), 10 µL de 12 U/mL de enzima
15 diaforasa en PBS, 10 µL de 165 U de esterasa en PBS y 10 µL de PBI-4600 60 µΜ en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, se añadió un reactivo para la detección de la luciferasa de Oplophorus (MES 100 mM pH 6, CDTA 1 mM, KCl 150 mM, tiourea 35 mM, DTT 1 mM, 0,5% de Tergitol y 0,05% de Mazu) que contenía una variante de luciferasa de Oplophorus (L27V) en una dilución de 109. La luminiscencia se midió a los 5 minutos y al cabo de 1 hora (FIG. 9).
20 Los datos muestran que los compuestos de la presente invención se pueden usar para medir NADH en una muestra mediante la detección de una enzima que utiliza NADH.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula (II):
    en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
    11 AA
    Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
    10 en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
    A CC
    Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado a partir de
    cada RX es independientemente H, halógeno o NO2
    cada RY es independientemente H o Me
    cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S
    5 nesde0a3;
    cada R es independientemente un alquilo C1-7;
    T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;
    V es -S-u -O-; y
    los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.
    10 2. Un compuesto de fórmula (I):
    en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5;
    2’ AA
    Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
    en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
    A CC
    Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;
    10 L es un enlazador seleccionado entre
    cada RX es independientemente H, halógeno o NO2
    cada RY es independientemente H o Me
    cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S 15 nesde0a3;
    cada R es independientemente un alquilo C1-7;
    T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;
    V es -S-u -O-; y
    los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.
    20 3. Un compuesto de fórmula (III):
    en donde R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(O)R u -OCH2OC(O)R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
    12 AA
    5 Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
    en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
    A CC
    Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA;
    10 RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado entre
    cada RX es independientemente H, halógeno o NO2
    cada RY es independientemente H o Me
    cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S
    V es -S-u -O-;
    cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-;
    cada R es independientemente alquilo C1-7; y
    los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.
  2. 4. Un compuesto de fórmula (IV):
    en donde R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en
    16 AA
    Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC(O)O-R, N(RB)2 o -NHC(O)ORA;
    5 en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;
    A CC
    Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado entre
    cada RX es independientemente H, halógeno o NO2
    cada RY es independientemente H o Me
    cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S
    n es de0 a 3; 15 T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;
    V es -S-u -O-;
    cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-;
    cada R es independientemente alquilo C1-7; y
    los enlaces con línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.
    20 5. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4,
    en elqueR2 es
    o alquilo C2-5 de cadena lineal; cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; Z es -CH-o -N-; Y es -H u -OH; W es -NH2, halo, -OH, -NHC(O)R, -CO2R; y R es alquilo C1-7.
  3. 6. Un compuesto según la reivindicación 5, en el que
    10 Res Xes O o S.
  4. 7.
    Un compuesto según la reivindicación 5, en el que R2 es alquilo C2-5 de cadena lineal.
  5. 8.
    Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que R8 es , cicloalquilo inferior o H, en el que R3 y R4 son ambos H o alquilo C1-2.
    15 9. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que R8 es bencilo.
  6. 10.
    Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que V es S.
  7. 11.
    Un método para detectar la presencia o la cantidad de una enzima que comprende: poner en contacto una muestra sospechosa de contener la enzima con un compuesto según una cualquiera
    de las reivindicaciones 1 a 10; y 20 detectar la luminiscencia de la muestra.
  8. 12.
    El método según la reivindicación 11, en el que la luminiscencia se cuantifica.
  9. 13.
    El método según la reivindicación 11, en el que la muestra es sospechosa de contener una segunda enzima, que comprende
    poner en contacto la muestra con un segundo compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 10, en donde el segundo compuesto contiene un sustrato para la segunda enzima; y
    detectar la luminiscencia de la muestra.
  10. 14. Un método para detectar la presencia de una enzima in vivo que comprende: administrar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a un animal transgénico; y detectar la luminiscencia.
    30 15. Un método para detectar la presencia de una enzima que comprende: administrar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a un animal; obtener una muestra a partir del animal; y
    detectar la luminiscencia de la muestra.
  11. 16. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en:
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