JP6041442B2 - 酸化型グルタチオンアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、2010年9月1日に出願された米国特許出願第61/379,203号の利益を主張する。
1.還元型グルタチオンからのシグナル生成のために使用される試薬は、試料中に存在する他のSH基からの実質的なシグナルを生成してはならない。
2.GSH検出反応の特異性も、試料中に存在するタンパク質上に存在するものを含む、反応中に存在する他のSH基の存在からはシグナルを生成しない。
3.アルキル化剤と試料中に存在する全てのSH基との反応は、本質的に即時的であり、非常に短期間のうちに完了しなければならず、よって、試薬がGSHに到達することができるとすぐに、試料中の既存のGSHを完全に排除することができる。
4.細胞からGSHを放出するために使用される物質は、アルキル化試薬を不活性化してはならないが、迅速かつ完全に細胞を溶解させることができなければならず、よって、試薬が添加されるとすぐに、試料からのGSHを完全に排除することができ、それによって試料中のあらゆるGSHのGSSGへの酸化を防止し、そうすることで試料中のGSSGのレベルを本質的に「凍結させる」。
5.添加される還元剤の添加は、それが、還元剤が試料中のGSSGから形成する可能性のあるいずれかのGSHを修飾することができる前にアルキル化剤を最初に不活性化しなければならないか、又はGSH検出酵素(この場合はGST)を不活性化させる。
6.ルシフェラーゼに基づく検出システムの感度は、試料中に存在するGSSGの量から生成された非常に低レベルのルシフェリンを正確に検出することができなければならない。
したがって、長年の間存在してきた問題を解決するためのこれら全ての要因の組み合わせは、新規であると同時に予期せぬものである。
本明細書で使用される場合、以下の用語及び表現は、指示された意味を有する。本発明の化合物は、非対称に置換された炭素原子を含有し、光学活性形態又はラセミ形態に単離されてもよいことを認識されたい。ラセミ形態の分割による又は光学活性出発材料からの合成による等の光学活性形態の調製の仕方は、当該技術分野において周知である。ある構造の全てのキラル、ジアステレオ異性、ラセミ形態、及び全ての幾何異性体形態が、本発明の一部である。
一態様において、本発明は、試料中のGSSGを検出する方法を提供する。別の態様において、本発明は、試料中のGSH対GSSGの比率を検出する方法を提供する。GSH対GSSGの比率は、しばしば細胞のレドックス状態をモニタリングするために使用されるため、本発明の方法は、細胞におけるレドックス状態を検出するために使用することができる。
好適な基質は、限定されないが、下の式(I)、(II)、及び(III)の化合物を含む。
Yは、O、OSO2、又はOP(O)OR(式中、Rは任意のアルキル又はアリールエステルである)であり、
R1は、H、F、又はOHであり、
R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、
R3、R3’、R4は、独立して、NO2、CF3、又はHであり、
Zは、CH又はNである。
R1は、H、F、又はOHであり、
R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、
R3、R3’、又はR4は、独立して、NO2、CF3、又はHである。
R1、R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、低級アルキル(C1−C6)、CF3、ハロゲン、NO2、CO2R(式中、Rは、HもしくはC1-6アルキルである)であるか、又は任意の2つの隣接するR1−R5が縮合環(例えば、ベンゾ、ナフト、複素環)を形成することができるが、但し、R1、R3、又はR5のうちの少なくとも1つはNO2であり、3つ全てがNO2ではないものとする。
GST−21(実施例19)の合成に使用したものと同様の方法を用いてGST−22を調製した。
GST−21の合成(実施例19)に使用したものと同様の方法を用いてGST−23を調製した。
GST−21の合成(実施例19)に使用したものと同様の方法を用いてGST−24を調製した。
GST−21の合成(実施例19)に使用したものと同様の方法を用いてGST−25を調製した。
ルシフェリン誘導体GST−3をGSTのための基質として調製し、2段階形式でテストした。第1段階において、グルタチオンを含むか又は含まないGST酵素を含有する混合物にGST−3を添加した。反応開始後の異なる時点で、反応物の一部をルシフェラーゼ反応混合物と混合した。経時的に光の生成が増加した反応は、誘導体GST−3が、GSTのための基質であり、GST及び/又は還元型グルタチオン(GSH)を検出するためのアッセイにおいて使用できることを示唆する。
以下の実施例は、GSTのためのルシフェリン誘導体基質を使用してGSSGの蛍光検出を達成することができることを実証するものである。
1.滴定(0、5、10、15、20、及び25uM)還元型グルタチオン(GSH、Sigma:1mlの1×PLBに希釈された100mMの1ul)
2.滴定(0、5、10、15、20、及び25uM)酸化型グルタチオン(GSSG、Sigma:1mlの1×PLBに希釈された10mMの2ul)
3.滴定(0、5、10、15、20、及び25uM)酸化型グルタチオン(高濃度(25uM)の還元型グルタチオン/GSHの存在下)
4.グルタチオン対照なし
還元型グルタチオンの滴定:
EMに曝露されていない場合、還元型グルタチオンの量の増加により、GSTの作用による経時的なルシフェリン濃度の増加がもたらされることが予想される。しかしながら、酵素を添加する前に還元型グルタチオンをNEMで処理した場合、NEMが還元型グルタチオンと反応し、プレルシフェリンをルシフェリンに変換するためにGSTによって使用されない新しい化学種を生成するため、シグナルは本質的に失われるはずである。これが正解である場合、時間の増加及びNEMを含有する試料中のグルタチオン濃度の増加に伴って蛍光の増加が見られるはずであり、また、グルタチオン濃度の増加に伴って発光の増加が予想される。その一方で、NEMを含有するウェルには、「化合物を含まない」試料を超えるごくわずかな蛍光又は発光が見られることが予想される。
各試料に還元剤(DTT)も添加することにより試料中のGSSGを減少させ、NEMを不活性化させるため、酸化型グルタチオンの量の増加によっても、GSTの作用による経時的なルシフェリン濃度の増加がもたらされることが予想される。GSSGはNEMによってアルキル化されないため、最初にGSHに還元されない限り、経時的に及びGSSGの濃度とともに、GSSGの滴定を含む試料において同様の光の増加が予想される。
これらの試料には高レベルの還元型グルタチオンが添加されているため、NEMも含有しない試料は、非常に高いシグナルを発することが予想され、実際には、GSSGからの追加シグナルは還元型グルタチオンからのシグナルに加えられるため、GSSGの滴定においてさらなる蛍光又は発光の増加をあまり示さない可能性がある。NEM、大量のGSH、及び様々な量のGSSGを含有する試料は、NEMによって排除された還元型グルタチオンからのシグナルを有することが予想され、よって、蛍光及び発光の増加率は、還元型グルタチオンを添加せずにGSSGを添加した試料の増加率と同様であることが予想される。
NEMを添加していない還元型グルタチオンのウェル:
NEMを添加していない還元型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、時間及びグルタチオン依存性の蛍光増加率を示す。このことは、これらのウェルで生成されたルシフェリンは、蛍光を測定することによって検出することができ、蛍光のレベルが、溶液中に存在する還元型グルタチオンの量に比例することを裏付けるものである。また、予想されたように、添加するグルタチオンの量を増加させると、発光の増加が見られた(図4B)。
GSHの添加によって生成されたシグナルをNEMが中和させることが予想されたため、NEMが存在する還元型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、ごくわずかな蛍光の増加を示した。また、予想されたように、GSHを含有しない試料と、最も高いレベルのGSHを含有する試料との間に、ごくわずかな発光の差が見られた(図4BとCを比較)。
NEMの存在下又は非存在下で酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、時間及びグルタチオン依存性の蛍光増加率を示す。このことは、これらのウェルで生成されたルシフェリンは、蛍光的に検出することができ、蛍光のレベルが、存在する酸化型グルタチオンの量に比例することを裏付けるものである。また、予想されたように、添加するグルタチオンの量を増加させると、これらの試料から発光の増加が見られた。また、NEMの非存在下で測定された値は、NEMの存在下で測定された値と同様である(図4BとCを比較)。
NEMは用いないが、高濃度の還元型グルタチオンの存在下での酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、時間依存性の蛍光の増加を示し、蛍光のレベルは、還元型グルタチオンの非存在下で酸化型グルタチオンの滴定に見られたものよりもはるかに高かった。これらのウェルにおけるシグナル生成のために存在するグルタチオンの合計レベルが非常に高いため、このことは予想された。また、予想されたように、これらの試料には非常に強い発光が認められた(図4B)。
高レベルの還元型グルタチオン及びNEMの存在下で酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、時間依存性の蛍光の増加を示し、蛍光のレベルは、GSHを添加していない酸化型グルタチオンの滴定を含むウェルに非常に類似していた。還元型グルタチオンのシグナルを生成する電位はNEMによって排除されているはずであり、よって、生成されたいずれのシグナルも、ウェルに添加された酸化型グルタチオンの結果であるはずであるから、このことは予想された。また、予想されたように、これらの試料からの発光は、酸化型グルタチオンを単独で添加したウェルからの発光と非常に類似しており(図4BとCを比較)、25μM GSHの存在下及びNEMの非存在下でGSSGを含有する試料から測定されたものよりもはるかに低い(図4B)。
固体のGSTルシフェリン誘導体GST30及びGST28をDMSOに溶解して4mg/mlの溶液を作製した。
この実施例では、GST及びグルタチオンの使用により、クマリン誘導体から蛍光シグナルを生成する。
図6は、GST酵素の添加後1、3、5、及び20分のプレート「4153」の画像を示す。緩衝液のみを有する試料(「対照ウェル」)の蛍光には明らかな増加は見られず、クマリン誘導体を含む還元型グルタチオンの存在のみでは蛍光種が生成されないことを裏付けている。しかしながら、含有するGST Mの量を減少させた試料には比較的急速な蛍光の増加が見られ、含有するGST Aの量を減少させた試料ではより緩やかな増加率、そしてGSTを含有する試料では更により緩やかな増加率であった。これらの結果は、GST Mが、蛍光クマリン誘導体を生成するための基質としてクマリン化合物を迅速に利用することができることを示している。GST Aも化合物を利用することができるが、より緩やかな速度である。Promega(V689B)からのGSTも化合物を利用したが、GST Aよりも更に緩やかな速度であった。GST Pでは、この酵素形態を含有するウェルには蛍光の増加が見られなかったことから、化合物を利用しなかったか、又は極々緩やかな速度で利用したかのいずれかであった。
本発明の方法は、接着性哺乳類細胞及び懸濁哺乳類細胞中の還元型グルタチオン(GSH)対酸化型グルタチオン(GSSG)の比率及び/又はGSSGのみを測定するように設計される。セクションBでは、試料中のGSHのモルをGSSGのモルで除すことにより、どのように比率が算出されるかを説明する。
i.接着性細胞の播種
アッセイは、ウェル当たり5,000〜10,000細胞のHeLa又はHepG2細胞、及び10,000〜20,000細胞/ウェルの肝細胞等の、低い細胞密度に最適化されている。HeLa又はHepG2細胞は、Corning Costar 3903 96ウェル平底組織培養プレート(白色に処理済み、透明底を有する)上に播種した。肝細胞は、BD BioCoat(商標)4650 96ウェルCollagen 1 Cellware上に播種した。業者の推奨する肝細胞培地を用いて肝細胞を培養した。透明な壁の組織培養プレートを使用する場合は、ルシフェラーゼ検出試薬(LDR)の添加後に、反応物を照度計のプレートに入れるための移動ステップが行われなければならない。細胞を播種し、5%CO2の培養インキュベータにて37℃で一晩インキュベートする。
メナジオンは、反応性酸素種(ROS)誘導物質であり、陽性対照として使用される。クレブス・リンゲル液、クレブス・ヘンゼライト液、又はハンクス平衡塩(HBSS)緩衝液中で40μΜメナジオンを調製した。血清、フェノールレッド、及びシステイン等の細胞培養培地の構成成分は、アッセイ化学に干渉する可能性があるため、他の緩衝液がメナジオンを希釈するために使用されてもよい。メナジオンで細胞を処理するのと同時に細胞の培養培地を緩衝液+ビヒクルと交換することにより、処理対照(ビヒクルのみ)は行わなかった。
Jurkat又はHela細胞等の懸濁細胞をクレブス・リンゲル液、クレブス・ヘンゼライト液、又はハンクス平衡塩(HBSS)緩衝液中で洗浄し、培地及び血清の痕跡を除去した。次いで、細胞を数え、所望の密度で上記緩衝液のうちの1つに希釈した。Jurkat細胞の場合、10,000〜20,000細胞/ウェルを使用した。次いで、(所望の密度の)細胞懸濁液20μlを96ウェルプレートのウェルに添加した。化合物の処理、ビヒクルのみの処理、及び処理対照なしについてテストするために、十分な細胞をウェルに播種した。次いで、5μlのテスト化合物、例えば5×濃度のメナジオンを、テスト化合物で処理した細胞に添加し、5μlのビヒクルのみ、例えばDMSOを、ビヒクルのみで処理した細胞に添加した。次いで、5%CO2インキュベータにて、37℃で60分間細胞をインキュベートした。
GSSGの測定のために以下の試薬を調製した。溶液は、GSHをブロックするための250μΜ N−エチルマレイミド(NEM)及びプロルシフェリン基質GST−22を細胞溶解溶液中に含有する。96ウェルプレートの各ウェルは、50μlを必要とする。
GSHの測定のために以下の試薬を調製した。GSH溶液は、NEMを含有しない。96ウェルプレートの各ウェルは、50μlを必要とする。
ルシフェリン生成試薬は、GSH−Glo buffer(Promega、カタログ番号V6911)に希釈されたDTT及びグルタチオン−Sトランスフェラーゼ(Promega)を含有する。全てのアッセイウェルに試薬を添加した。96ウェルプレートの各ウェルは、50μlを必要とする。
凍結乾燥したルシフェリン検出試薬(Promega、カタログ番号V859B)をエステラーゼを含有する再構成緩衝液(Promega、カタログ番号V144A)1瓶で再構成することにより、ルシフェリン検出試薬を調製した。96ウェルアッセイの各ウェルは、100μlのLDRを受容する。
GSH標準曲線の包含により、発光(相対発光量又はRLU)の生成とGSH及びGSSGの濃度との相関が可能になる。5mMグルタチオンを水中で320μΜに希釈することにより、20×濃度のグルタチオンを調製した。例えば、32μlの5mM GSHを468μlの水に希釈した。250μlの320μΜ GSHを250μlの水に移すこと等によって段階希釈を行った。5μl/ウェルの各GSHを3回希釈した。例えば、5μlの320μΜ GSHは、標準曲線の16μΜ GSHに対応する。GSHの標準曲線は、接着性細胞アッセイ及び懸濁細胞アッセイの両方で同じであった。
接着性細胞から化合物処理を除去し、廃棄した。GSSGの測定のために、25μl/ウェル又は50μl/ウェルの酸化型グルタチオン試薬を、それぞれ、懸濁細胞又は接着性細胞に添加した。GSHの測定のために、25μl/ウェル又は50μl/ウェルの総グルタチオン試薬を、それぞれ、懸濁細胞又は接着性細胞に添加した。GSHの標準曲線の測定のために、50μl/ウェルの総グルタチオン試薬を添加した。プレート振盪機上でプレートを5分間室温で振盪させ、50μl/ウェルのルシフェリン生成試薬を全てのウェルに添加した。再度、プレートを短時間振盪させ、室温で30分間インキュベートした後、100μl/ウェルのルシフェリン検出試薬を添加した。再度、プレートを短時間振盪させ、室温で10分間インキュベートして発光を読み取った。
GSSG:GSHの比率は、試料中のGSHのモルを試料中のGSSGのモルで除すことによって算出される。GSSGの各モルは2モルのGSHを生成するため、また、アッセイは、GSSGの還元によって生成される全てのGSHからシグナルを生成するため、GSHの標準曲線によって定量化されるGSHのモル数には2倍の調整が必要である。
細胞を含まない対照から生成された発光(RLU)又は標準曲線から生成された0μΜのGSHをバックグラウンドに用いた。処理細胞及び未処理細胞について、処理細胞及び未処理細胞から生成されたRLUから、全てのウェルからのバックグラウンドの平均を引いて正味のRLU値を求めた。次の式を使用して、未処理細胞のGSH/GSSGの比率を算出した。
発光(RLU)対GSHの濃度(μΜ)をプロットした。第2のプロットは、GSSGの濃度を決定するために作製した:X軸上に、GSH値を2で除すことによってGSSGの濃度を求めた。注)GSSG1モル当たり2モルのGSHなので、GSHの濃度を2で除すとGSSGの濃度が得られる。各標準曲線の直線部分によって生成された勾配(m)及び式(Y−B)/mを使用して、処理細胞及び未処理細胞の平均RLU(正味のRLUではない)値をGSSG及びGSHのμΜに変換した。細胞を含まない対照からのRLU値、すなわち、0μΜのGSHを、式(Y−B)/mにおいて「B」として使用した。したがって、未処理細胞のGSH/GSSGの比=未処理GSHのμΜ−未処理GSSのμΜ×2)/未処理GSSGのμΜであり、処理細胞のGSH/GSSGの比=処理GSHのμΜ−(処理GSSGのμΜ×2)/処理GSSGのμΜ(図7)である。
i.5,000細胞/ウェルのHeLa細胞を、40uMメナジオン又は0.1%DMSO(ビヒクル)で60分間処理した。Aに記載した方法によりGSSG及びGSHを検出した。Bに記載したようにGSH/GSSGの比率を算出した。
試薬
細胞再懸濁緩衝液:PBS、10mM DTT、2.5mM PMSF
カラム洗浄及び平衡化緩衝液:PBS、10mM DTT
10×緩衝液A:200mMリン酸ナトリウム、一塩基、pH4.0、5M NaCl
1×緩衝液A:20mMリン酸ナトリウム、一塩基、pH4.0、500mM NaCl
溶出緩衝液:20mMリン酸ナトリウム、一塩基、pH4.0、500mM NaCl、8M尿素
TEDG緩衝液:1×TE、1mM DTT、10%グリセロール
保存緩衝液:1×PBS、50%グリセロール
100gの細胞ペースト(大腸菌を発現する日本住血吸虫GST酵素)を600mlの細胞再懸濁緩衝液に再懸濁した(緩衝液6ml/細胞ペースト1g)。細胞懸濁液が均一になるまで溶液を混合し、次いで、溶液を氷上に置いた。
細胞懸濁液を9000psiでマントンゴーリンに2回通過させることにより再懸濁した細胞を破砕し、氷塩浴中に置いたステンレススチール製バケツに可溶化液を回収した。2回目に通過させた後、100〜200mlの細胞再懸濁緩衝液でマントンゴーリンを洗浄し、可溶化液と合わせた。次いで、4℃で60分間、16,000×gで可溶化液を遠心分離した。
還元型グルタチオンを含むGST親和性樹脂及びSepharose CL−4Bゲル濾過媒体(Sigma)を使用して精製カラムを調製した。樹脂2ml/細胞ペースト1gの樹脂対細胞ペーストの比率で147mlのGST親和性樹脂をカラムに充填した。
最初に、プールした各GST酵素溶液を、20LのTEDG緩衝液(10〜20プール体積)中、4℃で2.5時間、それぞれ2回透析した。10Lの保存緩衝液(10プール体積)中でそれぞれ2回最終透析を行った:最初に4℃で25時間行い、2回目に4℃で15時間行った。次いで、それぞれの透析した画分を、保存緩衝液中で4mg/mlの濃度になるよう調整し、使用するまで酵素溶液を4℃で保存した。
この実施例では、細胞中の反応性酸素種の生成に影響を与える可能性がある化合物(複数可)又は化学物質(複数可)を用いた処理の後に、細胞の健康をモニタリングするための方法を提供する。種々の研究者によって、哺乳類細胞が、細胞から酸化型グルタチオン(GSSG)を輸送するトランスポーターを発現することが同定されている(Minich,T.et.al,J.Neurochem.2006,vol97,p373−384)。GSSGの輸送は、細胞中に存在するGSSGのレベルと関連しているはずであり、したがって、化合物(複数可)又は化学物質(複数可)の輸送は、グルタチオン還元酵素等の酵素による細胞中のGSSGからのGSHの再生と競合する。よって、細胞外GSSGの増加を測定することによって、細胞中のGSSGレベルの増加を検出することが可能であり得る。
1.細胞の可溶化液から細胞のGSH及びGSSGを測定したが、溶解する前に、HBSS緩衝液を含むビヒクル又はメナジオン処理を除去した。
2.培地のGSH及びGSSGは、細胞から移したHBSS緩衝液から測定した。
3.GSH合計及びGSSG合計は、HBSS緩衝液で処理した細胞の可溶化液から測定したが、PLBを添加する前にHBSS緩衝液を除去しなかった。
Claims (17)
- GSSGを検出するための方法であって、以下の工程、
a.試料をスルフヒドリルアルキル化剤、及び任意で、溶解剤と接触させる工程と、
b.前記試料を、過剰な還元剤と、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させる工程であって、前記過剰の還元剤が、前記試料に添加される前記スルフヒドリルアルキル化剤の濃度よりも約2〜5倍高い工程と、
c.シグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記シグナルが、定量化される、請求項1に記載の方法。
- GSH:GSSGの比率を決定するための方法であって、以下の工程、
a.任意で試料を溶解剤と接触させる工程と、
b.前記試料の一部を除去する工程と、
c.残りの試料をスルフヒドリルアルキル化剤と接触させる工程と、
d.前記残りの試料に、過剰な還元剤と、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に
変換される基質と、を添加して第1の溶液を形成する工程であって、前記過剰の還元剤が、前記試料に添加される前記スルフヒドリルアルキル化剤の濃度よりも約2〜5倍高い工程と、
e.前記第1の溶液のシグナルを測定する工程と、
f.前記除去した試料を、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質
と、に接触させて第2の溶液を形成する工程と、
g.前記第2の溶液のシグナルを測定する工程と、
h.前記第2の溶液の前記シグナルを前記第1の溶液の前記シグナルと比較してGSH対GSSGの比率を決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 試料中の酸化ストレスを決定する方法であって、以下の工程、
a.前記試料をスルフヒドリルアルキル化剤、及び任意で、溶解剤と接触させる工程と、b.前記試料を、過剰な還元剤と、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させる工程であって、前記過剰の還元剤が、前記試料に添加される前記スルフヒドリルアルキル化剤の濃度よりも約2〜5倍高い工程と、
c.前記シグナルを測定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記試料が、細胞、培地、血漿、血清、血液、又は組織抽出物を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが、蛍光である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが、発光である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基質が、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でルシフェリンに変換されるルシフェリン誘導体である、請求項1〜5及び7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基質が、式(III)、
式中、Xは、N又はOであり、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、C1-6アルキル、CF3、ハロゲン、NO2、CO2Rであるか、又はいずれか2つの隣接するR1−R5が縮合環を形成することができるが、但し、R1、R3、又はR5のうちの少なくとも1つはNO2であって、3つ全てがNO2でなく、
Rは、H又はC1-6アルキルである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記基質が、下式、
式中、nが0であって、XがSであるか、又はnが1であって、XがCHであり、
Yは、O、OSO2、又はOP(O)OR(Rは任意のアルキル又はアリールエステルである)であり、
R1は、H、F、又はOHであり、
R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、
R3、R3’、R4は、独立して、NO2、CF3、又はHであり、
Zは、CH又はNである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記基質は、下式、
式中、nが0であって、XがSであるか、又はnが1であって、XがCHであり、
R1は、H、F、又はOHであり、
R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、
R3、R3’、又はR4は、独立して、NO2、CF3、又はHである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記縮合環が、ベンゾ、ナフト、又は複素環である、請求項9に記載の方法。
- 前記基質が、次式、
- 前記ルシフェリンが、ルシフェラーゼによって検出される、請求項1〜5及び7〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記スルフヒドリルアルキル化剤が、NEMである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤が、DTTである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのステップが、自動化される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
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