CN114577929B - 还原型谷胱甘肽的测量方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及测试领域，特别涉及一种还原型谷胱甘肽的测量方法。该测量方法包括以下步骤：利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，测量改性谷胱甘肽的含量。该测量方法可显著提高还原型谷胱甘肽的测量准确度。
Description
技术领域
本申请涉及测试领域，特别涉及一种还原型谷胱甘肽的测量方法。
背景技术
目前已报道的可用于测量谷胱甘肽含量的方法中主要有：高效液相色谱法(如CN201811581397)，比色法(如CN201110025402)等。高效液相色谱法通过测量色谱保留时间和紫外吸收强度来测量谷胱甘肽的含量。比色法是基于谷胱甘肽中巯基的选择性反应所得产物的吸收光谱变化来测量谷胱甘肽的含量。
目前常用的液相色谱法可直接对谷胱甘肽进行测定，但是谷胱甘肽的响应波长接近远紫外区、且其吸光度值低、在反相色谱柱上的保留时间短，因而谷胱甘肽的测量极易被基线波动或者被其他化合物的响应干扰，影响测量结果的准确性。此外，还原型谷胱甘肽的巯基反应活性强，极易被氧化为氧化型谷胱甘肽，或与亲核试剂(如烯基、炔基等)、金属(如金、铜等)发生反应，这也会导致测量结果偏低。比色法都是针对巯基的选择性反应，如果样品中有含巯基的杂质化合物(如半胱氨酸等)，测量结果将受到严重干扰。由此，目前的测试方法还不能准确测量还原型谷胱甘肽的含量。
发明内容
本申请公开了一种还原型谷胱甘肽的测量方法，该测量方法可显著提高还原型谷胱甘肽的测量准确度。
为达到上述目的，本申请提供以下技术方案：
一种还原型谷胱甘肽的测量方法，包括以下步骤：
利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，测量改性谷胱甘肽的含量。
进一步地，所述利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，包括：
将含有还原型谷胱甘肽的待测溶液的pH值调节至7.1-14，加入卤代芳香烃至所述待测溶液中，所述卤代芳香烃与所述待测溶液中的还原型谷胱甘肽反应结束后，在所述待测溶液中形成所述改性谷胱甘肽。
其中，可加入氢氧化钠、氢氧化钾等碱性化合物对待测溶液的pH值进行调节，以使待测溶液处于碱性环境，以催化反应进行。
进一步地，所述卤代芳香烃包括苄氯、苄溴以及2-苯基溴代乙烷中的至少一种。
进一步地，所述卤代芳香烃与所述还原型谷胱甘肽的反应过程中的温度为15-55℃，反应时间为15min-120min。
进一步地，所述卤代芳香烃与所述还原型谷胱甘肽的摩尔比1:1-5:1。
进一步地，所述测量改性谷胱甘肽的含量，包括：
将含有所述改性谷胱甘肽的所述待测溶液注入液相色谱仪中，利用反相色谱柱进行色谱分离，在205nm-280nm范围内进行所述改性谷胱甘肽含量的检测。
进一步地，先将含有所述改性谷胱甘肽的所述待测溶液的pH值调节至7-8之间，再进行所述改性谷胱甘肽的测量。
采用本申请的技术方案，产生的有益效果如下：
本申请提供的测量方法，利用卤代芳香烃与还原型谷胱甘肽的巯基的特异性反应，将芳香基团结合到还原型谷胱甘肽分子上，可在增加GSH的疏水性的同时，提高其在近紫外区的吸光度；然后将所得改性谷胱甘肽注入到高效液相色谱仪中进行分析，从而实现GSH的高准确度测量。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是：本申请中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。本申请中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。本申请中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。本申请中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。本申请中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。本申请中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本申请中。
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属)等结合，而具有整合解毒作用。故谷胱甘肽(尤其是肝细胞内的谷胱甘肽)能参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。谷胱甘肽还能帮助保持正常的免疫系统的功能。谷胱甘肽以还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathiol，GSSG)两种形式存在。还原型谷胱甘肽是一种护肝物质，某些食品或保健品中也含有还原型谷胱甘肽，建立精确测量还原型谷胱甘肽的方法对药物的质量控质及对食品、保健品等的质量监测都具有重要意义。还原型谷胱甘肽的巯基反应活性强，极易被氧化为氧化型谷胱甘肽，或与亲核试剂(如烯基、炔基等)、金属(如金、铜等)发生反应，因此，测试时常会导致测量结果偏低，目前的测量方法还不能准确测量还原型谷胱甘肽的含量。
为解决上述技术问题，本申请提供一种还原型谷胱甘肽的测量方法，该测量方法包括以下步骤：
利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，测量改性谷胱甘肽的含量。
本申请提供的测量方法，利用卤代芳香烃与还原型谷胱甘肽的巯基的特异性反应，将芳香基团结合到还原型谷胱甘肽分子上，可在增加GSH的疏水性的同时，提高其在近紫外区的吸光度；然后将所得改性谷胱甘肽注入到高效液相色谱仪中进行分析，从而实现GSH的高准确度测量。
具体的，本申请的测量方法，通过化学反应在还原型谷胱甘肽上键合疏水基团，从而显著提高还原型谷胱甘肽在反相色谱柱上的保留时间，以提高色谱分离度。另外，所键合的疏水基团中的苯环为生色基团，因而所得产物在近紫外区具有良好的吸光度，提高还原型谷胱甘肽在紫外检测器中的响应。此外，通过化学反应在巯基上连接烃类基团，从而钝化巯基的反应活性，避免因巯基的化学反应而造成的损失，提高检测准确度。再者，所设计的反应只针对还原型谷胱甘肽，可以避免氧化型谷胱甘肽的干扰，而且通过色谱分离的方法，也可以排除半胱氨酸的干扰，从而获得高准确度的测量结果。
在本申请一种实现方式中，所述利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，包括：将含有还原型谷胱甘肽的待测溶液的pH值调节至7.1-14，加入卤代芳香烃至所述待测溶液中，所述卤代芳香烃与所述待测溶液中的还原型谷胱甘肽反应结束后，在所述待测溶液中形成所述改性谷胱甘肽。
其中，所述卤代芳香烃包括苄氯、苄溴以及2-苯基溴代乙烷中的至少一种。
在本申请一种实现方式中，所述卤代芳香烃与所述还原型谷胱甘肽的反应过程中的温度为15-55℃，反应时间为15min-120min。
在本申请一种实现方式中，所述卤代芳香烃与所述还原型谷胱甘肽的摩尔比1:1-5:1。
在本申请一种实现方式中，所述测量改性谷胱甘肽的含量，包括：将含有所述改性谷胱甘肽的所述待测溶液注入液相色谱仪中，利用反相色谱柱进行色谱分离，在205nm-280nm范围内进行所述改性谷胱甘肽含量的检测。
在本申请一种实现方式中，先将含有所述改性谷胱甘肽的所述待测溶液的pH值调节至7-8之间，再进行所述改性谷胱甘肽的测量。
在本申请一种实现方式中，还原型谷胱甘肽的测量方法包括以下步骤：
准确称量待测量样品，并将其充分溶解在洁净水中，如果有未溶解成分，用0.22μm滤膜过滤，之后使用容量瓶进行定容；量取所得溶液，加入氢氧化钠溶液，使得最终溶液体系中氢氧化钠的浓度可为1mol/L-3mol/L，随后加入卤代芳香烃(可为苄氯、苄溴、2-苯基溴代乙烷等，卤代芳香烃与GSH含量之比可为1:1-5:1之间)；充分搅拌反应，反应温度可在15-55℃，反应时间为15min-2h；所得反应溶液加适量盐酸调节其pH在7-8之间，取样注入高效液相色谱仪进行定量分析，采用反相色谱柱进行色谱分离，紫外检测器进行数据采集。
实施例1
本实施例将以谷胱甘肽片中还原型谷胱甘肽的含量测试为例说明本申请的一种可行的操作方案，具体测量步骤如下：
取谷胱甘肽片2片，研磨为细粉后，准确称取50mg溶解于10mL洁净水中，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容；取10mL所得溶液，加入2mL浓度为2.4mol/L的氢氧化钠溶液，随后加入15μL的苄氯(分析纯)，室温下充分搅拌反应1h，反应结束后，加适量盐酸调节其pH在7-8之间，再次定容至100mL；取样注入高效液相色谱仪进行定量分析，采用反相色谱柱进行色谱分离，紫外检测器进行数据采集(254nm)。采用磷酸盐缓冲液(20mmol/L磷酸氢二钠水溶液)-甲醇(88:12)为流动相，检测波长为254nm，进样体积为10μL。按照外标标准曲线法测算还原型谷胱甘肽的含量。
显然，本领域的技术人员可以对本申请实施例进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (2)
1.一种还原型谷胱甘肽的测量方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，测量改性谷胱甘肽的含量；
所述利用卤代芳香烃对还原型谷胱甘肽进行改性，得到含有卤代芳香基的改性谷胱甘肽，包括：
将含有还原型谷胱甘肽的待测溶液的pH值调节至7.1-14，加入卤代芳香烃至所述待测溶液中，所述卤代芳香烃与所述待测溶液中的还原型谷胱甘肽反应结束后，在所述待测溶液中形成所述改性谷胱甘肽；
所述卤代芳香烃包括苄氯、苄溴以及2-苯基溴代乙烷中的至少一种；
所述卤代芳香烃与所述还原型谷胱甘肽的反应过程中的温度为15-55℃，反应时间为15min-120min；
所述卤代芳香烃与所述还原型谷胱甘肽的摩尔比1:1-5:1；
所述测量改性谷胱甘肽的含量，包括：
将含有所述改性谷胱甘肽的所述待测溶液注入液相色谱仪中，利用反相色谱柱进行色谱分离，在205nm-280nm范围内进行所述改性谷胱甘肽含量的检测。
2.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于，先将含有所述改性谷胱甘肽的所述待测溶液的pH值调节至7-8之间，再进行所述改性谷胱甘肽的测量。
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