WO2018174253A1 - ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途 - Google Patents

ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途 Download PDF

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WO2018174253A1
WO2018174253A1 PCT/JP2018/011736 JP2018011736W WO2018174253A1 WO 2018174253 A1 WO2018174253 A1 WO 2018174253A1 JP 2018011736 W JP2018011736 W JP 2018011736W WO 2018174253 A1 WO2018174253 A1 WO 2018174253A1
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group
cells
gstp1
compound
fluorescent probe
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PCT/JP2018/011736
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雄太 藤川
英史 井上
雅矢 森
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学校法人東京薬科大学
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  • the present invention relates to a nitrobenzene derivative or a salt thereof and use thereof.
  • Glutathione-S-transferase (also referred to herein as “GST”) is an enzyme that catalyzes the formation of a conjugate between an electrophilic compound and reduced glutathione (also referred to herein as “GSH”). And is known to be involved in glutathione conjugation of drugs and endogenous active metabolites as drug-metabolizing enzymes.
  • GST plays a role of detoxifying or discharging electrophilic compounds, for example, by producing these conjugates.
  • GST has various functions such as steroid hormone biosynthesis, amino acid degradation, and prostaglandin biosynthesis.
  • Non-Patent Document 1 discloses a series of fluorescent probes such as DNAFs and DNAT-Me as probes having a maximum absorption wavelength at 490 nm and a maximum fluorescence wavelength near 510 nm. These fluorescent probes show a significant increase in fluorescence intensity due to glutathioneization due to GST activity and the accompanying denitration reaction.
  • the fluorescent probes (DNAFs and DNAT-Me) disclosed in Non-Patent Document 6 have high reactivity with GST-independent glutathione, there is a problem that a sufficient S / N ratio cannot be obtained. In addition, there was a problem that the fluorescence quantum yield after the reaction was low.
  • GST is classified into three types, cytoplasmic type, mitochondrial type, and microsomal type, and human cytoplasmic type GST has seven types of classes, Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega, and Zeta.
  • the Pi class molecular species GSTP1 which is expressed in limited normal tissues such as placenta, is overexpressed in many cancer cells (Non-patent Document 3). It has been reported that it contributes to cancer drug resistance (Non-patent Document 4).
  • JNK c-jun-N-terminal kinase
  • GSTP1 is dissociated from this complex and JNK is activated (Non-patent Document 5). That is, GSTP1 is thought to suppress apoptosis through activation of JNK by anticancer agents.
  • GSTP1 inhibitors that have been developed so far bind to intracellular GSTP1 and inhibit the formation of GSTP1-JNK complex, thereby activating JNK and inducing apoptosis (Non-patent Document 6).
  • GSTP1 is expected as a cancer marker and as a target molecule for anticancer drugs because it is overexpressed in many cancer cells and contributes to the acquisition of anticancer drug resistance. ing.
  • Non-Patent Documents 7 and 8 fluorescent probes HMRef-bGal and gGlu-HMRG, which target ⁇ -galactosidase and ⁇ -glutamyltranspeptidase (GGT) that are overexpressed in cancer cells.
  • these enzymes are not overexpressed in all cancer cells, and it is difficult to detect cancer cells with low expression levels.
  • GSTP1 is overexpressed in almost all cancer cells except prostate cancer, it is considered that more cancer cells can be detected by capturing the overexpression of GSTP1. In the pathological diagnosis of cancer, tissue immunostaining is performed.
  • this fluorescent probe can be applied to a biopsy tissue to detect cancer with GSTP1 activity as an index. The presence or absence can be evaluated.
  • fluorescent probes that detect GSTP1 activity that can be used in living cells are expected to be used as new research tools.
  • Fluorescent probes disclosed in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 have low selectivity for GST molecular species (that is, they do not have selectivity for GSTP1). Moreover, since the said fluorescent probe has high reactivity with GSH, its non-enzymatic reaction rate is large. For this reason, even if the fluorescent probe for GST activity measurement disclosed in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 is used, the presence of GSTP1 overexpressed in cancer cells cannot be specifically detected. There is.
  • an object of the present invention is to provide a fluorescent probe capable of selectively detecting the activity of GSTP1.
  • a nitrobenzene derivative (or a salt thereof) having a predetermined chemical structure is useful as a fluorescent probe capable of solving the above-mentioned problems, and has completed the present invention.
  • L represents a fluorophore
  • an EWG group represents an electron withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78
  • a nitro (NO 2 ) group bonded to the benzene ring is bonded to the benzene ring.
  • a fluorescent probe for measuring GSTP1 comprising the above nitrobenzene derivative or a salt thereof.
  • composition for detecting cancer cells or cancer tissue a composition for cancer diagnosis, and the above-described fluorescent probe for measuring GSTP1 comprising the above-described fluorescent probe for measuring GSTP1.
  • kit for cancer diagnosis using the said composition for a detection is provided.
  • the step of applying the fluorescent probe for measuring GSTP1 or the composition for detection to a tissue the step of irradiating the tissue after application with excitation light, A step of detecting fluorescence from a tissue, a method of detecting cancer cells or cancer tissue, and a step of bringing the fluorescent probe for measuring GSTP1 or the composition for detection into contact with cells in blood collected from a living body
  • a method for detecting cancer cells in blood comprising: irradiating the cells with excitation light; and detecting fluorescence from the cells.
  • the EWG group represents an electron withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group bonded to the benzene ring is ortho to the amide bond bonded to the benzene ring.
  • the EWG group is located in the ortho or para position with respect to the nitro (NO 2 ) group, and R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, Represents a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (—C ( ⁇ O) NH 2 group), and m represents an integer of 0 to 5.
  • the nitrobenzene derivative represented by these, or its salt is also provided.
  • a fluorescent probe capable of selectively detecting the activity of GSTP1 is provided.
  • the fluorescent probe according to the present invention can be used for applications such as detection of cancer cells or cancer tissues and diagnosis of cancer.
  • the absorbance (Abs) value at the maximum absorption wavelength at the end of the 30-minute incubation in the presence of each GST molecular species was measured before the incubation.
  • (A) shows the results of HPLC analysis
  • FIGS. C and (D) are diagrams showing the results of HPLC analysis and LC-MS analysis of the fluorescent probe, respectively.
  • the fluorescent probe according to the present invention Ps-TG which is a nitrobenzene derivative having a fluorophore
  • GSTs having different concentrations are used for three types of GST (GSTA1-1, GSTM1-1, GSTP1-1). It is a figure which shows the result of having calculated specific activity by measuring the time-dependent change of the fluorescence intensity at the time of measuring GST activity.
  • (A) is a graph showing changes over time in the fluorescence intensity of Ps-TG when the concentrations of various GSTs are 0.5 ⁇ g / mL.
  • (B) is a graph showing the initial reaction rate of Ps-TG with various GSTs as a change in fluorescence intensity per unit time ( ⁇ F.I. / sec).
  • (A) and (B) show the measurement results of the absorption spectrum and fluorescence spectrum of the fluorescent probe according to the present invention (Ps-DCTG, which is a nitrobenzene derivative having a fluorophore) synthesized in the examples.
  • Ps-DCTG which is a nitrobenzene derivative having a fluorophore
  • GSTs having different concentrations are used for three types of GST (GSTA1-1, GSTM1-1, GSTP1-1). It is a figure which shows the result of having calculated specific activity by measuring the time-dependent change of the fluorescence intensity at the time of measuring GST activity.
  • A is a graph showing changes over time in the fluorescence intensity of Ps-DCTG when the concentrations of various GSTs are 0.5 ⁇ g / mL.
  • B is a graph showing the initial reaction rate of Ps-DCTG with various GSTs as a change in fluorescence intensity per unit time ( ⁇ F.I.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result of having investigated whether the fluorescence probe (Ps-TG, Ps-DCTG) which concerns on this invention synthesize
  • (A) and (C) are chemical structural formulas of Ps-TG and Ps-DCTG, respectively.
  • (B) and (D) are imaging images of MCF-7 cells to which each fluorescent probe was administered, respectively, from the left: fluorescence of the fluorescent probe; fluorescence of DsRed; and fluorescence of the fluorescent probe, fluorescence of DsRed, and It shows the superposition (Merge) of white images (the scale bars are all 20 ⁇ m).
  • a fluorescent probe according to the present invention in which the phenolic hydroxy group of the xanthene ring is acylated (such as Ps-TAc and Ps-DCTAc) is added to a living cell, it permeates through the cell membrane and is taken into the cell. It is deacetylated by the hydrolysis of esterase present in the cell, converted to the corresponding phenol (Ps-TG or Ps-DCTG), and glutathioneated by the action of GSTP1 present in the cell. It is a figure for demonstrating the presumed mechanism which comes to emit a strong fluorescence.
  • acylated such as Ps-TAc and Ps-DCTAc
  • each of the three types of GST molecular species was expressed by the method using the expression vector pIRES2-DsRed Express2. It is a figure which shows the result of having performed the cell imaging at the time of applying to the expressed MCF-7 cell.
  • A is a chemical structural formula of Ps-TAc
  • B is an imaging image (the scale bars are all 40 ⁇ m)
  • C is a cell expressing DsRed in which various GSTs are expressed (+ )
  • non-expressing cells are graphs comparing the fluorescence intensities of green fluorescence.
  • (D) is the chemical structural formula of Ps-DCTAc
  • (E) is an imaging image (the scale bars are all 40 ⁇ m)
  • (F) is the expression of DsRed in which various GSTs are expressed. It is the graph which compared the fluorescence intensity of the green fluorescence in a cell (+) and a non-expression cell (-).
  • various molecular species of cytoplasmic GST and mitochondrial GST (18 types of 8 different classes) were incorporated into pIRES2-DsRed Express2 / 3xFLAG-GST and expressed by transfection into MCF-7 cells. It is an electrophoresis photograph showing the result of confirming the GSTP1 selectivity of the fluorescent probe (Ps-TAc) by Western blotting.
  • FITC is an image of green fluorescence derived from a fluorescent probe (Ps-TAc)
  • DsRed is an image of red fluorescence derived from DsRed
  • Merge is an overlay image of these (scale) All bars are 20 ⁇ m).
  • A) is an enlarged view of an observation image of GSTP1-expressing cells shown in FIG. 14, and
  • B) is a graph in which the intensity of green fluorescence in each image shown in FIG. 14 is quantified among the GST-expressing cells. (The number of cells used for the measurement is 20).
  • the activity of GSTP1 expressed by treating MCF-7 cells with a DNA methyltransferase inhibitor (5-azacytidine) can be captured using the fluorescent probe (PS-TAc) according to the present invention. It is a figure which shows the result of having verified whether it is possible.
  • (A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above treatment
  • (B) is a distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control group and the 5-azacytidine administration group.
  • (A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above-described processing. Among them, “Merge ( ⁇ 10)” is a 10-fold enlarged image of the “Merge” image.
  • (B) is a diagram showing the distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA administration group and the GSTP1 siRNA administration group.
  • HT1080 cells which are fibroblastoma-derived cells expressing GSTP1. It is a figure which shows the result of applying the fluorescent probe (PS-TAc) which concerns on invention.
  • (A) is an electrophoresis photograph showing the results of Western blotting.
  • (B) is an imaging image of HT1080 cells subjected to the above-described processing, and among these, “Merge (wide field)” is a 6-fold enlarged image of the “Merge” image.
  • (C) is a graph showing the distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA administration group and the GSTP1 siRNA administration group.
  • (D) is an imaging image (corresponding to a merge (wide field)) before administration of Ps-TAc and after 6 minutes, 10 minutes, and 15 minutes after administration in a cell group administered with control siRNA and GSTP1 siRNA, respectively.
  • the fluorescent probe according to the present invention ( It is a figure which shows the result of having administered Ps-TAc) to various cancer cells, and observing with a confocal laser microscope.
  • A shows the chemical structure of the fluorescent probe according to the present invention (Ps-Naph which is a nitrobenzene derivative having a fluorophore) synthesized in the examples.
  • B is a graph showing the results of measuring the fluorescence spectrum of the fluorescent probe (Ps-Naph) before and after the reaction with GSH in the presence of GSTP1-1.
  • (A) shows the chemical structure of the fluorescent probe according to the present invention (Ps-FL which is a nitrobenzene derivative having a fluorophore) synthesized in the examples.
  • (B) is a graph showing the results of measuring the fluorescence spectrum of the fluorescent probe (Ps-FL) before and after the reaction with GSH in the presence of GSTP1-1.
  • (A) shows the chemical structure of the fluorescent probe according to the present invention (Ps-jRhod, which is a nitrobenzene derivative having a fluorophore) synthesized in the examples.
  • (B) is a graph showing the results of measuring the fluorescence spectrum of the fluorescent probe (Ps-jRhod) before and after the reaction with GSH in the presence of GSTP1-1.
  • One form of the present invention is the following general formula (1):
  • the EWG group is an electron-withdrawing group, and has a Hammet constant of 0.66 or more and less than 0.78.
  • the “Hammet constant ( ⁇ p)” is an index indicating the electron withdrawing property of the EWG group, and the larger this value, the higher the electron withdrawing property.
  • the value of the Hammett constant ( ⁇ p) of the EWG group described in the literature shall be used. To do.
  • the value of Hammett constant ( ⁇ p) is calculated by calculating the difference from the acid dissociation constant (pKa) of unsubstituted benzoic acid separately using a conventionally known software package. Can be obtained.
  • “acid dissociation constant (pKa)” means an acid dissociation constant (pKa) in an aqueous solution, and the smaller this value, the greater the acid strength.
  • the acid dissociation constant (pKa) in the aqueous solution can be actually measured by measuring the acid dissociation constant at 25 ° C. using an infinitely diluted aqueous solution.
  • a value based on a database of known document values can be obtained by calculation.
  • the Hammett constant of the EWG group is set to “0.66 or more and less than 0.78” because the Hammett constant of the EWG group is smaller than the value of the nitro group (—NO 2 group) (0.78). This indicates that the value is 0.66 or more of the cyano group (—C ⁇ N group).
  • the EWG group preferably exhibits a resonance effect.
  • the EWG group “represents a resonance effect” means that when the nitrobenzene derivative according to the present invention is used as a fluorescent probe for GSTP1 measurement, the aromatic quest for the benzene ring when the nitrobenzene derivative reacts with GSH.
  • nitro bonded to the benzene ring (NO 2) groups is located in the ortho or para to the amide bond attached to the benzene ring, wherein EWG group, the nitro (NO 2 ) Located in the ortho or para position relative to the group.
  • the nitrobenzene derivative can function as a GSTP1-selective fluorescent probe.
  • L represents a fluorophore.
  • the “fluorophore” means a chromophore that emits fluorescence, and is not particularly limited as long as it is a fluorescent functional group that can be used as a fluorescent labeling compound in the present invention.
  • the fluorophore include those having a mother nucleus selected from the group consisting of fluorescein, rhodamine, BODIPY (boron-dipyrromethene), coumarin, TokyoGreen, TokyoMagenta, SingaporeGreen, naphthalimide, and rhodol.
  • the fluorophore L is preferably the following general formula (2):
  • R 1 represents a substituted or unsubstituted carbon atom having 1 to 20 carbon atoms (preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, still more preferably 1 to 4 carbon atoms, and particularly preferably 1 to 4 carbon atoms).
  • N is the number of R 1 bonded to the benzene ring and represents an integer of 0 to 4.
  • n is preferably an integer of 0 to 3, more preferably an integer of 0 to 2, and still more preferably 0 or 1.
  • R 2 represents a hydrogen atom or 2 to 20 carbon atoms (preferably 2 to 12 carbon atoms, more preferably 2 to 8 carbon atoms, still more preferably 2 to 4 carbon atoms, particularly preferably carbon atoms). It represents an acyl group having 2 to 3, most preferably 2 carbon atoms. Among these, R 2 is preferably an acyl group having 2 to 20 carbon atoms from the viewpoint of high fat solubility (ie, cell membrane permeability) when used as a fluorescent probe for GSTP1 measurement.
  • high fat solubility ie, cell membrane permeability
  • X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom.
  • the halogen atom may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • the halogen atom must be a fluorine atom or a chlorine atom. Is preferable, and a chlorine atom is particularly preferable.
  • the “alkyl group” may be any alkyl group composed of a straight chain, a branched chain, a ring, or a combination thereof.
  • R 1 is an alkyl group
  • the carbon number thereof is 1 to 20 as described above, preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, still more preferably carbon number. 1 to 4, particularly preferably 1 to 2 carbon atoms (methyl group or ethyl group), and most preferably 1 carbon atom (methyl group).
  • alkoxy group means —O-alkyl group, where “alkyl group” is a group having the above-mentioned definition and preferred form.
  • acyl group may be either an aliphatic acyl group or an aromatic acyl group, or may be an aliphatic acyl group having an aromatic group as a substituent.
  • the acyl group may contain one or more heteroatoms.
  • an alkylcarbonyl group such as an acetyl group
  • an alkyloxycarbonyl group such as an acetoxycarbonyl group
  • an arylcarbonyl group such as a benzoyl group
  • an aryloxycarbonyl group such as a phenyloxycarbonyl group
  • an aralkylcarbonyl group Benzylcarbonyl group
  • alkylthiocarbonyl group such as methylthiocarbonyl group
  • alkylaminocarbonyl group such as methylaminocarbonyl group
  • arylthiocarbonyl group such as phenylthiocarbonyl group
  • arylaminocarbonyl group phenylaminocarbonyl group
  • the alkyl group or alkoxy group as R 1 and the acyl group as R 2 described above may have one or more arbitrary substituents.
  • substituents include an alkoxy group, a halogen atom (which may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, or
  • the acyl group include, but are not limited to, an acyl group.
  • the functional group has two or more substituents, they may be the same as or different from each other.
  • the alkyl group and alkoxy group as R 1 are preferably unsubstituted, and when R 1 is present (when n is an integer of 1 to 4), R 1 is an unsubstituted alkyl group. It is preferable that Similarly, the acyl group as R 2 is preferably unsubstituted.
  • the EWG group is more preferably a mesyl group or a cyano group, and the EWG group is most preferably a mesyl group. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the nitrobenzene compound represented by the general formula (1) or a salt thereof is represented by the following general formula (3):
  • the compound represented by the general formula (1) may exist as a salt.
  • the salt include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, and magnesium salt, ammonium salts, and organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt, and morpholine salt.
  • the acid addition salt include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate, and oxalate.
  • amino acid salts include glycine salts. However, the salt of the compound according to the present invention is not limited to these.
  • the compound of the present invention represented by the general formula (1) may have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and there are stereoisomers such as enantiomers or diastereomers. There is a case. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention.
  • the compound of the present invention represented by the general formula (1) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and any of these substances is included in the technical scope of the present invention.
  • the kind of solvent which forms a solvate is not specifically limited, For example, solvents, such as ethanol, acetone, isopropanol, are mentioned.
  • the nitrobenzene compound or a salt thereof according to the present invention is preferably present in a nonionic state under the condition of pH 7.4 (preferably pH 7.0 to 8.0) which is an in vivo environment.
  • a compound satisfying such conditions is particularly useful as a fluorescent probe used for living cells as described later because it is particularly excellent in cell membrane permeability.
  • the compound of the present invention represented by the general formula (1) can be used as a fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase (GST) P1.
  • the compounds of the present invention are substantially non-fluorescent in the neutral region (eg, in the range of pH 5-9).
  • GSH reduced glutathione
  • GST glutathione-S-transferase
  • the nitro group (—NO 2 group) bonded to the benzene ring the 2-position or 4-position of the compound of the present invention.
  • Is desorbed and glutathione is converted to a strong fluorescent compound at this position.
  • the compound represented by the general formula (1) or a salt thereof hardly emits fluorescence when irradiated with excitation light of, for example, about 490 nm in the neutral region, but the compound that is glutathione as described above is It has the property of emitting extremely intense fluorescence (for example, fluorescence wavelength 510 nm) under the same conditions.
  • This reaction occurs selectively only with respect to GSTP1, and this reaction does not proceed even if other GST molecular species are present. Therefore, by using the compound of the present invention as a fluorescent probe for GSTP1 measurement, the presence of GSTP1 can be selectively measured based on the change in fluorescence intensity.
  • a “fluorescent probe” refers to facilitating observation of a specific protein, cell, or tissue by specifically binding or distributing to a specific protein, cell, or tissue and emitting fluorescence. It means a substance that can be made.
  • the term “fluorescent probe” refers to a substance that emits fluorescence, but in the present invention, a precursor that does not emit fluorescence itself but becomes fluorescent due to decomposition or the like is also referred to as “fluorescence probe”. It shall be included in the concept of “probe”.
  • GSTP1 is overexpressed in almost all cancer cells except prostate cancer. For this reason, it is possible to detect cancer cells by capturing the overexpression of GSTP1 using the fluorescent probe for measuring GSTP1 according to the present invention. For example, it is possible to evaluate the presence or absence of cancer using GSTP1 activity as an index by applying a fluorescent probe according to the present invention capable of detecting GSTP1 activity to a biopsy tissue. That is, the fluorescent probe for measuring GSTP1 according to the present invention can be used as a probe for detecting cancer cells.
  • a composition for cancer diagnosis or cancer It can also be used in diagnostic kits, and in cancer detection, determination, or diagnostic methods.
  • the cancer detection, determination, or diagnosis method may be a method performed in vitro, or a method performed ex vivo or in vivo.
  • the compound, fluorescent probe, or detection or diagnostic composition according to the present invention is applied to a biological sample held in an observation container generally used in a biological imaging technique such as a preparation, a glass bottom dish, a slide glass, or a multiwell plate. Although it can be made to act on, it can also be made to act on the biological sample held in the biological sample fixing device described in International Publication No. 2011/149032 pamphlet or the like. That is, according to another aspect of the present invention, there is provided a cancer diagnostic kit including the compound according to the present invention, a fluorescent probe or a detection or diagnostic composition, and a biological sample fixing device.
  • the held biological sample is brought into contact by adding the compound according to the present invention, a fluorescent probe, a detection or diagnostic composition, or a solution thereof, and incubated for a predetermined time, and then a fluorescence microscope or a microplate reader is used. It is possible to irradiate a biological sample with excitation light and detect the generated fluorescence, and through this, a cell emitting fluorescence can be determined as a cancer cell.
  • a preferred example of the biological sample is blood, and in this case, a group of cells obtained from blood is preferable.
  • a group of blood cells collected from a patient suffering from cancer contains a large amount of blood cells and a small number of cancer cells, but the compound, fluorescent probe, or detection or diagnostic composition according to the present invention is used. By using it, cancer cells can be accurately detected from a large number of cells. Thereby, when a cancer cell exists in a test subject's blood cell, it can determine or diagnose that the said test subject has cancer. Alternatively, after incubation, the number of cancer cells and the acquisition of cancer cells can be performed using image acquisition by flow cytometry or fluorescence microscopy, followed by cell sorting using a micropipette.
  • the origin of the biological sample is not particularly limited to blood, and it may be a biological sample other than blood or a non-biological sample.
  • the kind of the sample derived from a living body other than blood is not particularly limited, and examples thereof include lymph, cerebrospinal fluid and other body fluids; cell extract (homogenate) and the like.
  • the composition for detecting cancer cells or cancer tissue and the composition for cancer diagnosis according to the present invention is applied to the present invention in addition to in vivo imaging, in surgery or examination, before surgery or examination, or during surgery or examination.
  • the composition for detecting cancer cells or cancer tissue is applied by parenteral administration, or the composition according to the present invention is sprayed or applied to a part or the whole of the surgical field under the naked eye or under the microscope.
  • it may be used for detecting cancer cells or cancer tissue by applying by a method such as injection and irradiating the application site with excitation light after several tens of seconds to several minutes.
  • the tissue emits fluorescence.
  • the site emitting the fluorescence is cancer tissue. It can be identified, and it can be excised with the surrounding tissue including it.
  • “surgery” refers to, for example, a craniotomy, a thoracotomy, a laparotomy, or a skin operation with a wound, and a mirror such as a gastroscope, a colonoscope, a laparoscope, or a thoracoscope Includes any surgery applied for the treatment of cancer, including visual surgery. This makes it possible to more clearly and accurately determine the range of cancer tissue that has been determined by relying on the morphology and tactile sensation of the cancer in surgical treatment to remove the cancer, making it easy to determine the extent of the removal. Become.
  • examination refers to examinations using endoscopes such as gastroscopy and colonoscopy, and procedures such as excision and collection associated with examinations, as well as to tissues separated and collected from living organisms. This includes inspections that are performed on these.
  • endoscopes such as gastroscopy and colonoscopy
  • procedures such as excision and collection associated with examinations, as well as to tissues separated and collected from living organisms. This includes inspections that are performed on these.
  • the cancer tissue When used in an examination using an endoscope, the cancer tissue emits fluorescence, so that the cancer tissue can be identified extremely easily.
  • examination resection or therapeutic resection. Terms such as surgery and examination must be interpreted in the broadest sense and not in any way limited.
  • the application concentration of the composition for detecting cancer cells or cancer tissue and the composition for cancer diagnosis according to the present invention is not particularly limited.
  • a solution having a concentration of about 1000 ⁇ M can be applied.
  • the pH of the composition is preferably used in the range of, for example, pH 7.0 to 7.5.
  • the detection composition and diagnostic composition of the present invention the above-described compound (or a salt thereof) according to the present invention may be used as it is. However, if necessary, additives usually used for the preparation of reagents are used. You may mix
  • additives such as solubilizers, pH adjusters, buffers, and isotonic agents can be used as additives for using the reagent in a physiological environment, and the amount of these can be selected as appropriate by those skilled in the art. It is.
  • These compositions are generally provided as a composition in any form such as a mixture in powder form, a lyophilized product, granules, tablets, liquids, etc., but it is used in sterile water for injection or an appropriate buffer at the time of use. What is necessary is just to melt
  • a method for detecting cancer cells or cancer tissues using the compound, fluorescent probe, or detection or diagnostic composition according to the present invention is applied to the cell or tissue, and the cell or tissue after application is irradiated with a predetermined excitation light, thereby Or detecting fluorescence in the tissue.
  • a method for detecting cancer cells in the blood in which case the cells in the blood may be fixed to an observation container such as a preparation, or the biological sample fixing apparatus described above. It may be a diagnostic chip fixed by.
  • such a detection method can be applied to a living tissue and used for a definitive diagnosis of cancer tissue at the time of surgery.
  • it may be applied by spraying or applying to cells or tissues, or may be applied by injection or infusion.
  • surgery / treatment including the steps of determining a cancer excision region using the cancer cell or cancer tissue detection method according to the present invention and excising the region. It may be related to the method.
  • the cancer cell detection method according to the present invention can be used in a cancer determination or diagnosis method. That is, when the method for detecting cancer cells according to the present invention detects fluorescence higher than the fluorescence serving as an index, it can be determined or diagnosed that cancer is present.
  • the determination method refers to a method of specifying without including a determination by a medical worker including a doctor by comparing with an index.
  • a fluorescence cell can be selected as the fluorescence serving as an index.
  • the severity of cancer can be determined by using the fluorescence intensity or the number of cells having fluorescence as an index.
  • cancer tissue means any tissue containing cancer cells.
  • tissue can be interpreted in the broadest sense, including part or all of an organ, and should not be limitedly interpreted in any way. Since the cancer diagnostic agent according to the present invention has an action of detecting the activity of GSTP1 that is specifically strongly expressed in cancer tissues, it highly expresses GSTP1 among cancer tissues. Tissues are preferred, and such cancer tissues are most cancer tissues except prostate cancer tissues. Examples of cancer include, for example, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, and ovarian cancer.
  • GSTP1 is expressed in normal epithelial cells, it is known that the expression of GSTP1 is not observed when the CpG part of the promoter region of the GSTP1 gene is methylated by canceration. Therefore, if the fluorescent probe according to the present invention can be applied to such a system, it is also possible to detect prostate cancer cells (GSTP1 is not overexpressed) using the presence or absence of fluorescence as an index.
  • cytoplasmic GST has seven classes such as Alpha, Mu, Pi, etc., but in this experiment, there are many reports in the paper because of the high expression level in vivo.
  • the reactivity and selectivity of various nitrobenzene derivatives as GST substrates were evaluated by performing assays using three types of cytoplasmic GSTs, GSTA1, GSTM1, and GSTP1.
  • an assay is performed using the fact that an absorption spectrum changes greatly when a nitro group (having high electron withdrawing property) is replaced with glutathione (having weak electron donating property) in a nitrobenzene derivative. Is going.
  • Non-Patent Document 1 the following compound (A) (3, which is the GST substrate site of the GST activity detection fluorescent probe (DNAT-Me) proposed in Non-Patent Document 1 is used using the same method as in Non-Patent Document 1.
  • 4-Dinitrobenzanilide (3,4-NNBA)) was synthesized as a reference substance.
  • the following compounds (B) to (G) were synthesized in the same manner as the compound (A) by changing the synthesis raw material.
  • FIGS. 1A to 1G The results are shown in FIGS. 1A to 1G.
  • (A) shows the structure of each compound
  • (B) shows the absorption spectrum at the end of the 30 minute incubation
  • (C) shows the absorption wavelength of each compound (described in each figure). It is a graph which shows the time change of a light absorbency.
  • “Before” is an absorption spectrum before addition of GSH and GST
  • compound (B) which is a positional isomer of compound (A) reacts more slowly than compound (A), such as a slow change in absorption spectrum in the absence of an enzyme in which only GSH is present. Although there was a decrease in sex, there was no change in the selectivity trend of GST molecular species.
  • the compound (C) showed no change in the absorption spectrum due to the presence or absence of GST ((B) in FIG. 1C).
  • the formation of a meisenheimer complex as a reaction intermediate is considered to be a rate-determining step.
  • the Hammett constant of the trifluoromethyl (CF 3 ) group is 0.54, and the cyano group (0.66) used in the compound (D) and the mesyl group (0.72) used in the compound (F). Is also small.
  • compound (D) showed a rapid increase in absorbance at 290 nm in the presence of GSTP1.
  • the absorbance decreased with time under conditions other than the presence of GSTP1. This difference suggests that different products are produced under each condition.
  • compound (F) which is a positional isomer of compound (E), rapidly changes in the absorption spectrum in the presence of GSTP1, and shows a change in the absorption spectrum in the presence of GSTA1 or GSTM1. There wasn't. In addition, no reaction with enzyme-independent GSH was observed. Thus, compound (F) is extremely promising as a GSTP1-selective substrate.
  • the compound (G) having a methylsulfinyl group (—SOCH 3 group) at the 2-position of the benzene ring did not change the absorption spectrum under any condition.
  • the Hammett constant of the methylsulfinyl group is 0.49, which is smaller than the cyano group (0.66) used in the compound (D) and the mesyl group (0.72) used in the compound (F). .
  • the contribution to the stabilization of the reaction intermediate (Meisenheimer complex) by the sulfinyl group is smaller than that of the cyano group or the mesyl group, it is considered that the glutathionation reaction did not proceed.
  • the absorbance (Abs) value at the maximum absorption wavelength at the end of the 30-minute incubation in the presence of each GST molecular species is expressed as the absorbance (the result of comparison of abs 0 values divided by the value obtained by the) (abs / abs 0) shown in the graph of FIG. 1H.
  • the absorbance the result of comparison of abs 0 values divided by the value obtained by the) (abs / abs 0) shown in the graph of FIG. 1H.
  • the absorbance (Abs) value at the maximum absorption wavelength at the end of the 30-minute incubation in the presence of each GST molecular species is expressed as the absorbance (the result of comparison of abs 0 values divided by the value obtained by the) (abs / abs 0) shown in the graph of FIG. 1H.
  • the compounds (D) to (F) only the value of Abs / Abs 0 in the presence of GSTP1 showed a large value.
  • the compounds (D) to (F) can be candidates for GSTP1-selective substrates. If this is generalized, it can be considered that the structure shown in the general formula (4) can be a GSTP1-selective substrate as long as the following conditions are satisfied.
  • the nitro (NO 2 ) group attached to the benzene ring is located in the ortho or para position relative to the amide bond attached to the benzene ring; and the EWG group is located in the ortho position relative to the nitro (NO 2 ) group or Located in the para position.
  • the peak of the compound (F) seen before the reaction (upper) disappears after the reaction (lower), and a new compound having a shorter retention time may be generated. confirmed. Moreover, since the absorption spectrum of the newly produced
  • GSH glutathione
  • the Griess method is known as a method for detecting and quantifying nitrite ions, and uses a diazo coupling of NO 2 ⁇ , sulfanilamide, and 1-naphthylethylenediamine under acidic conditions to produce a azo compound.
  • NO 2 ⁇ is indirectly detected and quantified by measuring absorbance.
  • nitrite was added to a reaction solution obtained by incubating compound (F) in 100 mM aqueous sodium phosphate (pH 7.4) in the presence of 5.0 ⁇ g / mL GSTP1 and 1 mM GSH at 25 ° C. for 30 minutes. Ions were quantified (reaction mechanism is shown in FIG. 3A).
  • a calibration curve based on the absolute concentration was prepared by quantifying separately prepared NO 2 - having a known concentration, and nitrite ions generated by the reaction were quantified by the calibration curve method.
  • FIG. 3B it was confirmed that nitrite ions having a concentration almost equal to the substrate concentration used were present in the reaction solution.
  • the starting material 2-methyl-4-nitrobenzoic acid (1) is first reduced to an alcohol by a borane complex, and the product is recrystallized from a mixed solvent of hexane / ethyl acetate (10: 1).
  • 2-methyl-4-nitrobenzyl alcohol (2) was obtained in a yield of 81%.
  • 2-methyl-4-nitrobenzyl alcohol was mixed with silica gel and oxidized to aldehyde with pyridinium chlorochromate (PCC).
  • PCC pyridinium chlorochromate
  • 2-methyl-4-nitrobenzaldehyde (3) was isolated by filtration through silica gel under reduced pressure (yield 91%).
  • 2-methyl-4-nitrobenzaldehyde (3) and resorcinol are heated in methanesulfonic acid and subjected to Friedel-Crafts type condensation reaction, dehydration condensation and oxidation reaction, and then 2-methyl-4-nitro TG (4) was synthesized. Reduction of the nitro group of 2-methyl-4-nitro TG (4) to an amino group with hydrates of sodium sulfide and sodium hydrogen sulfide gave 4-amino-2-methyl TG (6) (in two steps). Yield 4%).
  • the mixture was suspended in acetonitrile, 1N aqueous sodium hydroxide solution was added at room temperature with stirring at 4 ° C., and the mixture was allowed to react for 10 minutes.
  • the reaction was neutralized with 200 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, diluted with HPLC initial solvent (below) and purified by preparative HPLC.
  • 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) is used as mobile phase A
  • acetonitrile is used as mobile phase B
  • the elution was performed at a flow rate of 9 mL / min.
  • 2-methyl-4-nitro-dichloroTG (5) (8.7 mg, 0.023 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (12.2 mg, 0.050 mmol), and 1-ethyl-3- ( 3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC ⁇ HCl; 14.6 mg, 0.076 mmol) was stirred in 1 mL of acetonitrile for 20 minutes at room temperature. After the reaction solution was diluted with ethyl acetate, the organic layer was washed 3 times with 0.1N hydrochloric acid and once with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and evaporated under reduced pressure.
  • EDC ⁇ HCl 1-ethyl-3- ( 3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • FIGS. 4A and 4B The measurement results of the absorption spectrum and the fluorescence spectrum for Ps-TG (compound (8)) are shown in FIGS. 4A and 4B, respectively.
  • Ps-TG showed an increase in fluorescence intensity of about 60 times before and after the reaction (the fluorescence quantum yields before and after the reaction were 0.016 and 0.913, respectively). there were).
  • the absorption spectrum did not change before and after the reaction, and only the fluorescence spectrum changed greatly. This is because there is no difference in the process in which electrons are excited from the ground state to the excited state before and after the reaction, but there is a difference in the transition process of the excited electrons.
  • HPLC and LC-MS were performed to confirm that Ps-TG exhibited strong fluorescence by undergoing a glutathione reaction.
  • HPLC measurement was performed using the sample whose absorption spectrum and fluorescence spectrum were measured as described above as a reaction solution.
  • the HPLC analysis consisted of LC-10AT as a pump, SPD-M20A and RF-10AxL (manufactured by Shimadzu Corporation) as absorption and fluorescence detectors, and an Interstain C18 column (GL Science) as a separation column.
  • An HPLC system was utilized.
  • LC-MS analysis was performed on the reaction product in order to confirm that the strong fluorescent peak confirmed by HPLC analysis was actually a glutathione molecule.
  • the same reaction solution as that for HPLC measurement was used for LC-MS analysis.
  • LC-10AT as a pump
  • SPD-M20A as an absorption detector
  • quadrupole mass spectrometer LCMS-2020 manufactured by Shimadzu Corporation
  • Inertsil ODS-3 column as a separation column A system composed of (GL Science) was used.
  • FIG. 4D The analysis result by LC-MS is shown in FIG.
  • the upper stage of FIG.4 (D) is an absorption chromatogram
  • a lower stage is an extraction ion chromatogram.
  • the GSTP1 selectivity of Ps-TG was evaluated. Specifically, with respect to Ps-TG synthesized above, the fluorescence intensity over time when GST activity was measured using GSTs of different concentrations for three types of GST (GSTA1-1, GSTM1-1, GSTP1-1). Specific activity was calculated by measuring various changes.
  • GSTA1-1 1 ⁇ M Ps-TG is dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; DMSO 0.1% is included as a co-solvent), and various concentrations of GST (GSTA1-1; 0.1 to 10) are dissolved. 0.1 ⁇ g / mL, GSTM1-1; 0.4 to 10.1 ⁇ g / mL, GSTP1-1; 0.3 to 9.8 ⁇ g / mL) in the presence of 1 mM reduced glutathione (GSH) and room temperature (25 ° C. ), And the fluorescence intensity was recorded every 30 seconds for 30 minutes.
  • GST reduced glutathione
  • FIG. 5 (A) is a graph showing the change over time in the fluorescence intensity of Ps-TG when the concentration of various GSTs is 0.5 ⁇ g / mL.
  • FIG. 5B is a graph showing the initial reaction rate of Ps-TG with various GSTs as a change in fluorescence intensity per unit time ( ⁇ F.I. / sec).
  • FIGS. 5A and 5B no increase in fluorescence intensity was observed with 1 mM GSH in the absence of GST and in the presence of GSTA1.
  • an increase in fluorescence intensity was observed in the presence of GSTM1 or GSTP1, and changes in fluorescence intensity per unit time ( ⁇ F.I. / sec) were 0.9 and 7.1, respectively. The difference was about 8 times, and high GSTP1 selectivity could be confirmed.
  • the redox active species include dithiothreitol (DTT), cysteine, 2-mercaptoethanol ( ⁇ ME), sodium trisulfide (Na 2 S 3 ), reduced and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NADH and NAD + ), reduced and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH and NADP + ), ascorbic acid (AA) were used.
  • the excitation / fluorescence wavelength was 490/510 nm, and it was reacted with 2.0 ⁇ g / ml GSTP1-1 as a positive control (GSH / GSTP1).
  • As a negative control (None)
  • the same experiment was performed without adding GSTP1 or GSH. This experiment was performed using a multiwell plate reader (SH-9000, Corona Electric Co., Ltd.).
  • MCF-7 cells which are human breast cancer-derived cells in which the endogenous GSTP1 expression is hardly observed, were used.
  • MCF-7 cells and HT-1080 cells described later 5% at 37 ° C. in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin-glutamine. The cells were cultured under% CO 2 conditions and cultured while being passaged once every 3 to 4 days.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin-glutamine penicillin-streptomycin-glutamine
  • MCF-7 cells were placed in a 35 mm glass bottom dish (Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) or an 8-well chamber (IWAKI) at 3.0 ⁇ 10 5 cells / dish or 3.3 ⁇ 10 4 cells / well. Each sowing was carried out. After the cells adhere, the expression vector pIRES2-DsRed Express2 / 3xFLAG-GSTP1 in which a cDNA (3xFLAG-GSTP1) encoding GSTP1 with 3xFLAG tag at the N-terminus is inserted is introduced by transfection reagent Fugene 6 (Promega Corporation). The cells were introduced into the cells and used for experiments after 24 hours.
  • one mRNA transcribed downstream of the CMV promoter has both 3xFLAG-GSTP1 and DsRed Express2 mRNA sequences. Between these sequences, there is an internal ribosomal entry site (IRES), and 3xFLAG-GSTP1 and DsRed Express2 proteins are expressed. That is, by using this vector, the expression of 3xFLAG-GSTP1 can be confirmed by the fluorescence emitted by the red fluorescent protein DsRed Express2.
  • IRS internal ribosomal entry site
  • an imaging experiment was performed by loading a probe onto MCF-7 cells into which the expression vector was introduced. Specifically, 2.5 ⁇ M Ps-TG or Ps-DCTG was incubated for 5 minutes at 37 ° C. under 5% CO 2 on MCF-7 cells into which the above-described vector was introduced, and then confocal. Observation was performed under a laser scanning microscope.
  • FLUOVIEW FV10i-DOC manufactured by Olympus Corporation
  • the fluorescence of the fluorescent probe was excited by an LD laser having a wavelength of 473 nm
  • the fluorescence of DsRed Express2 was an LD having a wavelength of 584 nm
  • a fluorescence image in the corresponding fluorescence spectrum was obtained by excitation with a laser.
  • FIG. 10 are chemical structural formulas of Ps-TG and Ps-DCTG, respectively.
  • 10 (B) and (D) are imaging images of MCF-7 cells to which each fluorescent probe was administered, respectively, from the left: fluorescence of the fluorescent probe; fluorescence of DsRed; and fluorescence of the fluorescent probe, DsRed (Merge) of the fluorescence and the white image (scale bars are both 20 ⁇ m).
  • fluorescence of the fluorescent probe fluorescence of DsRed
  • DsRed Fluorescence of the fluorescent probe
  • DsRed Dege
  • the intensity of green fluorescence in cells that do not show red fluorescence was weak. This indicates that the fluorescence intensity of the fluorescent probe is selectively increased in cells in which GSTP1 is expressed.
  • the fluorescence intensity in the cells was relatively small, and strong fluorescence was observed in the cell membrane. That is, it was suggested that none of the fluorescent probes has a high cell membrane permeability. This was considered that these fluorescent probes showed anionic property and did not have sufficient fat solubility in the in vivo environment (pH 7.4), and as a result, it was difficult to permeate the cell membrane.
  • N, N′-diisopropylethylamine was added at a temperature of 4 ° C. to 2 mL of tetrahydrofuran in which Ps-TG (8) (2.1 mg, 0.0039 mmol) and acetyl chloride (0.6 ⁇ L, 0.008 mmol) were suspended.
  • DIEPA DIEPA
  • ethyl acetate was added dropwise and stirred on ice for 2 hours.
  • the organic layer was washed 3 times with 1N hydrochloric acid and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • Ps-TAc compound (10)
  • Ps-TAc showed absorption spectra having peaks at wavelengths of 450 nm and 490 nm, as shown by the “pre-reaction” absorption spectrum shown in FIG. This is considered to be because the phenolic hydroxy group of the xanthene ring constituting the fluorophore is protected by an acetyl group.
  • Ps-TAc and Ps-DCTAc are added to living cells, they are first permeated through the cell membrane by the mechanism shown in FIG. 12 and then taken into the cells, and then the esterase present in the cells. Is hydrolyzed and deacetylated, and converted to the corresponding alcohol (Ps-TG or Ps-DCTG). Since Ps-TG and Ps-DCTG are GSTP1-selective fluorescent probes, it is presumed that if GSTP1 is present in the incorporated cells, it will undergo glutathione action and emit strong fluorescence. .
  • Cell imaging (2) For the two types of acetylated fluorescent probes (Ps-TAc, Ps-DCTAc) prepared above, three types of GST molecules were obtained by a technique using the expression vector pIRES2-DsRed Express2 similar to “Cell Imaging (1)” described above. Cell imaging was performed when applied to MCF-7 cells in which each of the species (GSTP1, GSTM1, GSTA1) was expressed.
  • each of three types of GST molecular species (GSTP1, GSTM1, GSTA1) was expressed in MCF-7 cells expressed as 3xFLAG-tagged cDNA at the N-terminus.
  • 2.5 ⁇ M Ps-TAc or Ps-DCTAc was incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 5 minutes, and then observed using a confocal laser scanning microscope. From the images obtained as a result, the fluorescence intensity derived from the fluorescent probe in each cell was calculated from DsRed expressing cells (with red fluorescence) showing GST expression as + and non-expressing cells as ⁇ .
  • FIG. 13 The results are shown in FIG.
  • (A) in FIG. 13 is a chemical structural formula of Ps-TAc
  • (B) is an imaging image (the scale bars are all 40 ⁇ m)
  • (C) shows various GSTs. It is the graph which compared the fluorescence intensity of the green fluorescence in the expression cell (+) and non-expression cell (-) of DsRed.
  • (D) in FIG. 13 is a chemical structural formula of Ps-DCTAc
  • E) is an imaging image (the scale bars are all 40 ⁇ m)
  • (F) expresses various GSTs. It is the graph which compared the fluorescence intensity of the green fluorescence in the expression cell (+) and non-expression cell (-) of DsRed.
  • MCF-7 cells were transfected with pIRES2-DsRed Express2 / 3xFLAG-GST incorporating each of eight different 18 classes of GST by the same method as described above.
  • each GST molecular species was confirmed by Western blotting. Specifically, an equal amount of protein (derived from GST-expressing MCF-7 cells) was separated by SDS-polyacrylamide (PAGE) gel electrophoresis (12.5% polyacrylamide) and then applied to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Transcribed. After confirming protein transfer onto the PVDF membrane with 0.1% Ponceau S staining solution (manufactured by Vehicle Corporation), TBS-T containing 3% skim milk (Tris buffer containing 0.1% Tween-20) In the liquid) at room temperature for 1 hour.
  • PAGE SDS-polyacrylamide
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • anti-FLAG-M2 mouse IgG antibody (dilution ratio 1: 5000, Sigma-Aldrich Japan GK) or anti- ⁇ -actin rabbit IgG antibody (dilution ratio 1) was used as the primary antibody. : 4000, Laboratory of Biomedical Research) (in 5% bovine serum albumin (BSA)) and shaken overnight at 4 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • secondary antibody horseradish peroxidase
  • FIG. 14 shows the result of Western blotting performed as described above. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the target GST protein was expressed in MCF-7 cells in which any GST molecular species was expressed.
  • MCF-7 cells expressing each GST molecular species were fixed in 4% paraformaldehyde PBS solution at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the membrane was permeabilized by treatment with a PBS solution containing 0.1% Triton X-100 for 30 minutes.
  • antibody buffer PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Triton X-100 and 0.1% sodium azide
  • anti-FLAG-M2 mouse IgG Antibody (dilution ratio 1: 500, Sigma-Aldrich Japan LLC) was added and incubated overnight at 4 ° C. Cells were incubated with PBS for 5 minutes and washed to remove excess primary antibody (total 5 times). Next, the cells were incubated for 1 hour at room temperature in an antibody buffer containing AlexaFluor (registered trademark) 647-labeled anti-mouse IgG goat antibody (dilution ratio 1: 1000, Abcam Inc.), and then incubated with PBS for 5 minutes.
  • AlexaFluor registered trademark
  • the DAPI, DsRed, and AlexaFluor 647 fluorescent dyes were excited using laser beams having wavelengths of 405 nm, 583 nm, and 635 nm, respectively, and detection was performed using a corresponding filter set.
  • Ps-TAc was incubated on MCF-7 cells expressing any of the various GST molecular species as described above, and then fluorescence imaging was performed using an epifluorescence microscope. Specifically, 2.5 ⁇ M Ps-TAc was incubated for 5 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 on MCF-7 cells expressing each of various GST molecular species as 3 ⁇ FLAG-tagged cDNA. After that, observation was performed using an epifluorescence microscope IX80 (Olympus Corporation).
  • the fluorescence derived from the probe and the fluorescence derived from DsRed are respectively U-MNIBA filter set (excitation wavelength: 470 to 495 nm, fluorescence wavelength: 510 to 550 nm) and U-MWIG filter set (excitation wavelength: 530 to 550 nm, fluorescence wavelength). : 575 nm or more).
  • FITC in FIG. 16 is an image of green fluorescence derived from a fluorescent probe (Ps-TAc)
  • DsRed is an image of red fluorescence derived from DsRed
  • Merge is an overlay image of these. Yes (both scale bars are 20 ⁇ m).
  • FIG. 17A an enlarged observation image of GSTP1-expressing cells is shown in FIG. 17A, and a graph in which the intensity of green fluorescence in each image is quantified between the GST-expressing cells is shown in FIG. The number of cells used is 20).
  • GSTP1 is expressed by treating MCF-7 cells with 5-azacytidine, which is used as a DNA methyltransferase inhibitor, and the activity of GSTP1 thus expressed is captured using PS-TAc. was verified to be possible.
  • the medium was changed to a medium containing vehicle or 5 ⁇ M 5-azacytidine.
  • the cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, and the cells were seeded on a 35 mm glass bottom dish so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / dish. Was allowed to stand for more than 96 hours.
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • FLUOVIEW FV10i-DOC manufactured by Olympus Corporation
  • the fluorescence of the fluorescent probe was excited by an LD laser having a wavelength of 473 nm
  • the fluorescence of Hoechst 33258 was excited by an LD laser having a wavelength of 405 nm.
  • Fluorescence images in the corresponding fluorescence spectrum were acquired.
  • FIG. 18 (A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above-described processing
  • FIG. 18 (B) shows 60 images randomly extracted from each of the control group and the 5-azacytidine administration group. It is a figure which shows distribution of the fluorescence intensity in a cell. As shown in FIG. 18, strong fluorescent cells derived from the fluorescent probe were not observed in the control group, whereas cells having very high fluorescence intensity were observed in the 5-azacytidine administration group.
  • RNAi RNA interference
  • MCF-7 cells treated with 5 ⁇ M 5-azacytidine added to the medium and GSTP1
  • 4 ⁇ L of Lipofectamine TM RNAiMAX Transfection of 30 pmol of control siRNA or GSTP1 siRNA was compared to MCF-7 cells in the 5-azacytidine administration group in which strong fluorescent cells were observed as described above.
  • the cells were introduced into the cells using Reagent (Thermo Fisher Scientific).
  • the cells After 24 hours from the introduction of siRNA, the cells are detached with 0.25% trypsin-EDTA, all the cells are suspended in 6-10 mL of DMEM, reseeded in a 35 mm glass bottom dish, and further 24 hours after reseeding. Thereafter, observation was performed using a confocal laser scanning microscope in the same manner as described above.
  • FIG. 19A is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above-described processing
  • “Merge ( ⁇ 10)” is a 10-fold enlarged image of the “Merge” image.
  • FIG. 19B is a graph showing the distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA administration group and the GSTP1 siRNA administration group. As shown in FIG. 19, in the GSTP1 siRNA administration group, a significant decrease in the fluorescence intensity derived from the fluorescent probe (Ps-TAc) was observed.
  • the presence or absence of GSTP1 protein expression based on demethylation of the promoter region of the GSTP1 gene can be detected by using the fluorescent probe (Ps-TAc) according to the present invention.
  • GSTP1 is expressed in normal epithelial cells, it is known that expression of GSTP1 is not observed when the CpG part of the promoter region of the GSTP1 gene is methylated by canceration. Therefore, if the fluorescent probe according to the present invention can be applied to such a system, it is possible to detect prostate cancer cells (GSTP1 is not overexpressed) using the presence or absence of fluorescence as an index. Conceivable.
  • the present invention is applied to HT1080 cells which are fibroblastoma-derived cells expressing GSTP1.
  • HT1080 cells which are fibroblastoma-derived cells expressing GSTP1.
  • PS-TAc fluorescent probe
  • HT1080 cells were seeded in a 6-well plate at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well, 30 ⁇ mol of control siRNA or GSTP1 siRNA (manufactured by Invitrogen) was added to each 4 ⁇ L of Lipofectamine TM RNAiMAX Transfection.
  • the cells were introduced into the cells using Reagent (Thermo Fisher Scientific). After 24 hours from the introduction of siRNA, the cells are detached with 0.25% trypsin-EDTA, all the cells are suspended in 6-10 mL of DMEM, reseeded in a 35 mm glass bottom dish, and further 24 hours after reseeding. Thereafter, observation was performed using a confocal laser scanning microscope in the same manner as described above. Furthermore, GSTP1 knockdown was confirmed by Western blotting using the same method as described above.
  • FIG. 20A is an electrophoretogram showing the results of Western blotting.
  • FIG. 20B is an imaging image of the HT1080 cell subjected to the above-described processing. Among these, “Merge (wide field)” is a 6-fold enlarged image of the “Merge” image.
  • FIG. 20 (C) is a diagram showing the distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA administration group and the GSTP1 siRNA administration group.
  • FIG. 20 (D) corresponds to imaging images (merge (wide field)) before administration of Ps-TAc and after 6 minutes, 10 minutes and 15 minutes after administration in the cell groups administered with control siRNA and GSTP1 siRNA, respectively. ).
  • the fluorescent probe (Ps-TAc and the like) according to the present invention is a fluorescent probe capable of detecting the activity even in cancer cells that endogenously express GSTP1. .
  • Ps-TAc was administered to various cancer cells in order to clarify whether Ps-TAc can capture the GSTP1 activity of various cancer cells and evaluate the presence or absence of GSTP1 expression. Observed with a confocal laser microscope.
  • the cells were cultured for 20 minutes at 37 ° C. in Hank's buffer containing 10 ⁇ g / mL Hoechst 33258. Thereafter, the medium was removed, and the cells were washed with a sodium phosphate buffer. Subsequently, Hank's buffer containing 2 ⁇ M Ps-TAc was added, and further incubated at room temperature for 15 minutes, followed by fluorescence imaging with a confocal laser microscope (Olympus). As a confocal laser scanning microscope, FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used.
  • the fluorescence of Hoechst 33258 was excited by an LD laser having a wavelength of 405 nm, and the fluorescence of the fluorescent probe was excited by an LD laser having a wavelength of 473 nm. A fluorescence image in the spectrum was acquired.
  • HCT116, HT29 (colon cancer cell), HuCCT1 (bile duct cancer cell), DU145 (prostate cancer cell), HT1080 (fibrosarcoma cell) are used as GSTP1-positive cells, and GSTP1-negative cells are used.
  • MCF7 breast cancer cells
  • LNCaP prostate cancer cells
  • the results are shown in FIG. Of the photographs shown in FIG. 21, the upper photograph corresponding to each cell is a fluorescent image, and the lower photograph is a white light (BF) image, both taken using a confocal laser microscope. .
  • the fluorescence intensity and the intracellular distribution of the fluorescent product differ depending on the cell type, fluorescence could be confirmed in all the GSTP1-expressing cells used in this experiment. On the other hand, no increase in fluorescence intensity was observed in cells not expressing GSTP1.
  • the precipitate was dissolved in purified water (40 mL) in which sodium sulfide nonahydrate (2.42 g) was dissolved, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 hours.
  • the reaction solution was cooled to room temperature and poured into a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate.
  • the solution was separated with ethyl acetate, and washed twice with a saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate solution and once with a saturated saline solution.
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure.
  • the reaction solution was partitioned between ethyl acetate and saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate, and washed twice with saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate and once with saturated brine.
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure.
  • a fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation) was used.
  • 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; DMSO 1%) containing 2 ⁇ M Ps-FL containing 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 ⁇ g / mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) as a cosolvent ) was allowed to react for 2 hours with stirring at room temperature (25 ° C.). Thereafter, the fluorescence spectrum after the reaction was measured in the same manner as described above.
  • the reaction solution was cooled to room temperature and adjusted to pH 4 using saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate solution.
  • the mixture was separated with ethyl acetate, and washed three times with a saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate solution and once with a saturated saline solution.
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure.

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Abstract

【課題】ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することができる蛍光プローブを提供する。 【解決手段】下記一般式（１）： 式中、符号の定義は、明細書に記載の通りである、 で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩を、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）測定用蛍光プローブとして用いる。

Description

ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途
　本発明は、ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途に関する。
　グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（本明細書中、「ＧＳＴ」とも称する）は、親電子性化合物と還元型グルタチオン（本明細書中、「ＧＳＨ」とも称する）との抱合体の生成反応を触媒する酵素であり、薬物代謝酵素として薬物や内在性活性代謝物のグルタチオン抱合に関与していることが知られている。生体内において、ＧＳＴは、これら抱合体を生成することにより、例えば、親電子性化合物を無毒化したり、排出したりする役割を担っている。また、ＧＳＴはこれ以外にも、ステロイドホルモンの生合成・アミノ酸の分解・プロスタグランジンの生合成など、多岐にわたる機能をもつ。
　従来提案されているＧＳＴ活性の測定方法としては、吸光法（比色法）、生物発光法、蛍光法などがある。なかでも、高感度での測定が可能である蛍光法に基づくＧＳＴ活性の測定方法として、いくつかの蛍光プローブが開発されている。
　例えば非特許文献１には、４９０ｎｍに極大吸収波長、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長をそれぞれ有するプローブとして、ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ－Ｍｅといった一連の蛍光プローブが開示されている。これらの蛍光プローブはＧＳＴ活性によるグルタチオン化と、これに伴う脱ニトロ化反応によって大きな蛍光強度上昇を示す。ただし、非特許文献６に開示された蛍光プローブ（ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ－Ｍｅ）は、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が高いことから、十分なＳ／Ｎ比が得られないという問題があり、また、反応後の蛍光量子収率が低いという問題があった。さらに、ＤＮＡＦ類を蛍光プローブとして用いると、弱酸性領域のｐＨ条件下では生成物の蛍光強度が大幅に減少するという問題もあった。そして、これらの問題を解決することを目的とした技術として、特許文献１によれば、ＤＮＡＦ類におけるフルオレセイン構造のキサンテン環の特定部位にフッ素原子または塩素原子を導入したフルオレセイン誘導体をＧＳＴ活性測定用蛍光プローブとして用いることが提案されている。
　ところで、ＧＳＴは、細胞質型、ミトコンドリア型、ミクロソーム型の３種類に分類され、ヒトの細胞質型ＧＳＴにはＡｌｐｈａ、Ｍｕ、Ｐｉ、Ｓｉｇｍａ、Ｔｈｅｔａ、Ｏｍｅｇａ、Ｚｅｔａの７種類のクラスが存在し、それぞれに最大５種類の分子種が存在する（非特許文献２）。なかでも、胎盤をはじめとした限られた正常組織に発現しているＰｉクラスの分子種ＧＳＴＰ１は、多くのがん細胞で過剰発現しており（非特許文献３）、がん細胞の抗がん剤耐性に寄与していることが報告されている（非特許文献４）。さらにＧＳＴＰ１は、ＪＮＫ（ｃ－ｊｕｎ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｋｉｎａｓｅ）と相互作用して複合体を形成し、ストレスシグナルによるＪＮＫの活性化を阻害している。酸化ストレスや抗がん剤といった刺激が加わることで、この複合体からＧＳＴＰ１が解離し、ＪＮＫが活性化される（非特許文献５）。すなわち、ＧＳＴＰ１は、抗がん剤によるＪＮＫの活性化を介したアポトーシスを抑制していると考えられている。これまでに開発されてきたＧＳＴＰ１阻害剤は、細胞内ＧＳＴＰ１に結合し、ＧＳＴＰ１－ＪＮＫ複合体の形成を阻害することでＪＮＫを活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献６）。このように、多くのがん細胞で過剰発現していることと抗がん剤耐性の獲得に寄与していることから、ＧＳＴＰ１はがんマーカーとして、また抗がん剤の標的分子として期待されている。従来、がん細胞で過剰発現しているβ－ガラクトシダーゼやγ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を標的とした蛍光プローブのＨＭＲｅｆ－ｂＧａｌやｇＧｌｕ－ＨＭＲＧが開発され、微小がんの検出に成功している（非特許文献７、８）。しかしながら、これらの酵素はすべてのがん細胞で過剰発現しているわけではなく、発現量の低いがん細胞を検出することは困難である。一方、ＧＳＴＰ１は前立腺がんを除くほぼ全てのがん細胞で過剰発現しているため、ＧＳＴＰ１の過剰発現を捉えることでより多くのがん細胞を検出することが可能であると考えられる。がんの病理診断においては組織免疫染色等が行われるが、ＧＳＴＰ１の活性を検出可能な蛍光プローブを開発できれば、生検組織にこの蛍光プローブを塗布することでＧＳＴＰ１活性を指標としたがんの有無の評価が可能となる。また、生細胞で利用可能なＧＳＴＰ１活性を検出する蛍光プローブは、新たな研究ツールとしての使用が期待される。
特開２０１６－１０８２６４号公報
Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　２００８，　１３０　（４４），　１４５３３-１４５４３． Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｏｘｉｃｏｌ．　２００４，　４５　（１），　５１-８８． Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　１９９６，　５０　（１），　１４９-１５９． Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９４，　１５，　４３１３-４３２０． Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．　２０１０，　１７　（９），　１３７３-１３８０． Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２００５，　２８０　（２８），　２６３９７-２６４０５． Ｎａｔ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０１５，　６，　６４６３． Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　２０１１，　３　（１１０），　１１０ｒａ１１９．
　非特許文献１や特許文献１に開示された蛍光プローブは、ＧＳＴ分子種の選択性が低い（すなわち、ＧＳＴＰ１に対する選択性を有しない）。また、当該蛍光プローブはＧＳＨとの反応性が高いことから、非酵素的な反応速度が大きい。このため、非特許文献１や特許文献１に開示されたＧＳＴ活性測定用蛍光プローブを用いたとしても、がん細胞において過剰発現しているＧＳＴＰ１の存在を特異的に検出することはできないという問題がある。
　そこで本発明は、ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することが可能な蛍光プローブを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、所定の化学構造を有するニトロベンゼン誘導体（またはその塩）が、上記課題を解決可能な蛍光プローブとして有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の一形態によれば、下記一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
式中、Ｌは蛍光団を表し、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩が提供される。
　また、本発明の他の形態によれば、上記ニトロベンゼン誘導体またはその塩を含む、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブが提供される。
　さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブを含む、がん細胞またはがん組織の検出用組成物、およびがん診断用組成物、並びに上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を用いたがん診断用キットが提供される。
　また、本発明のさらに他の形態によれば、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を組織に適用する工程と、適用後の前記組織に対して励起光を照射する工程と、前記組織からの蛍光を検出する工程と含む、がん細胞またはがん組織の検出方法、および、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を、生体から採取した血液中の細胞と接触させる工程と、前記細胞に対して励起光を照射する工程と、前記細胞からの蛍光を検出する工程とを含む、血液中におけるがん細胞の検出方法が提供される。
　さらに、本発明のさらに他の形態によれば、下記一般式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
式中、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置し、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０～５の整数を表す、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩もまた、提供される。
　本発明によれば、ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することが可能な蛍光プローブが提供される。本発明に係る蛍光プローブは、がん細胞またはがん組織の検出やがんの診断といった用途に用いられうる。
実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ａ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ａ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ａ）の吸収波長（２９０ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。また、（Ｂ）において、「Ｂｅｆｏｒｅ」はＧＳＨおよびＧＳＴ添加前の吸収スペクトルであり、（Ｂ）および（Ｃ）における「ＧＳＨ」並びに「ＧＳＴＡ１」「ＧＳＴＭ１」および「ＧＳＴＰ１」は、ＧＳＨのみを添加した系並びにＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１およびＧＳＴＰ１のいずれかを添加した系の結果をそれぞれ示す（以下同様）。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｂ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ｂ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ｂ）の吸収波長（３４０ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｃ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ｃ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ｃ）の吸収波長（２８０ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｄ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ｄ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ｄ）の吸収波長（２９０ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｅ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ｅ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ｅ）の吸収波長（３１５ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｆ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ｆ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ｆ）の吸収波長（２８０ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｇ））を各ＧＳＴ分子種およびＧＳＨの存在下でインキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った結果を示す図である。（Ａ）は化合物（Ｇ）の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は化合物（Ｇ）の吸収波長（３１５ｎｍ）における吸光度の時間変化を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ａ）～（Ｇ））について、各ＧＳＴ分子種の存在下での３０分間のインキュベーション終了時点の極大吸収波長における吸光度（Ａｂｓ）の値を、インキュベーション前の同じ波長における吸光度（Ａｂｓ０）の値で除して得られた値（Ａｂｓ／Ａｂｓ０）を比較した結果を示すグラフである。 実施例において合成したニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｆ））がＧＳＴＰ１存在下において実際にグルタチオン化されることを、ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳによって解析した結果を示す図である。（Ａ）はＨＰＬＣ解析の結果を示し、（Ｂ）はＬＣ－ＭＳ解析の結果を示す。 実施例において、ＧＳＨとの反応に伴ってニトロベンゼン誘導体（化合物（Ｆ））からニトロ（ＮＯ２）基が脱離していることを、Ｇｒｉｅｓｓ法を用いて確認した結果を示す図である。（Ａ）はＧｒｉｅｓｓ法の反応機構を示し、（Ｂ）は化合物濃度に対して亜硝酸イオン濃度をプロットした検量線（破線）と、実測値（実線）をプロットしたグラフである。 （Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＴＧ）の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定結果を示す。また、（Ｃ）および（Ｄ）はそれぞれ、上記蛍光プローブについてＨＰＬＣ解析およびＬＣ－ＭＳ解析を行った結果を示す図である。 実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＴＧ）について、３種類のＧＳＴ（ＧＳＴＡ１－１、ＧＳＴＭ１－１、ＧＳＴＰ１－１）について異なる濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定することで特異活性を算出した結果を示す図である。（Ａ）は、各種ＧＳＴの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたときのＰｓ－ＴＧの蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。また、（Ｂ）は、Ｐｓ－ＴＧの各種ＧＳＴとの反応初速度を、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）として示すグラフである。 （Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＤＣＴＧ）の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定結果を示す。また、（Ｃ）および（Ｄ）はそれぞれ、上記蛍光プローブについてＨＰＬＣ解析およびＬＣ－ＭＳ解析を行った結果を示す図である。 実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＤＣＴＧ）について、３種類のＧＳＴ（ＧＳＴＡ１－１、ＧＳＴＭ１－１、ＧＳＴＰ１－１）について異なる濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定することで特異活性を算出した結果を示す図である。（Ａ）は、各種ＧＳＴの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたときのＰｓ－ＤＣＴＧの蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。また、（Ｂ）は、Ｐｓ－ＤＣＴＧの各種ＧＳＴとの反応初速度を、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）として示すグラフである。 実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＴＧ）について、各種濃度のＧＳＨとの非酵素的な反応性を評価した結果を示すグラフである。 実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＴＧ）について、各種の酸化還元活性種およびその関連物質との反応性を評価した結果を示すグラフである。 実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＧ、Ｐｓ－ＤＣＴＧ）を培養細胞へ適用し、細胞内においてＧＳＴＰ１活性を検出することが可能か否かを調べた結果を示す図である。（Ａ）および（Ｃ）はそれぞれ、Ｐｓ－ＴＧおよびＰｓ－ＤＣＴＧの化学構造式である。また、（Ｂ）および（Ｄ）はそれぞれ、各蛍光プローブを投与したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、左から蛍光プローブの蛍光；ＤｓＲｅｄの蛍光；並びに、蛍光プローブの蛍光、ＤｓＲｅｄの蛍光および白色像の重ね合わせ（Ｍｅｒｇｅ）を示すものである（スケールバーはいずれも２０μｍである）。 実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）について吸収スペクトルを測定した結果を示すグラフである。（Ａ）の「反応前」のスペクトルはブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）との反応前の吸収スペクトルを示し、「反応後」のスペクトルはＰＬＥを添加した系について反応後に測定した吸収スペクトルである。（Ｂ）は、上記蛍光プローブについて、ＧＳＨ添加系およびＰＬＥ添加系の双方について、反応の間、波長４９０ｎｍでの吸光度を経時的に記録した結果を示すグラフである。 キサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基がアシル化された本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃおよびＰｓ－ＤＣＴＡｃなど）が生細胞に添加された際に、細胞膜を透過して細胞内へ取り込まれ、その後に細胞内に存在するエステラーゼの加水分解作用を受けて脱アセチル化され、対応するフェノール（Ｐｓ－ＴＧやＰｓ－ＤＣＴＧ）へと変換されて、細胞内に存在するＧＳＴＰ１の作用によりグルタチオン化を受けて強い蛍光を発するようになる推定メカニズムを説明するための図である。 実施例において合成された本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ、Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ）について、発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いた手法により３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれを発現させたＭＣＦ－７細胞へ適用した際の細胞イメージングを行った結果を示す図である。（Ａ）はＰｓ－ＴＡｃの化学構造式であり、（Ｂ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｃ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（－）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。同様に、（Ｄ）はＰｓ－ＤＣＴＡｃの化学構造式であり、（Ｅ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｆ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（－）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。 実施例において、細胞質型ＧＳＴおよびミトコンドリア型ＧＳＴの各種分子種（異なる８クラス１８種類）をｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴに組み込んでＭＣＦ－７細胞にトランスフェクションすることにより発現させ、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）のＧＳＴＰ１選択性をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す電気泳動写真である。 実施例において、ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２の赤色蛍光を示す細胞においてＧＳＴタンパク質が発現していることを確かめるため、蛍光免疫染色を行った結果を示す図である。ここで、「ＤＡＰＩ」、「ＤｓＲｅｄ」、「Ａｌｅｘａ６４７」はそれぞれの蛍光色素による発光を撮影した画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である。 実施例において、各種ＧＳＴ分子種のいずれかを発現させたＭＣＦ－７細胞に対して本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）をインキュベーション後、落射蛍光顕微鏡を用いて蛍光イメージングを行った結果を示す図である。ここで、「ＦＩＴＣ」は蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の緑色蛍光の画像であり、「ＤｓＲｅｄ」はＤｓＲｅｄ由来の赤色蛍光の画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である（スケールバーはいずれも２０μｍである）。 （Ａ）は、図１４に示すＧＳＴＰ１発現細胞の観察画像を拡大したものであり、（Ｂ）は図１４に示す各画像における緑色蛍光の強度を各ＧＳＴ発現細胞間で定量化したグラフである（測定に用いた細胞数は２０個である）。 実施例において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（５－アザシチジン）を用いてＭＣＦ－７細胞を処理することにより発現させたＧＳＴＰ１の活性を本発明に係る蛍光プローブ（ＰＳ－ＴＡｃ）を用いて捕えることが可能であるかどうかを検証した結果を示す図である。（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、（Ｂ）はコントロール群および５－アザシチジン投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。 実施例において、５－アザシチジンを培地中へ加えて処理したＭＣＦ－７細胞に対して、さらにｓｉＲＮＡを投与することでＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を行い、ＧＳＴＰ１の発現を抑制することを試みた結果を示す図である。（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（×１０）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の１０倍拡大画像である。また、（Ｂ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。 実施例において、がん細胞に発現する内在性のＧＳＴＰ１の発現を可視化することが可能かどうか評価することを目的として、ＧＳＴＰ１を発現している繊維芽肉腫由来細胞であるＨＴ１０８０細胞に対して本発明に係る蛍光プローブ（ＰＳ－ＴＡｃ）を適用した結果を示す図である。（Ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳動写真である。（Ｂ）は上記の処理を施したＨＴ１０８０細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ　ｆｉｅｌｄ）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の６倍拡大画像である。（Ｃ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。（Ｄ）はコントロールｓｉＲＮＡおよびＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡをそれぞれ投与した細胞群におけるＰｓ－ＴＡｃの投与前並びに投与後６分、１０分および１５分経過後のイメージング画像（ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ　ｆｉｅｌｄ）に対応）である。 実施例において、Ｐｓ－ＴＡｃが様々ながん細胞のＧＳＴＰ１活性を捉えることができるかどうか、また、ＧＳＴＰ１の発現の有無を評価できるかどうか評価することを目的として、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）を各種がん細胞へ投与し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果を示す図である。 （Ａ）は、実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－Ｎａｐｈ）の化学構造を示す。（Ｂ）は、当該蛍光プローブ（Ｐｓ－Ｎａｐｈ）について、ＧＳＴＰ１－１存在下におけるＧＳＨとの反応前後の蛍光スペクトルを測定した結果を示すグラフである。 （Ａ）は、実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ＦＬ）の化学構造を示す。（Ｂ）は、当該蛍光プローブ（Ｐｓ－ＦＬ）について、ＧＳＴＰ１－１存在下におけるＧＳＨとの反応前後の蛍光スペクトルを測定した結果を示すグラフである。 （Ａ）は、実施例において合成した本発明に係る蛍光プローブ（蛍光団を有するニトロベンゼン誘導体であるＰｓ－ｊＲｈｏｄ）の化学構造を示す。（Ｂ）は、当該蛍光プローブ（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄ）について、ＧＳＴＰ１－１存在下におけるＧＳＨとの反応前後の蛍光スペクトルを測定した結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態を説明する。
　本発明の一形態は、下記一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩である。
　一般式（１）において、ＥＷＧ基は電子求引性基（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ）であって、０．６６以上０．７８未満のハメット（Ｈａｍｍｅｔ）定数を有するものである。なお、本明細書において「ハメット（Ｈａｍｍｅｔ）定数（σｐ）」とは、ＥＷＧ基の電子求引性を示す指標であり、この値が大きいほど、電子求引性が高いことを示す。ここで、文献（Ｈａｎｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　１９９１，　Ｖｏｌ，９１，　Ｎｏ．　２，　１６５－１９５）に記載されているＥＷＧ基のハメット定数（σｐ）の値についてはその値を用いるものとする。一方、文献に記載されていないＥＷＧ基については、別途、従来公知のソフトウェアパッケージを利用し、無置換安息香酸の酸解離定数（ｐＫａ）との差を算出することでハメット定数（σｐ）の値を得ることができる。また、「酸解離定数（ｐＫａ）」とは、水溶液中での酸解離定数（ｐＫａ）を意味し、この値が小さいほど酸強度が大きいことを示す。ここで、水溶液中での酸解離定数（ｐＫａ）は、具体的には、無限希釈水溶液を用い、２５℃での酸解離定数を測定することにより実測することができる。また、従来公知のソフトウェアパッケージを用いることで、公知文献値のデータベースに基づいた値を計算により求めることもできる。
　本発明において、ＥＷＧ基のハメット定数を「０．６６以上０．７８未満」としたのは、ＥＷＧ基のハメット定数が、ニトロ基（－ＮＯ２基）の値（０．７８）よりも小さく、シアノ基（－Ｃ≡Ｎ基）の値（０．６６）以上であることを示したものである。また、一般式（１）において、ＥＷＧ基は共鳴効果を示すものであることが好ましい。ここで、ＥＷＧ基が「共鳴効果を示す」とは、本発明に係るニトロベンゼン誘導体をＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いた場合において、当該ニトロベンゼン誘導体がＧＳＨと反応する際の上記ベンゼン環に対する芳香族求核置換反応の反応中間体であるマイゼンハイマー錯体の構造を安定化するように、当該ベンゼン環に結合したニトロ基上へ電子が局在化した共鳴構造が存在することを意味する。なお、本発明におけるＥＷＧ基の例としては、例えば、メシル基（－ＳＯ２ＣＨ３基；ハメット定数＝０．７２であり、共鳴効果を示す）やシアノ基（－Ｃ≡Ｎ基；ハメット定数＝０．６６であり、共鳴効果を示す）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、一般式（１）において、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している。このような配置とすることにより、ニトロベンゼン誘導体はＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブとして機能することができる。なお、一般式（１）においてベンゼン環に結合したアミド結合の当該ベンゼン環への結合位置を１位としたときに、上記の規定を満足するニトロ（ＮＯ２）基およびＥＷＧ基の結合位置の組み合わせを列挙すると以下の通りである：
　・２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、３位＝ＥＷＧ基；
　・２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、５位＝ＥＷＧ基；
　・４位＝ニトロ（ＮＯ２）基、３位＝ＥＷＧ基。
　一般式（１）において、Ｌは蛍光団を表す。ここで「蛍光団」とは、蛍光を発する発色団を意味し、本発明においては蛍光標識化合物として使用されうる蛍光性官能基であれば特に限定されない。当該蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（ボロン－ジピロメテン）、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎ、ナフタルイミドおよびロドール（Ｒｈｏｄｏｌ）からなる群から選択される母核を有するものが挙げられる。なかでも、脂溶性が高く細胞膜透過性を有するという観点からは、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、およびＳｉｎｇａｐｏｒｅ　Ｇｒｅｅｎからなる群から選択される母核を有するものが好ましく、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎを母核として有するものが特に好ましい。ここで、一般式（１）で表されるニトロベンゼン誘導体において、蛍光団Ｌは、好ましくは下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される構造を有するものであり、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎを母核として有する化合物はこの形態に包含される。
　一般式（２）において、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０（好ましくは炭素数１～１２、より好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～４、特に好ましくは炭素数１～２、最も好ましくは炭素数１）のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０（好ましくは炭素数１～１２、より好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～４、特に好ましくは炭素数１～２、最も好ましくは炭素数１）のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表す。また、ｎはベンゼン環に結合したＲ１の数であり、０～４の整数を表す。ｎは、好ましくは０～３の整数であり、より好ましくは０～２の整数であり、さらに好ましくは０または１である。
　一般式（２）において、Ｒ２は、水素原子または炭素数２～２０（好ましくは炭素数２～１２、より好ましくは炭素数２～８、さらに好ましくは炭素数２～４、特に好ましくは炭素数２～３、最も好ましくは炭素数２）のアシル基を表す。なかでも、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いられた際の脂溶性（すなわち、細胞膜透過性）が高いという観点からは、Ｒ２は炭素数２～２０のアシル基であることが好ましい。
　一般式（２）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す。ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよいが、Ｘ１および／またはＸ２がハロゲン原子である場合、当該ハロゲン原子はフッ素原子または塩素原子であることが好ましく、塩素原子であることが特に好ましい。また、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いられた場合のＧＳＴＰ１選択性の観点からは、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方が水素原子であることが好ましく、Ｘ１およびＸ２がともに水素原子であることがより好ましい。
　本明細書において、「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。Ｒ１がアルキル基である場合、その炭素数は上述したように１～２０であるが、好ましくは炭素数１～１２であり、より好ましくは炭素数１～８であり、さらに好ましくは炭素数１～４であり、特に好ましくは炭素数１～２（メチル基またはエチル基）であり、最も好ましくは炭素数１（メチル基）である。
　本明細書において、「アルコキシ基」は、－Ｏ－アルキル基を意味し、ここで「アルキル基」は上述した定義および好ましい形態を有する基である。
　本明細書において、「アシル基」は、脂肪族アシル基または芳香族アシル基のいずれであってもよく、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。アシル基は１個または２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、アシル基としてアルキルカルボニル基（アセチル基など）、アルキルオキシカルボニル基（アセトキシカルボニル基など）、アリールカルボニル基（ベンゾイル基など）、アリールオキシカルボニル基（フェニルオキシカルボニル基など）、アラルキルカルボニル基（ベンジルカルボニル基など）、アルキルチオカルボニル基（メチルチオカルボニル基など）、アルキルアミノカルボニル基（メチルアミノカルボニル基など）、アリールチオカルボニル基（フェニルチオカルボニル基など）、またはアリールアミノカルボニル基（フェニルアミノカルボニル基など）などのアシル基が挙げられるが、これらに限定されることはない。
　本明細書において、上述したＲ１としてのアルキル基やアルコキシ基、Ｒ２としてのアシル基は、任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。上記の官能基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１としてのアルキル基およびアルコキシ基は非置換のものであることが好ましく、Ｒ１が存在する場合（ｎが１～４の整数である場合）、当該Ｒ１は非置換のアルキル基であることが好ましい。同様に、Ｒ２としてのアシル基は非置換のものであることが好ましい。
　本発明の好ましい実施形態において、一般式（２）で表される蛍光団Ｌを有する化合物において、上述したＮＯ２基とＥＷＧ基との結合部位の組み合わせのうち、「２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、５位＝ＥＷＧ基」の組み合わせのものであることが好ましく、この際、ＥＷＧ基がメシル基またはシアノ基であることがより好ましく、ＥＷＧ基がメシル基であることが最も好ましい。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、一般式（１）で表されるニトロベンゼン化合物またはその塩は、下記一般式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表されるものである。なお、一般式（３）における符号の定義は、上記と同様である。
　上記一般式（１）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、またはトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩が挙げられる。また、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩が挙げられる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などが例示されうる。ただし、本発明に係る化合物の塩はこれらに限定されることはない。
　一般式（１）で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、エナンチオマーまたはジアステレオマーなどの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
　一般式（１）で表される本発明の化合物またはその塩は、水和物または溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の技術的範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒が挙げられる。
　なお、本発明に係るニトロベンゼン化合物またはその塩は、生体内環境であるｐＨ７．４（好ましくはｐＨ７．０～８．０）の条件下において非イオン性の状態で存在するものであることが好ましい。このような条件を満たす化合物であれば、細胞膜透過性に特に優れることから、後述するような生細胞に対して用いられる蛍光プローブとして特に有用である。
　一般式（１）で表される本発明の化合物は、例えば、従来公知の文献（Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２００８，　１３０（４４）：１４５３３－１４５４３（非特許文献１））に記載の手法を参照しつつ、合成することが可能である。また、本明細書の実施例の欄には、一般式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されており、当業者は本明細書の開示を参照し、また、必要に応じて本願出願時の技術常識を参酌することで出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
　一般式（１）で表される本発明の化合物は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１測定用の蛍光プローブとして使用することができる。本発明の化合物は、中性領域（例えばｐＨ５～９の範囲）では実質的に無蛍光である。一方、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１の存在下では、本発明の化合物におけるベンゼン環（の２位または４位）に結合しているニトロ基（－ＮＯ２基）が脱離するとともにこの位置がグルタチオン化され、強蛍光性の化合物となる。例えば、一般式（１）で表される化合物またはその塩は、中性領域において例えば４９０ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記のようにグルタチオン化された化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えば、蛍光波長５１０ｎｍ）を発する性質を有している。そして、この反応はＧＳＴＰ１のみに対して選択的に起こり、他のＧＳＴ分子種が存在してもこの反応は進行しない。したがって、本発明の化合物をＧＳＴＰ１測定用の蛍光プローブとして使用することにより、ＧＳＴＰ１の存在を、蛍光強度の変化に基づいて選択的に測定することが可能になる。なお、一般に「蛍光プローブ」とは、特定のタンパク質、細胞、または組織などに特異的に結合または分布して蛍光を発することにより、特定のタンパク質、細胞、または組織の観察を容易にすることができる物質を意味する。通常、「蛍光プローブ」といった場合は、その物質自体が蛍光を発する物質をいうが、本発明では、それ自体蛍光を発しないが、分解などにより蛍光を発するようになる前駆物質もまた、「蛍光プローブ」の概念に含まれるものとする。
　ここで、ＧＳＴＰ１は、前立腺がんを除くほぼ全てのがん細胞で過剰発現していることが知られている。このため、本発明に係るＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブを用いてＧＳＴＰ１の過剰発現を捉えることにより、がん細胞を検出することが可能である。例えば、ＧＳＴＰ１の活性を検出可能な本発明に係る蛍光プローブを生検組織に塗布することでＧＳＴＰ１活性を指標としたがんの有無の評価が可能である。すなわち、本発明に係るＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブは、がん細胞検出用のプローブとして利用可能であり、がん細胞またはがん組織の検出用組成物のほか、がん診断用組成物やがん診断用キットにおいて、さらにはがんの検出、判定、または診断方法においても使用することができる。なお、がんの検出、判定、または診断方法はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる方法であってもよいし、ｅｘ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで行われる方法であってもよい。
　本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物は、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレートなど、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができるが、国際公開第２０１１／１４９０３２号パンフレットなどに記載の生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。すなわち、本発明の他の形態によれば、本発明に係る化合物、蛍光プローブまたは検出もしくは診断用組成物、並びに生体試料固定装置を含むがん診断用キットが提供される。保持された生体試料に対して、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、あるいは検出もしくは診断用組成物、またはその溶液を加えることにより接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーを用いて励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができ、これを通じて蛍光を発する細胞をがん細胞と判定することができる。本発明では、試料の取得の容易性の観点から、生体試料の好ましい一例は血液であり、この場合において好ましくは、血液から得られた細胞群である。がんを患う患者から採取された血液の細胞群には、大量の血球細胞および少数のがん細胞が含まれているが、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物を用いることにより、大量の細胞の中からがん細胞を精度よく検出することが可能になる。これにより、被験者の血液細胞中にがん細胞が存在した場合には、当該被験者ががんを患っていると判定または診断することができる。別法では、インキュベート後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いて、がん細胞数の計測およびがん細胞の取得を行うこともできる。被験者の血液細胞中のがん細胞数を計測することにより、ＣＴなどの画像診断では発見不可能な微小な固形がんの存在を診断することが可能となり、これによりがんの早期診断も可能になる。さらに、被験者の所定体積の血液中の血液細胞におけるがん細胞数を一定期間ごとに計測することにより、被験者に対する外科手術、放射線治療などによる局所治療、または化学療法などによる全身治療、または分子標的薬の投与などによる治療の効果を判定することが可能となる。また、被験者の血液細胞中のがん細胞を検出後、取得することにより、がん細胞に対して別途解析手法を適用することが可能となり、遺伝子解析、発現解析、局在解析などの性状解析が可能となる。なお、生体試料の由来は血液に特に制限されず、血液以外の生体由来の試料であってもよいし、非生体由来の試料であってもよい。血液以外の生体由来の試料の種類は特に制限されないが、例えば、リンパ液、髄液その他の体液；細胞抽出物（ホモジネート）などが挙げられる。
　本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物、並びにがん診断用組成物は、生体イメージングの他に、手術または検査において、手術もしくは検査前または手術もしくは検査中に本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物を非経口投与することにより適用するか、または肉眼下または鏡視下における手術野の一部または全体に本発明に係る組成物を噴霧、塗布または注入などの方法により適用し、数十秒から数分後に励起光を適用部位に照射することにより、がん細胞またはがん組織を検出するために用いられてもよい。本発明に係る検出用または診断用組成物が適用された部位にがん組織が含まれる場合には、その組織が蛍光を発することから、その蛍光を発している部位ががん組織であると特定することができ、そこを含めた周囲組織と共に切除をすることが可能になる。ここで、「手術」とは、例えば開創を伴う開頭手術、開胸手術、もしくは開腹手術、または皮膚手術などのほか、胃内視鏡、大腸内視鏡、腹腔鏡、または胸腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、がんの治療のために適用される任意の手術を包含する。これにより、がんを切除する外科治療において、がんの形態や触覚に頼って決定されていたがん組織の範囲を、より明確に精度良く決定することができ、切除範囲の確定が容易になる。また、「検査」の用語は、胃内視鏡や大腸内視鏡などの内視鏡を用いた検査、および検査に伴う切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。内視鏡を用いた検査に用いた場合、がん組織が蛍光を発することにより、がん組織の特定が極めて容易になる。内視鏡検査においてがん組織が確認できた場合には、その組織について検査切除や治療的な切除を行うこともできる。手術や検査といった用語は最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
　本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物、並びにがん診断用組成物の適用濃度は、特に限定されないが、がん組織の存在が疑われる組織に対して、例えば、１～１０００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。組成物のｐＨについては、例えばｐＨ７．０～７．５の範囲で使用することが好ましい。本発明の検出用組成物及び診断用組成物としては、上述した本発明に係る化合物（またはその塩）をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合してもよい。例えば生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒、錠剤、液剤など任意の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用滅菌水や、適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。
　本発明の他の形態によれば、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出用もしくは診断用組成物を用いたがん細胞またはがん組織の検出方法が提供される。当該検出方法では、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物を、細胞または組織に適用し、適用後の細胞または組織に対して所定の励起光を照射することにより、細胞または組織における蛍光を検出することを含む。好ましくはかかる方法は、血液中におけるがん細胞を検出する方法であり、その場合、血液中の細胞は、プレパラートなどの観察容器に固定されていてもよいし、上で説明した生体試料固定装置により固定された診断チップであってもよい。一方で、このような検出方法を、生体の組織に適用して、手術時におけるがん組織の確定診断に用いることもできる。その場合の適用方法としては、細胞または組織に対して噴霧または塗布することにより適用してもよいし、注射や輸液により適用されてもよい。
　本発明のさらに他の形態によれば、本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出方法を用いて、がんの切除領域を決定し、当該領域を切除する工程を含む、手術・治療方法に関してもよい。
　本発明に係るがん細胞の検出方法は、がんの判定または診断方法に用いることができる。すなわち、本発明に係るがん細胞の検出方法により、指標となる蛍光よりも高い蛍光が検出された場合に、がんが存在すると判定または診断することができる。ここで、判定方法とは、指標との比較をすることにより、医師をはじめとした医療従事者による判断を含まずに特定する方法をいう。例えば指標となる蛍光として、蛍光を有する細胞を選択することができ、この場合、蛍光を有する細胞が検出された場合に、対象ががんを有すると決定することができる。別の形態では、蛍光強度や蛍光を有する細胞の数を指標とすることにより、がんの重篤度を判定することもできる。
　本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は、臓器の一部または全体を含めて最も広義に解釈することができ、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明に係るがん診断薬は、がん組織において特異的に強発現しているＧＳＴＰ１の活性を検出する作用を有していることから、がん組織の中でも、ＧＳＴＰ１を高発現している組織が好ましく、このようながん組織は、前立腺がんの組織を除くほとんどのがん組織である。がんの例としては、例えば、大腸がん、乳がん、肺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、脳腫瘍、造血器腫瘍などが挙げられるが、これらのがん種に限定されることを意図するものではない。また、後述する実施例の欄において実証されているように、本発明に係る蛍光プローブを用いることで、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化に基づくＧＳＴＰ１タンパク質発現の有無を検出することが可能である。ここで、正常上皮細胞においてはＧＳＴＰ１が発現しているが、がん化によってＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部分がメチル化されることでＧＳＴＰ１の発現が見られなくなることが知られている。したがって、本発明に係る蛍光プローブをそのような系へ適用することができれば、蛍光の有無を指標として、前立腺がん細胞（ＧＳＴＰ１が過剰発現していない）の検出を行うことも可能である。
　以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。
　［ＧＳＴＰ１選択的な基質の探索］
　本実験では、ＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブを構築するにあたり、いくつかのニトロベンゼン誘導体を対象として、ＧＳＴＰ１選択的な基質を探索した。
　ここで、上述したようにヒトの細胞質型ＧＳＴにはＡｌｐｈａ、Ｍｕ、Ｐｉなど７種類のクラスが存在するが、本実験ではこれらのうち生体内の発現量が多く論文としても多くの報告があるＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＰ１の３種類の細胞質型ＧＳＴを用いてアッセイを行うことにより、各種ニトロベンゼン誘導体のＧＳＴの基質としての反応性および選択性を評価した。非特許文献１では、ニトロベンゼン誘導体においてニトロ基（高い電子求引性を有する）がグルタチオン（弱い電子供与性を有する）へと置換されると吸収スペクトルが大きく変化することを利用して、アッセイを行っている。ここではまず、非特許文献１と同様の手法を用いて、非特許文献１で提案されているＧＳＴ活性検出蛍光プローブ（ＤＮＡＴ－Ｍｅ）のＧＳＴ基質部位である以下の化合物（Ａ）（３，４－ジニトロベンズアニリド（３，４－ＮＮＢＡ））を基準物質として合成した。また、合成原料を変更することにより、化合物（Ａ）と同様の手法により以下の化合物（Ｂ）～（Ｇ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 
　なお、ここでは、安息香酸誘導体を出発物質とした、化合物（Ｆ）の合成スキーム（下記の反応スキーム１）、化合物（Ｇ）の合成スキーム（下記の反応スキーム２）、および化合物（Ｄ）の合成スキーム（下記の反応スキーム３）について説明する。その後、化合物（Ｂ）および化合物（Ｃ）の合成方法についても、説明する。
　［反応スキーム１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（化合物（ａ）の合成；５－メチルチオ－２－ニトロ安息香酸）
　５－フルオロ－２－ニトロ安息香酸（３０５ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ），ナトリウムメタンチオラート（６２０ｍｇ，８．８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（１０ｍＬ）に懸濁し、室温で３０分間撹拌した。反応溶液に１Ｎ　ＨＣｌを加えて反応を止め、酢酸エチルで分液し、１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（２４６ｍｇ，収率７０％）。
　（化合物（ａ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：７．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ），７．５８－７．５６（２Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６６．５，１４８．５，１４５．１，１３０．０，１２７．９，１２５．９，１２５．４，１４．７。
　（化合物（ｂ）の合成；５－メシル－２－ニトロ安息香酸）
　５－メチルチオ－２－ニトロ安息香酸（ａ）（９７ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ），３０％　Ｈ２Ｏ２（４ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁し、泡が出るまでリン酸三カリウムを加え、室温で２０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（７９ｍｇ，収率６８％）。
　（化合物（ｂ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６４．３，１５２．９，１４５．５，１３３．０，１３０．７，１２８．０，１２５．９，４３．９
ＬＲＭＳ（ＥＩ＋）；２４６。
　（化合物（Ｆ）の合成；５－メシル－２－ニトロ安息香酸アニリド）
　５－メシル－２－ニトロ安息香酸（ｂ）（２７ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ），アニリン（１５．２μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１５分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（２１ｍｇ，収率５８％）。
　（化合物（Ｆ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：８．３６－８．２９（３Ｈ，ｍ），７．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６３．２，１５１．１，１４６．１，１３９．５，１３４．３，１３０．９，１２９．７，１２９．１，１２６．４，１２５．３，１２０．７，４３．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ５ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２３．０３６７，ｆｏｕｎｄ：３４３．０３６７（＋０．０ｍｍｕ）。
　（化合物（ｃ）の合成；５－メシル－２－メチルチオ安息香酸アニリド）
　５－メシル－２－ニトロ安息香酸アニリド（Ｆ）（４６ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ），ナトリウムメタンチオラート（１００ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（３４ｍｇ，収率７３％）。
　（化合物（ｃ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），３．２５（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６４．８，１４５．５，１３８．７，１３６．１，１３５．１，１２８．８，１２８．４，１２５．９，１２５．６，１２４．０，１１９．９，４３．６，１４．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１５Ｈ１５ＮＯ３Ｓ２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３４４．０３９１，ｆｏｕｎｄ：３４４．０３９３（＋０．２ｍｍｕ）。
　［反応スキーム２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　（化合物（ｄ）の合成；２－メチルチオ－５－ニトロ安息香酸）
　２－フルオロ－５－ニトロ安息香酸（２３５ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）とナトリウムメタンチオラート（４５０ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（６ｍＬ）に懸濁し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１７３ｍｇ，収率６４％）。
　（化合物（ｄ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：７．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ），７．５８－７．５６（２Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６６．５，１４８．５，１４５．１，１３０．０，１２７．９，１２５．９，１２５．４，１４．７。
　（化合物（ｅ）の合成；２－メチルスルフィニル－５－ニトロ安息香酸）
　２－メチルスルチオ－５－ニトロ安息香酸（ｄ）（９７ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ），３０％Ｈ２Ｏ２（４ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に懸濁し、泡が出るまでリン酸三カリウムを加え、室温で３０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（３３ｍｇ，収率２９％）。
　（化合物（ｅ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：８．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．５Ｈｚ），８．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），２．８２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６５．０，１５７．５，１４８．６，１２９．１，１２７．９，１２５．８，１２５．２，４３．７。
　（化合物（Ｇ）の合成；２－メチルスルフィニル－５－ニトロ安息香酸アニリド）
　２－メチルスルフィニル－５－ニトロ安息香酸（ｅ）（１６．９ｍｇ，０．０６９ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（３９．９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ），アニリン（９．３９μＬ，０．１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１１ｍｇ，収率４９％）。
　（化合物（Ｇ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．８（１Ｈ，ｓ），８．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．３Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７２－７．６３（２Ｈ，ｍ），７．４３－７．３２（２Ｈ，ｍ），７．１８－７．１１（１Ｈ，ｍ），３．４８（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６３．９，１５０．０，１４３．０，１３８．７，１３８．５，１３１．７，１２８．８，１２５．２，１２４．３，１２３．７，１２０．１，４４．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ４ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２７．０４１５，ｆｏｕｎｄ：３２７．０４２３（＋０．８ｍｍｕ）。
　［反応スキーム３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　（化合物（ｆ）の合成；３－ブロモ－４－ニトロ安息香酸アニリド）
　３－ブロモ－４－ニトロ安息香酸（２．１８ｇ，８．９ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦを塩化チオニル（１５ｍＬ）に懸濁し、３時間加熱還流した。トルエンを加え、余剰の塩化チオニルを留去した。残渣のジクロロメタン懸濁液（１０ｍＬ）に対して、アニリン（１．２５ｇ，１４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．８ｇ，２８ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン（５ｍＬ）を、氷上で滴下し、室温で１時間撹拌した。反応を１Ｎ　ＨＣｌで止め、ジクロロメタンを加えた。有機層を１Ｎ　ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンを留去した。ジクロロメタン－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１．４７ｇ，収率５１％）。
　（化合物（ｆ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．５（１Ｈ，ｓ），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），７．７９－７．７２（２Ｈ，ｍ），７．４３－７．３３（２Ｈ，ｍ），７．１９－７．１０（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６２．５，１５１．１，１３９．３，１３８．５，１３３．６，１２８．７，１２８．６，１２５．５，１２４．３，１２０．５，１１３．０
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１３Ｈ１０ＢｒＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：３２０．９８７５，ｆｏｕｎｄ：３２０．９８６５（－１．０ｍｍｕ）。
　（化合物（Ｄ）の合成；３ーシアノ－４－ニトロ安息香酸アニリド）
　３－ブロモ－４－ニトロ安息香酸アニリド（８０５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）とシアン化ナトリウム（２９１ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドンに溶解させて、１５０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、水を加えて沈殿を濾取した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（５１８ｍｇ，収率７７％）。
　（化合物（Ｄ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．６６（１Ｈ，ｓ），８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），８．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ），７．８０－７．７２，（２Ｈ，ｍ），７．４４－７．３５（２Ｈ，ｍ），７．２０－７．１０（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）１６２．１，１４９．５，１４０．０，１３８．４，１３４．６，１３３．７，１２８．８，１２６．１，１２４．４，１２０．４，１１５．３，１０７．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４Ｈ１０Ｎ３Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：２６８．０７２２，ｆｏｕｎｄ：２６８．０７１４（－０．８ｍｍｕ）。
　（化合物（Ｂ）の合成；２，５－ジニトロ安息香酸アニリド）
　２，５－ジニトロ安息香酸（４３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（８１ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ），アニリン（２２．４μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に懸濁し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ　ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再沈殿させて、目的化合物を得た（２７ｍｇ，収率４５％）。
　（化合物（Ｂ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．８９（１Ｈ，ｓ），８．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．５５（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝８．７，２．３Ｈｚ），８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．６６－７．６４（２Ｈ，ｍ），７．４０－７．３６（２Ｈ，ｍ），７．１７－７．１５（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６１．７，１５０．１，１４９．３，１３８．４，１３３．２，１２８．９，１２６．３，１２６．２，１２４．６，１２４．４，１１９．９。
　（化合物（Ｃ）の合成；３－トリフルオロメチル－４-ニトロ安息香酸アニリド
３－トリフルオロメチル－４-ニトロ安息香酸（７８５ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦを塩化チオニル（３ｍＬ）に懸濁し、２時間加熱還流した。反応溶液を室温まで冷却し、トルエンを加えて余剰の塩化チオニルを共沸により留去した。残渣のジクロロメタン懸濁液（２ｍＬ）に対して、アニリン（３０５μＬ，３．３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（９４０μＬ，６．６ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン（５ｍＬ）を、氷上で滴下し、室温で３０分間撹拌した。反応を１Ｎ　ＨＣｌで止め、ジクロロメタンを加えた。有機層を１Ｎ　ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンを留去した。ジクロロメタン－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（６１３ｍｇ，収率５９％）。
　（化合物（Ｃ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．６７（１Ｈ，ｓ），８．５０（１Ｈ，ｍ，８．５０－８．４９），８．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７９－７．７１（２Ｈ，ｍ），７．４４－７．３４（２Ｈ，ｍ），７．２０－７．１１（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６３．０，１４９．２，１３９．５，１３９．０，１３４．４，１２９．３，１２７．９，１２６．３，１２４．９，１２３．８，１２２．０，１２１．７，１２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４Ｈ１０Ｆ３Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：３１１．０６４４，ｆｏｕｎｄ：３１１．０６３６（－０．８ｍｍｕ）。
　（ＧＳＴ存在下における吸収スペクトルの変化の測定）
　次いで、上記で合成した７種類のニトロベンゼン誘導体（化合物（Ａ）～（Ｇ））をそれぞれ、５．０μｇ／ｍＬの各ＧＳＴ分子種および１ｍＭ　ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った。なお、本アッセイにおける各化合物の添加濃度は５０μＭとし、アッセイの溶媒としては１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）を用いた。また、吸収スペクトルの測定には、紫外・可視分光光度計（Ｖ－５５０、日本分光株式会社製）を用いた。
　結果を図１Ａ～図１Ｇに示す。なお、これらの図において、（Ａ）は各化合物の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は各化合物の吸収波長（各図に記載）における吸光度の時間変化を示すグラフである。また、各図の（Ｂ）において、「Ｂｅｆｏｒｅ」はＧＳＨおよびＧＳＴ添加前の吸収スペクトルであり、各図の（Ｂ）および（Ｃ）における「ＧＳＨ」並びに「ＧＳＴＡ１」「ＧＳＴＭ１」および「ＧＳＴＰ１」は、ＧＳＨのみを添加した系並びにＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１およびＧＳＴＰ１のいずれかを添加した系の結果をそれぞれ示す。
　図１Ａに示すように、化合物（Ａ）はＧＳＴの存在下において速やかに吸収スペクトルが変化したが、ＧＳＨのみが存在している酵素非存在下においても吸収スペクトルが変化した。また、ＧＳＴＰ１に対する選択性は示さなかった。
　図１Ｂに示すように、化合物（Ａ）の位置異性体である化合物（Ｂ）は、ＧＳＨのみが存在している酵素非存在下における吸収スペクトル変化が遅いなど、化合物（Ａ）に比べて反応性の低下が見られたが、ＧＳＴ分子種の選択性の傾向に変化は見られなかった。
　図１Ｃに示すように、化合物（Ｃ）はＧＳＴの有無により吸収スペクトルの変化を示さなかった（図１Ｃの（Ｂ））。ここで、ＧＳＴが触媒する芳香族求核置換反応では反応中間体であるマイゼンハイマー錯体の形成が律速段階であると考えられている。また、トリフルオロメチル（ＣＦ３）基のハメット定数は０．５４であり、化合物（Ｄ）で用いられるシアノ基（０．６６）や化合物（Ｆ）で用いられるメシル基（０．７２）よりも小さい。このため、トリフルオロメチル基による反応中間体（マイゼンハイマー錯体）の安定化への寄与はシアノ基やメシル基よりも小さいため、グルタチオン化反応が進行しなかったものと考えられる。
　図１Ｄに示すように、化合物（Ｄ）はＧＳＴＰ１存在下で２９０ｎｍの吸光度の急速な上昇を示した。これに対し、ＧＳＴＰ１存在下以外の条件では、吸光度は時間とともに低下した。この違いはそれぞれの条件において異なる生成物が生成していることを示唆している。
　図１Ｅに示すように、化合物（Ｅ）はＧＳＴＰ１存在下で速やかに吸収スペクトルが変化した。一方、ＧＳＨとの反応による吸収の変化はほとんど見られなかった。
　図１Ｆに示すように、化合物（Ｅ）の位置異性体である化合物（Ｆ）は、ＧＳＴＰ１存在下で速やかに吸収スペクトルが変化し、かつ、ＧＳＴＡ１またはＧＳＴＭ１の存在下では吸収スペクトルの変化を示さなかった。また、酵素非依存的なＧＳＨとの反応もまったく見られなかった。このように、化合物（Ｆ）はＧＳＴＰ１選択的な基質としてきわめて有望である。
　図１Ｇに示すように、ベンゼン環の２位にメチルスルフィニル基（－ＳＯＣＨ３基）を有する化合物（Ｇ）は、いずれの条件においても吸収スペクトルの変化を示さなかった。ここで、メチルスルフィニル基のハメット定数は０．４９であり、化合物（Ｄ）で用いられたシアノ基（０．６６）や化合物（Ｆ）で用いられたメシル基（０．７２）よりも小さい。このため、スルフィニル基による反応中間体（マイゼンハイマー錯体）の安定化への寄与はシアノ基やメシル基よりも小さいため、グルタチオン化反応が進行しなかったものと考えられる。なお、化合物（Ａ）～（Ｇ）のそれぞれについて、各ＧＳＴ分子種の存在下での３０分間のインキュベーション終了時点の極大吸収波長における吸光度（Ａｂｓ）の値を、インキュベーション前の同じ波長における吸光度（Ａｂｓ０）の値で除して得られた値（Ａｂｓ／Ａｂｓ０）を比較した結果を図１Ｈのグラフに示す。図１Ｈに示すように、化合物（Ｄ）～（Ｆ）ではＧＳＴＰ１存在下におけるＡｂｓ／Ａｂｓ０の値だけが大きい値を示した。
　以上のことから、本実験において評価した化合物（Ａ）～（Ｇ）のなかでは化合物（Ｄ）～（Ｆ）がＧＳＴＰ１選択的な基質の候補となりうるものと結論付けた。これを一般化すれば、上記一般式（４）に示す構造において、以下の条件を満たすものであればＧＳＴＰ１選択的な基質となりうるものと考えられる。
・ＥＷＧ基が０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有し、かつ共鳴効果を示す電子求引性基である；
・ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置する；および
・ＥＷＧ基は、ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置する。
　以下では、最も理想に近いＧＳＴＰ１選択性の可能性を示した化合物（Ｆ）（２－ニトロ－５－メシル安息香酸アニリド）を用いて、さらなる実験を行った。
　まず、化合物（Ｆ）がＧＳＴＰ１存在下において実際にグルタチオン化されることを、ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳによって解析した。具体的に、ＨＰＬＣによる検討では、化合物（Ｆ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中、５．０μｇ／ｍＬ　ＧＳＴＰ１および１ｍＭ　ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションした反応液を、反応前のものと比較した。また、ＬＣ－ＭＳによる検討では、反応後の反応液を解析した。ここで、ＨＰＬＣ解析の結果を図２（Ａ）に示し、ＬＣ－ＭＳ解析の結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ａ）に示すように、反応前（上段）には見られた化合物（Ｆ）のピークが反応後（下段）には消失し、保持時間がより短い新たな化合物が生成することが確認された。また、新たに生成した化合物の吸収スペクトルは図１Ｆに示したものと同じであったことから、本ピークが反応生成物であると考えられる。さらに、図２（Ｂ）に示すように、ＬＣ－ＭＳ解析によれば、反応生成物のピークはニトロ基がグルタチオン（ＧＳＨ）に置換している化合物の分子量に相当することが確認された。
　続いて、ＧＳＨとの反応に伴って化合物（Ｆ）からニトロ（ＮＯ２）基が脱離していることを、Ｇｒｉｅｓｓ法を用いて確認した。ここで、Ｇｒｉｅｓｓ法とは、亜硝酸イオンの検出・定量方法として知られており、酸性条件下でＮＯ２ －、スルファニルアミド、１－ナフチルエチレンジアミンのジアゾカップリングを利用し、生成したアゾ化合物の吸光度を測定することで間接的にＮＯ２ －を検出・定量する方法である。本実験では、化合物（Ｆ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中、５．０μｇ／ｍＬ　ＧＳＴＰ１および１ｍＭ　ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションした反応液に対して、亜硝酸イオンの定量を行った（反応機構を図３（Ａ）に示す）。この際、絶対濃度については、別途調製した濃度既知のＮＯ２ －を定量することで絶対濃度による検量線を作成し、反応によって生成した亜硝酸イオンを検量線法により定量した。その結果、図３（Ｂ）に示すように、用いた基質濃度とほぼ等濃度の亜硝酸イオンが反応液中に存在することが確認された。
　以上の結果から、ニトロベンゼン誘導体である化合物（Ｆ）はＧＳＴＰ１選択的な基質であることが示された。また、このことから、一般式（４）で表される化合物もまた、ＧＳＴＰ１選択的な基質として用いられうることが推認される。
　［蛍光プローブの合成（１）］
　ここでは、上述したスクリーニングによって得られたＧＳＴＰ１選択的な基質である５－メシル－２－ニトロ安息香酸アニリドを反応部位として有する蛍光プローブを合成した。なお、本実験では、キサンテン環を蛍光団として有するＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ；Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　２００５，　１２７，　４８８８－４８９４．）を母核として有する蛍光プローブを合成した（下記の反応スキーム４）。
　具体的には、まず出発原料である２－メチル－４－ニトロ安息香酸（１）をボラン錯体によりアルコールに還元し、生成物をヘキサン／酢酸エチル（１０：１）混合溶媒より再結晶を行うことで２－メチル－４－ニトロベンジルアルコール（２）を収率８１％で得た。次に、２－メチル－４－ニトロベンジルアルコールをシリカゲルと混合し、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）でアルデヒドに酸化した。不純物を取り除くために減圧下、シリカゲルにてろ過することにより、２－メチル－４－ニトロベンズアルデヒド（３）を単離した（収率９１％）。３ステップ目として、２－メチル－４－ニトロベンズアルデヒド（３）とレゾルシノールをメタンスルホン酸中で加熱し、Ｆｒｉｅｄｅｌ－Ｃｒａｆｔｓ型の縮合反応、脱水縮合および酸化反応を経て、２－メチル－４－ニトロＴＧ（４）を合成した。硫化ナトリウムおよび硫化水素ナトリウムの水和物で２－メチル－４－ニトロＴＧ（４）のニトロ基をアミノ基に還元し、４－アミノ－２－メチルＴＧ（６）を得た（２工程で収率４％）。最後に、得られた４－アミノ－２－メチルＴＧのアミノ基に５－メシル－２－ニトロ安息香酸を導入すべく、縮合剤（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ））とともにアセトニトリル中で反応させ、ヒドロキシ基にも導入された５－メシル－２－ニトロ安息香酸を水酸化ナトリウムで加水分解することにより最終生成物（８）（Ｐｓ－ＴＧ）を得た（収率５０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　なお、反応スキーム４に記載の化合物（１）～（４）および（６）は、非特許文献１において既知の化合物であることから、非特許文献１において報告された合成法に従って合成した。また、その他の化合物（７）～（９）および化合物（７）の合成中間体としての化合物（５）は、以下の手法により合成した。
　（化合物（８）の合成；Ｎ－（４－（６－ヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）－３－メチルフェニル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド（Ｐｓ－ＴＧ））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　２－メチル－４－アミノＴＧ（６）（１０．２ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（１５．６ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１２．５ｍｇ，０．０６５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに懸濁し、室温にて１時間撹拌した。反応液に対して酢酸エチルを加え、１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。これを無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ液を留去した。混合物をアセトニトリルに懸濁し、４℃において撹拌しながら室温で１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１０分間反応させた。反応液をｐＨ７．４、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液によって中和し、ＨＰＬＣの初期溶媒（下記）によって希釈し、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用い、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるように組成比の勾配をかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下で留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。酢酸エチルを留去して、目的化合物８．５ｍｇを得た（収率５０％）
　（化合物（８）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５６（２Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ，　ｄｄ，Ｊ＝１．６，８．８），６．９５（１Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｍ），６．４７　（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），６．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２），５．７７（４Ｈ，ｂｒ），２．５９（３Ｈ，ｓ），１．２０（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６３．３，１５９．１，１５０．１，　１４５．２，１４０．８，１３７．２，１３３．２，１３０．６，１２８．８，１２７．６，１２６．３，１２１．８，１２１．３，１１７．８，１１６．８，１０３．１，６０．３，２１．６，２１．３，１４．６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　５４５．１０１９　［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　５４５．１０１９　ｆｏｒ　Ｃ２８Ｈ２１Ｎ２Ｏ８Ｓ　（＋　０．０　ｍｍｕ）。
　（化合物（７）の合成；９－（４－アミノ－２－メチルフェニル）－２，７－ジクロロ－６－ヒドロキシ－３Ｈ－キサンテン－３－オン（２－メチル－４－アミノ－２’，７’－ジクロロ－ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　２－メチル－４－ニトロベンズアルデヒド（５５９ｍｇ，３．４ｍｍｏｌ）およびクロロレゾルシノール（９８３ｍｇ，６．８ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸３ｍＬに懸濁し、１時間加熱還流した。室温に戻した後、水３０ｍＬを加えて生じた沈殿を濾取した後、水、酢酸エチルで洗浄した。固体を酢酸エチルに懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ、酢酸エチル／２０％エタノール）にて精製して、化合物（５）（２－メチル－４－ニトロジクロロＴＧ）の赤褐色の粗生成物を得た。これを水１５ｍＬに懸濁し、硫化ナトリウム九水和物（２１６ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）および硫化ナトリウムｎ水和物（３４７ｍｇ）を加えて２時間加熱還流した。反応液を４℃に冷却し、濃塩酸を滴下し反応液を酸性にすることで生じた暗赤色の沈殿を濾取し、水で洗浄した。これを酢酸エチルに懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製（移動相：酢酸エチル）して、目的化合物（４－アミノ－２－メチルジクロロＴＧ）１０４ｍｇを得た（収率８％）。
　（化合物（７）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．１０（２Ｈ，ｓ），６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．７５（２Ｈ，ｓ），６．６１（２Ｈ，ｍ），１．８７（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１５１．４，１５０．２，１３６．４，１３０．２，１２８．４，１１７．７，１１５．５，１１５．３，１１１．５，１０３．９，７９．２，１９．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　３８６．０３５１　［Ｍ＋Ｈ］＋，　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　３８６．０３５１　ｆｏｒ　Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ３Ｃｌ２　（－０．１　ｍｍｕ）。
　（化合物（９）の合成；Ｎ－（４－（２，７－ジクロロ－６－ヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）－３－メチルフェニル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド（Ｐｓ－ＤＣＴＧ））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　２－メチル－４－ニトロ－ジクロロＴＧ（５）（８．７ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（１２．２ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１４．６ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍＬ中にて２０分間、室温にて撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、有機層を０．１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、減圧下で留去した。これをアセトニトリル２ｍＬに懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を氷上で加え、室温にて１０分間反応させた。反応液を中和し、セミ分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相ＡおよびＢとしてそれぞれ１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）、アセトニトリルを用い、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるように組成比の勾配をかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下で留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、目的化合物（Ｐｓ－ＤＣＴＧ）１１．１ｍｇを得た（収率７９％）。
　（化合物（９）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），８．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．８２（１Ｈ，ｓ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．０１（２Ｈ，ｓ），６．７７（２Ｈ，ｓ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．０５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６２．７，１４９．５，１４９．３，１４４．８，１３９．９，１３６．８，１３２．８，１３１．７，１３０．０，１２９．１，１２８．３，１２７．９，１２６．９，１２５．７，１２５．１，１２１．３，１１７．４，１０４．１，５９．７，４２．９，２０．８，１９．８，１４．１
ＨＲＭＳ　（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　６１３．０２４５　［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ　６１３．０２３９　ｆｏｒ　Ｃ２８Ｈ１９Ｎ２Ｏ８ＳＣｌ２　（＋０．６　ｍｍｕ）。
　［蛍光プローブの分光学的特性およびクラス選択性の評価（１）］
　上記で合成した蛍光プローブＰｓ－ＴＧ（化合物（８））およびＰｓ－ＤＣＴＧ（化合物（９））の分光学的特性を評価した。また、これらの蛍光プローブについて、反応前後でのＨＰＬＣ解析およびＬＣ－ＭＳ解析により、ＧＳＴ存在下におけるＧＳＨとの反応生成物の同定を行った。そして、ＧＳＨおよび各種ＧＳＴ存在下での蛍光強度上昇を指標として、ＧＳＴクラス選択的な反応性を評価した。
　（Ｐｓ－ＴＧの評価）
　まず、２．５μＭのＰｓ－ＴＧ（化合物（８））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。なお、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定には、それぞれ紫外・可視分光光度計（Ｖ－５５０、日本分光株式会社製）および蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２．５μＭのＰｓ－ＴＧを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および５μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら１日間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。
　Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））についての吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定結果を図４の（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示す。図４の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－ＴＧは反応の前後で約６０倍の蛍光強度上昇を示した（反応前後の蛍光量子収率はそれぞれ０．０１６および０．９１３であった）。また、図４（Ａ）に示すように反応の前後において吸収スペクトルは変化せず、蛍光スペクトルのみが大きく変化した。これは、電子が基底状態から励起状態へと励起される過程には反応の前後で違いはないが、励起された電子の遷移過程に違いがあるためである。
　続いて、Ｐｓ－ＴＧがグルタチオン化反応を受けることで強蛍光性を示すようになっていることを確認するために、ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳによる解析を行った。具体的には、上記で吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定したサンプルを反応液としてＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣによる分析には、ポンプとしてＬＣ－１０ＡＴ、吸収および蛍光検出器として、ＳＰＤ－Ｍ２０ＡおよびＲＦ－１０ＡｘＬ（株式会社島津製作所製）、分離用カラムとしてＩｎｔｅｒｓｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８カラム（ＧＬサイエンス社）から構成されたＨＰＬＣシステムを利用した。移動相としては、Ａ液およびＢ液に１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリルをそれぞれ用い、２０分間でＡ：Ｂ＝９０：１０から５：９５の混合比を変化させ、流速は０．２ｍＬ／分の条件で分析を行った。
　ＨＰＬＣによる解析結果を図４の（Ｃ）に示す。図４（Ｃ）に示す吸収クロマトグラムから、Ｐｓ－ＴＧの保持時間は反応に伴って短くなっていた。また、対応する蛍光測定モードでは、Ｐｓ－ＴＧに相当するピークはほぼ無蛍光であるのに対し、反応後は強蛍光性であった。
　また、ＨＰＬＣ解析で確認できた強蛍光性ピークが実際にグルタチオン化された分子であることを確かめるため、反応生成物についてＬＣ－ＭＳ解析を行った。具体的には、ＨＰＬＣ測定と同じ反応液をＬＣ－ＭＳ解析に用いた。ＬＣ－ＭＳ解析には、ポンプとしてＬＣ－１０ＡＴ、吸収検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ、ＭＳとして四重極型質量分析計ＬＣＭＳ－２０２０（株式会社島津製作所製）、分離用カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３カラム（ＧＬサイエンス社）から構成されたシステムを利用した。移動相としては、Ａ液には１０ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ液にはアセトニトリルを用い、２０分間でＡ：Ｂ＝９０：１０から５：９５の混合比を変化させ、流速は０．２ｍＬ／分の条件で分析を行った。
　ＬＣ－ＭＳによる解析結果を図４（Ｄ）に示す。なお、図４（Ｄ）の上段は吸収クロマトグラムであり、下段は抽出イオンクロマトグラムである。図４（Ｄ）に示すように、ＬＣ－ＭＳ解析ではグルタチオン化生成物由来のＭＳピークが検出された（ｍ／ｚ＝８０２．７±０．５）。以上のことから、Ｐｓ－ＴＧのニトロ基がＧＳＨに置換されることで、強蛍光性を持つ反応生成物が生じることが示された。そして、Ｐｓ－ＴＧは、グルタチオン化に伴ってニトロ基が脱離することでＤ－ＰｅＴ機構による消光が解除されるという分子設計通りに機能することが確認された。
　次いで、Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））のＧＳＴＰ１選択性を評価した。具体的に、上記で合成したＰｓ－ＴＧについて、３種類のＧＳＴ（ＧＳＴＡ１－１、ＧＳＴＭ１－１、ＧＳＴＰ１－１）について異なる濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定することで、特異活性を算出した。
　具体的には、１μＭのＰｓ－ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、異なる濃度の各種ＧＳＴ（ＧＳＴＡ１－１；０．１～１０．１μｇ／ｍＬ、ＧＳＴＭ１－１；０．４～１０．１μｇ／ｍＬ、ＧＳＴＰ１－１；０．３～９．８μｇ／ｍＬ）の存在下、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）にて撹拌しながら反応させ、蛍光強度を３０秒ごとに３０分間記録した。なお、本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ネガティブコントロールとしてＧＳＨのみを添加した系についても同様の実験を行った。また、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ－９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。
　結果を図５に示す。図５（Ａ）は、各種ＧＳＴの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたときのＰｓ－ＴＧの蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。また、図５（Ｂ）は、Ｐｓ－ＴＧの各種ＧＳＴとの反応初速度を、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）として示すグラフである。図５の（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＧＳＴの非存在下およびＧＳＴＡ１の存在下では、１ｍＭ　ＧＳＨによって蛍光強度の上昇は見られなかった。一方、ＧＳＴＭ１またはＧＳＴＰ１の存在下では蛍光強度の上昇が見られ、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）はそれぞれ０．９および７．１であった。その差は約８倍程度であり、高いＧＳＴＰ１選択性を確認することができた。
　（Ｐｓ－ＤＣＴＧ）
　続いて、Ｐｓ－ＤＣＴＧ（化合物（９））についても、上記と同様に評価を行ったところ、Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））と同様の結果が得られた（図６の（Ａ）～（Ｄ）並びに図７の（Ａ）および（Ｂ））。ここで、図６（Ｂ）に示す蛍光スペクトルから算出される反応の前後での蛍光量子収率はそれぞれ０．０２２および０．８５１であり、Ｐｓ－ＤＣＴＧは反応前後で約４０倍の蛍光強度の上昇を示した。図６（Ｄ）に示すＬＣ－ＭＳ解析結果におけるｍ／ｚは８７０．７±０．５であった。さらに、図７（Ａ）に示すように、１ｍＭ　ＧＳＨのみの存在下またはＧＳＨとＧＳＴＡ１との共存下においてＰｓ－ＤＣＴＧの蛍光強度に変化は見られなかった。一方、ＧＳＨとＧＳＴＭ１との共存下、およびＧＳＨとＧＳＴＰ１との共存下による反応初速度はそれぞれ３．７および１２．１であった。その差は約３倍程度であり、Ｐｓ－ＴＧと比較すると弱いもののＰｓ－ＤＣＴＧもまたＧＳＴＰ１選択性を示すことが明らかとなった。なお、図７に示す測定における励起／蛍光波長は５０５／５２５ｎｍとした。
　ここで、Ｐｓ－ＴＧおよびＰｓ－ＤＣＴＧのそれぞれに対する各種ＧＳＴの比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　［蛍光プローブのＧＳＨおよび各種還元活性種に対する反応性の評価（１）］
　（Ｐｓ－ＴＧのＧＳＨに対する反応性）
　従来のプローブ（ＤＮＡＦ－１，２、ＤＮＡＴ－Ｍｅおよび３，４－ＤＮＡＤＣＦ）は、その反応性の高さゆえ、ＧＳＴＰ１の非存在下においてもＧＳＨと非酵素的に反応し、蛍光強度の上昇を起こす。そこで、本実験では、このような特性がＰｓ－ＴＧにおいて改善しているかどうかを確かめるために、Ｐｓ－ＴＧとＧＳＨとの反応性を評価した。
　具体的には、２μＭのＰｓ－ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、異なる濃度のＧＳＨ（０．６２５～２０ｍＭ）の存在下、室温（２５℃）にて３０分間反応させた。そして、反応後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ポジティブコントロール（ＧＳＨ／ＧＳＴＰ１）として、２．０μｇ／ｍＬ　ＧＳＴＰ１－１と反応させた。また、ネガティブコントロール（Ｎｏｎｅ）としては、ＧＳＴＰ１もＧＳＨも添加せずに同様の実験を行った。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ－９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。
　結果を図８に示す。図８に示すように、Ｐｓ－ＴＧは、細胞内の生理的濃度（０．５～１０ｍＭ）を超える濃度のＧＳＨともほとんど反応しないことがわかる。これは、Ｐｓ－ＴＧの蛍光強度の上昇には、ＧＳＨ存在下でのＧＳＴＰ１の活性が必要であることを意味する。
　（Ｐｓ－ＴＧの各種還元活性種に対する反応性）
　細胞内には、ニトロ基との反応性があることが予想される酸化還元活性種が多数存在している。そこで、本実験では、これらの酸化還元活性種およびその関連物質について、Ｐｓ－ＴＧとの反応性を評価した。
　具体的には、２μＭのＰｓ－ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、１ｍＭの様々な酸化還元活性種の存在下、室温（２５℃）にて３０分間反応させた。その後、反応後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。ここで、酸化還元活性種としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、２－メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリスルフィドナトリウム（Ｎａ２Ｓ３）、還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋）、還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ＋）、アスコルビン酸（ＡＡ）を用いた。本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ポジティブコントロール（ＧＳＨ／ＧＳＴＰ１）として、２．０μｇ／ｍｌＧＳＴＰ１－１と反応させた。また、ネガティブコントロール（Ｎｏｎｅ）としては、ＧＳＴＰ１もＧＳＨも添加せずに同様の実験を行った。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ－９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。
　結果を図９に示す。図９に示すように、Ｐｓ－ＴＧは、上記で示した酸化還元活性種とはほとんど反応しないことがわかる。このことから、Ｐｓ－ＴＧは酸化還元活性種との反応による非特異的な蛍光強度の上昇を起こす恐れが少ない蛍光プローブであるといえる。
　［細胞イメージング（１）］
　上記で作製した２種類の蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＧ、Ｐｓ－ＤＣＴＧ）を培養細胞へ適用し、細胞内においてＧＳＴＰ１活性を検出することが可能か否かを調べた。なお、蛍光プローブの評価には内在的なＧＳＴＰ１の発現がほとんど見られないヒト乳がん由来細胞であるＭＣＦ－７細胞を用いた。また、ＭＣＦ－７細胞および後述するＨＴ－１０８０細胞については、いずれも１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃にて５％ＣＯ２条件下で培養し、３～４日に１回継代しつつ培養した。
　本実験ではまず、ＭＣＦ－７細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松波硝子工業株式会社）または８－ウェルチャンバー（ＩＷＡＫＩ）に３．０×１０５細胞／ディッシュまたは３．３×１０４細胞／ウェルとなるようにそれぞれ播種した。そして細胞が接着した後に、Ｎ末端が３ｘＦＬＡＧタグ化されたＧＳＴＰ１をコードするｃＤＮＡ（３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１）が挿入された発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１をトランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ株式会社）により細胞内へ導入し、２４時間後以降に実験に使用した。なお、ｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１ベクターでは、ＣＭＶプロモーターの下流において転写される１本のｍＲＮＡが３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１およびＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２の両者のｍＲＮＡ配列をもつ。そして、両配列の間にはＩｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）　が存在し、３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１およびＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２のそれぞれのタンパク質が発現する。すなわち、当該ベクターを用いることにより、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２が発する蛍光によって３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１の発現を確認することができるのである。
　次いで、上記発現ベクターが導入されたＭＣＦ－７細胞にプローブを負荷することによりイメージング実験を行った。具体的には、上記ベクターが導入されたＭＣＦ－７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ－ＴＧまたはＰｓ－ＤＣＴＧを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションして、その後に共焦点レーザー走査型顕微鏡下で観察を行った。なお、本実験において、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ　ＦＶ１０ｉ－ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２の蛍光は波長５８４ｎｍのＬＤレーザーにより励起させて、対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。
　結果を図１０に示す。ここで、図１０の（Ａ）および（Ｃ）はそれぞれ、Ｐｓ－ＴＧおよびＰｓ－ＤＣＴＧの化学構造式である。また、図１０の（Ｂ）および（Ｄ）はそれぞれ、各蛍光プローブを投与したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、左から蛍光プローブの蛍光；ＤｓＲｅｄの蛍光；並びに、蛍光プローブの蛍光、ＤｓＲｅｄの蛍光および白色像の重ね合わせ（Ｍｅｒｇｅ）を示すものである（スケールバーはいずれも２０μｍである）。図１０に示すように、いずれの蛍光プローブを用いた場合であっても、ＤｓＲｅｄの赤色蛍光を示す細胞では蛍光プローブ由来の緑色蛍光が観察された。これに対し、赤色蛍光を示さない細胞における緑色蛍光の強度は弱いものであった。このことから、ＧＳＴＰ１が発現した細胞において選択的に蛍光プローブの蛍光強度の上昇が起こっていることが示された。
　ここで、図１０に示す結果では、細胞内における蛍光強度が比較的小さく、細胞膜に強い蛍光が観察された。すなわち、いずれの蛍光プローブについても、細胞膜透過性がそれほど高くないことが示唆された。これは、生体内環境（ｐＨ７．４）においてこれらの蛍光プローブはアニオン性を示して十分な脂溶性を有しない結果、細胞膜を透過しにくいものと考えられた。
　［蛍光プローブの合成（２）］
　続いて、上記で作製した蛍光プローブの細胞膜透過性を向上させることを目的として、さらなる誘導体化を試みた。ここでは具体的に、上記で作製した蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＧ、Ｐｓ－ＤＣＴＧ）をより脂溶性の高い化学構造へと改変すべく、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基をアセチル化した化合物を合成した（下記の反応スキーム２）。なお、Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））およびＰｓ－ＤＣＴＧ（化合物（９））のそれぞれに対応するアセチル化化合物を、以下では「Ｐｓ－ＴＡｃ」（化合物（１０））および「Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ」（化合物（１１））とも称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（化合物（１０）の合成；９－（２－メチル－４－（５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）フェニル）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－６－イルアセテート（Ｐｓ－ＴＡｃ））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 
　Ｐｓ－ＴＧ（８）（２．１ｍｇ，０．００３９ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（０．６μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）を懸濁させたテトラヒドロフラン２ｍＬに対して、４℃条件下でＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ）（１．４μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）を滴下し、氷上において２時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加えた後、有機層を１Ｎ塩酸で３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させた。減圧下、有機層を留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）によって精製して、目的化合物０．５ｍｇを得た（収率２２％）。
　（化合物（１０）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８，），８．３１（１Ｈ，ｄｄ），７．８０（１Ｈ，ｓ，Ｊ＝８．２），７．７１（２Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８），７．３３（１Ｈ，　ｄ，Ｊ＝８．２），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．８），６．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．３２（３Ｈ，ｓ），２．０６（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１８４．４，１６８．７，１６２．７，１５８．１，１５４．２，１５２．４，１４９．５，１４７．５，１４４．８，１３９．６，１３６．８，１３２．９，１３０．８，１３０．５，１３０．８，１３０．１，１３．０，１２９．１，１２８．２，１２７．６，１２５．８，１２１．２，１１９．９，１１９．２，１１８．１，１１７．５，１１０．５，１０５．２，２９．０，２０．９，１９．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　５８７．１１２８　［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　５８７．１１２４　ｆｏｒ　Ｃ３０Ｈ２３Ｎ２Ｏ９Ｓ（＋０．４　ｍｍｕ）。
　（化合物（１１）の合成；２，７－ジクロロ－９－（２－メチル－４－（５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）フェニル）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－６－イルアセテート（Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　Ｐｓ－ＤＣＴＧ（５．１ｍｇ，０．００８３ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（１．２μｌ，０．０１７ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン２ｍＬに対して、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（３．０μＬ，０．０１７ｍｍｏｌ）を氷上で加え、４℃にて２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えた後、有機層を１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）により精製して、目的化合物（Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ）１．２ｍｇを得た（２２％）。
　（化合物（１１）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６），８．４０（１Ｈ，ｓ），８．３３（１Ｈ，ｍ），７．８４（２Ｈ，ｓ），７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），６．５３（１Ｈ，ｓ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．０９（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７２．５，１６８．４，１６３．３，１５８．１，１５１．６，１５０．０，１４８．２，１４５．３，１３０．７，１３０．５，１２８．８，１２８．３，１２８．２，１２６．３，１２３．３，１２１．８，１２０．９，１１８．０，１１３．９，１０５．６，６０．３，４３．４，２１．６，２１．３，２０．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　６５５．０３４９　［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ　６５５．０３４５　ｆｏｒ　Ｃ３０Ｈ２１Ｎ２Ｏ９ＳＣｌ２　（＋０．４　ｍｍｕ）。
　［蛍光プローブの分光学的特性およびクラス選択性の評価（２）］
　上記で合成したアセチル化蛍光プローブＰｓ－ＴＡｃ（化合物（１０））およびＰｓ－ＤＣＴＡｃ（化合物（１１））の分光学的特性を評価した。
　具体的には、まず、Ｐｓ－ＴＡｃ（化合物（１０））について、上記と同様の手法により吸収スペクトルを測定した。その結果、図１１（Ａ）に記載の「反応前」の吸収スペクトルで示すように、Ｐｓ－ＴＡｃは波長４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにピークをもつ吸収スペクトルを示した。これは、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基がアセチル基によって保護されているためであると考えられる。
　続いて、Ｐｓ－ＴＡｃを１０μＭの濃度で含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）溶液に、１０μｇ／ｍＬのブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）または１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加し、室温（２５℃）にて撹拌しながら６０分間反応させた。ここで、ＰＬＥを添加した系について反応後に測定した吸収スペクトルが図１１（Ａ）の「反応後」のスペクトルである。また、ＧＳＨ添加系およびＰＬＥ添加系の双方について、反応の間、波長４９０ｎｍでの吸光度を経時的に記録した。これにより得られた結果を図１１（Ｂ）に示す。図１１（Ｂ）に示すように、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）の添加によってＰｓ－ＴＡｃの吸収スペクトルは速やかに変化し、６０分経過後には上述した図４（Ａ）と同様の吸収スペクトルを示した。このことから、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基とアセチル基とからなるエステル結合がＰＬＥの作用によって加水分解され、フェノール性ヒドロキシ基が露出した（すなわち、Ｐｓ－ＴＡｃはＰｓ－ＴＣへと変換された）ものと考えられる。また、図１１（Ｂ）に示すように、この変化は細胞内に比較的高濃度で（通常は１～１０ｍＭ程度の量で）存在する還元型ＧＳＨの作用（エステル結合の開裂作用）によっても進行することが確認された。このため、本発明に係る一般式（２）で表される蛍光プローブのうち、フェノール性ヒドロキシ基がアシル化されたもの（置換基Ｒ２がアシル基であるもの；Ｐｓ－ＴＡｃやＰｓ－ＤＣＴＡｃなど）は、細胞内エステラーゼ活性が低い細胞においても、還元型ＧＳＨの作用によって酵素活性非依存的に、対応するフェノール性ヒドロキシ基含有蛍光プローブ（置換基Ｒ２が水素原子であるもの）へと変換されることが期待される。なお、Ｐｓ－ＤＣＴＡｃについても同様の実験を行った結果、図１１の（Ａ）および（Ｂ）に示すのと同様の結果が得られた。
　以上の結果から、Ｐｓ－ＴＡｃおよびＰｓ－ＤＣＴＡｃは、生細胞に添加されると、図１２に示すような機構によってまず細胞膜を透過して細胞内へ取り込まれ、その後に細胞内に存在するエステラーゼの加水分解作用を受けて脱アセチル化されて、対応するアルコール（Ｐｓ－ＴＧやＰｓ－ＤＣＴＧ）へと変換される。そして、Ｐｓ－ＴＧやＰｓ－ＤＣＴＧはＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブであることから、取り込まれた細胞内にＧＳＴＰ１が存在すれば、その作用によりグルタチオン化を受けて強い蛍光を発するものと推定される。
　［細胞イメージング（２）］
　上記で作製した２種類のアセチル化蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ、Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ）について、上述した「細胞イメージング（１）」と同様の発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いた手法により３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれを発現させたＭＣＦ－７細胞へ適用した際の細胞イメージングを行った。
　具体的には、上述した発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いて３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれをＮ末端が３ｘＦＬＡＧタグ化されたｃＤＮＡとして発現させたＭＣＦ－７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ－ＴＡｃまたはＰｓ－ＤＣＴＡｃを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした後に、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。その結果得られた画像から、ＧＳＴの発現を示すＤｓＲｅｄ発現細胞（赤色蛍光あり）を＋、非発現細胞を－として、それぞれの細胞における蛍光プローブ由来の緑色蛍光の蛍光強度を算出した。
　結果を図１３に示す。ここで、図１３の（Ａ）はＰｓ－ＴＡｃの化学構造式であり、（Ｂ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｃ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（－）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。同様に、図１３の（Ｄ）はＰｓ－ＤＣＴＡｃの化学構造式であり、（Ｅ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｆ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（－）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。
　図１３に示すように、ＧＳＴＰ１発現細胞において強い緑色蛍光が検出されたことから、Ｐｓ－ＴＡｃおよびＰｓ－ＤＣＴＡｃは細胞内におけるＧＳＴＰ１活性を選択的に検出していることが示された。なお、Ｐｓ－ＴＡｃとＰｓ－ＤＣＴＡｃとのシグナル／バックグラウンド比を比較すると、Ｐｓ－ＴＡｃの方が高い結果となった。したがって、以下の検討では、Ｐｓ－ＴＡｃを用いて実験を行った。
　続いて、細胞質型ＧＳＴおよびミトコンドリア型ＧＳＴの各種分子種をＭＣＦ－７細胞に発現させ、蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）のＧＳＴＰ１選択性を評価した。具体的には、上記と同様の手法により、異なる８クラス１８種類のＧＳＴのそれぞれを組み込んだｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴをＭＣＦ－７細胞へトランスフェクションした。
　次いで、各ＧＳＴ分子種の発現をウエスタンブロッティングにより確認した。具体的には、等量のタンパク質（ＧＳＴ発現ＭＣＦ－７細胞由来）をＳＤＳ－ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動（１２．５％ポリアクリルアミド）によって分離した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した。そして、０．１％ポンソーＳ染色液（株式会社ビークル製）にてＰＶＤＦメンブレン上へのタンパク転写を確認した後、３％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝液）中、室温にて１時間振盪した。ＴＢＳ－Ｔで３回（各５分間）洗浄した後、一次抗体として抗ＦＬＡＧ－Ｍ２マウスＩｇＧ抗体（希釈倍率１：５０００、シグマアルドリッチジャパン合同会社）または抗β－アクチンウサギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：４０００、生物医学研究所）を含むＴＢＳ－Ｔ（５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む）中、４℃にて一晩振盪した。ＴＢＳ－Ｔで３回（各５分間）洗浄して余分な抗体を取り除いた後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ抗体（両者ともに希釈倍率１：２５００、プロメガ株式会社）を含むＴＢＳ－Ｔ（５％ＢＳＡ含む）中にて室温で１時間振盪した。目的タンパク質の検出は、ルミノールおよび過酸化水素を含む発光試薬を用いた化学発光法により、冷却ＣＣＤカメラシステムＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社製）を用いて行った。
　上記のようにして行ったウエスタンブロッティングの結果を図１４に示す。図１４に示すように、いずれのＧＳＴ分子種を発現させたＭＣＦ－７細胞においても、目的のＧＳＴタンパク質が発現していることが確認された。
　続いて、ＤｓＲｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２の赤色蛍光を示す細胞において確かにＧＳＴタンパク質が発現していることを確かめるため、蛍光免疫染色を行った。具体的には、各ＧＳＴ分子種を発現させたＭＣＦ－７細胞を４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中、室温にて１５分間固定した。その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳ溶液で３０分間処理することにより、細胞膜透過処理を施した。そして、抗体バッファー（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中、室温にて１時間インキュベーションした後、抗ＦＬＡＧ－Ｍ２マウスＩｇＧ抗体（希釈倍率１：５００、シグマアルドリッチジャパン合同会社）を加え、４℃にて一晩インキュベーションした。細胞をＰＢＳで５分間インキュベートして洗浄して、余分な一次抗体を除去した（合計５回）。次いで、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベルされた抗マウスＩｇＧヤギ抗体（希釈倍率１：１０００、アブカム株式会社）を含む抗体バッファー中、室温にて１時間インキュベーションした後、ＰＢＳで５分間インキュベートして洗浄して、余分な二次抗体を除去した（合計５回）。そして、細胞を褪色防止用封入剤であるＰｒｏＬｏｎｇ　Ｇｏｌｄ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に封入した。そして、共焦点レーザー走査型顕微鏡下で観察を行った。なお、本実験において、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ　ＦＶ１０００（オリンパス株式会社製）を用いた。また、本実験において、ＤＡＰＩ、ＤｓＲｅｄおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の各蛍光色素について、それぞれ４０５ｎｍ、５８３ｎｍ、および６３５ｎｍの波長のレーザー光を用いて励起し、対応したフィルタセットを用いて検出を行った。
　結果を図１５に示す。ここで、図１５において、「ＤＡＰＩ」、「ＤｓＲｅｄ」、「Ａｌｅｘａ６４７」はそれぞれの蛍光色素による発光を撮影した画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である。図１５に示すように、赤色蛍光を示したすべての細胞において３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴが発現していることが確認された。
　続いて、上記で各種ＧＳＴ分子種のいずれかを発現させたＭＣＦ－７細胞に対してＰｓ－ＴＡｃをインキュベーション後、落射蛍光顕微鏡を用いて蛍光イメージングを行った。具体的には、各種ＧＳＴ分子種のそれぞれを３ｘＦＬＡＧタグ化されたｃＤＮＡとして発現させたＭＣＦ－７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ－ＴＡｃを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした後に、落射型蛍光顕微鏡ＩＸ８０（オリンパス株式会社）を用いた観察によって行った。なお、プローブ由来の蛍光およびＤｓＲｅｄ由来の蛍光は、それぞれＵ－ＭＮＩＢＡフィルタセット（励起波長：４７０～４９５ｎｍ、蛍光波長：５１０～５５０ｎｍ）およびＵ－ＭＷＩＧフィルタセット（励起波長：５３０～５５０ｎｍ、蛍光波長：５７５ｎｍ以上）を用いて観察した。
　結果を図１６に示す。ここで、図１６の「ＦＩＴＣ」は蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の緑色蛍光の画像であり、「ＤｓＲｅｄ」はＤｓＲｅｄ由来の赤色蛍光の画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である（スケールバーはいずれも２０μｍである）。また、ＧＳＴＰ１発現細胞の観察画像を拡大したものを図１７（Ａ）に示し、各画像における緑色蛍光の強度を各ＧＳＴ発現細胞間で定量化したグラフを図１７（Ｂ）に示す（測定に用いた細胞数は２０個である）。図１６および図１７に示すように、ＧＳＴＰ１発現細胞のみにおいて蛍光プローブ由来の緑色蛍光が観察され、その他のＧＳＴ分子種を発現している細胞では緑色蛍光は観察されなかった。このことから、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）は高いＧＴＳＰ１選択性を示すことが確認された。
　ところで、ＭＣＦ－７細胞においてはＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されており、これによってＧＳＴＰ１の発現が低いことが知られている。そこで、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤として利用されている５－アザシチジンを用いてＭＣＦ－７細胞を処理することによりＧＳＴＰ１を発現させ、このようにして発現したＧＳＴＰ１の活性をＰＳ－ＴＡｃを用いて捕えることが可能であるかどうかを検証した。
　具体的には、ＭＣＦ－７細胞を播種した翌日に、培地をベヒクルまたは５μＭの５－アザシチジンを含む培地へと交換した。そして、この培地交換から３日後に０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡによって細胞を剥がし、１．０×１０５細胞／ディッシュとなるように３５ｍｍガラスボトムディッシュに細胞を播種して、５－アザシチジン処理からの時間が９６時間を超えるまで静置した。その後、細胞培養用培地を除去し、ＰＢＳ（日水製薬株式会社）で細胞を２回洗浄し、２．５μＭの蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）および１０μｇ／ｍＬの蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ＤＮＡに結合するため生細胞の核を染色可能である）を含むＨａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ，ハンクス平衡塩溶液）（和光純薬工業株式会社）を加え、３７℃にて２０分間インキュベーションした。プローブ溶液を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、再びＨＢＳＳを加えて共焦点レーザー走査型顕微鏡により観察を行った。なお、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ　ＦＶ１０ｉ－ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８の蛍光は波長４０５ｎｍのＬＤレーザーにより励起させて、対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。
　結果を図１８に示す。ここで、図１８（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、図１８（Ｂ）はコントロール群および５－アザシチジン投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。図１８に示すように、コントロール群では蛍光プローブに由来する強蛍光性の細胞が観察されなかったのに対し、５－アザシチジン投与群では非常に高い蛍光強度を示す細胞が観察された。この結果は、５－アザシチジンの投与によってＤＮＡメチルトランスフェラーゼが阻害され、ＭＣＦ－７細胞におけるＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化が解除される結果、ＧＳＴＰ１遺伝子の発現が誘導されたことによるものと推定された。
　そこで、この仮説を検証することを目的として、５μＭの５－アザシチジンを培地中へ加えて処理したＭＣＦ－７細胞に対して、さらにｓｉＲＮＡを投与することでＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を行い、ＧＳＴＰ１の発現を抑制することを試みた。具体的には、上記で強蛍光性の細胞が観察された５－アザシチジン投与群のＭＣＦ－７細胞に対し、３０ｐｍｏｌのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）のそれぞれを４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後以降、細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡによって剥がし、全細胞を６～１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、３５ｍｍガラスボトムディッシュに再播種して、再播種からさらに２４時間後以降に上記と同様の手法により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。
　結果を図１９に示す。ここで、図１９（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（×１０）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の１０倍拡大画像である。また、図１９（Ｂ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。図１９に示すように、ＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ投与群においては、蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の蛍光強度の顕著な減少が観察された。このことから、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）を用いることで、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化に基づくＧＳＴＰ１タンパク質発現の有無を検出することが可能であることが示された。なお、正常上皮細胞においてはＧＳＴＰ１が発現しているが、がん化によってＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部分がメチル化されることでＧＳＴＰ１の発現が見られなくなることが知られている。したがって、本発明に係る蛍光プローブをそのような系へ適用することができれば、蛍光の有無を指標として、前立腺がん細胞（ＧＳＴＰ１が過剰発現していない）の検出を行うことも可能であると考えられる。
　さらに、がん細胞に発現する内在性のＧＳＴＰ１の発現を可視化することが可能かどうか評価することを目的として、ＧＳＴＰ１を発現している繊維芽肉腫由来細胞であるＨＴ１０８０細胞に対して本発明に係る蛍光プローブ（ＰＳ－ＴＡｃ）を適用した。この際、ＧＳＴＰ１特異性を調べることを目的として、上記と同様にｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＨＴ１０８０細胞においてもＧＳＴＰ１がノックダウンされるかどうかの確認も併せて行った。
　具体的には、６ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ウェルとなるようにＨＴ１０８０細胞を播種した翌日、３０ｐｍｏｌのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）のそれぞれを４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後以降、細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡによって剥がし、全細胞を６～１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、３５ｍｍガラスボトムディッシュに再播種して、再播種からさらに２４時間後以降に上記と同様の手法により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。また、やはり上記と同様の手法により、ウエスタンブロッティングによってＧＳＴＰ１のノックダウンを確認した。
　結果を図２０に示す。ここで、図２０（Ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳動写真である。また、図２０（Ｂ）は上記の処理を施したＨＴ１０８０細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ　ｆｉｅｌｄ）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の６倍拡大画像である。さらに、図２０（Ｃ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。そして、図２０（Ｄ）はコントロールｓｉＲＮＡおよびＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡをそれぞれ投与した細胞群におけるＰｓ－ＴＡｃの投与前並びに投与後６分、１０分および１５分経過後のイメージング画像（ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ　ｆｉｅｌｄ）に対応）である。図２０（Ａ）に示す結果から、ＨＴ１０８０細胞において発現している内因性ＧＳＴＰ１の活性もまた、ＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡの投与によってノックダウンを受けることが確認された。また、図２０の（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、ＨＴ１０８０細胞においても、コントロールｓｉＲＮＡ投与群では蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の蛍光が観察され、この蛍光はＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡの投与によって大きく減弱した。さらに、図２０（Ｄ）に示すように、本発明の蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）の投与によって蛍光強度は時間依存的な上昇を示したが、その一方でＧＳＴＰ１　ｓｉＲＮＡの投与により、この蛍光強度の上昇は抑制された。
　以上の結果から、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃなど）は、内在的にＧＳＴＰ１を発現するがん細胞においても、その活性を検出することが可能な蛍光プローブであることが確認された。
　続いて、Ｐｓ－ＴＡｃが様々ながん細胞のＧＳＴＰ１活性を捉えることができるか、また、ＧＳＴＰ１の発現の有無を評価できるか明らかとするために、Ｐｓ－ＴＡｃを各種がん細胞へ投与し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
　具体的には、まず、細胞を１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８を含むハンクス緩衝液中、３７℃にて、２０分間培養した。その後、培地を取り除き、リン酸ナトリウム緩衝液にて、細胞を洗浄した。続いて、２μＭのＰｓ－ＴＡｃを含むハンクス緩衝液を加え、さらに１５分間室温で培養した後、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）において、蛍光イメージングを行った。共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ　ＦＶ１０ｉ－ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８の蛍光は波長４０５ｎｍのＬＤレーザー、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、それぞれ対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。本実験では、ＧＳＴＰ１陽性細胞として、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９（大腸がん細胞）、ＨｕＣＣＴ１（胆管がん細胞）、ＤＵ１４５（前立腺がん細胞）、ＨＴ１０８０（線維肉腫細胞）を用い、また、ＧＳＴＰ１陰性細胞として、ＭＣＦ７（乳がん細胞）およびＬＮＣａＰ（前立腺がん細胞）を用いた。
　結果を図２１に示す。なお、図２１に示す写真のうち、各細胞に対応する上段の写真は蛍光画像であり、下段の写真は白色光（ＢＦ）画像であり、ともに共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮像したものである。図２１に示すように、細胞種によって蛍光強度、蛍光性生成物の細胞内分布などが異なるものの、本実験において用いた全てのＧＳＴＰ１発現細胞で、細胞内において蛍光を確認することができた。一方、ＧＳＴＰ１非発現細胞では、蛍光強度上昇が見られなかった。
　［蛍光プローブの合成（３）］
　上記とは異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（化合物（ｇ）の合成；２－（４－アミノフェニル）－６－ブロモ－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）
　４－ブロモ－１，８－ナフタル酸無水物（５０５．３ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）と１，４－ジアミノベンゼン（２４７．２ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）をエタノール（６．０ｍＬ）に懸濁させ、１０時間加熱還流を行なった。反応液を室温まで冷却し、沈殿を濾取し、目的化合物を収率９１％（６０９．８ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）で得た。
　（化合物（ｇ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８），７．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０），６．９４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．６４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），５．２６（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６３．４，１６３．７，１４８．６，１３２．５，１３１．５，１３１．３，１３０．９，１２９．８，１２９．１，１２８．９，１２８．８，１２８．６，１２３．４，１２２．７，１１３．７
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１８Ｈ１２Ｎ２Ｏ２Ｂｒ［Ｍ＋Ｈ］＋：３６７．００８２，ｆｏｕｎｄ；３６７．００７８（－０．４ｍｍｕ）。
　（化合物（ｈ）の合成；２－（４－アミノフェニル）－６－（アゼチジン－１－イル）－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）
　化合物（ｇ）（２００．０ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）とアゼチジン塩酸塩（１５３．１ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（５６２．４ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（３．０ｍＬ）に懸濁させ、８０℃で８時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）に注ぎ、沈殿を濾取し、目的化合物を収率９２％で得た。
　（化合物（ｈ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４１（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．９，１．１），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），７．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，７．３），６．８６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．６１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），５．２０（２Ｈ，ｓ），４．５０（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），２．５３（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６４．２，１６３．４，１５２．３，１４８．２，１３２．８，１３０．８，１３０．３，１２９．２，１２４．３，１２４．０，１２２．３，１２０．３，１１３．７，１０８．９，１０６．１，５５．２，４０．１，１６．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２１Ｈ１８Ｎ３Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：３４４．１３９９，ｆｏｕｎｄ；３４４．１３９４（－０．５ｍｍｕ）。
　（Ｐｓ－Ｎａｐｈの合成；Ｎ－（４－（６－アゼチジン－１－イル）－１，３－ジオキソ－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－２（３Ｈ）－イル）フェニル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）
　化合物（ｈ）（９．６ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）と５－メシル－２－ニトロ安息香酸（４．９ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（７．４ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）とクロロホルム（２ｍＬ）の混合溶媒に懸濁し、室温にて２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ　ＨＣｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウムで１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶解させて、水（１０ｍＬ）に滴下し、沈殿を濾取した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／酢酸エチル＝４：１）で精製し、目的化合物（Ｐｓ－Ｎａｐｈ）を収率２０％で得た（２．６ｍｇ，０．００４６ｍｍｏｌ）。
　（Ｐｓ－Ｎａｐｈの機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ９．１７（１Ｈ，ｓ），８．５１－８．４４（２Ｈ，ｍ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．２６－８．２２（２Ｈ，ｍ），７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９），７．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），４．５５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５），２．５４（２Ｈ，ｑｕｉｎ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２９Ｈ２３Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：５７１．１２８７，ｆｏｕｎｄ；５７１．１２８８（＋０．１ｍｍｕ）。
　［蛍光プローブの分光学的特性の評価（３）］
　まず、２．５μＭのＰｓ－Ｎａｐｈ（図２２の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２．５μＭのＰｓ－Ｎａｐｈを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。
　Ｐｓ－Ｎａｐｈについての蛍光スペクトルの測定結果を図２２の（Ｂ）に示す。図２２の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－Ｎａｐｈは反応の前後で５５５ｎｍにおいて約２５倍の蛍光強度上昇を示した。
　［蛍光プローブの合成（４）］
　上記とはさらに異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　（化合物（ｉ）の合成；５（６）－アミノフルオレセイン）
　４－ニトロフタル酸無水物（１．０２ｇ，５．３ｍｍｏｌ）とレゾルシノール（１．３２ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（１０ｍＬ）に懸濁し、８０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却し、氷水に注いだ。氷上にて、１０Ｎ　ＮａＯＨを用いて、その懸濁液のｐＨを１４にして沈殿を溶解させた後、濃塩酸を用いて、その溶液のｐＨを３にし、生成した沈殿を回収した。硫化ナトリウム９水和物（２．４２ｇ）を溶解した精製水（４０ｍＬ）に沈殿を溶解させて、６０℃にて２時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液に注いだ。酢酸エチルで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１：２から１：１）で精製し、目的化合物（５，６－異性体混合物）を収率７８％（１．４３ｇ，４．１２ｍｍｏｌ）で得た。
　（化合物（ｉ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１），６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），６．６５－６．６２（６Ｈ，ｍ），６．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．５７－６．５０（４Ｈ，ｍ），６．２４（２Ｈ，ｓ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），５．７３（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６９．４，１６９．０，１５９．２，１５９．１，１５６．３，１５５．５，１５１．９，１５１．５，１５０．５，１３９．７，１２９．０，１２９．０，１２７．５，１２５．９，１２４．１，１２１．７，１１５．４，１１２．５，１１２．４，１１２．１，１１０．７，１１０．６，１０６．１，１０５．５，１０２．１，１０２．０，８２．７，８０．６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ５［Ｍ＋Ｈ］＋：３４８．０８７２，ｆｏｕｎｄ；３４８．０８６８（－０．４ｍｍｕ）。
　（化合物（ｊ）の合成；５（６）－アミノフルオレセインジアセテート）
　化合物（ｉ）（５，６－異性体混合物）（２２２．２ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、無水酢酸（１２１μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２２３μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、４℃にて２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、目的化合物（５，６－異性体混合物）を収率７３％（２０２．８ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）で得た。
　（化合物（ｊ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．４），７．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），２．３１（６Ｈ，ｓ），２．３０（６Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．４，１６９．０，１６８．９，１６８．９，１５６．３，１５３．０，１５１．９，１５１．８，１５１．６，１５１．３，１２９．１，１２７．８，１２６．８，１２５．０，１２４．４，１１７．６，１１７．０，１１６．７，１１６．５，１１５．０，１１０．３，１１０．１，１０７．５，８１．８，８０．２，７７．３，７７．０，７６．７，２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２４Ｈ１８ＮＯ７［Ｍ＋Ｈ］＋：４３２．１０８３，ｆｏｕｎｄ；４３２．１０８３（＋０．０ｍｍｕ）。
　（化合物（ｋ）の合成；５－（５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－３’，６’－ジイルジアセテート）
　化合物（ｊ）（５，６－異性体混合物）（１００．６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（４４．９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５２．１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに懸濁させ、室温で１時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、目的化合物を収率４２％（６４．４ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）で得た。
　（化合物（ｋ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．４１（１Ｈ，ｓ），８．４６－８．３９（３Ｈ，ｍ），８．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１），７．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．４），６．９４－６．７０（４Ｈ，ｍ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．２９（６Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６９．４，１６９．０，１６８．９，１６８．９，１５６．３，１５３．０，１５１．９，１５１．８，１５１．６，１５１．３，１２９．１，１２７．８，１２６．８，１２５．０，１２４．４，１１７．６，１１７．０，１１６．７，１１６．５，１１５．０，１１０．３，１１０．１，１０７．５，８１．８，８０．２，７７．３，７７．０，７６．７，２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３２Ｈ２３Ｎ２Ｏ１２Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：６５９．０９７２，ｆｏｕｎｄ；６５９．０９７４（＋０．２ｍｍｕ）。
　（Ｐｓ－ＦＬの合成；Ｎ－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－イル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）
　化合物（ｋ）（１４ｍｇ，０．０２１ｍｍｏｌ）を１Ｎ　ＮａＯＨ（０．５ｍＬ）とジメチルスルホキシド（１．０ｍＬ）に溶解させて室温にて５分間攪拌した。反応液をｐＨ７．４、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液によって中和し、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるよう組成比のグラジエントをかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下、留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを減圧下留去し、目的化合物（Ｐｓ－ＦＬ）を収率６３％で得た（７．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）
　（Ｐｓ－ＦＬの機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，１０％ＭｅＯＤ　ｉｎ　ＣＤＣｌ３）δ８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．２３－８．１２（４Ｈ，ｍ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．２３－８．１２（４Ｈ，ｍ），６．７２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２８Ｈ１９Ｎ２Ｏ１０Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：５７５．０７６０，ｆｏｕｎｄ；５７５．０７５７（－０．３ｍｍｕ）
　［蛍光プローブの分光学的特性の評価（４）］
　まず、２μＭのＰｓ－ＦＬ（図２３の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２μＭのＰｓ－ＦＬを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。
　Ｐｓ－ＦＬについての蛍光スペクトルの測定結果を図２３の（Ｂ）に示す。図２３の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－ＦＬは反応の前後で５１５ｎｍにおいて約１５０倍の蛍光強度上昇を示した。
　［蛍光プローブの合成（５）］
　上記とはさらに異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　（化合物（ｌ）の合成；２－（８－ヒドロキシ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－カルボニル）－５（６）－ニトロ安息香酸）
　４－ニトロフタル酸無水物（２５７．１ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）と８－ヒドロキシジュロリジン（２５２．３ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に懸濁し、１００℃で３時間撹拌した後、加熱還流を行い、一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却し、溶液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で３回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２，０．５％酢酸）で精製し、目的化合物（５，６－異性体混合物）を収率６７．６％（３４３．６ｍｇ，０．８９９ｍｍｏｌ）で得た。
　（化合物（ｌ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），８．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３），８．２７（１Ｈ，ｄｄ，８．７，２．３），８．１７（１Ｈ，ｄ，８．７），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．３３（１Ｈ，ｓ），６．２７（１Ｈ，ｓ），３．２８－３．１５（８Ｈ，ｍ），２．６４（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２），２．４０（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７），１．９４－１．８４（４Ｈ，ｍ），１．８４－１．７４（４Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１９５．５，１９４．９，１７４．０，１６６．０，１６５．４，１６０．２，１６０．１，１４９．６，１４９．５，１４９．１，１４７．６，１４６．５，１４２．３，１３４．９，１３１．９，１３０．８，１２９．８，１２９．７，１２９．２，１２６．４，１２５．８，１２３．５，１２２．９，１１３．３，１１３．３，１０８．３，１０８．３，１０５．４，１０５．４，６０．５，５０．１，４９．７，４９．４，４９．２，４９．０，４８．８，４８．６，４８．３，２７．０，２１．３，２０．８，２０．６，２０．３，１９．６，１３．９
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２０Ｈ１９Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：３８３．１２４３，ｆｏｕｎｄ；３８３．１２４１（－０．２ｍｍｕ）。
　（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄの合成；Ｎ－（１２－ヒドロキシ－３’－オキソ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，３’Ｈ，５Ｈ－スピロ［クロメノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９，１’－イソベンゾフラン］－５’－イル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）
　化合物（ｌ）（５，６－異性体混合物）（２０３．８ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）とレゾルシノール（６６．７ｍｇ，０．６０６ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（０．５ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）に溶解させて、８０℃で一晩撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、１０Ｎ　ＮａＯＨを用いて、ｐＨ２～３にした。クロロホルムで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５：１）で粗精製した。得られた固体（１１５．２ｍｇ）、硫化ナトリウム９水和物（２７２．０ｍｇ，３．４８ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解させ、６０℃で１時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４にした。酢酸エチルで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝４：１から１：１）で粗精製し、化合物（ｍ）を得た。
　得られた化合物（ｍ）（１１ｍｇ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（１４ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１４ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に懸濁し、室温で４５分間攪拌した。反応溶液に１Ｎ　ＮａＯＨ（３ｍＬ）を加えて室温で５分間攪拌した。１Ｎ　ＨＣｌでｐＨを３にして酢酸エチルを加えて分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。酢酸エチルを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝３：１から１：１）で精製した。残渣をジメチルスルホキシド（２００μＬ）とアセトニトリル（２００μＬ）の混合溶媒に溶解させて、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０，４．０ｍＬ）を加えて、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるよう組成比のグラジエントをかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下、留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液加えた。酢酸エチルで２回分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを減圧下留去し、目的化合物（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄ）を得た（１．６ｍｇ，０．００２５ｍｍｏｌ）。
　（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄの機器データ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３４Ｈ２８Ｎ３Ｏ９Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：６５４．１５４６，ｆｏｕｎｄ；６５４．１５４８（＋０．２ｍｍｕ）。
　［蛍光プローブの分光学的特性の評価（５）］
　まず、２μＭのＰｓ－ｊＲｈｏｄ（図２４の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ　０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２μＭのＰｓ－ｊＲｈｏｄを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。
　Ｐｓ－ｊＲｈｏｄについての蛍光スペクトルの測定結果を図２４の（Ｂ）に示す。図２４の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－ｊＲｈｏｄは反応の前後で５６５ｎｍにおいて約７５倍の蛍光強度上昇を示した。

Claims (14)

  1. 　下記一般式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    式中、Ｌは蛍光団を表し、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している、
    で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  2. 　前記ＥＷＧ基は、メシル基またはシアノ基である、請求項１に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  3. 　前記蛍光団は、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、およびＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎからなる群から選択される母核を有するものである、請求項１または２に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  4. 　前記Ｌは、下記一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｎは０～４の整数を表し、Ｒ２は水素原子または置換もしくは非置換の炭素数２～２０のアシル基を表し、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す、
    で表される、請求項１～３のいずれか１項に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  5. 　下記一般式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｎは０～４の整数を表し、Ｒ２は水素原子または置換もしくは非置換の炭素数２～２０のアシル基を表し、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す、
    で表される、請求項４に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  6. 　前記Ｒ２は置換もしくは非置換の炭素数２～２０のアシル基である、請求項４または５に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩を含む、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１測定用蛍光プローブ。
  8. 　請求項７に記載のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１測定用蛍光プローブを含む、がん細胞またはがん組織の検出用組成物。
  9. 　請求項７に記載のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１測定用蛍光プローブを含む、がん診断用組成物。
  10. 　請求項７に記載のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１測定用蛍光プローブまたは請求項８に記載の検出用組成物を組織に適用する工程と、
    　適用後の前記組織に対して励起光を照射する工程と、
    　前記組織からの蛍光を検出する工程と、
    含む、がん細胞またはがん組織の検出方法。
  11. 　請求項７に記載のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１測定用蛍光プローブまたは請求項８に記載の検出用組成物を、生体から採取した血液中の細胞と接触させる工程と、
    　前記細胞に対して励起光を照射する工程と、
    　前記細胞からの蛍光を検出する工程と、
    を含む、血液中におけるがん細胞の検出方法。
  12. 　請求項７に記載のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１測定用蛍光プローブまたは請求項８に記載の検出用組成物と、
    　生体試料固定装置と、
    を含む、がん診断用キット。
  13. 　下記一般式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    式中、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置し、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０～５の整数を表す、
    で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。
  14. 　下記一般式（５）～（７）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０～５の整数を表す、
    からなる群から選択されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。
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