CN103180324A - 腔肠素衍生物及其使用方法 - Google Patents

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CN103180324A CN201180052806XA CN201180052806A CN103180324A CN 103180324 A CN103180324 A CN 103180324A CN 201180052806X A CN201180052806X A CN 201180052806XA CN 201180052806 A CN201180052806 A CN 201180052806A CN 103180324 A CN103180324 A CN 103180324A
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D.H.克劳伯特
P.梅森黑默
J.安奇
W.周
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Abstract

本发明提供作为非发光酶的底物和发光酶的前底物的腔肠素衍生物。本发明还提供一种使用所述衍生物的方法。

Description

腔肠素衍生物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年11月2日提交的美国系列No. 61/409,413的优先权，将其以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明提供用于测定酶的存在和活性的化合物和方法。
背景
酶的存在和活性可用于确定细胞的健康状况和代谢状态。酶还可以是特定细胞类型的标记物，因为某些酶的存在和活性通常是特定细胞的特征。例如，某些酶的活性通常可用于区分细菌、植物或动物来源的细胞或区分产生这种酶的组织的身份。
糖苷酶（也称为糖苷水解酶）催化糖苷键水解以产生两种更小的糖。糖苷酶是十分常见的酶，其在自然界中的作用包括在抗细菌防御策略中（例如，溶菌酶）、在发病机理中（例如，病毒神经氨酸酶）和在正常细胞功能中（例如，参与N-连接糖蛋白生物合成的修剪甘露糖苷酶）使诸如纤维素和半纤维素的生物质降解。在细菌和原核生物中，发现糖苷酶同时作为细胞内和细胞外酶，其主要参与营养获取。糖苷酶在细菌中的一种重要形式是β-半乳糖苷酶（LacZ），其参与在大肠杆菌（E. coli）中的lac操纵子的表达的调控。在高等生物中，糖苷酶被发现存在于内质网和高尔基体中，糖苷酶在这些位置参与N-连接糖蛋白的加工，并且在溶菌酶中作为参与碳水化合物结构的降解的酶。缺乏特殊溶酶体糖苷酶可导致许多的溶酶体贮积症，造成发育问题或死亡。糖苷酶在体内参与糖原的生物合成和降解。糖苷酶与糖基转移酶一起形成用于糖苷键合成和断裂的主要催化机器。
黄递酶是一种普遍存在的黄素结合酶，其催化用作氢受体的各种化合物从二-和三-磷基吡啶核苷酸（即，NADH、NADPH）的还原形式发生还原。细胞能量代谢是一个复杂的过程，其允许细胞通过一系列酶催化和化学反应来储存能量。细胞能量代谢的一个必需方面是细胞的还原-氧化态。活细胞的代谢状态以及酶活性和/或代谢物浓度的测定可以通过测定氧化还原定义辅助因子NAD(P)/NAD(P)H来确定。
发明概要
在一个方面，本发明提供式（I）的化合物：
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE002
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R2’选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE006
、H或低级环烷基组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L是连接子；
n为0至3；
每个R独立地为C1-7烷基；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
在另一个方面，本发明提供式（II）的化合物：
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE008
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R6选自由-H、-OH、NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE010
、、H或低级环烷基组成的组；
R11选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
n为0至3；
每个R独立地为C1-7烷基；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
在另一个方面，本发明提供式（III）的化合物：
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE014
其中R6选自由-H、-OH、-NH2 -OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE018
、H或低级环烷基组成的组；
R12选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
V为-S-或-O-；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
每个R独立地为C1-7烷基；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
在另一个方面，本发明提供式（IV）的化合物：
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE020
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R8选自由
Figure 532253DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 449394DEST_PATH_IMAGE018
、H或低级环烷基组成的组；
R16选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
n为0至3；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
每个R独立地为C1-7烷基；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
本发明还提供使用以上化合物的方法。
附图简述
图1示出z-DEVD-腔肠素-h的生物测试的结果。
图2示出使用刺虾（Oplophorus）-衍生萤光素酶和z-DEVD-腔肠素-h进行的胱天蛋白酶3测定的结果。
图3示出合适的连接子。
图4示出可以衍生得到的腔肠素。
图5示出可用于糖苷酶测定中的前腔肠素糖的实例。
图6示出酶的各种肽基底物。
图7示出用于蛋白酶测定中的合适的前腔肠素。
图8示出细胞数量与发光度之间的线性关联，表明使用化合物40和50所测得的发光度与细胞数量之间的直接关系。
图9示出使用根据本发明的前腔肠素所进行的NADH检测。
图10示出根据本发明的其它合适的前腔肠素底物。
详述
本发明提供用于测定样品中的各种酶的存在和活性的化合物和方法。
除非另外明确说明，否则本申请上下文中使用的术语“包括”是指除通过“包括”所介绍的成员列表外，可以任选存在其它成员。然而，本发明的具体实施方案预期所述术语“包括”涵盖了不存在其它成员的可能性，即，在这种实施方案中“包括”是以“由…组成”的含义理解。
如本文中所使用，以下术语和表达具有所指出的含义。应当明白，本发明的化合物含有非对称取代碳原子而且可以为分离的光学活性或消旋形式。本领域已熟知如何制备光学活性形式，诸如通过消旋形式的拆分或通过从光学活性起始材料合成。结构的所有手性、非对映、消旋形式和所有几何异构形式均为本发明的一部分。
以下针对游离基、取代基和范围而列举的具体值仅用于说明。这些值不排除其它定义值或在游离基和取代基的定义范围内的其它值。
定义
术语“烷基”是指通过将氢原子从烃化合物移除而获得的单价部分。烷基可以含有1至30个碳原子，或1至12个碳原子，或1至10个碳原子或1至6个碳原子或1至4个碳原子。烷基可以是直链或支链的而且可以是饱和、部分不饱和或完全不饱和的。烷基可以任选被（例如）卤基取代。直链烷基的实例包括但不限于乙基、正丙基、正丁基和正丙基、正己基和正庚基。具有一个或多个碳-碳双键的直链不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基（乙烯基，-CH=CH2）、2-丙烯基（烯丙基，-CH-CH=CH2）和丁烯基。具有一个或多个碳-碳三键的不饱和烷基的实例包括但不限于乙炔基和2-丙炔基（炔丙基）。支链烷基的实例包括异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基和异戊基。
术语“氨基酸”是指天然和非天然氨基酸。其还包括被保护的天然和非天然氨基酸。
术语“芳基”是指通过将氢原子从芳环移除而获得的单价部分。芳基可以具有6至10个碳原子（C6-10芳基）。例如，芳基可以是苯基或萘基。
术语“卤基”是指卤素，诸如Cl、F、Br或I。
术语“杂芳基”是指通过将氢原子从杂芳环移除而获得的单价部分。杂芳环可以具有5至10个环原子（C5-10杂芳基（应理解，“C”的使用意指环原子的总数，与该原子为C、N、O或S无关）。）。环原子可以是碳、氮、硫或氧。在环中可以存在多于一个杂原子。例如，杂芳基可以是呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、三唑基或四唑基。
术语“连接子”是指含2至50个原子的链，其将底物部分连接到腔肠素核。连接子可以包括一个或多个杂原子。连接子还可以被桥氧基、氨基、烷基、卤素和硝基取代。连接子还可以含有芳基。合适的连接子包括图3中所示出的那些连接子，诸如对氨基苄基连接子。连接子是合适的“无踪迹”或“自消耗”连接子。术语“无踪迹连接子”或“自消耗连接子”是指底物部分从连接子裂解，导致所述连接子从腔肠素核自发裂解以释放腔肠素的连接子。示例性“自消耗连接子”包括图3中所示出的那些连接子。
术语“低级环烷基”是指通过将氢原子从具有3至6个碳原子的烃化合物移除而获得的单价部分。饱和低级环烷基的实例包括但不限于诸如环丙基、环丁基、环戊基和环己基的基团。具有一个或多个碳-碳双键的不饱和低级环烷基的实例包括但不限于诸如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基和环己烯基的基团。
除非另外说明，否则术语“发光酶”是指将腔肠素用作底物的天然存在、重组或突变发光酶。发光酶（如果是天然存在）可以由本领域技术人员容易地从生物体获得。如果发光酶是天然存在的发光酶或是重组或突变发光酶，即，在天然存在的发光酶的萤光素酶-腔肠素反应中维持活性的发光酶，那么所述发光酶可以从被转变以表达编码所述发光酶的核酸的细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等的培养物容易地获得。而且，可以使用编码萤光素酶的核酸而从体外无细胞系统获得所述重组或突变发光酶。合适的发光酶包括从生物发光十足目动物，例如从刺虾科（Oplophoroidea），例如刺虾衍生萤光素酶）、海洋生物（如刺胞动物（例如，海肾（Renilla）萤光素酶）、须虾科（Aristeidae）、管鞭虾科（Solenoceridae）、萤虾科（Luciferidae）、樱虾科（Sergestidae）、玻璃虾科（Pasipheidae）和小海虾科（Thalassocaridiae）十足动物科获得的萤光素酶以及诸如水母发光蛋白（Aequorin）的光蛋白。
“发光反应混合物”含有使发光酶产生光信号（即发光）的物质。这种混合物还可以含有酶。所需的物质和产生发光信号所需的物质的特定浓度和/或量将根据所使用的发光酶以及即将实施的测定的类型变化。经常将其它物质加入至溶液，这些物质包括：使反应维持在合适的pH下的缓冲液、帮助维持酶活性的添加剂（诸如PRIONEX或牛血清白蛋白（BSA））、还原剂、洗涤剂等。
术语“肽”是指具有至少两个氨基酸的序列。在一些实施方案中，肽可以含有不超过80个氨基酸，或不超过35个氨基酸，或不超过10个氨基酸。
术语“糖”是指糖或其它碳水化合物，尤其是简单的糖。其包括α-和β-端基。糖可以是C6-多羟基化合物，一般是C6-五羟基，而且经常是环状烯糖。其包括已知的简单糖及其衍生物，以及具有两个或更多个单糖残基的多糖。糖可包括在羟基上的保护基。糖的羟基可以被一个或多个乙酰氨基、卤基或氨基置换。此外，可以使碳原子中的一个或多个氧化（例如）成酮基或羰基。合适的糖包括半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和神经氨酸。
术语“经取代”意指在使用“经取代”表述指示的基团上的一个或多个（例如，1个、2个、3个、4个或5个；在一些实施方案中1个、2个或3个；和在其它实施方案中1个或2个）氢被选自所指出的基团，或被本领域技术人员已知的合适的基团置换，条件是不超过所指出的原子的正常化合价，并且所述取代获得稳定化合物。合适的取代基包括卤基、羟基、苯基、-NH2、-NHMe、-NMe2、-SH、-CH(OMe)2、-CF3、-OCH3、-SCH3、C1-4烷基、哌嗪基和被芳基取代的哌嗪基。
化合物
已知在被各种不同的生物发光蛋白质（诸如海洋萤光素酶）作用时腔肠素会发光。海洋萤光素酶的实例包括海肾萤光素酶、水母发光蛋白、高斯（Gaussia）萤光素酶、刺虾萤光素酶）和海萤（Cypridina）萤光素酶。
本发明提供同时作为非发光酶的底物和发光蛋白质的前底物的腔肠素衍生物。一旦被所关注的非发光酶作用时，所述衍生物变为发光蛋白质的底物，并因此可以被本领域普通技术人员已知的方法检测。
在一些实施方案中，所述衍生物是以下示出的式I至式IV化合物：
（1）
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R2’选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE024
、
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE026
、H或低级环烷基组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L是连接子；
n为0至3；
每个R独立地为C1-7烷基；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环；
（2）
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE030
、、H或低级环烷基组成的组；
R11选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
n为0至3；
每个R独立地为C1-7烷基；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环；
（3）
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE032
其中R6选自由-H、-OH、-NH2 -OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 873608DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 687980DEST_PATH_IMAGE018
、H或低级环烷基组成的组；
R12选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
V为-S-或-O-；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
每个R独立地为C1-7烷基；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环；或
（4）
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE034
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R8选自由
Figure 323492DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 652842DEST_PATH_IMAGE018
、H或低级环烷基组成的组；
R16选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
n为0至3；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
每个R独立地为C1-7烷基；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
在一些实施方案中，R2为
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE036
、、
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE040
、
Figure 201180052806X100002DEST_PATH_IMAGE042
或C2-5烷基；每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；Z为-CH-或-N-；Y为-H或-OH；W为-NH2、卤基、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；并且R为C1-7烷基。
在一些实施方案中，R2为；并且X为O或S。在其它实施方案中，R2为C2-5直链烷基。在某些实施方案中，R8为
Figure DEST_PATH_IMAGE046
、低级环烷基或H，其中R3和R4均为H或C1-2烷基。在其它实施方案中，R8为苄基。
在一些实施方案中，V是S。
合适地，本发明的化合物是天然存在的（“原生”）腔肠素的衍生物以及其类似物，包括腔肠素-n、腔肠素-f、腔肠素-h、腔肠素-hcp、腔肠素-cp、腔肠素-c、腔肠素-e、腔肠素-fcp、双脱氧腔肠素(“腔肠素-hh”)、腔肠素-i、腔肠素-icp和2-甲基腔肠素，此外还有WO 2003/040100和美国申请系列No. 12/056,073 (第[0086]段)中所公开的那些化合物，将其公开内容以引用的方式并入本文。根据本发明可以衍生得到的其它合适的腔肠素包括图4中的那些。
在一些实施方案中，本发明的腔肠素衍生物是糖苷酶的底物。合适的衍生物包括图5中所示出的那些。
在一些实施方案中，本发明的腔肠素衍生物是蛋白酶（如胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3/7、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、二肽基肽酶4（DPPIV）、钙蛋白酶、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶体、胰蛋白酶样蛋白酶体、胱天蛋白酶样蛋白酶体、粒酶B、组织蛋白酶B/L/K、凝血酶、胰蛋白酶、氨基肽酶和SARS蛋白酶）的底物。合适的肽和氨基酸以及以其为底物的酶包括图6中所列举的那些。其它合适的衍生物包括图7中所列举的那些。
在一些实施方案中，本发明的腔肠素衍生物是细胞色素P450酶的底物。
在一些实施方案中，本发明的腔肠素衍生物是黄递酶的底物。
使用方法
本发明的腔肠素衍生物可以作为测定试剂用于检测非发光酶（如细胞色素P450酶、蛋白酶或糖苷酶）的存在或活性。使用发光酶及其底物的测定是本领域熟知的。例如，可以将发光酶、发光反应混合物和作为非发光酶的底物的腔肠素衍生物添加到预计含有所述非发光酶的样品。如果在样品中存在所述非发光酶，那么所述非发光酶将作用于腔肠素衍生物，使其被发光酶识别以产生发光信号。或者，所述非发光酶可以将发光的腔肠素衍生物转化为非发光形式，即，测定信号消失。
在一些实施方案中，所述测定可以使用腔肠素的化学发光。例如，可以将作为非发光酶的底物的腔肠素衍生物添加到预计含有非发光酶的样品。如果在样品中存在非发光酶，那么所述非发光酶将作用于所述腔肠素衍生物，使其变为化学发光并且可以被熟知技术检测。
可以在发光酶之前或同时将腔肠素衍生物添加到样品。在某些实施方案中，所述样品可以是细胞。细胞可以是真核细胞，例如，酵母、鸟类、植物、昆虫或哺乳动物细胞，包括但不限制于人类、猴、鼠科动物、犬科动物、牛科动物、马科动物、猫科动物、绵羊、山羊或猪细胞，或原核细胞，或来自两种或更多种不同生物体的细胞，或细胞裂解物或其上清液。细胞可以通过重组技术被遗传修饰。在某些方面，细胞可以在动物（例如，转基因动物）或生理流体（例如血液、血浆、尿液、黏液分泌物等）中。
样品可以含有多于一种待检测的非发光酶。在这种情况下，可以使用多于一种发光酶。此外，可以使用多于一种底物。可以在例如多重反应中同时将多种底物和/或发光酶用于检测多种非发光酶或其它受关注分子，例如，测试化合物。
还可以将腔肠素衍生物用于原位分析细胞方法。本领域已知使用萤光素酶实施细胞原位分析的方法，参见例如美国专利No. 5,998,204。在暴露于非发光酶之前，腔肠素衍生物不是发光酶的底物。然而，在暴露于非发光酶后，衍生物被转化为可以在存在发光酶的发光反应中容易地检测到的化合物。因此，可以通过原位成像确定非发光酶在细胞中所处位置。这可以通过使表达发光酶的细胞与腔肠素衍生物接触来完成。
或者，可以向表达发光酶基因的转基因动物施用作为受关注的特定非发光酶的底物的腔肠素衍生物。随后可以将成像技术（例如，体内生物光子成像）用于测定在活的正常动物的发光酶表达位置处的发光度。因此，可以向表达发光酶的转基因动物施用腔肠素衍生物，所述腔肠素衍生物将在表达受关注合适的非发光酶的组织中被转化为发光酶的底物。如果在该组织中还表达发光酶，那么将产生发光信号并且可以被任何合适的方法检测。因此，可以在以动物为基础的测定中对测试化合物进行测试，例如药物。应先将测试化合物施用于动物，然后施用腔肠素衍生物。或者，可以将来自转基因动物的组织用于以组织为基础的测定中。
在一些实施方案中，可以向非转基因动物施用作为受关注的特定非发光酶的底物的腔肠素衍生物。所述衍生物将在表达合适的非发光酶的组织中被转化为发光酶的底物。可以从动物获得生物样品（例如，血液、血清、胆汁、尿液、粪便或组织）并使其与发光酶接触。所产生的信号可以被任何合适的方法检测。因此，可以在以动物为基础的测定中对测试化合物进行测试，例如药物。应先将测试化合物施用于动物，然后施用腔肠素衍生物。
在一些实施方案中，可以筛选测试化合物（诸如候选药物）并且评价其作为例如（1）非萤光素酶的底物、（2）非萤光素酶的调节剂，例如，抑制剂、诱导剂或活化剂或（3）细胞状况（例如，活力、不断增加的活性氧种类或不断降低的电位）的改性剂的活性。还可以将腔肠素衍生物用于区分非萤光素酶的底物与抑制剂。可以在体外或体内实施筛选。
此外，对于本文中所描述的任何一种生物发光测定来说，可以将其它试剂加至反应混合物，包括但不限制于抑制或防止萤光素酶失活，或以其它方法延长或增强发光信号的那些试剂。
试剂盒
本发明还提供用于确定一种或多种非萤光素酶的存在或活性的试剂盒。所述试剂盒可以包括以下的一种或多种：腔肠素衍生物、非萤光素酶、腔肠素依赖性发光酶和反应缓冲液。反应缓冲液可以存在于用于非萤光素酶反应和发光酶反应的各个调配物中或用于单步骤测定的单个调配物中。本发明的试剂盒还可以含有非萤光素酶的抑制剂、活化剂和/或增强剂。本发明的试剂盒还可以含有针对所述测定的阳性和/或阴性对照。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例 1 ： z-DEVD- 腔肠素 -h （化合物 21 ）的合成
3-((((9H- 芴 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 氨基 )-4-((4-( 羟甲基 ) 苯基 ) 氨基 )-4- 氧代丁酸叔丁酯（ 13 ）：将Fmoc-Asp(OtBu)-OH（6.7 g，16.28 mmol）和100 ml干THF装入烧瓶。在环境温度下，将纯N-甲基吗啉（1.9 mL，17.28 mmol）加至该溶液，并将溶液冷却至-20℃。通过注射器加入纯氯甲酸异丁酯（2.2 mL，16.96 mmol）并将所获得的悬浮液搅拌10分钟。一次加入氨基醇（2.0 g，16.24 mmol），并将反应混合物搅拌10分钟，然后移走冷浴并在环境温度下继续搅拌2小时。以300 ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并依次用两份50 mL水、50 mL 0.5 M HCl和两份50 mL盐水溶液洗涤混合物。干燥（MgSO4）有机相并在真空下浓缩。在二氧化硅上用庚烷/乙酸乙酯梯度色谱分离残余物。获得5.2 g（10.7 mmol）呈白色固体形式的产物。1H NMR (300 MHz, dmso) d 10.02 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.5, 2H), 7.81 - 7.67 (m, 3H), 7.55 (d, J = 8.4, 2H), 7.47 - 7.27 (m, 4H), 7.24 (d, J = 8.4, 2H), 5.09 (t, J = 5.7, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.43 (d, J = 5.7, 2H), 4.37 - 4.16 (m, 3H), 2.76 - 2.51 (m, 2H), 1.37 (s, 9H)。
3-((((9H- 芴 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 氨基 )-4-((4-( 氯甲基 ) 苯基 ) 氨基 )-4- 氧代丁酸叔丁酯（ 14 ）：将醇（13）（0.5 g，0.97 mmol）和15 mL干苯装入烧瓶。在环境温度下，将纯三乙胺加至该悬浮液，并在搅拌2分钟后，将混合物在冰/水浴中冷却10分钟。向其中加入纯亚硫酰氯（78 μL，1.07 mmol），并在2分钟后，移走冷浴并在环境温度下继续搅拌3小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并以30 mL干苯冲洗滤饼。在真空下浓缩滤液，并用二氯甲烷通过柱色谱经二氧化硅纯化残余物。获得457 mg（0.85 mmol）呈粘性白色固体形式的产物。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 10.16 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.5, 2H), 7.79 (d, J = 8.1, 1H), 7.76 - 7.68 (m, 2H), 7.61 (d, J = 8.5, 2H), 7.44 - 7.27 (m, 6H), 4.72 (s, 2H), 4.58 - 4.44 (m, 1H), 4.33 - 4.18 (m, 3H), 2.63 (ddd, J = 6.0, 14.6, 21.8, 2H), 1.37 (s, 9H)。
化合物 17 和化合物 18：在氩气环境下将腔肠素-h（7）（200 mg，.37 mmol）和15 mL无水脱氧DMF装入干烧瓶。在环境温度下，将碘化钾（31 mg，0.19 mmol）和碳酸钾（51 mg，0.37 mmol）加至该溶液，并将混合物搅拌约2分钟。向其中加入化合物14，并将混合物搅拌18小时。通过反相和正相色谱纯化产物。
化合物 19 和化合物 20：在环境温度下将哌啶（2 mL）的7 mL二氯甲烷溶液加至化合物17或化合物18（365 mg，0.4 mmol）的3 mL二氯甲烷溶液。将反应混合物搅拌30分钟，以50 mL甲苯稀释并在真空下浓缩。通过反相色谱，用0.1% TFA/水至乙腈的梯度纯化残余物。将区域异构体的混合物（133 mg，0.19 mmol）溶于2 mL干DMF中，并加入HOBt（30 mg，0.22 mmol）和z-DEVD-CO2H（140 mg，0.23 mmol）。在环境温度下，将EDC（42 mg，0.22 mmol）加至该溶液，并将反应混合物搅拌过夜。以1 mL乙腈稀释粗反应混合物并通过反相柱色谱，用20 mM乙酸铵至乙腈梯度纯化。获得54 mg化合物19和69 mg化合物20。
化合物 21：将化合物19与化合物20的粗混合物溶于2 mL二氯甲烷中，并在环境温度下，将由4 mL三氟乙酸、2 mL二氯甲烷、0.4 mL三异丙基硅烷和0.4 mL茴香硫醚组成的去保护混合物加至该溶液。将反应混合物搅拌3小时并以30 mL二乙醚稀释。将上清液离心，并将固体与10 mL每份的二乙醚一起研磨两次。将残余物溶于2 mL甲醇中并通过反相色谱，用20 mM乙酸铵至乙腈梯度纯化。获得9 mg呈橙色固体的化合物21。
实施例 2 ： z-DEVD- 腔肠素 -h （化合物 21 ）的生物测试
将化合物21（50 μM）与50 mM HEPES缓冲液pH 7.2中的海肾萤光素酶（6.5 μg/ml，海肾-GST融合物）、2 mM DTT和0.5% CHAPS溶液组合并孵育20分钟以移除作为海肾萤光素酶的底物的任何游离腔肠素衍生物。以1:1体积比加入纯化的胱天蛋白酶-3（50 U/ml）或缓冲液对照品，以使最终浓度为25 μM Z-DEVD-腔肠素h衍生物底物、25 U/ml胱天蛋白酶-3和3.25 ug/ml萤光素酶。在110分钟内测定发光度。随着时间经过，看到发光度相对于不含胱天蛋白酶的对照样品增大了一百倍，表明腔肠素发生酶促释放并且证实本发明的腔肠素化合物可以用于检测胱天蛋白酶（图1）。
实施例 3 ： z-DEVD- 腔肠素 -h （化合物 21 ）的替代合成
Figure DEST_PATH_IMAGE050
(R)-3- 氨基 -4-(4-( 羟甲基 ) 苯基氨基 )-4- 氧代丁酸叔丁酯（ c ）。在250 mL圆底烧瓶中，将b（6 g，0.011摩尔）溶于二甲基甲酰胺（60 mL）中。加入哌啶（10 mL）。4小时后，TLC示出反应完成。蒸发溶剂。通过装载到硅藻土（在250 mL EtOAc中15 g）上并在二氧化硅（80 g）上用DCM向MeOH（10%溶于DCM）的渐升梯度进行洗脱来纯化残余物。蒸发合并的洗脱液。收率（76%）；Rf = 0.2 (50/50 Hept/EtOAc), 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 7.56 (d, J = 8.3, 2H), 7.22 (d, J = 8.3, 2H), 5.06 (t, J = 5.4, 1H), 4.41 (d, J = 4.6, 2H), 3.61 (t, J = 6.5, 1H), 2.59 (dd, J = 5.8, 15.5, 1H), 2.41 (dd, J = 7.2, 15.6, 1H), 1.35 (s, 9H); m/z。
(5S,8S,11R,14R)-5-(2- 叔丁氧基 -2- 氧代乙基 )-8-(3- 叔丁氧基 -3- 氧代丙基 )-14-(4-( 羟甲基 ) 苯基氨基甲酰基 )-11- 异丙基 -3,6,9,12- 四氧代 -1- 苯基 -2- 氧杂 -4,7,10,13- 四氮杂十六烷 -16- 酸叔丁酯（ d ）。将Z-D(tBu)E(tBu)V-OH（3.96 g，6.5 mmol）、c（1.6 g，5.4 mmol）、HOBt（0.915 g，5.9 mmol）和DMF（25 mL）加至100 mL圆底烧瓶。将EDAC（1.15 g，5.9 mmol）加至不断搅拌的溶液。18小时后，蒸发溶剂，并将残余物再溶于EtOAc（200 mL）中。以柠檬酸（30%，50 mL）、碳酸氢盐饱和（50 mL）、水（2×50 mL）和盐水（50 mL）洗涤溶液。使该物质吸附在硅藻土（15 g）上并在二氧化硅上以庚烷渐升至EtOAc梯度纯化。收率（74%）。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 9.85 (s, 1H), 8.33 (d, J = 7.7, 1H), 7.95 (d, J = 8.1, 1H), 7.83 (d, J = 8.3, 1H), 7.59 (d, J = 8.3, 1H), 7.53 (d, J = 8.5, 2H), 7.43 – 7.26 (m, 5H), 7.21 (d, J = 8.6, 2H), 5.06 (t, J = 5.7, 1H(经D2O振荡后消失)), 5.02 (d, J = 4.7, 2H), 4.70 (q, J = 7.7, 1H), 4.41 (d, J = 5.6, 2H(经D2O振荡后重叠为s)), 4.38 – 4.25 (m, 2H), 4.17 – 4.09 (m, 1H), 2.79 – 2.63 (m, 1H), 2.62 – 2.35 (m, 4H), 2.26 – 2.11 (m, 2H), 2.00 – 1.79 (m, 2H), 1.73 (d, J = 6.0, 1H), 1.34 (dd, J = 4.7, 7.4, 31H), 0.81 (t, J = 6.3, 6H). MS: C45H65N5O13计算值为883.5;实际值883.7。
(5S,8S,11R,14R)-5-(2- 叔丁氧基 -2- 氧代乙基 )-8-(3- 叔丁氧基 -3- 氧代丙基 )-14-(4-( 氯甲基 ) 苯基氨基甲酰基 )-11- 异丙基 -3,6,9,12- 四氧代 -1- 苯基 -2- 氧杂 -4,7,10,13- 四氮杂十六烷 -16- 酸叔丁酯（ e ）。将d（3.56 g，4 mmol）与苯（50 mL）一起加至100 mL RB烧瓶。蒸发溶液并在高真空下保存过夜。将干苯（70 mL）与TEA（610 μL，4.4 mmol）一起加至固体。在冰浴中冷却溶液，并缓慢加入SOCl2（320 μL，4.4 mmol）。使溶液升温到室温。4小时后，再加入TEA（241 μL）和SOCl2（100 μL）。再经过2小时后，使反应混合物吸附在硅藻土（10 g）上并在二氧化硅上用DCM向5%MeOH的DCM溶液的渐升梯度洗脱。收率（33%）。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 10.00 (s, 1H), 8.35 (d, J = 7.8, 1H), 7.95 (d, J = 7.8, 1H), 7.84 (d, J = 8.3, 1H), 7.67 (d, J = 8.6, 3H), 7.41 – 7.22 (m, 7H), 5.11 – 4.91 (m, 2H), 4.77 – 4.59 (m, 3H), 4.43 – 4.21 (m, 2H), 4.19 – 4.04 (m, 1H), 3.30 (s, (水)), 2.79 – 2.32 (m, 4H+DMSO), 2.26 – 2.07 (m, 2H), 2.00 – 1.79 (m, 2H), 1.77 – 1.60 (m, 1H), 1.40 – 1.24 (m, 27H), 0.81 (t, J = 6.4, 6H)。
(5S,8S,11R,14R)-5-(2- 叔丁氧基 -2- 氧代乙基 )-8-(3- 叔丁氧基 -3- 氧代丙基 )-14-(4-((2,8- 二苄基 -6-(4- 羟基苯基 ) 咪唑并 [1,2-a] 吡嗪 -3- 基氧基 ) 甲基 ) 苯基氨基甲酰基 )-11- 异丙基 -3,6,9,12- 四氧代 -1- 苯基 -2- 氧杂 -4,7,10,13- 四氮杂十六烷 -16- 酸叔丁酯（ 20 ）。将e（133 mg，147 μmol）的DMF（500 μL）除气溶液加至含有腔肠素-h（50 mg，122 μmol）和K2CO3（34 mg，245 μmol）的氩气除气小瓶。2小时后，将反应溶液在RP-HPLC上直接进样并用0.1% TFA（水溶液）向乙腈的梯度洗脱。分离主峰并蒸发。收率（13%）。UV峰：250、300和420 nm。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 9.79 (s, 1H), 8.27 (d, J = 7.5, 1H), 7.92 (d, J = 8.0, 1H), 7.85 (d, J = 10.1, 1H), 7.58 (d, J = 8.3, 1H), 7.53 (d, J = 8.7, 2H), 7.45 – 7.14 (m, 15H), 7.09 – 6.80 (m, 6H), 6.72 (d, J = 8.8, 2H), 5.13 – 4.90 (m, 2H), 4.73 – 4.53 (m, 1H), 4.22 (dd, J = 5.0, 17.7, 3H), 4.16 – 4.01 (m, 3H(在D2O振荡后为2H)), 3.25 – 3.01 (m, J = 10.0, 16.5, 4H), 2.76 – 2.53 (m, J = 15.6, 2H), 2.51 – 2.33 (m, 2H+DMSO), 2.24 – 2.04 (m, 2H), 1.99 – 1.77 (m, 2H), 1.76 – 1.61 (m, 1H), 1.40 – 1.07 (m, 27H), 0.89 – 0.62 (m, 6H). MS: C71H84N8O14的计算值为1272.6；实际值为1272.8。
实施例4. 30的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE052
将腔肠素乙酰酯（0.50 g，1.14 mmol）、醌三甲基锁C2-二胺碳酰氯（0.436 g，1.14 mmol）、DMAP（0.139 g，1.14 mmol）和TEA（0.115 g，1.14 mmol）的20 ml二氯甲烷溶液的混合物在室温下搅拌过夜。用庚烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过二氧化硅色谱纯化化合物以获得20%的收率（0.184 g）。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.47 (s, 1H), 8.04 (d, 2H), 7.55 (d, 2H), 7.0-7.5 (m, 9H), 4.57 (s, 2H, CH2), 4.16 (s, 2H, CH2), 3.2-3.7 (m, 4H, NCH2), 2.7-3.2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 2.30 (s, 3H, CH3), 1.0-2.2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 796.5 (M+)。
实施例5. 40的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE054
通过使用制备30（实施例4）的类似方法制得40。用庚烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过二氧化硅色谱纯化化合物以获得60%的收率（0.32 g）。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.47 (s, 1H), 8.03 (m, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.1-7.5 (m, 7H), 6.33 (s, 1H), 6.17 (s, 1H), 4.58 (s, 2H, CH2), 4.19 (s, 2H, CH2), 3.3-3.7 (m, 4H, NCH2), 2.7-3.2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 1.0-2.2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 728.5 (M+).在262 nm下的HPLC纯度: 90%。
实施例6. 50的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE056
通过使用制备PBI 4442（实施例20）的类似方法制得50。用庚烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过二氧化硅色谱纯化化合物以获得17%的收率（0.15 g）。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8.42 (s, 1H), 7.99 (m, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.1-7.5 (m, 10H), 4.58 (s, 2H, CH2), 4.19 (s, 2H, CH2), 3.3-3.7 (m, 4H, NCH2), 2.7-3.2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 1.0-2.2 (m, 15 H, CH3). MS (m/e): 738.5 (M+)。在262 nm下的HPLC纯度: 95%。
实施例 7. 使用醌衍生物测定代谢活性细胞。
该实施例展示含醌腔肠素衍生物测定代谢活性细胞的量的用途。活细胞维持代谢活性状态，当细胞被破坏时，这种状态将不可避免地丧失。一旦进入活细胞，醌腔肠素被还原成作为腔肠素萤光素酶（例如，刺虾或海肾萤光素酶）的底物的腔肠素衍生物。醌腔肠素的转化与代谢活性细胞的数量成比例，因此可以通过监测萤光素酶反应所产生的光而定量测定。
在PBS中制备Jurkat细胞的两倍系列稀释液，并以50 μl/孔转移到96-孔板的孔。将化合物40和化合物50稀释于PBS中以分别制得50 μM和100 μM储液。将10 μl所制备的化合物储液加至细胞，并将细胞放置到37℃、5% CO2培养箱中。在30分钟孵育后，将细胞从培养箱移出，在室温下冷却10分钟，并将50 μl刺虾萤光素酶检测试剂直接加至孔中。混合样品，在室温下孵育20分钟，并测定发光度。图8示出细胞数量与发光度之间的线性关联，表明发光度与细胞数量之间的直接关系。
实施例 8 ：使用刺虾萤光素酶和化合物 21 进行的胱天蛋白酶 3 测定
将刺虾萤光素酶（OgLuc）变异体9B8 opt用于使用包含DEVD胱天蛋白酶-3裂解序列的前腔肠素底物的生物发光测定中。将纯化的胱天蛋白酶-3酶与表达变异体9B8 opt的大肠杆菌裂解物样品（根据制造商的说明用HALOLINKTM树脂（Promega Corp.）纯化）混合，并10倍稀释于含有100 mM MES pH 6.0、1 mM CDTA、150 mM KCl、35 mM硫脲、2 mM DTT、0.25% TERGITOL® NP-9（体积比）、0.025% MAZU®、含有或不含23.5 μM z-DEVD-腔肠素-h的100 mM HEPES pH 7.5的缓冲液中。在室温下将胱天蛋白酶-3酶与裂解物样品一起孵育3小时，并在Turner MODULUSTM光度计上检测各个时间点的发光度。将仅含有细菌裂解物的样品和仅含有胱天蛋白酶-3的样品用作对照。使用三份复制品。图2和表1展示本发明的前腔肠素底物可用于检测受关注的酶。
表1
+/- 胱天蛋白酶 - +
时间(分钟) RLU RLU
5.0 26,023 25,411
15.3 7,707 36,906
29.9 4,013 41,854
60.9 2,305 43,370
190.3 1,155 42,448
将另一种刺虾萤光素酶变异体L27V02（“L27V”）用于使用包含DEVD胱天蛋白酶-3裂解序列的前腔肠素底物的生物发光测定中。将纯化的胱天蛋白酶-3酶（1 mg/mL）的100 mM MES pH 6（50 μL）溶液与227 nM LV27V02变异体和47 μM PBI-3741（z-DEVD-腔肠素-h）的50 μL测定缓冲液（100 mM MES pH 6、35 mM硫脲、0.5% TERGITOL® NP-9（体积比）、1 mM CDTA、2 mM DTT和150 mM KCl）溶液混合。将反应在室温下孵育3小时，并如上所述检测发光度。将使用L27V02变异体的测定与使用胱天蛋白酶3/7 Glo（胱天蛋白酶-Glo；Promega Corp.）的萤火虫萤光素酶测定变体比较。表2展示本发明的化合物可用于生物发光测定中以检测受关注的酶。
表2
(+) 胱天蛋白酶 +/- (-)胱天蛋白酶 +/-
L27V 11,532 93 803 25
胱天蛋白酶-Glo 15,156,567 793,981 302 5
预测性实施例 9 ： O-(8- 苄基 -2-( 呋喃 -2- 基甲基 )-6- 苯基咪唑并 [1,2-a] 吡嗪 -3(7H)- 酰 - 基 ) 半乳糖苷（ 25 ）的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE058
i．乙酰溴α-D-半乳糖、AgOTf、TMU、DCM。ii. KOMe、THF
典型 β- 糖前腔肠素的典型合成。(O-(8-苄基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酰-基)3,4,5,6-四乙酰氧基-β-半乳糖苷)
将合适的乙酰溴-α糖（例如，乙酰溴α-D-半乳糖）（1.1当量）、合适的腔肠素（例如(8-苄基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮)（1.0当量，100 mg）和三氟甲磺酸银（67 mg，1当量）加至100 mL圆底烧瓶并以氩气除气30分钟。注射2 mL二氯甲烷和70 μL四甲基脲并在室温下搅拌3小时。加入4 mL乙腈，并过滤固体。通过将上清液进样至制备型250×41 mm C18 RP-HPLC柱上来纯化样品，并通过使用水向乙腈或其它合适的溶剂的梯度洗脱来收集合适的洗脱液。可以蒸发洗脱液以获得化合物。
将1 mL甲醇加至以上样品并在冰浴上冷却至0℃。随后可加入甲醇钾（5.2当量）的甲醇或THF溶液。30分钟后，准确加入5.2当量乙酸。随后可加入3 mL乙腈，并可过滤样品。可通过将上清液进样至制备型250×41 mm C18 RP-HPLC柱上来纯化样品，并可通过使用水向乙腈或其它合适的溶剂的梯度洗脱来收集合适的洗脱液。可蒸发洗脱液以获得化合物（25）。
预测性实施例 10 ：各种 P450 底物的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE060
可以在室温下，在氩气环境下将一当量甲基碘加至腔肠素与1.1当量碳酸钾的DMF溶液的混合物。可以通过薄层色谱监测反应进程。在反应完成后，可以在冰浴中将混合物冷却几分钟，并可加入体积等于反应体积的水。可以用合适的有机溶剂（例如乙酸乙酯）萃取所获得的混合物，并且可以浓缩萃取液以获得粗化合物1。可以通过实施色谱在硅胶上进一步纯化该物质。
可以在室温下，在氩气环境下将一当量对甲氧基苄基溴加至腔肠素与各1.1当量的碳酸钾和碘化钾的DMF溶液的混合物。可以通过薄层色谱监测反应进程，并且在反应完成后，可将混合物在冰浴中冷却几分钟，然后加入体积等于反应体积的水。可以用合适的有机溶剂（例如，乙酸乙酯）萃取所获得的混合物，并且可浓缩萃取液以获得粗化合物2。可以通过实施色谱在硅胶上进一步纯化该物质。
Figure DEST_PATH_IMAGE064
在分子筛存在下回流加热3-苄基-5-苯基吡嗪-2-胺（6）（1当量）、(E)-3-(4-((3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基)氧基)苯基)-2-氧代丙酸（5）（1.5当量）和樟脑磺酸（1.5当量）的THF溶液的混合物，直至起始材料缩合完全。用乙酸乙酯将反应混合物稀释到3倍体积并以水和盐水溶液洗涤。用硫酸钠干燥后，在真空下移除溶剂并将含有化合物7的残余物溶于干DMF中。在室温下以乙酸酐（1.5当量）和吡啶（1.5当量）处理所获得的溶液。可通过TLC监测反应的进程，并且一旦完成，将反应混合物在冰浴中冷却几分钟，然后加入体积等于反应体积的水。用合适的有机溶剂（例如乙酸乙酯）萃取所获得的混合物，并浓缩萃取液以提供化合物8。将该物质溶于甲醇中，并在冷却至约0℃后，用硼氢化钠（5至10当量）逐个小份地处理，直至产物形成完全。在仍然冷却时，可以用相当于先前加入的氢化物的摩尔数的量的乙酸处理反应混合物，并可在真空下浓缩反应混合物。可将残余物与水一起研磨几次以获得粗化合物3。可用色谱经硅胶纯化该物质。
Figure DEST_PATH_IMAGE066
在分子筛存在下回流加热3-苄基-5-(4-(3,3-二甲氧基丙氧基)苯基)吡嗪-2-胺（10）（1当量）、2-氧代-3-苯基丙酸（9）（1.5当量）和樟脑磺酸（CSA）（1.5当量）的THF溶液的混合物，直至起始材料缩合完全。用乙酸乙酯将反应混合物稀释到3倍体积并以水和盐水溶液洗涤。用硫酸钠干燥后，在真空下移除溶剂并将含有11的残余物溶于干DMF中。在室温下以乙酸酐（1.5当量）和吡啶（1.5当量）处理所获得的溶液。可通过TLC监测反应的进程，并且一旦完成，将反应混合物在冰浴中冷却几分钟，然后加入体积等于反应体积的水。用合适的有机溶剂（例如乙酸乙酯）萃取所获得的混合物，并浓缩萃取液以获得化合物12。将该物质溶于甲醇中，并在冷却至约0℃后，以硼氢化钠（5至10当量）逐个小份地处理，直至产物形成完全。在仍然冷却时，用相当于先前加入的氢化物的摩尔数的量的乙酸处理反应混合物，并在真空下浓缩反应混合物。将残余物与水一起研磨几次以获得粗化合物4。可用色谱经硅胶纯化该物质。
实施例 11 ： NADH 的测定
将用于检测黄递酶的本发明的前腔肠素底物用于测定存在于样品中的NADH的量。通过组合NADH、黄递酶、所述前腔肠素底物和酯酶，检测存在于样品中的NADH。被黄递酶利用的前腔肠素底物被转化为腔肠素。通过刺虾萤光素酶变异体检测所产生的腔肠素的量，而且所产生的发光度与存在于样品中的NADH的量成比例。
在测定时，将10 μL NADH（从60 μM滴定到0 μM）、10 μL 12U/mL黄递酶的PBS溶液、10 μL 165 U酯酶的PBS溶液和10 μL 60 μM PBI-4600的PBS溶液在室温下孵育1小时。孵育后，加入在109稀释度下含有刺虾萤光素酶变异体（L27V）的刺虾萤光素酶检测试剂（100 mM MES pH 6，1 mM CDTA，150 mM KCl，35 mM硫脲，1 mM DTT，0.5%表面活性剂（Tergitol）和0.05% Mazu）。在5分钟和1小时时测定发光度（图9）。数据展示本发明的化合物可通过检测使用NADH的酶而用于测定样品中的NADH。
所有公开、专利和专利申请均以引用的方式并入本文。虽然在以上说明书中已经参考其某些优选实施方案来描述本发明，而且已经针对说明的目的提出许多细节，但是本领域技术人员显而易见的是，本发明允许存在其它实施方案而且可以在不脱离本发明的基本原则下对本文中所描述的某些细节进行重大变化。

Claims (16)

1. 一种式（II）的化合物：
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE002
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE006
、H或低级环烷基组成的组；
R11选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
n为0至3；
每个R独立地为C1-7烷基；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
2. 一种式（I）的化合物：
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE008
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R2’选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE012
、H或低级环烷基组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L是连接子；
n为0至3；
每个R独立地为C1-7烷基；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
3. 一种式（III）的化合物：
Figure 201180052806X100001DEST_PATH_IMAGE014
其中R6选自由-H、-OH、-NH2 -OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；
R8选自由
Figure DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure DEST_PATH_IMAGE018
、H或低级环烷基组成的组；
R12选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
V为-S-或-O-；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
每个R独立地为C1-7烷基；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
4. 一种式（IV）的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
其中R2为-(CH2)n-T或C1-5烷基；
R8选自由
、、H或低级环烷基组成的组；
R16选自由肽、氨基酸、糖、-O-RA、-OC(O)O-RA、-N(RB)2或-NHC(O)ORA组成的组；
其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；
RA为C1-4烷基、经取代的C1-4烷基、-CH2-RC或-CH2-V-RC；
每个RB独立地为-H或-RA；
RC为芳基、杂芳基、经取代的芳基或经取代的杂芳基；
L’为直接键或连接子；
n为0至3；
T为芳基、杂芳基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或环烷基；
V为-S-或-O-；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
每个R独立地为C1-7烷基；并且
虚键表示存在可以是饱和或不饱和的任选环。
5. 根据权利要求1、2和4中任一项所述的化合物，
其中R2为
Figure DEST_PATH_IMAGE022
、
Figure DEST_PATH_IMAGE024
、
Figure DEST_PATH_IMAGE026
、
Figure DEST_PATH_IMAGE028
或C2-5直链烷基；
每个X独立地为-S-、-O-或-NH-；
Z为-CH-或-N-；
Y为-H或-OH；
W为-NH2、卤基、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；并且
R是C1-7烷基。
6. 根据权利要求5所述的化合物，其中
R2为
Figure DEST_PATH_IMAGE030
；并且
X为O或S。
7. 根据权利要求5所述的化合物，其中R2为C2-5直链烷基。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中R8为
Figure DEST_PATH_IMAGE032
、低级环烷基或H，其中R3和R4均为H或C1-2烷基。
9. 根据权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中R8是苄基。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中V是S。
11. 一种检测酶的存在或量的方法，其包括：
使预计含有所述酶的样品与根据权利要求1-10中任一项所述的化合物接触；和
检测所述样品的发光度。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中将所述发光度量化。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中预计所述样品含有第二种酶，包括
使所述样品与根据权利要求1-10中任一项所述的第二种化合物接触，其中所述第二种化合物含有所述第二种酶的底物；和
检测所述样品的发光度。
14. 一种在体内检测酶的存在的方法，其包括：
将根据权利要求1-10中任一项所述的化合物施用于转基因动物；和
检测发光度。
15. 一种检测酶的存在的方法，其包括：
将根据权利要求1-10中任一项所述的化合物施用于动物；
从所述动物获得样品；和
检测所述样品的发光度。
16. 一种化合物，其选自由以下组成的组：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
Figure DEST_PATH_IMAGE036
Figure DEST_PATH_IMAGE038
Figure DEST_PATH_IMAGE040
。
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