JP7161475B2 - 官能化nanoluc阻害剤 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年12月28日に出願した米国仮特許出願第62/439,600号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
本開示は、Oplophorus由来ルシフェラーゼを阻害し得る化合物に関する。
Aは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
L1は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m1-であり、式中、m1は、1~100であり、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基は、ヘテロ原子、または、O、N(Ra3)、S(=O)、及び、S(=O)2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換しており、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基は、C(=O)で置換しており、任意の隣接する2つのCRa1Ra2基が、CRa1=CRa1を形成し、そして、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基を、-Cy-基で置換しており、各Cyは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ra1、Ra2、及びRa3は、独立して、水素、及び、C1-C4-アルキルからなる群から選択され、
Zは、C1-C10ハロアルキル、脱離基Y、生物活性剤、または、色素であり、当該脱離基Yは、OR4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
R1は、水素、または、C1-C8アルキルであり、
R2は、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
R3は、水素、または、C1-C8アルキルであり、及び
R4は、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたC3-C8-シクロアルキル、任意に置換されたC3-C8-シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される。
(a)当該試料を、セレンテラジン基質及び本明細書に記載の化合物と接触させ、及び、
(b)当該試料の発光を検出する、ことを含み、
当該化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の抑制を招く。
(a)試料を、セレンテラジン基質と本明細書に記載の化合物とに接触させ、当該試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、当該第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片と第1のタンパク質を含む、当該第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、当該第2の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片と第2のタンパク質を含む、当該第2のポリヌクレオチドを含み、及び
(b)当該試料での発光を検出する、ことを含み、
当該発光の検出が、第1のタンパク質と第2のタンパク質との間の相互作用を示す。
(a)試料を、セレンテラジン基質と本明細書に記載の化合物とに接触させ、当該試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、当該第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼと第1のタンパク質とを含み、当該Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、当該第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、当該第2の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子と第2のタンパク質とを含む、当該第2のポリヌクレオチドを含み、及び
(b)当該試料に含まれる生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出する、ことを含み、このことは、当該生物発光ドナーと蛍光アクセプターとの相互作用、または、近接近を示す。
(a)本明細書に記載の化合物、及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ、を含むキットを提供する。
(a)試料の第1の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)シグナルを検出し、当該試料が、
(i)融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、当該融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、当該Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、当該ポリヌクレオチド、
(ii)セレンテラジン基質、
(iii)本明細書に記載の化合物、及び
(iv)蛍光アクセプター分子と、標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサーを含み、
(b)当該試料を、目的とする分子と接触させ、及び
(c)当該試料に含まれる第2のBRETシグナルを検出し、当該第1のBRETシグナルと比較して、当該第2のBRETシグナルが減少することは、当該目的とする分子と当該標的タンパク質との間の相互作用を示す。
(a)当該試料を、セレンテラジン基質、本明細書に記載の化合物、及び、HALOTAG(登録商標)リガンドと接触させ、当該HALOTAG(登録商標)リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、当該試料は、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、当該第1の融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼ、及び、第1の標的タンパク質を含み、当該Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである当該第1のポリヌクレオチド、
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、当該第2の融合タンパク質は、HALOTAG(登録商標)タンパク質、及び、第2の標的タンパク質を含む当該第2のポリヌクレオチドを含み、
(b)当該試料の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出し、それにより、相互作用を検出し、あるいは、当該第1の標的タンパク質と当該第2の標的タンパク質とが近接近していることを示す。
特に断りのない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料は後述する。本明細書で言及した刊行物、特許出願、特許、及び、その他の参考文献は、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、例示目的のものに過ぎず、限定を意図するものではない。
る。
本明細書では、Oplophorus由来ルシフェラーゼ、及び/または、Oplophorus由来ルシフェラーゼ活性を阻害し得る化合物を提供する。本発明の化合物は、式(I)の化合物、または、その塩を含み、
Aは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
L1は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m1-であり、式中、m1は、1~100であり、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基は、ヘテロ原子、または、O、N(Ra3)、S(=O)、及び、S(=O)2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換しており、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基は、C(=O)で置換しており、任意の隣接する2つのCRa1Ra2基が、CRa1=CRa1を形成し、そして、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基を、-Cy-基で置換しており、各Cyは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ra1、Ra2、及びRa3は、独立して、水素、及び、C1-C4-アルキルからなる群から選択され、
Zは、C1-C10ハロアルキル、脱離基Y、生物活性剤、または、色素であり、当該脱離基Yは、OR4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
R1は、水素、または、C1-C8アルキルであり、
R2は、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
R3は、水素、または、C1-C8アルキルであり、及び
R4は、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたC3-C8-シクロアルキル、任意に置換されたC3-C8-シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される。
Aは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2が、少なくとも1つのC1-C4アルキル、または、C1-C4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
L2は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m2-であり、式中、m2は、1~90であり、各CRa1Ra2は、先に定義した通りである。
Aは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2が、少なくとも1つのC1-C4アルキル、または、C1-C4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり
tは、0または1であり、
vは、0または1であり、及び
L3は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m3-であり、式中、m3は、1~80であり、各CRa1Ra2は、先に定義した通りである。
式中、
Q1は、存在せず、O、または、NHであり、
Q2は、存在せず、
、-CO-NH-、-CH2-CH2-CO-、-CH2-CH2-NH-CO、または、-CH2-CH2-CO-NH-であり、
Q3は、存在せず、-CO-NH-、または、-CH2-CH2-であり、
k1は、1~10であり、
k2は、0~10であり、及び、
k3は、0~10である。
及び
からなる群から選択される。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、及び
L3は、上記した通りである。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、メチル、エチル、-CH2Br、及び、-CH2CH2CH2Brからなる群から選択される1つの置換基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり
tは、0または1であり、
vは、0または1であり、及び
L3は、上記した通りである。
であり、及び
Zは、C1-C4アルコキシ、フェノキシ、
である。
で表される、ニトロベンズオキサジアゾール(NBD)色素部分とし得るものであり、このものは、タンパク質においてリシン残基と共有結合を形成し、そして、当該タンパク質に付加した後に、蛍光標識を提供し得る。適切な蛍光標識部分として、その全内容を本明細書の一部を構成するものとして援用する、Yamaguchi et al.,Chemical Science,2014,5,1021-1029に開示したものがある。
Aは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、及び
L3は、上記した通りである。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10である。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、
L3は、上記した通りである。
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ)「3,2-b]ピロール-5-(カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコン-2-エン-1-イル(1-(トランス-4)-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコン-2-エン-1-イル(1-(トランス-4)-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン19-イル)カルバメート、
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10)-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル))-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2 -((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル-1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15-ジオキサ-2,9-ジアザオクタデカン-18-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18-トリオキサ-2,9-ジアザヘニコサン-21-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21-テトラオキサ-2,9-ジアザテトラコサン-24-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17-ジオキサ-2,11-ジアザイコサン-20-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-((1r,4r)-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル))-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20-トリオキサ-2,11-ジアザトリコサン-23-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20,23-テトラオキサ-2,11-ジアザヘキサコサン-26-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21,24,27,30,33-オクタオキサ-2,9-ジアザヘキサトリアコンタン-36-オアート、
N-(トランス-4-((6-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-3,13-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,14-ジアザイコサン)-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
メチル トランス-4-(4-(2-((3-(ブロモメチル)フェニル)(エチル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキシラート、
メチル トランス-4-(4-(2-((3-(3-ブロモプロピル)フェニル)(エチル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキシラート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
メチル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
メチル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
フェニル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
フェニル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((6-ヨードヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-ブロモヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-ヨードオクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
4-フルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
3,5-ジフルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキサミド)オクタノアート、
4-シアノフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
ナトリウム 1-((8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノイル)オキシ)-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホナート、
N-(トランス-4-((5-(2-クロロアセトアミド)ペンチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(2-クロロアセトアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
2,3,5,6-テトラフルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
N-(トランス-4-((5-(2-ブロモアセトアミド)ペンチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ))-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル))-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,18-トリオキソ-12,15,22-トリオキサ-2,9,19-トリアザテトラコサン-24-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,24-トリオキソ-12,15,18,21,28-ペンタオキサ-2,9,25-トリアザトリアコンタン-30-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,23-ジオキソ-3,10,13,16,19-ペンタオキサ-6,22-ジアザオクタコサン-28-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
5-((6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル ジアセタート、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン)-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-(カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-(カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5,6-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン)-5-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5,6-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-イル)-1,11-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,12-ジアザオクタデカン-18-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-イル)-1,11-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,12-ジアザイコサン-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-イル)-1,11-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,12-ジアザイコサン-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(6-((Z)-2)-(E)-3-(1,1-ジメチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-3λ4-ピロロ)[3,2,1-ij]キノリン-2-イル)アリーリデン)-1-メチル-1,2,5,6-テトラヒドロ-4H-ピロロ[3,2,1-ij]キノリン-1-イル)ヘキサンアミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(4’,5’-ジクロロ-3’,6’-ジヒドロキシ-2’,7’-ジメトキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N1-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)-N4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-13,16-ジオキサ-2,9-ジアザオクタデカン-18-イル)スクシンアミド、
N1-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)-N4-(8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクチル)スクシンアミド、
N1-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)-N4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,12-ジオキソ-15,18-ジオキサ-2,11-ジアザイコサン-20-イル)スクシンアミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4 -((6-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((6-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
4-(2-エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,18-ジオキソ-8,11,14-トリオキサ-4,17-ジアザトリコサン-23-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,21-ジオキソ-8,11,14,17-テトラオキサ-4,20-ジアザヘキサコサン-26-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,18-ジオキソ-8,11,14-トリオキサ-4,17-ジアザペンタコサン-25-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、及び
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,21-ジオキソ-8,11,14,17-テトラオキサ-4,20-ジアザオクタコサン-28-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
または、それらの塩がある。
本明細書に記載のチエノピロール化合物は、塩の形態とし得る。化合物の中性形態は、塩を、塩基または酸と接触させて、そして、従来の方法で親化合物を単離することで再生し得る。化合物の親形態は、極性溶媒に対する溶解性など、ある特定の物理的特性において、様々な塩形態とは異なるが、それ以外の点では、当該塩類は、本開示の目的のために、当該化合物の親形態と等価である。
ある特定のチエノピロール化合物は、1つ以上の特定の幾何異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、エピマー、アトロピック、立体異性体、互変異性体、配座異性体、または、アノマーの形態で存在し得るものであり、シス形及びトランス形、E形及びZ形、c形、t形及びr形、エンド形及びエキソ形、R形、S形及びメソ形、D形及びL形、d形及びl形、(+)形及び(-)形、ケト形、エノール形及びエノラート形、シン形及びアンチ形、シンクリナル形及びアンチクリナル形、a形及びβ形、アキシアル形及びエクアトリアル形、舟形、椅子型、ねじれ形、エンベロープ形、及び、半いす形、ならびに、これらの組合せなどがあるが、それらに限定されず、以下では、「異性体(isomer)」(または、「異性体形態(isomeric forms)」)と総称する。
開示した化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼを阻害するために使用し得る。開示した化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を阻害し得る。Oplophorus由来ルシフェラーゼは、野生型Oplophorusルシフェラーゼ、または、配列番号2のルシフェラーゼなどのOplophorusルシフェラーゼの変異体とし得る。Oplophorusルシフェラーゼ変異体は、米国特許第8,557,970号、及び、同第8,669,103号に記載されており、それら各々の全内容全体を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
本発明の開示した化合物を使用して、ルシフェラーゼへの結合を、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質で競合または干渉することで、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。セレンテラジン基質は、ルシフェラーゼ、及び、その他の生物発光タンパク質によって作用を受け次第に、冷光を発するレポーター分子の群である。セレンテラジン基質の例として、WO2003/040100、米国特許公開第2008/0248511号、及び、米国特許公開第US2012/0117667号に開示されたものに加えて、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、及び/または、類似体、例えば、2-フラニルルメチル-デオキシ-セレンテラジン(フリマジン)、セレンテラジン-n、セレンテラジン-f、セレンテラジン-h、セレンテラジン-hcp、セレンテラジン-cp、セレンテラジン-c、セレンテラジン-e、セレンテラジン-fcp、ビス-デオキシセレンテラジン(「セレンテラジン-hh」)、セレンテラジン-i、セレンテラジン-icp、セレンテラジン-v、及び、2-メチル-セレンテラジン、プロセレンテラジン(すなわち、化合物を、ルシフェラーゼのための基質に変換する、非発光酵素のための基質ではない化合物)、キノンマスクされたセレンテラジンなどがあるが、これらに限定されない。セレンテラジン基質のさらなる例は、例えば、米国公報第2012/0107849号、米国公報第2013/0130289号、米国特許出願第14/608,910号、及び、米国特許出願第14/609,372号に記載されており、それらの各々を本明細書の一部を構成するものとして援用する。
開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ活性を阻害する方法で使用し得る。この方法は、本明細書に開示した化合物を、Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現または含有する細胞と接触させることを含み得るものであって、当該開示した化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。当該方法は、本明細書に開示した化合物を、Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質での結合パートナーと接触させることを含み得るものであって、当該開示した化合物は、融合タンパク質がインタクトである場合に、Oplophorus誘導ルシフェラーゼを阻害する。当該開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼを用いて、酵素の存在、または、活性を検出するために用いるアッセイに使用して、Oplophorusルシフェラーゼ由来のシグナルを選択的に阻害し得る。例えば、それらを、Oplophorusルシフェラーゼ、及び、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質を利用する生物発光法で使用して、試料、例えば、目的のタンパク質(例えば、酵素、結合パートナー、リガンドなど)、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、または、OHラジカル、または、1つ以上の条件、例えば、レドックス条件において、1つ以上の分子を検出し得る。当該セレンテラジン基質は、Oplophorusルシフェラーゼの基質として作用するが、当該開示した化合物は、例えば、複数の生物発光システムの時間多重化を伴う用途、または、幾つかのプレートベース発光アッセイにおいて、発光シグナルの抑制が所望され得る実施形態では、ルシフェラーゼを阻害して、当該シグナルを選択的に抑制するように作用し得る。開示した化合物を使用して、細胞内、及び/または、細胞外Oplophorusルシフェラーゼ活性を阻害し得る。
本明細書に開示した式(I)の化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼの阻害剤として使用し得る。加えて、当該開示した化合物は、阻害効力に影響を与えることなく、酵素ポケットから溶媒へと延びる官能基を含み得る。当該官能基は、上記したL1、L2、または、L3基などのリンカーによって、ルシフェラーゼ阻害剤分子に結合し得る。例として、式(I)の化合物は、C1-C10ハロアルキル基(式(Ic)の化合物など)を有して、HaloTag-NanoLuc(登録商標)融合酵素を阻害し得るものであり、当該化合物は、様々なNanoLuc(登録商標)アッセイ(カスパーゼ検出など)のバイオセンサーとして使用し得るが、これらに限定されない。式(I)の化合物は、脱離基(式(Id)の化合物など)と、イムノアッセイ(ELISAなど)においてNanoLuc自殺型阻害剤としての機能とを有し得る。式(I)の化合物は、キナーゼ阻害アッセイにおいて使用し得る、キナーゼ阻害剤部分(式(Ie)の化合物など)を含み得る。式(I)の化合物は、蛍光または蛍光発生色素部分(式(If)の化合物など)を含み、これらは、NanoLucベースの細胞選別、及び、標識用途のための蛍光タグとして使用し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示した方法は、試料(例えば、細胞)を、細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞不透過性に改変した本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、当該開示した化合物及び方法を使用して、ハイスループットスクリーニング操作アッセイフォーマットの初期輝度を構築した後に、細胞から排泄され得るあらゆるルシフェラーゼを選択的に阻害して、細胞の外側に発生し得る発光を選択的に阻害し得る。そのような方法は、細胞内でより選択的なシグナルを提供し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示した方法は、試料(例えば、細胞)を、細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞透過性である本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、当該開示した化合物は、細胞に侵入し、そして、細胞内でOplophorusルシフェラーゼを選択的に阻害することができる。そのような方法は、2つ以上のルシフェラーゼの使用を伴う多重アッセイにおいて有利であり、そして、Oplophorusルシフェラーゼからの発光を阻害して、細胞内の別のルシフェラーゼ由来の発光を選択的に確認できるようにし得る。
特定の実施形態では、当該開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質での結合パートナーに連結し得る。これらの実施形態では、当該融合タンパク質がインタクトな場合、連結した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼの生物発光を阻害し得る。融合タンパク質が開裂すると、当該開示した化合物は、ルシフェラーゼの生物発光が阻害されないように、結合パートナーに連結したままとなる。幾つかの実施形態では、当該開示した連結化合物は、HALOTAG(登録商標)-、及び、NanoLuc(登録商標)-をベースした技術で使用し得る。これらの実施形態では、当該開示した化合物を、クロロアルカンに結合させて、HALOTAG(登録商標)タンパク質に結合し得る。したがって、そのような実施形態では、当該開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質における結合パートナーと考えられるHALOTAG(登録商標)タンパク質に連結される。そのような実施形態では、当該開示した化合物は、Nluc-HT融合タンパク質がインタクトの場合に、Oplophorusルシフェラーゼの生物発光を阻害する。Nluc-HT融合タンパク質が開裂すると、当該開示した化合物は、HTタンパク質に連結されたままであり、そして、Nluc生物発光は抑制を受ける。
当該開示した化合物は、遺伝子転写レポーター系と共に使用し得る。特定の実施形態では、試料に含まれるプロモーターの活性を測定する方法を提供し、当該プロモーターは、Oplophorus由来ルシフェラーゼ、または、その変異体をコードする遺伝子に作動可能に連結される。この方法は、(a)試料を、セレンテラジン基質と接触させ、(b)当該試料の発光を測定することによって、プロモーターの活性を決定することを含み、当該試料は、プロモーターを含む。当該方法は、当該試料を、本明細書に記載の化合物と接触させて、発光を選択的に阻害する工程をさらに含み得る。当該プロモーターは、翻訳融合または転写融合を介して、遺伝子に作動可能に連結し得る。目的とする生物学的経路は、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む細胞を、当該経路の誘導剤で処理して調べ得る。次いで、このプロモーター活性を測定し、そして、モニターして、プロモーターの活性と目的とする当該経路との間のあらゆる相関を検討し、そして、遺伝子発現に関連する動態測定(例えば、誘導性、抑制、及び、活性化)を行い得る。本明細書に記載の化合物を使用して、発光を選択的に阻害することができる。
当該開示した化合物を使用して、その他のルシフェラーゼ及びアッセイを用いる時間的な多重化に適用する際に、Oplophorusルシフェラーゼを阻害し得る。幾つかの実施形態では、Oplophorus由来ルシフェラーゼ、または、その変異体は、異なる波長で発光する別の酵素(例えば、ルシフェラーゼ)、例えば、緑色ホタルルシフェラーゼ、例えば、Photinus pyralis(例えば、Luc2;Promega Corp)、または、赤色コメツキムシルシフェラーゼ(CHROMA-LUC(商標)ルシフェラーゼ;Promega Corp.)を用いて多重化し得る。例えば、Oplophorusルシフェラーゼを、機能的レポーターとして使用する場合には、緑色ホタルルシフェラーゼ、または、赤色CHROMA-LUC(商標)ルシフェラーゼを用いて、遺伝子調節に関する非特異的な効果を制御することができ、または、トランスフェクション効率について正規化することができる。幾つかの実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼから生成される発光(約460nm)、及び、赤色CHROMA-LUCから生成される発光(約610nm)は、波長識別フィルターを具備するルミノメーターを用いて容易に分割することができ、同じ試料からの双方のシグナルの測定を可能にする。そのような実施形態では、本明細書に記載の化合物を使用して、Oplophorusルシフェラーゼを選択的に阻害することができ、その結果、その他のルシフェラーゼからのシグナルを、選択的に確認することができる。
当該開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼが、リガンド-タンパク質、及び/または、タンパク質-タンパク質の相互作用を検出するために使用するあらゆる方法で使用し得る。様々な実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼを使用して、エネルギーを、エネルギーアクセプターに移動し得る。そのような方法の1つが、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)である。BRETに関して、生物発光ドナーから蛍光アクセプターへのエネルギー移動は、発光のスペクトル分布にてシフトを生じる。このエネルギー移動は、タンパク質-タンパク質、または、リガンド-タンパク質のin vitroまたはin vivoでの相互作用のリアルタイムのモニタリングを可能にする。幾つかの実施形態では、このBRET法は、リガンド-タンパク質、及び/または、タンパク質-タンパク質の相互作用に関する、Nlucが介在する生物発光共鳴エネルギー移動(NanoBRETなど)アッセイとし得る。NANOBRET(商標)は、2つの異なる方法、すなわち、1)HALOTAG(登録商標)-、及び、NanoLuc(登録商標)-ベースの技術を利用して、シグナルの増大とスペクトルの減退との重複を達成し得る、タンパク質-タンパク質、及び/または、リガンド-タンパク質の相互作用を検出する生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)と、2)目的のタンパク質に融合したNlucルシフェラーゼと、蛍光トレーサーを利用して、生体細胞でのリガンド-受容体の相互作用を検出する方法とを含む。
幾つかの実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼを、循環置換型(CP)、または、直鎖開裂型(SS)の発光酵素融合タンパク質において、タンパク質の近接の程度を測定し得る。Oplophorusルシフェラーゼを、プロテアーゼ基質のアミノ酸配列(例えば、TEV)の挿入を介して置換または開裂して、低度の生物発光を生成する。不活性ルシフェラーゼを、(例えば、遺伝子融合を介して)モニタータンパク質に連結する。相互作用する可能性のあるタンパク質は、(例えば、遺伝子融合を介して)プロテアーゼ(例えば、TEV)に連結する。2つのモニタータンパク質が、相互作用、または、十分に近接する(例えば、構成的な相互作用、薬剤刺激、または、経路の応答を介して)と、発光酵素が切断されて、高度な生物発光活性を生成する。その例を、細胞または生化学アッセイにおいて、タンパク質近接の測定に適用し得る。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、バイオセンサーとして、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質において使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、酵素活性を測定するために、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質において使用し得る。特定の実施形態では、当該開示した化合物は、プロテアーゼ活性を測定するために、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質において使用し得る。幾つかの実施形態では、当該プロテアーゼを、カスパーゼタンパク質とし得る。幾つかの実施形態では、目的とする融合タンパク質は、プロテアーゼ感受性リンカーによってタンパク質に結合したOplophorusルシフェラーゼを含み得る。例として、Nlucは、DEVDリンカー(Nluc-DEVD-HT)によって、HALOTAG(登録商標)タンパク質に結合し得るが、これらに限定されない。これらの実施形態では、当該インタクトなNluc-DEVD-HT融合タンパク質は、Nluc基質の存在下で、高レベルの生物発光を発する。これらの実施形態では、当該DEVDリンカーは、カスパーゼの活性化がHTからのNlucの分離をもたらすような、カスパーゼ媒介開裂を受けやすい。幾つかの実施形態では、本明細書に開示した化合物を使用して、Nluc-DEVD-HT融合タンパク質からの生物発光を阻害し得る。カスパーゼを活性化すると、HT阻害剤複合体からNlucが分離し、それにより、生物発光が増大する。
幾つかの実施形態では、例えば、タンパク質相補アッセイ(PCA)または酵素断片化アッセイなど、リガンド-タンパク質、及び、タンパク質-タンパク質の相互作用、または、近接性を検出するためのその他の方法で、そのようなルシフェラーゼを使用する場合に、当該開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼを阻害するために使用し得る。タンパク質相補アッセイ(PCA)は、2つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、それらの融合パートナーの結合相互作用を介して互いに極めて接近したときにのみ光を発し、機能的な活性タンパク質に再構成することができる、目的とするポリペプチドに融合した同じタンパク質、例えば、酵素の2つの断片を利用する。幾つかの実施形態では、NANOBIT(登録商標)技術(Promega Corporation)を使用して、酵素の成分またはサブユニットの結合相互作用を介した発光酵素の再構成による分子の近接を検出し得る。NanoBiT(登録商標)システムは、目的とする標的タンパク質への融合として発現される2つのサブユニットを含み得る。当該2つのサブユニットは、ラージBiT(LgBiT;18kDa)、及び、スモールBiT(SmBiT;1.3kDa)を含み得る。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、それぞれの結合パートナー、例えば、FRB及びFKBPに融合した完全長の循環置換型発光酵素と共に使用し得るものであり、そして、タンパク質相補型アッセイで使用し得る。本明細書で開示した方法と従来のタンパク質相補性との間での重要な相違点は、相補性は無く、むしろ、2つの全長酵素、例えば、循環置換型発光酵素の二量体化が認められた、ことにある。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するために使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、NanoLuc(登録商標)-、及び、HALOTAG(登録商標)-ベースの技術を使用して、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するために使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ融合タンパク質の単離に使用するための薬物、ヌクレオチド類、糖類、タンパク質、ポリマー、及び、固体表面などの様々な生体分子及び巨大分子に付加し得る。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、Oplophorusルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺型阻害剤として使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、リガンド-受容体結合アッセイに適用される自殺型阻害剤として使用し得る。特定の実施形態では、当該開示した化合物を、ELISAにおける自殺型阻害剤として適用し得る。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、細胞取り込み、または、細胞の選別及び標識における使用のために、薬物、ヌクレオチド類、糖類、タンパク質、ポリマー、固体表面などの様々な生体分子、及び、巨大分子に付加し得る。例えば、モノクローナル抗体(例えば、Nluc-トラスツズマブ)を化学的にコンジュゲートさせ、そして、SKBR3細胞の表面に発現したHER2レセプターに結合させることができる。細胞不透過性Nluc阻害剤は、細胞外Nluc-トラスツズマブを阻害するために適用し得る。セレンテラジン基質を添加すると、シグナル獲得アッセイを使用して、活性/受動的に内在化したトラスツズマブ-Nluc-HER2受容体を動的に測定することができ、この適用は、その他の抗体、タンパク質、受容体、薬物、薬物担体、ペプチド、糖類、脂肪酸、ナノ粒子、または、Nlucに化学的にコンジュゲートしたその他の生体分子にも及ばせることができる。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、キナーゼ阻害アッセイでの使用のためにキナーゼ阻害剤に付加し得る。当該開示した化合物を、キナーゼ阻害剤に付加し、そして、細胞シグナリング、細胞の分裂及び増殖、発生、分化、及び、細胞死などのキナーゼによって調節される細胞プロセスをモニターするためのアッセイにおいて使用し得る。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、疎水性タグ付け(HyT)、または、タンパク質分解-標的化キメラ(PROTAC)タグ付け(Lai et al.,Nature Reviews Drug Discovery,2017,16,101-114)のいずれかを通じて、生体細胞内のタンパク質分解経路を動員し得る小分子の部分を含み得る。例えば、当該開示した化合物は、HyTまたはPROTAC部分に付加したルシフェラーゼ阻害剤構造を含み得る。そのような化合物は、ルシフェラーゼ融合タンパク質(NanoLuc(登録商標)融合タンパク質など)に結合し、そして、これらの融合タンパク質を分解のために標的化し得る。したがって、本明細書に開示した化合物は、細胞環境におけるルシフェラーゼ融合タンパク質の薬理学、及び、機能の研究において使用し得る。
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、ニトロベンズオキサジアゾール(NBD)色素部分などのタンパク質標識部分を含み得る。標的タンパク質(ルシフェラーゼなど)に結合すると、開示した化合物のタンパク質標識部分は、当該ルシフェラーゼの特定のアミノ酸と反応して、蛍光標識を形成し得る。例えば、幾つかの開示した化合物は、NBD基を含んでおり、このものは、NanoLucでのリシン78などのルシフェラーゼにおけるリシン残基と反応して、NanoLucに蛍光標識を形成し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、エーテル結合を介して付加したNBD基を有する蛍光体ではない。しかしながら、当該標的タンパク質に結合した後に、当該エーテル結合は、当該標的タンパク質のリシン残基のアミノ基とNBD基との間に形成したアミン結合と置換され、そして、得られる標識は蛍光性であり得る(例えば、約478nmでの励起、約530nmでの発光)。したがって、本明細書に開示した化合物は、蛍光アフィニティー標識用途に順次使用し得る(Yamaguchi et al.,Chemical Science,2014,5,1021-1029)。
で表される、ニトロベンズオキサジアゾール(NBD)色素部分を含む。幾つかの実施形態では、当該標的タンパク質は、NanoLuc(登録商標)融合タンパク質などの、Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質である。幾つかの実施形態では、当該タンパク質標識部分は、蛍光色素などの色素である。幾つかの実施形態では、当該共有結合を、当該標的タンパク質のリシン残基のアミノ基と当該タンパク質標識部分との間に形成する。幾つかの実施形態では、当該方法は、当該標的タンパク質のリシン残基のアミノ基と、当該開示した化合物との反応を許容する、ことをさらに含む。幾つかの実施形態では、当該方法は、当該共有結合を形成した後に、当該標的タンパク質の蛍光を検出する、ことをさらに含む。
当該開示した化合物は、生物学的成分を含有する試料と共に使用し得る。当該試料は、細胞を含み得る。当該試料は、成分(インタクトな細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官、エキソソーム、及び、これらの混合物を含む)の異種混合物、または、成分(例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸または糖質ポリマー、または、脂質膜複合体)の単一成分、または、同種群を含み得る。当該開示した化合物は、一般的に、使用の濃度内で、生体細胞、及び、その他の生物成分に対して非毒性とし得る。
開示したものは、1つ以上の酵素(例えば、OplophorusまたはOplophorus変異体ルシフェラーゼ)の存在または活性を決定するためのキットである。当該キットは、以下の1つ以上を含み得る。OplophorusまたはOplophorus変異体ルシフェラーゼを阻害し得る本発明の化合物または組成物、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質、OplophorusまたはOplophorus変異体ルシフェラーゼ、発光アッセイを実施するための説明書、及び、反応緩衝液(複数可)。当該反応緩衝液は、非ルシフェラーゼ酵素反応、及び、発光酵素反応のための個々の製剤に存在し得るものであり、または、単一工程アッセイのための単一製剤に存在し得る。また、当該キットは、非ルシフェラーゼ酵素(複数可)のためのその他の阻害剤、活性化剤、及び/または、増強剤を含み得る。また、当該キットは、このアッセイのためのポジティブ、及び/または、ネガティブコントロールを含み得る。
ハロアルカン基(例えば、クロロアルカン基)を有する式(I)の化合物は、スキーム1に従って合成することができる。その他の適切な合成方法は、2016年6月24日に出願され、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、米国特許出願第15/192,420号、Duellman et al.,”THIENOPYRROLE COMPOUNDS AND USES THEREOF,”に開示されている。
3-(3-アミノフェニル)プロパン酸(3.0g、18.2mmol)を含むメタノール(60mL)の溶液に対して、クロロトリメチルシラン(2.0g、18.2mmol)を加えた。この溶液を、室温で、18時間撹拌した。この混合物を濃縮し、メタノールに再溶解し、そして、再濃縮した(2×)。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的の生成物(3.5g、粗製)を、褐色の固形物として得た。ESI MS m/z 180 [M + H]+.
以下の実施例は、クロロアルカンに付加して、Nluc-HT融合タンパク質を強力に阻害する阻害剤の使用を提供する。Nluc、Nluc-HaloTag(HT)、及び、Nluc-HT-TMR(TMRクロロアルカンに結合したNluc-HT)を、PBS/0.05%BSAで、0.05nMの最終濃度にまで希釈し、そして、指示濃度のJRW-0308と共に、室温で、2時間、インキュベートした。BMG Clariostarプレートリーダーを使用して、フリマジン(10μMの最終濃度)を添加した後に、試料の分析をした。図1は、JRW-0308が、Nluc-HT融合タンパク質を強力に阻害するのに対して、Nlucだけを阻害、及び、Nluc-HT-TMRを阻害するには、高濃度を要することを実証している。TMRそれ自体は、クロロアルカン基を含んでおり、このものは、HTへの結合についてJRW-0308のクロロアルカン基と競合する。そのため、Nluc-HT-TMR融合タンパク質を阻害するためには、より高濃度のJRW-0308が必要となる。
HeLa細胞を、Nluc、または、Nluc-HTのための発現構築物でリバーストランスフェクトし、プレーティングし(20,000細胞/100μLの増殖培地)、そして、24時間、インキュベートした。次いで、増殖培地を、50μlのOptiMEM(500nMのNanoBRET(商標)618リガンド(Nluc-HT-618)を任意に含む)と交換し、続いて、37℃で、30分間、インキュベーションをした。次いで、これらの細胞を、37℃で、2時間、JRW-0308の段階希釈物を含む50μlのOptiMEMで処理した。50μLのOptiMEMで190μMの最終濃度にしたフリマジンを添加した後に、BMG Clariostarプレートリーダーを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図2Aは、JRW-0308が、Nluc-HT融合タンパク質を強力に阻害するのに対して、Nlucの阻害には高濃度を要する、ことを示している。図2Bは、Nluc-HT、及び、Nluc-HT-618の阻害を示す。また、NanoBRET(商標)618リガンドは、HTへの結合について、JRW-0308と競合するクロルアルカン基を含む。そのため、Nluc-HT-618の阻害には、高濃度のJRW-0308を必要とする。
同じNluc-DEVD-HT融合タンパク質を使用してカスパーゼ活性を測定するための2つの主要な方法を試験した。これらの方法を、図3に示している。左側の図は、発光強度をベースとした方法を示す。発光強度をベースとした方法は、融合タンパク質がインタクトの場合に、Nluc生物発光を阻害する。カスパーゼ活性の増大は、当該Nluc-DEVD-HT融合タンパク質の開裂、そして、その結果、Nluc阻害剤とNlucとの解離をもたらす。このカスパーゼ活性の増大によって、Nlucの脱抑制を招いて、放出される生物発光を増大させる。右側の図は、BRETをベースとしたセンサーを示しており、NlucとHT-色素コンジュゲートとの間にBRETが出現する。カスパーゼが活性化されておらず、かつ、融合タンパク質が開裂されずに存在している場合に、このBRETシグナルは最大となる。カスパーゼが活性化すると、当該Nluc-DEVD-HT融合物は開裂して、BRETの減少を招く。図4は、当該強度をベースとしたアッセイと、図3に記載の当該BRETをベースとしたアッセイとの間の比較を示す。HeLa細胞を、Nluc-DEVD-HTでリバーストランスフェクトし、プレーティングし、そして、一晩、インキュベートした。指示濃度のJRW-0308(緑色で表示)、または、500nM NanoBRET(商標)618リガンド(赤色で表示)を含むOptiMEMで増殖培地を交換し、続いて、37℃で、90分間、インキュベートして標識化を行った。段階希釈のスタウロスポリンを含有する50μLのOptiMEMを添加し、そして、37℃で、7時間、インキュベートして、カスパーゼ活性を誘導した。フリマジン(10μMの最終濃度)を添加した後に、BMG Clariostarを使用してプレートを読み取った。双方の方法について、スタウロスポリンに関する同様のEC50値を求めた。
タンパク質-タンパク質相互作用を、Frb/FKBP会合/解離モデルを用いて測定した。HeLa細胞を、Frb-NL/FKBP-HT(1:4のDNA比)融合のための発現構築物でリバーストランスフェクトし、プレーティングし、そして、一晩、インキュベートした。500nMのNanoBRET(商標)618リガンド、または、指示濃度のJRW-0308を含むOptiMEMで増殖培地を交換し、続いて、37℃で、90分間、インキュベートして標識化した。ラパマイシン及びフリマジンの連続希釈物(10μMの最終濃度)を添加した後に、BMG Clariostarを用いて、これらのプレートを、10分間読み取った。図5Aは、阻害剤が存在しない条件下でのBRETをベースとしたFrb/FKBP相互作用アッセイを示す。FKBP-HTは、ラパマイシンの存在下でFRB-NLに結合し、Nlucを、HT-NanoBRET(商標)618リガンド複合体に近接近させて、BRETを可能にする。これらの条件下で、当該BRETの比は、ラパマイシン濃度の増加に符合して増加し、放出される610nm:460nmの光の比を増大させる。図5Bは、JRW-0308の存在下での同じFrb/FKBP相互作用モデルを示す。低濃度のラパマイシンが存在する条件では、FKBは、FRBに結合せず、Nlucは、HT-JRW-0308複合体と結合しないままとなる。ラパマイシンを添加すると、FKB-HT/FRB-HT相互作用を誘発し、それにより、HT阻害剤複合体がNlucと接触して、シグナルの減少を招く。図5Cは、ラパマイシンが、上記した双方のモデルについて、同様のEC50を示すことを表している。
例示的なコハク酸または臭化物官能化阻害剤のNluc阻害活性を試験した。阻害剤を、OptiMEM+0.1%FBSで、3uMにまで希釈した。NanoLucを、NanoGlo(登録商標)緩衝液+100uMフリマジンで、0.4ng/mlにまで希釈した。50ulの各阻害剤を、50ulのNanoLuc/フリマジン/NanoGlo(登録商標)溶液に加えた。これらの試料を、直ちに、GloMax(登録商標)Multi+セットに入れて、2分間隔で、動的モードで読み取った。図6は、NanoLuc/フリマジン(黒ダイアモンド形)の光出力の動的測定を示す。可逆的阻害剤(JRW-0347)の存在下では、経時的な阻害は同じままである。臭化アルキル(JRW-0548)は、定常状態阻害を示す。また、コハク酸エステルJRW-0544も定常状態の結合を示し、一方で、コハク酸エステルJRW-0552は、予想外にも、時間依存性の阻害を示す。このことは、JRW-0552が、不可逆的な阻害剤である、ことを示す。
以下の実施例は、本明細書で開示した化合物のIC50値を提供する。結果を、表1に示す。NANOLUC(登録商標)酵素を、CO2非依存性培地+10%FBSで、0.4ng/mlにまで希釈して、検出試薬を作製した。次いで、各阻害剤の3倍希釈系列を、当該検出試薬に向けて調製した。「阻害剤なし」のコントロールも、各試料について調製した。各阻害剤希釈物の50ulを、20μMのフリマジンを含有する50ulのNanoGlo(登録商標)緩衝液(最終フリマジン濃度は10μMであり、Kmでもある)と混合し、そして、発光を測定した。各試料を「阻害剤なし」コントロールに対して正規化した。次いで、GraphPad Prism(log[阻害剤]対正規化反応)を用いて、IC50値を決定した。
表1
HEK293細胞を、SRCキナーゼとNanoLucとの融合体をコードするDNAでトランスフェクトした。これらの細胞を、DNA:Fugene HDを1:3の比率にして、トランスフェクトした。24時間の発現後、細胞を、50ug/mLのジギトニンを含むOptiMEMで溶解し、そして、様々な濃度のダサチニブ結合NanoLuc(登録商標)阻害剤(JRW-0577、-0589、-0593、-0595、結果を、図10A~10Dのそれぞれに示す)で処理した。細胞を、段階希釈した未修飾ダサチニブで、同時に処理をした。室温で、2時間、インキュベートした後、フリマジン(10uM)を添加し、そして、発光を、GloMax(登録商標)ルミノメーターで測定した。ダサチニブの結合は、用量依存的な発光の増大の証拠である。
以下の溶液を、TBS+20uMフリマジンで調製した。1)0.4ng/ml NanoLuc、2)0.4ng/ml NanoLuc+0.2nM HaloTag-HiBiT、3)0.4ng/ml NanoLuc+200nM LgBiT。各溶液の50ulを、NanoGlo(登録商標)緩衝液で希釈した100uMのJRW-0552を含有する溶液と三重に合わせた。これらの試料を、直ちに、GloMax(登録商標)+ルミノメーターに仕込み、そして、2分間の間隔で、50分間、動的モードで読み取った。
Aは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
L1は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m1-であり、式中、m1は、1~100であり、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基は、ヘテロ原子、または、O、N(Ra3)、S(=O)、及び、S(=O)2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換しており、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基は、C(=O)で置換しており、任意の隣接する2つのCRa1Ra2基が、CRa1=CRa1を形成し、そして、任意に、1つ以上のCRa1Ra2基を、-Cy-基で置換しており、各Cyは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ra1、Ra2、及びRa3は、独立して、水素、及び、C1-C4-アルキルからなる群から選択され、
Zは、C1-C10ハロアルキル、脱離基Y、生物活性剤、または、色素であり、前記脱離基Yは、OR4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
R1は、水素、または、C1-C8アルキルであり、
R2は、水素、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
R3は、水素、または、C1-C8アルキルであり、及び
R4は、任意に置換されたC1-C8アルキル、任意に置換されたC3-C8-シクロアルキル、任意に置換されたC3-C8-シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される、前記化合物、または、その塩。
Aは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2が、少なくとも1つのC1-C4アルキル、または、C1-C4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
L2は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m2-であり、式中、m2は、1~90であり、各CRa1Ra2は、条項1で定義した通りである、条項1に記載の化合物。
Aは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2が、少なくとも1つのC1-C4アルキル、または、C1-C4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり
tは、0または1であり、
vは、0または1であり、及び
L3は、存在せず、または、-(CRa1Ra2)m3-であり、式中、m3は、1~80であり、各CRa1Ra2は、条項1で定義した通りである、条項1に記載の化合物。
式中、
Q1は、存在せず、O、または、NHであり、
Q2は、存在せず、
、-CO-NH-、-CH2-CH2-CO-、-CH2-CH2-NH-CO、または、-CH2-CH2-CO-NH-であり、
Q3は、存在せず、-CO-NH-、または、-CH2-CH2-であり、
k1は、1~10であり、
k2は、0~10であり、及び、
k3は、0~10である、条項9に記載の化合物。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、及び
L3は
または
である、条項13に記載の化合物。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、メチル、エチル、-CH2Br、及び、-CH2CH2CH2Brからなる群から選択される1つの置換基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり
tは、0または1であり、
vは、0または1であり、及び
L3は、存在せず、C1-C4アルキレン、
である、条項16に記載の化合物。
であり、及び、
Zが、
であり、または
L3が、C1-C4アルキレンであり、及び、Zは、クロロ、ブロモ、または、ヨードである、条項16~17のいずれかに記載の化合物。
Aは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、
L3は、
または
であり、及び
Zは、
であり、または
L3は、
または
であり、及び
Zは、
である、請求項22~23のいずれかに記載の化合物。
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R2は、1つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Rx及びRyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、C1-C4アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、
L3は、存在せず、
であり、及び
Zは、
である、条項25に記載の化合物。
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ)「3,2-b]ピロール-5-(カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコン-2-エン-1-イル(1-(トランス-4)-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコン-2-エン-1-イル(1-(トランス-4)-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン19-イル)カルバメート、
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10)-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル))-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2 -((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル-1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-(カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15-ジオキサ-2,9-ジアザオクタデカン-18-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18-トリオキサ-2,9-ジアザヘニコサン-21-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21-テトラオキサ-2,9-ジアザテトラコサン-24-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17-ジオキサ-2,11-ジアザイコサン-20-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-((1r,4r)-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル))-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20-トリオキサ-2,11-ジアザトリコサン-23-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20,23-テトラオキサ-2,11-ジアザヘキサコサン-26-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21,24,27,30,33-オクタオキサ-2,9-ジアザヘキサトリアコンタン-36-オアート、
N-(トランス-4-((6-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-3,13-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,14-ジアザイコサン)-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
メチル トランス-4-(4-(2-((3-(ブロモメチル)フェニル)(エチル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキシラート、
メチル トランス-4-(4-(2-((3-(3-ブロモプロピル)フェニル)(エチル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキシラート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
メチル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
メチル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
フェニル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
フェニル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((6-ヨードヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-ブロモヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-ヨードオクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
4-フルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
3,5-ジフルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキサミド)オクタノアート、
4-シアノフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
ナトリウム 1-((8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノイル)オキシ)-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホナート、
N-(トランス-4-((5-(2-クロロアセトアミド)ペンチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(2-クロロアセトアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
2,3,5,6-テトラフルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
N-(トランス-4-((5-(2-ブロモアセトアミド)ペンチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ))-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル))-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,18-トリオキソ-12,15,22-トリオキサ-2,9,19-トリアザテトラコサン-24-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,24-トリオキソ-12,15,18,21,28-ペンタオキサ-2,9,25-トリアザトリアコンタン-30-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,23-ジオキソ-3,10,13,16,19-ペンタオキサ-6,22-ジアザオクタコサン-28-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
5-((6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル ジアセタート、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン)-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-(カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-(カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5,6-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン)-5-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3’,6’-ジアミノ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5,6-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-イル)-1,11-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,12-ジアザオクタデカン-18-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-イル)-1,11-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,12-ジアザイコサン-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-イル)-1,11-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,12-ジアザイコサン-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(6-((Z)-2)-(E)-3-(1,1-ジメチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-3λ4-ピロロ)[3,2,1-ij]キノリン-2-イル)アリーリデン)-1-メチル-1,2,5,6-テトラヒドロ-4H-ピロロ[3,2,1-ij]キノリン-1-イル)ヘキサンアミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((8-(4’,5’-ジクロロ-3’,6’-ジヒドロキシ-2’,7’-ジメトキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5,6-カルボキサミド)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N1-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)-N4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-13,16-ジオキサ-2,9-ジアザオクタデカン-18-イル)スクシンアミド、
N1-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)-N4-(8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクチル)スクシンアミド、
N1-(2-(5,5-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5H-5λ4,6λ4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-10-イル)エチル)-N4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,12-ジオキソ-15,18-ジオキサ-2,11-ジアザイコサン-20-イル)スクシンアミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4 -((6-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)オクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((6-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)オキシ)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
4-(2-エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,18-ジオキソ-8,11,14-トリオキサ-4,17-ジアザトリコサン-23-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,21-ジオキソ-8,11,14,17-テトラオキサ-4,20-ジアザヘキサコサン-26-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,18-ジオキソ-8,11,14-トリオキサ-4,17-ジアザペンタコサン-25-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、及び
4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-(((R)-3-((3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-((4-(4-メチルチアゾール-5-イル)ベンジル)カルバモイル)ピロリジン-1-カルボニル)-2,2-ジメチル-5,21-ジオキソ-8,11,14,17-テトラオキサ-4,20-ジアザオクタコサン-28-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、または、
それらの塩、からなる群から選択する、条項1に記載の化合物。
(a)前記試料を、セレンテラジン基質と条項1~36のいずれかに記載の化合物とに接触させ、及び、
(b)前記試料でのルシフェラーゼを検出する、ことを含み、
条項1~27のいずれかに記載の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの発光の抑制を招く、前記方法。
(a)前記試料を、セレンテラジン基質と条項1~27のいずれか1項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片と第1のタンパク質を含む、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片と第2のタンパク質を含む、前記第2のポリヌクレオチドを含み、及び
(b)前記試料での発光を検出する、ことを含み、
前記発光の検出が、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との間の相互作用を示す、前記方法。
(a)前記試料を、セレンテラジン基質と条項1~27のいずれか1項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼと第1のタンパク質とを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む、前記第2のポリヌクレオチドを含み、及び
(b)前記試料に含まれる生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出する、ことを含み、このことは、前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターとの相互作用または近接近を示す、前記方法。
(a)前記試料を、セレンテラジン基質と条項1~27のいずれか1項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、プロテアーゼ感受性Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含み、
(b)発光を測定し、
(c)プロテアーゼを活性化し、及び
(d)前記発光の測定を反復する、ことを含み、
工程(d)での発光の増大は、プロテアーゼ活性の増大を示す、前記方法。
(a)前記試料を、セレンテラジン基質と条項1~27のいずれか1項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、プロテアーゼ感受性Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質とエネルギー受容体とを含み、
(b)前記BRET比を測定し、
(c)プロテアーゼを活性化し、及び
(d)前記BRET比の測定を反復する、ことを含み、
工程(d)でのBRET比の減少は、プロテアーゼ活性の増大を示す、前記方法。
(a)前記試料を、条項1~27のいずれか1項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含み、
(b)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉し、
(c)工程(b)で捕捉した前記Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離する、ことを含む前記方法。
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ、を含むキット。
細胞を、条項1~27のいずれか1項に記載の化合物と接触させることを含み、前記細胞が、ルシフェラーゼ融合タンパク質及び少なくとも1つのプロテアーゼを含み、
それにより、前記融合タンパク質が、前記プロテアーゼによって分解される、前記方法。
標的タンパク質を、条項1に記載の化合物と接触させることを含み、Zが、-OR4であり、R4が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または、任意に置換された複素環であり、
それにより、前記標的タンパク質が、R4と共有結合を形成する、前記方法。
(a)試料の第1の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)シグナルを検出し、前記試料が、
(i)融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記ポリヌクレオチド、
(ii)セレンテラジン基質、
(iii)条項1~27のいずれか1項に記載の化合物、及び
(iv)蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサーを含み、
(b)前記試料を、目的とする分子と接触させ、及び
(c)前記試料に含まれる第2のBRETシグナルを検出し、前記第1のBRETシグナルと比較して、前記第2のBRETシグナルが減少することは、前記目的とする分子と前記標的タンパク質との間の相互作用を示す、前記方法。
(a)前記試料を、セレンテラジン基質、条項1~27のいずれか1項に記載の化合物、及び、HALOTAG(登録商標)リガンドと接触させ、前記HALOTAG(登録商標)リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、前記試料は、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼ、及び、第1の標的タンパク質を含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである前記第1のポリヌクレオチド、
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質は、HALOTAG(登録商標)タンパク質、及び、第2の標的タンパク質を含む前記第2のポリヌクレオチドを含み、
(b)前記試料の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出し、それにより、相互作用を検出し、あるいは、前記第1の標的タンパク質と前記第2の標的タンパク質とが近接近していることを示す、前記方法。
配列番号1-天然の成熟したOplophorusルシフェラーゼアミノ酸配列
FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADIHVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFR-VTINGVTGWRLCENILA
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕式(I)の化合物、または、その塩であって、
式中、
Aは、存在しないか、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
L 1 は、存在しないか、または、-(CR a1 R a2 ) m1 -であり、式中、m1は、1~100であり、1つ以上のCR a1 R a2 基は、O、N(R a3 )、S(=O)、及び、S(=O) 2 からなる群から選択されるヘテロ原子もしくはヘテロ原子基で置換されてもよく、1つ以上のCR a1 R a2 基は、C(=O)で置換されてもよく、隣接する2つのCR a1 R a2 基が、CR a1 =CR a1 を形成してもよく、かつ、1つ以上のCR a1 R a2 基が、-Cy-基で置換されてもよく、各Cyは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、R a1 、R a2 、及びR a3 は、独立して、水素、及びC 1 -C 4 -アルキルからなる群から選択され、
Zは、C 1 -C 10 ハロアルキル、脱離基Y、生物活性剤、または、蛍光色素もしくは蛍光発生色素であり、前記生物活性剤は酵素阻害剤、受容体阻害剤、及びタンパク質分解を誘導する部分からなる群から選択され、Zはキナーゼ阻害剤であってもよく、前記脱離基Yは、OR 4 、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
R 1 は、水素、または、C 1 -C 8 アルキルであり、
R 2 は、水素、任意に置換されたC 1 -C 8 アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
R 3 は、水素、または、C 1 -C 8 アルキルであり、及び
R 4 は、任意に置換されたC 3 -C 8 -シクロアルキル、任意に置換されたC 3 -C 8 -シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルであり、ここで、任意に置換された基とは、ハロ基、ペルフルオロアルキル基、ペルフルオロアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、ハロ基、オキソ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルコキシ基、ニトロ基、アジドアルキル基、スルホン酸基、アリールもしくはヘテロアリール基、アリールオキシもしくはヘテロアリールオキシ基、アラルキルもしくはヘテロアラルキル基、アラルコキシもしくはヘテロアラルコキシ基、HO-(C=O)-基、複素環式基、シクロアルキル基、アミノ基、アルキル-及びジアルキル-アミノ基、カルバモイル基、アルキルカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、ジアルキルアミノカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又はこれらの塩形態から選択される基で任意に置換されるものである、
前記化合物、または、その塩。
〔2〕R 1 が、水素、C 1 -C 8 アルキル、ハロ-C 1 -C 8 -アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及び、アリールアルキルからなる群から選択される、前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕R 2 が、任意に置換されたアリールであるか、又はR 2 が、C 1 -C 4 アルキル、シアノ、アミド、C 1 -C 4 アルコキシ、C 1 -C 4 ハロアルキル、及び、ヒドロキシアルキルからなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されているフェニルである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔4〕式(Ia)を有する化合物であって、
式中、
Aは、存在しないか、フェニル環、または、チエニル環であり、
R 2 が、少なくとも1つのC 1 -C 4 アルキル、または、C 1 -C 4 ハロアルキルで置換されているフェニルであり、及び
L 2 は、存在しないか、または、-(CR a1 R a2 ) m2 -であり、式中、m2は、1~90であり、各CR a1 R a2 は、前記〔1〕で定義した通りである、
化合物、又は式(Ib)を有する化合物であって、
式中、
Aは、存在しないか、フェニル環、または、チエニル環であり、
R 2 が、少なくとも1つのC 1 -C 4 アルキル、または、C 1 -C 4 ハロアルキルで置換されているフェニルであり、
R x 及びR y は、各々の存在時に、独立して、水素、または、C 1 -C 4 アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり
tは、0または1であり、
vは、0または1であり、及び
L 3 は、存在しないか、または、-(CR a1 R a2 ) m3 -であり、式中、m3は、1~80であり、各CR a1 R a2 は、前記〔1〕で定義した通りである、
化合物である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔5〕L 3 は、-(CR a1 R a2 ) m3 -であり、式中、m3は、1~20であり、及び、R a1 及びR a2 は、各々の存在時に、独立して、水素、または、C 1 -C 4 アルキルであるか、又は
L 3 が、-Q 1 -(CH 2 -CH 2 -O) k1 -Q 2 -(CH 2 -CH 2 -O) k2 -Q 3 -(CH 2 -CH 2 -O) k3 -であり、
式中、
Q 1 は、存在しないか、O、または、NHであり、
Q 2 は、存在しないか、
、-CO-NH-、-CH 2 -CH 2 -CO-、-CH 2 -CH 2 -NH-CO、または、-CH 2 -CH 2 -CO-NH-であり、
Q 3 は、存在しないか、-CO-NH-、または、-CH 2 -CH 2 -であり、
k1は、1~10であり、
k2は、0~10であり、及び、
k3は、0~10であるか、又は
L 3 が、
及び
からなる群から選択される、
前記〔4〕に記載の化合物。
〔6〕Zが、C 1 -C 10 ハロアルキルであり、Zが、-(CH 2 ) 6 -Clであってもよく、又は
Zが、OR 4 、ハロゲン、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルからなる群から選択される脱離基Yである、
前記〔1〕に記載の化合物。
〔7〕ZがC 1 -C 10 ハロアルキルである場合、式(Ic)を有する化合物であって、
式中、
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R 2 は、1つのメチル、または、エチル基で置換されているフェニルであり、
R x 及びR y は、各々の存在時に、独立して、水素、または、C 1 -C 4 アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、及び
L 3 は
または
である、
前記〔6〕に記載の化合物。
〔8〕Zが脱離基Yである場合、式(Id)を有する化合物であって、
式中、
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R 2 は、メチル、エチル、-CH 2 Br、及び、-CH 2 CH 2 CH 2 Brからなる群から選択される1つの置換基で置換されているフェニルであり、
R x 及びR y は、各々の存在時に、独立して、水素、または、C 1 -C 4 アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり
tは、0または1であり、
vは、0または1であり、及び
L 3 は、存在しないか、C 1- C 4 アルキレン、
、
、
、
または
である、
前記〔6〕に記載の化合物。
〔9〕(a) Zが、クロロ、ブロモ、ヨード、C 1- C 4 アルコキシ、フェノキシ、
であるか、
(b) L 3 は、存在しないか、
、
、
または
であり、及び
Zが、C 1- C 4 アルコキシ、フェノキシ、
であるか、
(c) L 3 が、-CH 2 -CH 2 -、または、
であり、及び、Zが、
であるか、もしくは
L 3 が、C 1 -C 4 アルキレンであり、及び、Zが、クロロ、ブロモ、または、ヨードであるか、又は
(d) tが、0であり、
vが、0であり、
L 3 が、存在せず、及び
Zが、ブロモ、ヨード、または、
である、
前記〔8〕に記載の化合物。
〔10〕式(Ie)を有する化合物であって、
式中、
Aは、存在しないか、フェニル環、または、チエニル環であり、
R 2 は、1つのメチル、または、エチル基で置換されているフェニルであり、
R x 及びR y は、各々の存在時に、独立して、水素、または、C 1 -C 4 アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、
L 3 は、
または
であり、及び
Zは、
であり、または
L 3 は、
または
であり、及び
Zは、
である、
前記〔1〕に記載の化合物。
〔11〕Zが、蛍光色素又は蛍光発生色素である、前記〔1〕に記載の化合物であって、式(If’)を有する化合物であってもよく、
式中、
Aは、フェニル環、または、チエニル環であり、
R 2 は、1つのメチル、または、エチル基で置換されているフェニルであり、
R x 及びR y は、各々の存在時に、独立して、水素、または、C 1 -C 4 アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または、10であり、
L 3 は、存在しないか、
、
または
であり、及び
Zは、
である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔12〕前記化合物が、
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ)「3,2-b]ピロール-5-(カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコント-2-エン-1-イル(1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコント-2-エン-1-イル(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル)カルバメート、
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10)-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル))-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-(カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15-ジオキサ-2,9-ジアザオクタデカン-18-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18-トリオキサ-2,9-ジアザヘニコサン-21-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21-テトラオキサ-2,9-ジアザテトラコサン-24-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17-ジオキサ-2,11-ジアザイコサン-20-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-((1r,4r)-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル))-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20-トリオキサ-2,11-ジアザトリコサン-23-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20,23-テトラオキサ-2,11-ジアザヘキサコサン-26-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21,24,27,30,33-オクタオキサ-2,9-ジアザヘキサトリアコンタン-36-オアート、
N-(トランス-4-((6-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-3,13-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,14-ジアザイコサン)-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
メチル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
メチル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
フェニル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
フェニル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((6-ヨードヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-ブロモヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-N-(トランス-4-((8-ヨードオクチル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
4-フルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
3,5-ジフルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキサミド)オクタノアート、
4-シアノフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
ナトリウム 1-((8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノイル)オキシ)-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホナート、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ))-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル))-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,18-トリオキソ-12,15,22-トリオキサ-2,9,19-トリアザテトラコサン-24-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,24-トリオキソ-12,15,18,21,28-ペンタオキサ-2,9,25-トリアザトリアコンタン-30-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,23-ジオキソ-3,10,13,16,19-ペンタオキサ-6,22-ジアザオクタコサン-28-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
5-((6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル ジアセタート、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
又はそれらの塩、からなる群から選択される、前記〔1〕に記載の化合物。
〔13〕Oplophorus由来ルシフェラーゼを阻害するインビトロ方法であって、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを、前記〔1〕~〔12〕のいずれかに記載の化合物と接触させることを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含んでもよく、又は前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが不可逆的に阻害される、前記方法。
〔14〕試料中のOplophorus由来ルシフェラーゼの発光を調節するインビトロ方法であって、
(a)前記試料を、セレンテラジン基質と前記〔1〕~〔12〕のいずれかに記載の化合物とに接触させること、及び、
(b)前記試料中における発光を検出すること、
を含み、
前記〔1〕~〔12〕のいずれかに記載の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの発光の低減を引き起こすものであり、該方法が、前記試料を前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を、前記セレンテラジン基質と接触させることを含んでもよい、前記方法。
〔15〕試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
(I)
(a)試料を、セレンテラジン基質と前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片と第1のタンパク質とを含む、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片と第2のタンパク質とを含む、前記第2のポリヌクレオチドを含み、及び
(b)前記試料中における発光を検出すること、
を含み、
前記発光の検出が、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との間の相互作用を示し、該方法が、前記試料を前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を、前記セレンテラジン基質と接触させることを含んでもよく、更に、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質とが相互作用すると、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第1の断片と、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第2の断片とが、前記セレンテラジン基質を安定に結合することができる全長酵素を再構成してもよい、
又は
(II)
(a)試料を、セレンテラジン基質と前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物とに接触させることであり、前記試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼと第1のタンパク質とを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子と第2のタンパク質とを含む、前記第2のポリヌクレオチドを含む、
該接触させること、及び
(b)前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出することを含み、これは、前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターとの相互作用または近接近を示す、
前記方法。
〔16〕試料におけるプロテアーゼ活性を検出するインビトロ方法であって、
(I)
(a)試料を、セレンテラジン基質と前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、プロテアーゼ感受性Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含むこと、
(b)発光を測定すること、
(c)プロテアーゼを活性化すること、及び
(d)前記発光の測定を反復すること、
を含み、
工程(d)での発光の増大は、プロテアーゼ活性の増大を示す、
又は
(II)
(a)試料を、セレンテラジン基質と前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、プロテアーゼ感受性Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質とエネルギー受容体とを含むこと、
(b)BRET比を測定すること、
(c)プロテアーゼを活性化すること、及び
(d)前記BRET比の測定を反復すること、
を含み、
工程(d)でのBRET比の減少は、プロテアーゼ活性の増大を示す、
前記方法。
〔17〕試料からOplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するインビトロ方法であって、
(a)試料を、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含むこと、
(b)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉すること、
(c)工程(b)で捕捉した前記Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離すること、
を含む前記方法。
〔18〕前記試料が、細胞を含み、前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを含んでもよく、又は前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現する、前記〔14〕~〔17〕のいずれか1項に記載の方法。
〔19〕前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジン類似体、プロ-セレンテラジン、または、キノンでマスクしたセレンテラジンである、前記〔14〕~〔18〕のいずれか1項に記載の方法。
〔20〕生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システムであって、
(I)第1の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第1の融合タンパク質、第2の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第2の融合タンパク質、セレンテラジン基質、及び、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Oplophorus由来ルシフェラーゼである、又は
(II)標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む融合タンパク質、蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、セレンテラジン基質、及び、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Oplophorus由来ルシフェラーゼである、又は
(III)第1の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第1の融合タンパク質、第2の標的タンパク質とHALOTAG(登録商標)タンパク質とを含む第2の融合タンパク質、蛍光アクセプター分子を含むHALOTAG(登録商標)リガンド、セレンテラジン基質、及び、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物、を含み、前記生物発光ドナー分子が、Oplophorus由来ルシフェラーゼである、
前記システム。
〔21〕(a)前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物、及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ、
を含むキットであって、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含んでもよく、かつセレンテラジン基質及び/又は発光アッセイを実施するための説明書をさらに含んでもよい、前記キット。
〔22〕タンパク質分解を誘導するインビトロ方法であって、
細胞を、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させることを含み、前記細胞が、ルシフェラーゼ融合タンパク質及び少なくとも1つのプロテアーゼを含み、
それにより、前記融合タンパク質が、前記プロテアーゼによって分解される、前記方法。
〔23〕標的タンパク質を標識するインビトロ方法であって、
標的タンパク質を、前記〔1〕に記載の化合物と接触させることを含み、Zが、-OR 4 であり、R 4 が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または、任意に置換された複素環であり、
それにより、前記標的タンパク質が、R 4 と共有結合を形成する、前記方法。
〔24〕目的とする分子と、試料中の標的タンパク質との間の相互作用を検出するインビトロ方法であって、
(a)試料中の第1の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)シグナルを検出することであって、前記試料が、
(i)融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記ポリヌクレオチド、
(ii)セレンテラジン基質、
(iii)前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物、及び
(iv)蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサーを含むこと、
(b)前記試料を、目的とする分子と接触させること、及び
(c)前記試料中の第2のBRETシグナルを検出すること、
を含み、前記第1のBRETシグナルと比較して、前記第2のBRETシグナルが減少することは、前記目的とする分子と前記標的タンパク質との間の相互作用を示し、前記標的タンパク質が、キナーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、または、ブロモドメイン含有タンパク質を含んでもよい、前記方法。
〔25〕試料中の第1の標的タンパク質と第2の標的タンパク質との間の相互作用を検出するインビトロ方法であって、
(a)試料を、セレンテラジン基質、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の化合物、及び、HALOTAG(登録商標)リガンドと接触させることであって、前記HALOTAG(登録商標)リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、前記試料は、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼ、及び、第1の標的タンパク質を含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第1のポリヌクレオチド、
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質は、HALOTAG(登録商標)タンパク質、及び、第2の標的タンパク質を含む、前記第2のポリヌクレオチドを含むこと、
(b)前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出し、それにより、相互作用を検出する、あるいは、前記第1の標的タンパク質と前記第2の標的タンパク質とが近接近していることを示す、前記方法。
Claims (21)
- 式(Ib)の化合物またはその塩であって、
式中、
Aは、存在しないか、フェニル環、またはチエニル環であり、
R 2 が、少なくとも1つのC 1 -C 4 アルキルまたはC 1 -C 4 ハロアルキルで置換されているフェニルであり、
R x 及びR y は、各々の存在時に、独立して、水素またはC 1 -C 4 アルキルであり、
pは、4、5、6、7、8、9、または10であり
tは、0または1であり、
vは、1であり、及び
L3は、-(CRa1Ra2)m3-であり、式中、m3は、1~20であり、Ra1及びRa2は、各々の存在時に、独立して、水素またはC 1-C4アルキルであるか、又は
L3が、-Q1-(CH2-CH2-O)k1-Q2-(CH2-CH2-O)k2-Q3-(CH2-CH2-O)k3-であり、
式中、
Q1は、存在しないか、O、またはNHであり、
Q2は、存在しないか、
、-CO-NH-、-CH2-CH2-CO-、-CH2-CH2-NH-CO-、または-CH2-CH2-CO-NH-であり、
Q3は、存在しないか、-CO-NH-、または-CH2-CH2-であり、
k1は、1~10であり、
k2は、0~10であり、及び、
k3は、0~10であるか、又は
L3が、
及び
からなる群から選択され、
Zは、C 1 -C 10 ハロアルキルであるか、OR 4 、ハロゲン、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルからなる群から選択される脱離基Yであるか、または以下から選択される部分であり、
及び
R 4 は、任意に置換されたC 3 -C 8 -シクロアルキル、任意に置換されたC 3 -C 8 -シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び任意に置換されたヘテロシクリルアルキルであり、ここで、任意に置換された基とは、ハロ基、ペルフルオロアルキル基、ペルフルオロアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、ハロ基、オキソ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルコキシ基、ニトロ基、アジドアルキル基、スルホン酸基、アリールもしくはヘテロアリール基、アリールオキシもしくはヘテロアリールオキシ基、アラルキルもしくはヘテロアラルキル基、アラルコキシもしくはヘテロアラルコキシ基、HO-(C=O)-基、複素環式基、シクロアルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、ジアルキルアミノカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、並びにアリールスルホニル基、又はこれらの塩形態から選択される基で任意に置換されるものである、
前記化合物又はその塩。 - Zが、C1-C10ハロアルキルであり、Zが、-(CH2)6-Clであってもよく、又は
Zが、OR4、ハロゲン、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルからなる群から選択される脱離基Yである、
請求項1に記載の化合物。 - 前記化合物が、
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ「3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコント-2-エン-1-イル(1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル)カルバメート、
[(E)-30-クロロ-6,17-ジオキソ-5,10,13,16,21,24-ヘキサオキサ-7,18-ジアザトリアコント-2-エン-1-イル(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル)カルバメート、
1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-11,14,17-トリオキサ-2,9-ジアザノナデカン-19-イル(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバメート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-(カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15-ジオキサ-2,9-ジアザオクタデカン-18-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18-トリオキサ-2,9-ジアザヘニコサン-21-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21-テトラオキサ-2,9-ジアザテトラコサン-24-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17-ジオキサ-2,11-ジアザイコサン-20-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-((1r,4r)-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20-トリオキサ-2,11-ジアザトリコサン-23-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,10-ジオキソ-14,17,20,23-テトラオキサ-2,11-ジアザヘキサコサン-26-オアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 1-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8-ジオキソ-12,15,18,21,24,27,30,33-オクタオキサ-2,9-ジアザヘキサトリアコンタン-36-オアート、
N-(トランス-4-((6-(3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-3,13-ジオキソ-7,10-ジオキサ-4,14-ジアザイコサン)-20-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
フェニル 8-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
フェニル 6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキサノアート、
4-フルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
3,5-ジフルオロフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン)-1-カルボキサミド)オクタノアート、
4-シアノフェニル 8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノアート、
ナトリウム 1-((8-(トランス-4-(4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)オクタノイル)オキシ)-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホナート、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,18-トリオキソ-12,15,22-トリオキサ-2,9,19-トリアザテトラコサン-24-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,17-ジオキソ-3,10,13-トリオキサ-6,16-ジアザドコサン-22-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(1-(トランス-4-(1-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-ピロール-2-カルボキサミド)シクロヘキシル)-1,8,24-トリオキソ-12,15,18,21,28-ペンタオキサ-2,9,25-トリアザトリアコンタン-30-イル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((1-(4-(6-((5-((2-クロロ-6-メチルフェニル)カルバモイル)チアゾール-2-イル)アミノ)-2-メチルピリミジン-4-イル)ピペラジン-1-イル)-7,23-ジオキソ-3,10,13,16,19-ペンタオキサ-6,22-ジアザオクタコサン-28-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
5-((6-(トランス-4-(1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド)シクロヘキサン-1-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-3’,6’-ジイル ジアセタート、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-5-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3’,6’-ビス(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9’-キサンテン]-6-カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-1-(2-(エチル(3-エチルフェニル)アミノ)-2-オキソエチル)-1H-インドール-2-カルボキサミド、
N-(トランス-4-((6-(3-(5,5-ジフルオロ-7,9-ジメチル-5H-5l4,6l4-ジピロロ[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]ジアザボリニン-3-イル)プロパンアミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)-4-(2-(エチル(m-トリル)アミノ)-2-オキソエチル)-4H-チエノ[3,2-b]ピロール-5-カルボキサミド、
又はそれらの塩、からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。 - Oplophorus由来ルシフェラーゼを阻害するインビトロ方法であって、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを、請求項1~8のいずれかに記載の化合物と接触させることを含み、任意に、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含み、又は前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが不可逆的に阻害される、前記方法。
- 試料中のOplophorus由来ルシフェラーゼの発光を調節するインビトロ方法であって、
(a)前記試料を、セレンテラジン基質及び請求項1~8のいずれかに記載の化合物と接触させること、及び、
(b)前記試料中における発光を検出すること、
を含み、
請求項1~8のいずれかに記載の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの発光の低減を引き起こすものであり、該方法が、前記試料を請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を、前記セレンテラジン基質と接触させることを含んでもよい、前記方法。 - 試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
(I)
(a)試料を、セレンテラジン基質及び請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片と第1のタンパク質とを含む、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片と第2のタンパク質とを含む、前記第2のポリヌクレオチドを含む、
該接触させること、及び
(b)前記試料中における発光を検出すること、
を含み、
前記発光の検出が、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との間の相互作用を示し、該方法が、前記試料を請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を、前記セレンテラジン基質と接触させることを含んでもよく、更に、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質とが相互作用すると、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第1の断片と、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第2の断片とが、前記セレンテラジン基質を安定に結合することができる全長酵素を再構成してもよい、
又は
(II)
(a)試料を、セレンテラジン基質及び請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであり、前記試料が、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質が、Oplophorus由来ルシフェラーゼと第1のタンパク質とを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子と第2のタンパク質とを含む、前記第2のポリヌクレオチドを含む、
該接触させること、及び
(b)前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出することを含み、これは、前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターとの相互作用または近接近を示す、
前記方法。 - 試料におけるプロテアーゼ活性を検出するインビトロ方法であって、
(I)
(a)試料を、セレンテラジン基質及び請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、プロテアーゼ感受性Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含む、該接触させること、
(b)発光を測定すること、
(c)プロテアーゼを活性化すること、及び
(d)前記発光の測定を反復すること、
を含み、
工程(d)での発光の増大は、プロテアーゼ活性の増大を示す、
又は
(II)
(a)試料を、セレンテラジン基質及び請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、プロテアーゼ感受性Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質とエネルギー受容体とを含む、該接触させること、
(b)BRET比を測定すること、
(c)プロテアーゼを活性化すること、及び
(d)前記BRET比の測定を反復すること、
を含み、
工程(d)でのBRET比の減少は、プロテアーゼ活性の増大を示す、
前記方法。 - 試料からOplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するインビトロ方法であって、
(a)試料を、請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含む、該接触させること、
(b)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉すること、
(c)工程(b)で捕捉した前記Oplophorus由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離すること、
を含む前記方法。 - 前記試料が、細胞を含み、任意に、前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを含み、又は前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現する、請求項10~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、2-フラニルメチル-デオキシ-セレンテラジン(フリマジン)、セレンテラジン-n、セレンテラジン-f、セレンテラジン-h、セレンテラジン-hcp、セレンテラジン-cp、セレンテラジン-c、セレンテラジン-e、セレンテラジン-fcp、ビス-デオキシセレンテラジン(「セレンテラジン-hh」)、セレンテラジン-i、セレンテラジン-icp、セレンテラジン-v、及び2-メチル-セレンテラジンから選択される、請求項10~14のいずれか1項に記載の方法。
- 生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システムであって、
(I)第1の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第1の融合タンパク質、第2の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第2の融合タンパク質、セレンテラジン基質、及び、請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Oplophorus由来ルシフェラーゼである、又は
(II)標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む融合タンパク質、蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、セレンテラジン基質、及び請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Oplophorus由来ルシフェラーゼである、又は
(III)第1の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第1の融合タンパク質、第2の標的タンパク質とHALOTAG(登録商標)タンパク質とを含む第2の融合タンパク質、蛍光アクセプター分子を含むHALOTAG(登録商標)リガンド、セレンテラジン基質、及び請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Oplophorus由来ルシフェラーゼである、
前記システム。 - (a)請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物、及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ、
を含むキットであって、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含んでもよく、かつ該キットが、
セレンテラジン基質、及び/又は
発光アッセイを実施するための説明書
をさらに含んでもよい、前記キット。 - タンパク質分解を誘導するインビトロ方法であって、
細胞を、請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物と接触させることを含み、前記細胞が、ルシフェラーゼ融合タンパク質及び少なくとも1つのプロテアーゼを含み、
それにより、前記融合タンパク質が、前記プロテアーゼによって分解される、前記方法。 - 標的タンパク質を標識するインビトロ方法であって、
標的タンパク質を、請求項1に記載の化合物と接触させることを含み、Zが、-OR4であり、R4が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または任意に置換されたヘテロシクリルであり、
それにより、前記標的タンパク質が、R4と共有結合を形成する、前記方法。 - 目的とする分子と、試料中の標的タンパク質との間の相互作用を検出するインビトロ方法であって、
(a)試料中の第1の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)シグナルを検出することであって、前記試料が、
(i)融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記ポリヌクレオチド、
(ii)セレンテラジン基質、
(iii)請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物、及び
(iv)蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー
を含む、該検出すること、
(b)前記試料を、目的とする分子と接触させること、及び
(c)前記試料中の第2のBRETシグナルを検出すること、
を含み、前記第1のBRETシグナルと比較して、前記第2のBRETシグナルが減少することは、前記目的とする分子と前記標的タンパク質との間の相互作用を示し、前記標的タンパク質が、キナーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、またはブロモドメイン含有タンパク質を含んでもよい、前記方法。 - 試料中の第1の標的タンパク質と第2の標的タンパク質との間の相互作用を検出するインビトロ方法であって、
(a)試料を、セレンテラジン基質、請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物、及びHALOTAG(登録商標)リガンドと接触させることであって、前記HALOTAG(登録商標)リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、前記試料は、
(i)第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、前記第1の融合タンパク質は、Oplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1の標的タンパク質を含み、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第1のポリヌクレオチド、及び
(ii)第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、前記第2の融合タンパク質は、HALOTAG(登録商標)タンパク質及び第2の標的タンパク質を含む、前記第2のポリヌクレオチドを含む、該接触させること、
(b)前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出し、それにより、相互作用を検出する、あるいは、前記第1の標的タンパク質と前記第2の標的タンパク質とが近接近していることを示す、前記方法。
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