JP6862368B2 - チエノピロール化合物、及びそのOplophorus由来ルシフェラーゼの阻害剤としての使用 - Google Patents
チエノピロール化合物、及びそのOplophorus由来ルシフェラーゼの阻害剤としての使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2015年6月25日に出願された米国仮特許出願第62/184,714号、及び2015年8月18日に出願された米国仮特許出願第号62/206,525号の優先権を主張し、それらの内容全体を参照によって本明細書に引用したものとする。
(I)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;及び
R3及びR4は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
(II)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zは、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib’)、または(II)の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させること;及び
(b)試料中の発光を検出すること
を含み、化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、方法を提供する。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib’)、または(II)の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させること、試料は、
(i)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(ii)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド;及び
(b)試料中の発光を検出すること、
発光の検出が、第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を示す、方法を提供する。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib’)、または(II)の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させること、試料は、
(iii)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(iv)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド;
を含み、
(b)生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出すること、を含む、方法を提供する。
(a)式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib’)、または(II)の化合物などの本明細書に記載の化合物;及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ
を含む、キットを提供する。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させることであって、
(II)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zは、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、接触させることと、
(b)試料中の発光を検出すること
を含み、
式(II)の化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、方法を提供する。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させることであって、
(II)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zは、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
試料は、
(v)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(vi)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含む接触させること;及び
(b)試料中の発光を検出すること
を含み、
発光の検出は、第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を示す、方法を提供する。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させることであって、
(II)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zは、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
試料は、
(vii)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(viii)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド;
を含む接触させること;
(b)生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出することを含む、方法を提供する。
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
(a)式(II)の化合物:
(II)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zは、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ
を含む、キットを提供する。
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は全て当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含み、本文書が規制するであろう。本明細書で記載されるものに類似するまたは同等の方法及び材料を本発明の実践及び試験で使用することができるけれども、好まれる方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は全てその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書で開示される材料、方法及び実施例は説明に役立つのみであって、限定を意図されるものではない。
本明細書で提供されるのは、Oplophorus由来ルシフェラーゼ及び/またはOplophorus由来ルシフェラーゼ活性を阻害し得るチエノピロール化合物である。チエノピロール化合物は、式(I)の化合物及びその塩を含み:
(I)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;及び
R3及びR4は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
(Ib)
式中:
Yは、−NRaRb及び−ORcからなる群から選択され;
Ra及びRbは、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され;またはRa及びRbは、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
Rcは、水素及び任意で置換されたC1−C4アルキルからなる群から選択される。
本明細書に記載のチエノピロール化合物は、塩の形態であってもよい。化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させて、従来の方法で親化合物を単離することによって再生してもよい。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解性などのある特定の物理的特性において、種々の塩形態とは異なるが、それ以外の場合、塩は、本開示の目的のため、化合物の親形態と等価である。
ある特定のチエノピロール化合物は、1つ以上の特定の、幾何異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、エピマー、アトロピック、立体異性体、互変異性体、配座異性体、またはアノマーの形態、例えば、限定するものではないが、シス形及びトランス形;E形及びZ形;c形、t形及びr形;エンド形及びエキソ形;R形、S形及びメソ形;D形及びL形;d形及びl形;(+)形及び(−)形;ケト形、エノール形及びエノラート形;シン形及びアンチ形;シンクリナル形及びアンチクリナル形;α形及びβ形;アキシアル形及びエクアトリアル形;舟形、いす型、ねじれ形、エンベロープ形、及び半いす形;並びに、それらの組合せなどがあるが、それらに限定されない。以下では、集合的に、「異性体(isomer)」(または、「異性体形態(isomeric forms)」)と称する。
本発明のチエノピロール化合物を使用して、Oplophorus由来ルシフェラーゼを阻害し得る。チエノピロール化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を阻害し得る。Oplophorus由来ルシフェラーゼは、野生型Oplophorusルシフェラーゼ、または配列番号2のルシフェラーゼなどのOplophorusルシフェラーゼの変異体であってもよい。Oplophorusルシフェラーゼ変異体は、米国特許第8,557,970号及び同第8,669,103号に記載されており、それら各々の内容全体を参照によって本明細書に引用したものとする。
本発明のチエノピロール化合物を使用して、ルシフェラーゼへの結合からセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質と競合または干渉することによって、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。セレンテラジン基質は、ルシフェラーゼ及び他の生物発光タンパク質によって作用した場合に冷光を発するレポーター分子の群である。セレンテラジン基質の例としては、WO2003/040100、米国特許公開第2008/0248511号、及び米国特許公開第US2012/0117667号に開示されたものに加えて、セレンテラジン;セレンテラジン誘導体及び/またはアナログ、例えば、2−フラニルルメチル−デオキシ−セレンテラジン(フリマジン)、セレンテラジン−n、セレンテラジン−f、セレンテラジン−h、セレンテラジン−hcp、セレンテラジン−cp、セレンテラジン−c、セレンテラジン−e、セレンテラジン−fcp、ビス−デオキシセレンテラジン(「セレンテラジン−hh」)、セレンテラジン−i、セレンテラジン−icp、セレンテラジン−v、及び2−メチル−セレンテラジン;プロセレンテラジン(すなわち、化合物をルシフェラーゼのための基質に変換する、非発光酵素のための基質ではない化合物)、キノンマスクされたセレンテラジン等が挙げられるが、これらに限定されない。セレンテラジン基質のさらなる例は、例えば、米国出願第2012/0107849号、米国出願第2013/0130289号、米国特許出願第14/608,910号、及び米国特許出願第14/609,372号に記載されており、それら各々を参照によって本明細書に引用したものとする。
本開示のチエノピロール化合物は、Oplophorusルシフェラーゼ活性を阻害する方法で使用され得る。本方法は、本明細書に開示のチエノピロール化合物(例えば、式(I)、(Ia)、(Ib)、または(Ib’)の化合物)を、Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現または含有する細胞と接触させることを含み得、本開示の化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。本開示のチエノピロール化合物は、Oplophorusルシフェラーゼを用いて酵素の存在または活性を検出するために使用されるアッセイに使用して、Oplophorusルシフェラーゼ由来のシグナルを選択的に阻害し得る。試料、例えば、目的のタンパク質(例えば、酵素、結合パートナー、リガンド等)、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、またはOHラジカル、または1つ以上の条件、例えば、レドックス条件にて1つ以上の分子を検出するのにOplophorusルシフェラーゼ及びセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質を採用する生物発光法にてそれらを使用してもよい。セレンテラジン基質は、Oplophorusルシフェラーゼの基質として作用するが、特許請求されるチエノピロール化合物は、そのような抑制が望まれ得る実施形態では、例えば、複数の生物発光システムの時間多重化を伴う用途では、またはいくつかのプレートベース発光アッセイでは、ルシフェラーゼを阻害して、発光シグナルを選択的に抑制するように作用し得る。例えば、チエノピロール化合物を使用して、細胞内及び/または細胞外Oplophorusルシフェラーゼ活性を阻害し得る。
上述のように、方法は、本明細書に開示のチエノピロール化合物(例えば、式(I)、(Ia)、(Ib)、または(Ib’)の化合物)を、Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現する細胞と接触させることを含み得、本開示の化合物は、Oplophorus由来ルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。式(I)、(Ia)、(Ib)及び(Ib’)の化合物に加えて、本明細書に記載の方法で使用することができる化合物は、式(II)の化合物またはその塩も含み:
(II)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zは、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法は、試料(例えば、細胞)を細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞不透過性であるように改変される本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、本開示のチエノピロール化合物及び方法を使用して、ハイスループットスクリーニング操作アッセイフォーマットの初期輝度を構築した後に、細胞から排泄され得る任意のルシフェラーゼを選択的に阻害し、細胞の外側に発生し得る発光を選択的に阻害してもよい。そのような方法は、細胞内でより選択的なシグナルを提供し得る。細胞不透過性チエノピロール化合物の例としては、JRW−0051、JRW−0147、及びJRW−0187が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法は、試料(例えば、細胞)を細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞透過性である本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、本開示のチエノピロール化合物は、細胞に侵入し、その中のOplophorusルシフェラーゼを選択的に阻害することができる。そのような方法は、2つ以上のルシフェラーゼの使用を伴う多重アッセイにおいて有利であり、細胞内の別のルシフェラーゼからの発光を選択的に見るように、Oplophorusルシフェラーゼからの発光を阻害することができ得る。細胞透過性チエノピロール化合物の例としては、JRW−0013及びJRW−0138が挙げられる。
本開示のチエノピロール化合物は、遺伝子転写レポーター系と共に使用されてもよい。特定の実施形態では、提供されるのは、試料におけるプロモーターの活性を測定する方法であって、その際、プロモーターは、Oplophorus由来ルシフェラーゼまたはその変異体をコードする遺伝子に操作可能に連結される。本方法は、(a)試料をセレンテラジン基質と接触させることと、(b)試料の発光を測定することによってプロモーターの活性を決定することとを含み、その際、試料は、プロモーターを含む。本方法は、試料を本明細書に記載のチエノピロール化合物と接触させて、発光を選択的に阻害する工程をさらに含み得る。プロモーターは、翻訳融合または転写融合を介して遺伝子に操作可能に連結されてもよい。目的の生物経路は、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターを含む細胞を経路の誘導剤で処理することによって調べられてもよい。次いで、このプロモーター活性を測定し、モニターしてプロモーターの活性と当該経路の間の任意の相関を検討すると共に、遺伝子発現に関連する動態測定(例えば、誘導性、抑制及び活性化)を得てもよい。本明細書に記載のチエノピロール化合物を使用して、発光を選択的に阻害することができる。
本開示のチエノピロール化合物を使用して、他のルシフェラーゼ及びアッセイとの時間多重化に適用する際に、Oplophorusルシフェラーゼを阻害してもよい。いくつかの実施形態では、Oplophorus由来ルシフェラーゼまたはその変異体は、異なる波長で発光する別の酵素(例えば、ルシフェラーゼ)、例えば、緑色ホタルルシフェラーゼ、例えば、Photinus pyralis(例えば、Luc2;Promega Corp)または赤色コメツキムシルシフェラーゼ(CHROMA−LUC(商標)ルシフェラーゼ;Promega Corp.)と共に多重化してもよい。例えば、Oplophorusルシフェラーゼが機能的レポーターとして使用されるのであれば、そのときは、緑色ホタルルシフェラーゼまたは赤色CHROMA−LUC(商標)ルシフェラーゼを用いて、遺伝子調節に対する非特異的な効果を制御すればよく、またはトランスフェクション効率について基準化すればよい。いくつかの実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼから生成される発光(およそ460nm)及び赤色CHROMA−LUC(商標)から生成される発光(およそ610nm)は、波長識別フィルターを持つルミノメーターを用いて容易に分割することができ、同じ試料からの双方のシグナルの測定を可能にする。そのような実施形態では、本明細書に記載のチエノピロール化合物を使用して、Oplophorusルシフェラーゼを選択的に阻害することができ、その結果、他のルシフェラーゼからのシグナルを選択的に見ることができる。
本開示のチエノピロール化合物は、Oplophorusルシフェラーゼが、リガンド−タンパク質及び/またはタンパク質−タンパク質の相互作用を検出するために使用される任意の方法で使用されてもよい。種々の実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼを使用して、エネルギーをエネルギーアクセプターに移動させてもよい。そのような方法の1つは、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)である。BRETに関して、生物発光ドナーからの蛍光アクセプターへのエネルギー移動は、発光のスペクトル分布にてシフトを生じる。このエネルギー移動は、タンパク質−タンパク質またはリガンド−タンパク質の試験管内または生体内での相互作用のリアルタイムのモニタリングを可能にする。いくつかの実施形態では、BRET法は、リガンド−タンパク質及び/またはタンパク質−タンパク質の相互作用のためのNlucが介在する生物発光共鳴エネルギー移動(NanoBRETなど)アッセイであってもよい。NANOBRETは、2つの異なる方法:1)HALOTAG及びNlucベースの技術、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を用いてタンパク質−タンパク質及び/またはリガンド−タンパク質の相互作用を検出することが、増加したシグナルと低下したスペクトルの重複によって達成されてもよいこと;及び2)目的のタンパク質に融合されたNlucルシフェラーゼと、蛍光トレーサーを用いて生細胞にてリガンド−受容体の相互作用を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼを循環置換型(CP)または直鎖開裂型(SS)の発光酵素融合タンパク質と共に用いて、タンパク質の近接を測定してもよい。Oplophorusルシフェラーゼは、プロテアーゼ基質のアミノ酸配列(例えば、TEV)の挿入を介して置換され、または開裂されて、低い生物発光を生成する。不活性ルシフェラーゼを(例えば、遺伝子融合を介して)モニタータンパク質に繋げる。相互作用する可能性のあるタンパク質は、(例えば、遺伝子融合を介して)プロテアーゼ(例えば、TEV)に繋がれる。2つのモニタータンパク質が相互作用する、または十分に近接する(例えば、構成的な相互作用、薬剤刺激または経路の応答を介して)と、発光酵素が切断されて、高い生物発光活性を生成する。その例が細胞または生化学アッセイにおいてタンパク質近接の測定に適用されてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示のチエノピロール化合物は、例えば、タンパク質相補アッセイ(PCA)または酵素断片化アッセイなどのリガンド−タンパク質及びタンパク質−タンパク質の相互作用または近接性を検出する他の方法でそのようなルシフェラーゼを使用する場合に、Oplophorusルシフェラーゼを阻害するために使用してもよい。タンパク質相補アッセイ(PCA)は、2つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、互いに最接近させると機能的に活性のあるタンパク質に再構成することができる同じタンパク質、例えば、酵素の2つの断片を利用する。いくつかの実施形態では、NANOBIT(登録商標)技術(Promega Corporation)を使用して、酵素の成分またはサブユニットの結合相互作用を介した発光酵素の再構成による分子の近接を検出してもよい。NANOBITは、Oplophorusルシフェラーゼ変異体、Nlucルシフェラーゼに由来する非発光性ペプチド(NLPep)及び非発光性ポリペプチド(NLPoly)を利用する。NLPep及びNLPolyは、目的タンパク質に融合される。目的タンパク質が相互作用するのであれば、NLPep及びNLPolyが相互作用して、完全長のOplophorusルシフェラーゼ酵素を再構成する。
いくつかの実施形態では、本開示のチエノピロール化合物は、各結合相手、例えば、FRB及びFKBPに融合される完全長の循環置換型発光酵素と共に使用され、タンパク質相補型アッセイで使用されてもよい。本明細書で開示の方法と従来のタンパク質相補性との間での重要な差異は、相補性はなかったが、むしろ、2つの完全長の酵素、例えば、循環置換型発光酵素の二量体化があったということである。
本開示のチエノピロール化合物は、生物成分を含有する試料と共に使用してもよい。試料は細胞を含んでもよい。試料は、成分(無傷細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官、エキソソーム、及びそれらの混合物を含む)の異種混合物、または単一成分、または成分(例えば、天然のまたは合成のアミノ酸、核酸または糖質ポリマー、または脂質膜複合体)の同種群を含んでもよい。チエノピロール化合物は一般に、使用の濃度内で生細胞及び他の生物成分に対して非毒性であり得る。
開示されるのは、1つ以上の酵素(例えば、OplophorusまたはOplophorus変異体ルシフェラーゼ)の存在または活性を測定するためのキットである。キットは、以下のもの:OplophorusまたはOplophorus変異体ルシフェラーゼ、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質、OplophorusまたはOplophorus変異体ルシフェラーゼを阻害し得る本発明の化合物または組成物、発光アッセイを実施するための指示書、及び反応緩衝液の1つ以上を含んでもよい。反応緩衝液は、非ルシフェラーゼ酵素反応及び発光酵素反応のために個々の製剤で存在してもよく、または単一工程アッセイのために単一製剤で存在してもよい。キットはまた、非ルシフェラーゼ酵素のための他の阻害剤、活性化剤、及び/または増強剤を含有してもよい。キットはまた、アッセイのための陽性対照及び/または陰性対照を含有してもよい。
一般的合成手順A:ジオキサン/水(4:1)中のエステル中間体(1当量)の溶液に、水酸化リチウム(5当量)を添加した。出発物質が消費されるまで、懸濁液を60℃に加熱した(LCMSまたはTLC分析によりモニターする)。反応混合物を冷却し、pH3までHCl(2M)で酸性化した。懸濁液を酢酸エチルと水の間に区分した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカ、ジクロロメタン/メタノール)によって精製し、所望の生成物を得た。
式(Ia)の化合物の一般的合成
式(Ia)の化合物は、スキーム1に従って一般的に合成することができる。
スキーム1.
2−クロロ−N−エチル−N−(m−トリル)アセトアミド(JRW−0003)
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0004)
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(WZ−141−74)
実施例2
N−シクロヘキシル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0006)
実施例3
N−エチル−2−(5−(ピロリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド(JRW−0008)
実施例4
N−エチル−2−(5−(ピペリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド(JRW−0009)
実施例5
1−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル(JRW−0012)
実施例6
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−フェニル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0143)
実施例7
2−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)フェニル)酢酸エチル(JRW−0152)
実施例8
3−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)安息香酸メチル(JRW−0151)
実施例9
メチル−シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0041)
実施例10
6−(シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸(JRW−0264)
ステップ1.シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0261)
ステップ2.6−(シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル(JRW−0262)
ステップ3.6−(シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸(JRW−0264)
実施例11
8−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)オクタン酸(JRW−0198)
ステップ1.8−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)オクタン酸メチル(JRW−0196)
ステップ2.8−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)オクタン酸(JRW−0198)
実施例12
6−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−イル)−6−オキソヘキサン酸(JRW−0208)
ステップ1.tert−ブチル 4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−カルボン酸(JRW−0203)
ステップ2.4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(ピペリジン−4−イル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0204)
ステップ3.6−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−イル)−6−オキソヘキサン酸メチル(JRW−0206)
ステップ4.6−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−イル)−6−オキソヘキサン酸(JRW−0208)
実施例13
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル(JRW−0267)
実施例14
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸(JRW−0268)
実施例15
式(Ib)の化合物の一般的合成
スキーム2.
実施例16
トランス−メチル−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0013)
実施例17
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0034)
実施例18
N−(トランス−4−(ブチルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0042)
実施例19
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((2−ヒドロキシエチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0043)
実施例20
N−(トランス−4−((2−(ジメチルアミノ)エチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0044)
実施例21
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ブタン酸(JRW−0051)
ステップ1.4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ブタン酸メチル(JRW−0050)
ステップ2.4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ブタン酸(JRW−0051)
実施例22
N−(トランス−4−カルバモイルシクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0052)
実施例23
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0138)
実施例24
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル(JRW−0140)
実施例25
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル(JRW−0145)
実施例26
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸(JRW−0147)
実施例27
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸(JRW−0187)
実施例28
8−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)オクタン酸(JRW−0188)
ステップ1.8−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)オクタン酸メチル(JRW−0186)
ステップ2.8−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)オクタン酸(JRW−0188)
実施例29
N−(トランス−4−(シクロヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0190)
実施例30
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0191)
実施例31
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチル(JRW−0192)
実施例32
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ピペリジン−4−イルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0194)
実施例33
N−(トランス−4−((1−アセチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0195)
実施例34
(6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキシル)カルバミン酸tert−ブチル(JRW−0197)
実施例35
N−(トランス−4−((6−(3’,6’−ジヒドロキシ−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−5(6)−カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0200)
ステップ1.N−(トランス−4−((6−アミノヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0199)
ステップ2.N−(トランス−4−((6−(3’,6’−ジヒドロキシ−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−5(6)−カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0200)
実施例36
N−(トランス−4−((6−アミノヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミドヒドロクロリド(JRW−0241)
実施例37
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0242)
実施例38
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム(JRW−0344)
ステップ1.4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヨードヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0342)
ステップ2.6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム(JRW−0344)
実施例39
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸カリウム(JRW−0348)
実施例40
メチル−トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0243)
実施例41
トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0245)
実施例42
(11S,14S,17S)−17−アセトアミド−11,14−ビス(カルボキシメチル)−1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキシル)−1,10,13,16−テトラオキソ−2,9,12,15−テトラアザノナデカン−19−オイック酸(JRW−0251)
ステップ1.tert−ブチル(11S,14S,17S)−17−アセトアミド−11,14−ビス(2−(tert−ブトキシ)−2−オキソエチル)−1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキシル)−1,10,13,16−テトラオキソ−2,9,12,15−テトラアザノナデカン−19−オエート(JRW−0249)
ステップ2.(11S,14S,17S)−17−アセトアミド−11,14−ビス(カルボキシメチル)−1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキシル)−1,10,13,16−テトラオキソ−2,9,12,15−テトラアザノナデカン−19−オイック酸(JRW−0251)
実施例43
式(Ia)の化合物の代替合成
スキーム3.
実施例44
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−メチル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(WZ−141−84)
ステップ1.2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(WZ−141−82)
ステップ2.4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−メチル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(WZ−141−84)
実施例45
N−シクロペンチル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(WZ−141−88)
実施例46
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(ピリジン−4−イルメチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(WZ−141−89)
実施例47
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(3−モルフォリノプロピル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(WZ−141−90)
実施例48
N−エチル−2−(5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド(WZ−141−91)
実施例49
式(Ic)の化合物の合成
スキーム4.
実施例50
4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0077)
実施例51
N−シクロヘキシル−4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0081)
ステップ1.4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0080)
ステップ2.N−シクロヘキシル−4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0081)
実施例52
N−シクロヘキシル−4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0109)
ステップ1.N−(2−(2−メトキシエトキシ)エチル)−3−メチルアニリン(JRW−0101)
ステップ2.2−クロロ−N−(2−(2−メトキシエトキシ)エチル)−N−(m−トリル)アセトアミド(JRW−0104)
ステップ3.4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0105)
ステップ4.4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0107)
ステップ5.N−シクロヘキシル−4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0109)
実施例53
メチル−トランス−4−(4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0110)
実施例54
4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0142)
ステップ1.2−クロロ−N−ヘキシル−N−(m−トリル)アセトアミド(JRW−0141)
ステップ2.4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0142)
実施例55
N−シクロヘキシル−4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0148)
ステップ1.4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0149)
ステップ2.N−シクロヘキシル−4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0148)
実施例56
メチル−トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0149)
実施例57
トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0260)
実施例58
4−(2−(ベンジル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(WZ−141−86)
ステップ1.N−ベンジル−2−クロロ−N−(m−トリル)アセトアミド(WZ−141−85)
ステップ2.4−(2−(ベンジル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(WZ−141−86)
スキーム5.
実施例59
トランス−4−(4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0318)
ステップ1.4−(2−(tert−ブトキシ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0277)
ステップ2.2−(5−(メトキシカルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)酢酸(JRW−0288)
ステップ3.4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0294)
ステップ4.4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−309)
ステップ5.トランス−4−(4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0318)
実施例60
トランス−4−(4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0321)
ステップ1.2−クロロ−N−(3−シアノフェニル)−N−エチルアセトアミド(JRW−0313)
ステップ2.4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0316)
ステップ3.4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0319−1)及び4−(2−((3−カルバモイルフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0319−2)
ステップ4.トランス−4−(4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0321)
実施例61
トランス−4−(4−(2−((3−カルバモイルフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0322)
実施例62
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0326)
ステップ1.4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0298)
ステップ2.4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0323)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0326)
実施例63
4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0429)
ステップ1.トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0427)
ステップ2.4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0429)
実施例64
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム(JRW−0432)
ステップ1.4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヨードヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド(JRW−0431)
ステップ2.6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム(JRW−0432)
実施例65
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0327)
ステップ1.4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0299)
ステップ2.4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0324)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0327)
実施例66
トランス−4−(4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0330)
ステップ1.4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0300)
ステップ2.4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0328)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0330)
実施例67
トランス−4−(4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0331)
ステップ1.4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0301)
ステップ2.4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0329)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0331)
実施例68
トランス−4−(4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0334)
ステップ1.4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0314)
ステップ2.4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0332)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0334)
実施例69
トランス−4−(4−(2−(エチル(4−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0335)
ステップ1.4−(2−((4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0320)
ステップ2.4−(2−(エチル(4−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0333)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(4−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0335)
実施例70
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0460)
ステップ1.4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0454)
ステップ2.4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0457)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0460)
実施例71
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0461)
ステップ1.4−(2−((3−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0455)
ステップ2.4−(2−(エチル(3−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0458)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(3−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0461)
実施例72
トランス−4−(4−(2−((3−(ブロモメチル)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0466)
実施例73
トランス−4−(4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0478)
ステップ1.4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0475)
ステップ2.4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0476)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0478)
実施例74
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0508)
ステップ1.4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0502)
ステップ2.4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0505)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0508)
スキーム6.
実施例75
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0355)
ステップ1.1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボン酸メチル(JRW−0349)
ステップ2.1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボン酸(JRW−0353)
ステップ3.トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0355)
実施例76
トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0424)
ステップ1.2−クロロ−N−エチル−N−(3−エチルフェニル)アセトアミド(JRW−0413)
ステップ2.1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボン酸メチル(JRW−0416)
ステップ3.1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボン酸(JRW−0419)
ステップ4.トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0424)
実施例77
1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−1H−インドール−2−カルボキサミド(JRW−0430)
ステップ1.トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸(JRW−0428)
ステップ2.1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−1H−インドール−2−カルボキサミド(JRW−0430)
実施例78
6−(トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム(JRW−0434)
ステップ1.1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヨードヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−1H−インドール−2−カルボキサミド(JRW−0433)
ステップ2.6−(トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム(JRW−0434)
実施例79
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0359)
ステップ1.1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸メチル(JRW−0351)
ステップ2.1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(JRW−0357)
ステップ3.トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0359)
実施例80
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−360)
ステップ1.4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0352)
ステップ2.4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−358)
ステップ3.トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−360)
実施例81
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0456)
ステップ1.1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボン酸メチル(JRW−0450)
ステップ2.1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボン酸(JRW−0453)
ステップ3.トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0456)
実施例82
トランス−4−(6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0463)
ステップ1.6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボン酸メチル(JRW−0459)
ステップ2.6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボン酸(JRW−0462)
ステップ3.トランス−4−(6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル(JRW−0463)
Nlucルシフェラーゼの阻害
K562を、2000細胞/ウェルで、20μLのRPMI培地中のCorning 3707アッセイプレートのウェルにプレートし、一晩インキュベートした。トレイル滴定を10μLのRPMI培地中で調製し、細胞に添加した。その後、10μLの4×REALTIME−GLO(商標)MT細胞生存率試薬(RTCV;Promega Corporation)または培地(対照)のいずれかを各ウェルに添加した。反応物を種々の時点で37℃/5%CO2にてインキュベートし、Tecan M1000 Proプレートリーダーで発光を測定した。5時間で、40μLのCASPASE−GLO(登録商標)3/7検出試薬(Promega Corporation)を、200μMのJRW−0004の有無に関わらず添加した。反応物を2時間室温(RT)でインキュベートし、Tecan M1000 Proプレートリーダーで発光を測定した。図1は、JRW−0004が、REALTIME−GLO(商標)MT細胞生存率試薬中でNluc酵素を阻害するため、REALTIME−GLO(商標)アッセイとCASPASE−GLO(登録商標)アッセイを組み合わせる多重化において、CASPASE−GLO(登録商標)アッセイウインドウを回復することができることを示す。
精製されたNlucルシフェラーゼの阻害
Corning 3570アッセイプレートでは、精製されたNluc酵素(Promega Corporation)、20mMのDTT、及びDTTによる還元時にNluc基質に変換されるNluc Pro基質(米国特許公開第2013/0130289号に記載されるPBI−4442)を添加した。その後、JRW−0004、JRW−0013、JRW−0006、JRW−0042、JRW−0138、及びJRW−0147の化合物滴定を行った(PBS中で1:2の段階希釈、11ポイント+阻害剤無しの対照、200μMで開始し;反応中で100μMの最終濃度)。化合物滴定をアッセイプレートのウェルに等しい容量で添加した。反応物を室温で2時間インキュベートし、Tecan M1000 Proプレートリーダーで発光を測定した。GraphPad Prism 6.03を用いて、半最大阻害(チエノピロール化合物)濃度(IC50)を判断した。図2は、全ての化合物が、精製されたNluc酵素を阻害することができることを示す。
Nlucルシフェラーゼの阻害の特異性
以下の実施例は、Nlucルシフェラーゼ活性対ホタルルシフェラーゼ活性、例えば、ULTRAGLO(登録商標)ルシフェラーゼを阻害するための本開示のチエノピロール化合物JRW−0004、JRW−0013、JRW−0006、JRW−0042、JRW−0138、及びJRW−0147の特異性について述べる。Corning 3570アッセイプレートでは、ルシフェラーゼ検出試薬(Promega Corporation V865/859)中に1μMのルシフェリンを含有する溶液をアッセイウェルに添加した。その後、チエノピロール化合物JRW−0004、JRW−0013、JRW−0006、JRW−0042、JRW−0138、及びJRW−0147の等しい容量の滴定をウェルに添加した。反応物を室温で2時間インキュベートし、Tecan M1000 Proプレートリーダーで発光を測定した。図3は、チエノピロール化合物が、ホタルルシフェラーゼ活性を阻害しなかったことを示す。
多重化を可能にするチエノピロール化合物
以下の実施例は、Nlucルシフェラーゼと別のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼを利用するアッセイの多重化を可能にするための本発明のチエノピロール化合物の使用について述べる。
表1
表2
以下の実施例は、化合物JRW−0004、WZ141−88、WZ141−86、WZ141−74、WZ141−84、WZ141−89、WZ141−90、及びWZ141−91が、Nlucルシフェラーゼを阻害することを示す。DTTによる還元時にNluc基質に変換される、精製されたNluc及びNlucプロ基質(US2013/0130289に記載されるPBI−4442)の溶液をPBS緩衝液中でpH7.5に調製した。1%のTERGITOLを含有する、PBS中のDTTのpH7.5の40mM溶液も調製した。次いで、DTT及びTERGITOLを含有する、緩衝液中のチエノピロール化合物JRW−0004、WZ141−88、WZ141−86、WZ141−74、WZ141−84、WZ141−89、WZ141−90、及びWZ141−91の滴定も調製した。等しい容量のNluc/前基質溶液を、アッセイプレートのウェル中のチエノピロール化合物滴定に添加した。反応物を室温でインキュベートし、Tecan M100 Proプレートリーダーで発光を種々の時点で測定した(積分時間200ms)。GraphPad Prism 6.03を用いて、IC50値を判断した。図4〜6は、試験した全ての化合物が、用量及び時間依存的にNlucルシフェラーゼを阻害することを示す。
細胞透過性
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物の透過性を示す。HEK293またはHeLa細胞をβ2アドレナリン受容体−Nluc(B2AR−Nluc)融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Nlucを細胞質的に固定し、配向させた。トランスフェクションの24時間後、細胞を−/+50μg/mLのジギトニンで処理し、生及び溶解シナリオをそれぞれ模倣した。その後、無傷細胞及び透過性細胞を、チエノピロール化合物の化合物反応曲線に最大2時間暴露させた。10μMのフリマジン(Promega Corp.)を添加し、発光を測定した。チエノピロール化合物(阻害剤)が透過性であった場合、生細胞及び透過性細胞の両方の用量反応曲線は重複した。しかしながら、チエノピロール化合物が不透過性であった場合、EC50は、透過性細胞と比較して、生細胞において右にシフトした。図7〜11を参照されたい。
細胞外BRETの阻害
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物が細胞外BRETを阻害する能力を示す。図12Aを参照されたい。HEK293をNluc−HDAC6融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Nluc−HDAC6を細胞の内側に配向させた。トランスフェクションの24時間後、細胞を、NANOBRET618リガンドで標識された10ng/mLの精製Nluc−HALOTAGで処理し、疑似細胞外BRETをシミュレートした。次いで、細胞をチエノピロール化合物JRW−0013、JRW−0051、JRW−0147、及びJRW−0187の化合物反応曲線に2時間暴露させた。その後、10μMのフリマジンを添加し、BRET比610/450nmを測定した。チエノピロール化合物、例えば、JRW−0013が透過性であった場合、BRET比は、化合物用量反応曲線全体で一定のままであった。チエノピロール化合物、例えば、JRW−0051、JRW−0147、またはJRW−0187が不透過性であった場合、BRET比は、化合物用量反応曲線全体で減少し、細胞外BRETを阻害しながら細胞内Nlucシグナルを増強した。図12B〜12Eを参照されたい。
細胞外ルシフェラーゼ活性の阻害、及び細胞内BRETの増強
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物が、細胞内BRETを増強しながら細胞外ルシフェラーゼ活性を阻害する能力を示す。図13Aを参照されたい。HEK293をNluc−HALOTAG融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Nluc−HALOTAGを細胞の内側に配向させた。トランスフェクションの24時間後、細胞をNANOBRET618リガンドで標識し、特異的細胞内BRETをシミュレートした。その後、細胞を10ng/mLの精製Nlucで処理し、疑似細胞外発光をシミュレートした。細胞をチエノピロール化合物JRW−0013、JRW−0051、JRW−0147、及びJRW−0187の化合物反応曲線に2時間暴露させた。10μMのフリマジンを添加し、BRET比610/450nmを測定した。阻害剤、例えば、JRW−0013が透過性であった場合、BRET比は、化合物用量反応曲線全体で一定のままであった。阻害剤、例えば、JRW−0051、JRW−0147、またはJRW−0187が不透過性であった場合、細胞内BRET比は、疑似細胞外Nlucシグナルを阻害しながら化合物用量反応曲線全体で増強された。図13B〜13Fを参照されたい。
生物発光イメージングによる細胞透過性
HeLa細胞をβ2アドレナリン受容体−Nluc(B2AR−Nluc;C末端Nluc)またはNluc−β2アドレナリン受容体(Nluc−B2AR;N末端Nluc)融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Nlucを細胞内または細胞外にそれぞれ固定し、配向させた。トランスフェクションの24時間後、細胞を−/+30μMのチエノピロール化合物JRW−0147、JRW−0051、及びJRW−0138で処理した。10μMのフリマジンを添加し、Olympus LV200上のイメージングによって発光を検出した。チエノピロール化合物JRW−0147及びJRW−0051は、不透過性であり、細胞外Nlucを阻害し、細胞内Nlucを増強した。化合物JRW−0138は、細胞透過性であり、細胞内及び細胞外Nlucの両方を阻害した。図14を参照されたい。
標的会合モデルにおける不透過性チエノピロール化合物の特徴付け
HEK293細胞をSrc−Nluc融合タンパク質で一時的にトランスフェクトした。図15Aを参照されたい。トランスフェクションの24時間後、細胞を−/+50μg/mLのジギトニンで処理し、生及び溶解シナリオをそれぞれシミュレートした。無傷細胞及び透過性細胞を1μMのダサチニブ−DY605トレーサー(不透過性)で標識し、細胞不透過性チエノピロール化合物JRW−0147反応曲線で2時間処理した。10μMのフリマジンを添加し、BRET比610/450nmを記録した。図15B〜15Cは、JRW−0147が、細胞残屑中のBRETを阻害したが、細胞内部のBRETを阻害しなかったことを示す。
細胞透過性の時間的経過
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物の透過性を示す。HEK293細胞をNlucルシフェラーゼで一時的にトランスフェクトし、それを細胞質的に発現した。トランスフェクションの24時間後、細胞をチエノピロール化合物JRW−0147またはJRW−0013の化合物反応曲線に10分間、30分間、または120分間暴露させた。その後、10μMのフリマジンを添加し、発光を測定した。
Nlucへの化学的複合化または分子融合によるエンドサイトーシスの測定
抗体、タンパク質、受容体、薬物、薬物担体、ペプチド、糖類、脂肪酸、ナノ粒子、または他の生体分子は、Nlucに化学的に複合化または融合して、本明細書に記載の細胞不透過性チエノピロール化合物(阻害剤)と組み合わせてエンドサイトーシスを測定することができた。
Nlucルシフェラーゼの阻害の特異性
以下の実施例は、Nlucルシフェラーゼ活性とホタルルシフェラーゼ活性、例えば、ULTRAGLO(登録商標)ルシフェラーゼを阻害するための本開示のチエノピロール化合物JRW−0251、JRW−0344、及びJRW−0147の特異性について述べる。Corning 3570アッセイプレートでは、ルシフェラーゼ検出試薬(Promega Corporation V865/859)中に1μMのルシフェリンを含有する溶液をアッセイウェルに添加した。その後、チエノピロール化合物JRW−0251、JRW−0344、及びJRW−0147の等しい容量滴定をウェルに添加した。反応物を室温で2時間インキュベートし、Tecan M1000 Proプレートリーダーで発光を測定した。表3は、チエノピロール化合物が、ホタルルシフェラーゼ活性を阻害しなかったことを示す。
表3
多重化を可能にするチエノピロール化合物
以下の実施例は、Nlucルシフェラーゼと別のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼを利用するアッセイの多重化を可能にするための本発明のチエノピロール化合物の使用について述べる。
表4
細胞透過性
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物の透過性を示す。HEK293をβ2アドレナリン受容体−Nluc(B2AR−Nluc)融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Nluc及びpGEM−3z担体DNA(1:100)を細胞質的に固定し、配向させた。トランスフェクションの24時間後、細胞を−/+50μg/mLのジギトニンで処理し、生及び溶解シナリオをそれぞれ模倣した。その後、無傷細胞及び透過性細胞を、チエノピロール化合物の化合物反応曲線に最大2時間暴露させた。10μMのフリマジン(Promega Corp.)を添加し、発光を測定した。チエノピロール化合物(阻害剤)が透過性であった場合、生細胞及び透過性細胞の両方の用量反応曲線は重複した。しかしながら、チエノピロール化合物が不透過性であった場合、EC50は、透過性細胞と比較して、生細胞において右にシフトした。図17A〜17Cは、JRW−0147及びJRW−0344が、生細胞対溶解細胞において右にシフトしたEC50によって特徴付けられた細胞不透過性であることを示す。JRW−0013は、生細胞対溶解細胞において同様のEC50によって特徴付けられた細胞透過性対照として機能した。
細胞生存率及び毒性
以下の実施例は、JRW−0344の細胞生存率及び毒性を示す。HEK293細胞を20k細胞/ウェルでプレートし、ビヒクル(DMSO)、ジギトニン(細胞死に対する陽性対照)、またはJRW−0344に10分間/30分間/120分間/240分間/または18時間暴露させた。細胞Titer−Glo(Promega Corp.)を添加し、発光を測定した。図18A〜18Cは、18時間後に100μMまでビヒクルまたはJRW−0344の明らかな毒性は無かったことを示す。ジギトニン処理細胞は、2μg/mLを超える濃度でほぼ完全な死を経験した。
生物発光イメージングによる細胞透過性
HeLa細胞をNluc−ADRB2(細胞外Nluc)またはADRB2−Nluc(細胞内Nluc)で一時的にトランスフェクトし、Nlucを細胞内または細胞外にそれぞれ固定し、配向させた。トランスフェクション24時間後、細胞を−/+30μMのチエノピロール化合物JRW−0147、JRW−0013、及びJRW−0344で処理した。10μMのフリマジンを添加し、Olympus LV200上のイメージングによって発光を検出した。DMSO(未処理)は、陰性対照として使用し、いずれかの配向でNlucを阻害しなかった。JRW−0013は、細胞透過性の陽性対照であり、いずれかの配向でNlucを阻害した。しかしながら、JRW−0344またはJRW−0147は、Nlucが細胞外に配向される場合には典型的な環状構造を阻害するが、Nlucが細胞内に配向される場合には阻害しない。図19を参照されたい。
細胞外ルシフェラーゼ活性の阻害
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物が、細胞内BRETを増強しながら細胞外ルシフェラーゼ活性を阻害する能力を示す。図20Aを参照されたい。HEK293をSRC−NlucまたはNluc−HaloTagのいずれかで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、20k/細胞を96ウェルプレート(Costar 3600)のウェルにプレートした。1μMの細胞不透過性トレーサーであるダサチニブ−DY605をHEK293 SRC−Nluc発現細胞に添加し、100nMの細胞透過性トレーサーであるNanoBRET−618をNluc−HaloTag発現細胞に添加した。HEK293 SRC−Nluc及びNluc−HaloTag細胞の両方をJRW−0344の用量反応曲線に暴露させた。図20A〜20Cは、JRW−0344が、HEK293 SRC−Nluc発現細胞中の細胞残屑ではBRETを阻害したが、HEK293 Nluc−HaloTag発現細胞では阻害しなかったことを示す。
阻害剤IC50決定
以下の実施例は、本明細書に開示の化合物のIC50値を提供する。表5を参照されたい。NANOLUC(登録商標)酵素をCO2独立培地+10%FBS中の0.4ng/mlに希釈し、検出試薬を作製した。次いで、各阻害剤の3×希釈系列を検出試薬で作製した。「阻害剤無し」対照も試料ごとに作製した。50ulの各阻害剤希釈物を、20uMのフリマジンを含有する50ulのNanoGlo緩衝液と混合し(最終フリマジン濃度は、Kmで10uMである)、発光を測定した。各試料を「阻害剤無し」対照に正規化した。次いで、GraphPad Prismを用いて、IC50値を決定した(log[阻害剤]対正規化応答)。
表5
(I)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;及び
R3及びR4は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、化合物、またはその塩。
(Ib)
式中:
Yが、−NRaRb及び−ORcからなる群から選択され;
Ra及びRbが、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され;またはRa及びRbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
Rcは、水素及び任意で置換されたC1−C4アルキルからなる群から選択される、条項1〜23のいずれか1項に記載の化合物。
N−シクロヘキシル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−エチル−2−(5−(ピロリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
N−エチル−2−(5−(ピペリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
1−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−フェニル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
2−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)フェニル)酢酸エチル;
3−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)安息香酸メチル;
メチル−シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
8−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)オクタン酸;
6−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−イル)−6−オキソヘキサン酸;
トランス−メチル−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
N−(トランス−4−(ブチルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((2−ヒドロキシエチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((2−(ジメチルアミノ)エチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ブタン酸;
N−(トランス−4−カルバモイルシクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸;
8−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)オクタン酸;
N−(トランス−4−(シクロヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチル;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ピペリジン−4−イルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((1−アセチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
(6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキシル)カルバミン酸tert−ブチル;
N−(トランス−4−((6−(3’,6’−ジヒドロキシ−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−5(6)−カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((6−アミノヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミドヒドロクロリド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
(11S,14S,17S)−17−アセトアミド−11,14−ビス(カルボキシメチル)−1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキシル)−1,10,13,16−テトラオキソ−2,9,12,15−テトラアザノナデカン−19−オイック酸;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−メチル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−シクロペンチル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(ピリジン−4−イルメチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(3−モルフォリノプロピル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−エチル−2−(5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
N−シクロヘキシル−4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−シクロヘキシル−4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
N−シクロヘキシル−4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
4−(2−(ベンジル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
6−(シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル;
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸カリウム;
トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
トランス−4−(4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−カルバモイルフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(4−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−(ブロモメチル)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−1H−インドール−2−カルボキサミド;
6−(トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;及び
トランス−4−(6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル
からなる群から選択される、条項1〜35のいずれか1項に記載の化合物。
前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを式(II)の化合物:
(II)
と接触させることを含み、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記方法。
(a)試料をセレンテラジン基質及び条項1〜36のいずれか1項に記載の化合物と接触させること;及び
(b)試料中の発光を検出すること、
を含み、
条項1〜36のいずれか1項に記載の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
(a)試料をセレンテラジン基質及び条項1〜36のいずれか1項に記載の化合物と接触させること、ここで試料は、
(ix)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(x)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;及び
(b)試料中の発光を検出すること、
を含み、
発光の検出が、第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
(a)試料をセレンテラジン基質及び条項1〜36のいずれか1項に記載の化合物と接触させること、ここで試料は:
(xi)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xii)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;
(b)生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出すること
を含む、前記方法。
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
(a)前記試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させること:
(II)
を含み、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
(b)試料中の発光を検出すること、
式(II)の化合物が、Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させること、
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
試料が、
(xiii)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xiv)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;及び
(b)前記試料中の発光を検出すること
を含み、
発光の前記検出は、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させること、
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
前記試料が、
(xv)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xvi)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;及び
(b)前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出すること
を含む、前記方法。
第1の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第1の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Oplophorus由来ルシフェラーゼである;第2の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第2の融合タンパク質;セレンテラジン基質、及び式(II)の化合物、を含み、
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム。
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1及びR2が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR3R4及び−OR5からなる群から選択され;及び
R3、R4、及びR5が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
付録
FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADIHVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFR−VTINGVTGWRLCENILA
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕式(I)の化合物、またはその塩であって:
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
nは、0、1、2、3、4、または5であり;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 は、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;及び
R 3 及びR 4 は、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記化合物、またはその塩。
〔2〕nが、1である、前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕前記点線が、結合の存在を表し、Xが、CHである、前記〔1〕〜〔2〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔4〕Aが、5員のヘテロアリール環である、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔5〕Aが、チエニル環またはフラニル環である、前記〔1〕〜〔4〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔6〕Aが、フェニル環である、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔7〕R 1 が、水素、C 1 −C 8 アルキル、ハロ−C 1 −C 8 −アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及びアリールアルキルからなる群から選択される、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔8〕R 1 が、水素、エチル、n−ヘキシル、2−(2−メトキシエトキシ)エチル及びベンジルからなる群から選択される、前記〔1〕〜〔7〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔9〕R 1 が、エチルである、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔10〕R 2 が、任意で置換されたアリールである、前記〔1〕〜〔9〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔11〕R 2 が、置換フェニルである、前記〔10〕に記載の化合物。
〔12〕R 2 が、C 1 −C 4 アルキル、シアノ、アミド、C 1 −C 4 アルコキシ、及びヒドロキシアルキルからなる群から選択される1つの置換基で置換されたフェニルである、前記〔11〕に記載の化合物。
〔13〕R 2 が、1つのメチル基で置換されたフェニルである、前記〔12〕に記載の化合物。
〔14〕R 3 及びR 4 が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記〔1〕〜〔13〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔15〕R 3 及びR 4 が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する、前記〔14〕に記載の化合物。
〔16〕前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピロリジン、ピペリジン及びピペラジンからなる群から選択される、前記〔15〕に記載の化合物。
〔17〕前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピロリジン、未置換ピペリジン、1つの置換基で置換されたピペリジン、または1つの置換基で置換されたピペラジンからなる群から選択される、前記〔15〕に記載の化合物。
〔18〕R 3 が、水素である、前記〔1〕〜〔17〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔19〕R 4 が、未置換C 1 −C 8 アルキル、ハロ−C 1 −C 8 −アルキル、カルボキシ−C 1 −C 8 −アルキル、C 1 −C 4 −アルコキシカルボニル−C 1 −C 8 −アルキル、任意で置換されたフェニル、任意で置換されたC 5 −C 6 シクロアルキル、任意で置換されたC 5 −C 6 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される、前記〔1〕〜〔18〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔20〕R 4 が、未置換であるかまたは1つの置換基で置換されるフェニルである、前記〔19〕に記載の化合物。
〔21〕前記置換基が、C 1 −C 4 −アルコキシカルボニル、及びC 1 −C 4 −アルコキシカルボニル−C 1 −C 4 −アルキルからなる群から選択される、前記〔20〕に記載の化合物。
〔22〕R 4 が、カルボキシ、C 1 −C 4 −アルコキシカルボニル、C 1 −C 8 −アルキルアミド、ヒドロキシ−C 1 −C 8 −アルキルアミド、アミド、任意で置換されたアミノ−C 1 −C 8 −アルキルアミド、C 1 −C 4 −ジアルキルアミノ−C 1 −C 8 −アルキルアミド、カルボキシ−C 1 −C 8 −アルキルアミド、スルホン酸−C 1 −C 8 −アルキルアミド、スルホン酸−C 1 −C 8 −アルキルアミド、C 1 −C 4 −アルキルカルボニル−C 1 −C 8 −アルキルアミド、任意で置換されたC 3 −C 6 −シクロアルキルアミド、及び任意で置換されたヘテロシクリルアミドからなる群から選択される1つの置換基で置換されるシクロヘキシルである、前記〔1〕〜〔18〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔23〕前記化合物が、式(Ia):
(Ia)
を有する、前記〔1〕に記載の化合物。
〔24〕前記化合物が、式(Ib)を有し:
(Ib)
式中:
Yが、−NR a R b 及び−OR c からなる群から選択され;
R a 及びR b が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され;またはR a 及びR b が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
R c は、水素及び任意で置換されたC 1 −C 4 アルキルからなる群から選択される、前記〔1〕に記載の化合物。
〔25〕Yが、−OR c である、前記〔24〕に記載の化合物。
〔26〕R c が、水素及びメチルからなる群から選択される、前記〔25〕に記載の化合物。
〔27〕Yが、−NR a R b である、前記〔24〕に記載の化合物。
〔28〕R a 及びR b が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記〔27〕に記載の化合物。
〔29〕R a 及びR b が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する、前記〔28〕に記載の化合物。
〔30〕前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピペリジンである、前記〔29〕に記載の化合物。
〔31〕前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピペリジン及び1つの置換基で置換されたピペリジンからなる群から選択される、前記〔30〕に記載の化合物。
〔32〕R a が、水素である、前記〔27〕に記載の化合物。
〔33〕R b が、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、前記〔32〕に記載の化合物。
〔34〕R b が、水素、C 1 −C 6 アルキル、ヒドロキシアルキル、任意で置換されたアミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホン酸−アルキル、スルホネート−アルキル、アルキルカルボニルアルキル、任意で置換されたC 3 −C 6 −シクロアルキル、及び任意で置換された6員のヘテロシクリルからなる群から選択される、前記〔32〕に記載の化合物。
〔35〕前記化合物が、以下の式(Ib’)
(Ib’)
を有する、前記〔24〕〜〔34〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔36〕前記化合物が、
N−シクロヘキシル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−エチル−2−(5−(ピロリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
N−エチル−2−(5−(ピペリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
1−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−フェニル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
2−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)フェニル)酢酸エチル;
3−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)安息香酸メチル;
メチル−シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
8−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)オクタン酸;
6−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−イル)−6−オキソヘキサン酸;
トランス−メチル−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
N−(トランス−4−(ブチルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((2−ヒドロキシエチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((2−(ジメチルアミノ)エチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ブタン酸;
N−(トランス−4−カルバモイルシクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸;
8−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)オクタン酸;
N−(トランス−4−(シクロヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチル;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ピペリジン−4−イルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((1−アセチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
(6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキシル)カルバミン酸tert−ブチル;
N−(トランス−4−((6−(3’,6’−ジヒドロキシ−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−5(6)−カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((6−アミノヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミドヒドロクロリド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
(11S,14S,17S)−17−アセトアミド−11,14−ビス(カルボキシメチル)−1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキシル)−1,10,13,16−テトラオキソ−2,9,12,15−テトラアザノナデカン−19−オイック酸;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−メチル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−シクロペンチル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(ピリジン−4−イルメチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(3−モルフォリノプロピル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−エチル−2−(5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
N−シクロヘキシル−4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−シクロヘキシル−4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
N−シクロヘキシル−4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
4−(2−(ベンジル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
6−(シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル;
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸カリウム;
トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
トランス−4−(4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−カルバモイルフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(4−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−(ブロモメチル)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−1H−インドール−2−カルボキサミド;
6−(トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;及び
トランス−4−(6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル
からなる群から選択される、前記〔1〕に記載の化合物。
〔37〕Oplophorus由来ルシフェラーゼを前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させることを含む、
前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの阻害方法。
〔38〕前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔37〕に記載の方法。
〔39〕Oplophorus由来ルシフェラーゼの阻害方法であって、
前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを式(II)の化合物:
と接触させることを含み、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR 3 R 4 及び−OR 5 からなる群から選択され;及び
R 3 、R 4 、及びR 5 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記方法。
〔40〕前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔39〕に記載の方法。
〔41〕試料中のOplophorus由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料をセレンテラジン基質及び前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させること;及び
(b)前記試料中の発光を検出すること、
を含み、
前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
〔42〕試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
(a)試料をセレンテラジン基質及び前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させること、前記試料は、
(xvii)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xviii)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;及び
(b)前記試料中の発光を検出すること、
を含み、
発光の検出が、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
〔43〕前記試料を前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を前記セレンテラジン基質と接触させることを含む、前記〔41〕〜〔42〕のいずれか1項に記載の方法。
〔44〕前記第1のタンパク質と第2のタンパク質が相互作用する場合、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第1の断片及び前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第2の断片が、前記セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成する、前記〔42〕に記載の方法。
〔45〕試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
(a)試料をセレンテラジン基質及び前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させること、前記試料は:
(xix)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xx)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;
(b)前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出すること
を含む、前記方法。
〔46〕前記試料が、細胞を含む、前記〔41〕〜〔45〕のいずれか1項に記載の方法。
〔47〕前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを含む、前記〔46〕に記載の方法。
〔48〕前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現する、前記〔46〕に記載の方法。
〔49〕前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、前記〔41〕〜〔48〕のいずれか1項に記載の方法。
〔50〕第1の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第1の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Oplophorus由来ルシフェラーゼである;第2の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第2の融合タンパク質;セレンテラジン基質、及び前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物、を含む、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム。
〔51〕(a)前記〔1〕〜〔36〕のいずれか1項に記載の化合物;及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
〔52〕前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔51〕に記載のキット。
〔53〕セレンテラジン基質をさらに含む、前記〔51〕〜〔52〕のいずれか1項に記載のキット。
〔54〕発光アッセイを実施するための指示書をさらに含む、前記〔51〕〜〔53〕のいずれか1項に記載のキット。
〔55〕試料中のOplophorus由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させること:
を含み、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR 3 R 4 及び−OR 5 からなる群から選択され;及び
R 3 、R 4 、及びR 5 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;及び
(b)前記試料中の発光を検出すること、
前記式(II)の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
〔56〕試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させること、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR 3 R 4 及び−OR 5 からなる群から選択され;及び
R 3 、R 4 、及びR 5 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
前記試料が、
(xxi)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xxii)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;及び
(b)前記試料中の発光を検出すること
を含み、
発光の検出は、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
〔57〕前記試料を式(II)の前記化合物と接触させる前に、前記試料を前記セレンテラジン基質と接触させることを含む、前記〔55〕〜〔56〕のいずれか1項に記載の方法。
〔58〕前記第1のタンパク質と第2のタンパク質が相互作用する場合、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第1の断片及び前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第2の断片が、前記セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成する、前記〔57〕に記載の方法。
〔59〕試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物と接触させること、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR 3 R 4 及び−OR 5 からなる群から選択され;及び
R 3 、R 4 、及びR 5 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
前記試料が、
(xxiii)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(xxiv)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;
(b)前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出すること
を含む、前記方法。
〔60〕前記試料が、細胞を含む、前記〔55〕〜〔59〕のいずれか1項に記載の方法。
〔61〕前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを含む、前記〔60〕に記載の方法。
〔62〕前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを発現する、前記〔60〕に記載の方法。
〔63〕前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、前記〔55〕〜〔62〕のいずれか1項に記載の方法。
〔64〕生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システムであって、
第1の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第1の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Oplophorus由来ルシフェラーゼである;第2の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第2の融合タンパク質;セレンテラジン基質、及び式(II)の化合物、を含み、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR 3 R 4 及び−OR 5 からなる群から選択され;及び
R 3 、R 4 、及びR 5 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム。
〔65〕(a)式(II)の化合物:
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 及びR 2 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
Zが、−NR 3 R 4 及び−OR 5 からなる群から選択され;及び
R 3 、R 4 、及びR 5 が、各々独立して、水素、任意で置換されたC 1 −C 8 アルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキル、任意で置換されたC 3 −C 8 −シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR 3 及びR 4 は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する;及び
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
〔66〕前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記〔65〕に記載のキット。
〔67〕セレンテラジン基質をさらに含む、前記〔65〕〜〔66〕のいずれか1項に記載のキット。
〔68〕発光アッセイを実施するための指示書をさらに含む、前記〔65〕〜〔67〕のいずれか1項に記載のキット。
Claims (24)
- 式(I)の化合物、またはその塩であって:
(I)
式中:
点線は、結合の存在または不在を表し;
Xは、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xは、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xは、OまたはSであり;
Aは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R1は、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;及び
R3及びR4は、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;並びに
(a)Aが、5員のヘテロアリール環、任意でチエニル環もしくはフラニル環であり;R2が、任意で置換されたアリールであり;及び
nが、0、1、2、3、4もしくは5であり;または
(b)Aが、フェニル環であり;
R 2が、任意で置換されたアリールであり;及び
nが、0である
のいずれかである、前記化合物、またはその塩。 - Aが5員のヘテロアリール環である場合、nが、1である、請求項1に記載の化合物。
- 前記点線が、結合の存在を表し、Xが、CHである、請求項1〜2のいずれか1項に記載の化合物。
- R1が、水素、C1−C8アルキル、ハロ−C1−C8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及びアリールアルキルからなる群から選択され;任意で、R1が、水素、エチル、n−ヘキシル、2−(2−メトキシエトキシ)エチル及びベンジルからなる群から選択され;さらに任意で、R1が、エチルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- R2が、置換フェニルであり;任意で、R2が、C1−C4アルキル、シアノ、アミド、C1−C4アルコキシ、及びヒドロキシアルキルからなる群から選択される1つの置換基で置換されたフェニルであり;さらに任意で、R2が、1つのメチル基で置換されたフェニルである、請求項1に記載の化合物。
- R3及びR4が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;任意で、前記環が、任意で置換された単環式の複素環であり;さらに任意で、前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピロリジン、ピペリジン及びピペラジンからなる群から選択され;さらにまた任意で、前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピロリジン、未置換ピペリジン、1つの置換基で置換されたピペリジン、または1つの置換基で置換されたピペラジンからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- R3が、水素である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- R4が、未置換C1−C8アルキル、ハロ−C1−C8−アルキル、カルボキシ−C1−C8−アルキル、C1−C4−アルコキシカルボニル−C1−C8−アルキル、任意で置換されたフェニル、任意で置換されたC5−C6シクロアルキル、任意で置換されたC5−C6−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;任意で、R4が、未置換であるかまたは1つの置換基で置換されたフェニルであり;さらに任意で、前記置換基が、C1−C4−アルコキシカルボニル、及びC1−C4−アルコキシカルボニル−C1−C4−アルキルからなる群から選択される、請求項1〜5及び7のいずれか1項に記載の化合物。
- R4が、カルボキシ、C1−C4−アルコキシカルボニル、C1−C8−アルキルアミド、ヒドロキシ−C1−C8−アルキルアミド、アミド、任意で置換されたアミノ−C1−C8−アルキルアミド、C1−C4−ジアルキルアミノ−C1−C8−アルキルアミド、カルボキシ−C1−C8−アルキルアミド、スルホン酸−C1−C8−アルキルアミド、スルホネート−C1−C8−アルキルアミド、C1−C4−アルキルカルボニル−C1−C8−アルキルアミド、任意で置換されたC3−C6−シクロアルキルアミド、及び任意で置換されたヘテロシクリルアミドからなる群から選択される1つの置換基で置換されるシクロヘキシルである、請求項1〜5及び7のいずれか1項に記載の化合物。
- Yが、−ORcであり、任意で、Rcが、水素及びメチルからなる群から選択され、もしくはYが、−NRaRbであり;任意で、Ra及びRbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;さらに任意で、前記環が、任意で置換された単環式の複素環であり;さらに任意で、前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピペリジンであり、任意で、前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピペリジン及び1つの置換基で置換されたピペリジンからなる群から選択される、請求項11に記載の化合物。
- Raが、水素であり、任意で、Rbが、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリル;、C1−C6アルキル、ヒドロキシアルキル、任意で置換されたアミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホン酸−アルキル、スルホネート−アルキル、アルキルカルボニルアルキル、及び任意で置換された6員のヘテロシクリルからなる群から選択される、請求項12に記載の化合物。
- N−シクロヘキシル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−エチル−2−(5−(ピロリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
N−エチル−2−(5−(ピペリジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
1−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−フェニル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
2−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)フェニル)酢酸エチル;
3−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)安息香酸メチル;
メチル−シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
8−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)オクタン酸;
6−(4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)ピペリジン−1−イル)−6−オキソヘキサン酸;
トランス−メチル−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
N−(トランス−4−(ブチルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((2−ヒドロキシエチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((2−(ジメチルアミノ)エチル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ブタン酸;
N−(トランス−4−カルバモイルシクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸エチル;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボニル)ピペリジン−4−カルボン酸;
8−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)オクタン酸;
N−(トランス−4−(シクロヘキシルカルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチル;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−(ピペリジン−4−イルカルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((1−アセチルピペリジン−4−イル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
(6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキシル)カルバミン酸tert−ブチル;
N−(トランス−4−((6−(3’,6’−ジヒドロキシ−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−5(6)−カルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−(トランス−4−((6−アミノヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミドヒドロクロリド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
トランス−4−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
(11S,14S,17S)−17−アセトアミド−11,14−ビス(カルボキシメチル)−1−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキシル)−1,10,13,16−テトラオキソ−2,9,12,15−テトラアザノナデカン−19−オイック酸;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−メチル−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−シクロペンチル−4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(ピリジン−4−イルメチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(3−モルフォリノプロピル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−エチル−2−(5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−4−イル)−N−(m−トリル)アセトアミド;
4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
N−シクロヘキシル−4−(2−オキソ−2−(m−トリルアミノ)エチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
N−シクロヘキシル−4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(4−(2−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
N−シクロヘキシル−4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
メチル−トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキシレート;
4−(2−(ベンジル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボン酸メチル;
6−(シス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸メチル;
6−(トランス−4−((4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)メチル)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン酸;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸カリウム;
トランス−4−(4−(2−(ヘキシル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸;
トランス−4−(4−(2−(エチル(フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−シアノフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−カルバモイルフェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−メトキシフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(o−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(6−メチル−3,4−ジヒドロキノリン−1(2H)−イル)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(p−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(4−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−フロ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド;
6−(トランス−4−(4−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソプロピルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−(ブロモメチル)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−((3−(ジメチルアミノ)フェニル)(エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(4−(2−(エチル(3−イソブチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−4H−チエノ[3,2−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;
1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−(トランス−4−((6−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル)シクロヘキシル)−1H−インドール−2−カルボキサミド;
6−(トランス−4−(1−(2−(エチル(3−エチルフェニル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−インドール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボキサミド)ヘキサン−1−スルホン酸ナトリウム;
トランス−4−(1−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−1H−ピロール−2−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル;及び
トランス−4−(6−(2−(エチル(m−トリル)アミノ)−2−オキソエチル)−6H−チエノ[2,3−b]ピロール−5−カルボキサミド)シクロヘキサン−1−カルボン酸メチル
からなる群から選択される、化合物。 - Oplophorus由来ルシフェラーゼの阻害方法であって、
前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを式(II)の化合物:
(II)
と接触させることを含み、
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 が、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
R 2 が、任意で置換されたアリールであり;
Zが、−NR3R4であり;及び
R3及びR4が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し;任意で、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む、前記方法。 - 試料中のOplophorus由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
(a)前記試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物:
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 が、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
R 2 が、任意で置換されたアリールであり;
Zが、−NR3R4であり;及び
R3及びR4が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する;
と接触させること;並びに
(b)前記試料中の発光を検出すること、
を含み、
式(II)の化合物が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。 - 試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物:
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 が、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
R 2 が、任意で置換されたアリールであり;
Zが、−NR3R4であり;及び
R3及びR4が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する;
と接触させること、前記試料は、
(i)Oplophorus由来ルシフェラーゼの第1の断片及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(ii)前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの第2の断片及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;並びに
(b)前記試料中の発光を検出すること、
を含み、
発光の検出が、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。 - 前記試料を式(II)の化合物と接触させる前に、前記試料を前記セレンテラジン基質と接触させること;任意で、前記第1のタンパク質と第2のタンパク質が相互作用する場合、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第1の断片及び前記Oplophorus由来ルシフェラーゼの前記第2の断片が、前記セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成することを含む、請求項17〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
(a)試料をセレンテラジン基質及び式(II)の化合物:
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 が、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
R 2 が、任意で置換されたアリールであり;
Zが、−NR3R4であり;及び
R3及びR4が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する;
と接触させること、前記試料は:
(i)生物発光ドナーであるOplophorus由来ルシフェラーゼ及び第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
(ii)蛍光アクセプター分子及び第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み;
(b)前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出すること
を含む、前記方法。 - 前記試料が、細胞を含み;任意で、前記細胞が、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼを含むか、または発現するかである、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第1の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Oplophorus由来ルシフェラーゼである;第2の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第2の融合タンパク質;セレンテラジン基質、及び式(II)の化合物;
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 が、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
R 2 が、任意で置換されたアリールであり;
Zが、−NR3R4であり;及び
R3及びR4が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
を含む、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム。 - (a)式(II)の化合物:
(II)
式中:
点線が、結合の存在または不在を表し;
nが、0、1、2、3、4、または5であり;
Xが、CH、N、O、またはSであり;
前記点線が結合の存在を表す場合、Xが、CHまたはNであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Xが、OまたはSであり;
Aが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された5または6員のヘテロアリール環であり;
R 1 が、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され;
R 2 が、任意で置換されたアリールであり;
Zが、−NR3R4であり;及び
R3及びR4が、各々独立して、水素、任意で置換されたC1−C8アルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキル、任意で置換されたC3−C8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され;またはR3及びR4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する;並びに
(b)Oplophorus由来ルシフェラーゼ;任意で、前記Oplophorus由来ルシフェラーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を含む;
を含むキットであり;
前記キットが、さらに任意で:
セレンテラジン基質及び/または発光アッセイを実施するための指示書
を含む、キット。
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