JP3844082B2 - 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 Download PDFInfo
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(1)野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、217及び315位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの217及び315位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
(2)野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである(1)記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
(3)疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン若しくはフェニルアラニンである(1)又は(2)記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
(4)(1)又は(2)記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DNA。
(5)(4)記載の組み換え体DNAを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
(6)野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、217及び315位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの217及び315位と同等位置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
(7)野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである(6)記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
本発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフェラーゼが提供される前提として、野性型のホタルのルシフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体DNAを調製することが必要である。野性型ホタルの遺伝子等の種類は、提供が企図される耐熱性ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そして、ホタル由来のものであれば、如何なるものでも用いることが可能であり、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米ボタル等由来のものを用いることが可能である。
(1)作用適温の範囲:0〜65℃である。
(2)pH、温度等による失活の条件:
i)pH4.0以下はpH12.0以上で4時間後完全に失活する。
(3)熱安定性:温度52℃、20分間の処理で80%以上の残存酵素活性を有し、温度52℃、60分間の処理でも65%以上の残存酵素活性を有する。
(4)発光波長:620±5nmまた、当該耐熱性ホタルルシフェラーゼのうち耐熱性北米ボタルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、Deluca,M.et al.,Methods Enzymol.72,3−15(1978)記載の野生型北米ボタルのルシフェラーゼと同様である。
(1)温度等による失活の条件:pH7.8において温度55℃、60分間の熱処理により完全に失活する。
(2)熱安定性:温度40℃、20分間及び60分間の処理で夫々80%以上及び65%以上の残存酵素活性を有する。
(3)発光波長:620±5nm
先ず、組み換え体pHLf7−217LeuDNA〔プラスミドpUC119DNAに217番目のAlaがLeuに置換された耐熱変異のヘイケボタル(Luciola lateralis)ルシフェラーゼ遺伝子(特開平5−244942号公報記載)が挿入されたもの。〕の1本鎖DNAをヘルパーファージM13 K07(宝酒造社・製)を用いて調製し、DNAModel392シンセサイザー(Applied Biosystems社製)を用いて合成したオリゴヌクレオチドSLF15(AGGAATAAAGAACTCTTCACAGTT)とオリゴヌクレオチド−ダイレクティッド インビトロ ミュータジェネシス システム バージョン2(Amersham社・製)を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変えずにルシフェラーゼ遺伝子の内部に存在するEcoRI部位を除去した組み換え体プラスミドpHLf107DNAを得た。
次にLlL−217Lの315番目のアラニンを疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換させる方法を記載する。大腸菌JM101(pHLf107)にヘルパーファージM13K07(宝酒造社製)を感染させることにより、メッシング(Messing)の方法〔メソズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第101巻、第20〜78項(1983)〕に従って1本鎖DNAを調製した。得られた1本鎖DNAによる部位特異的変換はインビトロ ミュータジェネシス システム バージョン2.0(アマシャム社製)を用いて行なった。なお、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、合成DNASLF129(配列番号1記載)を合成した。なお、SLF129内のnがgの場合LlL−217Lの315番目のAlaがLeuに置換される。同様にtの場合にはIle、aの場合にはPheに置換される。
次に北米ボタルのルシフェラーゼのヘイケボタルの315位と同等の位置の残基を疎水性アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンに変換させる方法を記載する。北米ホタルルシフェラーゼ(PpL)のアミノ酸配列において、ヘイケボタルルシフェラーゼ(LlL)の315位のアミノ酸残基と同等の位置を見い出すために、ベックマン社製のアミノ酸相同性解析用ソフトMicro GenieTMを用いて両者のアミノ酸配列を解析したところ、PpLの313位のAlaがLlLの315位に相当することが明らかになった。組み換え体DNAプラスミドpT3/T7−LUC(東洋紡・社・製)〔野性型北米ホタルルシフェラーゼ(PpL)の遺伝子を含有する〕よりPpL遺伝子を含有する1.9KbのBamHIを切り出し、プラスミドpUC119(宝酒造社・製)のBamHI部位にPpL遺伝子の転写方向をラクトースプロモーターの転写方向と同じ向きに挿入した組み換え体プラスミドpALf301を得た。
Claims (4)
- ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、217位のアミノ酸がロイシンに、及び315位のアミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンに変異されているアミノ酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。
- 請求項1記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DNA。
- 請求項2記載の組み換え体DNAを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。
- ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、217位のアミノ酸がロイシンに、及び315位のアミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンに変異されていることを特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
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