JP6398295B2 - 変異型グルコース−6−リン酸脱水素酵素 - Google Patents
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項1. 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項2. 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項3. 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項4. 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項5. 項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているDNA。
項6. 下記(i)又は(ii)に示すDNAである、項5に記載のDNA。
(i)配列番号76、80、64、52、56、62、66、68、70、72、又は8
4に示す塩基配列からなるDNA、
(ii)グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列か
らなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号76、80、64、52、56、62、66、68、70、72、又は84に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列を含むDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
項7. 項5又は6に記載のDNAを含む組換えベクター。
項8. 項7に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項9. 宿主が大腸菌である、項8に記載の形質転換体。
項10. 項8又は9に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
本発明のポリペプチドは、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、G6PDH活性を有し、野生型G6PDHよりも補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチドである。
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における、46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における、46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。
下記Km測定試薬を調製し、該測定試薬0.87mlを分光光度計用セルに入れ、30℃で5分間以上プレインキュベートする。下記酵素希釈液でG6PDHを希釈した酵素活性測定溶液0.03mLを分光光度計用セルに添加してよく混合し、30℃で予めインキュベートされた分光光度計で、340nmの吸光度変化を60秒間記録し、1分間あたりの吸光度変化(ΔOD/分)を測定する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに酵素希釈液を酵素活性測定試薬に混合して上記のように吸光度変化(ΔODblank/分)を測定する。前記反応速度VをΔOD/分からΔODblank/分を差し引いた値として算出し、各NAD濃度におけるVを記録する。
(Km測定試薬)
84mMトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)、40mM塩化マグネシウム、2.6mMグルコース−6−リン酸、及び0.78mM〜8.0mMのNADを含有する水溶液。
(酵素希釈液)
50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)
(測定モード)
Number of Substrate:1
Type of study:Single Substrate
Maximum Number of Velocity Replicates:2
Analysis:Fit to Model
Equation:Michaelis−Menten
Equation Code:Vmax*S/(Km+S)
(試薬)
100mM トリス−塩酸緩衝液(pH9.0)
22.5mM NADP+水溶液
33.0mM グルコース−6−リン酸水溶液
1M 塩化マグネシウム水溶液
酵素活性測定試薬:上記トリス−塩酸緩衝液を25.20mL、NADP+水溶液を1.20mL、グルコース−6−リン酸水溶液を2.40mL、および塩化マグネシウム水溶液を1.20mL混合して酵素活性測定試薬とする。
酵素活性測定溶液:ペプチド(G6PDH)を所望の濃度に希釈するための溶液(以下、「酵素希釈液」と表記することもある)として、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)を使用し、以下の活性値が5〜10U/mLとなるように酵素の原液(以下、「酵素原液」ともいう)を希釈して酵素活性測定溶液とする。
酵素活性測定試薬3.00mLを分光光度計用セルに入れ、30℃で3分間以上プレインキュベートする。酵素活性測定溶液0.01mLを分光光度計用セルに添加してよく混合し、30℃で予めインキュベートされた分光光度計で、340nmの吸光度変化を60秒間記録し、1分間当たりの吸光度変化(ΔOD/分)を測定する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに酵素希釈液を酵素活性測定試薬に混合して上記のように吸光度変化(ΔODblank/分)を測定する。これらの値から、以下の式に従って1mL当たりのG6PDH活性を求める。
本発明のポリペプチドをコードしているDNA(以下、「本発明のDNA」と表記することもある)は、例えば、野生型G6PDHをコードしているDNAに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。
F:フェニルアラニン(ttt)、L:ロイシン(ctg)、I:イソロイシン(att)、M:メチオニン(atg)、V:バリン(gtg)、Y:チロシン(tat)、終止コドン(taa)、H:ヒスチジン(cat)、Q:グルタミン(cag)、N:アスパラギン(aat)、K:リジン(aaa)、D:アスパラギン酸(gat)、E:グルタミン酸(gaa)、S:セリン(agc)、P:プロリン(ccg)、T:スレオニン(acc)、A:アラニン(gcg)、C:システイン(tgc)、W:トリプトファン(tgg)、R:アルギニン(cgc)、G:グリシン(ggc)。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを含む組換えベクター(以下、本発明の組換えベクターと表記することもある)は、発現ベクターに本発明のDNAを挿入することにより得ることができる。
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体(以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある)が得られる。
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
(1−1)野生型G6PDH遺伝子の単離と配列解読
ジオバチルス・ステアロサーモフィラスUK−563株の水懸濁液、配列番号1及び配列番号2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(オペロンバイオテクノロジー株式会社製)を準備した。表1に示すPCR反応溶液を調製し、98℃:10秒、54℃:30秒、68℃:90秒のPCR反応を30サイクル実施した。
発現用ベクターにはpTrc99A(Pharmacia Biotech製)を選択した。pTrc99Aはマルチクローニング部位(MCS)の上流にtrcプロモーター配列、MCSの下流に転写終了シグナル配列を含有する。MCS内には制限酵素NcoI認識配列、及び制限酵素BamHI認識配列が含まれ、NcoI認識配列はtrcプロモーター配列に並列しているため、翻訳開始コドンのATGをもつDNA断片を結合させることにより、直接発現させることができる。pTrc99Aのサイズは約4.2kbpである。
以下の手順により、発現用組換えベクターを得るためのpTrc99Aの前処理を行なった。表3に示す反応溶液を調製し、37℃で3時間インキュベートすることにより、約2μgのpTrc99Aを制限酵素NcoI(タカラバイオ株式会社製)により切断した。
以下の手順により、発現用組換えベクターを得るための前処理を行なった。配列番号5、配列番号6に記載のオリゴヌクレオチドDNAを準備した。表5に示すPCR反応溶液を調整し、98℃:10秒、52℃:30秒、68℃:90秒のPCR反応を18サイクル実施した。
上記のように前処理したpTrc99AのDNA断片とG6PDHのDNA断片を、Ligation high(東洋紡株式会社製)を用いてT4リガーゼの作用により結合させた。1μlの該反応溶液を10μlの大腸菌DH5αケミカルコンピテントセル(タカラバイオ株式会社製)に添加し、42℃のヒートショックにより形質転換させ、LB寒天培地上で、37℃、18時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。表5の鋳型DNA以外を混合したPCR反応溶液を使用したコロニーPCRにより、G6PDH断片を含む形質転換体のコロニーを選抜し、該コロニーをLB液体培地に植菌し、一晩培養した後、アルカリ−SDS法によりプラスミドを精製した。
(2−1)形質転換体の作製と培養
pTrcG6PDHにより大腸菌BL21(タカラバイオ株式会社製)を形質転換した形質転換体のコロニーを用意した。比較用に、pTrc99Aにより大腸菌BL21を形質転換した形質転換体のコロニーも用意した。
培養後の形質転換体を6,000×gで10分間、遠心分離して回収し、20mMトリス緩衝液(pH9.0)を40ml添加して菌体を懸濁し、超音波破砕により破砕した。該破砕液を10,000×gで20分間、遠心分離して上清を回収した。該上清を、粗酵素液として活性測定に使用した。
前記粗酵素液を用いてG6PDHを精製した。該粗酵素液を60℃で60分間、熱処理した後、急冷した。10,000×g、40分間の遠心分離により変性したタンパク質を含む宿主由来の共雑物を沈殿させ、上清を回収した。20mMトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)で平衡化したRESOURCE Qカラム(GEヘルスケア製)に吸着させた。0M〜1Mの塩化ナトリウムの濃度勾配によりG6PDH活性画分が溶出された。該G6PDH活性画分に40%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、40%飽和硫安を含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)で平衡化したRESOURCE PHEカラム(GEヘルスケア製)に吸着させた。40%〜0%飽和硫安の濃度勾配により、G6PDH活性画分が溶出された。該画分を回収してAmicon(登録商標)Ultra−15(ミリポア社製)により濃縮し、20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)にバッファー交換した。得られたG6PDH活性画分をSDS−PAGEに供し、約55kDaの単一のバンドのみが観察されたので、精製G6PDHとした。以下、本酵素を単に野生型G6PDHと表記することもある。
(3−1)部位特異的変異導入
野生型G6PDHのアミノ酸配列(配列番号4に示すアミノ酸配列)の46番目のアルギニン(R)を別のアミノ酸残基に変更するように設計した表7に示すオリゴヌクレオチドを材料に、PCRによる部位特異的変異導入を行なった。オリゴヌクレオチドは、配列番号3に示す塩基配列の124番目から150番目の間において、アルギニンのコドン(CGC)を置換するように設計し、その相補鎖も設計した。例えば、R46F変異体の作成には、前記コドン(CGC)をフェニルアラニンのコドン(TTC)に置換した配列番号10に示すオリゴヌクレオチドと、その相補鎖の配列番号11に示すオリゴヌクレオチドを使用した。PCRの鋳型には前記pTrcG6PDHを用い、試薬には市販のQuikChange Lightning Site−Directed Mutagenesis Kit(アジレントテクノロジー社製)を使用し、方法はキットに添付の取扱説明書に従った。
前記19種類の変異体遺伝子を含む組換えベクターを夫々用いて、参考例2に記載した方法に従って形質転換体を取得し、培養することにより変異型G6PDHを発現させた。培養液を一部回収して遠心分離により形質転換体を回収し、1mlの20mMトリス緩衝液(pH9.0)に懸濁して超音波破砕し、遠心分離した上清を粗酵素液として活性測定に供した。いずれの変異体もG6PDH活性が検出されたので、参考例2に記載した方法に従って精製した。
(4−1)補酵素NADへの親和性の比較
参考例2で精製された野生型G6PDH、及び実施例1で精製された19種類の変異体G6PDHを用いて、補酵素NADへの親和性の指標である「NADに対するKm値」を求めた。
前記野生型G6PDH及び19種類の変異型G6PDHを50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)でタンパク質濃度が1.0mg/mlとなるように希釈した。希釈した酵素液を60℃で60分間、加熱熱処理した。加熱処理後のG6PDH活性の残存率(%)を表9に示す。比較例として、ロイコノストック・メセンテロイデス由来G6PDH(SIGMA製)の測定結果も示す。
Claims (10)
- 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。 - 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。 - 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。 - 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、46番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列における46番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号4に示すアミノ酸配列に対する46番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるグルコース−6−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素NADに対する親和性が向上しているポリペプチド。 - 請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているDNA。
- 配列番号76、80、64、52、56、62、66、68、70、72、又は84に示す塩基配列からなるDNAである、請求項5に記載のDNA。
- 請求項5又は6に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主が大腸菌である、請求項8に記載の形質転換体。
- 請求項8又は9に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
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