JPH04258289A - Ｎａｄ親和性グルコースデヒドロゲナーゼ及びその製 造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来
のＮＡＤ親和性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下「Ｇ
ＤＨ」という。）及び該酵素をコードするＤＮＡを大腸
菌用ＤＮＡ導入ベクターに組み込んだ大腸菌内で複製可
能な組換えＤＮＡ、それを含む形質転換体及びそれを用
いるＮＡＤ親和性ＧＤＨの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＧＤＨ〔ＥＣ　　１．１．１．４７〕は
、グルコース定量用酵素として臨床検査及び食品工業の
分野において重要な酵素として使用されている。従来、
ＧＤＨを生産する微生物としては、バチルス・メガテリ
ウム、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅ
ｒｅｕｓ）等のバチルス属菌が知られている（特開昭５
３−１３７１９９号）。

【０００３】バチルス・メガテリウム由来のＧＤＨは分
子量約３００００の同一サブユニットからなる四量体酵
素として知られている。また、従来より知られているＧ
ＤＨは補酵素としてＮＡＤよりもＮＡＤＰに親和性が高
い性質を有している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の理由により、グ
ルコース定量用キットの試薬組成において、補酵素とし
てはＮＡＤＰを使用する方が望ましい。しかし、現在で
は経済性などの点からＮＡＤが使用されている。ＮＡＤ
ＰよりもＮＡＤにより親和性が高いＧＤＨが得られれば
、現在よりも経済性に優れ、且つ安定性に優れたキット
を構成することが可能となるため、従来のＧＤＨと異な
り、ＮＡＤＰよりもＮＡＤにより親和性の高いＧＤＨ（
以下、「ＮＡＤ親和性ＧＤＨ」という。）及びそれをよ
り安価に製造する方法の開発が望まれていた。

【０００５】最近になってバチルス・メガテリウム由来
のＧＤＨ遺伝子を大腸菌に組み入れた組換え体を用いた
ＧＤＨの生産方法が開示された〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．）１７４巻、４８５〜４９０頁、（１９８８
）〕。

【０００６】バチルス・メガテリウム由来のＧＤＨ遺伝
子は複数個存在することが示され、それらを用いて形質
転換体を得、ＧＤＨを生産しているが、使用しているベ
クターはＧＤＨの大量生産には向かないものであった。

【０００７】本発明者らは、既にＧＤＨをより安価に製
造するため、バチルス・メガテリウム由来のＧＤＨ遺伝
子を高発現ベクターｐＫＫ２２３−３に組み入れて形質
転換体を得、該形質転換体を栄養培地で培養することに
よってＧＤＨを高生産することに成功している（特開平
２−７２８７８）。

【０００８】さらに検討してバチルス・メガテリウム由
来のＧＤＨをコードするＤＮＡのアミノ酸配列で示され
る特定の位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換して得
られる改良型ＤＮＡを大腸菌に組み入れた形質転換体を
栄養培地で培養したところ、培養物中に従来のＧＤＨよ
り熱安定性に優れたＧＤＨを大量に製造せしめることに
も成功している（特開平２−８６７７９）。

【０００９】

【課題を解決するための手段・作用】本発明は前記発明
について更に検討を重ね、バチルス・メガテリウムＩＡ
Ｍ１０３０由来のＮＡＤ親和性ＧＤＨをコードする遺伝
子の塩基配列を決定し、該ＧＤＨが従来知られているＧ
ＤＨのアミノ酸配列と異なった配列を有することを見い
だした。さらに、本ＤＮＡを大腸菌に組み入れた形質転
換体を栄養培地で培養したところ、培養物中に従来のＧ
ＤＨよりＮＡＤにより親和性の高いＮＡＤ親和性ＧＤＨ
を製造することに成功して本発明を完成した。

【００１０】バチルス・メガテリウム由来のＮＡＤ親和
性ＧＤＨをコードするＤＮＡを調製するために使用する
菌株としては、ＧＤＨ生産能を有するバチルス・メガテ
リウムであればいずれのものも使用できるが、好ましく
はバチルス・メガテリウムＩＡＭ１０３０を用いるのが
よい。

【００１１】以下、実施例を記載しながら本発明を詳述
する。

【実施例】（１）　　ＧＤＨの精製 バチルス・メガテリウムＩＡＭ１０３０を２ＸＴＹブロ
スに植菌し、培養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して
得られる上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたＧ
ＤＨ粗酵素粉末１０５μｇをグリセロール１０％含有イ
ミダゾール緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）１５ｍｌに
溶解し、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０に吸着させ
た後、食塩濃度勾配（０．１Ｍ−０．５Ｍ）により溶出
させ、活性画分を集め脱塩濃縮する。次にＴＳＫ−ゲル
ＤＥＡＥ−３−ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラ
フィーにより分子量分画を行い、さらにＴＳＫ−ゲルＧ
３０００−ＳＷを担体とする高速液体クロマトグラフィ
ーにより吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分（蛋
白質量として約５ｍｇ）を得た。

【００１２】（２）　　バチルス・メガテリウムからの
全ＤＮＡの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）
、７２巻、６１９頁（１９６３）〕に従ってバチルス・
メガテリウムＩＡＭ１０３０から全ＤＮＡを抽出精製し
た。

【００１３】（３）　　ＮＡＤ親和性ＧＤＨのクローニ
ング （２）の工程で得られた染色体ＤＮＡをサザンハイブリ
ダイゼーションにより解析した。プローブとしては発明
者らが既に取得しているＧＤＨの構造遺伝子（ｇｄｈＩ
Ｉ）０．９ｋｂを使用した。〔ジャーナル・オブ・ファ
ーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（
Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、７０巻、６号
、３６３−３６９頁（１９９０）〕

【００１４】図１に示すようにＨｉｎｄＩＩＩでの消化
や、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ等の消化で４本のシグナルが
見られることより４種のＧＤＨアイソザイム遣伝子の存
在が示唆された。

【００１５】本発明者らはＢｇｌＩＩの３ｋｂ付近の染
色体断片及びＰｓｔＩの６ｋｂ付近の染色体断片を用い
て、特開平２−８６７７９に記載された方法を準用して
形質転換体を調製し、ＧＤＨ活性のある株をスクリーニ
ングした。

【００１６】ＢｇｌＩＩの３ｋｂ付近の断片からは３０
００株より１株、（ＰｓｔＩの６ｋｂ付近の断片からは
１２００株より２株の陽性株を得た。

【００１７】得られた陽性株を解析してプラスミドｐＧ
ＤＢ３及びｐＧＤＢ４の制限酵素地図を作成したところ
、以前に取得した遺伝子（ｇｄｈＩ及びｇｄｈＩＩ）を
コードするｐＧＤＢ１及びｐＧＤＢ２とは全く異なった
制限酵素地図を示した（図２に示す）。

【００１８】新たに得られたｇｄｈＩＩＩ及びｇｄｈＩ
Ｖの塩基配列及びそれより推定されるアミノ酸配列を決
定した。配列表の配列番号：１においてＮ末端から１６
７位のＡがグルタミン、２５８位のＢがスレオニンのと
きはｇｄｈＩＩＩのＧＤＨをコードするアミノ酸配列を
示し、Ａがロイシン、ＢがアラニンのときはｇｄｈＩＶ
のＧＤＨをコードするのアミノ酸配列を示す。

【００１９】図３にはＧＤＨの遺伝子ｇｄｈＩ、ｇｄｈ
ＩＩ、ｇｄｈＩＩＩ、ｇｄｈＩＶ及びバチルス・メガテ
リウムＭ１２８６由来のＧＤＨ遺伝子（ｇｄｈＡ）〔Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７４巻、４８５−４９
０頁（１９８８）〕との比較を示す。

【００２０】ｇｄｈＩからｇｄｈＩＶ及びｇｄｈＡはＡ
ＴＧで始まる７８３塩基、つまり２６１個のアミノ酸か
らなる分子量約２８０００の酵素をコードし、上流部に
ＳＤ領域が確認される。

【００２１】ｇｄｈＩＩＩとｇｄｈＩＶの上流部及び下
流部にはホモロジーは認められないが、ｇｄｈＩＶとｇ
ｄｈＡとではホモロジーが高い結果となっている。

【００２２】表１はこれらの５つの遺伝子（ｇｄｈＩ、
ｇｄｈＩＩ、ｇｄＨＩＩＩ、ｇｄｈＩＶ及びｇｄｈＡ）
の塩基配列のホモロジーを比較した表である。

【００２３】

【表１】

【００２４】各酵素遺伝子保持株よりプラスミドＤＮＡ
を調製し、常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を
行い、変異点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列
上の変化を確認した。

【００２５】図４はアミノ酸配列でホモロジーを比較し
たものである。ＧＤＨ（Ｉ）（ｇｄｈＩに対応）、ＧＤ
Ｈ（ＩＩ）（ｇｄｈＩＩに対応）、ＧＤＨ（ＩＩＩ）（
ｇｄｈＩＩＩに対応）、ＧＤＨ（ＩＶ）（ｇｄｈＩＶに
対応）及びＧＤＨ（Ａ）（ｇｄｈＡに対応）を比較した
とき、ＧＤＨ（ＩＶ）とＧＤＨ（Ａ）ではＮ末端から２
０４位が異なっているのみであり、ＧＤＨ（ＩＩＩ）と
ＧＤＨ（ＩＶ）とではＮ末端から１６７位および２５８
位が異なっているのみである。また、ＧＤＨ（ＩＩＩ）
、ＧＤＨ（ＩＶ）とＧＤＨ（ＩＩ）及びＧＤＨ（Ｉ）で
は多箇所の違いがみられた。

【００２６】次いで各プラスミドでエシエリヒア・コリ
ＪＭ１０３を形質転換して得られた各形質転換体につい
て２ＸＴＹブロス培地で３７℃，１８時間培養し、集菌
後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離後、得られた
上澄液をＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフ
ィーで電気泳動的に均一まで精製し、その酵素化学的性
質を比較した。また、その比活性は各々、４４３ｕ／ｍ
ｇ、２６９ｕ／ｍｇ、６３８ｕ／ｍｇ及び６８９ｕ／ｍ
ｇであった。尚、ＧＤＨの酵素活性は以下の方法に従っ
て測定した。

【００２７】Ｄ−グルコース０．１Ｍ、ＮＡＤ　　２ｍ
Ｍを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）７５ｍＭに酵
素液を加えて光度計セル内にて３０℃で反応させ、３４
０ｎｍにおける吸光度の増大を測定する。反応の１分間
に１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを生成する酵素活性を１単位
と定め、比活性は酵素液中の蛋白質１ｍｇ当りの単位数
として示した。

【００２８】（１）　　基質特異性の比較

【００２９】

【表２】

【００３０】（２）　　ＮＡＤとＮＡＤＰに対する反応
速度の比較（補酵素５０μＭ、Ｄ−グルコース１００ｍ
Ｍでの比較）

【００３１】

【表３】

【００３２】（３）　　　　動力学定数の比較

【００３
３】

【式１】

【００３４】ＮＡＤの場合

【００３５】

【表４】

【００３６】ＮＡＤＰの場合

【００３７】

【表５】

【００３８】（４）　　温度安定性 ２ＭのＮａＣｌの存在下と非存在下で５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）、２０分間処理した後のＧＤＨの残
存活性を測定する。その結果を、図５及び図６に示す。

【００３９】（５）　　ｐＨ安定性 ２ＭのＮａＣｌの存在下と非存在下で各緩衝液中に３０
℃、２０分間放置した後の残存活性を測定する（ｐＨ４
〜６は７５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６〜７．５は７５ｍＭ
リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜８．５は７５ｍＭトリス−
塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１０．５は７５ｍＭグリシン
−ＮａＯＨ緩衝液を使用）。その結果を、図７及び図８
に示す。

【００４０】以上の結果より、本発明のＧＤＨは従来の
ＧＤＨと比較してＮＡＤに対する親和性が高いこと、従
来のＧＤＨと比較してＮａＣｌの影響を受け易いことな
ど、従来知られている酵素とは異なる性質を持っている
ことが判る。

【００４１】

【発明の効果】本発明により、グルコース定量用キット
の試薬組成において、補酵素への親和性がＮＡＤＰより
もＮＡＤに高いＧＤＨを使用することによって、より経
済性に優れ且つ安定性に優れたキットを構成することが
できる。

【配列表】

【００４２】

【図面の簡単な説明】

【図１】サザン・ハイブリダイゼーション分析の結果を
示す。

【図２】プラスミドｐＧＤＢ１、ｐＧＤＢ２、ｐＧＤＢ
３及びｐＧＤＢ４の制限酵素地図を示す。

【図３】ＧＤＨの遺伝子ｇｄｈＩ、ｇｄｈＩＩ、ｇｄｈ
ＩＩＩ、ｇｄｈＩＶ及びｇｄｈＡの比較を示す。

【図４】アミノ酸配列でＧＤＨ（Ｉ）、ＧＤＨ（ＩＩ）
、ＧＤＨ（ＩＩＩ）、ＧＤＨ（ＩＶ）及びＧＤＨ（Ａ）
のホモロジーを比較を示す。

【図５】ＧＤＨ（ＩＩＩ）及びＧＤＨ（ＩＶ）の２Ｍの
ＮａＣｌ存在下で５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
、２０分間処理した後のＧＤＨの残存活性を示す。 図中で−●−はＧＤＨ（ＩＩＩ）を示し、−○−はＧＤ
Ｈ（ＩＶ）を示す。

【図６】ＧＤＨ（ＩＩＩ）及びＧＤＨ（ＩＶ）のＮａＣ
ｌ非存在下で５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、２
０分間処理した後のＧＤＨの残存活性を示す。図中で−
●−はＧＤＨ（ＩＩＩ）を示し、−○−はＧＤＨ（ＩＶ
）を示す。

【図７】ＧＤＨ（ＩＩＩ）及びＧＤＨ（ＩＶ）の２Ｍの
ＮａＣｌ存在下で各ｐｈ緩衝液中に３０℃、２０分間放
置した後の残存活性を示す。図中で−●−はＧＤＨ（Ｉ
ＩＩ）を示し、−○−はＧＤＨ（ＩＶ）を示す。

【図８】ＧＤＨ（ＩＩＩ）及びＧＤＨ（ＩＶ）のＮａＣ
ｌ非存在下で各ｐＨ緩衝液中に３０℃、２０分間放置し
た後の残存活性を示す。図中で−●−はＧＤＨ（ＩＩＩ
）を示し、−○−はＧＤＨ（ＩＶ）を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列表の配列番号：１で示されるバチ
   ルス・メガテリウム由来のＮＡＤ親和性グルコースデヒ
   ドロゲナーゼ。
2. 【請求項２】　　請求項１のＮＡＤ親和性グルコースデ
   ヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを大腸菌導入ベクタ
   ーに組み込んだ大腸菌内で複製可能な組換えＤＮＡ。
3. 【請求項３】　　請求項２の組換えＤＮＡを導入したエ
   シエリヒア・コリ。
4. 【請求項４】　　請求項３の形質転換体を栄養培地で培
   養し、ＮＡＤ親和性グルコースデヒドロゲナーゼを培養
   物中に産生せしめ、該培養物中よりＮＡＤ親和性グルコ
   ースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするＮＡ
   Ｄ親和性グルコースデヒドロゲナーゼの製造法。