CN113151210B - 一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用 - Google Patents
一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用，所述过氧化物酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。与原始过氧化物酶相比，本发明所述过氧化物酶突变体Q154F比酶活提高了30％，达320U/mg，取得了良好的技术效果；同时，过氧化物酶突变体Q154F对愈创木酚的亲和力能够大幅度提高，酶促反应速率显著提高，有利于提高过氧化氢的转化效率，进一步拓展了该酶在分析检测等领域的广泛应用，具有广阔市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用。
背景技术
过氧化物酶是过氧化物酶体的标志酶，是其一类氧化还原酶。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于载体的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物和烃类氧化产物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用。过氧化物酶还是临床检验试剂中的常用酶。该酶不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。
目前，过氧化物酶的比酶活高低对于检测试剂盒的检测结果的影响较为显著，尤其是在诊断试剂检测过程中，低过氧化物比酶活会造成检测结果容易受到待检样本的复杂化学组成干扰，造成结果不精确，从而影响检测效果。因此寻找有效途径和手段，提高过氧化物酶的比酶活是当务之急。随着基因工程和分子生物学的发展，利用外源蛋白高效表达系统表达目的蛋白，或是利用已有过氧化物酶的蛋白结构进行人工改良提高其活性，是进一步提高过氧化物酶应用的有效途径。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高比酶活过氧化物酶突变体。
本发明还要解决的技术问题是提供编码上述过氧化物酶突变体的基因。
本发明还要解决的技术问题是提供上述过氧化物酶突变体的表达载体。
本发明还要解决的技术问题是提供上述过氧化物酶突变体的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，所述蛋白是对来源于Cucumis sativus的过氧化物酶(氨基酸序列如SEQ IDNO.1，核酸序列：SEQ ID NO.2所示)的N末端突变，经过大量筛选发现，第154位氨基酸由Aln变为Phe能引起过氧化物酶活性的提高；即SEQ ID NO.3所述的序列为SEQ ID NO.1所述的过氧化物酶第154位氨基酸Aln突变Phe的过氧化物酶突变体。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了编码上述蛋白的基因。
其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了表达上述蛋白的表达载体。
其中，所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒和宿主细胞中的任意一种。
其中，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉和木霉中的任意一种或几种组合。
为了解决上述第四个技术问题，本发明公开了上述蛋白作为过氧化物酶的应用。
上述蛋白或上述基因在分析检测中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述蛋白在对过氧化物酶底物进行酶促反应中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述过氧化物酶底物为愈创木酚。
上述蛋白在提高过氧化氢转化率中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明通过定点突变的方法改造过氧化物酶，使改造后的过氧化物酶突变体在比活性上更加优良，有利于其在诊断试剂中的应用。
(2)与原始过氧化物酶相比，本发明所述过氧化物酶突变体Q154F比酶活提高了30％，达320U/mg，取得了良好的技术效果。
(3)与原始过氧化物酶相比，本发明所述过氧化物酶突变体Q154F对愈创木酚的亲和力能够大幅度提高，酶促反应速率显著提高。
(4)本发明所述过氧化物酶突变体Q154F比酶活的提高，有利于提高过氧化氢的转化效率，进一步拓展了该酶在分析检测等领域的广泛应用，具有广阔市场前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为原始过氧化物酶与突变体Q154F的SDS-PAGE电泳结果。
图2为本发明所述过氧化物酶突变体的酶活力。
图3为原始过氧化物酶与突变体Q154F的最适pH。
图4为原始过氧化物酶与突变体Q154F的pH耐受性。
图5为原始过氧化物酶与突变体Q154F的最适温度。
图6为原始过氧化物酶与突变体Q154F的温度耐受性。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：过氧化物酶突变体基因的突变
为提高来源于Cucumis sativus的过氧化物酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1，核酸序列如SEQ ID NO.2所示)的比活性，利用分子模拟，将酶与过氧化氢结合位点进行对接，发现154Q为对酶活力的显著影响位点。进而，采用定向进化的方式，对该位点进行突变筛选，设计如表1所示的突变引物。
表1
以初始过氧化物酶基因作为模板，进行全质粒扩增，从而得到所有定点突变的序列。将得到的序列转入大肠杆菌感受态细胞E.coli中，涂布于含有34μg/mL氯霉素的LB琼脂平板培养基上，37℃，培养20-24h，从而获得相应的突变体。
实施例2：过氧化物酶及其突变体酶的获取
将实施例1构建的突变体以及原始过氧化物酶分别接种至100mL含氯霉素34μg/mL的LB液体培养基中，200r/min，37℃培养24h，得到种子液；以5vt％的接种量将种子液接种至新鲜的500mL的LB液体培养基中，200r/min，37℃恒温培养24h，加入0.1mmol/L诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导表达24h，得到发酵液。将所得发酵液于18000r/min离心15min，弃去上清；所得菌体再用50mM pH 7.0磷酸缓冲重悬菌体，然后超声破碎，得到混悬液。
将上述所得混悬液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，原始过氧化物酶的分子量为33kDa，诱导后突变体在在33kDa处有明显的条带，这与原始过氧化物酶的分子量基本一致，表明原始过氧化物酶和突变体成功诱导表达。
将上述所得混悬液用镍柱进行分离纯化，具体步骤如下：将镍柱用5倍体积的pH7.520mM Tris缓冲液平衡后，用注射器将混悬液以0.5mL/min上柱至出现蛋白穿透峰；再用pH 7.5 20mM Tris缓冲液以2mL/min冲洗镍柱，直到没有蛋白峰为止；接着，以pH 7.520mMTris-HCl、不同浓度咪唑(100mM、200mM、300Mm、400Mm和500mM)以2mL/min进行梯度洗脱，每个浓度均洗至没有蛋白流出，收集不同梯度下的吸收峰蛋白；直至最终无蛋白洗出；利用脱盐柱，以pH 7.0 50mM磷酸缓冲液去除咪唑，即得液体酶；将去除咪唑后的不同梯度下的蛋白液进行SDS-PAGE电泳检测，可得不同突变体的纯化蛋白。
实施例3：过氧化物酶最优突变体的筛选程序
(1)过氧化物酶突变体活力测定
配制溶液：A液：由38mL 0.1mol/L磷酸二氢钠，62mL 0.1mol/L磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100mL，磷酸盐缓冲液(pH7.0)；B液：由0.22mL愈创木酚用蒸馏水定容至100mL；C液：由0.082mL 30％过氧化氢用蒸馏水定容至100mL。
酶反应：吸取液体酶1mL，用A液稀释至100U/mL。所用试剂及样品溶液测定前于25℃土2℃恒温箱中孵育30min，得到酶液。
在1cm比色皿中，按次序加入2.8mL A液、0.1mL B液、0.05mL C液和0.05mL蒸馏水作为参比溶液。于另只1cm比色皿中，按次序加入2.8mL A液、0.1mL B液、0.05mL C液和0.05mL酶液。快速混匀后，于分光光度计436nm波长下，测定初始时和2min后的吸光度值，两者之差即为△A(△A的值在0.080～0.400之间方为有效，如大于0.4应调整稀释度)。每次测定至少完成2个平行实验。
液体样品酶活力U计算：U＝(△A×3.0×4×D/25.5×1×0.05×2)×10000。式中：U-液体样品酶活力，单位为U/mg；△A-样品吸光度变化值；3.0-反应试剂的总体积，单位为mL；4-愈创木酚换算成过氧化氢的量的系数；D-稀释倍数；25.5-愈创木酚的摩尔消光系数，单位为L/(mol.cm)；1-比色皿光径，单位为cm；0.05-参与反应酶液的体积，单位为mL；2-反应时间，单位为min。酶活定义为：每分钟催化1mol愈创木酚所需酶蛋白量为1个酶活单位(U)。
将实施例2中获得的19个突变体，分别进行酶活检测，不同突变体的活力结果如图2所示，大多数突变后酶活均呈现显著下降，只有当野生型过氧化物酶第154位氨基酸由Aln突变为Phe时(Q154F)，酶活力显著上升。
(2)本发明还参考发明专利《灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用》(CN108070574B)，分别以ABTS和TMB为底物对Q154F的酶活进行了检测，所得的酶活分别为330.86U/mg和57.37U/mg，高于该发明专利报道的305.75U/mg和55.26U/mg。
实施例4：过氧化物酶突变体Q154F的酶学性质分析
1.最适pH和pH稳定性
将实施例3(1)中的A液分别替换为pH 3.0-6.0柠檬酸缓冲液、pH 7.0-8.0磷酸缓冲液和pH 9.0-10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，进行酶活力测定。以原始酶和突变体各自最高的酶活为100％，计算相对酶活，绘制酶活随着pH变化的曲线。结果如图3所示，原始过氧化物酶及其突变体Q154F最适反应pH均为6.0，随着pH的升高或降低，其酶活性均减少。
将不同pH配制的酶液在冰上4℃孵育2h，然后测定其酶活力。分别以原始过氧化物酶和突变体各自最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。结果如图4所示，原始过氧化物酶及其突变体Q154F在pH 5.0-7.0之间的稳定性较为平稳，突变体的pH稳定性与原始酶保持一致。
2.最适反应温度和温度稳定性。
按照实施例3(1)中配制好的反应体系分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下检测原始过氧化物酶和突变体活力，以原始酶和突变体各自最高的酶活为100％，计算相对酶活，绘制不同温度下的酶活变化曲线。结果如图5所示，原始过氧化物酶与突变体Q154F的最适反应温度均为60℃；当温度在30℃-60℃时，原过氧化物酶及突变体的酶活逐渐升高；当温度高于60℃时，原始过氧化物酶及其突变体的酶活均呈现下降。
将实施例2制备的液体酶分别放入30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中保温2h，然后测定其活力。分别以原始酶和突变体各自最高的酶活为100％，计算相对酶活，绘制酶活温度稳定性曲线。结果如图6所示，原始过氧化物酶及其突变体Q154F在低于50℃条件下孵育2h，仍然保留了80％以上的酶活力；而在高于60℃条件下孵育2h后，原始酶的活力仅保留30％，而突变体Q154F的活力仍有55％，表明突变体的热稳定性明显高于原始过氧化物酶。
3.原始过氧化物酶和突变体Q154F的Km和Vmax测定
按照实施例3(1)的方法，用不同浓度的愈创木酚为底物，在最适条件(pH为6.0，温度为35℃)下测定酶活力，利用双倒数作图法计算出相应的反应速度，Km和Vmax值。结果如表1所示，相对于原始过氧化物酶，突变体Q154F对底物的亲和力大大提高，酶促反应速率得到显著提高，表明突变体Q154F的酶活力有显著的提高。
表1原始过氧化物酶及其突变体Q154F的反应动力学参数
| 酶 | Km(mmol/mL) | Vmax(mmol/mg min) |
| 原始过氧化物酶 | 52.8 | 13.5 |
| 突变体Q154F | 29.4 | 20.8 |
本发明提供了一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京赛科迪迈生物技术有限公司
<120> 一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 307
<212> PRT
<213> Cucumis sativus
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Ala Ala Lys Leu Ile Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly
35 40 45
Cys Asp Gly Ser Ile Leu Leu Val Asp Val Pro Gly Val Ile Asp Ser
50 55 60
Glu Leu Asn Gly Pro Pro Asn Gly Gly Ile Gln Gly Met Asp Ile Val
65 70 75 80
Asp Asn Ile Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Gly Val Val Ser
85 90 95
Cys Ala Asp Ile Leu Ala Ile Ser Ser Gln Ile Ser Val Phe Leu Ser
100 105 110
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<400> 8
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat tgtgggcttg attctacaga tc 52
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154D-F)
<400> 9
ctgtagaatc aagcccatca tctttaaact tgcctttaag tcccac 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154D-R)
<400> 10
gtgggactta aaggcaagtt taaagatgat gggcttgatt ctacag 46
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物(Q154E-F)
<400> 11
agaatcaagc ccttcatctt taaacttgcc tttaagtccc a 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物(Q154E-R)
<400> 12
tgggacttaa aggcaagttt aaagatgaag ggcttgattc t 41
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154F-F)
<400> 13
gatctgtaga atcaagccca aaatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 14
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154F-R)
<400> 14
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat tttgggcttg attctacaga tc 52
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154G-F)
<400> 15
gatctgtaga atcaagccca ccatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154G-R)
<400> 16
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat ggtgggcttg attctacaga tc 52
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(Q154H-F)
<400> 17
gtagaatcaa gcccatgatc tttaaacttg cctttaagtc cc 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(Q154H-R)
<400> 18
gggacttaaa ggcaagttta aagatcatgg gcttgattct ac 42
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154I-F)
<400> 19
gatctgtaga atcaagccca atatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154I-R)
<400> 20
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat attgggcttg attctacaga tc 52
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物(Q154K-F)
<400> 21
tagaatcaag ccctttatct ttaaacttgc ctttaagtcc cact 44
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物(Q154K-R)
<400> 22
agtgggactt aaaggcaagt ttaaagataa agggcttgat tcta 44
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154L-F)
<400> 23
cgagatctgt agaatcaagc ccaagatctt taaacttgcc tttaag 46
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154L-R)
<400> 24
cttaaaggca agtttaaaga tcttgggctt gattctacag atctcg 46
<210> 25
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154M-F)
<400> 25
gatctgtaga atcaagcccc atatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 26
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154M-R)
<400> 26
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat atggggcttg attctacaga tc 52
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154N-F)
<400> 27
ctgtagaatc aagcccatta tctttaaact tgcctttaag tcccac 46
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154N-R)
<400> 28
gtgggactta aaggcaagtt taaagataat gggcttgatt ctacag 46
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154P-F)
<400> 29
cgagatctgt agaatcaagc cccggatctt taaacttgcc tttaag 46
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154P-R)
<400> 30
cttaaaggca agtttaaaga tccggggctt gattctacag atctcg 46
<210> 31
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154R-F)
<400> 31
cgagatctgt agaatcaagc ccacgatctt taaacttgcc tttaag 46
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154R-R)
<400> 32
cttaaaggca agtttaaaga tcgtgggctt gattctacag atctcg 46
<210> 33
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154S-F)
<400> 33
gatctgtaga atcaagccca ctatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 34
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154S-R)
<400> 34
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat agtgggcttg attctacaga tc 52
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 引物(Q154T-F)
<400> 35
ctgtagaatc aagccctgta tctttaaact tgcctttaag tcccactag 49
<210> 36
<211> 49
<212> DNA
<213> 引物(Q154T-R)
<400> 36
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat acagggcttg attctacag 49
<210> 37
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154V-F)
<400> 37
gatctgtaga atcaagccca acatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 38
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<212> DNA
<213> 引物(Q154V-R)
<400> 38
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat gttgggcttg attctacaga tc 52
<210> 39
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<212> DNA
<213> 引物(Q154W-F)
<400> 39
gatctgtaga atcaagcccc caatctttaa acttgccttt aagtcccact ag 52
<210> 40
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物(Q154W-R)
<400> 40
ctagtgggac ttaaaggcaa gtttaaagat tgggggcttg attctacaga tc 52
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154Y-F)
<400> 41
ctgtagaatc aagcccataa tctttaaact tgcctttaag tcccac 46
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(Q154Y-R)
<400> 42
gtgggactta aaggcaagtt taaagattat gggcttgatt ctacag 46
Claims (10)
1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种表达权利要求1所述蛋白的表达载体。
5.根据权利要求4所述表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒和宿主细胞中的任意一种。
6.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉和木霉中的任意一种或几种组合
7.权利要求1所述蛋白作为过氧化物酶的应用。
8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因在制备分析检测试剂盒中的应用。
9.权利要求1所述蛋白在对过氧化物酶底物进行酶促反应中的应用，其中，所述过氧化物酶底物为愈创木酚。
10.权利要求1所述蛋白在提高过氧化氢转化率中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110635236.2A CN113151210B (zh) | 2021-06-08 | 2021-06-08 | 一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110635236.2A CN113151210B (zh) | 2021-06-08 | 2021-06-08 | 一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151210A CN113151210A (zh) | 2021-07-23 |
| CN113151210B true CN113151210B (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=76875757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110635236.2A Active CN113151210B (zh) | 2021-06-08 | 2021-06-08 | 一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151210B (zh) |
-
2021
- 2021-06-08 CN CN202110635236.2A patent/CN113151210B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| peroxidase 2-like precursor[Cucumis sativus];无;《NCBI Reference Sequence:NP_001292611.1》;20191222;第1-2页 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113151210A (zh) | 2021-07-23 |
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