CN115851473B

CN115851473B - 一种高甲醇耐受的毕赤酵母菌株的构建及其应用

Info

Publication number: CN115851473B
Application number: CN202211381199.8A
Authority: CN
Inventors: 高乐; 吴信; 孟娇
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2022-11-06
Filing date: 2022-11-06
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2042-11-06
Also published as: CN115851473A

Abstract

本发明公开一种高甲醇耐受的毕赤酵母菌株的构建及其应用，具体涉及参与毕赤酵母细胞壁O‑糖基化修饰的蛋白及其应用。对毕赤酵母敲除该蛋白的编码基因可以直接影响甲醇代谢、转化效率、生长以及异源蛋白质的分泌。该基因敲除后对毕赤酵母菌株表达中性纤维素酶的分泌表达有促进作用，其细胞壁对SDS和刚果红等敏感性降低，对甲醇环境的耐受性明显提升；毕赤酵母细胞壁组成发生重排，甲醇菌体干重和粗蛋白含量均提高20%左右。基于此，本发明创制了高分泌量、高甲醇耐受且高菌体蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株。

Description

一种高甲醇耐受的毕赤酵母菌株的构建及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一碳资源利用及生产微生物单细胞蛋白应用技术领域，更具体涉及一个与高甲醇耐受且高蛋白的毕赤酵母菌株的构建及其应用。

背景技术

甲醇是一种重要的基础有机化工原料，也是一种新型清洁能源，其用途十分广泛。甲醇的制备工艺主要为煤制甲醇、焦炉气制甲醇及天然气制甲醇。我国甲醇产能已经超过4500万吨/年，并呈现继续增加趋势，而国内甲醇需求量仅为1000万吨/年，急需开发甲醇下游产品。目前，甲醇价格低廉，并且可以作为碳源。利用可以高效利用甲醇等低值碳源菌株，将甲醇转化为菌体蛋白。该模式中低值碳源来源的菌体蛋白生产成本低，蛋白营养价值高,以菌体蛋白代替传统的鱼粉和豆类等蛋白，将会降低饲料蛋白生产成本，提高饲料营养价值和利用率。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）具有较高的细胞密度和较低的内源蛋白分泌量，适合在学术或工业水平上分泌重组蛋白。相比与其他一些表达宿主，毕赤酵母具有很强的、甲醇诱导和严格调控的醇氧化酶启动子（AOX1），可以高效利用甲醇，在甲醇诱导作用下具有了高蛋白质分泌的能力，更适合表达高水平的外源基因。尽管毕赤酵母可以利用甲醇作为唯一碳源进行呼吸代谢、生物合成及能量利用，但仍然存在高浓度甲醇对细胞毒害和生长限速等问题。

发明内容

前期工作中，本发明人利用RNA-Seq技术分析在不同浓度甲醇中的巴斯德毕赤酵母C1菌株基因表达变化情况，预测巴斯德毕赤酵母细胞壁稳定所需O-糖基化修饰的蛋白基因PAS_chr4_0305可能与巴斯德毕赤酵母甲醇耐受有相关性。PAS_chr4_0305基因敲除后对巴斯德毕赤酵母C3菌株表达中性纤维素酶的分泌表达有促进作用，为构建巴斯德毕赤酵母外源表达“超级”分泌体系和高效酵母展示体系的构建提供了基础。同时，PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母细胞壁对SDS和刚果红等敏感性降低，对甲醇环境的耐受性明显提升；同时，发现PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母细胞壁组成发生重排，甲醇菌体干重和粗蛋白含量均提高20%左右。

本发明首先提供与毕赤酵母参与细胞壁稳定性所需的O-糖基化修饰的蛋白，其敲除可以直接影响甲醇代谢、转化效率、生长以及异源蛋白质的分泌。

本发明提供一种高甲醇耐受的毕赤酵母菌株，其中敲除参与细胞壁稳定性所需的O-糖基化基因，或者使其表达能力降低或表达的O-糖基化修饰的蛋白活性降低。

具体地，所述基因是PAS_chr4_0305。

优选地，出发菌株是高产中性纤维素酶毕赤酵母菌株。具体地，出发菌株是保藏号为：CGMCC NO. 24324的巴斯德毕赤酵母菌株C1。更优选地，将出发菌株是保藏号为：CGMCCNO. 24324的巴斯德毕赤酵母菌株C1的细胞壁中O-糖基化蛋白基因敲除，进而获得高分泌量、高甲醇耐受且高菌体蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株。

在具体实施方式中，通过基因编辑方法定点敲除所述O-糖基化蛋白基因。

具体地，通过基因工程方法敲除所述基因，或者使其表达能力降低或表达的蛋白活性降低。

本发明还提供所述的毕赤酵母菌株的构建方法获得的重组菌株在制备菌体蛋白、高附加值（如有机酸、酶）表达宿主的应用。

本发明公开一种参与毕赤酵母细胞壁O-糖基化修饰的蛋白基因（具体是基因PAS_chr4_0305）及其应用。对毕赤酵母敲除该蛋白的编码基因可以直接影响甲醇代谢、转化效率、生长以及异源蛋白质的分泌。该基因敲除后对毕赤酵母菌株表达中性纤维素酶的分泌表达有促进作用，毕赤酵母细胞壁对SDS和刚果红等敏感性降低，对甲醇环境的耐受性明显提升；毕赤酵母细胞壁组成发生重排，甲醇菌体干重和粗蛋白含量均提高20%左右。因此，本发明创制了高分泌量、高甲醇耐受且高菌体蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株。

附图说明

图1：PAS_chr4_0305敲除株与对照菌株C3尼罗红染色后吸光值变化情况。

图2：PAS_chr4_0305敲除株与对照菌株C3中性纤维素酶生产比较。

图3：PAS_chr4_0305敲除株与对照菌株C3在不同甲醇浓度下耐受性比较。

图4：PAS_chr4_0305敲除株与对照菌株C3敏感性比较（A是刚果红测定菌株敏感性；B是SDS测定菌株敏感性）。其中，采用菌株的浓度是10^-5、10^-4、10^-3个孢子/ml。

图5：PAS_chr4_0305敲除株与对照菌株C3细胞壁组成变化情况。

生物材料保藏信息：

本发明用到的巴斯德毕赤酵母菌株(pichia pastoris)C1，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏时间为：2022年1月17日，保藏号为：CGMCC NO.24324，分类命名是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行阐述，以期更好的理解本发明。但并不构成对本发明的限制。

实施例一、甲醇浓度变化直接影响毕赤酵母细胞壁合成关键基因的发掘

本发明基于巴斯德毕赤酵母菌株(Pichia pastoris C1)（保藏号为：CGMCC NO.24324）进行了细胞壁合成关键基因的发掘。RNA序列数据显示，当甲醇浓度从0.5%增加到3%时，该菌株有181个基因显著差异表达，其中115个基因上调，66个基因下调。然而，在这181个差异表达基因中，只有2个基因与细胞壁合成相关，即基因PAS_chr4_0305（NCBIReference Sequence：XP_002493723.1）（参与细胞壁稳定性所需的O-糖基化修饰的蛋白）和基因PAS-chr2_0454（细胞壁的主要外显子-1,3-β-葡聚糖酶，参与细胞壁β-葡糖组装）（表1）。

表1：通过转录组学数据比较发掘的差异表达基因

基因名称

基因描述

0.5% 甲醇条件下基因表达量

3%甲醇条件下基因表达量

FC (3% 甲醇/0.5% 甲醇)

差异表达量 (3%甲醇 /0.5% 甲醇)

P值

PAS_chr4_0305

细胞壁稳定相关的O-糖基化基因

55.68667

175.5933

2.814

1.492579

6.14E-25

PAS_chr2_0454

参与细胞壁β-1,3葡聚糖合成基因

38.01667

85.97

2.003

1.002486

1.35E-15

随着甲醇浓度的增加，PAS_chr4_0305和PAS_ chr2_0454基因的表达分别平均上调2.8倍和2倍。因此，响应于甲醇浓度升高的细胞壁增厚可能是这两个基因上调的直接结果。相反，假设PAS_chr4_0305和PAS_ chr2_0454基因的缺失可能改变细胞壁结构，导致与细胞壁相关的许多表型和功能的改变。因此，在野生型巴斯德毕赤酵母中敲除这两个基因。值得注意的是，PAS_chr2_0454突变株未在转化平板上成功筛选，表明PAS_ chr2_0454是巴斯德毕赤酵母生长的关键基因。这些发现导致了随后的研究，重点是阐明PAS_chr4_0305基因对巴斯德毕赤酵母细胞壁特性和蛋白质分泌的影响。

培养基及工艺：

种子培养基及培养条件选择 YPD 复合培养基为种子培养基:1% 酵母浸粉、2%蛋白胨、2% 葡萄糖、 pH 自然。培养条件：在 250 mL 摇瓶中装入 50 mL 种子培养基，巴斯德毕赤酵母接种量为 1%，于 30 ℃，200 r/ min 摇床培养 24 h。

5L 发酵罐发酵培养基及培养条件选择

巴斯德毕赤酵母5L发酵罐发酵培养基：42 g/L甘油，1.2 g/L KH₂PO₄，18 g/LNH₄H₂PO₄，6.5 g/L MgSO₄·7H₂O。培养条件：5L发酵罐装液量为3 L，巴斯德毕赤酵母接种量为 1%，培养温度 30 ℃，pH值 4. 5~ 5. 0，空气流量 4~8 m³ / h，甘油按照0.5-1.0 rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；连续发酵 24 h 后，补料甲醇0.1 rpm/h/次，维持DO≥25%。

酶活力测定：

在50℃、pH值为4.8的条件下，每分钟从浓度为15 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1µmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位，以U/ mL表示。

吸取1.80 mL羧甲基纤维素钠溶液（pH4.8），加入到刻度试管中，50℃预热5 min，再加入0.20 mL经过适当稀释的酶液（已经过50℃预热5 min），混匀，50℃精确保温10 min后加入3 mL DNS试剂，混匀。沸水浴煮沸5 min，用自来水冷却至室温，不定容混匀。以空白样为对照调仪器零点，在540 nm处测定吸光值。

样品酶活力的计算按下式计算：

式中：

X— 试样中的纤维素酶活力， U/mL；A — 酶反应液扣除空白样的吸光度；

K — 标准曲线的斜率；C_O — 标准曲线的截距；m—称样量，毫升(mL)；

M — 葡萄糖的摩尔质量M (C₆H₁₂O₆) = 180.2 g/mol；t — 酶解反应时间，min；1000 — 转化因子，1mol= 1000 mmol；n—试样的稀释倍数。

实施例二、PAS-0305基因的敲除

以巴斯德毕赤酵母C1为出发菌株，将特异腐质菌（Humicola insolens）的纤维素酶cel45a编码基因电转入巴斯德毕赤酵母C1菌株，获得高产中性纤维素酶的巴斯德毕赤酵母菌株C3。

为了验证PAS_chr4_0305基因在毕赤酵母细胞壁合成中作用，本发明将该PAS_chr4_0305基因在高产中性纤维素酶的巴斯德毕赤酵母菌株C3中定点敲除，通过YPD平板（g418抗性）筛选阳性转化子。通过测序确认正确的转化子进行摇瓶和发酵罐发酵实验，完成中性纤维素酶活力分析，并收集菌体测定菌体中蛋白含量以及采取扫描电镜方式观察其细胞壁通透性有何变化。

在本实施例中，选用CRISPR-Cas9基因编辑系统来实现对巴斯德毕赤酵母C3编码细胞壁稳定性所需的O-糖基化蛋白基因PAS_chr4_0305的无痕敲除。CRISPR-Cas9系统通过小向导RNA (Small guide RNA，sgRNA) 的靶向序列定位至含有前间隔序列邻近基序(Protospacer adjacent motif，PAM) 序列的特定位点，引导 Cas9蛋白切割 DNA 形成双链断裂缺口，再依靠同源重组 (HR) 或者非同源末端连接 (NHEJ) 修复的方式进行连接，从而引发基因编辑。首先，设计PAS_chr4_0305的gRNA，构建敲除质粒pPICZ-Cas9-gPAS_chr4_0305，以及设计及构建供体DNA：PAS_chr4_0305-Donor。其次，同时转化pPICZ-Cas9-gPAS_chr4_0305和PAS_chr4_0305-Donor到巴斯德毕赤酵母C3菌株中，涂布YPDZ（YPD+博来霉素）平板。最后，挑取平板上的克隆进行菌落 PCR以及基因测序验证，后在YPD 培养基中进行传代，丢掉质粒后保菌，至此完成PAS_chr4_0305基因的敲除，菌株命名为巴斯德毕赤酵母C4（或称为△PAS-0305）。

实施例三、PAS_chr4_0305基因敲除后的巴斯德毕赤酵母C4细胞壁通透性的改变

为了验证巴斯德毕赤酵母PAS_chr4_0305敲除后，对巴斯德毕赤酵母细胞壁通透性的影响。使用荧光光谱测量了尼罗红的全井累积，巴斯德毕赤酵母C4菌株与比基因未敲除的C3菌株在相同条件下更易于进行尼罗红染色。从图1中结果显示， PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母C4菌株吸光值明显比C3菌株高，说明PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母细胞壁通透性的确增强。

由于巴斯德毕赤酵母C3菌株是高产中性纤维素酶菌株，通过5L发酵罐发酵培养后，从图2可知，结果显示巴斯德毕赤酵母C4菌株比巴斯德毕赤酵母C3菌株胞外蛋白分泌量提升22.54%，酶活力也随之提高20%左右（其中，巴斯德毕赤酵母C3是表达单一纤维素酶基因的工程菌，同一个基因在相同的底盘菌中，酶的比酶活力（IU/mg）是固定值，所以胞外酶活力与胞外酶的分泌量是成正比的）。该结果与尼罗红染色结果一致，都证实了PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母细胞壁通透性的确增强。该关键基因的发现，为构建毕赤酵母外源表达“超级”分泌体系提供新的思路。

实施例四、PAS_chr4_0305基因敲除后的巴斯德毕赤酵母C4甲醇耐受性的改变

为了研究巴斯德毕赤酵母中PAS_chr4_0305敲除后对甲醇的耐受性是否变化，让对照巴斯德毕赤酵母菌株C3与敲除菌株C4分别在1.5%、2%、2.5%、3% 的不同甲醇浓度下培养，培养24小时后测量其OD值，结果如图3所示。结果表明，敲除PAS_chr4_0305基因后，敲除菌株C4在2%、2.5%、3.5%的甲醇浓度下对甲醇的耐受力均比对照组高，3.5%浓度下高出两倍，说明PAS-0305基因敲除可以有效增强巴斯德毕赤酵母对甲醇的耐受性。

实施例五、PAS_chr4_0305基因敲除后的巴斯德毕赤酵母C4细胞壁敏感性分析

巴斯德毕赤酵母细胞壁敏感性分析采用SDS，刚果红两种材料。SDS敏感性分析采用的是在YPD固体培养基+1M山梨醇+终浓度为10 μg/ml或者20 μg/ml或者50 μg/ml SDS。刚果红敏感性分析采用的是在YPD固体培养基+1M山梨醇+终浓度为10 μg/ml或者20 μg/ml或者50 μg/ml 的刚果红。

将对照巴斯德毕赤酵母菌株C3与巴斯德毕赤酵母菌株C4均按照相同的孢子数，分别选取10^-5、10^-4、10^-3个孢子/ml点种在相应平板上，放置30℃培养。培养24 h后，结果如图4所示（A是刚果红测定菌株敏感性；B是SDS测定菌株敏感性）。结果表明，敲除PAS_chr4_0305后，巴斯德毕赤酵母细胞壁对SDS、刚果红敏感性均有所降低，对环境耐受性有所提高。

实施例六、PAS_chr4_0305基因敲除后的巴斯德毕赤酵母菌体中含量变化

（1）粗蛋白测定：

①收集菌体；

②用ddH₂O洗涤菌体3次除去固体盐；

③处理好的菌体在专用催化剂存在的情况下，通过热催化高温氧化反应进行消解反应：通过这种途径，即便是非常稳定、复杂的含氮的化合物都可以在一定数量上被消解；样品直接进入填充的反应管中高温区，在这个区域中样品在载气流中发生高温催化和氧化反应生成NO；经高温分解的气体在一个旋管冷凝器中冷却，然后冷却水在接下来的TIC冷凝管中与测定气体分离，在进一步的干燥并除去腐蚀性气体之后，NO测定用气体通过CLD检测器；氮氧化物的浓度每秒被测定几次，可以得到信号随时间变化的峰图；

④峰面积与测定溶液中氮的浓度成比例；

⑤通过使用先前确定的标准曲线可以计算样品中含氮的含量；

⑥在测定出总氮量后，菌体中粗蛋白质含量的计算公式如下: 蛋白质(g/100g)=总氮量(g/100g)×6.25。

（2）通过250ml摇瓶及5L发酵罐发酵诱导测总氮结果如表2所示。结果表明：摇瓶和发酵罐不同发酵规模下，敲除PAS_chr4_0305基因后，巴斯德毕赤酵母菌体中粗蛋白含量均提高18.7-20.7%左右，菌体干重也提升18.6-21.4%。

表2：PAS_chr4_0305敲除株与对照巴斯德毕赤酵母菌株C3在不同发酵规模条件下菌体干重和粗蛋白含量变化情况

（2）菌体组成分析：

将对照巴斯德毕赤酵母菌株C3与巴斯德毕赤酵母菌株C4菌体收集后，取大约1 g(菌体干重)的样品，加入5 mL 72%(w/w)的硫酸在30 ℃下处理2.5 h，然后用玻璃搅拌棒每15分钟搅拌一次。用181.7 mL水稀释，然后在121 ℃高压灭菌1 h。高压灭菌冷却后立即以10,000×g离心20 min，以去除固体颗粒。上清液过0.22微米的过滤器。在Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad，HercμLes，CA，USA）上，使用带有折射率检测器（Shimadzu，Shimadzu）的高效液相色谱（高效液相色谱法，岛津，日本，京都）测定葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基-D-葡萄糖胺浓度。柱温度为60 ℃，流动相为5 mM H₂SO₄，流速为0.6 mL/min。根据计算葡聚糖和甘露聚糖的浓度，将葡萄糖含量转化为β-1,3葡聚糖含量，甘露糖含量转化为甘露聚糖含量和N-乙酰基-D-葡萄糖胺含量转化为几丁质的含量。其计算公式为：β-1,3葡聚糖含量=葡萄糖浓度*0.9/总干重；甘露聚糖含量=甘露糖浓度*0.88/总干重；几丁质含量=N-乙酰基-D-葡萄糖胺*0.9/总干重。从图5显示的结果可以看出，PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母细胞壁组成有所改变，几丁质相对含量减少9.2%，β-1,3葡聚糖相对含量提升了12.1%，甘露聚糖相对含量增加2.4%，变化不太明显，说明PAS_chr4_0305基因敲除后，巴斯德毕赤酵母细胞壁组成发生重排。

Claims

1.一种高甲醇耐受的毕赤酵母菌株，其特征在于，其中敲除参与细胞壁稳定性所需的O-糖基化修饰的蛋白基因，或者使其表达能力降低或表达的O-糖基化修饰蛋白的活性降低；所述基因是基因PAS_chr4_0305；；其出发菌株是保藏号为：CGMCC NO. 24324的巴斯德毕赤酵母菌株C1中过表达特异腐质菌的纤维素酶cel45a编码基因而获得高产中性纤维素酶的巴斯德毕赤酵母菌株C3。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，通过基因工程方法敲除所述O-糖基化酶基因，或者使其表达能力降低或表达的O-糖基化酶活性降低。

3.如权利要求2所述的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，通过基因编辑方法定点敲除所述O-糖基化蛋白基因。

4.如权利要求1或2所述的毕赤酵母菌株的构建方法获得的重组菌株在制备菌体蛋白或有机酸中的应用。