CN113061539B - 提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株。通过外源质粒的启动子使用Tet‑on系统，利用同源重组在黑曲霉糖化酶高产的尿嘧啶缺陷型(pyrG‑)菌株上进行整合，使得酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种过表达，通过脂肪酸代谢途径的调控大大提高了黑曲霉的糖化酶生产能力。

Description

提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株。

背景技术

葡萄糖水解酶(Glucoamylase,E.C.3.2.1.3.)也被称为糖化酶(amyloglucosidase),是一种一条肽链的酸性糖蛋白酶，具有外切活力，能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物碳链上的1,4糖苷键连接的非还原端，终产物是β-D-葡萄糖，也可水解α-1,6和α-1,3糖苷键，只是相对水解速度较慢。葡萄糖淀粉酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，自上世纪70年代黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶被首次纯化出来后，它便被广泛地应用于淀粉糖、食品、医药、酿造等工业生产中，是世界上仅次于蛋白酶的第二大类酶制剂，占全球酶制剂交易市场的25-33％。目前，工业上糖化酶的生产主要是由Aspergillus和Rhizopu属发酵制取。构建糖化酶基因的高拷贝工程菌，异源表达以及糖化酶发酵培养基和工艺的优化，如优化培养温度，pH，菌丝体大小，通气，搅拌以及反应器的类型，是提高糖化酶工业化生产的主要手段，寻找新的糖化酶或通过蛋白工程改造提高现有糖化酶的催化效率是近年来主要的研究方向。

黑曲霉(Aspergillus)是一种常见的丝状真菌，因其强大的蛋白质分泌能力和良好的安全性被广泛用于多种酶制剂的生产。随着基因组学技术的日益发展和成熟，黑曲霉的基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等组学数据不断增长。黑曲霉作为生产工业用酶的重要生产菌株，深入研究其高效产酶机制和分泌机制具有重要的现实意义。目前，转录组学分析广泛地应用于分析不同环境变量，不同产酶水平菌株之间产酶量差异的关键因素，寻找起到关键调控作用的基因或基因簇，为后续的菌种改造提高黑曲霉产酶性能提供潜在的靶点。

黑曲霉的研究主要从蛋白分泌途径改造、菌丝形态、增强产酸能力、代谢调控等方面开展，但是极少的研究从脂肪酸代谢的角度对黑曲霉细胞工厂进行优化。

发明内容

本申请提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株，通过黑曲霉中脂肪酸代谢调控基因的过表达可有效提高黑曲霉的糖化酶生产能力。

本申请提供如下技术方案：

第一方面，本申请提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，包括：在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。

在一些实施方案中，所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种。

在一些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶编码基因为An14g03240基因(GENE ID:4987180)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因为An04g05720基因(GENE ID:4990979)；所述细胞色素P450单加氧酶编码基因为An03g06460基因(GENE ID:4980633)。

在一些实施方案中，所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件。

在一些实施方案中，所述方法包括：将所述脂肪酸代谢途径调控基因插入到含有可诱导表达Tet-on系统的质粒中，并导入黑曲霉菌株，使所述脂肪酸代谢途径调控基因在所述黑曲霉菌株中过表达。

第二方面，本申请进一步提供一种糖化酶生产能力提高的重组黑曲霉菌株，所述重组黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。

在一些实施方案中，所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种。

在一些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶编码基因为An14g03240基因(GENE ID:4987180)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因为An04g05720基因(GENE ID:4990979)；所述细胞色素P450单加氧酶编码基因为An03g06460基因(GENE ID:4980633)。

在一些实施方案中，所述重组黑曲霉菌株包括调控所述脂肪酸代谢途径调控基因过表达的基因表达调控元件，例如所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件。

在一些实施方案中，所述重组黑曲霉菌株为尿嘧啶缺陷型。

第三方面，本申请还提供上述重组黑曲霉菌株在制备糖化酶中的应用。

在一些实施方案中，所述应用包括：发酵培养所述重组黑曲霉菌株，使其表达糖化酶。

本申请的发明人从转录组响应水平进行分析发现，氧限制期发酵过程中菌体蛋白合成减弱，而脂类分解代谢上调，糖化酶及其原料氨基酸的合成上调，进而提出脂肪酸的分解代谢能够提供乙酰辅酶A等重要前体和能量并流向糖化酶合成，通过结合转录组数据(氧限制期转录水平显著上调)、KEGG数据库(脂肪酸降解途径)以及黑曲霉数据库的基因功能宏观预测来筛选可显著改善黑曲霉糖化酶生产能力的目的基因，并通过一步克隆构建整合外源质粒载体与目的基因，并且外源质粒的启动子使用Tet-on系统，利用同源重组在黑曲霉糖化酶高产的尿嘧啶缺陷型(pyrG-)菌株上进行整合，大大提高了重组菌株的糖化酶生产能力。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例1的重组质粒构建策略图谱；

图2是本申请实施例2中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36摇瓶发酵的干重-时间检测曲线；其中A为03号菌株、057号菌株、06号菌株及野生型菌株B36摇瓶培养18h起添加DOX的干重-时间生长曲线，B为该四种菌株摇瓶培养42h起添加DOX的干重-时间生长曲线；

图3是本申请实施例2中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36摇瓶发酵的目的基因转录水平检测结果；

图4是本申请实施例2中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36摇瓶发酵的过表达菌株拷贝数检测结果；

图5是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的干重-时间检测曲线；

图6是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的CER-时间检测曲线；

图7是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的OUR-时间检测曲线；

图8是本申请实施例3中重组黑曲霉菌株及野生型黑曲霉菌株B36反应器培养的目的基因转录水平的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请实施例提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，包括在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。

本文中，“葡萄糖淀粉酶”与“糖化酶”具有相同含义，可互换使用，是指α-1,4-葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.3.)，可使多糖类化合物(例如淀粉)的α-1,4糖苷键水解而生成葡萄糖，也可缓慢水解α-1,6糖苷键。

本申请的发明人出乎意料地发现，脂肪酸代谢途径与黑曲霉产糖化酶的能力相关。因此，一些脂肪酸代谢途径调控基因可作为改善黑曲霉产糖化酶能力的改造目的基因。在一些实施方案中，过表达酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因等脂肪酸代谢途径调控基因中的至少一种，可显著提高黑曲霉的产糖化酶能力。在一些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶编码基因为An14g03240基因(GENE ID:4987180)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因为An04g05720基因(GENE ID:4990979)；所述细胞色素P450单加氧酶编码基因为An03g06460基因(GENE ID:4980633)。

本文中，“过表达”基因是与相应的正常或以其它野生型黑曲霉或参比/对照水平或样本相比，在黑曲霉当中以更高水平表达的基因。例如本申请中An14g03240基因过表达是指相比于野生型黑曲霉基因或其他未针对该基因添加增强型调控元件或系统的黑曲霉而言，本申请的黑曲霉当中，An14g03240基因的表达水平更高。在一些实施例中，可以采用本领域已知的基因表达调控元件/系统使得基因的表达水平提高，例如采用Tet-on系统(四环素调控表达系统)或其他可增强基因表达的元件或系统。

本领域技术人员可以理解，可以采用本领域已知的基因工程方法或分子生物学方法来实现目的基因的过表达；例如，可以采用本领域已知的同源重组方法将过表达调控元件与目的基因整合到宿主菌株中，例如可通过同源重组方法将可诱导过表达调控系统的外源质粒载体与目的基因整合，转化到宿主菌株中进行表达。还可以采用本领域已知的基因工程方法实现上述目的，例如采用基因编辑系统实现调控元件与目的基因的整合。

在一些实施方案中，可通过如下步骤构建过表达上述目的基因的重组黑曲霉菌株：

(1)构建重组质粒：将所述脂肪酸代谢途径调控基因进行PCR扩增，酶切，插入到质粒载体中得到重组质粒，其中，所述质粒载体为可诱导表达Tet-on系统的质粒载体；

(2)采用步骤(1)所述的重组质粒转化大肠杆菌，进行菌落PCR验证，提取重组质粒，并测序验证；

(3)将经测序验证正确的重组质粒转化宿主黑曲霉菌株，得到所述重组黑曲霉菌株。

在一些实施方案中，该可诱导表达Tet-on系统的质粒载体为pFW22.1质粒，所述脂肪酸代谢途径调控基因的编码区插入到pFW22.1质粒的PmeI酶切位点。

本申请还进一步提供依据上述方法构建的重组黑曲霉菌株。

本申请提供的重组黑曲霉菌株可用于生产糖化酶，例如可发酵培养所述重组黑曲霉菌株，得到糖化酶。本领域技术人员可根据本领域已知的黑曲霉发酵生产糖化酶的发酵方法培养本申请的重组黑曲霉菌株，培养基及培养条件没有特别的限定。

以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。除特别说明外，本申请实施例所用的试剂均为市售商品。除特别说明外，本申请实施例的实验操作步骤均依据本领域已知的实验步骤实现。

本实施例用的培养基配方如下：

用于菌株培养的培养基：完全培养基(Complete medium,CM培养基)(500ml)：10ml50％葡萄糖，10ml50×ASP+N(297.5g/L NaNO₃，26.1g/L KCl，74.8g/L KH₂PO₄)，1ml 1MMgSO₄,500ul 1000×Trace elements,0.5g酪蛋白，2.5g酵母提取物，7.5g琼脂，高压灭菌。

基本培养基(minimal medium,MM培养基)(500ml)：10ml 50％葡萄糖，10ml50×ASP+N，1ml 1M MgSO₄,500ul 1000×Trace elements,7.5g琼脂，高压灭菌。

MM+尿嘧啶培养基(500ml)：MM培养基高压灭菌后加入已过滤除菌10mM尿嘧啶溶液。

摇瓶培养基(g/l)：3 0g/L麦芽糖，10g/Ltryptone，5g/L酵母提取物，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.03g/LZnCl₂，0.02g/L CaCl₂，0.01g/L MnSO₄·H₂O，0.3g/L FeSO₄·7H₂O，0.1％消泡剂，用1MHCl调节pH为5.5，115℃高压灭菌。

反应器初始发酵培养基(g/l)：麦芽糖10g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，NH₄Cl 4.5g/L，KCl0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，1000×Trace element 1ml/L，0.1％消泡剂，用1M HCl调节pH到3，121℃灭菌1h。

黑曲霉MM转化培养基上层筛选培养基：81.3g蔗糖，1.5g琼脂,5ml 50×ASP+N溶液,0.25ml 1000×Trace elements,0.5ml 1M MgSO₄,去离子水定容至250ml，高压灭菌，保存于70℃培养箱中。

黑曲霉MM转化培养基下层筛选培养基:162.6g蔗糖，6g琼脂,10ml 50*ASP+N溶液,0.5ml 1000×Trace elements,1ml 1M MgSO₄,去离子水定容至500ml，高压灭菌，保存于70℃培养箱中。

本实施例涉及如下测试方法：

菌体干重测定方法：每个取样点从摇瓶中取4ml的发酵液，通过真空抽滤分离菌体和上清液。菌体用去离子水清洗三次后于-80℃冷冻，将冷冻后的菌体转移至冷冻抽干机后过夜冷冻干燥后称重。

总分泌蛋白测定方法：通过考马斯亮蓝的方法测量发酵上清液中的总分泌蛋白量，依据BioRad公司的操作方法，并采用酶标仪的

-MultiDetectionSystem(Promega)在582nm下测量样品的吸光度。

糖化酶酶活测定方法：50mg糖化酶标品对应大约2500AGI。230μlAGIsub(p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)试剂(37℃预热5min)与20μl发酵液上清混合，37℃反应20min后加100μlAGIstop试剂，在405nm下测量混合液体吸光度来定量糖化酶。按上述方法稀释糖化酶标品(EC3.2.1.2,SigmaAldrich)至不同浓度后测定酶标仪405nm下的吸光度值，根据标品浓度和相应吸光度值做标准曲线方程：糖化酶酶活＝(OD405+0.01)*稀释倍数/0.008(R2>0.999)。利用同样的测定步骤和此标准曲线计算发酵液糖化酶活力。

糖化酶含量测定方法：使用糖化酶(Glucoamylase)酶联免疫分析试剂盒进行分析测定，试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中糖化酶(Glucoamylase)水平。用纯化的糖化酶(Glucoamylase)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入糖化酶(Glucoamylase)，再与HRP标记的糖化酶(Glucoamylase)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的糖化酶(Glucoamylase)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中糖化酶(Glucoamylase)浓度。

荧光定量PCR：利用生工真菌RNA抽提试剂盒提取样品中RNA，使用试剂盒PrimeScript TMII 1st Strand cDNA synthesis Kit用于将总RNA反转录成单链cDNA，根据试剂盒

Premix Dimer Eraser TM Kit的操作流程，以适当稀释的cDNA为模板，分别测定内参基因GADPH和目的基因的Ct值，Ct值应在20～30之间。最后计算各基因的相对表达量，基因相对表达量计算公式：相对转录水平＝2-((Ct1-Ct_control)sampleA-(Ct1-Ct_control))sampleB)，其中Ct1:目的基因Ct值，Ct_control:参比基因的Ct值。

胞内代谢物快速提取方法：采用本实验室构建的快速取样装置进行快速取样，将1-2mL发酵液从反应器中快速抽出至10mL-30℃预冷的60％冷甲醇淬灭溶剂中，混匀。取样前后均要对取样的试管称重以确定所取样品的准确质量。通过真空抽滤去掉淬灭后的过滤液，以尽可能地去掉胞外代谢物，然后用20mL℃预冷的-60％冷甲醇清洗滤饼。之后将滤饼放入50ml离心管中，加入100μl实验室制备的13C内标，加入25mL预热至75℃的75％乙醇混匀，于95℃下提取3min。准确反应3分钟后，置于冰上冷却至常温，真空抽滤，并用少量75％乙醇润洗，收集滤液。将提取液在旋蒸仪中过夜旋蒸至600μl。

脂肪酸测定方法：将发酵样品使用索桥生物的游离脂肪酸含量试剂盒(分光光度计法)测定胞内的脂肪酸含量(货号：QS2400)。在弱酸性条件下，FFA与铜盐反应生成铜皂，在715nm处有特征吸收峰，在一定范围内游离脂肪酸含量与显色程度呈线性关系。

胞外有机草酸测定：采用岛津高效液相色谱HPLC进行分析，HPLC的流动相为5mMH₂SO₄，分析样品的时候需在50℃下用5mMH₂SO₄以0.4mL/min的流速冲洗VARIAN Metacarb Hplus色谱柱，分光光度计的波长设为215nm。

本实施例采用的菌株如表1所示。

表1菌株相关信息

实施例1重组黑曲霉菌株的构建

1)通过PCR，一步克隆，胶回收和质粒纯化等基础分子克隆步骤外源构建质粒来整合目的基因与质粒载体，本实施例采用Phanta高保真酶PCR体系扩增目的基因以整合目的基因与质粒载体，PCR体系及反应条件如表3和表4所示；所用质粒为Tet-on系统启动的表达质粒，在含有可诱导表达Tet-on系统的质粒pFW22.1上的PmeI酶切位点插入上述需要过表达基因的编码区，质粒构建策略如图1。

2)将步骤1)得到的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，用Tag Mix酶对菌落PCR对大肠杆菌转化平板上的转化子验证后，提取质粒进行单酶切验证，之后通过测序确定正确的转化子。

3)选用尿嘧啶缺陷型黑曲霉菌株，制备黑曲霉原生质体，加入经测序验证正确的重组质粒，进行黑曲霉转化，实现尿嘧啶缺陷型和目的基因过表达系统在黑曲霉基因组上的定点整合，筛选黑曲霉转化子菌株。

4)验证阳性转化子并通过qt-PCR筛选单拷贝的过表达转化子菌株。

本实施例中基因An14g03240过表达株编号03，基因An04g05720过表达株编号057，基因An03g06460过表达株编号06，野生型黑曲霉为B36。

本实施例分别采用黑曲霉MM转化培养基上层筛选培养基和黑曲霉MM转化培养基下层筛选培养基对黑曲霉转化子菌株进行筛选。

本实施例所涉及的引物序列如表2所示，其中F-03、R-03、F-057、R-057、F-06、R-06分别是扩增目的基因An14g03240、基因An04g05720、基因An03g06460时用的引物对，RT-03-F、RT-03-R、RT-057-F、RT-057-R、RT-06-F、RT-06-R分别是测03号、057号、06号菌株中转录水平和拷贝数所用的引物对，qGAPDH F和qGAPDH R是内参基因扩增引物对，jpVF，jpVR是用来验证质粒正确导入黑曲霉基因组上的PCR验证引物，上游引物在黑曲霉基因组上，下游引物在导入质粒上。

表2本实施例所涉及的引物序列

表3 Phanta酶PCR扩增体系

表4 Phanta酶PCR反应条件

转录水平和拷贝数的测定采用Biorad CFX96 Real-Time PCR Detection System进行RT-qPCR反应，反应体系和条件如表5和表6所示，实验测定每个样品的内参基因和目的基因的CT值。

表5转录水平和拷贝数测定用PCR扩增体系

表6转录水平和拷贝数测定用PCR扩增体系

实施例2重组黑曲霉菌株摇瓶发酵实验

使用实施例1构建的过表达菌株进行摇瓶实验，培养基为摇瓶培养基。接种量为10⁶个孢子/ml，培养条件为30℃，250rpm培养72h，添加5颗玻璃珠防止结球，摇瓶发酵时，当菌体生长到对数生长初期约18h时添加10μg/ml诱导物Doxycycline(DOX)，由于DOX需避光保存，长时间暴露于光下可能失活，因此每12小时添加一次DOX。接种后每24h取样，测量菌体干重、总分泌蛋白和糖化酶酶活。并且于对数生长中期约26h左右，即诱导8h后保存菌丝体用以提取mRNA。另一平行实验组从42h开始添加DOX，每12h补加一次。

实施例1构建的过表达菌株以及野生型菌株B36的菌体干重测量结果如图2所示，总分泌蛋白和糖化酶酶活检测结果如表7所示。

表7实施例1构建菌株摇瓶发酵后糖化酶酶活及总分泌蛋白检测结果

图2显示了不同实验株的生长情况，其中A为03号菌株、057号菌株、06号菌株及野生型菌株B36摇瓶培养18h起添加DOX的干重生长曲线，B为该四种菌株摇瓶培养42h起添加DOX的干重生长曲线，可见所有过表达株与野生型菌株B36的生长趋势相似。表7实验结果表明，相比于野生型菌株B36，三个基因的过表达菌株都能够一定程度上的提高酶活以及总蛋白的分泌，其中03号菌株单位酶活可提高40％以上。

图3、图4显示了摇瓶发酵实验中目的基因的转录水平和过表达菌株拷贝数。根据图3、图4可以看出，本申请构建的所有过表达株目的基因的转录水平及目的基因拷贝数均明显高于野生型菌株B36。

实施例3重组黑曲霉菌株反应器培养实验

批培养发酵：培养在带有称重的5L罐上进行。5L罐的装液量为3L，接种量为10⁶个孢子/ml，培养基为反应器初始发酵培养基。5L罐搅拌转速和通气速度分别为750rpm和2vvm，罐压为0.05MPa，温度为30℃。批培养期间，在添加诱导剂DOX后每两个小时取样用于检测生长曲线。当在线监控的曲线CER,OUR开始下降，溶氧上升后转入恒化培养。CER和OUR开始下降时证明发酵结束，此时开始补料，进入恒化发酵阶段。发酵罐中的尾碳和尾氧浓度通过过程质谱仪(MAX300-LG，Extrel)进行测定。

恒化发酵采用碳限制策略，以麦芽糖为唯一限制性底物，将菌体的比生长速率分别控制在0.1h^-1。通过过程质谱仪测定尾氧和尾二氧化碳浓度，并计算OUR和CER。恒化实验各参数设置同批培养发酵。将装有pH和DO电极的整个反应器放置在电子称上以准确监控反应器体积的变化。通过反应器的pH反馈控制系统，自动滴加2mol/L的NaOH溶液，将pH控制在3。恒化实验阶段采用相同的培养基组分，均以麦芽糖作为碳源。补料培养基是将反应器初始发酵培养基的麦芽糖浓度改为8g/L，其他成分维持不变。每批次恒化实验进行5个洗脱体积。

发酵过程中常规取样检测菌株生长情况，检测各取样点的干重，结果如图5所示。通过在线的OUR和CER实时检测得到OUR和CER生理曲线，分别如图6、图7所示。在对数生长中期取样测定胞内目的基因的相对表达量，如图8所示。在菌株达到代谢稳态时取胞内代谢物，发酵结束后，检测各取样点总分泌蛋白，糖化酶含量以及脂肪酸水平，发酵结束后糖化酶含量及总分泌蛋白、胞内脂肪酸的检测结果如表8所示，不同发酵时期胞外草酸的含量检测结果如表9所示。

表8发酵结束后糖化酶含量及总分泌蛋白、胞内脂肪酸的检测结果

表9不同发酵时期胞外草酸含量(μmol/gDCW)检测结果

根据图5-图7可以看出，野生型黑曲霉B36和三株过表达株经过约22小时左右的批发酵阶段转入恒化培养之后CER保持稳定，从干重、CER和OUR测定结果来看野生型菌株与过表达菌株之间的生长没有较大差异。根据图8可见，过表达菌株的目的基因表达水平相比于野生型菌株在对数生长期提高1.84-3.71倍。根据表8可以看出，03号过表达株的单位酶活与单位总分泌蛋白相对于野生型菌株分别提高了60.07％与48.24％，胞内脂肪酸下降了41.64％；057号过表达株的单位酶活与单位总分泌蛋白相对于野生型菌株分别提高了50.18％与64.65％，胞内脂肪酸下降了44.57％。表9显示，过表达菌株的胞外草酸分泌略低于野生型菌株。以上结果表明，通过对脂肪酸代谢基因的过表达提高黑曲霉的糖化酶产量，证明对其相关基因的过表达可有效提高黑曲霉的蛋白生产能力，通过脂肪酸代谢途径调控策略可有效打破其产酶的瓶颈。

以上对本申请实施例所提供的一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株

<130> SHP210194CN

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<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 7

agctgattat gcgaaggaga g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

ccgcctccaa cctcatatac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 9

attgccaatg ccctgaaatc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

ggtgaaggga gcagaaactt a 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

ctgatggagg aattaacgta cca 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 12

tggcaggtag taaggaagta ga 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 13

ctcctacacc aaggacatca ac 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

tcaacgatgc cgaacttgt 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 15

gtctccgcaa ggaagctgat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 16

ggggcgaaaa ctctcaagga 20

Claims (6)

1.一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，其特征在于，包括：在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达；

所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件；

所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因An14g03240基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将所述脂肪酸代谢途径调控基因插入到含有可诱导表达Tet-on系统的质粒中，并导入到黑曲霉菌株，使所述脂肪酸代谢途径调控基因在所述黑曲霉菌株中过表达。

3.一种糖化酶生产能力提高的重组黑曲霉菌株，其特征在于，所述重组黑曲霉菌株包括至少一种脂肪酸代谢途径调控基因，以及调控所述脂肪酸代谢途径调控基因过表达的基因表达调控元件；

所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件；

所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因An14g03240基因。

4.根据权利要求3所述的重组黑曲霉菌株，其特征在于，所述重组黑曲霉菌株为尿嘧啶缺陷型菌株。

5.权利要求3或4所述的重组黑曲霉菌株在制备糖化酶中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：发酵培养所述重组黑曲霉菌株，使其表达糖化酶。

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