CN105969675B - 一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用 - Google Patents

一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用，属于生物技术领域。本发明的重组菌是通过失活α‑葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因后得到的。本发明的实验证明，本发明通过对一株高产糖化酶的黑曲霉pyrG缺陷型Aspergillus niger SH‑2:ΔpyrG进行基因工程改造，失活基因agdB、agdA和agdE后，得到低转苷酶活性的新菌株，利用该菌株发酵生产的糖化酶与原始菌株相比，糖化酶酶活增加33％，α‑葡萄糖转苷酶酶活降低43％以上，简化了从发酵液中去除转苷酶的分离纯化工艺，降低了生产成本，具有一定的创新性，有较强的开发意义。

Description

一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用。
背景技术
糖化酶，系统名为1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC 3.2.1.3)，又名葡糖淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，能够催化淀粉或有关寡糖和多糖分子的非还原端释放出D-葡萄糖。在商业上，糖化酶常用于转化已由α-淀粉酶部分水解为葡萄糖的玉米淀粉，是淀粉加工业的主要酶制剂。近年来，国内生产的糖化酶的活力和产量均取得了很大的进展，但是存在糖化酶中α-葡萄糖转苷酶活性较高的问题。
黑曲霉Aspergillus niger SH-2是工业上常用的高产糖化酶菌株，其显著特点是不产孢子，进行无性繁殖，可以进行高密度液体发酵，高效地生产工业用糖化酶。而且，工业生产菌株无孢黑曲霉Aspergillus niger SH-2已于2014年完成基因组测序、组装和注释，对其基因组和遗传学信息有了进一步了解。通过敲除pyrG基因得到的黑曲霉Aspergillusniger SH-2的pyrG缺陷型Aspergillus niger SH-2:ΔpyrG，可将pyrG基因作为筛选标记，简化了黑曲霉基因工程改造的筛选步骤，提高了黑曲霉基因工程改造菌的应用价值。
工业上常常利用黑曲霉Aspergillus niger SH-2深层液体发酵生产糖化酶，但是利用该菌株发酵生产的糖化酶中含有较高活性的α-葡萄糖转苷酶，该酶不仅具有水解活性，还具有转糖苷能力，生成的异麦芽糖或潘糖等非发酵性糖严重影响了糖化酶的质量。转苷酶产生的这些产物不能被糖化酶分解，同时，异麦芽糖的存在还阻碍了葡萄糖的结晶，严重影响了葡萄糖生产中最终产物的纯度和产率。而且工业上使用的去除糖化酶中的转苷酶的方法的效果均不理想，不仅增加了糖化酶发酵生产工艺的工序，还增加了糖化酶生产的成本，降低了工业生产效率。
专利CN104962594A公开了一种黑曲霉，其特征是失活对糖化有害的α-葡萄糖苷酶agdB基因，将其生产的目的蛋白用于葡萄糖转化时，能显著提高DX值。但是该专利中没有记载将α-葡萄糖苷酶基因agdB、agdA和agdE缺失后能有效提高糖化酶的活性。
发明内容
为了克服现有技术中高产糖化酶的黑曲霉工业菌种发酵生产的糖化酶中α-葡萄糖转苷酶活性较高的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌。本发明通过基因敲除技术改造该黑曲霉菌种，从源头上减少或不产α-葡萄糖转苷酶，避免了糖化酶纯化中去除α-葡萄糖转苷酶的工序，节省生产成本，提高生产效率。
本发明的另一目的在于提供所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的构建方法。
本发明的再一目的在于提供所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)中的至少一种；优选为至少2种；更优选为至少3种；最优选为3种。
所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)，或失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)和α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)，或失活α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)。优选地，所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)和α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)，或失活α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)。更优选地，所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)和α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)。
所述基因agdB的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:1所示；所述基因agdA的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:2所示；所述基因agdE的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:3所示；所述基因agdG的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:4所示；所述基因agdF的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:5所示；所述基因agdC的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:6所示；所述基因agdD的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:7所示。
所述的高产糖化酶的黑曲霉为无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG，该菌株在文献“黑曲霉来源脯氨酞蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究.华南理工大学[D].2014”中被公开。具体步骤参照文献“黑曲霉来源脯氨酞蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究.华南理工大学[D].2014”。
所述的无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2在文献“黑曲霉来源脯氨酞蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究.华南理工大学[D].2014”中被公开。
上述重组菌中，所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因为删除各种所述基因的全部或者部分重要编码框，即敲除各种所述基因的全部或者部分重要编码框；以及其他一些方式，使该基因不能表达产物或者表达产物没有功能。
本发明所提供的黑曲霉改造菌株敲除了与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因，通过测定该改造菌株相较于野生型的转苷酶和糖化酶的相对酶活实现对该敲除菌株的评价。
一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的构建方法，包括如下步骤：失活高产糖化酶的黑曲霉中的所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因，得到的重组菌。
所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因具体通过同源重组实现。
所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因为α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)中的至少一种。
上述构建方法，所述的同源重组包括如下步骤：
1)构建敲除载体，该敲除载体(如图1所示)的敲除表达框自上游至下游依次为Upstream-Redown-Selective marker-Downstream，其中Upsteam为待敲除基因5′侧翼区；Selective marker为筛选标记基因；Downstream为待敲除基因3′侧翼区；Redown为Downstream的5′端至少300bp的重复片段；所述待敲除基因5′侧翼区选自该待敲除基因5′侧翼区至少500bp的DNA片段；所述待敲除基因3′侧翼区选自该待敲除基因3′端至少500bp的DNA片段，该3′侧翼区可包含该待敲除基因的部分编码区。
2)将所述载体导入出发菌中，即得到同源重组菌；
3)利用所述敲除载体的重复片段产生的基因交换现象，在含有5-氟乳清酸的平板上涂布同源重组菌，筛选得到不含有筛选标记基因的改造菌株，回收筛选标记基因，即得到所述重组菌。
在上述方法的步骤2)的出发菌为无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG。
上述构建方法中，所述的同源重组中，步骤1)的所述待敲除基因为基因agdB，步骤2)的出发菌为为无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG；步骤2)得到同源重组菌为同源重组菌A(Aspergillusniger SH-2:Δ1(敲除基因agdB))，步骤3)得到重组菌为重组菌B(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB)；具体如下：
1)构建基因agdB敲除载体；
2)将上述载体作为目标质粒通过PEG-原生质体转化法转入所述的高产糖化酶的黑曲霉的pyrG缺陷型黑曲霉SH-2:ΔpyrG中，利用筛选标记pyrG筛选出同源重组菌A(Aspergillus niger SH-2:Δ1(敲除基因agdB))；
3)利用设计的500bp左右的重复片段及其5-氟乳清酸筛选平板，回收筛选标记基因pyrG，得到重组菌B(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB)。
上述构建方法中，所述的同源重组中，步骤1)的所述待敲除基因为基因agdA，步骤2)的出发菌为所述的重组菌B(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB)；步骤2)得到同源重组菌为同源重组菌C(Aspergillus niger SH-2:Δ2(敲除基因agdB和agdA))；步骤3)得到重组菌为重组菌D(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA)；具体如下：
1)构建基因agdA敲除载体；
2)将上述载体作为目标质粒通过PEG-原生质体转化法转入重组菌B(Aspergillusniger SH-2:ΔpyrGΔagdB)中，利用筛选标记pyrG筛选出同源重组菌C(Aspergillusniger SH-2:Δ2(敲除基因agdB和agdA))；
3)利用设计的500bp左右的重复片段及其5-氟乳清酸筛选平板，回收筛选标记基因pyrG，得到重组菌D(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA)。
上述构建方法中，所述的同源重组中，步骤1)的所述待敲除基因为基因agdE，步骤2)的出发菌为所述的重组菌D(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA)，步骤2)得到同源重组菌为同源重组菌E(Aspergillus niger SH-2:Δ3(敲除基因agdB、agdA和agdE))，步骤3)得到重组菌为重组菌F(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE)；具体如下：
1)构建基因agdE敲除载体；
2)将上述载体作为目标质粒通过PEG-原生质体转化法转入重组菌D(Aspergillusniger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA)中，利用筛选标记pyrG筛选出同源重组菌E(Aspergillus niger SH-2:Δ3(敲除基因agdB、agdA和agdE))；
3)利用设计的500bp左右的重复片段及其5-氟乳清酸筛选平板，回收筛选标记基因pyrG，得到重组菌F(Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE)。
依次类推，这里就不一一赘述。
为了实现上述没有表述的agdB、agdA、agdE、agdG、agdF、agdC和agdD中的至少一种的基因敲除重组菌的构建方法也是本发明的保护的范围。
所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌在生产糖化酶中的应用。
一种生产糖化酶的方法，包括如下步骤：在淀粉发酵培养基中发酵培养上述的重组菌，离心收集发酵液，干燥后得到糖化酶粗酶制剂。
上述方法中，所述淀粉发酵培养基中的玉米淀粉浓度为5％～10％。
上述方法中，所述淀粉发酵培养基中的玉米浆浓度为1％～5％。
上述方法中，所述淀粉发酵培养基中的豆粕粉浓度为1％～3％。
所述淀粉发酵培养基的成分包括5％～10％玉米淀粉、1％～5％玉米浆、1％～3％豆粕粉。
所述的发酵培养的条件优选为在30℃，200～250rpm条件下培养6～8天。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明的实验证明，本发明通过对一株高产糖化酶的黑曲霉pyrG缺陷型Aspergillus niger SH-2:ΔpyrG进行基因工程改造，失活基因agdB、agdA和agdE后，得到低转苷酶活性的新菌株，利用该菌株发酵生产的糖化酶与原始菌株相比，糖化酶酶活增加33％，α-葡萄糖转苷酶酶活降低43％以上，简化了从发酵液中去除转苷酶的分离纯化工艺，降低了生产成本，具有一定的创新性，有较强的开发意义。
附图说明
图1是构建的黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因敲除载体的结构示意图。
图2是PCR和相对荧光定量PCR验证基因agdB敲除结果图；其中，M为DL1000DNAMarker；1为野生型Aspergillus niger SH-2；2为agdB敲除株Aspergillus niger SH-2:Δ1(敲除基因agdB)。
图3是PCR和相对荧光定量PCR验证基因agdA敲除结果图；其中，M为DL1000DNAMarker；1为野生型Aspergillus niger SH-2；2为agdA敲除株Aspergillus niger SH-2:Δ2(敲除基因agdB和agdA)。
图4是PCR和相对荧光定量PCR验证基因agdE敲除结果图；其中，M为DL1000DNAMarker；1为野生型Aspergillus niger SH-2；2为agdE敲除株Aspergillus niger SH-2:Δ3(敲除基因agdB、agdA和agdE)。
图5是PCR和相对荧光定量PCR验证基因agdG敲除结果图；其中，M为DL1000DNAMarker；1为野生型Aspergillus niger SH-2；2为agdG敲除株Aspergillus niger SH-2:Δ4(敲除基因agdB、agdA、agdE和agdG)。
图6是野生型Aspergillus niger SH-2和基因agdB敲除株Aspergillus nigerSH-2:Δ1(敲除基因agdB)摇瓶发酵液中α-葡萄糖转苷酶酶活随发酵时间变化情况。
图7是各个黑曲霉基因敲除株摇瓶发酵液中糖化酶的相对酶活测定结果图；其中，以野生型摇瓶发酵液中的糖化酶酶活作为100％。
图8是各个黑曲霉基因敲除株摇瓶发酵液中α-葡萄糖转苷酶的相对酶活测定结果图；其中，以野生型摇瓶发酵液中的α-葡萄糖转苷酶酶活作为100％。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本文所述的术语“agdB”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因B；“agdA”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因A；“agdE”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因E；“agdG”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因G；“agdF”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因F；“agdC”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因C；“agdD”的全称为α-葡萄糖转苷酶表达基因D。
本文所用的术语“敲除基因”是指通过将该基因的编码框全部或部分删除，达到失活该基因的目的。
本文所用的术语“失活基因”是指通过删除全部或者部分编码框，以及其他一些方式，使该基因不能表达产物或者产物没有功能。
本文所用的术语“侧翼区”是指目的基因编码框敲除部分5′端的上游序列或者3′端的下游序列。
本发明的重组菌是在高产糖化酶的黑曲霉的基础上通过基因工程改造而获得的。基因工程操作的起始菌株可以是野生型黑曲霉，也可以是已经经过某些基因工程改造的重组黑曲霉。本邻域技术人员可以理解，本发明的重组菌中还可以包含其他基因突变，以便获得某些性状。本领域技术人员可以根据现有技术的教导容易地引入此类突变。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面实施例中所用酶制剂均购自Takara公司，质粒提取所用试剂盒购自广州捷倍斯生物科技有限公司，回收DNA片段所用试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
实施例1构建黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因敲除载体
以黑曲霉Aspergillus niger SH-2基因组为模板，分别用引物Upstream-F与Upstream-R、Redown-F和Redown-R、Downstream-F和Downstream-R进行扩增，得到1000bp左右的Upstream片段(待敲除基因的上游同源臂)、500bp左右的Redown片段(待敲除基因的下游同源臂的部分重复序列)和1000bp左右的Downstream片段(待敲除基因的下游同源臂)；以构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组为模板，用引物对pyrG-F和pyrG-R扩增出1398bp的pyrG片段(如序列表中的序列SEQ ID NO:8所示)，胶回收后以Upstream片段、Redown片段和pyrG片段为模板，以Upstream-F和pyrG-R为引物，进行PCR得到Upstream-Redown-pyrG融合PCR产物；再以胶回收得到的Upstream-Redown-pyrG片段和Downstream片段为模板，以Upstream-F和Downstream-R为引物进行PCR得到Upstream-Redown-pyrG-Downstream融合PCR产物。再将整个片段加A纯化后连接T-vector pMDTM20(购自Takara公司)，得到pMD20-Upstream-Redown-pyrG-Downstream质粒，构建好的质粒图谱见图1。该质粒在Upstream片段上游和Downstream片段下游5′端加上了EcoR V或者Bgl II等限制性酶切位点，以便线性化后用于原生质体转化。
实施例2同源重组敲除目的基因的转化和筛选
1、原生质体的制备：在CD液体培养基(葡萄糖2％；NaNO3 0.3％；KCl 0.2％；MgSO4·7H2O 0.05％；KH2PO4 0.001％；琼脂糖0.05％；pH5.5；灭菌后加入1×尿嘧啶核苷)中培养黑曲霉菌丝，当菌体量足够时转移至YPD液体培养基(蛋白胨2％；酵母粉1％；葡萄糖2％；灭菌后加入1×尿嘧啶核苷)。用双层滤纸从培养液中过滤菌丝球并用0.8M NaCl洗涤，菌丝体滤干后转移至含有0.8M NaCl、1％纤维素酶(w/v)、0.2％溶壁酶(w/v)、1％蜗牛酶(w/v)和0.5％溶菌酶(w/v)的酶解液中。30℃，100rpm酶解1.5～3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上，四层擦镜纸过滤后用5mL NaCl冲洗四次。滤液900×g，4℃离心10min后，弃上清；用20mL STC(10mM Tris-HCl；1.2M山梨醇；50mM CaCl2；pH7.5)重悬后，900×g，4℃离心10min，再用20mL STC重悬第二次，900×g，4℃离心10min后将得到的原生质体重悬于适量的STC溶液中。
2、原生质体的转化：将10μg质粒即EcoR V等限制性内切酶线性化DNA片段加入到100μL原生质体悬浮液和60μL PEG溶液(10mM Tris-HCl；60％(w/v)PEG 4000；10mM CaCl2；pH7.5)中，混匀后冰上放置30min，再加入1.5mL PEG溶液，混匀，室温放置25min后加入到3mL STC和6mL软琼脂蔗糖高渗培养基(蔗糖40％；NaNO3 0.3％；KCl 0.2％；MgSO4·7H2O0.05％；KH2PO4 0.001％；琼脂糖0.5％；pH5.5)中，混合后铺平板(其中下层培养基中含2％琼脂)，待平板凝固后放入30℃培养箱中培养。同时准备阳性对照和阴性对照组，其中阳性对照不加质粒，但加入1×尿嘧啶核苷；而阴性对照既不加质粒也不加入尿嘧啶核苷。平板在30℃培养箱中培养4～6天后在上层培养基长出的转化子即为阳性转化子。
实施例3Aspergillus niger SH-2:Δ1和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB菌株的构建及其功能鉴定(敲除基因agdB)
一、Aspergillus niger SH-2:Δ1和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB菌株的构建
1、构建敲除载体
(1)agdB基因敲除载体构建相关引物序列如下：
引物名称 序列(5′→3′)
Upstream(agdB)-F add EcoR V gatatcTGCGCCTCAGTACTTGGGAG
Upstream(agdB)-R <u>ccctgtcaatggcaa</u>ATCCCAGCTGGGTGGTCCCAGC
Redown(agdB)-F <u>ccacccagctgggat</u>TTGCCATTGACAGGGTTAGTG
Redown(agdB)-R <u>tctcgaggaagttgc</u>GCTCGCCGGTCTGGCTTTG
pyrG(agdB)-F <u>gccagaccggcgagc</u>GCAACTTCCTCGAGAACGCGC
pyrG(agdB)-R <u>cactaaccctgtcaatggcaa</u>CCCTTTTAGTCAATACCG
Downstream(agdB)-F <u>cggtattgactaaaaggg</u>TTGCCATTGACAGGGTTAGTG
Downstream(agdB)-R add EcoR V gatatcCTACTTCAGCTTAAAGTTCACCG
引物Upstream(agdB)-F和引物Downstream(agdB)-R斜体加粗部分为EcoR V酶切位点，其他引物序列下划线部分为重叠序列便于进行融合PCR。
(2)用上述基因agdB敲除所用引物扩增出目的片段后，按照实施例1所述载体构建方法构建基因agdB敲除载体。
2、同源重组敲除目的基因agdB的转化和筛选
将上述敲除载体通过PEG-原生质体转化方法转入无孢黑曲霉(Aspergillusniger)SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株(命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG)中(具体方法如前所述)，利用成功整合筛选标记基因pyrG的菌株能在不含尿嘧啶核苷的蔗糖高渗培养基上生长的特性筛选同源重组突变株。通过在基因agdB编码框敲除部分设计引物，分别进行PCR和相对荧光定量PCR验证是否成功敲除基因agdB，如图2所示，该图说明基因agdB已成功敲除，即得到成功敲除基因agdB的同源重组菌，命名为Aspergillus niger SH-2:Δ1。
3、筛选标记pyrG的回收利用
通过设计500bp左右的同向重复片段，利用生物体自身存在的自交换机制，通过在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶核苷的CD固体培养基(葡萄糖2％，硝酸钠0.3％，KCl 0.2％，MgSO4 0.05％，K2HPO4 0.1％，FeSO4 0.001％，Agar 1.5％，pH 5.5)中培养，利用5-氟乳清酸能抑制含有pyrG基因的菌株的生长，筛选出不含pyrG筛选标记的菌株，将该菌株用作下一步敲除的宿主菌。所以能在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶核苷的CD固体培养基上生长而在CD固体培养基上无法生长的菌株则为筛选得到的不含pyrG基因的目标菌株，得到成功敲除基因agdB的重组菌，命名为Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB。
二、Aspergillus niger SH-2:Δ1菌株功能的鉴定
1、摇瓶发酵
挑选在CD固体培养基上验证正确且正常生长的单克隆，低速研磨后转接CD液体培养基，培养到足够菌体量后转接至装有100mL淀粉摇瓶发酵培养基(豆粕粉2％(w/v)；玉米浆3％(w/v)；玉米淀粉5％(w/v)；pH5.5)的500mL三角瓶中，同时取野生型的黑曲霉Aspergillus niger SH-2作为对照，30℃，250rpm培养，从第二天开始每隔24h取样，离心后取发酵上清液测定转苷酶的活性，实验重复3次，实验结果见图6，由图可知，agdB敲除株发酵液中转苷酶酶活与野生型一样随着发酵时间的增长而增加，但由图可以看出agdB敲除株发酵液中转苷酶酶活始终低于野生株，且随着时间的增长，两者发酵液中转苷酶酶活差异越大，到第7天以后转苷酶酶活已经降到野生株的50％左右。取第6天的发酵上清液分别进行转苷酶和糖化酶酶活测定。
2、糖化酶和转苷酶酶活测定
糖化酶活力单位定义为：1mL酶液在40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位。
转苷酶活力单位定义：在37℃pH6.8条件下，每分钟水解对硝基苯基-α-D-葡萄糖苷生成1μmol D-葡萄糖所需酶量定义为一个酶活力单位。
利用DNS法(孙淑琴and邵冬梅(1997)比色法快速测定糖化酶活力新方法.河北省科学院学报，36-40)测定糖化酶酶活，相对酶活测定结果见表1和图7，由图可知，agdB敲除株糖化酶酶活为野生型的1.15倍左右；pNPG法(Toshitaka Minetoki et al.(1995)Nucleotide Sequence and Expression ofα-Glucosidase-encoding Gene(agdA)fromAspergillus oryzae.Biosci.Biotech.Biochem.,59(8),1516-1521)(方法略有改动)测定转苷酶酶活，转苷酶相对酶活见表1和图8，由图可知，agdB敲除株转苷酶酶活为野生型的64％左右，说明敲除基因agdB后，转苷酶酶活降低36％。
上述重组菌Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB，与Aspergillus niger SH-2:Δ1菌株的功能一致。
实施例4Aspergillus niger SH-2:Δ2和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA菌株的构建及其功能鉴定(敲除基因agdB和agdA)
一、Aspergillus niger SH-2:Δ2和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA菌株的构建
1、构建敲除载体
(1)agdA基因敲除载体构建相关引物序列如下：
引物名称 序列(5′→3′)
Upstream(agdA)-F add EcoR V gatatcCAGAGTCTGAGGCTCGCTGACGAT
Upstream(agdA)-R <u>gccgccccagtggcc</u>GGCTCGCTTAAGGAGGCTCGAG
Redown(agdA)-F <u>ctccttaagcgagcc</u>GGCCACTGGGGCGGCGACAAC
Redown(agdA)-R <u>tctcgaggaagttgc</u>TCGTACCACACTTCGCCATGTCC
pyrG(agdA)-F <u>cgaagtgtggtacga</u>GCAACTTCCTCGAGAACGCGCC
pyrG(agdA)-R <u>gccgccccagtggcc</u>CCCTTTTAGTCAATACCGTTACACAT
Downstream(agdA)-F <u>tattgactaaaaggg</u>GGCCACTGGGGCGGCGACAAC
Downstream(agdA)-R add EcoR V gatatcCTACCATTCCAATACCCAGTTTTCC
引物Upstream(agdA)-F和引物Downstream(agdA)-R斜体加粗部分为EcoR V酶切位点，其他引物序列下划线部分为重叠序列便于进行融合PCR。
(2)用上述基因agdA敲除所用引物扩增出目的片段后，按照实施例1所述载体构建方法构建基因agdA敲除载体。
2、同源重组敲除目的基因agdA的转化和筛选
将上述敲除载体通过PEG-原生质体转化方法转入黑曲霉Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdB中(具体方法如前所述)，利用成功整合筛选标记基因pyrG的菌株能在不含尿嘧啶核苷的蔗糖高渗培养基上生长的特性筛选同源重组突变株。通过在基因agdA编码框敲除部分设计引物，分别进行PCR和相对荧光定量PCR验证是否成功敲除基因agdA，如图3所示，该图说明基因agdA已成功敲除，即得到成功敲除基因agdA的同源重组菌，命名为Aspergillus niger SH-2:Δ2。
3、筛选标记pyrG的回收利用
通过设计500bp左右的同向重复片段，利用生物体自身存在的自交换机制，通过在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶核苷的CD固体培养基(葡萄糖2％，硝酸钠0.3％，KCl 0.2％，MgSO4 0.05％，K2HPO4 0.1％，FeSO4 0.001％，Agar 1.5％，pH 5.5)中培养，利用5-氟乳清酸能抑制含有pyrG基因的菌株的生长，筛选出不含pyrG筛选标记的菌株，将该菌株用作下一步敲除的宿主菌。所以能在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶核苷的CD固体培养基上生长而在CD固体培养基上无法生长的菌株则为筛选得到的不含pyrG基因的目标菌株，得到成功敲除基因agdA的重组菌，命名为Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA。
二、Aspergillus niger SH-2:Δ2菌株功能的鉴定
1、摇瓶发酵
挑选在CD固体培养基上验证正确且正常生长的单克隆，低速研磨后转接CD液体培养基，培养到足够菌体量后转接至装有100mL淀粉摇瓶发酵培养基(豆粕粉2％(w/v)；玉米浆3％(w/v)；玉米淀粉5％(w/v)；pH5.5)的500mL三角瓶中，同时取野生型的黑曲霉Aspergillus niger SH-2作为对照，30℃，250rpm培养6天，离心后取发酵上清液分别测定转苷酶和糖化酶的活性，实验重复3次。
2、糖化酶和转苷酶酶活测定
利用DNS法测定糖化酶酶活，相对酶活测定结果见表1和图7，由图可知，agdA敲除株糖化酶酶活为野生型的1.07倍；pNPG法测定转苷酶酶活，转苷酶相对酶活见表1和图8，由图可知，agdA敲除株转苷酶酶活为野生型的63％，说明在敲除基因agdB的基础上再将基因agdA进行敲除后，转苷酶酶活降低37％。
上述重组菌Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA，与Aspergillusniger SH-2:Δ2菌株的功能一致。
实施例5Aspergillus niger SH-2:Δ3和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE菌株的构建及其功能鉴定(敲除基因agdB、agdA和agdE)
一、Aspergillus niger SH-2:Δ3和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE菌株的构建
1、构建敲除载体
(1)agdE基因敲除载体构建相关引物序列如下：
引物名称 序列(5′→3′)
Upstream(agdE)-F add EcoR V gatatcGGCCGGGGGAGCAGAGCTTCA
Upstream(agdE)-R <u>atagggatggaagcg</u>GATGGGAGAGCTCAGTAGTCAATC
Redown(agdE)-F <u>ctgagctctcccatc</u>CGCTTCCATCCCTATGGTTCTGAA
Redown(agdE)-R <u>tctcgaggaagttgc</u>CCGTATGCCGCTTTCCGGCTCC
pyrG(agdE)-F <u>gaaagcggcatacgg</u>GCAACTTCCTCGAGAACGCGCC
pyrG(agdE)-R <u>atagggatggaagcg</u>CCCTTTTAGTCAATACCGTTACACAT
Downstream(agdE)-F <u>tattgactaaaaggg</u>CGCTTCCATCCCTATGGTTCTGAA
Downstream(agdE)-R add EcoR V gatatcCTAAAACTCAATCCGCCATGTCTTTC
引物Upstream(agdE)-F和引物Downstream(agdE)-R斜体加粗部分为EcoR V酶切位点，其他引物序列下划线部分为重叠序列便于进行融合PCR。
(2)用上述基因agdE敲除所用引物扩增出目的片段后，按照实施例1所述载体构建方法构建基因agdE敲除载体。
2、同源重组敲除目的基因agdE的转化和筛选
将上述敲除载体通过PEG-原生质体转化方法转入黑曲霉Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdA中(具体方法如前所述)，利用成功整合筛选标记基因pyrG的菌株能在不含尿嘧啶核苷的蔗糖高渗培养基上生长的特性筛选同源重组突变株。通过在基因agdE编码框敲除部分设计引物，分别进行PCR和荧光定量PCR验证是否成功敲除基因agdE，如图4所示，该图说明基因agdE已成功敲除，即得到成功敲除基因agdE的同源重组菌，命名为Aspergillus niger SH-2:Δ3。
3、筛选标记pyrG的回收利用
通过设计500bp左右的同向重复片段，利用生物体自身存在的自交换机制，通过在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶核苷的CD固体培养基(葡萄糖2％，硝酸钠0.3％，KCl 0.2％，MgSO4 0.05％，K2HPO4 0.1％，FeSO4 0.001％，Agar 1.5％，pH 5.5)中培养，利用5-氟乳清酸能抑制含有pyrG基因的菌株的生长，筛选出不含pyrG筛选标记的菌株，将该菌株用作下一步敲除的宿主菌。所以能在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶核苷的CD固体培养基上生长而在CD固体培养基上无法生长的菌株则为筛选得到的不含pyrG基因的目标菌株，得到成功敲除基因agdE的重组菌，命名为Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE。
二、Aspergillus niger SH-2:Δ3菌株功能的鉴定
1、摇瓶发酵
挑选在CD固体培养基上验证正确且正常生长的单克隆，低速研磨后转接CD液体培养基，培养到足够菌体量后转接至装有100mL淀粉摇瓶发酵培养基(豆粕粉2％(w/v)；玉米浆3％(w/v)；玉米淀粉5％(w/v)；pH5.5)的500mL三角瓶中，同时取野生型的黑曲霉Aspergillus niger SH-2作为对照，30℃，250rpm培养6天，离心后取发酵上清液分别测定转苷酶和糖化酶的活性，实验重复3次。
2、糖化酶和转苷酶酶活
利用DNS法测定糖化酶酶活，相对酶活测定结果见表1和图7，由图可知，agdE敲除株糖化酶酶活为野生型的1.33倍；pNPG法测定转苷酶酶活，转苷酶比酶活见表1和图8，由图可知，agdE敲除株转苷酶酶活为野生型的57％，说明在敲除基因agdB和基因agdA基础上继续敲除基因agdE，转苷酶酶活降低43％。
上述重组菌Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE，与Aspergillus niger SH-2:Δ3菌株的功能一致。
实施例6Aspergillus niger SH-2:Δ4和Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdEΔagdG菌株的构建及其功能鉴定(敲除基因agdB、agdA、agdE和agdG)
agdG基因敲除载体构建相关引物序列如下：
引物名称 序列(5′→3′)
Upstream(agdG)-F add EcoR V gatatcCGGATATAGACTGACTTCGAGAAATT
Upstream(agdG)-R <u>gtgtcttcgttggtg</u>CTTGGGCGAGAGTTTTGAAATCCTGT
Redown(agdG)-F <u>aaactctcgcccaag</u>CACCAACGAAGACACTCGCGCC
Redown(agdG)-R <u>ctgcggcgcgttctcgaggaagttgc</u>AGACGGCACCCAATTCACCCCAG
pyrG(agdG)-F GCAACTTCCTCGAGAACGCGCC
pyrG(agdG)-R CCCTTTTAGTCAATACCGTTACACAT
Downstream(agdG)-F <u>atgtgtaacggtattgactaaaaggg</u>CACCAACGAAGACACTCGCGCC
Downstream(agdG)-R add EcoR V gatatcTCACGCATACAGCACCGTTCCATT
引物Upstream(agdG)-F和引物Downstream(agdG)-R斜体加粗部分为EcoR V酶切位点，其他引物序列下划线部分为重叠序列便于进行融合PCR。
按照实施例1所述方法构建基因agdG的敲除载体，同源重组菌Aspergillus nigerSH-2:Δ4和重组菌Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdEΔagdG的构建步骤见实施例3～5，其中同源重组菌Aspergillus niger SH-2:Δ4构建的宿主菌为黑曲霉Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdE，敲除结果由图5所示，该图说明基因agdG已成功敲除，即得到成功敲除基因agdG的同源重组菌，命名为Aspergillus nigerSH-2:Δ4；其发酵培养方式及转苷酶和糖化酶酶活测定方法见实施例3～5。
利用DNS法测定糖化酶酶活，相对酶活测定结果见表1和图7，由图可知，agdG敲除株糖化酶酶活为野生型的1.22倍；pNPG法测定转苷酶酶活，转苷酶比酶活见表1和图8，由图可知，agdG敲除株转苷酶酶活为野生型的58％，说明在敲除基因agdB、agdA和agdE基础上继续敲除基因agdG，转苷酶酶活降低42％。
上述重组菌Aspergillus niger SH-2:ΔpyrGΔagdBΔagdAΔagdEΔagdG，与Aspergillus niger SH-2:Δ4菌株的功能一致。
表1Aspergillus niger SH-2，SH-2:Δ1，SH-2:Δ2，SH-2:Δ3和SH-2:Δ4摇瓶发酵对比实验结果
菌株 SH-2 SH-2:Δ1 SH-2:Δ2 SH-2:Δ3 SH-2:Δ4
糖化酶酶活U/mL 19775 22823 21208 26314 24218
转苷酶酶活U/mL 0.0469 0.0298 0.0297 0.0265 0.0273
由上述结果可知，转苷酶基因agdB、agdA、agdE和agdG敲除后，转苷酶酶活均有下降，其中SH-2:Δ3与SH-2:Δ1的差别在于敲除了基因agdA和agdE，结果显示SH-2:Δ1转苷酶酶活较野生型降低36％左右，糖化酶酶活较野生型升高了15％左右；而SH-2:Δ3转苷酶酶活较野生型降低43％左右，糖化酶酶活较野生型提高了33％左右；SH-2:Δ3相较于SH-2:Δ1与SH-2:Δ2，转苷酶酶活有所降低，糖化酶酶活有所增加。综合实验结果可知，SH-2:Δ3敲除菌株相较于其他敲除菌株的效果最好，不仅降低了转苷酶酶活，还提高了糖化酶的生产产量，有利于扩大该高产糖化酶黑曲霉的工业生产应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，其特征在于：是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中agdB、agdA和agdE，或失活agdB、agdA、agdE和agdG；
所述基因agdB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述基因agdA的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；所述基因agdE的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述基因agdG的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的高产糖化酶的黑曲霉为无孢黑曲霉SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG。
2.根据权利要求1所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，其特征在于：所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的agdB、agdA和agdE，或失活agdB、agdA、agdE和agdG为使该基因不能表达产物或者表达产物没有功能。
3.权利要求1所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
失活高产糖化酶的黑曲霉中的agdB、agdA和agdE，或失活agdB、agdA、agdE和agdG，得到的重组菌。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的agdB、agdA和agdE，或失活agdB、agdA、agdE和agdG具体通过同源重组实现。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：
所述的同源重组包括如下步骤：
1)构建敲除载体，该敲除载体的敲除表达框自上游至下游依次为Upstream-Redown-Selective marker-Downstream，其中Upstream为待敲除基因5′侧翼区；Selective marker为筛选标记基因；Downstream为待敲除基因3′侧翼区；Redown为Downstream的5′端至少300bp的重复片段；所述待敲除基因5′侧翼区选自该待敲除基因5′端至少500bp的DNA片段；所述待敲除基因3′侧翼区选自该待敲除基因3′端至少500bp的DNA片段；
2)将所述载体导入出发菌中，即得到同源重组菌；
3)利用所述敲除载体的重复片段产生的基因交换现象，在含有5-氟乳清酸的平板上涂布同源重组菌，筛选得到不含有筛选标记基因的改造菌株，回收筛选标记基因，即得到所述重组菌。
6.权利要求1～2任一项所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌在生产糖化酶中的应用。
7.一种生产糖化酶的方法，其特征在于包括如下步骤：在淀粉发酵培养基中发酵培养权利要求1～2任一项所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，离心收集发酵液，干燥后得到糖化酶粗酶制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述淀粉发酵培养基中的玉米淀粉浓度为5％～10％；
所述淀粉发酵培养基中的玉米浆浓度为1％～5％；
所述淀粉发酵培养基中的豆粕粉浓度为1％～3％。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养的条件为在30℃，200～250rpm条件下培养6～8天。
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