CN104651242B - 一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104651242B
CN104651242B CN201510073078.0A CN201510073078A CN104651242B CN 104651242 B CN104651242 B CN 104651242B CN 201510073078 A CN201510073078 A CN 201510073078A CN 104651242 B CN104651242 B CN 104651242B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amya
homologous recombination
aspergillus niger
genetic engineering
transformant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510073078.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104651242A (zh
Inventor
李�杰
王小燕
张会
刘天奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NINGXIA SUNSON INDUSTRY GROUP CO.,LTD.
Original Assignee
Ao Ruizhen Bio Tech Ltd Harbin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ao Ruizhen Bio Tech Ltd Harbin filed Critical Ao Ruizhen Bio Tech Ltd Harbin
Priority to CN201510073078.0A priority Critical patent/CN104651242B/zh
Publication of CN104651242A publication Critical patent/CN104651242A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104651242B publication Critical patent/CN104651242B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明所提供的基因工程菌是利用黑曲霉α‑淀粉酶基因amyA置换出发菌株的糖化酶基因glaA获得的基因工程菌。本发明所提供的基因工程菌在液态发酵条件下，高产高纯度真菌α‑淀粉酶，发酵液中真菌α‑淀粉酶活性达到15368U/mL，真菌α‑淀粉酶含量占分泌蛋白总量的90％以上，发酵液中糖化酶，蛋白酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶等活性极低。同时，本发明还提供了该基因工程菌的构建方法。

Description

一种真菌α-淀粉酶基因工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种真菌α-淀粉酶基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
真菌α-淀粉酶是由曲霉属微生物发酵产生的一种α-淀粉酶。又名真菌淀粉酶，可以迅速水解胶凝淀粉、直链淀粉和支链淀粉水溶液内部的α-1，4葡萄糖苷键，产生可溶性糊精及少数麦芽糖和葡萄糖。长时间反应会产生大量麦芽糖和少量葡萄糖的糖浆。因此，真菌α-淀粉酶广泛地应用于淀粉糖浆、低聚糖、麦芽糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的生产，具有十分广阔的市场前景。目前，真菌α-淀粉酶高产菌株都是经米曲霉诱变获得，经固态发酵或深层培养、提取等工序精制而成。存在着生产工艺复杂、产量低等不足。导致其价格昂贵，市场售价一般在200～350元/公斤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株适合于液态发酵的食品级真菌α-淀粉酶工程菌，所采取的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种适合液态发酵的真菌α-淀粉酶基因工程菌，该基因工程菌是利用黑曲霉α-淀粉酶基因amyA置换出发菌株的糖化酶基因glaA获得的基因工程菌。
优选地，所述出发菌株，是黑曲霉黑曲霉CICC2462或米曲霉。
更优选地，所述黑曲霉，是利用黑曲霉的α-淀粉酶基因amyA置换黑曲霉CICC2462的糖化酶基因glaA，再利用潮霉素进行筛选得到黑曲霉同源重组转化子，再利用PCR检测后获得的基因工程菌。
所述基因工程菌用于发酵生产真菌α-淀粉酶。
本发明的另一目的在于提供一种所述基因工程菌的构建方法，该方法是扩增黑曲霉α-淀粉酶基因后构建质粒载体，再酶切质粒载体和Ti质粒后构建同源重组表达载体，通过农杆菌介导将同源重组表达载体转化到黑曲霉中获得黑曲霉同源重组转化子，再利用潮霉素进行筛选，经过PCR检测后获得真菌α-淀粉酶基因工程菌。
所述方法的步骤如下：
1)以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物后扩增黑曲霉α-淀粉酶基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18-T连接后，获得质粒载体pMD-amyA；
2)对步骤1)所得的质粒载体pMD-amyA进行双酶切后回收目的片段，再与同样经过双酶切的载体pSZHG的目的片段进行连接获得黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA；
3)将步骤2)所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA通过农杆菌转化到黑曲霉中获得黑曲霉同源重组转化子；
4)利用潮霉素对步骤3)所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，并利用PCR进行检测后获得真菌α-淀粉酶基因工程菌。
步骤1)所述引物，核苷酸序列表如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
步骤2)所述利用PCR，所用引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述方法的具体步骤如下：
1)以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增黑曲霉α-淀粉酶基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18-T连接后，获得质粒载体pMD-amyA；
所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
2)利用ApaI、HindIII酶对步骤1)所得的质粒载体pMD-amyA进行双酶切后回收目的片段，再与同样经过双酶切的载体pSZHG的目的片段进行连接，获得黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA；
3)采用冻融法将步骤2)所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA转化入农杆菌AGLI中，将转化后的农杆菌AGLI接种到YEB培养基上培养后，利用核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，检测黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA，转入成功即获得黑曲霉同源重组转化子；
4)利用潮霉素对步骤3)所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，获得糖化酶基因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子，再利用同源重组引物对转化子进行PCR检测，能扩增出1701bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株在含有200mg/L的潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代培养，28℃下培养3-4d后，获得纯合同源重组菌株，即真菌α-淀粉酶基因工程菌；
所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述方法用于构建真菌α-淀粉酶基因工程菌。
本发明还提供了一种适合于液态发酵的食品级真菌α-淀粉酶工程菌的具体构建方法：构建黑曲霉α-淀粉酶基因amyA表达载体pSZHG-amyA(图1)，采用农杆菌介导法将上述表达载体转化黑曲霉，通过潮霉素筛选和PCR鉴定，获得在糖化酶基因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子；通过荧光定量PCR、SDS-PAGE和蛋白活性检测等方法测定amyA基因的表达量，获得安全高效表达黑曲霉α-淀粉酶的工程菌。
本发明获得的有益效果如下：
本发明所提供的基因工程菌在液态发酵条件下，高产高纯度真菌α-淀粉酶，发酵液中真菌α-淀粉酶活性达到15368U/mL，真菌α-淀粉酶含量占分泌蛋白总量的90％以上，发酵液中糖化酶，蛋白酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶等活性极低。
附图说明
图1为黑曲霉α-淀粉酶基因amyA表达载体的质粒图谱。
图2为amyA基因的PCR扩增电泳图；
(M，分子量标记DL2000；1，amyA扩增结果)。
图3为pSZHG-amyA载体的构建示意图。
图4为pSZHG-amyA导入农杆菌的PCR电泳图；
(M，DL4500；1，水阴性对照；2，质粒pSZHG-amyA阳性对照；3-10，pSZHG-amyA的农杆菌转化子)。
图5为pSZHG-amyA黑曲霉转化子的PCR电泳图；
(M，DL15000；1，水阴性对照；2，出发菌株对照；3，质粒pSZHG-amyA阳性对照；4-13，pSZHG-amyA转化子)。
图6为同源重组转化子的PCR电泳图；
(M，DL4500；1，水阴性对照；2，出发菌株对照；3，质粒pSZHG-amyA对照；4-6，pSZHG-amyA同源重组转化子)
图7为纯合的同源重组菌株的PCR电泳图；
(M，DL4500；1，水阴性对照；2，出发菌株对照；3，质粒pSZHG-amyA对照；4，pSZHG-amyA非纯合同源重组转化子；5-8，pSZHG-amyA纯合同源重组转化子)。
图8为工程菌分泌蛋白的SDS-PAGE分析；
(M为蛋白Marker；1为出发菌株对照；2-5为工程菌)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1：黑曲霉α-淀粉酶基因amyA表达载体pSZHG-amyA的构建
1.黑曲霉α-淀粉酶基因amyA的扩增
以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，用α-淀粉酶基因amyA引物(amyA-sense：5’ApaI GGGCCCATGGTCGCGTGGTGGTCTCTAT 3’；amyA--antisense：5’HindIII AAGCTTCACGAGCTACTACAGATCTTGC 3’；上海生工合成)扩增amyA基因，得到约2054bp的amyA基因片段(图2)。将基因片段与克隆载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌，提取质粒pMD-amyA，送交测序，结果表明正确。
2.黑曲霉α-淀粉酶基因amyA表达载体pSZHG–amyA的构建
用ApaI、HindIII双酶切质粒pMD18-amyA，回收约2000bp的目的片段，用相同的酶消化载体pSZHG(Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体及其应用，申请号：201310066124.5)，回收约15000bp的目的片段，将这2个片段连接，构建黑曲霉表达载体pSZHG-amyA(图3)。实施例2：黑曲霉α-淀粉酶工程菌的构建
1.重组质粒转化农杆菌
采用冻融法将构建好的同源重组表达载体pSZHG-amyA转化入农杆菌AGLI中，涂布在含有50mg/L Rif和mg/L Kan的固体YEB培养基上，28℃培养3-4d，待长出单菌落以菌落为模板，以水为阴性对照，以质粒pSZHG-amyA为阳性对照，用引物amyA--sense、amyA--antisense进行PCR扩增(图4)，可扩增出约2000bp目的条带，说明载体pSZHG-amyA成功地转入农杆菌AGLI中。
2.农杆菌介导法转化黑曲霉
取200μL黑曲霉CICC2462菌丝悬液和150μL农杆菌菌液混匀，将上述混合物涂布到铺有玻璃纸的含200umol/L AS的PDA平板上，28℃共培养2d，将玻璃纸转到含200mg/L头孢噻肟霉素、200mg/L潮霉素B的PDA平板上，32℃培养1d后揭下玻璃纸，继续培养6-8d至长出菌落。将抗性菌落转移到含200mg/L潮霉素B的PDA液体培养基上，进行二次筛选。
3.黑曲霉转化子的鉴定
对二次筛选仍然正常生长的黑曲霉菌丝体采用CTAB法提取基因组，以提取的基因组DNA为模板，用引物GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2进行PCR扩增，并将扩增产物用HindIII酶切，检测结果如图5，可见约3100bp和1200bp的目的条带的是阳性重组转化子。
进一步用鉴定同源重组引物(hph-sense：GACAATGGCCGCATAACAG；hph-antisense：GAAGCCTTGAGCGACGAAT；上海生工合成，hph-sense位于HPH基因内，hph-antisense位于GLA3外侧)对转化子进行PCR检测，筛选同源重组转化子。可扩增出约1701bp的目的条带的是同源重组转化子(图6)。
为分离出纯合的同源重组转化子，将同源重组转化子在含有200mg/L潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代，液体培养物涂在含有200mg/L潮霉素B的PDA固体培养基上，28℃培养3-4d后，挑取单菌落于PDA液体培养基中培养，待长出大量菌丝后，提取基因组DNA，用引物GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2进行PCR扩增，并将扩增产物用HindIII酶切，检测结果如图7，只有约3100bp和1200bp的目的条带的是纯合的同源重组菌株，这些菌株基因组中的糖化酶基因glaA完全被α-淀粉酶基因amyA所置换，即为工程菌。
4.工程菌发酵液中蛋白和酶活的检测
将出发菌株和工程菌进行液态发酵(每升培养基含100克葡萄糖、20毫升玉米浆、20克豆饼粉，pH5.5～6.0)，取发酵液上清进行SDS-PAGE和酶活检测。SDS-PAGE检测结果如图8，可见纯合同源重组菌株发酵液中无糖化酶，α-淀粉酶显著增加。经酶活检测，工程菌发酵液上清中α-淀粉酶活性为15368U/mL(QB 2526-2001)，蛋白酶活性为21.5U/mL(GB/T23527-2009)，木聚糖酶活性为47.9U/mL(GB/T 23874-2009)，甘露聚糖酶活性为173.2U/mL(在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位)，纤维素酶活性为52.3U/mL(CMC酶活)。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种适合液态发酵的真菌α-淀粉酶基因工程菌，其特征在于，是利用黑曲霉α-淀粉酶基因amyA置换出发菌株的糖化酶基因glaA获得的基因工程菌；上述基因工程菌的具体步骤如下：
1)以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增黑曲霉α-淀粉酶基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18-T连接后，获得质粒载体pMD-amyA；
所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
2)利用ApaI、HindIII酶对步骤1）所得的质粒载体pMD-amyA进行双酶切后回收目的片段，再与同样经过双酶切的载体pSZHG的目的片段进行连接，获得黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA；
3)采用冻融法将步骤2）所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA转化入农杆菌AGLI中，将转化后的农杆菌AGLI接种到YEB培养基上培养后，利用核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，检测黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA，农杆菌AGLI介导法转化黑曲霉CICC2462，转入成功即获得黑曲霉同源重组转化子；
4)利用潮霉素对步骤3）所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，获得糖化酶基因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子，再利用同源重组引物对转化子进行PCR检测，能扩增出1701bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株在含有200mg/L的潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代培养，28℃下培养3-4d后，获得纯合同源重组菌株，即真菌α-淀粉酶基因工程菌；
所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株，是黑曲霉CICC2462。
3.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，是利用黑曲霉CICC2462的α-淀粉酶基因amyA置换黑曲霉CICC2462的糖化酶基因glaA，再利用潮霉素进行筛选得到黑曲霉同源重组转化子，再利用PCR检测后获得的基因工程菌。
4.权利要求1-3中的任意一项所述基因工程菌，其特征在于，用于发酵生产真菌α-淀粉酶。
5.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增黑曲霉α-淀粉酶基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18-T连接后，获得质粒载体pMD-amyA；
所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
2）利用ApaI、HindIII酶对步骤1）所得的质粒载体pMD-amyA进行双酶切后回收目的片段，再与同样经过双酶切的载体pSZHG的目的片段进行连接，获得黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA；
3）采用冻融法将步骤2）所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA转化入农杆菌AGLI中，将转化后的农杆菌AGLI接种到YEB培养基上培养后，利用核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，检测黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA，农杆菌AGLI介导法转化黑曲霉CICC2462，转入成功即获得黑曲霉同源重组转化子；
4）利用潮霉素对步骤3）所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，获得糖化酶基因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子，再利用同源重组引物对转化子进行PCR检测，能扩增出1701bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株在含有200mg/L的潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代培养，28℃下培养3-4d后，获得纯合同源重组菌株，即真菌α-淀粉酶基因工程菌；
所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
CN201510073078.0A 2015-02-12 2015-02-12 一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法 Active CN104651242B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510073078.0A CN104651242B (zh) 2015-02-12 2015-02-12 一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510073078.0A CN104651242B (zh) 2015-02-12 2015-02-12 一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104651242A CN104651242A (zh) 2015-05-27
CN104651242B true CN104651242B (zh) 2017-12-22

Family

ID=53242893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510073078.0A Active CN104651242B (zh) 2015-02-12 2015-02-12 一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104651242B (zh)

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
β-1,4-内切木聚糖酶基因在黑曲霉中安全高效表达的研究;张会;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20131015;摘要，第6页第4段，第10页2.1.1节至第33页3.4节,第42页第2段 *
β-甘露聚糖酶基因和牛凝乳基因黑曲霉工程菌的构建;张莹莹;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20131015;第1-40页 *
内切葡聚糖酶基因在黑曲霉中的同源表达;李杰 等;《东北农业大学学报》;20140930;第45卷(第9期);第56-61页 *
农杆菌介导pepA基因对黑曲霉菌丝体的遗传转化;李杰等;《东北农业大学学报》;20130531;第44卷(第5期);第29-35页 *
单宁酶基因在黑曲霉中的同源表达;李杰 等;《东北农业大学学报》;20140731;第45卷(第7期);第61-65页 *
强启动子glaA介导cbhB基因在黑曲霉中的表达;秦慧彬 等;《中国生物工程杂志》;20101130;第30卷(第11期);第34-38页 *
构建β-甘露聚糖酶的黑曲霉基因工程菌;张莹莹 等;《生物技术》;20130630;第23卷(第3期);第31-36页 *
耐高温α-淀粉酶基因工程菌的构建及发酵条件的研究;秦亚楠;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》;20130815;全文 *
阿魏酸酯酶基因在黑曲霉中的同源表达;刘君;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20150115;第200-203页 *
食品级木聚糖酶黑曲霉工程菌的构建;李杰 等;《东北农业大学学报》;20131130;第44卷(第11期);第7-13页 *
黑曲霉耐酸性α-淀粉酶基因真核表达载体的构建及酶学性质研究;李松 等;《工业微生物》;20100831;第40卷(第4期);第63-68页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104651242A (zh) 2015-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105671070B (zh) 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法
CN107586789B (zh) 高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用
EP3556846B1 (en) Genetically engineered candida utilis capable of degrading and utilizing kitchen waste and construction method therefor
CN105802854B (zh) 一种纤维素酶高产菌株及其应用
CN101531988B (zh) 碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法
CN107574173B (zh) 一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法
CN104975039B (zh) 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用
CN104962594A (zh) 一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法
CN103409458B (zh) Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体及其应用
CN101469325B (zh) 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法
CN105969675B (zh) 一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用
RU2701308C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы
CN107058263A (zh) 一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法
CN104651242B (zh) 一种真菌α‑淀粉酶基因工程菌及其构建方法
CN113528492B (zh) 一种将木质纤维素水解液回用于发酵生产纤维素酶液的方法
CN104611284A (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用
CN106350461B (zh) 根瘤农杆菌介导的特异腐质霉的遗传转化方法及其表达载体
CN115197957A (zh) 一种提高贵州木霉njau 4742在逆境下分解农作物秸秆的基因片段及其应用
CN113943662A (zh) 一株异源表达木聚糖酶/纤维素酶CbXyn10c基因的里氏木霉菌株及应用
CN108949784B (zh) 芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用
CN111893107A (zh) 一株异源表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母工程菌株及应用
JP5507062B2 (ja) 高発現プロモーター
CN110713940B (zh) 一种高产重油出芽短梗霉菌株及其构建方法与用途
CN111334446A (zh) 一株耐高温糖化酵母菌株及其应用
CN104403956A (zh) 木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211130

Address after: No. 126, Kangdi Road, Jinfeng District, Yinchuan City, Ningxia Hui Autonomous Region

Patentee after: NINGXIA SUNSON INDUSTRY GROUP CO.,LTD.

Address before: 150030 Heilongjiang Province, Harbin city Xiangfang District Gongbin Road No. 201

Patentee before: HARBIN AURUIZHEN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.