CN101531988B

CN101531988B - 碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN101531988B
Application number: CN 200910068617
Authority: CN
Inventors: 路福平; 肖静; 王春霞; 郝育杰
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2029-04-24
Also published as: CN101531988A

Abstract

本发明涉及一种碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法，包括从产碱性果胶酶的菌株中分离染色体DNA、设计引物、PCR获得目的基因、构建重组质粒、在枯草芽孢杆菌中进行表达，基因序列测定及对比分析。本方法中所得到并表达的基因区别于已报道的该酶基因序列，并在个别氨基酸组成上有差异；工程菌发酵采用的培养基适用于工业化生产，表达宿主为蛋白酶缺陷型，利于后期酶的分离纯化和稳定保藏，工程菌发酵液酶活性较出发菌株提高22倍，达到330U/mL。

Description

碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法。

背景技术

果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布于高等植物和微生物中，但从植物中提取受到资源、技术水平的诸多限制而一直未能真正实现产业化，因此微生物来源的果胶酶成为研究热点。国内外对酸性果胶酶的研究已经具有一定基础，但是对碱性果胶酶尤其是果胶裂解酶(pectate lyase)的研究报道较少。

碱性果胶酶是指最适作用pH在碱性范围内的果胶酶，是果胶酶研究领域中的新兴内容，主要应用于纺织工业中用作对环境友好的生物催化剂，用柔和的酶生物精练代替传统的碱高温蒸煮技术，实现绿色清洁生产，既可减少碱排放污染，又可降低加热能耗和漂洗用水量，同时提高纺织物的加工和使用性能。因而随着生物技术的不断快速发展，碱性果胶酶在纺织工业中的应用潜力也越来越受到大家的关注。

从1972年Horikoshi，K.发表第一篇关于芽孢杆菌生产碱性果胶酶的论文开始，日本等国开始致力于碱性果胶酶的研究。印度Mukesh Kapoor于2001年报道了Bacillus sp.MG-cp-2碱性聚半乳糖醛酸酶的生产、纯化和酶学性质，确定该菌株发酵活力为47u/mL，培养基优化后活力提升为98u/mL，室温时在pH7.0～12.0范围内稳定，可有效应用于苎麻和菽麻纤维脱胶；德国学者2004年测定了果胶酶菌种Bacillus licheniformis DSM13的基因组序列。美国、荷兰、英国、西班牙等国的学者也分别对碱性果胶酶的菌种资源、发酵、纯化方法、酶学性质、分泌调控及分子生物学等内容进行了报道，研究对象除了上述芽孢杆菌之外，还包括一些植物病原菌，如菊欧文氏菌、洋葱伯克霍尔德菌等。

为了获得高产，优质的碱性果胶酶产品，自1990年以来，国外学者把研究重点从筛选产碱性果胶酶菌种方面逐步转向产酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是随着1999年丹麦NovoNordisk(诺和诺德)碱性果胶酶Bioprep(是一种基因改良的芽孢杆菌经发酵制成的酶制剂，其最适pH值为7.5～9.5，适用温度为55℃左右)和碱性果胶裂解酶ScourzymeL(最佳pH值为7.5～9.5，对温度的选用则根据pH值而定，如pH值在8～8.5时，温度掌握在55℃～60℃)的产品问世，人们将注意力越来越多地转向了酶基因及其克隆技术的研究。西班牙、法国、荷兰、日本学者分别将Bacillus sp.(2000年)、Erwinia chrysanthemi3937、Thermotoga maritima(海栖热袍菌，2003年)、Bacillus subtilis(2002年)四种菌株的碱性果胶酶基因克隆到大肠杆菌中成功进行了表达。

国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代，1990年初开始对碱性果胶酶进行研究，大量文献对果胶酶菌种的筛选、传统诱变育种、生产工艺和酶的工业应用等方面做了报道，但关于碱性果胶酶的发酵、酶制剂制备和分子生物学遗传育种方面的研究内容较少。菌种主要是芽孢杆菌，如吉氏芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌No.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02以及小芽孢杆菌WSH03-09、RK9等，此外还有嗜盐嗜碱菌Alkalibacterium sp.F26等。2006年我国学者甄东晓等将Clostridium stercorarium(耐热梭状芽孢杆菌)的耐热果胶裂解酶基因pel9A克隆到表达载体pET28α然后转化大肠杆菌进行表达；同年，诸葛斌等利用温控载体构建了碱性果胶酶工程菌。越来越多的研究单位在基因工程菌应用于工业生产的总体趋势下进行了碱性果胶酶分子生物学操作的有效尝试，大多分子生物学操作或以大肠杆菌表达体系为主要内容，或以枯草芽孢杆菌表达体系为研究对象，但大多载体和宿主的选择在以生产为目的时均显示了某种不足，例如温控载体和穿梭质粒的使用会因表达中需要温度、诱导剂等条件而增加生产成本。

我国碱性果胶酶研究总体起步较晚，在国外酶制剂公司80％的工业用酶都是由基因工程菌发酵生产获得，发酵酶活较高、酶学性质优良的酶制剂工业生产背景下，必须进行基因工程菌构建体系和方法的研究以拓宽民族工业酶制剂的竞争和发展空间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碱性果胶酶的基因工程菌及其构建方法，以获得高产碱性果胶酶基因工程菌。

本发明采取的技术方案是：

一种碱性果胶酶基因工程菌，是将出发菌株枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因连接在表达载体pWB980上，并采用化学方法转化WB600得到的工程菌株。

而且，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis168，其碱性果胶酶基因的大小为1263bp。

一种碱性果胶酶基因工程菌的构建方法，构建方法包括如下步骤：

(1).以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，设计特异的PCR引物，扩增碱性果胶酶基因；

(2).将目的基因酶切后与载体连接，命名重组质粒为pWB-pelG₂521；

(3).重组质粒pWB-pelG₂521转化枯草芽孢杆菌表达宿主，构建碱性果胶酶基因工程菌WB600/pWB-pelG₂521，最终获得枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因工程菌。

而且，所述步骤[1]中用于PCR上游引物5’端含Sal I酶切位点，在酶切位点后根据编码框正确读码要求补充碱基C；下游引物5’端含SphI酶切位点，扩增获得碱性果胶酶基因全长1263bp，其中信号肽部分63bp。

而且，所述步骤[2]中pWB980分子量为3787bp，pWB-pelG₂521大小为5045bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距120bp。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明探索了碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的转化和表达条件，构建了高产碱性果胶酶的基因工程菌株，建立了碱性果胶酶的发酵工艺，适用于工业化的生产和应用，具有一定的理论和应用价值。

2、本方法中所得到并表达的基因区别于已报道的该酶基因序列，并在个别氨基酸组成上有差异；工程菌发酵采用的培养基适用于工业化生产，表达宿主为蛋白酶缺陷型，利于后期酶的分离纯化和稳定保藏。

3、本发明拓宽碱性果胶酶分子生物学研究思路和领域，探索碱性果胶酶基因工程菌构建的可操作对象，所构建的工程菌发酵所产生的酶活达到330U/mL，比出发菌株碱性果胶酶活性提高了22倍。

附图说明

图1是本发明基因工程菌中pWB980-G₂521的酶切验证电泳图；

图2是本发明基因工程菌WB600/pWB980-G₂521对照携带空质粒的出发菌株WB600/pWB980的碱性果胶酶的平板显影图；

图3是本发明基因工程菌WB600/pWB980-G₂521的生长曲线及酶生成曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一、碱性果胶酶基因工程菌的构建

从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(保藏单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CICC 10027)中分离出碱性果胶酶基因，设计引物(引物委托大连宝生物工程有限公司合成)是以pWB980为载体，以WB600为表达宿主。

1、PCR扩增目的基因

GE UP 5′-CCGGCATGCCATGAAAAAAGTGATGTTAGCTACG-3′

GE DOWN 5′-CACGCGTCGACTTAATTTAATTTACCCGCACC-3′

根据NCBI报道，枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的碱性果胶酶基因1263bp设计引物，其中PCR上游引物5’端含Sal I酶切位点，在酶切位点后根据编码框正确读码要求补充碱基C；下游引物5’端含Sph I酶切位点，扩增获得碱性果胶酶基因全长1260bp，其中信号肽部分63bp。

以枯草芽孢杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增，在0.5mL Eppendorf管中按以下顺序分别加入各试剂：

扩增体系(50μL)：ddH₂O 37μL，10×buffer 5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)5.0μL，上游引物GE UP(10μmol/L)0.75μL，下游引物GE DOWN(10μmol/L)0.75μL，DNA模板1.0μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL；

扩增程序：95℃5min，1个循环；94℃45s，49℃45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，1个循环。

2、重组质粒的构建和转化

(1).将PCR扩增得到的目的基因pelG₂521分别用sal I和sph I双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒(该试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)纯化。

(2).将pWB980质粒(该质粒购自TAKARA公司)经sal I和sph I双酶切、纯化后与第(1)步的纯化产物通过连接试剂盒(该试剂盒购自TAKARA公司)在16℃的条件下连接12h，得到重组质粒pWB-pelG₂521。

pWB980分子量为3787bp，pWB-pelG₂521大小为5045bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距120bp。

双酶切体系：10×H buffer 2μL，DNA/pWB980 8μl，Sph I 1.2μL，Sal I 1.2μL，ddH₂O 7.6μL。37℃酶切过夜，目的基因酶切产物直接回收，质粒酶切产物电泳后切胶回收。

连接体系：Solution I 5μL，载体DNA 1μL，目的基因4μL，16℃作用12h。

(3).将10μL的pWB-pelG₂521化学转化40μL枯草芽孢杆菌感受态细胞，涂布在含卡那霉素(50μg/mL)的LA平板上，从抗性平板上挑选抗性菌落进行sal I和sph I双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，特异性条带大小与目的基因1263bp两种碱性果胶酶基因大小相同。

3、碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将验证正确的重组质粒化学转化枯草芽孢杆菌WB600，构建成为工程菌株WB600/pWB-pelG₂521，与对照菌WB600/pWB980分别接种于2mL含Kan的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养过夜，按8％的接种量转接于装有5mL含Kan的LB培养基中，37℃水浴振荡培养24h。培养液12000rpm离心保留上清液，测定酶活。

二、发酵培养方法

在LA培养基上培养24h，挑取活化的WB600/pWB-pelG₂521接种到LB种子培养基中，装液量50mL/250mL三角瓶，37℃，200r/min培养16h，然后按2％接种量转接至发酵培养基(玉米粉3％，豆饼粉4％，(NH₄)₂SO₄0.4％，MgSO₄.7H₂O 0.03％，NaCO₃ 0.02％，K₂HPO₄0.4％，KH₂PO₄0.4％，pH7.5)，装液量100mL/500mL挡板三角瓶，37℃，180r/min培养24h。各培养基中均含Kan 50μg/mL。

三、碱性果胶酶活力的测定

酶活力单位定义：1mL酶液在45℃，pH为9.0条件下，每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

测定方法酶液制备：果胶酶菌种经发酵培养结束后，8000转离心5分钟，取上清液。用缓冲液稀释不同倍数，和原液平行测定；酶活测定方法：反应体系中包括粗酶稀释液20μL，0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2mol/L)缓冲液(pH 9.0，含有0.44mmol/L的CaCl₂)2mL，反应条件为45℃温育15min，用3mL0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。酶空白：将2mL上述缓冲体系配制的底物保温2min后，依次加入3mL0.03mol/L的磷酸和20μL与实验样相同稀释倍数的灭活的酶液，混匀。其他操作与实验样相同。

式中：4600(Lmol^-1cm^-1)-不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数

t(min)-酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)

b(cm)-比色杯厚度

经简化：酶活力(u/ml)＝3.6232*稀释倍数*OD235

本方法中所得到并表达的碱性果胶酶基因与已报道的该酶基因序列相似性98.89％，氨基酸序列相似性99.76％，氨基酸组成差异为Ala45Ser；Luria-Bertani培养基发酵分析显示，工程菌株及野生菌株的发酵过程相似，发酵7h前后达到稳定生长期，在指数生长时期，发酵液pH由7.0略有下降直至6.5，指数期后期及稳定期发酵液pH逐渐上升到8.5；碱性果胶酶在指数期伴随菌体的迅速生长而大量合成，稳定期前期最高酶活性达到240～260U/mL且酶活性稳定；优化培养基选用适用于工业生产的玉米粉、豆粕为主要碳源、氮源，具体配方为玉米粉4％，豆粕3％，(NH₄)₂SO₄0.4％，MgSO₄.7H₂O 0.03％，FeSO₄ 0.01％，K₂HPO₄ 0.4％，KH₂PO₄ 0.4％，发酵培养条件37℃，200rpm，摇瓶培养24h酶活达到330U/mL，比出发菌株碱性果胶酶活性提高了22倍。

SEQUENCE LISTING

<110>天津科技大学

<120>碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法

<130>20090424

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>引物1-GE UP

<400>1

ccggcatgcc atgaaaaaag tgatgttagc tacg 34

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>引物2-GE DOWN

<400>2

cacgcgtcga cttaatttaa tttacccgca cc 32

<210>3

<211>1263

<212>DNA

<213>基因pelG2521

<400>3

atgaaaaaag tgatgttagc tacggctttg tttttaggat tgactccagc tggcgcgaac 60

gcagctgatt taggccacca gacgttggga tccaatgatg gctggggcgc gtactcgacc 120

ggcacgacag gcggggcaaa agcatcgtcc tcaaatgtgt ataccgtcag caacagaaac 180

cagcttgtct cggcattagg gaaggaaacg aacacaacgc caaaaatcat ttatatcaag 240

ggaacgattg acatgaacgt agatgacaat ctgaagccgc ttggtctaaa tgactataaa 300

gatccggagt atgatttgga caaatatttg aaagcctatg atcctagcac atggggcaaa 360

aaagagccgt cgggaacaca agaagaagcg agagcacgct ctcagaaaaa ccaaaaagca 420

cgggtcatgg tggatatccc tgcaaacacg acgatcgtcg gttcagggac taacgctaaa 480

gtcgtgggag gaaacttcca aatcaagagt gataacgtca ttattcgtaa cattgaattc 540

caggatgcct atgattattt tccgcaatgg gatccgactg acggaagctc aggaaactgg 600

aactcacaat acgacaacat cacgataaac ggcggcacac acatctggat tgatcactgt 660

acatttaacg acggttcgcg tccggacagc acatcaccga aatattatgg aagaaaatat 720

cagcaccatg acggccaaac ggatgcttcc aacggcgcta actatatcac gatgtcttac 780

aactattatc acgatcatga taaaagctcc attttcggat caagtgacag caaaacctcc 840

gatgacggca aattaaaaat aacgctgcat cataaccgct ataaaaatat tgtccagcgc 900

gcgccgagag tccgcttcgg gcaagtgcac gtatacaaca actattatga aggaagcaca 960

agctcttcaa gttatccttt cagctatgca tggggaatcg gaaagtcatc taaaatctat 1020

gcccaaaaca atgtcattga cgtaccggga ctgtcagctg ctaaaacgat cagcgtattc 1080

agcgggggaa cggctttata tgactccggc acgttgctga acggcacaca gatcaacgca 1140

tcggctgcaa acgggctgag ctcttctgtc ggctggacgc cgtctctgca tggatcgatt 1200

gatgcttctg ctaatgtgaa atcaaatgtc ataaatcaag cgggtgcggg taaattaaat 1260

taa 1263

Claims

1.一种碱性果胶酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：构建方法包括如下步骤：

(3).重组质粒pWB-pelG₂521转化枯草芽孢杆菌表达宿主，构建碱性果胶酶基因工程菌WB600/pWB-pelG₂521，最终获得枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因工程菌，

所述pWB-pelG₂521的构建方法如下：

[1] 将PCR扩增得到的目的基因pelG₂521分别用sal I和sph I双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化，

[2] 将pWB980质粒经sal I和sph I双酶切、纯化后与第[1]步的纯化产物通过连接试剂盒在16℃的条件下连接12h，得到重组质粒pWB-pelG₂521，pWB-pelG₂521大小为5045bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距120bp

所述WB600/pWB-pelG2521是将pWB-pelG₂521化学转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中得到的基因工程菌；

所述步骤[1]中用于PCR上游引物5’端含Sal I酶切位点，在酶切位点后根据编码框正确读码要求补充碱基C；下游引物5’端含SphI酶切位点，扩增获得碱性果胶酶基因全长1263bp，其中信号肽部分63bp；

所述步骤[2]中pWB980分子量为3787bp，pWB-pelG₂521大小为5045bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距120bp；

具体步骤如下：

一、碱性果胶酶基因工程菌的构建

从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中分离出碱性果胶酶基因，保藏单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CICC 10027，设计游引物GE UP和GE DOWN，本碱性果胶酶基因工程菌是以pWB980为载体，以WB600为表达宿主；

A、PCR扩增目的基因

GE UP 5′-CCGGCATGCCATGAAAAAAGTGATGTTAGCTACG-3′

GE DOWN 5′-CACGCGTCGACTTAATTTAATTTACCCGCACC-3′

根据NCBI报道，枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的碱性果胶酶基因1263bp设计引物，其中PCR上游引物5’端含Sal I酶切位点，在酶切位点后根据编码框正确读码要求补充碱基C；下游引物5’端含Sph I酶切位点，扩增获得碱性果胶酶基因全长1260bp，其中信号肽部分63bp；

以枯草芽孢杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增，在0.SmL Eppendorf管中按以下顺序分别加入各试剂：

扩增体系50μL：ddH₂O 37μL，10×buffer 5.0μL，dNTPs 2.5mmol/L 5.0μL，上游引物GE UP 10μmol/L 0.75μL，下游引物GE DOWN 10μmol/L 0.75μL，DNA模板1.0μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL；

扩增程序：95℃5min，1个循环；94℃45s，49℃45s，72℃ 90s，30个循环；72℃10min，1个循环；

B、重组质粒的构建和转化

(1).将PCR扩增得到的目的基因pelG₂521分别用sal I和sph I双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化；

(2).将pWB980质粒经sal I和sph I双酶切、纯化后与第(1)步的纯化产物通过连接试剂盒在16℃的条件下连接12h，得到重组质粒pWB-pelG₂521；

pWB980分子量为3787bp，pWB-pelG₂521大小为5045bp，载体上转录起始密码子与目的基因上转录起始密码子之间相距120bp；

双酶切体系：10×H buffer 2μL，DNA/pWB9808μl，SphI 1.2μL，Sal I 1.2μL，ddH₂O 7.6μL，37℃酶切过夜，目的基因酶切产物直接回收，质粒酶切产物电泳后切胶回收；

连接体系：Solution I 5μL，载体DNA 1μL，目的基因4μL，16℃作用12h；

(3).将10μL的pWB-pelG₂521化学转化40μL枯草芽孢杆菌感受态细胞，涂布在含卡那霉素50μg/mL的LA平板上，从抗性平板上挑选抗性菌落进行sal I和sph I双酶切验证，

琼脂糖凝胶电泳检测，特异性条带大小与目的基因1263bp两种碱性果胶酶基因大小相同；

C、碱性果胶酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将验证正确的重组质粒化学转化枯草芽孢杆菌WB600，构建成为工程菌株WB600/pWB-pelG₂521，与对照菌WB600/pWB980分别接种于2mL含Kan的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养过夜，按8％的接种量转接于装有5mL含Kan的LB培养基中，37℃水浴振荡培养24h，培养液12000rpm离心保留上清液，测定酶活。